UNIVERSIDAD DE COLIMA

TRANSPLANTE SEGMENTARIO DE MEDULA ESPINAL A NIVEL CERVICAL CON INTEGRIDAD DE LA ARTERIA ESPINAL ANTERIOR. ESTUDIO REALIZADO EN PERROS.

TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS MEDICAS

M. en C. WADIH EMILIO BITAR ALATORRE

ASESOR UNIV. DE COLIMA : Dr. en Cs. MIGUEL HUERTA VIERA ASESOR IMSS : Dr. en Cs. CARLOS BEAS ZARATE

Colima, Col. Enero, 2002

DEDICATORIAS

A mi esposa Kathy e hijos Gina y Michel, por su gran amor, apoyo y comprensión.

A mis padres Emilio y Estela, por ser mis primeros y permanentes maestros y amigos.

A mis hermanos Anuar, Emely, Compy y Farid, por su amor profundo y estímulo constante.

A mi abuelita de Guadalajara, por inculcar en mi el determinismo ante la vida: “ El que quiere, puede “.

A Mom, Steve, Craig, Ana, Jan Carlo y Elán, por su gran apoyo y profundo cariño.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Miguel Huerta Viera y al Dr. Carlos Beas Zárate, por su apoyo y tutoría del presente trabajo de investigación. Al Dr. Benjamín Trujillo Hernández, por su enseñanza en la coordinación del Doctorado, así mismo a la a la Lic. Ana Isabel Ceballos y a las señoritas Patricia y Ofelia, secretarias de la Facultad de Medicina de la Universidad de Colima por su gran apoyo administrativo. Al Dr. Genaro Gabriel Ortiz, Dr. Sergio Rosales, Sra. Margarita Jáuregui y a la Sra. Magda García por su apoyo en la realización de los estudios histológicos. Al Dr. David García, por su gran apoyo profesional. Al Dr. José Blanco, Dr. Alberto Ramos, Dr. Waldo del Regil, Dr. Javier Muñoz y a Salvador Cuarenta así como a todo el personal de Bioterio, por su apoyo en la preparación y cuidados de mis casos. Al Personal de enfermería de la división quirúrgica del CIBO, por su colaboración durante los procedimientos quirúrgicos. Al personal del laboratorio de Neurobiología celular y molecular, en especial a Mario Flores y Cesar Soria, por su apoyo y colaboración. Al Ing. Rogelio Troyo, por su apoyo estadístico. Al Dr. Gustavo Velarde, por su apoyo en los estudios de conducción eléctrica. Al Sr. Mario Aguilar, por su apoyo en fotografía. Al Dr. Ignacio González Burgos y Colaboradores, por permitirme trabajar en su laboratorio con el analizador de imágenes. A la Dra. Alma Rosa del Angel, Jefe de División de Neurociencias IMSS, por su gran apoyo durante el doctorado. Al Dr. José Sánchez Corona,

Director del CIBO, IMSS, por facilitarme el

camino para la realización de éste trabajo de investigación. Al Dr. Jesús García Pérez, Coordinador Delegacional de Investigación en Salud. IMSS, Jalisco. Al Dr. Ramón Paniagua, Jefe de área de formación de personal para la investigación. Nivel Central, IMSS, por su gran apoyo y confianza en todos mis avances durante la maestría y el doctorado.

INDICE RESUMEN__________________________________________1 -

Español

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Inglés

I. INTRODUCCION_____________________________________5

1. EMBRIOLOGIA DE LA MEDULA ESPINAL______________________6 DESARROLLO DE LOS SOMITAS -

Neurulación

-

Canalización

-

Diferenciación retrogresiva

2. ESTRUCTURA DE LA MEDULA ESPINAL______________________11 ANATOMIA DE LA MEDULA ESPINAL -

Meninges

-

Raíces nerviosas

-

Nervios espinales

-

Ramos ventrales

-

Ramos dorsales PRINCIPALES HACES DE FIBRAS DE LA MEDULA ESPINAL

-

Vías ascendentes

-

Vías descendentes

-

Vías propiospinales ARTERIAS DE LA MEDULA ESPINAL

-

Arterias radiculares

-

Arteria espinal anterior

-

Arteria de Adamkiewicz

-

Ramas centrales de la arteria espinal anterior

-

Arterias espinales posteriores

-

Plexo arterial pial

3. LOCALIZACION Y PAPEL DE LOS RECEPTORES A GLUTAMICO NMDA____________________________________________________28 -

Receptores para GLUTAMATO

-

Receptor a KAINATO

-

Receptor a AMPA

-

Receptor a NMDA

II. ANTECEDENTES CIENTIFICOS_______________________________32 III.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA______________________38

IV.

HIPOTESIS__________________________________________39

V.

OBJETIVOS _________________________________________40 1. OBJETIVO GENERAL 2. OBJETIVOS PARTICULARES

VI.

MATERIAL Y METODOS_______________________________41 1. ASIGNACION DE CASOS Y METODOLOGIA QUIRURGICA 2. TECNICA QUIRURGICA 3. EVALUACION CLINICA 4. POTENCIALES EVOCADOS SOMATO-SENSORIALES 5. ESTUDIOS HISTOLOGICOS 6. ESTUDIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR METODOLOGIA: 6. 1 OBTENCION DEL TEJIDO 6. 2 OBTENCION Y CUANTIFICACION DEL RNA TOTAL 6. 3 DETERMINACION ESPECTROFOTOMETRICA DE LA CANTIDAD Y CALIDAD DEL RNA 6. 4 RETROTRANSCRIPCION Y REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA ( RT-PCR ) 7. ANALISIS ESTADISTICO

VII.

RESULTADOS____________________________________________52 TRANSPLANTE- SECCION 1. CLINICOS 2. POTENCIALES EVOCADOS SOMATO-SENSORIALES (PESS) 3. HISTOLOGICOS 4. EXPRESION DE LAS SUB-UNIDADES DEL RECEPTOR NMDA

VIII.

DISCUSION______________________________________________76

IX.

CONCLUSIONES__________________________________________80

X.

CITAS BIBLIOGRAFICA_____________________________________81

RESUMEN En los Estados Unidos la incidencia de lesión de la médula espinal es de aproximadamente 10,000 casos nuevos por año. Las estrategias para prevenir el daño medular o salvar algunos dermatomas tiene efectos significativos en la recuperación funcional. En trabajos previos; la sección del 50% de la médula espinal y de la arteria espinal anterior a nivel cervical reproduce el fenómeno de cuadriplegia; esto ha sido demostrado experimentalmente en perros. Por otro lado, la sección del 50% sin afectar la vascularidad, no provocó una lesión neurológica irreversible. Se demostró también que existe un tiempo crítico de isquemia en casos igualmente de sección medular del 50% y que corresponde a 3 horas, permitiendo una recuperación clínica en un promedio de 23 días. Con el propósito de demostrar que el transplante homólogo de tejido medular permite la recuperación funcional después de una sección traumática del 50% a nivel de C5-C6, con preservación de la arteria espinal anterior. Se utilizaron 2 grupos de 8 perros cada uno machos, adultos de 25 a 30 kg de peso, a los que se les practicó sección medular del 50% ( mitad derecha ) a nivel de C5-C6, correspondiente al plano antero-posterior, sin comprometer la vascularidad de la arteria espinal anterior; se tomaron 4 mm de tejido medular correspondiente al área de la sección e integrándose en el sitio similar tomado de un animal donador. GRUPO A; grupo de Transplante Homólogo de médula espinal y GRUPO B, el correspondiente al de Sección Medular pura, sin transplante. El grupo A se dividió en agudo y crónico, teniendo para cada subgrupo 4 animales. De los 4 casos agudos, los resultados fueron evaluados de la siguiente manera: 2 de ellos para Microscopía Optica y 2 casos para estudios moleculares, (Expresión del Receptor de NMDA, sub-Unidades NR1, NR2A, NR2B y NR2C). De los casos crónicos se evaluó la Evolución Clínica y el mismo protocolo del grupo agudo, a las 4 semanas de evolución post- operatoria. El grupo B de Sección Pura, que contó con el mismo número de animales, se evaluó con los estándares similares al grupo transplantado. 1

Se estudiaron 2 casos Basales, sin lesión, para cada Grupo. Los resultados muestran que en el Grupo de Transplante se obtuvo coordinación total de 16.25 días, en el Grupo de Sección medular fue de 8.25 días en promedio, de acuerdo a la Escala de Daniels y la Clasificación de Frankel. Con los estudios de potenciales evocados somato-sensoriales, no se obtuvo diferencia significativa entre los Grupos de Transplante y Sección medular. La evaluación histológica indica cambios simultáneos de degeneración y de regeneración axonal que se manifiestan en las zonas contralateral y distal respecto al transplante. Estudios de Biología Molecular: Mediante las sub-unidades NR1, NR2A y NR2C del receptor NMDA, se observaron cambios en la expresión del receptor en los casos de Transplante agudo en donde la disminución de las sub-unidades fue evidente, al igual que el aumento de las mismas en el grupo de Transplante crónico en las áreas contralateral y distal a la lesión. Estos resultados sugieren que existe una etapa de degeneración axonal, la cual se manifiesta por la disminución o ausencia de las sub-unidades del receptor y una etapa de regeneración axonal graduada por la presencia de nuevos vasos sanguíneos y por el aumento de las sub-unidades del receptor NMDA. El transplante hómologo de medula espinal, permite la recuperación funcional después de una resección traumática a nivel de C5-C6, con preservación de la arteria espinal anterior.

PALABRAS CLAVE: Médula espinal, Arteria Espinal Anterior, Estudios Moleculares,, N-metil-D-Aspartato (NMDA), Potenciales Evocados Somato sensoriales (PESS).

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ABSTRACT

In the United States, the occurrence of spinal cord injury is approximately 10,000 new cases in a year. The strategies to prevent the damage or to salvage some dermatomes have significant effects in the functional recuperation. In previous studies, the section of 50% of the spinal cord and the anterior spinal artery at a cervical level reproduce quadriplegia; this has been demonstrated experimentally in dogs. On the other hand, a section of 50% without affecting vascularity, did not cause an irreversible neurological lesion. It has also been demonstrated that a critical time of ischemia

exists in the cases with 50%

section of the spinal cord; that time corresponds to three hours, permitting a clinical recuperation in an average time of 23 days. This present research has as it’s main objective

to demonstrate that the

homologous transplant of medullar tissue permits the functional recuperation after a traumatic section of 50% at the level of C5- C6, with the preservation of the anterior spinal artery. Two groups of eight male,adult dogs where made, each weighing between 25 to 30 kilograms. In each case, a medullar section of 50% was performed (on the half right side) at the level of C5-C6, corresponding to the antero-posterior plane, without compromising the vascularity of the anterior spinal artery; 4 mm of medullar tissue was taken corresponding to the area of the section and being integrated in the similar place taken from a donor animal. From both groups: considered as GROUP A; a group of homologous transplant of spinal cord and the second, GROUP B, corresponding to the group of medullar section, without transplant. Group A was subdivided into acute and chronic, having 4 animals for each sub group. From the 4 acute cases, the results were evaluated in the following way: 2 of them for Optic Microscopy and 2 cases for molecular studies, (Expression of the NMDA Receptor, Sub-Units NR1, NR2A, NR2B and NR2C).

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From the chronic cases, the clinical evolution was evaluated and the same protocol of the acute group, was made at 4 weeks of post-operative evolution. In Group B of spinal cord section, using the same number of animals, it was evaluated with similar standards than the transplanted group. 2 cases of basal control were performed without injury for each group. The results show that in the transplant Group a total coordination was obtained in 16.25 days, in the spinal section group in 8.25 days in average, this in relation to the Daniels Scale and Frankel’s Classification. With the evaluation of the somato-sensorial evoked potentials, there was not a significant difference between both groups of transplant and medullar section. The histological evaluation shows simultaneous changes of degeneration and axonal regeneration which are manifest in the contralateral and distal zones with respect to the transplant. Mollecular biology studies: With the sub-units NR1, NR2A y NR2C of the NMDA receptor, changes of the receptor expression were observed in the acute transplant cases where the reduction of the sub-units was evident the same as the recuperation of the same units in the chronical transplant group, evident in the contralateral and distal areas of the injury. These results suggest that a stage of axonal degeneration exists, which manifests itself by reduction or absence of the receptor sub-units and a stage of graduated axonal regeneration by the presence of new vessels and by the increase of the sub-units of the NMDA receptor. The homologous transplant of spinal cord tissue permits the functional recuperation after a traumatic 50% resection at the level of C5-C6 with preservation of the anterior spinal artery.

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I. INTRODUCCION

Conociendo la estructura de la médula espinal a nivel cervical y la importancia del flujo vascular dado por la arteria espinal anterior, la cual nutre los dos tercios anteriores de la misma, que por ende corresponde a la actividad motora. La expectativa en este estudio es tanto la recuperación de las funciones neurológicas como de al menos la mejoría de los niveles o dermatomas secundarios a la lesión medular producto del trauma agudo. Son bien conocidas las consecuencias de una lesión medular traumática aguda a nivel cervical, así como el tratamiento o tratamientos actuales reales a nivel de la clínica. De estos últimos, se consideran la estabilidad de la fractura con o sin descompresión mediante laminectomía, el manejo de la vejiga neurogénica, la rehabilitación temprana con transposición tendinosa en algunos casos y la estimulación eléctrica periférica. A pesar de estos aspectos, los resultados clínicos aún dejan mucho que desear ya que no existe un procedimiento médico o quirúrgico que ofrezca por sí mismo una recuperación neurológica. El primer caso de lesiones medulares data de 3000 años A.C., en la época del Médico y Arquitecto Imoteph, quien describió un caso de la siguiente manera Paciente que mientras sufrió una dislocación de una vértebra de su cuello, sus brazos y piernas permanecían dormidas cuando su orina goteaba, una patología que no podía ser tratada ! (1). En 1911, Allen fue el primero en describir la evolución de los cambios patológicos en perros. A los 15 minutos ocurría una hemorragia petequial en la materia gris así como edema de la materia blanca. A las 2 horas la hemorragia se incrementaba y para las 4 horas se encontraba inflamación y edema de los cilindros del axis (2). La incidencia de lesión de la médula espinal en los Estados Unidos es aproximadamente de diez mil casos nuevos por año. Las estrategias para prevenir el daño o salvar algunos dermatomas pueden tener efectos significativos en los resultados (3).

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En trabajos previos(4) (5), se demostró experimentalmente que la sección del 50% de la médula espinal y de la arteria espinal anterior, a nivel cervical reproduce el fenómeno de cuadriplegia. Por otro lado, la sección del 50% de la médula espinal, sin afectar la vascularidad de la arteria espinal anterior no es suficiente para provocar una lesión neurológica irreversible, aún cuando en los primeros días post-sección se hayan presentado datos clínicos de cuadriplegia, los animales se recuperaron espontáneamente y de manera progresiva. Demostramos también que el tiempo crítico de isquemia en un modelo de sección medular traumática aguda del 50% a nivel cervical es menor a las cuatro horas. Por estas experiencias sugerimos que la circulación medular hacia la porción motora, juega un papel fundamental en la reversión del trauma medular. En el presente trabajo demostramos que la reparación micro-quirúrgica de la arteria espinal anterior, permite la recuperación neurológica clínica en un promedio de 23 días.

I.1 EMBRIOLOGIA DE LA MEDULA ESPINAL

DESARROLLO DE LOS SOMITAS En las fases más tempranas, el disco embrionario posee dos capas, el ectodermo, sobre la futura cara dorsal con la cavidad amniótica sobre un lado, y el endodermo, que en la parte ventral forma el techo del saco vitelino (día 12 de la edad de gestación). En la extremidad craneal del disco embrionario de dos capas, estas se fusionan formando la lamina precordal. En la parte caudal, el ectodermo forma la estría primitiva. Inmediatamente el sentido craneal a la estría primitiva, las células se engruesan formando el nudo primitivo o nódulo de Hensen. En el centro de este nódulo, las células se invaginan para formar el hoyuelo primitivo, que es el equivalente del blastoporo de los animales inferiores. A partir del hoyuelo primitivo las células emigran entre el ectodermo y el endodermo en dirección craneal, formando la prolongación de la notocorda, que crece para reunirse con la placa precordal. Al propio tiempo, las células emigran a partir de la estría primitiva entre el ectodermo y el endodermo alrededor de la

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placa de la notocorda en sentido craneal, para formar la tercera capa embrionaria el día 18. El hoyuelo primitivo profundiza en la sólida prolongación de la notocorda, que se convierte ahora en tubular. La prolongación de la notocorda llega a disponerse directamente en contacto con el saco vitelino, formando un surco en el techo del saco vitelino que es la placa de la notocorda. Por consiguiente, en esta fase existe una comunicación directa entre el saco vitelino y la cavidad amniótica a través de la prolongación de la notocorda y el hoyuelo primitivo. Esta conexión se denomina conducto neuroentérico. Puede tener relevancia en lo que se refiere al desarrollo de afecciones como la diastematomielia. Se desconoce la fase exacta y el lugar de cierre del hoyuelo primitivo y de la desaparición del nódulo de Hensen. El endodermo en cada lado de la placa de la notocorda se encurva hasta que hace contacto y se reúne para formar la verdadera notocorda. Este proceso empieza en sentido craneal y progresa en sentido caudal, y se completa hacia el término de cuatro semanas o cuando se alcanza la fase de 25 somitas con una longitud de 4mm de la coronilla a la rabadilla (C-R). La verdadera notocorda produce el engrosamiento del ectodermo suprayacente para formar la placa neural. Cuando se han desarrollado la notocorda y el tubo neural, el mesodermo intraembrionario se dispone como una capa completa entre el ectodermo y el endodermo. Este mesodermo se engruesa para formar dos columnas paramedias longitudinales denominadas mesodermo paraxial. En la parte lateral, el mesodermo se diferencia en mesodermo intermedio y placa mesodérmica lateral. El mesodermo intermedio da lugar al sistema genitourinario, y la placa mesodérmica lateral se continúa con el mesodermo de la somatopleura que reviste la cavidad amniótica y la esplacnopleura que reviste el saco vitelino. Empezando en el vigésimo día de la gestación, las células del mesodermo paraxial sufren un proceso de segmentación. Se forman los somitas y están separados por fisuras intersegmentarias. Los primeros somitas craneales aparecen en la porción media del embrión en un punto inmediatamente caudal a la extremidad craneal de la notocorda. A causa del predominio del desarrollo cefálico que sigue a esta fase, la región en donde por vez primera aparecen los

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somitas corresponde a la futura área occipital. El proceso de segmentación prosigue en dirección cráneo caudal, y hacia el término de la quinta semana se han formado 42 somitas. En la superficie externa del embrión, estos somitas son visibles en forma de una serie de “cuentas” prominentes junto a la superficie dorsolateral del embrión. En un corte, los somitas presentan forma de cuña con una cavidad central, el miocele. Durante esta fase de somita, los somitas craneales más antiguos muestran cierto grado de especialización interna. Las células situadas en sentido dorsolateral con respecto al miocele, junto con las células que proliferan en esta cavidad primitiva, forman las cubiertas de la piel. Las células más internas forman la musculatura dorsal. Estas células emigran entre el endodermo y el ectodermo para formar los músculos paravertebrales y se combinan con la somatopleura para constituir los músculos de los miembros y de la pared abdominal. La masa de células ventrointerna forma el esclerotoma. Estas células emigran en sentido interno hacia el tubo neural y la notocorda para formar la columna vertebral.

Existen tres fases de desarrollo de la médula espinal: 1. Neurulación, que es la formación de la mayor parte de la médula espinal y del cerebro en sentido craneal. 2. Canalización. 3. Diferenciación retrogresiva.

Neurulación Aproximadamente hacia el décimo séptimo a décimo noveno día tiene lugar la primera diferenciación hacia la formación de un sistema nervioso. Las células de la línea media del ectodermo (placa neural) se especializan como ectodermo y el proceso de neurulación separa estas células de la cavidad amniótica formando una cubierta completa de ectodermo. La placa neural de hunde hacia dentro, presenta surcos y sus bordes laterales se incurvan para unirse en la línea media

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dorsal y

formar el tubo neural. Este tubo está formado probablemente por

migración de células en esta área. El proceso prosigue en sentido craneal y caudal hasta un tubo cerrado con aberturas craneal y caudal. Las células a nivel de la unión de la placa neural y del ectodermo están especializadas y llegan a desprenderse del tubo neural y del ectodermo para formar una masa de células dispuesta sobre el lado dorsal del tubo neural; es la cresta neural. Estas células están especializadas y forman las células ganglionares espinales dorsales. Aproximadamente 3 días después, los tubos neurales empiezan a fusionarse y la porción craneal del tubo neural se diferencia para formar el cerebro. Los pliegues neurales continúan cerrándose en sentido rostral y el lugar del cierre final es el neuroporo anterior. Esto ocurre en la fase de 13 a 20 somitas, y ahora el conducto central del tubo neural se continúa con la cavidad amniótica a través del neuroporo posterior. El neuroporo posterior se cierra dos días más tarde en la fase de 21 a 29 somitas. Este suele localizarse a nivel del cierre aproximadamente en la I o II vértebra lumbar con variaciones de dos o más segmentos en sentido craneal o caudal, es decir, de DXI-LIV. Cuando se cierra el neuroporo posterior, se completa la fase inicial de la formación del tubo neural y se ocluyen por completo las cavidades internas del sistema nervioso. Falta ahora la comunicación entre el canal central y la cavidad amniótica.

Canalización Con el cierre completo del tubo neural no se desarrollan los segmentos lumbar inferior, sacro y coccígeo. La diferenciación en esta área está menos bien descrita que el proceso de neurulación. Estudios recientes sugieren que el proceso es similar al que tiene lugar en los pájaros, que experimentan canalización de la masa de células caudales y diferenciación retrogresiva. En la extremidad caudal del tubo neural y de la notocorda existe un voluminoso agregado de células indiferenciadas, que se extienden al interior del primitivo pliegue de la cola. En esta fase, las únicas estructuras en esta región son el mesonefros y el intestino posterior. Algunas de las células indiferenciadas cerca

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de la extremidad del tubo neural se orientan por sí mismas alrededor de pequeñas vacuolas (día 22 a 23). Estas células indiferenciadas alrededor de las vacuolas se reúnen entre sí, y cuando esto sucede, dos o tres capas de células adoptan el aspecto de células neurales. Estas vacuolas unidas entran en contacto con el canal central del tubo neural en el interior de la cola. Estudios realizados en embriones en esta fase del desarrollo, muestran que en el proceso de canalización no se producen las variaciones precisas de la neurulación.

Diferenciación retrogresiva En esta fase existe regresión de las estructuras formadas durante la fase de canalización. Este acontecimiento se produce en una forma precisa y no es un proceso degenerativo, si bien Streeter lo ha denominado diferenciación retrogresiva. La diferenciación retrogresiva inicial tiene lugar en la fase de 11mm con desaparición de la cola embrionaria. La regresión de los tubos neurales empieza más tarde, en la fase C-R de 13 a 18mm (48 días). Las variaciones en el tubo neural comportan al propio tiempo modificaciones en las estructuras vertebrales. Durante la diferenciación retrogresiva, estas estructuras derivan del tubo neural embrionario: el ventrículo terminal, el filum terminale y el vestigio medular coccígeo. La luz del canal central disminuye de tamaño en su porción media. El ventrículo terminal permanece durante todo el tiempo como un espacio identificable. En algunos casos se haya en el interior de aquella porción de la médula espinal que se convertirá en el cono medular, si bien, en ocasiones, se observa en el filum terminale superior. El ascenso de la médula espinal tiene lugar por el crecimiento diferencial que se produce en el embrión entre la médula espinal y la columna vertebral. Esta última crece a una velocidad longitudinal más rápida que la médula espinal y es causa de que la extremidad distal de la médula espinal “emigre” en sentido craneal. Existen controversias respecto a cuanto exactamente de la médula espinal alcanza su posición adulta entre LI y II con valoraciones que oscilan desde el período embrionario al segundo año de la vida.

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En la fase C-R de 3mm (60 días) el tubo neural caudal se atrofia dejando un pequeño resto ependimario en el vértice de los segmentos coccígeos. Este resto se conoce como vestigio medular coccígeo. Entre este vestigio y el ventrículo terminal, el tubo neural se atrofia en una banda fibrosa, el filum terminale. Esta estructura persiste en el transcurso de la vida y se divide en una parte sub-aracnoidea intradural craneal y una parte caudal, que se fusiona con la duramadre (6).

I.2 ESTRUCTURA DE LA MÉDULA ESPINAL

ANATOMIA DE LA MÉDULA ESPINAL La médula espinal es la continuación hacia abajo del bulbo raquídeo y tiene una longitud aproximada de 46cm. Se extiende desde el borde superior del atlas hasta terminar en una extremidad de volumen decreciente, el cono medular, opuesto al borde inferior de la V Vértebra lumbar, o a nivel del disco intervertebral entre las 2 vértebras lumbares superiores. Desde el cono, se prolonga un hilo fibroso en la línea media que se adelgaza progresivamente, el filum terminale que llega hasta el coxis. La duramadre y el aracnoides (y, por consiguiente, el espacio sub-aracnoideo) se extienden inferiormente hasta la II vértebra sacra. Aunque

en

general

cilíndrica,

la

médula

está

ligeramente

aplanada

anteroposteriormente y muestra unos engrosamientos cervical y lumbar que corresponden a los segmentos relacionados con los nervios dirigidos a la extremidades superiores o inferiores. La invervación del miembro superior corresponde a los segmentos medulares comprendidos entre el IV cervical y el II torácico, y la de los miembros inferiores, a los segmentos situados entre el III lumbar y el III sacro.

Meninges La médula está rodeada por la duramadre, la aracnoides y la piamadre, que continúan con las correspondientes capas de las meninges cerebrales a nivel del

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agujero occipital. La duramadre espinal, a diferencia de la cerebral, consta solamente de una capa meníngea que no se adhiere a las vértebras; está separada de los límites del conducto vertebral por un espacio epidural que contiene tejido areolar graso y múltiples venas. Los espacios sub-aracnoideos espinal y craneal son continuos entre si y contienen líquido cefaloraquídeo. La piamadre se encuentra íntimamente unida a la médula; a cada lado, emite una serie de 22 procesos triangulares, los ligamentos dentados, que se encuentran unidos a la duramadre y, por lo tanto, fijan la médula. La médula espinal es considerablemente menor que el conducto vertebral; las meninges, el líquido cefaloraquídeo, y el tejido graso epidural así como el plexo venoso se combinan para protegerla contra cualquier posible impacto con las estructuras ósea y ligamentosas vecinas. La médula espinal está envuelta por las meninges, que, a nivel del agujero occipital, continúan directamente con las que rodean el encéfalo. La externa, fuerte y fibrosa duramadre continúa hacia abajo hasta la II vértebra sacra, donde termina en forma ciega. La dura envaina las raíces espinales ventrales y dorsales, a las cuales está unida cuando la perforan; luego las raíces se unen casi inmediatamente para formar un nervio espinal, y la vaina dural se fusiona con el epineuro. Entre la duramadre y la aracnoides existe un espacio subdural potencial, que normalmente contiene una simple lámina de líquido de tipo linfático. La aracnoides espinal es laxa y tenue y también termina a nivel de la II vértebra sacra. Está separada de la piamadre por el espacio subaracnoideo, que es atravesado por delicados septos mesoteliales y contiene líquido cefalorraquídeo. Las raíces espinales, hasta los puntos en que penetran en la duramadre, están incluídos en la aracnoides. La piamadre es una fina capa de tejido conjuntivo vascular, que reviste directamente la médula espinal y sus raíces nerviosas. Por debajo del cono medular, continúa con el filum terminale que va adelgazándose progresivamente y desciende en medio de la cola de caballo, perfora las porciones terminales de la dura y la aracnoides y termina fundiéndose con el tejido conjuntivo tras el

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primer segmento coccígeo. A cada lado, la pia está fijada a la dura por 22 prominencias puntiformes, los ligamentos dentados. Raíces nerviosas espinales

Raíces nerviosas. La médula espinal es una estructura segmentada, y esto es indicado por las fijaciones regulares de los pares de nervios espinales. La médula y los segmentos vertebrales coinciden en la vida embrionaria precoz, pero el conducto vertebral se hace más largo que la médula a causa de los distintos índices de crecimiento, de forma que la mayoría de nervios espinales están situados oblicuamente en sentido inferior respecto a sus puntos de salida. Los filamentos nerviosos, están fijados a la médula a lo largo de sus porciones anterolateral y posterolateral. Los filamentos ventrales (anteriores) salen en dos o tres líneas irregulares. Están compuestos predominantemente de fibras eferentes, que son los axones de las células de las columnas o astas ventrales, de sustancia gris, y transportan impulsos motores hacia los músculos voluntarios. En las regiones torácica y lumbar superior, los filamentos contienen también fibras simpáticas preganglionares, que son los axones de las células columnares laterales. Los filamentos dorsales (posteriores) están fijados en series regulares a lo largo de un surco poco profundo, el surco posterolateral, y son cúmulos de prolongaciones centrales de células nerviosas seudounipolares localizadas en los ganglios espinales de las raíces nerviosas dorsales relacionadas. Las prolongaciones celulares laterales pasan hacia los nervios espinales y sus ramas a los receptores periféricos, y conducen impulsos aferentes hacia la médula espinal desde los distintos puntos somáticos, viscerales y vasculares. La médula espinal muestra una fisura media anterior y un surco medio posterior poco profundo desde el que se extiende un tabique medio de neuroglia hacia delante con una longitud de 4 a 6 mm. La médula está dividida en mitades simétricas por la fisura, el surco y el tabique. Las líneas de fijación de los filamentos nerviosos ventrales y dorsales se utilizan para demarcar la sustancia

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blanca en cada mitad de la médula en columnas o cordones anterior, lateral y posterior.

Nervios espinales Existen 31 pares (8 cervicales, 12 dorsales, 5 lumbares, 5 sacros, y 1 coccígeo) de nervios espinales dispuestos simétricamente, fijados a la médula en series lineales por raicillas o filamentos nerviosos ventrales y dorsales, y que se unen para formar las raíces nerviosas. Cada raíz nerviosa espinal dorsal posee un engrosamiento oval, el ganglio espinal (sensitivo). En la vida embrionaria precoz, la médula es tan larga como el conducto vertebral, pero a medida que avanza el desarrollo, su crecimiento se retrasa con respecto al de la columna vertebral. En consecuencia, los segmentos medulares están en situación superior con respecto a las vértebras, y las raíces espinales originalmente horizontales, adoptan una dirección cada vez más oblicua desde arriba hacia abajo a medida que avanzan a su agujero de salida. En el adulto – salvo en la región cervical superior – los segmentos medulares se sitúan a distancias variables por encima de las vértebras correspondientes. A efectos clínicos, es habitual localizarlos con relación a las apófisis espinosas vertebrales. En la región cervical inferior, las apófisis vertebrales son inferiores en un número al de los correspondientes segmentos medulares; en la región torácica superior, tienen dos números menos; y en la región torácica inferior, tres números menos. Por ejemplo, la IV apófisis espinosa torácica corresponde aproximadamente al nivel del VI segmento medular torácico. Los segmentos lumbares, sacros y coccígeos de la médula se encuentran estrechamente agrupados y ocupan el espacio aproximadamente enfrente las vértebras IX torácica y I lumbar. Estas alteraciones de los segmentos medulares respecto a los segmentos vertebrales explican por qué el engrosamiento cervical (C IV a D II) está situado aproximadamente enfrente de las vértebras correspondientes, mientras que el engrosamiento lumbar (L III a S III) se encuentra frente a las tres últimas vértebras torácicas. Las raíces espinales fijadas en la parte inferior de la médula,

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descienden hasta sus puntos de salida formando la llamada cola de caballo, cuyo nombre deriva de sus similitud con dicha estructura equina.

Nervios espinales o raquídeos Las raíces nerviosas ventrales están íntimamente recubiertas por la piamadre y de forma más laxa por la aracnoides. Como cada par sale a través de un agujero intervertebral, las raíces están incluidas en una vaina de duramadre, rodeada por tejido areolar graso que contiene un plexo de venas. Las raíces se sitúan juntas entre sí cuando perforan la dura y se unen casi inmediatamente para formar un nervio espinal o raquídeo, haciéndose continuas sus vainas durales con el epineuro. Los nervios espinales cervicales superiores están situados horizontalmente, pero todos los demás adoptan una dirección cada vez más oblicua y hacia abajo a medida que avanzan hacia su agujero de salida. En el adulto, los segmentos medulares lumbares, sacros y coccígeos están situados frente a las tres últimas vértebras dorsales y la I lumbar, y las raíces nerviosas fijadas a ellas descienden como una vaina en torno al filum terminale para constituir la cola de caballo. Los nervios espinales están conectados con las cadenas ganglionares simpáticas adyacentes mediante ramos comunicantes. Estos ramos aportan fibras simpáticas eferentes y aferentes a los nervios espinales, que constan principalmente de fibras somáticas eferentes y aferentes derivadas de las raíces nerviosas centrales y dorsales. Poco después de salir de los agujeros intervertebrales, los nervios espinales emiten pequeños ramos meníngeos recurrentes, que inervan las meninges y sus vasos; también aportan filamentos a las estructuras articulares y ligamentosas adyacentes. Luego se dividen en ramos ventrales (anteriores) y dorsales (posteriores primarios), que contienen fibras de ambas raíces nerviosas y un número variable de fibras simpáticas.

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Ramos ventrales Inervan las porciones anterior y lateral del cuello y tronco y constituyen los nervios del periné y miembros. Excepto en la región dorsal, donde conservan sus identidades individuales como nervios intercostales y subcostales, los ramos ventrales se dividen y se reúnen en diferentes patrones para formar los siguientes plexos nerviosos: el plexo cervical, a partir de los ramos ventrales de los cuatro primeros nervios cervicales: el plexo braquial, originado a partir de los ramos ventrales de los 4 nervios cervicales inferiores y el I dorsal; el plexo lumbar, de los ramos ventrales de los 3 primeros nervios lumbares y de la mayor parte del ramo ventral del IV nervio lumbar; el plexo sacro, a partir del resto del ramo ventral del IV nervio lumbar y de los ramos ventrales del V nervio lumbar y de los 3 primeros nervios sacros; y el pequeño plexo sacrococcígeo, a partir de los ramos ventrales de los nervios sacros IV y V y el nervio coccígeo.

Ramos dorsales Giran hacia atrás y se distribuyen en los territorios cutáneos, músculos y otras estructuras de la parte dorsal del cuello y del tronco. Aunque algunos ramos dorsales se unen para formar asas, sus ramos no forman verdaderos plexos al igual que los ramos derivados de los ramos ventrales. Además, los ramos dorsales (con excepción de los originados a partir del I y II nervio cervical) son generalmente menores que los ramos ventrales correspondientes. Todos los ramos dorsales, salvo los derivados de los nervios I cervical, IV y V sacros y coccígeo, se dividen en ramos medial, mayor y lateral, menor. La mayoría de ramos mediales inervan los músculos y la piel, mientras que los ramos laterales terminan en los músculos. Sin embargo, los ramos laterales tienden a aumentar de tamaño de arriba abajo, de forma que los de los últimos nervios torácicos, los 5 lumbares y los 5 sacros emiten filamentos musculares y cutáneos.

PRINCIPALES HACES DE FIBRAS DE LA MÉDULA ESPINAL La médula espinal consta de un núcleo central de neurópilo, la sustancia gris, rodeado por una capa de fibras externa, la sustancia blanca. La sustancia gris

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consta de los cuerpos celulares y dendritas de las neuronas medulares y de los axones y terminaciones axonales procedentes de ellas o que terminan a este nivel. La sustancia blanca está compuesta por los axones de los haces de fibras que discurren longitudinalmente. Los límites de las sustancias gris y blanca son diferentes en los distintos niveles medulares. La sustancia blanca es relativamente masiva en la región cervical y disminuye progresivamente de volumen en niveles inferiores. La sustancia gris está más desarrollada en los engrosamientos cervical y lumbar, donde se encuentra constituida por las neuronas de las que dependen las funciones motoras y sensitivas de los brazos y las piernas (Figura 1). Los tractos pueden dividirse en ascendentes y descendentes que unen la médula espinal con el cerebro, y en vías propiospinales compuestas por fibras que conectan entre sí distintos niveles de la propia médula.

Vías ascendentes Incluyen los fascículos delgado (gracilis) y cuneiforme que forman parte del sistema del lemnisco medial y conducen la sensibilidad discriminativa fina desde las partes inferior y superior del cuerpo, respectivamente. Las sensaciones menos discriminativas, de umbral más alto, son transportadas por los tractos espinotalámicos anterior y lateral; este último es particularmente importante en la conducción de la sensibilidad térmica y dolorosa. Otras vías ascendentes, que se encuentran más íntimamente implicadas en la actividad refleja y el control motor, incluyen los tractos espinocerebelosos anterior y posterior y los tractos espinoolivar, espinotectal y espinorreticular.

Vias descendentes. Han sido divididas para mayor utilidad en dos grupos. El primer grupo incluye los tractos corticospinales y el tracto rubrospinal. Terminan preferentemente en las

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regiones dorsolaterales de la médula espinal, que contienen las neuronas que controlan los músculos distales de los miembros. Las lesiones de estas vías originan una pérdida del control selectivo de las extremidades. El segundo grupo incluye los tractos reticulospinales anterior y lateral, el tracto tectospinal, los tractos vestibulospinales lateral y medial, y el tracto intersticiospinal, que discurre por el fascículo longitudinal medial y termina preferentemente en las regiones ventromediales de la médula espinal. Estas regiones contienen las neuronas que controlan los músculos proximales de los miembros, así como los axiales. Las lesiones de estas vías originan trastornos de la posición y el mantenimiento de la bipedestación. Además de su acción motora, ambos grupos de vías descendentes incluyen también fibras que modulan la transmisión sensitiva de las vías medulares.

Vías propiospinales Algunas de las vías propiospinales constan de fibras aferentes, que entran en la médula espinal a través de las raíces dorsales y luego ascienden o descienden en el haz oval, tracto semilunar, fascículo dorsolateral (de Lissauer), y fascículos delgado o cuneiforme para terminar en neuronas espinales a otros niveles de la médula espinal. Otras fibras propiospinales se originan de interneuronas de la propia sustancia gris medular. En conjunto, las fibras propiospinales son importantes en la mediación de reflejos espinales y en la coordinación de la actividad a los distintos niveles de la médula espinal.

ARTERIAS DE LA MEDULA ESPINAL La médula espinal está irrigada por múltiples arterias radiculares, que forman la arteria espinal anterior y las dos arterias espinales posteriores (Figura 2, 3 y 4).

Arterias radiculares Se originan de las arterias vecinas a nivel de cada segmento vertebral. Independientemente de su origen, las múltiples arterias radiculares pequeñas pasan medialmente a través de los agujeros intervertebrales, junto con las raíces

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nerviosas. La mayoría no alcanza la médula espinal; les corresponde principalmente la irrigación de las raíces nerviosas. Sin embargo, algunas de las arterias de mayor calibre alcanzan la duramadre, donde dan lugar a pequeñas ramas meníngeas, y luego se dividen en ramas ascendentes y descendentes para formar las arterias espinales. Las arterias radiculares de mayor calibre, que irrigan tanto las raíces nerviosas como la médula espinal, son llamadas arterias radiculomedulares para distinguirlas de las arterias radiculares que irrigan sólo las raíces nerviosas.

Arteria espinal anterior Discurre a lo largo de toda la médula espinal en la línea media. Usualmente se origina en la región cervical superior en la unión de las dos ramas espinales anteriores que comienzan en el cuarto segmento de cada arteria vertebral. De 6 a 10 arterias radiculares anteriores contribuyen a formarla a través de su longitud, ramificándose hacia arriba y hacia abajo. Como consecuencia, existe un punto entre dos arterias radiculares anteriores donde, a causa del flujo sanguíneo opuesto, puede no haber flujo en ninguna dirección. Ocasionalmente, en la región torácica la arteria espinal anterior se estrecha hasta un punto en que no funciona como anastomosis adecuada. La sangre de la arteria espinal anterior es distribuida a los dos tercios anteriores del parénquima de la médula espinal a través de ramas centrales y ramas penetrantes del plexo pial (Figura 5 y 6). Los segmentos cervical y los dos primeros torácicos de la médula espinal son irrigados por arterias radiculares que se originan de ramas de la arteria subclavia. La variabilidad es la regla y las ramas pueden originarse sea del lado derecho o del izquierdo (en general alternativamente) para unirse a la arteria espinal anterior en un ángulo de 60 a 80. No es infrecuente que una rama radicular anterior se origine de la arteria vertebral y acompañe la raíz CVI y una rama se origine de la arteria intercostal superior y acompañe la raíz CVIII. La región dorsal media de la médula espinal (DIII a DVII) suele recibir sólo una arteria radicular, que acompañe la raíz DIV o DV.

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En consecuencia, esta sección de la médula se caracteriza por su escasa irrigación aferente, y la arteria espinal anterior puede no ser continua a este nivel.

Arteria de Adamkiewicz La porción dorsolumbosacra de la médula espinal (DVIII hasta el cono medular) obtiene su principal aporte arterial de la arteria de Adamkiewicz, que se origina de una arteria intercostal (lumbar) del lado izquierdo en el 80% de los individuos. En el 85% de los casos, alcanza la médula con una raíz nerviosa entre DIX y LII; en el 15% de los casos en que alcanza la médula DV y DVIII, es suplementada por una arteria radicular que se origina más inferiormente. La arteria de Adamkiewicz (la principal arteria radicular anterior) tiene una rama radicular anterior de grueso calibre y otra posterior menor. Al alcanzar la cara anterior de la médula espinal, la rama radicular anterior asciende un breve trayecto y luego adquiere forma de horquilla para emitir una pequeña rama ascendente y una rama descendente de mayor volumen, que desciende hasta el nivel del cono medular donde forma un círculo anastomótico con las ramas terminales de las dos arterias espinales posteriores. La cola de caballo es acompañada e irrigada por una o dos ramas de las arterias lumbar, iliolumbar y sacras lateral y media. Estas ramas también ascienden para contribuir a formar el círculo arterial anastomótico en torno al cono medular.

Ramas centrales de la arteria espinal anterior. Pasan hacia atrás en el surco medio anterior para irrigar las porciones centrales del parénquima de la médula espinal. En la comisura anterior, las ramas giran alternativamente a derecha e izquierda para irrigar las mitades correspondientes de la médula, excepto en el engrosamiento lumbar en que se originan ramas izquierda y derecha de un tronco común. Las ramas terminales ascienden y descienden de la médula, irrigando territorios superpuestos. Existen de 5 a 8 arterias centrales para cada centímetro de longitud de médula espinal en la

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región cervical, de 2 a 6 en la región torácica y de 5 a 12 en el área lumbosacra. Las arterias centrales irrigan la comisura anterior y la sustancia blanca adyacente de las columnas anteriores, astas anteriores, bases de las astas posteriores, columnas de Clarke, haces corticospinales, tractos espinotalámicos, porciones ventrales de los fascículos delgado y cuneiforme y la región que rodea el conducto central.

Arterias espinales posteriores. Son arterias pares que discurren sobre las caras posterolaterales de la longitud total de la médula espinal, aunque pueden hacerse discontinuas en ocasiones. Cada una de ellas se origina del cuarto segmento de la correspondiente arteria vertebral y recibe contribuciones de 10 a 23 arterias radiculares posteriores. Las arterias espinales posteriores distribuyen sangre al tercio posterior de sus respectivos lados de médula. En la región cervicodorsal, la arteria espinal posterior recibe una, y a veces dos, tributarias en cada segmento. Bajo el nivel DIV o DV, es decir, en promedio, una rama radicular posterior cada dos segmentos, incluyendo la rama radicular posterior de la arteria de Adamkiewicz.

Plexo arterial pial. Las arterias espinales dan lugares a pequeñas ramas piales que se ramifican e interconectan sobre la superficie de la médula para formar un plexo pial. Ramas penetrantes del plexo irrigan la parte externa del parénquima medular; siguen el principal surco de la médula (el surco posterior medio y el surco intermedio posterior) para alcanzar las astas anterior y posterior. Las ramas piales periféricas irrigan las porciones externas de las astas posteriores, la mayor parte de las columnas posteriores y la porción externa de la sustancia blanca de la periferia de la médula espinal. Existe cierto grado de superposición en la distribución de las arterias periféricas centrales a nivel capilar, pero no hay anastomosis a nivel arterial, y ambos tipos son, de hecho, arterias terminales (7).

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I.3 LOCALIZACION Y PAPEL DE LOS RECEPTORES A GLUTAMATO tipo NMetil, D-Aspartato (NMDA).

RECEPTORES PARA GLUTAMATO (glu). El efecto excitador que ejerce el glu sobre la célula postsináptica depende de su interacción con receptores específicos, los cuales pueden ser de dos tipos generales: ionótropicos o metabotrópicos (8). Los receptores metabotrópicos glutamatérgicos (R-mGlu) interaccionan con proteínas G que regulan diferentes vías de señalización intracelular. Dentro del SN existen, por lo menos 8 subtipos de R-mGlu, los tipos 1 y 5 estimulan la activación de la fosfolipasa C y la producción de inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG), en tanto que los tipos 2-4 y 6-8 inhiben a la adenilato ciclasa y disminuyen los niveles de AMPc (9). Por otra parte, los receptores ionotrópicos glutamatérgicos actúan como canales iónicos activados por ligando; permiten la entrada de Na y Ca++; y la salida de K+. Estos receptores se clasifican de acuerdo a la afinidad de agonistas específicos como: receptores para N-Metil-D-Aspartato (R-NMDA), para ácido propiónico 3-amino-4-hidroxi-5-metil isoxasol (R-AMPA) y para ácido kaínico

(R-KA)

(8).

Estructuralmente,

son

complejos

macromoleculares

oligoméricos formados por 5 subunidades polipeptídicas, de las cuales existen múltiples variantes de empalme y de expresión, que al combinarse alternativamente, permiten la estructuración de receptores funcionalmente diferentes con afinidad por el mismo agonista selectivo (8,10).

RECEPTOR A KAINATO Los receptores a Kainato se forman por las subunidades GluR5-7 en combinación con KA1 y KA2, estas subunidades protéicas exhiben una afinidad diferencial por el Kaínico (8).

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Las subunidades GluR5 y GluR7 también se modifican por procesos postranscripcionales y pueden generar dos variantes de cada subunidad (GluR51 y 2, GluR7a y b). Adicionalmente, las subunidades GluR5 y GluR6 están sujetas a procesos de edición, donde a partir del RNAm pueden modificarse en un residuo aminoacídico de glutamina (Q) o arginina (R). Así, el residuo Q, facilita la entrada de Ca++ y la arginina (R) limita dicha conductancia (11). Las isoformas GluR5 (Q) y GluR6 (Q) se denominan formas no editadas, mientras que las isoformas GluR5 (R) y GluR6 (R) son formas editadas. La cantidad de formas editadas se regula durante el desarrollo del SNC, donde se observa que, la edición de la subunidad GluR5 (R) es baja (50-60 %) en la etapa embrionaria en comparación con la edad adulta, mientras que la edición de la subunidad GluR6 (R), es alrededor del 70-95% (12,13). Así mismo, la subunidad GluR6 puede presentar modificaciones de edición en el primer segmento transmembranal, donde la Isoleucina se cambia por Valina (I/V) y la tirosina por cisteina (Y/C). Así, la isoforma GluR6 (R) (V) (C) es la que predomina en el adulto. Finalmente, las subunidades GluR5, GluR6 y GluR7 pueden ensamblarse de forma homomérica o en combinación heteromérica con KA1 o KA2 para formar canales iónicos diferencialmente funcionales (11).

RECEPTOR A AMPA Los R-AMPA son heterómeros que se forman por diferentes combinaciones de las subunidades GluR1-4, durante la maduración del ARNm de éstas, se producen variantes de empalme que originan receptores con diferente selectividad y cinética de desensibilización (Siegel et al., 1999), (8). La subunidad GluR2 posee un papel determinante en la permeabilidad al Ca++ y en la rectificación del canal en el R-AMPA maduro (14,15). Los canales homoméricos o heteroméricos formados con las subunidades GluR1, GluR3 o GluR4 son permeables al Ca++, mientras que los canales ensamblados con, al menos, una subunidad GluR2, son prácticamente impermeables al Ca++ semejantes a los R-AMPA nativos (16). El papel de la subunidad GluR2 en determinar la permeabilidad al Ca++, se atribuye a la presencia de una arginina

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(R) en lugar de una glutamina (Q) en la región hidrofóbica M2. A este sitio de intercambio de aminoácidos se le denomina sitio Q/R y es el determinante tanto en la permeabilidad al Ca++ como de la sensibilidad a poliaminas (8).

EL R-NMDA El receptor NMDA ha sido objeto de numerosos estudios, debido a su implicación funcional en diferentes procesos de plasticidad neuronal, así como en el establecimiento de algunas alteraciones neurológicas (8). Este receptor se caracteriza por tener una conductancia elevada para Ca++ y Na+, además de poseer múltiples sitios de regulación farmacológica, entre los que destacan: el sitio de unión para Glu; el sitio de unión para el co-agonista glicina (Gly); sitios de unión para poliaminas; sitios sensibles al estado redox; el sitio de modulación positiva sensible a Zn++; y los sitios sensibles al bloqueo por Mg++ y MK-801, presentes en el interior del canal del receptor (8). Estudios moleculares han demostrado que la estructura del R-NMDA es producto de la combinación heteromérica de al menos, dos tipos de subunidades: las NR1 y las NR2. Recientemente, se ha caracterizado una nueva subunidad para el R-NMDA conocida como NR3 o NR-L, la cual se expresa durante los primeros días del desarrollo del SNC. Aunque la función de la subunidad NR3 no se ha caracterizado completamente, los trabajos con ratones “knockout” para esta subunidad, indican que podría estar involucrada en el desarrollo de las espinas dendríticas (17). La subunidad NR1 puede presentarse como producto de diferentes variantes de empalme o de modificación postranscripcional, posee una región extracelular con varios sitios de glucosilación en el extremo N-terminal y cuatro dominios transmembranales (TMI-IV) (18). Una característica distintiva de esta subunidad, en comparación con las de los receptores AMPA/KA, es la presencia de un residuo de asparagina en lugar de una glutamina en el dominio TMII (inmerso en la membrana a manera de horquilla), que le confiere la permeabilidad al Ca++ y la sensibilidad al bloqueo por Mg++ y determina las características funcionales del receptor (18). Este segmento determinante también lo poseen las subunidades 30

NR2. Los estudios de expresión de la subunidad NR1, en ovocitos de Xenopus sp, han demostrado que puede formar receptores homoméricos con las características y propiedades del canal de los R-NMDA. Sin embargo, cuando se ensambla con las subunidades NR2, las corrientes activadas por glu o NMDA se incrementan en varios ordenes de magnitud, por lo que parece ser que la entidad heteromérica funciona con mejor eficiencia. Es importante señalar que los homómeros de las subunidades NR2 no forman receptores funcionales, por lo que estas subunidades pueden considerarse sólo como moduladoras (20). La

subunidad

NR2

también

es

un

polipéptido

con

cuatro

dominios

transmembranales, de la cual se conocen cuatro tipos diferentes NR2A-D. Estudios electrofisiológicos demuestran que los canales de las subunidades recombinantes NR1-NR2C y NR1-NR2D son poco sensibles al bloqueo por Mg++ y se inactivan lentamente, en cambio los recombinantes NR1-NR2A y NR1NR2B son altamente sensibilidad a este bloqueo y su inactivación es rápida (21 22,23).

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II. ANTECEDENTES

Las primeras descripciones de la médula espinal fueron incluídas en los comentarios más interesantes de manejo, encontrados en "Edwin Smith Surgical Papyrus", en Nueva York. Los escritos fueron fechados en el siglo XVII pero son copia de un trabajo previo. Estos documentos originales son de la edad de las pirámides aproximadamente 3,000 años a.C. Este es el tiempo del gran Médico y Arquitecto Imothep, pero no hay evidencia positiva de que sea el autor. Hay algunos casos de daño del cordón espinal en los papiros de los cuales el caso más interesante se refirió de la siguiente manera: teniendo dislocación de una vértebra de su cuello mientras permanecía inconsciente de piernas y brazos , y su orina goteaba. Esto era una patología para no ser tratada. Niels Stensen ( 1648 a 1686 ) , un brillante Médico, que en 1661 publicó su " Dissertation de Cerebri Anatome", el más importante texto crítico de neuroanatomía. Stensen realizó el primer experimento sobre suplemento vascular en la médula espinal cuando en un cazón demostró que ligando la aorta abdominal causaba parálisis de la cola y que se recuperó cuando la ligadura se retiró. Ambos antecedentes científicos crearon una base fuerte para la futura investigación. (1) Se han realizado diferentes trabajos de investigación usando modelos animales, para evaluar tanto lesiones por compresión (24-30) como por contusión de la médula espinal (31-41). Se sabe a través de los años que la colocación de un pedículo de epiplón sobre el cerebro y la médula espinal resulta en el desarrollo rápido de vasos sanguíneos que penetran directa, vertical y profundamente en la estructura subyacente del SNC(42). El término "Choque Espinal" aplica a todos los fenómenos fisiológicos después de una sección anatómica del cordón espinal que resulta en pérdida temporal o depresión de todos o la mayor parte de los reflejos por debajo del nivel de la

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lesión. La hipotensión debida a pérdida del tono simpático es una posible complicación, dependiendo del nivel de la lesión. El mecanismo del daño que causa choque espinal es usualmente traumático y ocurre inmediatamente, el choque espinal ha sido descrito con mecanismos de daño que progresa sobre varias horas. El término de la fase del choque del cordón espinal es señalado por el retorno del arco reflejo cutáneo-espinal o arco reflejo muscular anormal. El regreso del arco reflejo por debajo del nivel del daño son irrevocablemente alterados y son la base sobre la cual los esfuerzos de la rehabilitación son basados. (43) En un animal crónico y daño de 300 gr/cm se produce una paraplegia transitoria, con 500 gr/cm de daño produce una paraplegia permanente.(44,45) Existen dos teorías, que no son excluyentes una de otra, que tratan de patogénesis de lesiones comunes de la médula espinal después de un daño. La teoría neuronal enfatiza la importancia del efecto directo de los daños mecánicos mismos que resultan en la distorsión de la médula espinal a nivel de la lesión así como también en disrupción estructural y funcional . La teoría vascular implica una reducción o interrupción de fluidos sanguíneos como factores que contribuyen a la necrosis del cordón de la médula espinal. formulado,

Como ha sido

ninguna de estas teorías explican adecuadamente las 3

peculiaridades mayores de daños de la médula espinal en ambos humano y animal- experimental: 1.- La naturaleza progresiva de la lesión, 2.- Su localización central, y 3.- Aspectos de la hemorragia en la necrosis. A pesar de las consecuencias

potenciales trágicas de daños de la médula

espinal, el proceso patogénico es responsable por el daño progresivo que se mantiene desconocido. Lo que sí es conocido es que la hemorragia de la necrosis en el CNS ocurre después de una oclusión momentánea de arterias por embolia que después se rompen y pasan distantes, permitiendo reflujo de sangre en la vasculatura isquémica previa. Ha sido también demostrado que las hemorragias de la necrosis en el parénquima del CNS, pueden resultar de obstrucción venosa si después se acompaña por presión intraluminal excesiva en venas y capilares.

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En modelos experimentales, donde el cordón es expuesto por laminectomía, las arterias de la espina dorsal pueden ser estrechas o invisibles después de un daño. Mediante observaciones de microscopía electrónica se ha demostrado que el estrechamiento basilar agudo o de la arteria cerebral media en el felino (secundario a la hemorragia sub-aracnoidea, estimulación eléctrica, daño mecánico,

ligadura parcial, etc.), resulta en daño endotelial severo, con

deposición de plaquetas y trombinas en el tejido sub-endotelial expuesto (46). La micro perfusión tanto en la materia gris como en la materia blanca disminuyó a la media hora posterior a la lesión y se encontró una severa falta de perfusión que fue evidente a las 8 y 24 horas. La disminución del llenado de los vasos en la materia gris y blanca mostró estar en paralelo al grado de necrosis hemorrágica de la materia gris. Un incremento en el número de vasos también fue evidente en la médula espinale a largo plazo (47). También se observaron cambios en la conducción axonal en los tractos somato-sensoriales y motores del cordón que se determinaron por Potenciales Eléctricos Motores (PEM) y Potenciales Evocados Somato-Sensoriales (PESS), mismos que fueron referidos como significativos en la extensión del daño del cordón. Estos cambios en los PEM y PESS se relacionaron con cambios en el flujo sanguíneo del cordón espinal después del trauma y por lo tanto, este dato sugiere que, la isquemia post-traumática está íntimamente relacionada con la disfunción axonal después del daño medular (48). Después de la lesión aguda, la médula espinal experimenta cambios patológicos secuenciales en los que se incluyen; la hemorragia, edema axonal, necrosis neuronal y desmielinización seguida de la formación de quistes e infarto. Allen fue el primero que describir la evolución de estos cambios patológicos en lesiones de perros. Así, se ha observado que dentro de los primeros 15 minutos, la lesión aguda potencia hemorragias que ocurren en la materia gris y edema de la materia blanca y durante las primeras 2 horas, la hemorragia en la materia gris aumenta y después de 4 horas se observaron numerosos cilindros del axis inflamados. Ducker y colaboradores también demostraron que los cambios

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patológicos se acentuaban 6 horas después de la lesión con necrosis severa, proceso al cual Nemecek denominó AUTODESTRUCCION. Dohrman y colaboradores mostraron por microscopía electrónica que 5 minutos después de la lesión, las vénulas musculares de la materia gris se dilataban por eritrocitos, pero los axones aparecieron sin cambios. Entre los 15 y 30 minutos después del trauma, se observaron pequeñas hemorragias con extravasación de los eritrocitos dentro del espacio perivascular postcapilar y las vénulas musculares, y se presentaron algunos cambios axonales. Después de las 4 horas, se observó disrupción de las vainas de mielina, degeneración axonal y lesiones endoteliales isquémicas. Griffits y McCulloch, mostraron cambios progresivos axonales en el desarrollo de zonas necróticas durante los primeros días después de la lesión. Bresnahan y Balentine observaron cambios axonales en la lesión aguda del cordón espinal. Balentine enfatizó que el trauma induce disolución

granular

del

axoplasma

y

disrupción

vesicular

de

mielina

especialmente en la materia blanca. Algunos investigadores identificaron edema en el sitio de la lesión el cual se extendió progresivamente a los diferentes segmentos del cordón. De 24 a 48 horas después del trauma, el sitio de la lesión hemorrágica se observó con necrosis. Días después de la lesión la zona hemorrágica muestra un área de cavitación y la zona adyacente presenta necrosis, frecuentemente con bordes bien definidos. Estos cambios progresivos consistentes en cavitación y necrosis coagulativa en el sitio de la lesión y en las zonas adyacentes corresponden al infarto post-traumático. El trauma del cordón espinal causa numerosos cambios vasculares, los cuales podrían ser divididos dentro de los efectos sistémicos y locales. La lesión aguda del cordón espinal causa inmediatamente mecanismos de daño de la micro vasculatura del cordón seguido por una lesión secundaria de estos vasos. Se ha propuesto que el tratamiento de la lesión vascular secundaria debe de dirigirse hacia los efectos de la circulación local en el cordón y al choque neurogénico sistémico.

La isquemia post-traumática del cordón podría ser

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tratada en orden de prevención del infarto post-traumático. Así, el mecanismo exacto de la isquemia post-traumática del cordón espinal se desconoce (2). Todos los pacientes con daño agudo en el cordón espinal deberían recibir un bolo intravenoso de metilprednisolona a dosis de 30 mg por kg, en las primeras 8 horas del daño, seguido por una infusión de 5.4 mg/ Kg/hora a lo largo de 23 horas (49). Acciones antinflamatorias. Los corticosteroides inhiben no solamente el fenómeno temprano del proceso inflamatorio; edema , deposición de fibrina , dilatación capilar, migración de leucocitos dentro del área inflamada y actividad fagocitaria, sino también manifestaciones tardías ( proliferación de capilares y fibroblastos, deposición de colágeno y cicatrización ). Aunque de gran valor en ciertas circunstancias, la habilidad de los glucocorticoides para inhibir el reclutamiento de leucocitos y monocitos-macrófagos dentro de las áreas afectadas ha sido considerado ser un factor muy importante en sus acciones antinflamatorias(50,51). Investigaciones posteriores confirmaron esta idea y demostraron que los glucocorticoides inhiben la habilidad de estas células para elaborar substancias quimiotácticas que al igual han sido factores que median el incremento de la permeabilidad capilar y vasodilatación (52). Los glucocorticoides inhiben sustancias que sintetizan tales como: ácido araquidónico y sus metabolitos (prostaglandinas y leucotrinas), factor activador de plaquetas ( PAF ) (53), síntesis de proteína o familia de proteínas (lipocortin o macrocortin ), también inhiben la actividad de fosfolipasa (54), así como el factor de necrosis tumoral (TNF), el cual incita muchos de los procesos de inflamación y normalmente se libera de células fagocíticas(55) y finalmente la Interleucina-1 (IL-1) elaborada por macrófagos macrocíticos , los cuales resultan de la actividad de glucocorticoides y disminuye su concentración de RNAm (56). La IL-1 realiza una gran cantidad de acciones inflamatorias, entre las que se incluyen: la estimulación en la producción de PGE2, de colagenasa, la activación de linfocitos T, la estimulación en la proliferación de fibroblastos (57). Los glucocorticoides también inhiben la formación de activador plasminógeno por neutrófilos. Esta proteína convierte plasminógeno a plasmina (fibrinolicina), la

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cual facilita la migración de leucocitos dentro de lugares con inflamación por fibrina hidrolicina y otras proteínas (58), además de inhibir la liberación de mediadores de inflamación los glucocorticoides, también pueden inhibir la acción de reguladores humorales, tales como PAF ( 59) y factor inhibitorio de migración de macrófagos (MIF), el cual normalmente causa la acumulación de macrófagos no sintetizados en los lugares de inflamación (50). El cuidado médico antes y después de cirugía juega un papel importante en los pacientes que requieren neurocirugía y tendrán un impacto en la recuperación neurológica. Es de considerarse la prevención de la destrucción del cordón espinal desde la cascada de eventos los cuales ocurren secundariamente por trauma al sistema nervioso central. Otras drogas prometedoras son los 21 aminoesteroides y GM-1 gangliósidos (60). La metilprednisolona a las dosis recomendadas actúa como un barredor de radicales de oxígeno y es un efectivo anti-inflamatorio (61).

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III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La incidencia de daño al cordón espinal en los Estados Unidos es de aproximadamente 10, 000 casos por año. También se han realizado diferentes trabajos de investigación utilizando diferentes modelos y especies animales, con lo cual hasta la actualidad no han mostrado resultados óptimos para los pacientes con sección medular, aunque algunas drogas nuevas como la metilprednisolona y la nimodipina han mostrado resultados prometedores en modelos animales, su uso aislado no resulta ser suficiente para una recuperación clínica en sección medular. Por lo tanto, al no existir ningún tratamiento médico o quirúrgico que ofrezca la recuperación de la actividad motora o al menos que recupere algunos niveles de sensibilidad para las lesiones medulares, es necesario buscar alternativas de tratamiento quirúrgico con la posibilidad de mejorar el cuadro clínico. En este sentido, investigaciones previas de nuestro grupo de trabajo y con el uso de un modelo en perros, se demostró una importante recuperación clínica en casos de lesión aguda de médula espinal con lesión cervical a nivel de C5-C6 y con preservación de la vascularidad. Con el mismo modelo también se demostró que el tiempo crítico de isquemia fue de 3 horas. Sin embargo, se desconoce si se establece una recuperación clínica y funcional del individuo después de un transplante homólogo de médula espinal a nivel cervical. Por lo tanto, en el presente trabajo se evaluó la recuperación funcional después de una resección del 50% de médula espinal a nivel de C5-C6, con preservación de la arteria espinal anterior después de un transplante homólogo siempre y cuando se preserve la vascularidad de la arteria espinal anterior. Así, estos resultados podrían apoyar posibles alternativas de tratamiento y una potencial recuperación clínica para el paciente.

38

IV. HIPOTESIS

El Transplante Homólogo de tejido medular permite la recuperación funcional después de una resección traumática del 50% a nivel de C5-C6, con preservación de la Arteria Espinal Anterior.

39

V. OBJETIVOS

V.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la recuperación funcional de una resección traumática del 50% de médula espinal a nivel de C5-C6, con preservación de la arteria espinal anterior después de un transplante homólogo.

V. 2 OBJETIVOS PARTICULARES

1-Determinar la recuperación clínica posterior a un transplante homólogo de tejido medular en el área de sección, después de preservar la vascularidad de la Arteria Espinal Anterior. 2-Determinar el re-establecimiento de las funciones, de la Conductibilidad Eléctrica a través de Potenciales Evocados Somato-Sensoriales, a las cuatro semanas de evolución. 3-Determinar los cambios morfológicos en la médula espinal después del transplante a través de estudios de Microscopía Optica. 4- Determinar los cambios de Expresión de las Sub-unidades del Receptor NMDA en los diferentes segmentos de la médula espinal con sección y transplante medular.

40

VI. MATERIAL Y METODOS

VI. 1 ASIGNACION DE CASOS Y METODOLOGIA QUIRURGICA Se utilizaron dos grupos de 8 ( ocho ) perros machos cada uno de 25 a 30 kilogramos de peso y agrupados al azar y mantenidos bajo condiciones de Bioterio, de acuerdo a las Normas Institucionales. En todos los casos se les practicó sección medular del 50% ( mitad derecha ) a nivel de C5-C6, correspondiente al plano antero-posterior, sin comprometer la vascularidad de la arteria espinal anterior; se tomaron 4 (cuatro) mm de tejido medular correspondiente al área de la sección e integrándose en el sitio similar tomado de un animal donador. Los dos grupos considerados como GRUPO A; grupo de Transplante Homólogo de médula espinal y el GRUPO B, el correspondiente al grupo de Sección Medular pura, sin transplante (Figura 7). El grupo A se dividió en: Agudo ( tres días del post-operatorio) y Crónico, (cuatro semanas del post-operatorio) teniendo para cada subgrupo 4 animales. De los 4 casos en agudo se evaluaron los resultados con 2 casos en microscopía óptica así como 2 casos para evaluar la expresión del receptor de NMDA, sub-unidades NR1, NR2A, NR2B y NR2C. De los casos crónicos se evaluó la evolución clínica mediante la clasificación de Daniels, (motora) y la escala de Frankel, (sensitivo-motora) y el mismo protocolo del grupo agudo, a las 4 semanas de evolución post- operatoria. El grupo B de Sección Pura, que contó con el mismo número de animales, se evaluaron los mismos parámetros al grupo transplantado. Para el estudio Basal de estudiaron 2 casos por cada grupo y se evaluaron los mismos parámetros: PESS, Microscopía Optica y Estudios Moleculares. Para los CASOS AGUDOS, tres días después de realizar la sección medular y confirmar clínicamente la lesión neurológica completa (cuadriplegia), dos animales de ellos se estudiaron mediante PESS con evaluación de Latencia y Amplitud. Después de sacrificar a los animales mediante dosis altas de

41

anestésico, se tomaron cuatro muestras de médula espinal considerando la muestra 1= al nivel del transplante, a la muestra 2 al segmento contralateral del transplante, a la muestra número 3= a medio cm proximal a la zona del transplante y la muestra 4= a medio cm distal al transplante; se realizaron estudios de microscopía óptica para analizar Axones Mielinizados y no Mielinizados, Espesor de las Vainas de Mielina e Integridad del Endotelio de los Vasos Sanguíneos. Los dos casos restantes fueron para evaluar la expresión de las subunidades del receptor

NMDA,

NR1,

NR2A,

NR2B

y

NR2C,

en

los

cuatro

sitios

correspondientes a: 1= a nivel del transplante, 2= a nivel contralateral al transplante, 3= a medio cm proximal al transplante y 4= a medio cm distal al nivel del transplante. Los 4 CASOS CRONICOS de transplante de médula espinal fueron estudiados al término de cuatro semanas. También la evaluación clínica fue con la Escala de Daniels (Escala Motora) y la Clasificación de Frankel (Sensitivo-Motora), así mismo se realizaron los estudios de Potenciales Evocados Somato-Sensoriales, evaluando Latencia y Amplitud. Estudiados histológicos para microscopía óptica para analizar Axones Mielinizados y no Mielinizados, el Espesor de Vainas de Mielina y la Integridad del Endotelio de los Vasos Sanguíneos. Las muestras fueron tomadas de la siguiente forma: 1= a nivel del transplante, 2 a nivel contralateral al sitio del transplante, 3 a medio cm proximal al transplante y 4= a medio cm distal al transplante. Los dos casos restantes fueron para la evaluación de la expresión de las subunidades del receptor de NMDA: NR1, NR2A, NR2B y NR2C. El segundo grupo ( B ) correspondiente al grupo con sección medular exclusiva, se utilizó como control, con el mismo número de casos y evaluación de los mismos parámetros que al grupo A, de transplante de médula espinal

42

VI. 2 TECNICA QUIRURGICA A los cuatro grupos experimentales y de control se le aplicó anestesia con Acepromacina - Pentobarbital sódico, para proceder al afeitado de la superficie anterior del cuello. Se colocó al animal en posición decúbito dorsal. Aplicación de cánula endotraqueal, para mantener ventilación asistida con ventilador de presión a 20 mmHg con Fi 02 de 0.4 (fracción inspirada de oxígeno), con frecuencia respiratoria de 12-16 respiraciones por minuto. Se realizó abordaje ventro-lateral izquierdo de aproximadamente cinco centímetros y mediante disección por planos hasta segmentos vertebrales. Se practica resección de ligamentos anteriores vertebrales y se procede a realizar discoidectomía de C5-C6, así como hemicorporectomía distal de C5 y hemicorporectomía proximal de C6. Se practica incisión de membranas meníngeas mediante corte en forma de H. Se identifica la arteria espinal anterior, la cuál se preserva. Se procede a practicar una resección segmentaria de 4 mm de médula espinal de la mitad derecha y a nivel descrito de C5-C6. Simultáneamente se practica el mismo procedimiento en

otro ejemplar

integrándose el segmento medular a manera de injerto homólogo. Se cierra por planos. Al Grupo Control solo se practico 50% de sección medular, afectando la mitad derecha, mediante un corte transversal con bisturí del número 11 y al mismo nivel que al Grupo de transplante. El resto del procedimiento de semejantes características al grupo experimental. VI. 3 LA EVALUACION CLINICA Esta comprendió cambios en : Movilización de la cabeza Actividad motora de miembros torácicos Actividad motora de miembros pélvicos Control de esfínteres Tiempo de coordinación total

43

A Figura 7.

B

C

A) Médula espinal cervical intacta, superficie anterior. B) Médula

espinal cervical con sección del 50%, superficie anterior. C) Médula espinal cervical con sección del 50%, superficie postero-lateral-derecha.

44

Escala motora de Daniels, ( 0= Ausente, parálisis total, 1= Contracción muscular palpable o visible, 2= Pobre. Movimiento activo sin gravedad, 3= Regular. Movimiento activo contra gravedad, 4= Bueno. Movimiento activo contra resistencia leve, 5= Normal. Movimiento contra resistencia máxima ), aplicada a los casos agudos, y crónicos diariamente hasta 4 semanas del post-operatorio. Clasificación sensitivo-motora de Frankel, ( A= Pérdida completa las funciones motora y sensitiva bajo el nivel segmentario de la lesión, B= Actividad sensitiva solamente. Parálisis motora. C= Motora inútil, D= Motora útil por debajo del nivel de la lesión, E= Intacta. Sin síntomas ni déficit neurológico), aplicada a los casos agudos, y crónicos diariamente hasta 4 semanas del postoperatorio.

VI.

4

EN

POTENCIALES

EVOCADOS

SOMATO-SENSORIALES,

se

consideraron: Latencia en milisegundos (mS) y Amplitud en microvolts (V). Se realizó el estudio de Potenciales Evocados Somato-Sensoriales con un Equipo para Electrodiagnóstico marca Nicolett Modelo Viking IV, calibrándose con Frecuencia de Filtros bajos (LFF), 30 Hertz (Hz) y Frecuencia de Filtros Altos (HFF), 3 Kilo-Hertz, con velocidad de barrido de 10 milisegundos (mS), y amplitud de 2 microvoltios por división, utilizándose estímulos con frecuencia de de 2.3 Hz, correspondiente a 2.3 estímulos por segundo, duración de 0.2 ms e intensidad variable con promedio de 12 miliamperes (mA). El estudio se realizó a cada uno de los perros previo rasurado y asepsia tanto de la región craneal como de la región hemipélvica derecha, bajo sedación con Zoletil 50 ( Clorhidrato de Tiletamina 125mg– Clorhidrato de Zolazepam 125 mg), vía intramuscular a dosis de 10 mg/Kg de peso, (0.2 ml/Kg). Los estímulos se aplicaron con electrodos de aguja a nivel de la escotadura ciática derecha, captando el estímulo en cráneo con electrodos de superficie de oro en Cz’-Fpz., nomenclatura encefalográfica según sistema 10-20 (Resultante del cruce de una línea que une las porciones mastoideas y una línea que une la base nasal y la protuberancia occipital. La tierra se aplicó a nivel frontal.

45

Se promediaron un total de 200 a 250 estímulos de acuerdo a la definición del Potencial Evocado. La medición de los PESS se realizó de acuerdo a la técnica ya estandarizada en la cual la p37 se mide en el vértice de la curvatura que muestra el potencial evocado hacia abajo. El estudio se realizó en todos los casos, previo a la cirugía como control basal, a los tres días de la sección o transplante de médula espinal y en los casos crónicos igualmente de sección o transplante, a las 4 semanas del postoperatorio.

VI. 5 ESTUDIOS HISTOLOGICOS Para los estudios histológicos se evaluaron los siguientes parámetros: Axones Mielinizados y no Mielinizados (normales y anormales). Espesor de vainas de mielina Integridad del Endotelio de los Vasos Sanguíneos. Antes de sacrificar los casos tanto agudos como crónicos, los animales fueron perfundidos con solución de Karnovski (62). Se realizaron los cortes de igual forma que para los estudios moleculares (regiones anatómicas 1, 2, 3, y 4), para cada perro en estudio. El material se incluyó en resina Epoxy ( Poli/bed), una micra de grosor y la tinsión con Azul de Toloudina. Las mediciones y conteos se realizaron en Analizador de Imágenes Carl Zeiss ( Zeiss Image 3.0), 400X. Se consideraron para el estudio un promedio de 10 campos de 74,000 micras cada uno, en donde se contaron y midieron axones normales y anormales, espesor de las vainas de mielina de axones normales y anormales y cantidad y características de los vasos sanguíneos.

VI. 6 ESTUDIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR

VI. 6.1 Obtención del tejido. Después del tratamiento, los animales se mantuvieron en condiciones de bioterio hasta los 4 semanas, los casos crónicos fueron sacrificados por sobredosis de

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anestésico. Se extrajo la médula espinal a nivel cervical en condiciones asépticas y se cortaron las regiones medulares a estudiar: 1. Sitio transplantado, 2. Sitio contralateral al transplante, 3. Medio cm proximal al transplante, 4. Medio cm distal al transplante. A los casos agudos se les tomo la muestra de igual forma, inmediatamente después de la cirugía. El grupo B, (comparativo) correspondiente al grupo de sección exclusiva, fue manejado de la misma forma. Después de tomar las muestras de tejidos medulares, se pesaron y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido hasta el día de su utilización para la extracción del ácido ribonucléico total (RNA total).

VI. 6. 2 Obtención y cuantificación del RNA total. La extracción del RNA total se realizó mediante el método de isotiocianato de guanidina (63), el cual se describe a continuación. El tejido (50 mg) se homogenizó en 500 µl de trizol, se le adicionaron 100 µL de cloroformo y se centrifugó a 12,000 rpm. durante 19 min a 4ºC, se tomó el sobrenadante y se le agregó un volumen igual de isopropanol (0-4ºC), se incubó de 10 a 15 min a 4ºC y se volvió a centrifugar bajo las mismas condiciones. Posteriormente, el RNA precipitado se lavó con etanol al 75% en agua tratada previamente con dietil pirocarbonato (DEPC al 0.1%) y se disolvió en un volumen total de 20-80 µL de agua DEPC.

VI. 6. 3 Determinación espectrofotométrica de la cantidad y calidad del RNA. La cantidad y calidad del RNA extraído, se evalúo a través del índice de absorbancia de 260/280 nm. Considerándose óptimas aquellas muestras cuyo índice de absorbancia fuera de 1.8 a 2.0.

47

VI. 6. 4 Retrotranscripción y Reacción en Cadena de la Polimerasa (RTPCR). Para la síntesis del DNAc se utilizó la transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina de Molovney. Se tomaron 2 µg de RNA de cada muestra, se adicionó agua estéril para un volumen total de 6 µL y se incubo durante 10 min a 70ºC. Inmediatamente después se incubó en un baño de hielo con agitación continua

durante

5

min.

Posteriormente,

se

adicionó

la

mezcla

de

retrotranscripción (Tris-HCl 50 mM pH 8.3; Desoxinucleótidos trifosfatados (dNTPS) 2.5 mM; Ditiotreitol 10 mM; Iniciadores aleatorios 1 mg/µL; Inhibidores de RNAasas (RNAsin) 1U/µL) y la transcriptasa reversa (200 U/µL) para luego incubarse a 37ºC durante una hora y a 95ºC durante 10 min, se les adicionó agua estéril y se conservaron a -20ºC hasta su utilización para la PCR. Para la reacción en cadena de la polimerasa, se utilizó la siguiente mezcla de reacción: Taq DNA polimerasa (1 U/µL), 1 µL de DNAc, dNTPs (10 mM), MgCl2 (50 mM), Tris-HCl 50 mM pH 8.0, agua estéril y los oligonucleótidos sentido y antisentido para cada subunidad proteica del receptor NMDA (Tabla 1). Simultáneamente se utilizó la expresión del gen para -Actina como gen constitutivo (control metodológico). Los ciclos de temperatura se realizaron en un termociclador automático. La amplificación para la subunidad NR1 se realizó en 32 ciclos y la amplificación de la subunidad NR2A y NR2C se realizó en 43 ciclos, constando cada ciclo de un paso de desnaturalización del DNA a 94ºC por 5 minutos, alineación e hibridación de los iniciadores a 60ºC por un minuto y extensión de los iniciadores a 72ºC por 1.5 minutos. A estos ciclos se les agrego un ciclo inicial de 5 min a 94ºC y uno final de 5 a 72ºC grados centígrados.

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TABLA 1. Secuencias de Oligonucleótidos utilizados para la PCR SUBUNIDAD

SECUENCIA

PARES

CICLOS

DE BASES NMDA-R1

Sentido 5’TAC ACT GCC AAC TTG GCA GCT TTT 3’

549

32

Antisentido 3’GTT TAG CGT CCC CAG AAG TAC 5’

NMDA-2A

Sentido 5’GAC TAC AGC CTG GAG GCA AG 3’

571

43

563

20-43

526

43

Antisentido 3’GT CTT GAC ACT TCA AGT GGA 5’ NMDA-2B

Sentido 5’GGA TCT ACC AGT CTA ACA TG 3’ Antisentido 3’GT CAC CCT AGT GAT TGA TAG 5’

NMDA-2C

Sentido 5’ACA TGA AGT ATC CGT ATGG 3’ Antisentido 3’GTT CTG GTT GTA GCT GAC AG 5’

-actina

Sentido

517

26

5’CACCACAGCTGAGAGGGAAATCGTGCGTGA3’ Antisentido 3’ATTTGCGGTGCACGATGGAGGGGCCGG5’

Los productos amplificados de la PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, posteriormente se fotografiaron con película polaroid 665 en exposición a la luz UV, y al negativo de la fotografía con las bandas en oscuro se les dio seguimiento con un espectrofotómetro Beckman DU650. Los valores de densidad óptica para las diversas subunidades fueron calculados y normalizadas contra la expresión del gen para la -Actina. Los resultados se expresan

49

como unidades de Pixeles, evaluados mediante estudio semi-cuantitativo (Figura 8).

VI. 7 ESTADISTICA

Estadística descriptiva en todos los grupos. Prueba de normalidad. x2 entre variables no paramétricas. T de Student y Análisis de Varianza para comparar variables paramétricas. En la evaluación histológica se realizó un análisis de varianza entre los diferentes grupos y zonas de lesión, encontrando diferencia significativa entre grupos y zonas de evaluación, tanto para zonas normales, anormales y espesores de vainas de mielina en axones normales y anormales. Posteriormente se realizó el análisis Post-hoc de Sheffe y la prueba t de Student para valorar los diferentes grupos y zonas de lesión contra el grupo control. Análisis de correlación entre variables en Potenciales evocados somatosensoriales ( latencia y amplitud ) y para los datos sobre la expresión del receptor de NMDA, los valores obtenidos se analizaron a través de ANOVA de una vía, considerándose significativamente diferentes aquellos con una p0.05 ns

t=(p=0.467)=p>0.05 ns

BASAL VS AGUDO LATENCIA =p = 0.509 ns AMPLITUD =p = 0.396 ns AGUDO VS CRÓNICO LATENCIA = p = 0.464 ns AMPLITUD = p = 0.255 ns

BASAL VS CRONICO LATENCIA = p = 0.815 ns AMPLITUD = p = 0.255 ns

Tabla 5. Potenciales evocados somato-sensoriales. Sección medular. Estudio comparativo entre grupo basal agudo y crónico.

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COMPARATIVO TRANSPLANTE /SECCION

BASALES = LATENCIA

MEDIA Y EE.

p = 0.006

AMPLITUD

MEDIA Y EE.

p = 0.145 NS

VII. 3 MICROSCOPIA OPTICA

Los resultados histológicos muestran una disminución axonal que en la mayoría de las zonas tanto de transplante como de sección. Sin embargo, en la sección aguda y sección crónica en la zona 4 el número de axones se incrementó de manera significativa (Tabla 6, Figura 9-12 y Grafica 3) En relación al área de axones anormales, éstos no se observaron en el grupo control ni en la sección aguda, zonas 1, 2, 4 y transplante agudo zona 4. En cambio en la sección aguda, zona 3 y el transplante agudo, zonas 1, 2, 3, así como los grupos crónicos de sección y transplante se observó un incremento en la presencia de axones anormales respecto al grupo control (Tabla 7, Figura 912 y Grafica 4). En cuanto al espesor de vainas de mielina de axones normales, en todos los casos se observó una diferencia significativa, excepto en la sección aguda zona 3. En tanto que en la sección crónica zona 2, 3 y transplante agudo zonas 2 y 3 se observó un aumento en el espesor de vainas de mielina respecto al grupo control. En los demás casos se encontró una disminución en este parámetro (Tabla 8, Figura 9-12 y Grafica 5). Respecto a los axones degenerados, estos se observaron en todos los grupos y zonas en comparación al grupo control, donde éstos no estuvieron presentes (Tabla 9, Figura 9-12 y Grafica 6).

56

57

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60

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VII. 4 ESTUDIOS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Subunidad NR1 Los resultados sobre la expresión de la subunidad del receptor NMDA tipo NR1 muestran una importante disminución en los niveles de expresión de NR1 en los grupos agudo y crónico de transplante en todos los segmentos estudiados, excepto en el segmento distal del grupo crónico de transplante en relación al grupo control (Figura 13). También se observó una importante disminución en la expresión de los niveles de NR1 en los grupos de sección aguda y crónica en el sitio del transplante, así como en el sitio contralateral de sección aguda respecto al grupo control (Figura 13). Finalmente en el segmento proximal y distal se observó un incremento significativo en la expresión de los niveles de NR1 en el grupo de sección crónica, así como en el segmento distal de sección aguda en comparación con el grupo control (Figura 13).

Subunidad NR2A

Los resultados muestran que los niveles de expresión de la subunidad 2A fue nula en el grupo de transplante-agudo en todas las zonas de estudio (Figura 14).En tanto que en el grupo de transplante crónico se observó una importante reducción en los niveles de expresión de NR2A en todas las zonas de estudio, en relación al grupo control (Figura 14). Mientras que en el grupo con sección aguda se observó una disminución importante de los niveles de expresión de la subunidad en las zonas de transplante, contralateral y distal. En el grupo de sección crónica dicha expresión se diminuyó en las zonas de transplante, contralateral y proximal respecto al grupo control (Figura 14).

Subunidad NR2B En relación a los niveles de expresión de la subunidad NR2B, los resultados muestran que no fue posible detectar dicha subunidad bajo ninguna circunstancia en el grupo control ni en el experimental (datos no mostrados).

71

Subunidad NR2C Los niveles de expresión de la subunidad NR2C fueron significativamente reducidos en los grupos con transplante y de sección tanto en agudo como crónico en todas las zonas de estudio excepto en la zona proximal donde se observó un incremento significativo en comparación al grupo control (Figura 15). En tanto que, los niveles de expresión de la subunidad NR2C también se redujeron en el sitio de transplante y contralateral del grupo de sección tanto aguda como crónica. Así mismo en el segmento distal del grupo de sección aguda también fue menor esta expresión, respecto al grupo control (Figura 15). Finalmente, en el segmento proximal de los grupos tanto de transplante como de sección crónica la expresión de esta subunidad se incrementó de manera significativa, en relación al grupo control (Figura 15).

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73

74

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VIII. DISCUSION

El impacto de las lesiones medulares alcanza una cifra de 10,000 casos al año en los Estados Unidos de Norte América con la trascendencia de secuelas en la mayoría de los casos y las pérdidas económicas son considerables ya que afecta por índice de frecuencia a personas en etapa productiva de la vida, además de las repercusiones familiares y sociales afectados por pacientes lesionados, por lo tanto cualquier esfuerzo en controlar o al menos mejorar el nivel de la lesión neurológica se justifica plenamente (3). Revisiones recientes demuestran que la zona de lesión traumática de médula espinal más frecuente afecta el nivel C5 (64). Así, el tratamiento quirúrgico concerniente en descompresión de la médula espinal, reposición y estabilización de los segmentos óseos se ha indicado en el 76% de los casos traumáticos de columna cervical, con la finalidad de recuperar la anatomía del segmento (65). El tiempo ideal para intervenir quirúrgicamente a un paciente con lesión traumática de la médula espinal a nivel cervical, no se definido (47), aunque se considera que el déficit neurológico puede ser beneficiado mediante la descompresión quirúrgica y estabilización dentro de las primeras 72 horas del daño (66). Estudios recientes han mostrado que si se evita la necrosis isquémica por la presencia de astrocitos y células ependimales, más que por macrófagos, linfocitos y fibroblastos se desarrolla un crecimiento axonal en la zona de lesión de médula espinal (67). Por lo que, en el presente trabajo se cuidó mantener una adecuada vascularidad en la zona de lesión y/o transplante. Así, un adecuado abastecimiento de sangre es un factor crítico en la recuperación de las lesiones traumáticas de médula espinal. Una lesión bien vascularizada permite el crecimiento hacia el interior de ésta, de células gliales y otras células las cuales dan lugar al sustento de material básico para la regeneración de los nervios y los procedimientos que inducen la revascularización o la angiogénesis que reducirá la cascada progresiva de la necrosis tisular, misma que puede atenuarse con agentes antiinflamatorios específicos (68, 69).

76

En un modelo con hemisección a nivel de T8 de la médula espinal realizado en ratones mutantes se observó recuperación de la marcha en 16 días, lo cual indica que el proceso de neuroplasticidad puede obtenerse después de un daño neurodegenerativo (70). En un trabajo previo de microcirugía vascular en lesiones medulares

se

demostró una recuperación clínica después de preservar el flujo vascular de la arteria espinal anterior (nivel C5-C6) y con un tiempo crítico de isquemia de 3 horas (4,5). Sin embargo, bajo este modelo no fue posible conocer los cambios a nivel celular y molecular si adicional a la sección, se incluye un transplante homólogo de médula espinal. Los resultados obtenidos en este estudio parecen confirmar la importancia de preservar y/o reparar la vascularidad de manera prioritaria dentro de un periodo crítico de isquemia post-traumático para lograr una importante recuperación tanto clínica. Así, Los casos de transplante y de sección medular se manifestaron clínicamente en la etapa aguda con cuadriplegia y los dos grupos evolucionaron a una recuperación total. Estos resultados corresponden a los obtenidos en el trabajo previo (5), esta recuperación clínica se puede explicar en función de que no se aplicó isquemia de la arteria espinal anterior. Por otro lado, en el grupo de transplante agudo se encontró ausencia total de la actividad eléctrica comprado con los grupos basal y crónico, lo que demuestra que, el grupo de transplante paso por una etapa de cuadriplegia clínica y eléctrica a una recuperación clínica y eléctrica.Tanto en transplante como en sección no se encontró diferencia significativa entre los grupos basal y crónico con los parámetros de conducción eléctrica evaluados. En el grupo se sección medular, no se observaron cambios significativos en la actividad eléctrica entre los grupos basal, agudo y crónico, lo cual se explica ya que no se provocó isquemia en la sección. Histológicamente se observó daño muy severo en las diferentes zonas, tanto del grupo de transplante como en el de sección. En el grupo agudo con sección se observó una importante degeneración en la zona distal, aunque proximalmente existe aumento de los vasos sanguíneos con características

77

normales, lo cual corresponde a un incremento en vascularidad como manifestación de una probable regeneración. De igual forma, en el grupo crónico con sección se observó degeneración muy severa en las 4 zonas. En el área de la lesión así como en la contralateral y distal a la lesión, se observó una gran cantidad de vasos nuevos con apariencia normal, lo que podría ser indicativo de reparación medular. Mientras que en el grupo de transplante agudo, mostró una importante degeneración, sobre todo en la zona distal en donde se aprecian vasos que abarcan el diámetro del campo visual (74,000 micras). También en el grupo crónico con transplante se observó degeneración severa, pero con gran cantidad de vasos normales, indicativos de regeneración medular. Por otro lado, diversos trabajos han demostrado la presencia del receptor NMDA en médula espinal (71-87), y dado el papel que desempeña este receptor en la plasticidad neuronal, en el presente trabajo se consideró importante observar su presencia y evolución durante el proceso de recuperación medular. Así, la subunidad NR1 se observó una disminución del RNAm en la zona de transplante, contra lateral y distal del grupo agudo transplantado con un aumento de los mismos segmentos de los casos crónicos, esto podría significar un evento de una posible recuperación funcional neuronal que pudiese corresponder a un fenómeno de compensación del daño. La expresión de la sub-unidad NR2A muestra ausencia de la misma en la zona de transplante agudo en las 4 zonas así como en el grupo crónico zona proximal. Mientras se observó una recuperación considerable en las zonas 1, 2 y 4 de los grupos crónicos. Este resultado nos indica la diferencia en el grado de sensibilidad para la expresión de las diferentes subunidades que componen el receptor NMDA, lo cual podría significar cambios importantes en las propiedades del mismo receptor y por lo tanto en el flujo de calcio intracelular. En cuanto a la sub-unidad NR2C, se observó un patrón más estable de las subunidades en las zonas de transplante y contralateral. En las zonas proximal y distal se comporta como el resto de las sub-unidades (NR1 y NR2A), con una ligera disminución de ésta en el agudo y de recuperación en los casos crónicos, y con aumento en el segmento proximal, lo que indica que esta subunidad fue la

78

menos susceptible a cambios en su expresión en relación al resto de las subunidades. Así en conjunto estos resultados podrían indicar que el receptor NMDA parece tener un papel importante en los procesos de degeneración y regeneración, posiblemente modificando su composición y estructura molecular, lo que le permite poseer características y propiedades diferenciales a otras regiones del SNC. Por lo tanto, si estas evaluaciones moleculares son indicativas de degeneración y regeneración, sin conocer los mecanismos involucrados, entonces serán necesarios experimentos adicionales para determinar el papel funcional de estos receptores a glu del tipo NMDA durante los procesos de regeneración en la médula espinal.

79

IX.

CONCLUSIONES

1.-La preservación de la arteria espinal anterior en el transplante homólogo de tejido medular a nivel de C5-C6 permite una recuperación funcional.

2.- Se confirmó la lesión neurológica a nivel de C5-C6 en la etapa aguda y la recuperación secundaria, de la actividad eléctrica en la etapa crónica.

3.- La evaluación histológica indica cambios simultáneos de degeneración y de regeneración que se manifiesta en las zonas contralateral y distal respecto al transplante .

4.- Los niveles de expresión de NR1, NR2A y NR2C del receptor NMDA sugieren que la recuperación de la médula espinal puede iniciar en la zona contralateral de los grupos de sección y transplante.

5.-La composición del receptor NMDA en médula espinal es diferente a otras regiones del SNC, cuya implicación funcional en los procesos de regeneración medular deberá de estudiarse en el futuro.

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X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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