W XIX wieku...

WITAMY NA KURSIE HISTOLOGII

W XXI wieku...

„Histologia to nauka o mikroskopowej budowie komórek, tkanek i narządów”

Nasz kurs:

„Histologia to nauka o powiązaniach struktury mikroskopowej, submikroskopowej i molekularnej komórek, tkanek i narządów z ich funkcją”

Dział: techniki mikroskopowe

Poprzez badanie funkcji komórek i tkanek, histologia jest częściowo zintegrowana z: • fizjologią • immunologią • biochemią • biologią molekularną

Dział: podstawy histologii tkanek i narządów

Podstawowe narzędzie badawcze: mikroskop

METODY PRZYGOTOWANIA MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO DO BADAŃ W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM – cz. I

Źródła wiedzy...

www.histologia.cm-uj.krakow.pl • regulamin kursu • prezentacje wykładowe • materiały uzupełniające • ogłoszenia • wyniki egzaminu • repetytorium praktyczne (obrazy preparatów)

wydanie z 2011 r.

1

.

TYPY PREPARATÓW: • skrawki • szlify (z tkanek zmineralizowanych) • rozmazy (z płynów ustrojowych i zawiesin komórkowych) • rozgnioty • odciski • preparaty całościowe • hodowle komórkowe

PREPARAT MIKROSKOPOWY: • przejrzysty (cienki) • zabarwiony (skontrastowany) • dobrze zachowana struktura

PIERWSZY CEL: UTRWALENIE (dobre zachowanie struktury)

Przygotowanie materiału biologicznego do badań mikroskopowych obejmuje kilka etapów, z których każdy służy osiągnięciu pewnego celu Co osiągamy przez utrwalenie materiału: • zapobieżenie autolizie poprzez inaktywację enzymów • wytrącenie i zachowanie niektórych substancji rozpuszczalnych • wstępne utwardzenie materiału

UTRWALANIE:

Chemiczne • aldehydy (formalina, ald. glutarowy)

immersyjne

DRUGI CEL: UTWARDZENIE I KROJENIE (tylko dla skrawków) Przepojenie substancją utwardzającą (zatapianie) • parafina • celoidyna • żywice akrylowe

• alkohole (metanol, etanol) • ketony (aceton) • kwasy (octowy, pikrynowy) • związki metali ciężkich (sublimat, czterotlenek osmu) Utrwalacze proste i złożone

Fizyczne: • mikrofale (często w kombinacji

Zamrożenie

z utrwalaczem chemicznym) perfuzyjne

2

Parafina, celoidyna i część żywic to substancje niepolarne (nie rozpuszczają się w wodzie). Przygotowywany materiał trzeba zatem stopniowo przeprowadzić ze środowiska polarnego (wodny roztwór utrwalacza) do niepolarnego (1) Odwadnianie – (alkohol etylowy lub aceton – szereg roztworów o wzrastającym stężeniu) (2) Płyny pośrednie – rozpuszczalne zarówno w środowisku odwadniającym jak i w substancji używanej do zatapiania - dla parafiny: rozpuszczalniki organiczne (ksylen, benzen, chloroform) - dla celoidyny: roztwór alkoholu i eteru, octan amylu (3) Zatapianie

Utrwalone próbki tkanek umieszcza się w specjalnych „kasetkach” i przeprowadza przez kolejne płyny albo ręcznie, albo automatycznie w tzw. procesorach tkankowych

Zestalenie zatopionego materiału:

ZAMRAŻANIE (technika mrożeniowa)

• parafina – ochłodzenie • celoidyna – odparowanie rozpuszczalnika • żywice – polimeryzacja

Podczas zamrażania woda w materiale biologicznym ulega krystalizacji.

Tworzy się „bloczek” z zatopionym materiałem, który można kroić na skrawki

Najmniejsze kryształki, nie uszkadzające struktury komórek i tkanek tworzą się przy bardzo szybkim zamrożeniu do bardzo niskiej temperatury. Dlatego do zamrażania stosujemy: • ciekłe gazy (azot, hel) • zestalony CO2 (tzw. suchy lód) • zamrożoną listwę metalową w kriostacie Można zamrażać i kroić materiał nieutrwalony – technika mrożeniowa umożliwia najszybsze uzyskanie preparatów

DO KROJENIA SKRAWKÓW SŁUŻĄ MIKROTOMY

Podczas krojenia skrawków parafinowych tworzy się „wstęga”

Mikrotom rotacyjny do skrawków parafinowych • stolik przedmiotowy • nóż • mechanizm przesuwu stolika względem noża

skrawki parafinowe: 2-10 µm skrawki z żywic: 0.5-2.0 µm

3

Kriostat służy do krojenia skrawków z zamrożonego materiału Mikrotom umieszczony w komorze o regulowanej temperaturze ujemnej

HISTOLOGIA OGÓLNA (TKANKI) Elementy składowe tkanki: • komórki (o podobnym pochodzeniu, zbliżonej strukturze i funkcji) • substancja międzykomórkowa (produkowana przez komórki)

Temperatura krojenia: od -15°C do -25°C

skrawki mrożeniowe: 4-10 µm

Główne rodzaje tkanek zwierzęcych: • tkanka nabłonkowa • tkanka łączna • tkanka mięśniowa • tkanka nerwowa

FORMY: • wyściółki (pokrywające zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie organizmu)

• gruczoły (zespoły komórek nabłonkowych pełniących funkcje wydzielnicze)

Tkanka nabłonkowa

Nabłonki nie zawierają naczyń krwionośnych! FUNKCJE: • ochronna (np. naskórek) • resorbcyjna (np. nabłonek jelitowy) • wydzielnicza (np. gruczoły) • regulacja transportu przez nabłonek (np. śródbłonek wyścielający naczynia krwionośne) • zmysłowa (np. kubki smakowe) W obrębie jednego nabłonka mogą występować różne typy komórek pełniące różne funkcje

KLASYFIKACJA NABŁONKÓW

Nabłonek jednowarstwowy płaski

• liczba warstw: - jednowarstwowe - wielowarstwowe • kształt komórek: - płaskie - sześcienne - walcowate Główne funkcje: kontrola transportu W klasyfikacji należy zawsze uwzględniać oba kryteria W nabłonkach wielowarstwowych kształt komórek dotyczy warstwy powierzchniowej

Przykładowa lokalizacja: naczynia (śródbłonek), pęcherzyki płucne (pneumocyty), opłucna i otrzewna (międzybłonek)

4

Nabłonek jednowarstwowy sześcienny

Nabłonek jednowarstwowy walcowaty

Główne funkcje: wchłanianie, wydzielanie Przykładowa lokalizacja: kanaliki nerkowe, gruczoły i ich przewody

Główne funkcje: wchłanianie, wydzielanie, kontrola transportu, ochrona Przykładowa lokalizacja: przewód pokarmowy, drogi żółciowe, żeńskie drogi rozrodcze, duże przewody wyprowadzające gruczołów

Nabłonek wieloszeregowy (wielorzędowy)

Nabłonek wielowarstwowy płaski Odmiany: • nierogowaciejący (wszystkie komórki nabłonka żywe) • rogowaciejący (komórki warstwy powierzchniowej martwe, przekształcone w sztywne płytki)

Odmiana nabłonka jednowarstwowego walcowatego - komórki różnej wysokości (niekiedy różne typy komórek) i/lub jądra na różnych poziomach, ale wszystkie komórki mają podstawy na tym samym poziomie (przylegają do blaszki podstawnej) Główne funkcje: ochrona, wydzielanie, funkcja zmysłowa

Główne funkcje: ochrona

Przykładowa lokalizacja: drogi oddechowe, najądrze, kubki smakowe

Nabłonek przejściowy (urotelium)

Przykładowa lokalizacja: • nierogowaciejący: jama ustna, przełyk, rogówka oka • rogowaciejący: naskórek

Inne nabłonki wielowarstwowe (rzadkie)

wielowarstwowy na powierzchni komórki baldaszkowate: • niekiedy dwujądrzaste • połączenia ścisłe i mechaniczne • specyficzna szczytowa błona komórkowa zawierająca sztywne białkowe płytki (białko uroplakina)

Główne funkcje: ochrona (szczelny - bariera osmotyczna, bardzo rozciągliwy) Lokalizacja: drogi moczowe

TYP dwuwarstwowy sześcienny

FUNKCJA kontrola transportu

wielowarstwowy ochronna, sześcienny lub wydzielnicza walcowaty

PRZYKŁADY LOKALIZACJI przewody wyprowadzające gruczołów potowych rejony przejściowe pomiędzy nabłonkiem wielowarstwowym płaskim a jednowarstwowym, walcowatym (nagłośnia, odbyt), spojówka, męska cewka moczowa, przewody wyprowadzające dużych gruczołów

5

Komórki nabłonkowe są spolaryzowane (biegunowe): mają powierzchnię szczytową, boczną i przypodstawną

Odnowa i regeneracja nabłonków

Powierzchnia szczytowa: - mikrokosmki, - migawki, - białka transportowe Powierzchnia boczna: - połączenia międzykomórkowe - kanaliki międzykomórkowe

Wszystkie nabłonki mają zdolność do szybkiej odnowy i zawierają niezróżnicowane komórki macierzyste • w nabłonkach jednowarstwowych „stare” komórki obumierają na drodze apoptozy i są zastępowane przez komórki różnicujące się z komórek macierzystych • w nabłonkach wielowarstwowych komórki stale migrują z warstw podstawnych do powierzchniowych, gdzie ulegają złuszczeniu

Powierzchnia przypodstawna: - połączenia komórka – substancja międzykomórkowa - białka transportowe - prążkowanie przypodstawne

Mikrokosmki Struktury występujące na szczytowej powierzchni komórek nabłonkowych:

mikrokosmki

• nieregularne • zawierają wiązki filamentów aktynowych • bardzo liczne, regularne = brzeżek szczoteczkowy

stereocylia

filamenty aktynowe

rzęski (migawki)

to wypustki cytoplazmy pokryte błoną komórkową i zawierające elementy cytoszkieletu

Stereocylia

Funkcja: zwiększają powierzchnię błony, ułatwiając wchłanianie (brzeżek szczoteczkowy jest typowy dla nabłonków resorbcyjnych)

sieć krańcowa

Rzęski (migawki)

to długie i grube mikrokosmki występujące na powierzchni niektórych komórek nabłonkowych (w najądrzu, nasieniowodzie i uchu wewnętrznym)

ciałko podstawne korzonek

• łodyga - część wystająca ponad powierzchnię, zawiera aksonemę (układ mikrotubul) • ciałko podstawne (= centriola) • korzonek - wiązka włókienek białkowych

6

Układ mikrotubul w aksonemie:

9 obwodowych dubletów 2 mikrotubule centralne

Skoordynowany ruch (metachronia) licznych rzęsek tworzących tzw. brzeżek migawkowy transportuje po powierzchni nabłonka różne obiekty:

neksyna

• śluz z przylepionymi cząstkami pyłów w drogach oddechowych • oocyty w jajowodzie • plemniki w męskich drogach rozrodczych

Ruch rzęsek generuje mechanoenzym dyneina, która przesuwa względem siebie pary mikrotubul, powodując czynne zgięcie rzęski. Elastyczna neksyna odpowiada za fazę bierną ruchu (powrót).

Połączenia międzykomórkowe Strefa zamykająca

Strefa zamykająca (połączenie ścisłe)

- połączenia ścisłe: strefa zamykająca (zonula occludens)

Strefa przylegania

Desmosom

- połączenia mechaniczne: strefa przylegania (zonula adhaerens) desmosom

- połączenia komunikacyjne: połączenie szczelinowe (neksus)

Połączenie szczelinowe

Błony sąsiadujących komórek są połączone za pośrednictwem stykających się ze sobą białek transbłonowych (białka łączące)

Białka łączące: klaudyny i okludyny

Połączenia mogą występować między komórkami wszystkich tkanek

Strefa: połączenie w formie ciągłego pasa otaczającego komórkę

Strefa zamykająca jest wzmocniona poprzez połączenie z filamentami aktynowymi

W mechanicznych połączeniach międzykomórkowych połączone są nie tylko błony komórkowe, ale również elementy cytoszkieletu (poprzez białka pośredniczące)

(pośredniczące) jony uczestniczące w połączeniu

filament aktynowy

białko ZO

klaudyna lub okludyna

Funkcje: • uszczelnienie przestrzeni międzykomórkowych (kontrola transportu) • bariera dla ruchu białek błonowych (polaryzacja komórki)

transbłonowe białka łączące

7

Desmosom

Strefa przylegania

filamenty aktynowe białka pośredniczące białka łączące: kadheryny strefa przylegania

białka łączące

białka łączące: desmogleiny

płytka desmosomowa zbudowana z białek pośredniczących

filamenty pośrednie

Forma lokalna: punkt przylegania

Połączenie szczelinowe (neksus)

Komórki tworzą również połączenia mechaniczne z substancją międzykomórkową (kontakty lokalne, półdesmosomy) filamenty aktynowe

filamenty pośrednie

jednostka: konekson

białka pośredniczące

białka łączące: koneksyny

białka łączące: integryny Kontakt lokalny Półdesmosomy

Funkcja: umożliwia bezpośrednie przechodzenie substancji niskocząsteczkowych (jonów, cząsteczek sygnałowych, ATP) pomiędzy połączonymi komórkami

Kompleksy połączeń międzykomórkowych Połączenia szczelinowe umożliwiają: • bezpośrednie przewodzenie bodźców elektrycznych między komórkami • szybką wymianę sygnałów chemicznych między komórkami • synchronizację procesów metabolicznych i różnicowania (sprzężenie metaboliczne)

Listewki graniczne (w niektórych nabłonkach jednowarstwowych): • strefa zamykająca • strefa przylegania • desmosom

Wstawki (pomiędzy komórkami mięśnia sercowego): Zamknięcie koneksonów i przerwanie komunikacji między komórkami następuje w warunkach zagrażających komórce (spadek pH, nadmierny wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+).

• strefy przylegania • desmosomy • neksusy

8

Prążkowanie przypodstawne

Blaszka podstawna - jedyna forma substancji międzykomórkowej w tkance nabłonkowej komórka nabłonkowa

• głębokie fałdy przypodstawnej błony komórkowej, zwiększające jej powierzchnię • w fałdach pionowo ułożone mitochondria

Funkcja: aktywny transport jonów przez błonę komórkową

blaszka jasna blaszka ciemna

Białka: • laminina • kolagen IV • entaktyna

integryny błona komórkowa

Proteoglikany: • perlekan Składniki blaszki podstawnej tworzą molekularną sieć

Funkcje blaszki podstawnej: • przytwierdza nabłonek do podłoża (poprzez połączenie z integrynami komórek nabłonkowych) • uczestniczy w regulacji przechodzenia substancji wysokocząsteczkowych do rejonu podnabłonkowego (filtr) • ukierunkowuje migrację komórek w procesach rozwoju i regeneracji Blaszki podstawne są też wytwarzane przez komórki innych tkanek Błona podstawna (w niektórych nabłonkach): blaszka podstawna + dodatkowa warstwa włóknisto-siatkowata wytworzona przez tkankę łączna (fibryle z kolagenu III, VII, fibryliny) komórka nabłonkowa blaszka podstawna

błona podstawna

• wewnątrzwydzielnicze: wydzielają do przestrzeni międzykomórkowej, skąd wydzielina (hormon) dostaje się do naczyń krwionośnych, a z krwią do odległych narządów (np. przysadka, tarczyca, nadnercza)

Nie posiadają przewodów wyprowadzających, nie są podzielone na jednostki wydzielnicze (wyjątek: tarczyca)

kolagen IV

laminina

entaktyna

perlekan

Gruczoły - zespoły komórek nabłonkowych o specjalizacji wydzielniczej Klasyfikacja: • zewnątrzwydzielnicze: kierują wydzielinę do określonego miejsca przez przewody wyprowadzające (np. ślinianki, trzustka, małe gruczoły w ścianie przewodu pokarmowego, dróg oddechowych, w skórze). Posiadają jednostki (odcinki) wydzielnicze i przewody wyprowadzające. Od każdego odcinka wydzielniczego odchodzi przewód wyprowadzający.

Morfologiczna klasyfikacja gruczołów zewnątrzwydzielniczych

1. Ze względu na kształt jednostek (odcinków) wydzielniczych: • cewkowe • pęcherzykowe cewkowy 2. Ze względu na układ odcinków wydzielniczych i przewodów wyprowadzających: • proste (nierozgałęziony odcinek wydzielniczy, pojedynczy przewód wyprowadzający) • rozgałęzione (rozgałęziony odcinek wydzielniczy) • złożone (rozgałęziony układ przewodów proste rozgałęziony wyprowadzających)

pęcherzykowy

złożony

9

Klasyfikacja gruczołów zewnątrzwydzielniczych ze względu na sposób wydzielania 1. Wydzielanie merokrynowe (ekrynowe) = egzocytoza Tak wydziela większość gruczołów 2. Wydzielanie apokrynowe Wydzielina lipidowa, nieotoczona błoną. Od szczytowych części komórek odrywają się pęcherzyki zawierające wydzielinę. Gruczoły apokrynowe (zapachowe) skóry, gruczoł mlekowy

3. Wydzielanie holokrynowe Komórki gromadzą wydzielinę, obumierają i rozpadają się na fragmenty. Gruczoły łojowe

10