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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y

BI O Q

UI

M IC A

BIOQUIMICA

Y

Determinación del marcador molecular ácido ganodérico A en

AC

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productos comerciales elaborados a base de Ganoderma lucidum,

FA

RM

por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

DE

TESIS II

TE CA

PARA OBTAR EL GRADO DE BACHILLER

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AUTORES:

BI

ROSALES SÁNCHEZ, ANDERSON BRANDO VÁSQUEZ PAYAC, DANIEL ORLANDO

ASESOR: Mg. GANOZA YUPANQUI, MAYAR LUIS Trujillo - Perú 2013

i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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M IC A

A Dios nuestro padre todo poderoso por bendecirme e iluminarme en mi camino, y ayudarme a superar todos los obstáculos para poder seguir adelante y cumplir mis metas.

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A mis padres Amado y Noemí que me dieron la vida y me apoyaron en todo momento a pesar de la distancia.

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A mis queridos hermanos Karen y Adderly quienes a pesar de todo siempre me apoyaron.

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A mi enamorada Jahaira por soportarme, sin ella esto no pudo haber sido posible.

Anderson B. R. S. i

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M IC A

A Dios por guiar siempre mi camino. Por todas Sus bondades y darme la fortaleza así como el optimismo para alcanzar todas mis metas y de esta manera poder ser el orgullo de mis padres, familiares y amigos que forman parte de mi existir.

TE CA

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AC

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Y

A mis padres: Francisco e Irene que siempre estuvieron apoyándome en todo momento.

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A mis queridos hermanos Fernando y Ronald que estuvieron conmigo en todo momento.

Daniel O. V. P. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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AGRADECIMIENTOS

Nuestro agradecimiento en primer lugar a Dios por regalarnos la vida.

M IC A

A nuestros profesores, que hoy pueden ver un reflejo de lo que han formado y que sin duda han calado hondo en nuestras vidas, permitiéndonos escoger esta profesión, por

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el amor que hemos visto reflejados en su desarrollo profesional.

A nuestro asesor y maestro Mg. Mayar Ganoza Yupanqui, por la paciencia que tuvo,

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Y

el apoyo y la dedicación que demostró durante la realización del presente trabajo.

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A todas aquellas personas que hicieron posible el desarrollo de la presente memoria,

BI

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DE

FA

RM

en especial al Ing. Noé Costilla Sánchez, por su apoyo y colaboración.

iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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JURADO DICTAMINADOR

…………………………………………………..

M IC A

Dr. MANUEL MIRANDA LEYVA

AC

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Y

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(PRESIDENTE)

RM

………………………………………………………………..

(MIEMBRO)

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DE

FA

Mg. JULIO CAMPOS FLORIÁN

…………………………………………………………. Mg. MAYAR GANOZA YUPANQUI (MIEMBRO)

iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado: Dando cumplimiento a lo establecido por los reglamentos de trabajos de investigación de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo,

M IC A

sometemos a vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente informe de Investigación “Determinación del marcador molecular ácido ganodérico A en

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productos comerciales elaborados a base de Ganoderma lucidum, por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)”. Es propicia esta oportunidad

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para manifestar el más sincero reconocimiento a nuestra alma Máter y su plana

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docente, que con su conocimiento, capacidad y buena voluntad contribuyen con

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nuestra formación profesional.

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Dejamos a criterio, señores miembros del jurado la calificación del presente trabajo de

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DE

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Investigación Científica.

BI

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Trujillo, Enero 2013

Rosales Sánchez, Anderson Brando

Vásquez Payac, Daniel Orlando

i

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ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS

Grados Celsius

cm

Centímetros

col.

Colaboradores

Fig.

Figura

g

Gramos

KHz

Kilohertz

L

Litros

min

Minutos

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Y

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°C

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Listado de símbolos, abreviaturas y acrónimos empleados en esta memoria.

Mililitros

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mL

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mUA

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m.s.n.m

μg

Microgramos Partes por millón

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ppm

Nanómetros

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nm

Metros sobre el nivel del mar Factor nuclear kappa B

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NF-κB

Miliunidades de área

vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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ÍNDICE DE CONTENIDOS Resumen…………………………………………………………………………………………..……………………...1 Abstract………………………………………………………………………………………….….…….………………2 Introducción…………………………………………….………………………..…………….…..………4

1.1

Generalidades del reino fungi……...…………………………….………….…..….…..………..…...5

1.2

Género Ganoderma…...……………………………...….……………..…..……..…….………..………..7

M IC A

1

1.2.1 Características………………………………………………………………………………...…………..…7

Especie Ganoderma lucidum………………………………..……..……………………..…..…….….8

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1.3

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1.2.2 Sistemática clásica………………………………………………………………….….…...…….………..8

1.3.1 Generalidades……….………………………………………………………………………...…………..…8

IA

Y

1.3.2 Compuestos activos……………………………………………………………….….…...…….………10

AC

1.3.3 Usos medicinales de Ganoderma lucidum………………………………………….....………..12

RM

1.3.4 Producción mundial……………………………………………………………….…......…….……….13

FA

1.3.5 Mercado de Ganoderma lucidum y sus derivados……………………..…......…….……….14 Material y método………………………………….…………………………….……….…..………..19

2.1

Material……………………..…………….……………….……………………………………………..…..19

DE

2

TE CA

2.2.1 Material biológico………………………………………………………………………....…………..…19 2.2.2 Material de laboratorio………………………………………………………………………………...19

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2.2.2.1 Material de uso común……………………………………………………..……………………….....19

BI

2.2.2.2 Equipos………………………………………………………………………..…..……………………….....19 2.2.2.3 Reactivos…………………..……………………………………………………..……………………….....20 2.2.2.4 Otros………………………………………………………………………………..……………………….....20 2.2

Método………………………………………………………………..………………………………………21

2.2.1 Recolección de la muestra………………………………………………………...…...…………..…21 2.2.2 Selección de la muestra…………………………………..…….……………………………………...21

vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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2.2.3 Almacenamiento de la muestra………………………………………………...…...…………..…21 2.2.4 Preparación de la muestra…………………………………….……………………………………...21 2.2.5 Preparación del estándar o solución test………………………………………..…………..…22 2.2.6 Análisis por Cromatografía Líquida de Alta resolución………………...………………...22 Resultados………………………………………………………………..……………………………..…24

3.1

Preparación de la curva de calibración….………..……………………………….……...….…24

3.2

Determinación de ácido ganodérico A en muestras comerciales…………………...24

4

Discusión…………………………………………………………………………………………....………27

4.1

Preparación de la curva de calibración….………..……………………………….……...….…27

4.2

Determinación de ácido ganodérico A en muestras comerciales………………..…..28

5

Conclusiones……………….………………………………………………………….……………….…30

6

Recomendaciones……………….……………………………………………..…………....…………32

7

Referencias bibliográficas……………………………………………………….…….……..……34

RM

AC

IA

Y

BI O Q

UI

M IC A

3

BI

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TE CA

DE

FA

Anexos………………..…………………………………………………………….………………………….……..…41

viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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RESUMEN

El presente trabajo de investigación intitulado Determinación del marcador molecular Ácido Ganodérico A en productos comerciales elaborados a base de extracto de Ganoderma lucidum por Cromatografía Líquida de alta Resolución (HPLC), tiene por

M IC A

objetivo determinar si los productos elaborados y comercializados a base de extracto de Ganoderma lucidum, cuentan con el marcador molecular: el Ácido Ganodérico A. El

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Ácido Ganodérico A viene a ser un componente triterpenoide mas importante dentro de la composición del Ganoderma lucidum debido a sus propiedades terapéuticas.

Y

La operación consistió en una extracción clorofórmica de los productos elaborados a

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base de extracto de Ganoderma lucidum; esta técnica extractora se realizó a 40 °C por

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30 minutos. Posteriormente mediante la realización de la prueba de Lieberman-

FA

RM

Burchard se comprobó si las muestras de Ganoderma contenían triterpenos.

BI

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DE

Palabras claves: Ganoderma lucidum, triterpenos, HPLC.

i

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ABSTRACT

This research paper entitled Synthesis of substituted oxa-heterocyclic compounds from dimedone and benzaldehyde derivatives, is to obtain a series of oxa-

M IC A

heterocyclic compounds substituted, by the dehydration of the adducts formed by the tandem Knoevenagel – Michael reaction. Oxa-heterocyclic compounds obtained are

UI

functional derivatives of xanthene, which is considered a dibenzo-γ-pirano.

BI O Q

The derivatives of benzaldehyde (10 mmol) and dimedone (20 mmol) interact in a tandem system Knoevenagel - Michael in presence of piperidine as catalyst and ethanol

Y

as solvent to produce adducts intermediaries by dehydration in the presence of

IA

hydrochloric acid generated the final compounds. The reaction was monitored by thin

RM

AC

layer chromatography (TLC).

BI

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TE CA

DE

FA

Keywords: Ganoderma lucidum, triterpenes, HPLC.

2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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INTRODUCCIÓN

1.1

GENERALIDADES DEL REINO FUNGI Los hongos constituyen un reino de la naturaleza independiente de las plantas y

de los animales, ya que comparten características de ambos, es un grupo muy variado y

M IC A

polimórfico que se encuentra prácticamente en todos los ambientes, su nombre “fungus” significa florecimiento o excrecencia de la tierra aplicado por Tournefort en el

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UI

siglo XVII1. Este término coincide con el que los purépechas utilizaban para referirse a

Y

los hongos, “echeriue tsikuaro enganaka” que quiere decir nacido de la tierra.2

IA

Inicialmente, los hongos fueron clasificados dentro del Reino Plantae, ya que

AC

fueron considerados organismos inmóviles presentando estructuras que se asientan

RM

firmemente en el sustrato sobre el que crecen. Sin embargo, cuando se ha aplicado la

FA

biología molecular en los estudios taxonómicos, se ha observado que los hongos están

DE

más próximos al Reino Animalia que al Plantae. En el año 1969, Whitaker los diferenció

TE CA

en un reino aparte, el Reino Fungi o quinto reino.3

BL IO

Los hongos son organismos eucariotas que poseen una pared celular compuesta fundamentalmente por polisacáridos y diversas proteínas. Los polisacáridos más

BI

importantes son la quitina (polímero de n-acetilglucosamina), el manano (polímero de manosa) y el glucano (polímero de glucosa). Aunque comparten muchas estructuras, las células de los hongos se diferencian de las células vegetales en la composición de la pared y en que carecen de cloroplastos y clorofila. Mientras que la diferencia con las células animales es que las células de los hongos tienen pared celular y presentan ergosterol en la membrana citoplásmica. Los hongos presentan básicamente dos tipos 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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de morfología celular: una multicelular filamentosa denominada micelio y otra unicelular denominada levaduriforme. Los hongos filamentosos (miceliares o mohos), representan el crecimiento más típico de los hongos microscópicos. En medios de cultivo sólido y también sobre cualquier superficie en la que se desarrollen, por ejemplo frutas u otros alimentos, producen colonias algodonosas o pulverulentas que

M IC A

son muy características. Al microscopio óptico, los hongos filamentosos presentan unas estructuras tubulares denominadas hifas. En la mayoría de los hongos filamentosos, las

UI

hifas son tabicadas y presentan septos que delimitan las diferentes células. Las hifas

BI O Q

que carecen de septos se denominan cenocíticas o sifonadas. Las hifas de los hongos tabicados suelen tener un diámetro inferior (2-5 μm) a las de los hongos sifonados (10-

IA

Y

15 μm). Las hifas normalmente se desarrollan a partir de esporas, aunque también

AC

pueden originarse a partir de fragmentos de otras hifas, y crecen gracias al depósito de

RM

nuevos materiales en su extremo, ramificándose con mucha frecuencia hasta producir

FA

una maraña de filamentos que constituyen el micelio. En una colonia de un hongo filamentoso se produce una diferenciación en las funciones del micelio, de tal forma

DE

que el micelio vegetativo penetra en el sustrato para obtener los nutrientes, mientras

TE CA

que el micelio aéreo se proyecta hacia el exterior de la colonia y puede producir esporas asexuales.4

BL IO

Se estima, que existe más de un millón de especies de hongos en el planeta, pero

BI

tan sólo unas 70,000 de ellas han sido descritas; no así en los países de las regiones tropicales, de los cuales apenas se conocen el 5% a nivel mundial, porcentaje que disminuye cuando nos referimos a la diversidad micológica de los trópicos. Mientras tanto, muchas especies de hongos se han extinguido y otras se encuentran amenazadas en todo el mundo. Durante muchos años, los hongos han formado parte de la dieta humana como un tipo especial de alimento. Por prueba y error, los humanos han

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aprendido a evitar los hongos venenosos, que representan aproximadamente el 10% de las cerca de 100.000 especies conocidas en el mundo. Se cree que sólo alrededor del 10% de todas las especies de hongos son comestibles.5

De las 150 especies conocidas de hongos comestibles de los cuales algunos

M IC A

contienen propiedades medicinales solo la mitad es cultivada, solo algunas especies con fines comerciales, mientras que la otra mitad se encuentra de manera silvestre. La

UI

importancia ecológica de esta actividad radica en la utilización y reciclaje acelerado de

BI O Q

millones de toneladas de subproductos agrícolas, agroindustriales y forestales utilizados como substrato en el proceso de cultivo6,7. Sin embargo, es poco conocido su

IA

Y

gran potencial como alimento funcional con propiedades nutricionales y medicinales

AC

que promueven la salud. Estas propiedades son únicas y diferentes a las aportadas por

FA

RM

otros alimentos ampliamente consumidos.8

Desde la perspectiva económica, los hongos ofrecen múltiples servicios, pues se

DE

utilizan como alimentos, levaduras de la masa de pan, fermentadores en la producción

TE CA

de vino y cerveza, en la maduración de quesos y en el control biológico de plagas agrícolas. Además, como fuentes de sustancias que por su actividad biológica pueden

BL IO

ser de enorme utilidad en medicina y en la bioindustria, por ejemplo en la producción

BI

de antibióticos.9,10

Los hongos han sido tradicionalmente usados en la medicina oriental, recomendados en los siguientes casos:

para reducir los niveles de colesterol,

tratamiento de la diabetes, hipertensión, desórdenes

nerviosos, buena memoria,

antiparasítico, disfunción sexual, rejuvenecimiento, laxante, daños en la piel, caída del

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cabello, antiinflamatorio, antitumorales y úlcera intestinal; entre ellos se pueden citar algunos: Tremella fusciforme, Auricularia aurícula, Auricularia polytricha, Ganoderma lucidum, Schyzophyllum commune, Grifota frondosa, Pycnoporus sanguineus, Geastrum saccatum, Lentinula edodes, Pleurotus djamour, Hericium erinaceum, y Coriolus

1.2

M IC A

versicolor.11,12

GÉNERO Ganoderma

UI

1.2.1 Características

BI O Q

Los hongos poliporáceos son clasificados por tener muchos poros pequeños en la parte inferior del cuerpo fructífero, los cuales contienen esporas, y una apariencia

IA

Y

leñosa. Ganoderma pertenecen al reino Fungi, división Basidiomicota, clase

AC

Himenomicetes, orden Poliporales, familia Ganodermataceae.13

RM

Desarrollan el cuerpo fructífero sobre los troncos de árboles caducos o raíces

FA

muertas. Sus basidiomas son anuales o perennes en forma de repisa, pileados y estipitados central o lateralmente. La superficie del píleo está cubierta por una costra

DE

resinosa lisa de color opaca a brillante, con una cutícula distintiva de color café en

TE CA

varios tonos a purpura oscuro, los poros son de pequeños a medíanos con borde entero blanquecinos, ocráceos a color café. El sistema hifal es trimítico, las basiodiosporas son

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truncadas de grande a muy grande (7-25 μm de longitud), amarillas a color café,

BI

ovoides a elipsoides. Las especies de Ganoderma se encuentran entre los hongos que son capaces de crecer bajo condiciones elevadas de temperatura y humedad. Este género presenta distribución mundial y crece en una gran diversidad de climas incluyendo las zonas tropicales e incluso las templadas. El género Ganoderma actúa como parasito facultativo.14

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1.2.2 Sistemática clásica El tipo de Ganoderma fue establecido por Karstan en 1881. Actualmente, el tipo de las especies se escribe como Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst15. Posteriormente el género fue dividido en dos grupos distintos, los lacados con una capa fina cerosa y brillante en la superficie del cuerpo fructífero del complejo Ganoderma

M IC A

lucidum y, las especies no lacadas del complejo Ganoderma applanatum, desde entonces, los más de 250 nombres taxonómicos del genero Ganoderma que han sido

UI

publicados, señalan que este género es morfológicamente complicado16. Como

BI O Q

resultado, el concepto de especie en este género no está bien establecido

ESPECIE Ganoderma lucidum

AC

1.3

IA

Y

universalmente.17

RM

1.3.1 Generalidades

FA

Ganoderma lucidum pertenece al reino Fungi, Phylum Basidiomicota, clase Himenomicetes, orden Polyporales, familia Ganodermataceae, género Ganoderma. Su

DE

taxonomía es compleja debido a una pobre e inadecuada descripción morfológica y a

TE CA

múltiples nombres dados a una especie en particular.18

BL IO

El nombre Ganoderma deriva del griego ganos (brillo, resplandor) y dermis

BI

(piel) mientras que lucidum en latín significa brillante. También es conocido como el políporo panacea. La historia herbácea de G. lucidum ha sido largamente documentada en la antigua farmacopea china escrita alrededor de 2.000 años atrás.19

G. lucidum crece como saprobio en tocones y árboles caducos como robles y otras maderas duras, nunca en pinos, se desarrolla de los 1000 a 2000 msnm. Se

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encuentra distribuido por todo el mundo, en zonas tropicales y zonas templadas, incluido Norteamérica, Sudamérica, África, Europa y Asia. En el sur de Estados Unidos de Norteamérica y la costa del golfo de México se tienen la mayor cantidad de registros de esta especie.19

M IC A

G. lucidum es un hongo políporo suave cuando es fresco, chato, rojizo, con sombrero arriñonado y, dependiendo de la edad, posee poros blancos a marrones. No

UI

posee laminillas y libera sus esporas de 9-12 x 5,5-8 μm a través de poros finos. En su

BI O Q

proceso de crecimiento, primero se desarrolla el estípite cuyo extremo superior se dobla y crece en forma de espátula que se va ensanchando hasta formar un sombrero o

IA

Y

píleo, más o menos circular, reniforme o en abanico, de 3-12 cm de diámetro y 2-3 cm

AC

de grosor con una superficie dura y muy brillante. El pie alcanza una altura de 8-15 cm,

RM

sin embargo algunos pueden ser más cortos. Las esporas son de color pardo,

FA

elipsoidales y truncadas, provistas de dos capas: un exosporium hialino y un

DE

endosporium pardo verrugoso.19

TE CA

G. lucidum es un hongo económicamente importante, particularmente en China, Corea y Japón, debido a sus propiedades medicinales. Es un hongo de pudrición blanca

BL IO

(degrada completamente la lignina)20 y crece anualmente de manera natural sobre una

BI

amplia variedad de árboles caducifolios como Quercus, Acer, Ulmus, Betula, Salix, etc. En el Oriente, se desarrolla esencialmente en árboles del género Prunus, mientras que en las regiones subtropicales de Europa, Asia, América del Sur y del Norte, crece principalmente, aunque con menos frecuencia, en árboles de coníferas como Larix, Picea y Pinus.21

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G. lucidum posee un 31% de humedad, con el 7.3% de proteína en base a peso seco. El contenido de glucosa es de 11.1% y un 10.2% de metales, en peso seco (K, Mg y Ca son los mayores componentes) con Ge como quinto metal más abundante, con una concentración de 489 μg/g, este es un hongo bajo en calorías y rico en proteínas

M IC A

vegetales, quitina, vitaminas y minerales.22

1.3.2 Compuestos activos

UI

Desde el punto de vista medicinal, los compuestos importantes que se

BI O Q

encuentran en G. lucidum son principalmente polisacáridos (β-D-glucanos), esteroles (especialmente ergosterol), triterpenos (ácidos ganodéricos), glucósidos, riboflavina,

IA

Y

ácido ascórbico y aminoácidos. Además, posee fibra (mucopolisacáridos, quitina), es

AC

decir, compuestos de alto peso molecular que no se absorben o se transforma en el

RM

tracto digestivo, y por lo tanto, estos son directamente excretados como tales. La

FA

característica más atractiva de este tipo de hongos medicinales es su efecto

triterpenoides

TE CA

Los

DE

inmunomodulador y actividad antitumoral.23, 24,25

aislados

de

esporas

de

G.

lucidum

mostraron

significativamente actividades anti-VIH-1 proteasa, anti-tumor, y anti-complemento.

BL IO

Los triterpenoides son los principales constituyentes activos de las esporas de

BI

Ganoderma y muestran actividades biológicas diferentes para su uso medicinal. Por definición se consideran “productos naturales que tienen esqueleto de 30 átomos de carbono y que derivan del escualeno (6 unidades de isopreno) por ciclaciones y/o modificaciones de este”.52

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Se han identificado las propiedades físico-químicas de más de 150 triterpenoides encontrados en G. lucidum. Se han dividido en 10 grupos de acuerdo a sus similitudes estructurales y sus actividades biológicas y medicinales conocidas. Se han aislado de los frutos, las esporas y el micelio por varios procedimientos cromatográficos. El hongo produce amargor durante la fructificación y ese sabor está

M IC A

contribuido por sustancias, tales como ácidos ganodéricos A, C, I, y J; ácidos lucidénicos

UI

A, D, I y lucidonas A y C.26

BI O Q

Más de 200 tipos de polisacáridos han sido aislados del cuerpo fructífero, las esporas y micelio, o separados del caldo de cultivos sumergidos de G. lucidum27. Los

como

β-D-glucanos

y

heteropolisacáridos,

se

han

aislado

y

AC

polisacáridos

IA

Y

polisacáridos constituyen aproximadamente el 45% en peso seco, glicoproteínas y

RM

caracterizado21 siendo los β-(1,3)(1,6)-D-glucanos las principales especies de

FA

polisacáridos presentes en extractos de este hongo. Extensos estudios han demostrado que los polisacáridos inmunomoduladores se obtienen a partir del extracto acuoso en

DE

forma de β-D-glucanos, los cuales se precipitan adicionando etanol, éstos presentan un

TE CA

patrón de unión 1-3, sus cadenas son relativamente pequeñas mostrando una estructura helicoidal.1 El Ganopoly® es un extracto acuoso patentado (fracción

BL IO

polisacárida) que se encuentra en fase clínica, eficaz contra la diabetes mellitus tipo

BI

II.28

1.3.3 Usos medicinales de G. lucidum G. lucidum ha sido utilizado en la medicina tradicional de China y Japón, especialmente como auxiliar en el tratamiento de la hepatitis, hipertensión, hipercolesterolemia, cáncer, artritis y bronquitis23, por lo que en las últimas décadas

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algunos investigadores se han dedicado a estudiar el efecto que pudieran tener los distintos componentes bioactivos presentes en G. lucidum sobre células de mamíferos, incluyendo células humanas.26

Claramente, los efectos de G. lucidum se deben principalmente a los

M IC A

polisacáridos y/o triterpenoides del hongo. Más de 130 triterpenoides se han aislado

UI

del cuerpo de la fruta, micelos y esporas, durante las últimas dos décadas. 29,30

antihepatitis

B32,

BI O Q

Algunos de los triterpenoides muestran actividades antiandrogénica31, antioxidante33,

antitumoral34,35,

anticomplemento36,

IA

Y

antimicrobiana37, contra el VIH-138, inhibidor selectivo de la DNA polimerasa

RM

AC

eucariota39, e inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina.40

FA

En experimentos posteriores Sliva y col. (2002) observaron que extractos obtenidos a partir de esporas y basidiomas de G. lucidum inhiben constitutivamente la

DE

actividad de los factores AP-1 y NF-κB en células humanas con cáncer de mama y

TE CA

cáncer de próstata altamente invasivas.41

BL IO

Xie y col. (2006) observaron que extractos de G. lucidum poseen propiedades

BI

antioxidantes e inhiben la proliferación de células humanas con cáncer colorrectal.20

En otra instancia, Cheung et al. (2000) encontraron la presencia de compuestos neuroactivos en extractos de G. lucidum, que inducen la diferenciación neuronal y neuroprotección en células de rata PC12.42

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Así mismo se ha observado que algunos elementos bioactivos de este hongo inhiben fuertemente la multiplicación del VIH-1.43

1.3.4 Producción mundial Los hongos no crecen directamente en el suelo como las otras plantas, sino en

M IC A

substratos orgánicos, crudos o compostados, de modo que no compiten con las plantas por espacio de una plantación. Estos substratos son los desperdicios agrícolas e

UI

industriales, subproductos generalmente inútiles que pueden ser reciclados para

BI O Q

producir un alimento adicional o un producto con propiedades medicinales. Ejemplos de tales materiales son los residuos de maíz, fardos, aserrín, bagazo, la pulpa de

IA

Y

madera, los desperdicios de la palma de aceite y el algodón, de la cosecha de banana y

AC

café, los desperdicios de explotaciones avícolas, las cáscaras de coco, la corteza y las

FA

RM

hojas de árbol.44

Actualmente el cultivo comercial de G. lucidum representa una industria

DE

mundial en constante crecimiento, ya que los compuestos bioactivos purificados y

TE CA

aislados de los carpóforos son una alternativa confiable para el tratamiento de diversas enfermedades que afectan al humano tales como hipertensión, diabetes, glicemias,

BL IO

cáncer y algunas enfermedades producidas por virus. Las especies del género

BI

Ganoderma contienen diferentes niveles de compuestos bioactivos. G. lucidum es el que produce mayor cantidad de polisacáridos y ácidos ganodéricos, pero esto dependerá de las condiciones ambientales que afectan las características morfológicas, macroscópicas y microscópicas, así como también la conformación de los metabolitos y su actividad biológica, de ahí su dificultad de identificar las especies al momento de recolectarlas.45

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Por lo tanto, está surgiendo el mercado mundial para productos farmacéuticos y funcionales. El término funcional se usa para una nueva clase de compuestos que se pueden extraer tanto del micelio como del cuerpo fructífero del hongo, capaces de proporcionar beneficios a la salud y ayudar a prevenir, tratar o aliviar enfermedades.

M IC A

Los hongos funcionales pueden poseer propiedades tanto nutritivas como medicinales, siendo aquellas que son utilizadas como suplemento alimenticio, principalmente, para

UI

fortalecer el sistema inmunológico, prevenir y tratar el cáncer, diabetes, SIDA y

BI O Q

enfermedades cardiovasculares y parasitarias.46

IA

Y

El único inconveniente es el alto costo de compra. Una capsula que contenga

AC

uno a dos gramos de Ganoderma lucidum tiene un costo de un dólar americano. Como

RM

un tratamiento intensivo se propone tres a seis capsulas diarias de, el tratamiento está

FA

realmente reservado a pacientes afortunados. Por otra parte se espera que el cultivo eficiente de los hongos medicinales y la extracción de los principios activos lleven a

TE CA

DE

una disminución del precio.47

1.3.5 Mercado de G. lucidum y sus derivados

BL IO

Los datos sobre el mercado mundial son difíciles de encontrar y las cifras se

BI

relacionan solamente con la producción en Asia. El mercado mundial de los hongos medicinales se ha estimado en 3.9 billones de dólares americanos solo para 1995, representando el mercado de tónicos y medicinas. Durante la década pasada, su crecimiento ha sobrepasado en forma consistente el desarrollo rápido de hongos comestibles. Mientras que la demanda de hongos medicinales está concentrada en Asia, su atractivo está aumentando en Europa y en Norte América donde no hay el

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conocimiento del saber cómo (Know how) ni tradición. El rey de los hongos medicinales es G. lucidum. El interés comercial en G. lucidum está creciendo, esta especie está asociada en la cultura China con buena salud y longevidad. En 1995, el valor en el mercado mundial de los productos de G. lucidum se estimó en 1.6 billones de dólares. El valor por comparaciones de los tónicos y nutraceúticos de G. lucidum en

M IC A

los Estados Unidos de América es solo de 10 millones de dólares. El mercado Europeo, latinoamericano y africano no existe. En el 2002 la producción mundial de G. lucidum

UI

fue de alrededor 5000 toneladas, de las cuales 3800 toneladas fueron producidas en

BI O Q

China.48

IA

Y

Las últimas estimaciones disponibles colocan el valor anual de los productos de

AC

G. lucidum en más de US$ 2,5 billones. Se espera que estos valores se incrementen aún

RM

más cuando las propiedades medicinales atribuidas a este hongo se confirmen con los

FA

ensayos que se están realizando en seres humanos.48

DE

G. lucidum se ha preparado en diversos tipos de formulaciones, estos incluyen

TE CA

rodajas y polvo de cuerpos fructíferos, extractos preparados a base de agua y/o solventes orgánicos, bebidas, jarabes, y lociones de uso externo. Al menos 100

BL IO

diferentes marcas de productos a base de G. lucidum se venden en el mercado. En el

BI

2004 se calculó un volumen de ganancia anual mundial de estos productos de aproximadamente 2.16 billones de dólares.48

Los extractos de G. lucidum son especialmente populares y su uso va en aumento en pacientes a que hayan estado sometidos a tratamiento de quimioterapia o que haya estado tomando antibióticos durante periodos prolongados. A diferencia de la

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mayoría de los productos farmacéuticos, estos compuestos biológicamente activos extraídos de hongos medicinales tienen una baja toxicidad, aun en dosis altas. El mercado mundial de productos con base en plantas medicinales (extractos y fitoterapéuticos) es aproximadamente de 14 billones de dólares anuales. Actualmente el mercado de fitoterapéuticos europeo y norteamericano crece a tasas anuales del

M IC A

10%, siendo este crecimiento más dinámico que el presentado por los farmacéuticos convencionales de acuerdo con el “Pharmaceutical raw materials, pharmaceutical

BI O Q

UI

products and medicinal herbs”.49

El mercado norteamericano de fitoterapéuticos es de 10 billones de dólares, y el

IA

Y

mercado de la Unión Europea es en la actualidad de 4.4 billones de Euros anuales;

AC

Alemania registra el 45% de este comercio, se comercializan alrededor de 1560 plantas

RM

medicinales y Francia el 29%. Le siguen en importancia, Italia, Reino Unido, España,

FA

Holanda y Bélgica.49

DE

Existen muchas compañías internacionales que se dedican a la producción y

TE CA

comercialización de G. lucidum, la mayoría de ellas de origen chino. Tal es el caso de Gano Excel, fundada en 1995, en el estado de Kedah, Malasia, que es una compañía

BI

BL IO

mundial en redes de mercadeo y que llega al Perú en el año 2007.

En vista de que en el país aún no se han publicado muchos estudios de G.

lucidum o de sus productos comercializados, nos hemos propuesto realizar la presente memoria debido, ya que es una alternativa terapéutica a muchos problemas de la salud, asociado a que su popularidad y consumo va en aumento. Queremos instaurar una base científica para su uso apropiado y además asegurar de que los productos

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comerciales elaborados a base de extracto de G. lucidum tengan los componentes específicos y cantidades que declaran. Además, en nuestra facultad e incluso en toda la Universidad Nacional de Trujillo no existen trabajos de investigación sobre dicho hongo o sus derivados, y que pueden ser extendidas a estudios farmacológicos.

M IC A

Es por ello que se plantea el siguiente objetivo general:  Determinar la concentración del marcador molecular ácido ganodérico A en

BI O Q

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

UI

productos comerciales elaborados a base extracto de G. lucidum por

IA

Y

Y para lo cual se tienen los siguientes objetivos específicos:

AC

 Realizar la curva de calibración para determinar concentración de ácido

RM

ganodérico A en los productos comercializados a base de G. lucidum.

FA

 Cuantificar el marcador molecular Ácido ganodérico A en productos comerciales

BI

BL IO

TE CA

DE

elaborados a base de extracto de G. lucidum por HPLC

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MATERIAL Y MÉTODO

2.1

MATERIAL

2.1.1 Material biológico Productos comerciales elaborados a base de extracto de G. lucidum procedentes

M IC A

de la ciudad de Trujillo, región La Libertad.

BI O Q

UI

2.1.2 Material de laboratorio 2.1.2.1 Material de uso común

Y

 Matraces Erlenmeyer de 250 y 500 mL

IA

 Balones fondo plano de 250 mL

TE CA

 Cocina eléctrica

DE

 Soporte universal

RM

 Papel filtro

FA

 Probetas de 100 y 500 mL

AC

 Vasos de precipitación de 100, 250 y 500 mL

BL IO

 Pipetas de 10 mL

2.1.2.2 Equipos

BI

 Baño de agua ultrasónico DC 150H  Equipo HPLC serie Agilent 1100  Balanza analítica Sartorius  Equipo rotavapor  Equipo de filtración al vacío

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2.1.2.3 Reactivos  Estándar ácido ganodérico A  Ácido acético glacial 99.8% de pureza  Cloroformo 99.8% de pureza  Acetonitrilo grado HPLC

M IC A

 Metanol grado HPLC

UI

 Agua ultrapura

BI O Q

2.1.2.4 Otros  Papel filtro Whatman N° 1

 Filtro de jeringa

MÉTODO

TE CA

2.2

DE

FA

 Viales ámbar para HPLC

RM

 Jeringa descartable de 3mL

AC

IA

Y

 Filtro de membrana 0.45μm

2.2.1 Recolección de la muestra

BL IO

Se recolectaron cinco lotes diferentes de productos comerciales elaborados a base de extracto de G. lucidum tanto de la marca Gano Excel y Organo Gold

BI

comercializados en la ciudad de Trujillo, región La Libertad. La recolección de las muestras se realizó por compra directa al proveedor de cada marca comercial y se verificó que esté en buenas condiciones.

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2.2.2 Selección de la muestra Se seleccionaron aleatoriamente tres muestras representativas de cinco lotes diferentes por cada marca comercial.

2.2.3 Almacenamiento de la muestra

UI

análisis instrumental de la facultad de ingeniería Química.

M IC A

Las muestras se almacenaron en un lugar fresco y seco del laboratorio de

BI O Q

2.2.4 Preparación de la muestra

Se tomaron 2 g de muestra y se extrajo con 40 mL de cloroformo, asistida por un

IA

Y

baño de agua ultrasónico (capacidad 7.2 L con frecuencia de operación 40 KHz) a una

AC

temperatura de operación de 40 °C por 30 minutos. La temperatura aplicada a la

RM

extracción asistida por ultrasonido no puede sobrepasar los 40 °C, para evitar la

FA

transformación de los posibles compuestos bioactivos53. Los extractos clorofórmicos obtenidos se concentraron al vacío hasta sequedad en un rotavapor a 35 °C,

DE

obteniéndose así los extractos crudos correspondientes. El extracto seco se disolvió en

TE CA

5 mL de metanol y se filtró a través de un filtro de membrana de 0.45 μm. Entonces

BL IO

10μL de cada muestra se analizó por HPLC.

BI

2.2.5 Preparación del estándar o solución test La solución estándar para el análisis en HPLC se preparó disolviendo una

cantidad exacta del estándar Ácido Ganodérico A en metanol. La solución madre tuvo una concentración de 1000 ppm. Luego, a partir de esta solución madre se prepararon cinco soluciones estándard con concentraciones crecientes de 1, 16 ppm; 2, 24 ppm; 3, 32 ppm; 4, 48ppm; 5, 64ppm. Luego de estas soluciones se cogieron 10μL para ser

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analizadas por HPLC. La curva de calibración se trazó a partir de la regresión lineal de relaciones de área de pico frente a la concentración del estándard Ácido Ganodérico A.

2.2.6 Análisis por Cromatografía Líquida de alta resolución (HPLC) El análisis fue en un equipo HPLC Agilent serie 1100 equipado con una bomba

M IC A

cuaternario, un detector arreglo diodo (DAD) y un auto muestreador. La muestra fue separada en una columna Zorbax C18 (5 μm, 4.6 x 150 mm; Agilent). La fase móvil

UI

consistió en acetonitrilo: ácido acético glacial 0.2%, con una gradiente de 30% de

BI O Q

acetonitrilo por 5 minutos, después a 40% por 10 minutos y se bajo a 30% por otros 5 minutos. El flujo fue de 1.0 mL/min con la columna a 35 °C, el DAD fue monitorizado a

BI

BL IO

TE CA

DE

FA

RM

AC

IA

Y

252nm y el espectro UV on-line fue registrado en el rango de 190-400 nm.

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RESULTADOS

3.1

PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN La tabla 1 muestra la ecuación de regresión y el coeficiente de correlación para

M IC A

el estándar ácido ganodérico A

Concentración de la soluciones

ganodérico

estándar (μg/mL)

A

16, 24, 32, 48, 64

Ecuación de

BI O Q

Acido

UI

Tabla 1. Ecuación de regresión y coeficiente de correlación para el ácido ganodérico A.

R2

y = 5.635x - 11.55

0.999

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GANODÉRICO A EN MUESTRAS COMERCIALES

AC

3.2

IA

Y

regresión

RM

En las tablas 2 y 3 se muestran las concentraciones de ácido ganodérico A

DE

FA

presente en las muestras tanto de Gano Excel y Organo Gold respectivamente.

TE CA

Tabla 2. Concentración de ácido ganodérico A en las muestras de Gano Excel.

BI

BL IO

Muestra

Concentración de ácido ganodérico A (μg/mL)

GE1

0

GE2

0

GE3

0

GE4

0

GE5

0

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Tabla 3. Concentración de ácido ganodérico A en las muestras de Organo Gold. Muestra

Concentración de ácido ganodérico A

0

OG2

0

OG3

0

OG4

0

OG5

0

BI

BL IO

TE CA

DE

FA

RM

AC

IA

Y

BI O Q

UI

OG1

M IC A

(μg/mL)

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DISCUSIÓN

PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

BI

BL IO

TE CA

DE

FA

RM

AC

IA

Y

BI O Q

UI

M IC A

4.1

23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GANODÉRICO A EN MUESTRAS COMERCIALES

BI

BL IO

TE CA

DE

FA

RM

AC

IA

Y

BI O Q

UI

M IC A

4.2

24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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CONCLUSIONES

1.

Se logró realizar la curva de calibración del ácido ganodérico A con un R2 =

2.

M IC A

0.999

Las muestras comerciales elaboradas a base G. lucidum no poseen el marcador

BI

BL IO

TE CA

DE

FA

RM

AC

IA

Y

BI O Q

UI

molecular ácido ganodérico A.

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RECOMENDACIONES

Realizar una marcha fitoquímica preliminar al hongo Ganoderma lucidum.

2.

Cuantificar ácido ganodérico A en muestras recolectadas del hongo Ganoderma lucidum en la región La Libertad u otras del país.

UI

Determinar que componente es el que aparece con una señal aproximadamente

BI

BL IO

TE CA

DE

FA

RM

AC

IA

Y

al minuto de corrido con el presente método.

BI O Q

3.

M IC A

1.

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