Mgr Mayank Chaturvedi • • • • • • •

Dziedzina: nauki biologiczne Dyscyplina: biologia Otwarcie: 12.04.2013 r. Temat: Nanoparticles mediated delivery of Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases -1 (TIMP-1) to the brain for neuroprotection from excitotoxicity induced neurodegeneration Promotor: prof. dr hab. Leszek Kaczmarek Promotor pomocniczy: dr Jakub Włodarczyk Recenzenci: prof. dr hab. Grzegorz Bartosz, dr hab. n. med. Elżbieta Salińska

Streszczenie

Streszczenie Wstęp: Metaloproteazy macierzy zewnątrzkomórkowej (ang. Matrix metalloproteinases – MMPs) są rodziną endopeptydaz zależnych od cynku przecinających białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Odgrywają one istotną rolę w remodelowaniu tkanek w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Wzrost poziomu ekspresji MMP, w szczególności MMP-9, zaobserwowano w licznych procesach patologicznych, m.in. w epilepsji i w czasie udaru mózgu. Dlatego też zahamowanie aktywności MMP-9 ma potencjał terapeutyczny. Hipoteza: Dlatego też postanowiono zbadać neuroprotekcyjny wpływ tkankowego inhibitora metalloproteaz macierzy zewnątrzkomórkowej-1 (ang. Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1 – TIMP-1), który jest endogennym inhibitorem MMP-9 charakteryzującym się wysokim powinowactwem do tej proteazy I hamującym jej aktywność enzymatyczną. Jednakże cechuje się on krótkim czasem półtrwania, niską biodostępnością oraz niezdolnością do przekraczanie bariery krew-mózg (ang. Bloodbrain barrier – BBB). Dlatego też zdecydowano się na zastosowanie rozwiązania nanotechnologicznego polegającego na dostarczeniu TIMP-1 w nanocząsteczkach (ang. Nanoparticles – NP) zbudowanych z kwasu polilakto-co-glikolowego (ang. Poly lactoco-glycolic acid – PLGA).

1|Strona

Streszczenie Projekt obejmował trzy najważniejsze etapy: 1. Sklonowanie genu TIMP-1 oraz jego ekspresja heterologiczna: Rekombinowany gen mysiego TIMP-1 został sklonowany i wyrażony w linii komórkowej HEK293T. Pokazano zdolność oczyszczonego rekombinowanego białka TIMP-1 do blokowanie endogennej i rekombinowanej auto-aktywującej się MMP-9. 2. Opracowanie nanocząsteczek przenoszących TIMP-1: W następnym etapie opracowano nanocząsteczki PLGA wypełnione TIMP-1, które pokryto polisorbatem 80 (ang. Polysorbate 80 – Ps80) w celu zwiększenia zdolności przekraczania bariery krew – mózg (BBB – ang. blood–brain barrier). Do porównania in vitro NP pokrytych i niepokrytych Ps80 zastosowano pierwotną hodowlę mysich komórek nabłonka naczyń włosowatych (ang. Rat capillary endothelial cel – RBCEC) oraz linię komórkową RBE4. Stwierdzono, że oba typy nanocząsteczek są nietoksyczne i nie powodują znaczącego otwarcia BBB. NP bez Ps80 miały większą zdolność wiązania się z komórkami nabłonkowymi w porównaniu do NP pokrytych Ps80. Badania zdolności przenikania nanocząsteczek wykazały, że NP wypełnione TIMP-1 i pokryte Ps80 cechowały się zwiększoną

przenikalnością

przez

monowarstwę

komórek

nabłonkowych,

w

porównaniu do TIMP-1 oraz NP wypełnionych TIMP-1 ale niepokrytych Ps80. 3. Właściwości neuroprotekcyjne: W ostatnim eksperymencie zbadano właściwości neuroprotekcyjne rekombinowanego TIMP-1 i nanocząsteczek wypełnionych TIMP-1,

2|Strona

Streszczenie którymi traktowano organotypowe hodowle neuronalne, wystawione na działanie kwasu kainowego, posiadającego właściwości neurotoksyczne. Wynik doświadczenia wskazuje, że TIMP-1 ma silne właściwości neuroprotekcyjne, zwłaszcza gdy został podany 30 min przed podaniem KA i był uwalniany z NP. Test żelatynolityczny wykazał

zahamowanie

aktywności

MMP-9,

co

sugeruje,

że

właściwości

neuroprotekcyjne są powiązane z zahamowanie aktywności żelatynaz. Przedstawione wyniki sugerują, że podwyższenie poziom białka TIMP-1 może chronić komórki nerwowe. Co więcej, efekt ochronny może być spowodowany inhibicją aktywności MMP-9. Przeprowadzenie dalszych eksperymentów in vivo, pozwoli na potwierdzenie neuroprotekcyjnych właściwości białka TIMP-1 i wypełnionych TIMP-1 nanocząsteczek.

3|Strona

Summary

Summary

Graphical summary of the project: 1. Introduction: Literature suggests crucial role of increased MMP-9 activity in excitotoxic neurodegeneration 2. Hypothesis: The increased MMP-9 activity can be inhibited by TIMP-1, which is endogenous inhibitor of MMP-9 and may have neuroprotective effects. 3. Plan of Work: The project involved three major steps (i) Cloning and expressing recombinant TIMP-1. (ii) Developing TIMP-1 loaded nanoparticles (NPs) which can cross blood-brain barrier and deliver recombinant TIMP-1 to the brain. (iii) And finally, evaluating neuroprotective effects of recombinant TIMP-1 and TIMP-1 loaded NPs. 4. Key Results: In organotypic hippocampal slice cultures, TIMP-1 and TIMP-1 loaded NPs have neuroprotective effects which have been mediated through MMP-9 inhibition.

Introduction: Matrix metalloproteinases (MMPs) are family of zinc dependent endopeptidases, which cleave extracellular matrix proteins, and play an important role in tissue remodeling in physiological and pathological processes. There is enhanced expression of MMPs, in particular MMP-9 causing excitotoxic neurodegeneration (Fig. 1). Therefore, inhibition of MMP-9 is considered as a potential therapeutic target. 1|Page

Summary Hypothesis: Therefore, it was planned to investigate whether Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase-1 (TIMP-1), which is endogenous inhibitor of MMP-9 and known to bind MMP-9 with high affinity to block its enzymatic function can have neuroprotective effects. But being a protein, it has very short half-life, low bioavailability and does not crosses blood-brain barrier (BBB), hence it was decided to use a nanotechnology based approach of delivery it through poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) based nanoparticles (NPs). The major results of the project are as follows: 1. TIMP-1 Cloning & Expression: In order to produce recombinant mouse TIMP-1, the gene of interest was cloned and expressed in HEK 293T cell line. It was demonstrated that purified mouse recombinant TIMP-1 was effectively inhibiting both endogenous and recombinant auto-activating MMP-9. 2. TIMP-1 loaded NPs development: Next, TIMP-1 loaded PLGA NPs were developed, which were coated with Polysorbate 80 (Ps80) for enhancing BBB penetration. For in- vitro studies primary rat brain capillary endothelial cell (RBCEC) cultures and RBE4 cell line were used to compare Ps80 coated and non-coated NPs. Results showed that neither Ps80 coated nor non-coated NPs caused significant opening of BBB and essentially they were non-toxic. NPs without Ps80 coating had more binding to endothelial cells as compared to Ps80 coated NPs. Penetration studies showed that TIMP-1 NPs + Ps80 had more penetration, when compared with

2|Page

Summary TIMP-1 alone and TIMP-1 NPs without Ps80 coating. In vivo studies also indicated BBB penetration of intravenously injected TIMP-1 NPs + Ps80. 3. Neuroprotective effects: In the final set of experiments, recombinant TIMP-1 and TIMP-1 loaded NPs were examined for its in vitro neuroprotective effects, against Kainic Acid (KA) induced excitotoxicity in organotypic hippocampal slice culture (OHC). Briefly, our result show that TIMP-1 provided significant level of neuroprotection, especially when given before 30 min of KA and released from the NPs. Since gelatinolytic activity assay showed a decrease in MMP-9 activity, it can be suggested that this neuroprotection might be mediated by the gelatinase inhibition. Taken together, our findings suggest that raising TIMP-1 levels may be neuroprotective in vitro. Moreover, this neuroprotection can be due to MMP-9 inhibition. In future, further in vivo experiments can be done in this direction to study whether TIMP-1 and TIMP-1 NPs can have similar effects in the brain

3|Page