W XIX wieku...
WITAMY NA KURSIE HISTOLOGII
W XXI wieku...
„Histologia to nauka o mikroskopowej budowie komórek, tkanek i narządów”
Nasz kurs:
„Histologia to nauka o powiązaniach struktury mikroskopowej, submikroskopowej i molekularnej komórek, tkanek i narządów z ich funkcją”
Dział: techniki mikroskopowe
Poprzez badanie funkcji komórek i tkanek, histologia jest częściowo zintegrowana z: • fizjologią • immunologią • biochemią • biologią molekularną
Dział: podstawy histologii tkanek i narządów
Podstawowe narzędzie badawcze: mikroskop
METODY PRZYGOTOWANIA MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO DO BADAŃ W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM – cz. I
Źródła wiedzy...
www.histologia.cm-uj.krakow.pl • regulamin kursu • prezentacje wykładowe • materiały uzupełniające • ogłoszenia • wyniki egzaminu • repetytorium praktyczne (obrazy preparatów)
wydanie z 2011 r.
1
.
TYPY PREPARATÓW: • skrawki • szlify (z tkanek zmineralizowanych) • rozmazy (z płynów ustrojowych i zawiesin komórkowych) • rozgnioty • odciski • preparaty całościowe • hodowle komórkowe
PREPARAT MIKROSKOPOWY: • przejrzysty (cienki) • zabarwiony (skontrastowany) • dobrze zachowana struktura
PIERWSZY CEL: UTRWALENIE (dobre zachowanie struktury)
Przygotowanie materiału biologicznego do badań mikroskopowych obejmuje kilka etapów, z których każdy służy osiągnięciu pewnego celu Co osiągamy przez utrwalenie materiału: • zapobieżenie autolizie poprzez inaktywację enzymów • wytrącenie i zachowanie niektórych substancji rozpuszczalnych • wstępne utwardzenie materiału
UTRWALANIE:
Chemiczne • aldehydy (formalina, ald. glutarowy)
immersyjne
DRUGI CEL: UTWARDZENIE I KROJENIE (tylko dla skrawków) Przepojenie substancją utwardzającą (zatapianie) • parafina • celoidyna • żywice akrylowe
• alkohole (metanol, etanol) • ketony (aceton) • kwasy (octowy, pikrynowy) • związki metali ciężkich (sublimat, czterotlenek osmu) Utrwalacze proste i złożone
Fizyczne: • mikrofale (często w kombinacji
Zamrożenie
z utrwalaczem chemicznym) perfuzyjne
2
Parafina, celoidyna i część żywic to substancje niepolarne (nie rozpuszczają się w wodzie). Przygotowywany materiał trzeba zatem stopniowo przeprowadzić ze środowiska polarnego (wodny roztwór utrwalacza) do niepolarnego (1) Odwadnianie – (alkohol etylowy lub aceton – szereg roztworów o wzrastającym stężeniu) (2) Płyny pośrednie – rozpuszczalne zarówno w środowisku odwadniającym jak i w substancji używanej do zatapiania - dla parafiny: rozpuszczalniki organiczne (ksylen, benzen, chloroform) - dla celoidyny: roztwór alkoholu i eteru, octan amylu (3) Zatapianie
Utrwalone próbki tkanek umieszcza się w specjalnych „kasetkach” i przeprowadza przez kolejne płyny albo ręcznie, albo automatycznie w tzw. procesorach tkankowych
Zestalenie zatopionego materiału:
ZAMRAŻANIE (technika mrożeniowa)
• parafina – ochłodzenie • celoidyna – odparowanie rozpuszczalnika • żywice – polimeryzacja
Podczas zamrażania woda w materiale biologicznym ulega krystalizacji.
Tworzy się „bloczek” z zatopionym materiałem, który można kroić na skrawki
Najmniejsze kryształki, nie uszkadzające struktury komórek i tkanek tworzą się przy bardzo szybkim zamrożeniu do bardzo niskiej temperatury. Dlatego do zamrażania stosujemy: • ciekłe gazy (azot, hel) • zestalony CO2 (tzw. suchy lód) • zamrożoną listwę metalową w kriostacie Można zamrażać i kroić materiał nieutrwalony – technika mrożeniowa umożliwia najszybsze uzyskanie preparatów
DO KROJENIA SKRAWKÓW SŁUŻĄ MIKROTOMY
Podczas krojenia skrawków parafinowych tworzy się „wstęga”
Mikrotom rotacyjny do skrawków parafinowych • stolik przedmiotowy • nóż • mechanizm przesuwu stolika względem noża
skrawki parafinowe: 2-10 µm skrawki z żywic: 0.5-2.0 µm
3
Kriostat służy do krojenia skrawków z zamrożonego materiału Mikrotom umieszczony w komorze o regulowanej temperaturze ujemnej
HISTOLOGIA OGÓLNA (TKANKI) Elementy składowe tkanki: • komórki (o podobnym pochodzeniu, zbliżonej strukturze i funkcji) • substancja międzykomórkowa (produkowana przez komórki)
Temperatura krojenia: od -15°C do -25°C
skrawki mrożeniowe: 4-10 µm
Główne rodzaje tkanek zwierzęcych: • tkanka nabłonkowa • tkanka łączna • tkanka mięśniowa • tkanka nerwowa
FORMY: • wyściółki (pokrywające zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie organizmu)
• gruczoły (zespoły komórek nabłonkowych pełniących funkcje wydzielnicze)
Tkanka nabłonkowa
Nabłonki nie zawierają naczyń krwionośnych! FUNKCJE: • ochronna (np. naskórek) • resorbcyjna (np. nabłonek jelitowy) • wydzielnicza (np. gruczoły) • regulacja transportu przez nabłonek (np. śródbłonek wyścielający naczynia krwionośne) • zmysłowa (np. kubki smakowe) W obrębie jednego nabłonka mogą występować różne typy komórek pełniące różne funkcje
KLASYFIKACJA NABŁONKÓW
Nabłonek jednowarstwowy płaski
• liczba warstw: - jednowarstwowe - wielowarstwowe • kształt komórek: - płaskie - sześcienne - walcowate Główne funkcje: kontrola transportu W klasyfikacji należy zawsze uwzględniać oba kryteria W nabłonkach wielowarstwowych kształt komórek dotyczy warstwy powierzchniowej
Przykładowa lokalizacja: naczynia (śródbłonek), pęcherzyki płucne (pneumocyty), opłucna i otrzewna (międzybłonek)
4
Nabłonek jednowarstwowy sześcienny
Nabłonek jednowarstwowy walcowaty
Główne funkcje: wchłanianie, wydzielanie Przykładowa lokalizacja: kanaliki nerkowe, gruczoły i ich przewody
Główne funkcje: wchłanianie, wydzielanie, kontrola transportu, ochrona Przykładowa lokalizacja: przewód pokarmowy, drogi żółciowe, żeńskie drogi rozrodcze, duże przewody wyprowadzające gruczołów
Nabłonek wieloszeregowy (wielorzędowy)
Nabłonek wielowarstwowy płaski Odmiany: • nierogowaciejący (wszystkie komórki nabłonka żywe) • rogowaciejący (komórki warstwy powierzchniowej martwe, przekształcone w sztywne płytki)
Odmiana nabłonka jednowarstwowego walcowatego - komórki różnej wysokości (niekiedy różne typy komórek) i/lub jądra na różnych poziomach, ale wszystkie komórki mają podstawy na tym samym poziomie (przylegają do blaszki podstawnej) Główne funkcje: ochrona, wydzielanie, funkcja zmysłowa
Główne funkcje: ochrona
Przykładowa lokalizacja: drogi oddechowe, najądrze, kubki smakowe
Nabłonek przejściowy (urotelium)
Przykładowa lokalizacja: • nierogowaciejący: jama ustna, przełyk, rogówka oka • rogowaciejący: naskórek
Inne nabłonki wielowarstwowe (rzadkie)
wielowarstwowy na powierzchni komórki baldaszkowate: • niekiedy dwujądrzaste • połączenia ścisłe i mechaniczne • specyficzna szczytowa błona komórkowa zawierająca sztywne białkowe płytki (białko uroplakina)
Główne funkcje: ochrona (szczelny - bariera osmotyczna, bardzo rozciągliwy) Lokalizacja: drogi moczowe
TYP dwuwarstwowy sześcienny
FUNKCJA kontrola transportu
wielowarstwowy ochronna, sześcienny lub wydzielnicza walcowaty
PRZYKŁADY LOKALIZACJI przewody wyprowadzające gruczołów potowych rejony przejściowe pomiędzy nabłonkiem wielowarstwowym płaskim a jednowarstwowym, walcowatym (nagłośnia, odbyt), spojówka, męska cewka moczowa, przewody wyprowadzające dużych gruczołów
5
Komórki nabłonkowe są spolaryzowane (biegunowe): mają powierzchnię szczytową, boczną i przypodstawną
Odnowa i regeneracja nabłonków
Powierzchnia szczytowa: - mikrokosmki, - migawki, - białka transportowe Powierzchnia boczna: - połączenia międzykomórkowe - kanaliki międzykomórkowe
Wszystkie nabłonki mają zdolność do szybkiej odnowy i zawierają niezróżnicowane komórki macierzyste • w nabłonkach jednowarstwowych „stare” komórki obumierają na drodze apoptozy i są zastępowane przez komórki różnicujące się z komórek macierzystych • w nabłonkach wielowarstwowych komórki stale migrują z warstw podstawnych do powierzchniowych, gdzie ulegają złuszczeniu
Powierzchnia przypodstawna: - połączenia komórka – substancja międzykomórkowa - białka transportowe - prążkowanie przypodstawne
Mikrokosmki Struktury występujące na szczytowej powierzchni komórek nabłonkowych:
mikrokosmki
• nieregularne • zawierają wiązki filamentów aktynowych • bardzo liczne, regularne = brzeżek szczoteczkowy
stereocylia
filamenty aktynowe
rzęski (migawki)
to wypustki cytoplazmy pokryte błoną komórkową i zawierające elementy cytoszkieletu
Stereocylia
Funkcja: zwiększają powierzchnię błony, ułatwiając wchłanianie (brzeżek szczoteczkowy jest typowy dla nabłonków resorbcyjnych)
sieć krańcowa
Rzęski (migawki)
to długie i grube mikrokosmki występujące na powierzchni niektórych komórek nabłonkowych (w najądrzu, nasieniowodzie i uchu wewnętrznym)
ciałko podstawne korzonek
• łodyga - część wystająca ponad powierzchnię, zawiera aksonemę (układ mikrotubul) • ciałko podstawne (= centriola) • korzonek - wiązka włókienek białkowych
6
Układ mikrotubul w aksonemie:
9 obwodowych dubletów 2 mikrotubule centralne
Skoordynowany ruch (metachronia) licznych rzęsek tworzących tzw. brzeżek migawkowy transportuje po powierzchni nabłonka różne obiekty:
neksyna
• śluz z przylepionymi cząstkami pyłów w drogach oddechowych • oocyty w jajowodzie • plemniki w męskich drogach rozrodczych
Ruch rzęsek generuje mechanoenzym dyneina, która przesuwa względem siebie pary mikrotubul, powodując czynne zgięcie rzęski. Elastyczna neksyna odpowiada za fazę bierną ruchu (powrót).
Połączenia międzykomórkowe Strefa zamykająca
Strefa zamykająca (połączenie ścisłe)
- połączenia ścisłe: strefa zamykająca (zonula occludens)
Strefa przylegania
Desmosom
- połączenia mechaniczne: strefa przylegania (zonula adhaerens) desmosom
- połączenia komunikacyjne: połączenie szczelinowe (neksus)
Połączenie szczelinowe
Błony sąsiadujących komórek są połączone za pośrednictwem stykających się ze sobą białek transbłonowych (białka łączące)
Białka łączące: klaudyny i okludyny
Połączenia mogą występować między komórkami wszystkich tkanek
Strefa: połączenie w formie ciągłego pasa otaczającego komórkę
Strefa zamykająca jest wzmocniona poprzez połączenie z filamentami aktynowymi
W mechanicznych połączeniach międzykomórkowych połączone są nie tylko błony komórkowe, ale również elementy cytoszkieletu (poprzez białka pośredniczące)
(pośredniczące) jony uczestniczące w połączeniu
filament aktynowy
białko ZO
klaudyna lub okludyna
Funkcje: • uszczelnienie przestrzeni międzykomórkowych (kontrola transportu) • bariera dla ruchu białek błonowych (polaryzacja komórki)
transbłonowe białka łączące
7
Desmosom
Strefa przylegania
filamenty aktynowe białka pośredniczące białka łączące: kadheryny strefa przylegania
białka łączące
białka łączące: desmogleiny
płytka desmosomowa zbudowana z białek pośredniczących
filamenty pośrednie
Forma lokalna: punkt przylegania
Połączenie szczelinowe (neksus)
Komórki tworzą również połączenia mechaniczne z substancją międzykomórkową (kontakty lokalne, półdesmosomy) filamenty aktynowe
filamenty pośrednie
jednostka: konekson
białka pośredniczące
białka łączące: koneksyny
białka łączące: integryny Kontakt lokalny Półdesmosomy
Funkcja: umożliwia bezpośrednie przechodzenie substancji niskocząsteczkowych (jonów, cząsteczek sygnałowych, ATP) pomiędzy połączonymi komórkami
Kompleksy połączeń międzykomórkowych Połączenia szczelinowe umożliwiają: • bezpośrednie przewodzenie bodźców elektrycznych między komórkami • szybką wymianę sygnałów chemicznych między komórkami • synchronizację procesów metabolicznych i różnicowania (sprzężenie metaboliczne)
Listewki graniczne (w niektórych nabłonkach jednowarstwowych): • strefa zamykająca • strefa przylegania • desmosom
Wstawki (pomiędzy komórkami mięśnia sercowego): Zamknięcie koneksonów i przerwanie komunikacji między komórkami następuje w warunkach zagrażających komórce (spadek pH, nadmierny wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+).
• strefy przylegania • desmosomy • neksusy
8
Prążkowanie przypodstawne
Blaszka podstawna - jedyna forma substancji międzykomórkowej w tkance nabłonkowej komórka nabłonkowa
• głębokie fałdy przypodstawnej błony komórkowej, zwiększające jej powierzchnię • w fałdach pionowo ułożone mitochondria
Funkcja: aktywny transport jonów przez błonę komórkową
blaszka jasna blaszka ciemna
Białka: • laminina • kolagen IV • entaktyna
integryny błona komórkowa
Proteoglikany: • perlekan Składniki blaszki podstawnej tworzą molekularną sieć
Funkcje blaszki podstawnej: • przytwierdza nabłonek do podłoża (poprzez połączenie z integrynami komórek nabłonkowych) • uczestniczy w regulacji przechodzenia substancji wysokocząsteczkowych do rejonu podnabłonkowego (filtr) • ukierunkowuje migrację komórek w procesach rozwoju i regeneracji Blaszki podstawne są też wytwarzane przez komórki innych tkanek Błona podstawna (w niektórych nabłonkach): blaszka podstawna + dodatkowa warstwa włóknisto-siatkowata wytworzona przez tkankę łączna (fibryle z kolagenu III, VII, fibryliny) komórka nabłonkowa blaszka podstawna
błona podstawna
• wewnątrzwydzielnicze: wydzielają do przestrzeni międzykomórkowej, skąd wydzielina (hormon) dostaje się do naczyń krwionośnych, a z krwią do odległych narządów (np. przysadka, tarczyca, nadnercza)
Nie posiadają przewodów wyprowadzających, nie są podzielone na jednostki wydzielnicze (wyjątek: tarczyca)
kolagen IV
laminina
entaktyna
perlekan
Gruczoły - zespoły komórek nabłonkowych o specjalizacji wydzielniczej Klasyfikacja: • zewnątrzwydzielnicze: kierują wydzielinę do określonego miejsca przez przewody wyprowadzające (np. ślinianki, trzustka, małe gruczoły w ścianie przewodu pokarmowego, dróg oddechowych, w skórze). Posiadają jednostki (odcinki) wydzielnicze i przewody wyprowadzające. Od każdego odcinka wydzielniczego odchodzi przewód wyprowadzający.
Morfologiczna klasyfikacja gruczołów zewnątrzwydzielniczych
1. Ze względu na kształt jednostek (odcinków) wydzielniczych: • cewkowe • pęcherzykowe cewkowy 2. Ze względu na układ odcinków wydzielniczych i przewodów wyprowadzających: • proste (nierozgałęziony odcinek wydzielniczy, pojedynczy przewód wyprowadzający) • rozgałęzione (rozgałęziony odcinek wydzielniczy) • złożone (rozgałęziony układ przewodów proste rozgałęziony wyprowadzających)
pęcherzykowy
złożony
9
Klasyfikacja gruczołów zewnątrzwydzielniczych ze względu na sposób wydzielania 1. Wydzielanie merokrynowe (ekrynowe) = egzocytoza Tak wydziela większość gruczołów 2. Wydzielanie apokrynowe Wydzielina lipidowa, nieotoczona błoną. Od szczytowych części komórek odrywają się pęcherzyki zawierające wydzielinę. Gruczoły apokrynowe (zapachowe) skóry, gruczoł mlekowy
3. Wydzielanie holokrynowe Komórki gromadzą wydzielinę, obumierają i rozpadają się na fragmenty. Gruczoły łojowe
10