Biogasforum – Vortrag Prof. Tebbe, vTI Braunschweig

30.11.2011

Kultivierungsunabhängige Untersuchungen zur  Vielfalt mikrobieller Gemeinschaften aus  experimentellen Biogasanlagen  unter besonderer Berücksichtigung von Clostridien unter besonderer Berücksichtigung von Clostridien

Anja B. Dohrmann und Christoph C. Tebbe vTI – von Thünen Bundesforschung Institut für Biodiversität Braunschweig

Die Suche nach Clostridium botulinum in  experimentellen Biogasanlagen 

Anja B. Dohrmann und Christoph C. Tebbe vTI – von Thünen Bundesforschung Institut für Biodiversität Braunschweig

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Forschungsprojekt (2005 bis 2007)1 • Clostridien sind wichtige, konstant vorkommende mikrobiologische  Funktionsträger in Biogasreaktoren (bis zu 50 % aller Bakterien!) • Clostridien beinhalten auch hoch‐pathogene bzw. toxische Vertreter, wie  Clostridien beinhalten auch hoch pathogene bzw toxische Vertreter wie Clostridium perfringens, Clostridium tetani, und Clostridium botulinum)    

Kommt Clostridium botulinum in Biogasreaktoren vor? H2, CO2, Acetat

CO2,, CH4

Biomasse Propionat, Butyrat,  Succinat, Alkohole

Clostridien 1gefördert durch das Niedersächsische Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft, Verbraucherschutz und Landesentwicklung. Zusammenarbeit zwischen dem 

Institut für Technologie  (Team Prof. Weiland) und dem Institut für Agrarökologie (Team Prof. Tebbe) der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) 

Kultivierungsunabhängige DNA‐Analysen zur Charakterisierung der Bakterienvielfalt und zur Suche nach Clostridium botulinum

Experimentelle Biogasanlage Institut für Technologie, FAL, Prof. Weiland

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Kultivierungsunabhängig: Warum? • Klassische Verfahren: Isolierung und Kultivierung  von Mikroorganismen in/auf Nährmedien • Anaerobe Kultivierung: experimentell  aufwendig, langsam und teuer • Kultivierung pathogener Bakterien erfordert  hohe Sicherheit (L2 bzw. L3 Labor) • Direkte DNA Extraktion liefert das gesamte  genetische Programm („Metagenom“) aus dem  Biogasreaktor • Nachweis erfolgt unabhängig von  Kultivierbarkeit oder Pathogenität • Spezifische Gene lassen sich aus dem Biogas‐ Reaktor Metagenom durch PCR‐Verfahren  quantifizieren und differenzieren

Kultivierungsunabhängig: Warum? • Hinweis auf pathogene Bakterien kann ohne Risiken gewonnen werden • Ethisch vertretbarer Weg, um nach C. botulinum in zahlreichen  g Umweltproben zu suchen (keine Mäuseversuche!) 

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16S rRNA Gene Der Goldstandard für die Suche nach Bakterien • • • • •

•

Kommt in allen Bakterien vor Die Ähnlichkeit der Gene korreliert mit Verwandtschaft Aus Umweltproben leicht nachweisbar durch PCR Durch qPCR auch quantifizierbar Durch phylogenetische Analysen schnelle  Eingruppierung eines unbekannten Bakteriums zu  bereits bekannten Vertretern Kann für genetisches Fingerprinting mikrobieller  Gemeinschaften aus Umweltproben genutzt werden  (SSCP DGGE TRFLP) (SSCP, DGGE, TRFLP) SSCP‐Profil

• ABER •

Eine Differenzierung von pathogenen und nicht‐ pathogenen Vertretern häufig nicht möglich kein direkter Nachweis von Toxinen oder Pathogenität

aus einer  Umweltprobe Jede Bande zeigt ein  anders 16SrRNA Gen an. Fingerprint einer  Bakterien‐Gemeinschaft

16S rRNA Gene Phylogenetischer Baum  mit Clostridien und Verwandten Es gibt viele Bakterien mit dem Namen  Clostridium (ca. 150 Arten) Clostridium (ca 150 Arten) Historisch bedingt! Nicht immer sehr  miteinander verwandt

Cluster I

Clostridium sensu stricto eigentliche Clostridien mit 73 Arten, darunter , alle pathogenen Vertreter wie Clostridium botulinum,  Clostridium perfringens,  oder Clostridium tetani

The Prokaryotes, Introduction to the Family Clostridiaceae 12/31/2005

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Gruppe II

16S rRNA Gene von  Clostridium Cluster I Keine eindeutige Gruppierung  von Arten nach ihren 16S  rRNA Genen rRNA Genen

Gruppe III

Gruppe IV

Verschiedene „Arten“ mit sehr ähnlichen oder sogar gleichen  16S rRNA Genen Eindeutige Differenzierung  aufgrund von 16S rRNA Genen  alleine nicht möglich

Gruppe I

The Prokaryotes, Introduction to the Family Clostridiaceae 12/31/2005

Gruppe II

16S rRNA Gene von  Clostridium Cluster I Keine eindeutige Gruppierung  von Arten nach ihren 16S  rRNA Genen rRNA Genen

Gruppe III

Verschiedene „Arten“ mit sehr ähnlichen oder sogar gleichen  16S rRNA Genen

Gruppe IV

Eindeutige Differenzierung  aufgrund von 16S rRNA Genen  alleine nicht möglich

Gruppe I

ABER Cluster I: Detektion würde  alle bekannten C. botulinum  Stämme erfassen, aber auch  andere The Prokaryotes, Introduction to the Family Clostridiaceae 12/31/2005

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Clostridium botulinum (Cb) • •

• • •

•

Phylogenetisch ist Cb keine „Art“! Heterogene Gruppe von Neurotoxin Heterogene Gruppe von Neurotoxin  (BoNT) bildenden Clostridien  innerhalb von  Clostridium Cluster I 16S rRNA nur grobe Indikation Serologische Gruppen A bis G  Nachweis serologisch über ELISA  (Toxine, Differenzierung) bzw.  Mäusetest (Symptome) ABER Neue PCR Systeme erlauben   multiplex qPCR Nachweise und  Differenzierung von BoNT‐Genen  (für BoNT A bis G)  (Kirchner et al., 2010, AEM 76: 4387‐4395)

Gruppe II

Gruppe II Nicht proteolytisch Typ B, E und F

16S rRNA Gene von  Clostridium Cluster I

Gruppe III

Gruppe III Nicht proteolytisch Typ C und D Gruppe IV Gruppe IV Typ G

BoNT‐Symptome  (Einzelfälle)

Gruppe I Gruppe I Proteolytisch Typ A, B und F

Clostridium butyricum Clostridium barati Cl. argentinense (Typ G)

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Experimentelle Analysen Methanproduktivität Kleegrassilage Methanproduktivität 10 0 10,0

0,90

9,0

0,80

8,0

0,70

7,0

0,60

6,0

0,50

5,0

0,40

4,0

0,30

3,0

0,20

2,0

0,10

1,0

92

89

98 10 5 11 1 11 7 12 0 12 6 13 3 13 9 14 7 15 3 15 9 16 2

83

76

70

63

56

49

42

34

19

16

13

6

0,0 3

0,00 0

Raumbelastung [g oTS/l R *d)]

Methanproduktivität [lN /(lR*d)]

Raumbelastung 1 00 1,00

Versuchsdauer [d]

Kl Kleegrassilage il Maissilage Hühnertrockenkot Schweinegülle Rindergülle

mesophil (37°C) thermophil (55 °C)

PCR qPCR

BoNT Gene 16S rRNA Gene ‐ alle Bakterien ‐ Clostridium Cluster I

Nachweis und Differenzierung von BoNT Genen aus  Material der experimentellen Biogasreaktoren

Gene für BoNT A, B, E, F

bont

Universeller Vorwärts‐Primer

bont/A

639 bp

bont/B

636 bp

bont/E

615 bp

bont/F

639 bp

~ 4000 bp

Spezifische  Rückwärts‐Primer

Fach P, et al. 2002. Detection by PCR‐enzyme‐linked immunosorbent assay of Clostridium botulinum in fish and  14 environmental samples from a coastal area in northern France . Appl. Environ. Microbiol. 68: 5870‐5876

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BoNT A

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bont/A

639 bp

bont/B

636 bp

bont/E

615 bp

bont/F

639 bp

bont/A

N    1     2       3    4    5     6     7      8

N 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

BoNT B

527 bp

kein BoNT A! kein BoNT A!

Negative Kontrolle (A. dest.) Negative Kontrolle (1.PCR) Klärschlamm Hühner‐Trockenkot (10‐1) Maissilage (10‐1) Rindergülle (5 x 10‐2) Schweinegülle (10‐1) Gärsubstrat (2 Tage, Rindergülle, 10‐1) Gärsubstrat (127 Tage, Rindergülle, 10‐1)

bont/A

639 bp

bont/B

636 bp

bont/E

615 bp

bont/F

639 bp

N   1 

bont/B

2     3   4    5   6    7    8

523 bp

kein BoNT B! kein BoNT B!

280 ms

N 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Negative Kontrolle (A. dest.) Negative Kontrolle (1.PCR) Klärschlamm Hühner‐Trockenkot (10‐1) Maissilage (10‐1) Rindergülle (5 x 10‐2) Schweinegülle (10‐1) Gärsubstrat (2 Tage, Rindergülle, 10‐1) Gärsubstrat (127 Tage, Rindergülle, 10‐1)

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16

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BoNT E

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bont/A

639 bp

bont/B

636 bp

bont/E

615 bp

bont/F

639 bp

N  1     2       3     4     5     6     7     8

bont/E

506 bp

kein BoNT E! kein BoNT E!

280 ms

N 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

BoNT F

Negative Kontrolle (A. dest.) Negative Kontrolle (1.PCR) Klärschlamm Hühner‐Trockenkot (10‐1) Maissilage (10‐1) Rindergülle (5 x 10‐2) Schweinegülle (10‐1) Gärsubstrat (2 Tage, Rindergülle, 10‐1) Gärsubstrat (127 Tage, Rindergülle, 10‐1)

bont/A

639 bp

bont/B

636 bp

bont/E

615 bp

bont/F

639 bp

N     1     2      3      4     5    6     7    8

bont/F

591 bp

kein BoNT F! kein BoNT F!

280 ms

N 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Negative Kontrolle (A. dest.) Negative Kontrolle (1.PCR) Klärschlamm Hühner‐Trockenkot (10‐1) Maissilage (10‐1) Rindergülle (5 x 10‐2) Schweinegülle (10‐1) Gärsubstrat (2 Tage, Rindergülle, 10‐1) Gärsubstrat (127 Tage, Rindergülle, 10‐1)

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Wie verändern sich die Bakterien‐ und Clostridien‐ Gemeinschaften während der Biogasproduktion? Methanproduktivität Kleegrassilage

15 9 16 2

14 7 15 3

13 3 13 9

12 0 12 6

11 1 11 7

98 10 5

89

92

76

0,0 83

1,0

0,00 63

2,0

0,10

70

0,20

49

3,0

56

40 4,0

0,30

34

5,0

0 40 0,40

42

6,0

0,50

16

0,60

19

7,0

6

8,0

0,70

13

9,0

0,80

0

0,90

Rau umbelastung [g g oTS/l R *d)]

Methanproduktivität 10,0

3

Methanpro oduktivität [lN /(lR*d)]

Raumbelastung 1,00

Versuchsdauer [d]

Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation

Kleegrassilage (mesophil) KS    KGS    12      20     35     54       71     89    111   131    154  174    195   230   ‐ Nachgärung      

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Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation

Hühnertrockenkot (mesophil) KS    HTK                2       3        4       7       14     21     28     36     51       70   87    105   127   147  170   190    211   246

Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation

Maissilage (mesophil) MS    KS      2         3        4      7       14     21               28      36     51   70      87    105    127   147   170 190   211

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30.11.2011

Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation

Schweinegülle (mesophil) KS    SG     2      3     4        7    14    21   28   36            51  70   87   105 127  147 170  190 211 246

Dynamik der Bakterien‐Gemeinschaft während der Biogas‐Fermentation

Rindergülle (mesophil) RG      KS        2         3       4         7       14       21    28      36       51       70      87    105   127   147

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30.11.2011

Dynamik der Clostridien (nicht nur Cluster I) während der Biogas‐Fermentation

Rindergülle (mesophil) KS     RG      2         3      4         7      14      21    28      36       51   70     87    105     127  147   170   190 211 

Quantitative PCR Abundanzen von  Cluster I  Clostridia 9

Relative copy numbers

8 7 6 5 4 3 2

7,9

4,95

1

1

0

Cattle manure

Day 85

1

1,95

1,8

Day 105

Relative copy numbers * g‐1 (fresh weight) Relative copy numbers * g‐1 (dry weight)

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Dynamik der Clostridien (nicht nur Cluster I) während der Biogas‐Fermentation

Schweinegülle (mesophil) KS           SG      2     3      4      7     14   21             28    36   51   51   70     87  105  127  147 170  190 211 246

Rindergülle                                                          Schweinegülle

Bande

Sequenzähnlichkeit

Engster Verwandter

Isolationsquelle

98% (615/626)

Nicht kultiviertes Clostridium

Anaerober mesophiler Klärschlamm

98% (617/626)

Nicht kultiviertes Clostridium

Anaerober mesophiler Klärschlamm

100% ((628/628))

Nicht kultiviertes Clostridium

Deponie-Abwasser p ((China))

97% (611/624)

Nicht kultiviertes Clostridium

98% (614/624)

Clostridium paraputrificum,

99% (625/628)

Nicht kultiviertes Clostridium

Deponie-Abwasser (China)

99% (619/623)

Nicht kultiviertes Clostridium

Aerosol aus Schweinestall

97% (606/624)

Nicht kultiviertes Clostridium

Menschlicher Stuhl

Gesunder menschlicher Stuhl AY442815

Kängeruh Vormagen

Clostridien aus Klärschlamm oder Fäkalien – also den Substraten die auch in den Prozess gegeben wurden 28

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Dynamik der Clostridien (nicht nur Cluster I) während der Biogas‐Fermentation

Rindergülle (thermophil) KS      RG         1          7        14        21      28      35        49     63       78       96     110     125    139

‐ ‐‐ 160

Höhere Clostridien‐Vielfalt im thermophilen Prozess bei Rindergülle?

Dynamik der Clostridien (nicht nur Cluster I) während der Biogas‐Fermentation

Schweinegülle (thermophil) 1        4         7        21     28     35      49      63      78      96    110   125    139    160   SG   KS 

Keine Veränderung der Clostridien‐Vielfalt bei Schweinegülle im thermophilen Prozess?

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Phylogenetische  Zuordnung der  Clostridien‐Cluster I Sequenzen unter  besonderer  Berücksichtigung von Berücksichtigung von  Clostridium botulinum Unterschiedliche 16S rRNA  Gene aus Clostridien, aber  keine nahe an Gruppen von  C. botulinum oder anderen  pathogenen Vertretern pathogenen Vertretern

Zusammenfassung (1) • Die Zusammensetzung der Bakterien in den experimentellen  Biogasreaktoren wurde deutlich von den Eigenschaften der  unterschiedlichen Gärsubstrate beeinflusst  • In der Startphase (30 bis 100 Tage) dominierten die durch das Impfgut  (hier: Klärschlamm) eingebrachten Bakterien, danach jedoch nicht mehr • Je nach Substrat und Inkubationsbedingung (meso/thermophil) stellten  sich nach der Startphase relative stabile Bakterien‐Gemeinschaften ein • Bei mesophilen Prozessen: Die Veränderung der Clostridien‐Vielfalt  folgte der Dynamik der anderen dominanten Bakterien g y • Bei thermophilen Prozessen: Stabile Clostridien‐Gemeinschaften stellten  sich schneller ein als stabile Gemeinschaften der dominanten Bakterien  (geringerer Anteil an der Gesamtpopulation?)

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Zusammenfassung (2) • Bei der Vergärung von Rindergülle kam es zu keiner Massenvermehrung  von Clostridien im Vergleich zu den Ausgangssubstraten, wohl aber zu  einer Veränderungen ihrer Vielfalt i d ih i lf l • Clostridien aus unterschiedlichen phylogenetischen Zweigen gehörten zu  den charakteristischen Bakterien in allen experimentellen  Biogasreaktoren • Phylogenetische Analysen gaben keinen Hinweis, dass unter diesen  Clostridien Clostridium botulinum vorkommt • Auch der negative Nachweis von Genen für vier unterschiedliche  Botulinum Neurotoxine deutet darauf hin, dass es unter den gegebenen  Bedingungen zu keiner Vermehrung von C. botulinum kam 

Schlussfolgerungen • Keine Hinweise auf das Vorkommen oder die Vermehrung von C.  botulinum in experimentellen Biogasreaktoren mit 5 unterschiedlichen  Substraten unter mesophilen oder thermophilen Bedingungen Substraten unter mesophilen oder thermophilen Bedingungen • In den vergangenen 3 Jahren (seit Abschluss des Projekts) haben sich  erhebliche methodisch Verbesserung zur kultivierungsunabhängigen  Analysen von C. botulinum aus Umweltproben ergeben  • Mit Hilfe dieser neuen Methoden sollte es möglich sein, belastbare  Daten zum Vorkommen und zur Vermehrung von C. botulinum in  landwirtschaftlichen Biogasanlagen in Niedersachsen zu erhalten Wichtige Ergebnisse aus den hier vorgestellten Unterschungen wurden publiziert in:

Dohrmann, A.B, S. Baumert, L. Klingebiel, P. Weiland, and C.C. Tebbe. 2011. Bacterial  community structure in experimental methanogenic bioreactors and search for pathogenic  clostridia as community members. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89: 1991‐2004

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