Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I

Neurobiologia wybrane zagadnienia „neuroscience”

Dariusz Adamek Zakład Neuropatologii CM UJ Materiały do wykładów z neurobiologii dla studentów Wydziału Lekarskiego i Stomatologii CM UJ Materiały stanowią własność autora (w rozumieniu praw autorskich) i mogą być wykorzystywane jedynie jako pomoc i podstawa do przygotowania się do zaliczenia przez studentów zajęć fakultatywnych z zakresu neurobiologii, którym zostały udostępnione nieodpłatnie.

1

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I

Informacje wstępne Przydatne teksty/materiały: Książka : „Wokół depresji. Problemy farmakoterapii depresji i współistniejących schorzeń” Dariusz Adamek, Gabriel Nowak (red.) Rozdziały: Rozdział I D.Adamek: „Neurotransmisja – neurotransmitery. Układy monoaminergiczne w mózgu. Rozdział II D.Adamek: Podstawy neurobiologii emocji i zaburzeń afektywnych. Rozdział XV: D.Adamek, B.Tomik: Podstawy neuropatologii schorzeń neurodegeneracyjnych. http://www.ibuk.pl/fiszka/13202/wokol-depresji-problemy-farmakoterapii-depresji-i-wspolistniejacychschorzen.html

Neurobiologia: rys historyczny •pierwsze ‘lecznicze’ trepanacje zaczęli wykonywać starożytni Egipcjanie, którzy jednak preparując zwłoki nie poświęcali mózgowiu szczególnej uwagi (serce było centralnym narządem). •pierwszym który powiązał przeżycia psychiczne z mózgiem był Hipokrates •od Galena uważano, że mózg wywiera wpływ na mięśnie poprzez pompowanie płynu (z komór) do mięśni przez nerwy •na przełomie XVIII i XIX Galvani i du Bois-Reymond odkrywają, że przepływ pobudzenia przez nerwy odbywa się za pomocą zjawisk elektrycznych. •na początku XIX w. Charles Bell oraz Francois Magendie ustalili, że przed „wejściem” nerwów do rdzenia następuje separacja włókien czuciowych i ruchowych •Szczególnie ważne postacie w historii nauki o układzie nerwowym przełomu XIX i XXw: ○Paul Broca: odkrywając związek miedzy uszkodzeniem szczególnego obszaru płata czołowego z afazją motoryczną dał podwaliny do poszukiwań lokalizacji określonych „ośrodków” kontrolujących określone funkcje. ○Camillo Golgi: teoria retikularna („syncytialna”) – neurony tworzą anatomicznie ciągłą sieć na podobieństw układu krążenia ○Ramon y Cajal: doktryna neuronalna – każdy neuron jest niezależną komórką ○Charles Sherrington: postulat synapsy (zobaczono je 50 lat później w ME), zdefiniowanie pojęcie odruchu.

Przepływ informacji w systemie nerwowym. Cz.I. Geneza potencjału błonowego i potencjału czynnościowego. Przewodnictwo nerwowe. „Elektryka układu nerwowego” - Równanie Nernsta •równanie potencjału równowagi dla określonego jonu t.j. równowagi między gradientem stężeń i „gradientem” elektrycznym: na przykładzie potasu (po prawej wersja uproszczona dla temp. 37 st. C) R= stała gazowa (8,315 J K-1 mol -1);

[ K  ]  RT EK   ln   O  zF  [ K ]i  Dla [K+ zew]/[K+ wew] = 4/155 = 0,026 Log10 0,026 = -1,58 a zatem 61,5 x (–1,58) = -97,7 mV EK = -97,7mV (potencjał równowagi dla K)

[ K  ]  E K  61,5mV  Log   O  10  [ K ]i  J K zC J K mol J V(wolt)      K mol mol K mol z C z C z F = stała Faraday’a (96485 Culombów/mol) T=temp.Kelvina; z = wartościowość jonu Culomb = 6x1018 ładunków; V = J/C (wolt = Joul / Coulomb) Ponadto ln(x) = Log10(x) / Log10e = Log10(x) / 0,434; L Avogadry = 6 x 1023 mol-1 K+ o = stężenie pozakom K+, K+i = stężenie wewnkom. K+

2

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I

•Gdy uwzględnimy inne jony (ich stężenia wewnątrz i zewnątrzkomórkowe) oraz względne różnice ich przepuszczalności przez błonę komórkową możemy obliczyć tzw. potencjał spoczynkowy błony komórkowej (zob. Równanie Goldman-Hodgkin-Katz). ○Jest on wartością „wypadkową” i co za tym idzie różni się od potencjału równowagi dla potasu (jak również od pozostałych jonów!) •Różne populacje komórek w CSN mają różne wartości potencjału spoczynkowego. •Wartości mogą zależeć od pory dnia, np. neurony wzgórza są hyperspolaryzowane w nocy zmniejszając w ten sposób impulsację dokorową.

Równanie Goldman-Hodgkin-Katz: •Hodgkin i Katz eksperymentem (na aksonie kałamarnicy) ze zmianą stężenia pozakomórkowego K ustalili, że potencjał równowagi zachowuje się „prawie” zgodnie z równaniem Nernsta, •Błona komórkowa jest zatem znacznie bardziej przepuszczalna dla K niż dla innych jonów i że to właśnie potas najbardziej wpływa na zachowanie potencjału błonowego •równanie wyznacza potencjał spoczynkowy komórki uwzględniając najważniejsze jony i ich relatywne (w stosunku do potasu) przepuszczalności PK:PNa:PCl

 pK [ K  ]O  pNa [ Na  ]O  pCl [Cl  ]i  RT Vm   ln      F  pK [ K ]i  pNa [ Na ]i  pCl [Cl ]O  •Względne przepuszczalności dla jonów PK:PNa:PCl pozostaja w nastepującej relacji: PK:PNa:PCl = 1:0,02:0,45 Indeksy „o” oraz „i” przy nawiasach kwadratowych oznaczają odpowiednio, że stężenie danego jonu odnosi się do przestrzeni pozakomórkowej („O”- outside) i wewnatrzkomórkowej (”i” inside)

Ciekawostka - Potas może zabijać… •„Mikstura” do wykonywania wyroku śmierci w niektórych stanach USA (tzw. lethal injection): thiopental sodium 6 g, pancuronium bromide 150 mg, potassium chloride 360 mEq •KCl podawany iv ponad 20 miliekwiwalentów/h jest toksyczny. (nie powinno się przekraczać 80 mEq/dobę a ponadto maksymalnie 40mEq/godz) Podawanie uśmiercające jest szybkie a jego skutkiem jest zaburzenie czynności elektrycznej serca (indukcja cardiac arrest).

Pompy jonowe i białka transporterowe „pompy jonowe”: ○3Na+-2K+-ATPaza ○Ca++-Mg+-ATPaza H+ - ATPaza (pompa protonowa obecna m.in. w pęcherzykach synaptycznych)

Wymieniacze jonowe: •operują głównie „kosztem” Na+ a zatem pośrednio korzystające z energii gradientu elektrochemicznego wynikającego z różnicy Na wytworzonej przez Na/K ATP-azę: ○Wymieniacz 1Ca++- 1Na+ ○Wymieniacz 1Cl- - 1Na+/HCO3○Wymieniacz 1H+- 1Na+ ○Wymieniacze Na+/transportery neurotransmiterów Kotransportery jonowe:

3

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I ○ KCC2 (usuwa chlor wraz z potasem z komórki – u płodów i noworodków brak lub słaba aktywność) ○NKCC1 (wprowadza do komórki sód wraz z chlorem i potasem)

Kanały jonowe •Kanał jonowy to rodzaj „poru” w błonie komórkowej, kontrolowanego przez otwierające się i zamykające „bramki” •Typy kanałów jonowych (również w błonach organelli wewnątrzkomórkowych): ○napięciowo-zależne ○aktywowane ligandem (mniej selektywne niż poprzednie) ○aktywowane fizyczną zmianą kształtu (rozciąganiem) ○zależne od temperatury (z rodziny TRP) ○ zależne od kwasowości (pH – acid sensing ion channels (ASICs) ○ zależne od cyklicznych nukleotydów (cGMP,cAMP) ○ aktywowane światłem(channelrhodopsin 1-2 –algi) ○ przeciekowe •Ruch określonych jonów poprzez błonę komórkową jest formą prądu elektrycznego zależnego od: ○„siły napędowej” będącej różnicą potencjału (spoczynkowego lub aktualnego potencjału) Em i potencjału równowagi dla określonego jonu np. dla potasu Ek ○ np. dla prądu potasowego: Em – Ek. Jeśli Em = Ek prądu nie ma. •Przewodnictwo błony dla określonego jonu (de facto jest to odwrotność oporu elektrycznego zgodnie z prawem Ohma tj. I = V/R). •Dla potasu prąd określi równanie: Ik= gk (Em – Ek) ○gdzie Ik – oznacza prąd jonowy potasu; gk – oznacza przewodnictwo dla potasu (g = 1 Siemen gdy 1 volt powoduje przepływ 1 ampera) ○przewodnictwo (conductance) przelicza się na powierzchnię błony w cm2 •„Makroskopowy” prąd jest sumą mikroskopowych prądów pojedynczych (napięciowozależnych) kanałów ○„Makroskopowe” prądy potasowe – do zewnątrz (outward) są również zsumowanymi prądami kanałów potasowych

Techniki badania kanałów jonowych •Technika „voltage-clamp” (Hodgkin i Huxley) ○Wyjaśniono dzięki niej mechanizm m.in. potencjału czynnościowego jako zjawiska, które można wytłumaczyć i opisać poprzez zmieniające się w czasie właściwości przewodności błony komórkowej dla poszczególnych jonów •Technika patch-clamp (Erwin Neher, Bert Sakmann 1976) ○umożliwiła badanie przepływów jonowych (prądów) dla indywidualnych kanałów jonowych. ○ostatecznie udowodniła istnienie kanałów jonowoselektywnych a jednocześnie potwierdziła wcześniejsze postulaty odnośnie istnienia takich kanałów proponowane przez Hodgkina i Huxley’a

Napięciowo-zależne kanały K+ w porównaniu do kanałów Na+: •podobieństwa ○jonoselektywność ○zarówno kanał potasowy jak i sodowy posiadają „voltage sensor” – strukturę „wyczuwającą” napięcie (zależność prawdopodobieństwa otwarcia od napięcia) ○zamykanie kanałów Na i K przez hyperpolaryzację •oraz różnice ○ w kinetyce otwarcia ○ depolaryzacja w kanale Na prowadzi oprócz otwarcia także do jego inaktywacji ale nie w przypadku kanału potasowego

4

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I -wykryto również takie napięciowozależne kanały Na które nie są inaktywowane depolaryzacją i prowadzące do długotrwających Pcz (blokowane przez lidokainę, benzokainę)

Ciekawostka – Potrawa z ryby może znieczulać a nawet zabijać… Tetrodotoksyna (TTX) wytwarzana przez ryby typu puffer fish blokuje napięciowozależne kanały sodowe tym samym blokując przewodnictwo nerwowe.

Kanały potasowe • kanał K+ jest tetramerem • Miejsce w kanale, które ze względu na największe przewężenie jest „bramkarzem” nazywane jest „filtrem selektywności” ; jest wspólne dla całej rodziny kanałów potasowych •przez kanał potasowy przechodzą tylko nieuwodnione jony K+ Kanały potasowe są najbardziej zróżnicowane (np. czasem inaktywacji od milisekund do minut). Wyróżnia się wiele szczególnych podtypów (podgrup kanałów potasowych) np: 1.Kanały potasowe napięciowozależne 2.Kanały potasowe wapniowo-zależne „Maxi K+” 200-300 pS, blokowane przez charybdotoksynę (ze skorpiona) Kanały o pośrednim przewodnictwie (18-80 pS) aktywowane obrzękiem komórek „małe” kanały potasowe 10-14 pS, blokowane przez toksynę pszczół – apaminę 3.Dośrodkowe prostowniki (inward rectifiers) M.in. wrażliwe na ATP i blokowane przez glibenclamid i tolbutamid 4.Kanały potasowe z podwójną domeną wewnętrznego otworu (2-pore domain=tandem pore domain, tzw. leak channels) – (dimery!) M.in. kanały zależne od pH

Kanały Potasowe „dowewnątrz prostujące” (inwardly rectifying) •Wykazują osłabione przewodnictwo w warunkach depolaryzacji i podwyższone w warunkach hyperpolaryzacji. •Wspólną cechą jest zdolność do wytwarzania większego dokomórkowego napływu jonów (influx) niż wypływu (efflux). •Występuje blokowanie kierunku „od” czyli wypływu jonów potasowych w warunkach gdy potencjał błonowy jest bardziej dodatni niż potencjał spoczynkowy (depolaryzacja). UWAGA! Pomimo nazwy („inwardly rectifying”) w praktyce niemal zawsze przepuszczają jony potasowe na zewnątrz (kierunek zależy od wartości potencjału błonowego w relacji do potencjału równowagi dla potasu czyli –80mV). •Poznano 7 podrodzin potasowych kanałów prostujących, (K-ir) które różnią się m.in. Stopniem „prostowania”. K-ir grają istotną rolę w kontroli i regulacji potencjału spoczynkowego oraz wartości potencjału progowego. •Pozwalają na dłuższe odpowiedzi depolaryzacyjne np. w sercu (gdzie potencjał czynnościowy trwa 100-600msec), •Grają rolę w tzw „fertilization potential” w komórkach jajowych (który trwa minuty). •Zapobiegają utracie K+ w czasie przedłużonej depolaryzacji i mogą pozwalać na re-entry K+ T-tubul w mięśniach.

Przykłady chorób spowodowanych nieprawidłowością działania kanałów jonowych •Mukowiscydoza: zmutowany kanał chlorkowy. •Zesp. Bartter’a : mutacja napięciowozależnego kanału chlorkowego – brak odpowiedzi na aldosteron. •Myotonia congenita: mutacja napięciowozależnego kanału chlorkowego. •Cholera: biegunka spowodowana działaniem toksyny bakteryjnej, która pobudza cAMP w nabłonku jelita i w następstwie pobudza kanał CFTR i w rezultacie wywołuje sekrecję chloru do światła jelita. (w mukowiscydozie toksyna nie działa!). •Rodzinna hypoglikemia z hyperinsulinizmem; mutacja ATP-zależnego kanału potasowego w komórkach beta trzustki, która powoduje ,że kanał stymuluje wydzielanie insuliny. •Zesp. Liddle’a: nadaktywność kanału sodowego w nabłonkach – wrodzone nadciśnienie. •Zesp. Lamberta-Eatona (miasteniczny): przeciwciała przeciw kanałom Ca.

5

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I KANAŁOPATIE mózgowe Nie ma jednoznacznego wytłumaczenia dlaczego określona mutacja kanału jonowego powoduje dane objawy Istnieją różne typy mutacji w danym kanale jonowym różniące się także fenotypowo (objawami). 1. Zaburzenia napięciowo-zależnych kanałów wapniowych (Ca): 1. Familial hemiplegic migraine (FHM) = (rodzinna migrena z hemiplegią) 2. Episodic ataxia type 2 (EA2) 3. X-linked congenital stationary night blindness (CSNB) 2. Defekt kanałów sodowych (Na): 1. Generalized epilepsy with febrile seizures (GEPS) 3. Defekt kanałów potasowych (K) 1. Benign familial neonatal convulsions (BFNC) – objawy drgawek zanikają po okresie noworodkowym

Potencjał czynnościowy (Pcz) •Zmiana stężenia pozakomórkowego sodu prowadzi do wyraźnej zmiany amplitudy Pcz ale „prawie” nie ma wpływu na potencjał spoczynkowy. (na wartość potencjału spoczynkowego wpływa przede wszystkim stężenie potasu) •Stąd wniosek Hodgkina i Katza, że w czasie Pcz następuje gwałtowny wzrost przepuszczalności dla sodu (maksymalna depolaryzacja w czasie Pcz wyznaczona jest wartością potencjału równowagi dla sodu). •Pcz w różnych neuronach ma różny kształt ale wnioski z eksperymentów Hodgkina i Katza na kałamarnicy zasadniczo obowiązują wszędzie. •Różne kształty Pcz są związane z dodatkowymi prądami (kanałami) jonowymi (Ca-, Kir) Zasadnicza sekwencja potencjału czynnościowego Potencjał czynnościowy rozpoczyna się z chwilą otwarcia się pierwszych kanałów sodowych, kolejne z nich otwierają się lawinowo, ponieważ każde otwarcie kanału sodowego oznacza wprowadzenie do komórki jonów sodu (wchodzą one zgodnie z gradientem dyfuzji). Każda „porcja” jonów sodu pojawiająca się w wyniku otwarcia kanału sodowego w oczywisty sposób podwyższa potencjał błonowy w kierunku bardziej „elektrododatnim” (a mówiąc inaczej „mniej elektroujemnym”) czyli przyczynia się do dalszej depolaryzacji (i otwarcia kolejnych jeszcze nie otwartych jeszcze kanałów sodowych itd. itd.). Proces ten zatem przebiega w trybie dodatniego sprzężenia zwrotnego („lawinowo”) doprowadzając lokalny potencjał błonowy komórki do napięcia znacznie przekraczającego 0mV, czyli innymi słowy powodując chwilowe „odwrócenie” napięcia z normalnie ujemnego na dodatnie. Ten proces limituje wartość potencjału równowagi dla sodu, który waha się w okolicy +50mV, Osiągnięcie wartości potencjału równowagi dla sodu oznacza, że ustaje prąd sodowy w selektywnych kanałach sodowych. Ale błona komórkowa nie musi osiągnąć potencjału równowagi dla sodu aby ustała „ucieczka” jonów sodu. Kanały sodowe mają jeszcze jedną ważną cechę – po otwarciu bardzo szybko „automatycznie” się „zamykają”, a dokładniej wchodzą w tzw. stan inaktywacji, co oznacza, że przestają być wrażliwe na depolaryzację. Rezultatem jest tzw. bezwzględna refrakcja, oznaczająca niemożliwość ponownej inicjacji potencjału czynnościowego w czasie, gdy trwa inaktywacja kanałów sodowych a której długość trwania limituje maksymalną częstotliwość przewodzenia potencjałów czynnościowych. Inaktywacja kanałów sodowych otwiera drogę do odbudowania „wyjściowej” polaryzacji błony czyli do odtworzenia ujemnego potencjału spoczynkowego. Szybki powrót polaryzacji, przejściowo nawet do wartości bardziej ujemnych niż potencjał spoczynkowy (mówimy tu o hyperpolaryzacji) jest rezultatem otwarcia (również napięciowo-zależnych) kanałów potasowych. Otwarcie kanałów potasowych podobnie jak sodowych jest wywołane osiągnięciem wartości potencjału progowego tyle, że w przeciwieństwie do kanałów sodowych kanału potasowe otwierają się z opóźnieniem (co umożliwia fazę depolaryzacyjną potencjału czynnościowego realizowaną przez opisany wyżej dokomórkowy prąd sodowy – nie równoważony w tej fazie przez odkomórkowy prąd potasowy). Ponadto w przeciwieństwie do kanałów sodowych, czas otwarcia kanałów potasowych jest długi, co powoduje nie tylko powrót do spoczynkowej elektroujemności wnętrza komórki (oczywiście z uwagi na ponad dwudziestokrotnie wyższe stężenie jonów potasu wewnątrzkomórkowo niż poza-komórkowo, dodatnie jony potasu opuszczają komórkę przez otwarte kanały co powoduje powrót elektroujemności wnętrza komórki) ale także wspomnianą fazę hyperpolaryzacji błony, po której napięcie błonowe powraca do stanu wyjściowego sprzed powstania potencjału czynnościowego. Hyperpolaryzacja ostatecznie zamyka kanały potasowe oraz pozwala na przejście kanałów sodowych ze stanu inaktywacji do zamknięcia (ale już z możliwością ponownego otwarcia, gdy tylko ponownie przekroczony zostanie potencjał progowy), a okres jej trwania charakteryzuje się, co zrozumiałe, utrudnieniem inicjacji potencjału czynnościowego (jest to czas tzw. refrakcji względnej, gdy owszem, może być zainicjowany potencjał czynnościowy, ale wymaga to nieco większej zmiany potencjału błonowego – tzn. nieco więcej niż wynika z różnicy między potencjałem spoczynkowym i progowym) . Opisana sekwencja zdarzeń „rozchodzi” się „wzdłuż” błony komórkowej, co

6

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I najbardziej typowo przebiega w długich wypustkach neuronów zwanych aksonami czyli wypustkami osiowymi. Modulowany częstotliwościowo sygnał, w postaci ciągów potencjałów czynnościowych jest zasadniczym nośnikiem informacji w układzie nerwowym. Kanały sodowe, są celem działania tetrodotoksyny (TTX) , neurotoksyny, która je selektywnie blokuje, a która występuje u ryb zwanych „fugu” („nadymki” albo „rozdymki”) będących przysmakiem w Japonii i Korei. Spożycie nieprawidłowo przyrządzonej ryby z tej rodziny może prowadzić nawet do zgonu wskutek uduszenia (porażenie mięśni). Najbardziej obfitująca w TTX jest wątroba ryby ale i inne (jadalne) części zawierają nieco neurotoksyny w niewielkich dawkach powodującej tak bardzo cenione przez smakoszy sensacje np. w postaci uczucia niewielkiego drętwienia języka i warg.

Elektrotonus, potencjały elektrotoniczne •Potencjały podprogowe (nie wywołujące potencjału czynnościowego) rozprzestrzeniają się biernie (elektrotonicznie) i ulegają osłabieniu wraz z odległością od miejsca ich powstania (np. w błonie postsynaptycznej) i wraz z upływem czasu. •Ich poznanie pozwala na zrozumienie przede wszystkim funkcjonowania dendrytów (aksony przewodzą potencjały czynnościowe, nie ulegające dekrementowi). •Służy temu formułowanie tzw. obwodów ekwiwalentnych, która to czynność wymaga przyjęcia (niestety) wielu upraszczających założeń np.: ○wyodrębniony segment wypustki jest walcowaty (ta sama średnica) ○potencjał elektrotoniczny pojawia się w postaci czymkolwiek spowodowanej zmiany „potencjału spoczynkowego”, a jego wartość w „punkcie zero” wynosi V = Vzmieniony - Espocz (także Espocz bywa pomijane) ○pomijana jest właściwość „kondensatorowa” błon komórkowych

„Kablowe” właściwości neuronu •Równanie kablowe opisuje relację (zmian) napięcia wzdłuż (modelowej) wypustki neuronu w stosunku do odległości i czasu, a jego rozwiązanie: Vx = V0 e –x/l Vt = V0 e –t/t oznacza tzw. „stałą długości” i jest to odległość od punktu „0”, w której napięcie zmniejszy się do 37% wartości pierwotnej (w punkcie „0”). •Zatem jeśli x= l to Vx=0,37V0 a więc w odległości l napięcie wyniesie 0,37 napięcia początkowego. •Większe neurony zwykle wykazują większa pojemność i mniejszą oporność •Aksony zmielinizowane tej samej średnicy przewodzą impulsy 100x szybciej niż niezmielinizowane (ale przy średnicy poniżej 1 [mm] niezmielinizowane są „szybsze”). ○Najgrubsze aksony u ssaków o śr. 20 [mm] przewodzą 120 m/s ○Cienkie, o śr. 1 [mm] przewodzą 5 – 10 m/s. •Empirycznie stwierdzono, że szybkość propagacji potencjału czynnościowego w aksonie zmielinizowanym w metrach/sek. jest równa ich średnicy w mikronach (mikrometrach) pomnożonej przez 6.

Zróżnicowanie długości i grubości aksonów i szybkości przewodnictwa Pcz •Średnica najgrubszego axonu (squid giant axon) bliska 1 mm a w niezmielinizowanych aksonach korowych ssaków (od 0.08 do 0.4 μm) •Axonalne opóźnienie zależy ○zasadniczo od prędkości Pcz – znaczenie dla funkcji integracyjnych (np.. W lokalizacji źródła dźwięku), z ○od zgrubień aksonalnych ○podziałów (spowalniają) ○powtarzanej stymulacji (również spowalnia) ○wpływu określonych kanałów jonowych •Zjawisko zatrzymania propagacji Pcz. w występuje w punktach rozgałęzień aksonu oraz w zgrubieniach i w „wejściu” do sromy neuronu oraz na skutek powtarzanych stymulacji (akumulacja K pozaaksonalnie i stąd depolaryzacja) może być spowodowane blokowaniem Na/K ATP-azy przez OUABAINĘ (depolaryzacja) oraz przez hyperpolaryzację.

Zjawisko „cofki” Pcz oraz interakcje „efatyczne” 7

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •U bezkręgowców stwierdzono „cofanie” się Pcz który wcześniej ulegał prawie wygaśnięciu w miejscach rozgałęzień aksonu (u ssaków stwierdzono to zjawisko w dendrytach). •„Cofka” Pcz powstająca w rozgałęzieniach jest tłumaczona występującym tam opóźnieniem przewodnictwa które „przeczekuje” okres refrakcji. •Pcz w aksonie powoduje zmianę wrażliwości (ekscytatyczności) aksonu sąsiedniego (zwykle początkowo obniżenie potem podwyższenie). Prowadzić to może do synchronizacji przebiegów Pcz w pęczku aksonów – są to tzw. wpływy (interakcje) efatyczne.

Rola dendrytów •Zasada częstotliwościowego kodowania wysyłanej informacji – INTEGRACJA NASTĘPUJĄCA W DENDRYTACH WPŁYWA NA „OUTPUT” •Ale badania ostatnich lat udowodniły, że nawet neurony z aksonem mogą używać dendrytów jako środka „komunikacji wychodzącej” (OUTPUT) ○jest to udowodnione zwłaszcza u bezkręgowców (np. detekcja ruchu u much mięsnych blowfly) -w świecie bezkręgowców ogromna część neuronów nie ma aksonów! ○nawet odległe dendryty mogą znacznie efektywniej wpływać na „axonal OUTPUT” •Dendryty stanowią zasadniczy i najważniejszy obszar przetwarzania informacji w neuronie → ‘microchip’ •kolce dendrytyczne pełnią funkcje ○jednostek mikrointegracyjnych (operacje logiczne i „liczenia”) ○sekwestratorów jonów wapniowych (toksycznych dla komórki) ○maja też udział w mechanizmach pamięci •Obecnie wiemy, że miejsce inicjacji potencjału czynnościowego może się zmieniać w kierunku nawet dystalnych dendrytów. ○wsteczny” Pcz może mieć na celu m.in.. „resetowanie” potencjału błonowego ○wzmaga on też reaktywność synaps. ○powoduje w korze mózgowej oddziaływanie GABAergicznych dendrytów interneuronów na zakończenia aksonalne komórek piramidalnych a z kolei glutamatergiczne dendryty komórek piramidalnych oddziałują na zakończenia aksonalne interneuronów – te połączenia i związki mogą mieć znaczenie w patogenezie drgawek!

Ciekawostka Wg Penrose-Hameroff:mikrotubularny cytoszkielet dendrytów jest miejscem zjawisk kwantowych („quantum computation”), które wg nich m.in. mają być substratem świadomości, (oddziaływanie na te kwantowe zjawiska wg Hameroff’a ma również tłumaczyć działanie wziewnych środków używanych w analgezji). Więcej na ten temat w części III „Materiałów” w dziale zagadnień kognitywnych.

Przepływ informacji w systemie nerwowym cz. II: Neurotransmisja – systematyka neurotransmiterów •Thomas Elliot (XIX/XX) zaobserwował skurcz nieunerwionych mięśni gładkich pod wpływem epinefryny. •Otto Loewi – dowody na chemiczną neurotransmisję i na rolę w niej acetylocholiny (Ach) na podstawie eksperymentów z sercem żaby.

Rodzaje sygnalizacji międzykomórkowej (nie tylko synaptyczne i nie tylko między neuronami i ich komórkami „docelowymi”) •Humoralna •Parakrynna •Autokrynna •Efatyczna (poprzez przestrzeń-pozakomórkową) •Synaptyczna: elektryczna (m-komórkowe prądy jonowe bezpośrednio poprzez gap junction) •Synaptyczna: chemiczna

Neurotransmiter („klasyczne” kryteria) •Substancja musi być syntetyzowana (obecna) w neuronie

8

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •Musi być obecna w zakończeniach synaptycznych i uwalniana po stymulacji (depolaryzacji) a następnie musi wywoływać reakcję komórki efektorowej (musi być izolowana i identyfikowalna chemiczne lub farmakologicznie) •Neurotransmiter musi wywoływać te same zmiany w komórce postsynaptycznej jak stymulacja neuronu presynaptycznego •Powinien istnieć swoisty receptor w komórce postsynaptycznej, co oznacza w praktyce, że podając substancję egzogennie można wywołać podobny efekt jak stymulując synapsę, ponadto powinno być możliwe dawkozależne blokowanie przez kompetytywnego antagonistę. Również blokowanie syntezy neurotransmitera powinno blokować efekty stymulacji presynaptycznej •Powinien być mechanizm aktywnego usuwania uwolnionego neurotransmitera (enzymatyczny rozkład/transport) •Uwalnianie neurotransmitera niemal zawsze (niektórzy formułują Ca-zależne uwalnianie jako jednoznacznie konieczne kryterium) łączy się z napływem Ca++ do zakończenia (musi być wapń w przestrzeni pozakomórkowej)

Składowe procesu neurotransmisji 1.Synteza neurotransmitera 2.Magazynowanie n-t w zakończniach presynaptycznych („klasyczne” n-t gromadzą się w mniejszych pęcherzykach 50nm, peptydowe w większych –100 z gęstym rdzeniem). ○ponieważ w większości synteza n-t jest w cytozolu istnieje aktywny mechanizm „ładowania” pęcherzyków 3.Uwalnianie n-t do szczeliny synaptycznej zwykle z udziałem wapnia, może być „konstytutywne” (bez stymulacji np. czynniki wzrostu) lub stymulowane 4.Wiązanie i rozpoznawanie n-t przez receptor komórki docelowej (receptory jonotropowe i metabotropowe), receptory mogą być na tym samym neuronie (tzw. autoreceptory – mech.regulacyjne) 5.Aktywne zakończenie działania n-t (dla klasycznych n-t) enzymatyczna degradacja i/lub wychwyt - jest też „pasywne” zakończenie działania n-t, poprzez dyfuzję)

Neurotransmitery: Neurotransmitery drobnomolekularne: •„Jasne pęcherzyki” 40-60 nm, ( katecholaminy mają pęcherzyki dense-core) •Synteza w strefie synaps, •Enzymy syntetyzujące transportowane poprzez slow axonal transport (0.5 – 5 mm/doba)

Neurotransmitery peptydowe (neuropeptydy): •„Ciemnordzeniowe” pęcherzyki 90-250 nm •Synteza w ciele neuronu (ew. modyfikacja prekursorów w strefie synaps) •Transport do synaps poprzez „fast axonal transport” (400mm/doba)

Neurotransmitery „klasyczne” •Acetylocholina, Glutaminian, Glicyna, kw. gammaaminomasłowy (GABA), katecholaminowe (adrenalina, noradrenalina, dopamina), serotonina (5-HT) •Do „klasycznych” neurotransmiterów niektórzy zaliczają również: ATP (i inne puryny), neuropeptydy

Neurotransmitery „nieklasyczne” Do „nieklasycznych” (niekonwencjonalnych) neurotransmiterów zaliczane są: Endokanabinoidy, Tlenek azotu (NO)

Szczegółowe uwagi na temat poszczególnych neurotransmiterów Dopamina • wraz z adrenaliną, noradrenaliną, należy do amin katecholowych • a dodatkowo wraz w/w i z serotonią i histaminą do amin biogennych • Hydroksylaza tyrozyny (TH) jest kluczowym enzymem w produkcji amin katecholowych. •Neurony albo zwiększają jego syntezę albo aktywność przez fosforylację. •Fosforylacja Hydroksylazy tyrozyny zmieniając jej konformację zwiększa jej aktywność a zatem i syntezę katecholamin

9

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I ○Hydroksylaza tyrozyny jest substratem dla wielu różnych kinaz będących elementami różnych szlaków sygnalizacyjnych które działają poprzez cAMP, Ca++ lub DAG •Dekarboksylaza DOPA odgrywa rolę w syntezie 5-HT – jest „finalnym” enzymem w neuronach dopaminergicznych, •Neurony dopaminergiczne znajduja się w: ○substancja czarna ○Ventral Tegmental Area

Ciekawostka… L-DOPA jest kluczowym związkiem w leczeniu ch.Parkinsona, (w której jest niedobór dopaminy w prążkowiu) ponieważ w przeciwieństwie do dopaminy przenika przez BBB. Niestety L-DOPA podawana przewlekle hamuje aktywność endogennej dekarboksylazy DOPA w mózgu !!! (hamuje w ten sposób przejście w dopaminę).

„Załadunek i wyładunek” katecholamin •Pęcherzyki chronią są przed degradacją. •Rola Vesicle Monoamine Transporter (VMAT): ○VMAT (poznano 2 typy) nie jest wysoko specyficzny, wymaga Mg2+; hamuje go rezerpina (b.stary lek w nadciśnieniu i psychozach – rozrywa pęcherzyki i uwalnia monoaminowy n-t) ○VMAT może też grać rolę w sekwestracji toksyn •Uwalnianie n-t: ○egzocytoza (jest Ca2+ zależna) ○oraz inne procesy (np. odwrócenie działania transporterów) •Rola autoreceptorów w regulacji – hamują uwalnianie n-t i prawdopodobnie syntezę.

Inaktywacja katecholamin •Enzymatyczna: (kiedyś sądzono, że najważniejsza, obecnie uważa się że gra rolę gł tylko we krwi) ○MAO (monoaminooksydaza) na zewn. Bł. mitochondrialnej ○COMT (catechol-O-metylotransferaza) •Wychwyt n-t przez neurony (najważniejszy sposób inaktywacji katecholamin w mózgu !!!). mimo nazw, nie są bardzo spoecyficzne. ○DAT = Transporter dopaminy (jest raczej pozasynaptyczny !! Stąd być może katecholaminy działaja nie tylko synaptycznie ale i „parakrynnie”; faktycznie b.duże ilości dyfundują poza synapsy) ○NE-T Transporter norepinefryny (trójcykliczne antydepresanty np. doxepina, imipramina blokują ten transporter) •Ponadto znane są mniej swoiste transportery wychwytujące monoaminy (nie tylko katecholaminy) z przestrzeni pozakomórkowej: Tzw. rodzina transporterów kationów organicznych (OCT – organic kation transporters) PMAT= plasma membrane monoamine transporter Psychostymulujący efekt kokainy i amfetaminy polega na blokowaniu wychwytu katecholamin (oraz w przypadku kokainy także 5-HT) przez blokowanie transporterów (kokaina szczeg. blokuje DAT). Amfetamina bardziej niż blokująco, działa poprzez odwracanie działania transportera !

Histamina •Oprócz katecholamin również należy do grupy „amin biogennych” •Główny rejon: nucleus tuberomammillaris hypothalami •Promuje aktywność mózgu, wspomaga uwagę UWAGA! Histamina należy też do ważnych mediatorów reakcji zapalnej i alergicznej. Leki antyhistaminowe używane m.in. jako antyuczuleniowe powodują senność i są np. przeciwwskazane przy prowadzeniu pojazdów! •Histamina m.in. odgrywa rolę w kontroli układu przedsionkowego •Przypuszczalnie histamina może też regulować przepływ mózgowy krwi •Transporter pęcherzykowy jest wspólny dla innych monoamin Nie zidentyfikowano swoistego transportera błonowego histaminy ale wraz z innymi monoaminami może być wychwytywana przez transporter(y) z rodziny zwanej „organic cation transporter” (OCT) •Rozkład: metylotransferaza histaminy i MAO

10

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •Wszystkie znane receptory histaminy należą do metabotropowych (sprzężonych z białkiem G)

Serotonina (5-HT) •Wraz z histaminą i katecholaminami należy do „amin biogennych” •Główny ośrodek serotoninergiczny: n.raphe •Bierze udział w regulacji snu i czuwania •Aktywacja receptorów serotoniny powoduje m.in. uczucie sytości •Mózg zawiera jedynie 1% zasobów(5-HT) •Szczególną uwagę zwrócono na 5-HT z powodu jej podobieństwa do LSD i w związku z teoriami, że 5-HT gra rolę w schizofrenii i depresji. •Hydroksylaza tryptofanu limituje produkcję 5-HT. ○Tryptofan dostaje się do mózgu a zwiększenie podaży tryptofanu zwiększa syntezę 5-HT •5-HT nie przechodzi do mózgu ale przechodzi 5-HydroxyTryptofan (5-HTP) •Rezerpina zmniejsza również 5-HT w pęcherzykach synapt. •SER-T : Transporter serotoniny odpowiedzialny za jej inaktywację poprzez wychwyt jest transporterem o wysokim powinowactwie (jest też spokrewniony z DA-T i NE-T). •Selektywnym inhibitorem SER-T jest lek antydepresyjny fluoxetyna (Prozac). Pośrednio wskazuje to także na rolę serotoniny w procesach psychicznych.

Aminy biogenne w chorobach psychicznych •Pomimo relatywnie niewielkiej ilości neuronów aminergicznych w obrębie CSN ich rola w regulacji stanów psychicznych jest bardzo duża. •Rezerpina blokująca wychwyt noradrenaliny i obniżenie ciśnienia krwi a jednocześnie powodująca stany depresyjne zwróciła uwagę na rolę amin biogennych w mechanizmach zjawisk psychicznych (np. nastrój). ○była też pierwszym lekiem antypsychotycznym •Obecnie wiemy, że aktywacja układu dopaminergicznego odgrywa rolę w psychozach i większość leków antypsychotycznych chloropromazyna, haloperidol, benzperidol) w ten lub inny sposób hamuje układ dopaminergiczny (np. blokując receptory dopaminergiczne). •Aminy odgrywają też rolę w mechanizmach stanów lękowych – inhibitory MAO były wykorzystywane jako leki przeciwlękowe •Stany depresyjne : leki przeciwko depresji takie jak inhibitory MAO (fenelezyna), trójcykliczne antydepresanty (desipramina – blokująca wychwyt noradrenaliny), blokery wychwytu serotoniny (Prozac), trazodon – wszystkie ingerują w przewodnictwo aminergiczne •Amfetamina – stymulująca uwalnianie noradrenaliny z zakończeń nerwowych powoduje stany (tzw. „high”), które można uznać za „odwrotność” depresyjnego działania rezerpiny!

GABA kwas -aminomasłowy) •U dorosłych osobników jest głównym hamującym n-terem ale u płodów i noworodków GABA jest pobudzający ! (GABA otwiera selektywny kanał dla chloru - skutek otwarcia kanału zależy od wewnątrzkomórkowego stężenia Cl-, a to od aktywności kotrasportera potasu i chloru KCC2) u dorosłych - hyperpolaryzacja po otwarciu kanału - hamujacy IPSP u noworodków i płodów pobudzający (brak kotransportera KCC2!) •GABA jest częścią metabolizmu glukozy (w przeciwieństwie do katecholamin). •GAD jest enzymem krytycznym dla tworzenia GABA i jest tylko w neuronach GABA-ergicznych •Zastanawia przeciwieństwo Glu i GABA przy tym samym szlaku metabolicznym i związku z cyklem Krebsa •GABA-T = transaminaza GABA-ketoglutaranu tworzy z a-ketoglutaranu kw.glutaminowy, który w neuronie jest dekarboksylowany przez dekarboksylazę kw.glutaminowego (GAD) do GABA. ○GAD wymaga kofaktora w postaci fosforanu pirydoksalu (pochodnego vit B6). ○Niedobór vit B6 prowadzi do niedoboru GABA (drgawki u dzieci niekiedy śmiertelne) •Ten sam enzym GABA-T (obecny w mitochondriach ale też w synaptosomach) inaktywuje GABA !!! UWAGA! Z pobudzającego N-T (kw.glutaminowy) powstaje hamujący (GABA) Zatem tylko jedna reakcja chemiczna dzieli związki o całkowicie odmiennym działaniu! Można podać bardzo wiele innych przykładów gdzie tylko jedna „drobna” (?) zmiana, np. pojedynczego aminokwasu w polipeptydzie całkowicie zmienia jego fizjologiczne własności

11

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I (np. właściwości kanału jonowego w receptorze glutamatergicznym) albo decyduje o fenotypie choroby (zob. materiały na temat genetyki rodzinnej choroby Creutzfeldta-Jakoba i rodzinnej śmiertelnej bezsenności).

Glicyna •Hamujący NT obecny głównie w rdzeniu •Powstaje z seryny (mitochondrialna hydroksymetylotransferaza) •Ładowana do pęcherzyków przez ten sam transporter co transporter dla GABA •Receptory (wyłącznie) jonotropowe – kanały dla Cl (blokowanie przez alkaloid strychninę) •Usuwana z przestrzeni pozakomórkowej przez transportery glicynowe (ich mutacja prowadzi do hyperglicynemii – choroby wrodzonej i śmiertelnej z sennością, opóźnieniem rozwoju umysłowego, drgawkami)

Glutaminian i asparaginian •Glutaminian i asparaginian – metabolity i neurotransmitery (żaden z nich nie przekracza bariery krew-mózg!) •Glutaminian to najważniejszy pobudzający NT •Powstaje na drodze różnych przemian chemicznych ale głównie z alfa-ketoglutaranu (z cyklu Krebsa) oraz z glutaminy. •Po uwolnieniu z błony presynaptycznej jest wychwytywany przez astrocyty za pomocą specjalnych białek transporterowych. ○W astrocytach ulega przemianie do glutaminy i która powraca do neuronu gdzie przekształcana jest ponownie w glutaminian. •Nadmierne uwalnianie glutaminianu lub niefektywny wychwyt prowadzą do tzw. ekscytotoksycznego uszkodzenia tkanki mózgu i odgrywa rolę w wielu chorobach OUN •Glutaminian działa poprzez receptory jonotropowe i metabotropowe

Acetylocholina (pierwszy poznany n-t) •Najprostsza synteza ze wszystkich n-t• ChAT – acetylotransferaza choliny - marker neuronów cholinerg. •Ac-CoA pochodzi z pirogronianu i poprzez pirogronian wiąże syntezę Ach z metabolizmem glukozy, Cholina wnika do neuronu z pomoca aktywnego transportu ((transporter Na+/cholina o wysokim powinowactwie) •Esteraza acetylocholiny działa pozakomórkowo i sama może być przypuszczalnie neurotransmiterem

Receptory cholinergiczne ○Receptory nikotynowe (jonotropowe); 40 typów; w złączu N-M ○Receptory muskarynowe (metabotropowe), gruczoły. M-oka •Inaktywacja Ach poprzez enzym acetylocholinoesteraza (AChE) hydrolizująca Ach. •Substancje blokujące Ach-esterazę prowadzą do akumulacji Ach i depolaryzacyjnej inaktywacji mięśni są to: ○sarin („nerve gas”) ○zw. fosforoorganiczne (insektycydy np. parathion), •Kompetycyjne blokery służą do zwiotczenia w anestezji (sukcynylocholina - prototypowy zwiotczający lek depolaryzujący) i jako leki w miastenii •Cholinergiczne neurony aktywującego układu siatkowatego na pograniczu mostu i śródmózgowia odgrywają kluczową rolę w regulacji aktywności mózgu (czuwanie kontra sen).

Puryny: ATP, AMP, adenozyna •ATP jest obecne niemal we wszystkich pęcherzykach synaptycznych („co-transmiter”?) •Pozakomórkowe podawanie puryn może wywołać odpowiedzi elektryczne neuronów (lata 20-ste!) •ATP działa pobudzająco w motoneuronach rdzenia w zwojach autonomicznych i czuciowych, w hipokampie •Puryny odgrywają rolę w przewodzeniu bólu i mechanorecepcji jednak w większości ich funkcja jest nieznana •Kofeina i teofilina blokują receptory purynergiczne (obecne w całym mózgu) •Adenozyna nie jest obecna w pęcherzykach a zatem jest „nieklasyczna”

Neuropeptydy •N-T peptydowe podobnie jak klasyczne są identyczne pomiędzy gatunkami, magazynowane są w pęcherzykach i uwalniane w sposób zależny od Ca2+, jednak inna jest biosynteza i inaktywacja. •Obecnie wiadomo, że neuron może dysponować 2 lub więcej neurotransmiterami •Peptydy aktywują receptory w niskich stężeniach (mili i mikromolowych)

12

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •Neuropeptydy powstają jako tzw. pre-propeptydy, następnie przetwarzane do propeptydów (proteoliza) i ładowane do pęcherzyków gdzie zachodzą ostateczne przemiany (powstają definitywne formy neuropeptydu oraz ich modyfikacje – np. fosforylacja, glikozylacja) •Zwykle w pęcherzyku są różne pochodne peptydy (i uwalniane są razem) •Peptydowe N-T nie mają specyficznego wychwytu i są inaktywowane przez dyfuzję i enzymatyczny rozkład (który nie jest swoisty dla określonego peptydu ale np. dla dipeptydu). ○produkty „dezaktywacji” mogą też być aktywne

•Niektóre wybrane neuropeptydy: • • • • • •

○Substancja P -czucie bólu i temperatury Substancja P: działanie hipotensyjne; 11-aminokwasów (odkryta 60 lat temu jako „Powder extract” mózgu i jelita) tzw. brain/gut peptide (hipokamp, neocortex, jelito, aferentne włókna C z dróg czucia bólu i temperatury) W rdzeniu antagonistycznie do substancji P działają opioidy Szereg innych neuropeptydów jest kodowanych przez ten sam gen co gen substancji P (neurokinina A, neuropeptyd K i neuropeptyd gamma) Receptory dla Neurokinin i substancji P to metabotropowe receptory NK1, NK2, NK3 Antagonista NK1 aprepitant jest nowym lekiem przeciwwymiotnym blokującym area postrema ○Opioidy -dzielą się na 3 grupy (pochodzące z 3 osobnych odpowiednio genów): endorfiny, enkefaliny, dynorfiny -atagoniści substancji P -grają rolę w percepcji bólu (działają na te same receptory co morfina) -uważa się, że ich wydzielanie jest podstawą efektu znieczulającego akupunktury -grają rolę w zachowaniach seksualnych oraz agresyjno-submisywnych, być może także w schizofrenii i autyzmie Receptory opioidów (wszystkie metabotropowe): µ, δ, κ ○Melanocyte Stimulating Hormone, ACTH, beta-endorfina – reakcje na stress

○Neuropeptyd Y odgrywa rolę w regulacji zachowań pokarmowych (sytość, otyłość). Z rodziny obejmującej: Neuropeptyd Y, peptyd YY, pancreatic polypeptide Należy do najwazniejszych polipeptydów w autonomicznym, obwodowym i centralnym układzie nerwowym Współwystępuje z noradrenaliną w neuronach układu sympatycznego Działa obkurczająco na naczynia Stymuluje przyjmowanie pokarmów W trakcie badań jest szereg niepeptydowych antagonistów receptorów NPY ○Orexyny A i B -utrzymywanie stanu czuwania - badania u ludzi wskazują na rolę orexyn w narkolepsji (u narkoleptyków nie ma orexyn w CSF) -stymulacja jedzenia przez oreksyny jest słabsza od NPY ale o dłuższym działaniu. -powodują wzrost zużycia tlenu, spadek poziomu prolaktyny i GH oraz wzrost kortykosteronu w osoczu. -wpływają na układ autonomiczny m.in. Powodując wzrost ciśnienia krwi i częstości akcji serca. Calcitonine gene related peptide (CGRP)

• • • • • •

37 aminokwasów, 30% homologiczny do łososiowej kalcytoniny Wraz z kalcytoniną w kk. C tarczycy, w układzie autonomicznym i enteralnym Włókna czuciowe czucia somatycznego Silnie wazodilatacyjny i hypotensyjny Może towarzyszyć substancji P lub Ach Prawdopodobnie odgrywa główną rolę w odruchu „aksonalnym” na uraz mechaniczny tkanki 13

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •

Rola w patogenezie migreny - wydzielany przez włókna nerwu V – (agoniści serotoninowego receptora normalizuja poziom CGRP, antagonista receptora CGRP BIBN4096BS wchodzi w użycie jako lek przeciw migrenie )

Endokanabinoidy (EK) •Uważane są za nieklasyczne neurotransmitery bo nie są magazynowane w pęcherzykach a często biorą udział w sygnalizacji „wstecznej” (uwalniane są z komórki postsynaptycznej i następnie dyfundują do komórek) •Znane są 2 substancje (endokanabinoidy): ○anandamid oraz 2-arachidonylglicerol (2-AG) – reagują z receptorem egzogennego aktywnego składnika marihuany: delta9-tetrahydrokanabinolu •Endokanabinoidy (EK) są wychwytywane przez aktywny transport i hydrolizowane. • EK synetyzowane i uwalniane pod wpływem Ca++ hamują wstecznie wydzielanie neurotransmiterów (np. GABA) w synapsach Głównym receptorem EK jest receptor CB1 – jest to receptor typu metabotropowego (GPCR) spokrewniony z metabotropowymi receptorami Ach. •Receptory dla EK są szczególnie liczne m.in. w substantia nigra oraz skorupie (caudate putamen). • Syntetyczny cannabinoid dexanabinol próbowany m.in. w neuroprotekcji po urazie mózgu lub rdzenia • Antagonista cannabinoidów Rimonabant prawdopodobnie będzie w prowadzany w leczeniu uzależnienia

Inne neurotransmitery niekonwencjonalne – NO i CO •Azotany, nitrogliceryna znane od dziesiątków lat jako rozszerzające naczynia. (NO jest stymulowany także przez Glu w mózgu prowadząc do wazodilatacji!). •wątpliwości co do roli n-t ○nie jest magazynowany, ○nie ma receptora, ○nie ma mechanizmu inaktywacji, •NO stymulując cyklazę guanylową powoduje wzrost cGMP (podobnie jak Glu, który w ciągu sekund 3x wzmaga aktywność NOS) •NO w szlaku pobudzenia: ○Ach w endotelium stymuluje szlak IP3 prowadząc do wzrostu Ca2+. ○Ca2+ aktywuje NOS. NO dyfunduje z endotelium do mięśniówki gładkiej naczynia gdzie aktywuje cyklazę guanylową i produkcję cGMP. ○cGMP aktywuje GMP-zależne kinazy proteineowe co prowadzi do rozluźnienia mięśnia. •CO: powstaje przy degradacji hemu i razem z NO bierze udział np. w neurotransmisji w jelicie (zwiększają relaksację, a u knock-outowych myszy relaksacja jest skrócona ).

Rola NO, NOS i cyklazy guanylowej NO ○relaksacja mięśniówki gładkiej w obwodowych naczyniach, oraz mięśniówki w jelicie, ○zabijanie obcych komórek w makrofagach. ○jest głównym stymulatorem cGMP (może również działać niezależnie od cGMP np. uwalnianie N-T) •Konstytutywna NOS w neuronach i w endoteliach •Indukowana NOS w makrofagach stymulowana przez cytokiny ○iNOS jest związana z kalmoduliną i działa w warunkach niepodwyższonego poziomu Ca2+ •nNOS jest silnie aktywna w komórkach ziarnistych móżdżku i dlatego NO aktywując cyklazę guanylową w kk.Purkinjego i powodując wzrost cGMP indukuje Long-Term Depression. •Nitrogliceryna i nitroprusydek sodu są dawcami NO i wzmagając cGMP rozluźniają mięśniówkę naczyń prowadząc do obniżenia ciśnienia krwi. •2 typy cyklazy guanylowej: ○cytozolowa ○błonowa – jest receptorem dla neuropeptydów takich jak atrial natriuretic peptide i brain natriuretic peptide

Czynniki wzrostu jako niekonwencjonalne N-T 14

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I Mogą wpływać na neurony presynaptyczne, kontrolują rozwój, różnicowanie i utrzymywanie neuronów. •Ich ekspresja jest stymulowana lub hamowana przez aktywność i inne N-T (np. Glu i Ach podwyższa ekspresję BDNF i NGF a GABA obniża.) •Rodzaje: ○BDNF (brain derived neurotrophic factor) – może być magazynowany w pęcherzykach ○NGF (nerve growth factor) ○Neurotrofina-3 (NT-3) •Ich uwalnianie jest: ○konstytutywne ○stymulowane depolaryzacją (aktywnością neuronu). Jest to uwalnianie niezależne od zewnątrzkomórkowego Ca2+ (jak w klasycznych N-T) ale od zapasów wewnątrzkomórkowego Ca2+.

Neurotransmisja Synapsy •Synapsa chemiczna pozwala wielokrotnie wzmacniać sygnał oraz umożliwia wieloczynnikową regulację transmisji i w związku z tym procesy adaptacyjne i(„PLASTYCZNOŚĆ SYNAPTYCZNA”). •Potencjał czynnościowy uwalnia N-T który łącząc się z receptorem powoduje w zależności od typu kanału jonowego pobudzający (EPSP) lub hamujący (IPSP) postsynaptyczny potencjał. Depolaryzacja przesuwa potencjał błonowy w kierunku progu potencjału czynnościowego lub odwrotnie - hyperpolaryzacja. •Z pojedynczego pęcherzyka („magazynu”) uwalnia się ok. 5000 molekuł N-T powodując powstanie tzw. MINIEPSP lub MINI-IPSP •Gradient protonowy (dzięki ATPazowej pompie protonowej) jest dostarczycielem energii do transportu N-T do wewnątrz pęcherzyków (realizowanemu przez transportery N-T). Jest 5 typów transporterów przenoszących drobnomolekularne N-T do pęcherzyków: 1) dla Ach, (VAChT = vesicular acetylocholine transporter) 2) dla monoamin [katecholaminy/serotonina/histamina] (VMAT= vesicular monoamine transporter), 3) dla glutaminianu, (VGLUT= vesicular glutamate transporter) 4) dla [GABA/glicyny] (VIAAT= vesicular inhibitory amino acid transporter). 5) dla ATP (VNUT= vesicular nucleotide transporter) •Transportery mają pokrewieństwo z bakteryjnymi transporterami odpowiedzialnymi za odporność przeciw lekom. Są różne od transporterów błonowych wychwytujących N-T z przestrzeni pozakomórkowej.

Neurotransmitery peptydowe sa „ładowane” do pęcherzyków w ciele neuronu (tam gdzie sa syntetyzowane) i wraz z pęcherzykami transportowane transportem aksonalnym do zakończeń synaptycznych, w których „załadowywane” są N-T drobnomolekularne. Wśród pęcherzyków synaptycznych można wyróżnić podgrupy : • Gotowe do uwolnienia 2% • Pula recyklingu 10-20% – Odnawianie z udziałem clathrin trwa sekundy • Pula rezerwowa 80-90% – (synapsin wiąże je z białkami cytoszkieletu, silny sygnał wapniowy uaktywnia fosforylacje synapsin co uwalnia od cytoszkieletu) – pula rezerwowa jest przemieszana z pula recyklingujacą – Inna droga recyklingu puli rezerwowej (poprzez tworzenie cystern) – trwa minuty Uwalnianie neurotransmitera •Opóźnienie między PCz i uwolnieniem N-T wynosi mniej niż 0,2 msek. (a w złączu n-mięśń. upływa ok.. 0,5msek). •Uważa się, że istnieją „gotowe do fuzji” kompleksy pęcherzyków-błony synaptycznej, dla których Ca2+ jest jedynie wyzwalaczem nagłych zmian konformacyjnych prowadzących do otwarcia pęcherzyka. •Stężenie Ca2+ zdolne do aktywowania egzocytozy pęcherzyków gwałtownie spada nieco dalej od kanałów wapniowych (buforowanie Ca przez cytozol)

15

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •Uważa się, że rolę detektora Ca2+ prowadzącego do uwolnienia N-T z pęcherzyka gra synaptotagmina •Potencjał czynnościowy (PCz) powoduje otwarcie kanałów wapniowych (Ca2+ wewnątrzkomórkowe jest zaledwie rzędu 100nM, po otwarciu kanałów skacze do 100mM lub więcej tuż przy kanale). •Dwuwartościowe kationy takie jak Co2+ lub Mn2+ blokują transmisję. •Zespół miasteniczny Lamberta-Eatona: (głównie paraneoplastyczny) jest spowodowany przeciwciałami przeciwko presynaptycznym napięciowo-zależnym kanałom wapniowym

Białka pęcherzyków synaptycznych •Skład i budowa pęcherzyków zostały dość dobrze poznane (nie zależą od rodzaju transmitera) •Białka lepiej poznane i/lub ważniejsze z nich to: ○ATP-azowy transporter protonów - Zakwasza światło pęcherzyków (gradient umożliwiający ładowanie n-t) ○Transportery pęcherzykowe dla poszczególnych N-T (umożliwiają wypuszczenie protonów w zamian za n-t) ○Synaptofizyna: funkcja nieznana (ale wykorzystywana w diagn. histopatologicznej) ○ Synapsyna: łączy pęcherzyki z puli rezerwowej z białkami cytoszkieletu ○Synaptotagmina: łączy się z błonowymi białkami kompleksu SNARE (syntaxin) i prawdopodobnie pełni rolę „sensora” Ca2+ (a calmodulina może pełnić rolę modulacyjną). SNARE complex jest to kompleks 3 białek koniecznych dla prawidłowego działania uwalaniania NT z pęcherzyków Toksyny blokujące uwalnianie N-T (toksyny Gr+ pałeczek beztlenowców Clostridium) botulinowe i tężcowa są enzymami proteolitycznymi tnącymi komponenty SNARE

Biologia „kwantowa” neurotransmiterów • „Quantal size” = jednostkowa odpowiedź na uwolnienie 1 kwantu N-T (w postaci amplitudy sygnału elektrycznego w komórce postynaptycznej) • „Quantal content” = średnia ilość kwantów uwalnianych przez pojedynczy impuls •Potencjał czynnościciowy podnosi prawdopodobieństwo egzocytozy N-T i uwolnienia „kwantu” N-T •Kwant N-T daje w przybliżeniu ten sam efekt elektryczny w kom.postsynaptycznej („quantal size” = Q ) •Kwanty N-T mogą sumować się liniowo dając wielokrotność jednostkowej odpowiedzi (czyli „quantal size”) •Średnia ilość uwolnionych kwantów „m” („quantal content”) N-T m jest określona równaniem: m = n p ○gdzie -n=ilość dostępnych kwantów; -p=prawdopodobieństwo uwolnienia kwantu •Przeciętna odpowiedź na bodziec jest iloczynem (Q m)(= Qnp) Złącze nerwowo-mięśniowe: ○Pojedynczy potencjał czynnościowy motoneuronu uwalnia nawet 300 „kwantów” N-T ○Każdy receptor posiada przewodnictwo o wartości 25 pS i otwiera się na 1,5 ms. (przepuszczając 35 000 jonów dodatnich). ○Otwarcie pojedynczego pęcherzyka (ok. 5000 molekuł n-t, związując ok. 2000 receptorów) powoduje napływ ok. 70 mln jonów w receptorowych kanałach dając pojedynczy „MINI” potencjał postsynaptyczny. •Synapsa glutamatergiczna: ○1 potencjał czynnościowy uwalnia 5-10 kwantów N-T, każdy z nich aktywuje ok. 30 kanałów a 1 kwant powoduje EPSP=1mV (zdecydowanie za mało do wywołania potencjału czynnościowego)

Model standardowy „kwantowego przekaźnictwa” Katz’a •Jest wykorzystywany w badaniach nad neuromodulacją i wpływem potencjalnych leczniczych substancji – wskazuje na miejsce uchwytu potencjalnego neuromodulatora (potencjalnego leku). •W obrębie CNS model standardowy często nie pasuje bo m.in. ○Pęcherzyki mogą zawierać różne ilości N-T ○Prawdopodobnie nie zawsze opróżniana jest cała zawartość pęcherzyka ○Jest bardzo trudna rejestracja EPP i wyznaczenie wartości „miniEPP” ○Synapsy konwergują na neuronach ○Istnieją różne izoformy kanałów Ca2+ a dodatkowo fosforylacja zmienia ich właściwości. ○W niektórych przypadkach uwolnienie pęcherzyka hamuje uwolnienie innych pęcherzyków.

Zmiany przepuszczalności błony postsynaptycznej w czasie aktywności synapsy (neurotransmisji) 16

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •Technika „patch-clamp” pozwala na zmierzenie prądu płynącego przez pojedynczy kanał jonowy •Pozakomórkowy płyn stanowi „uziemienie” układu elektrycznego w którym wzmacniacz utrzymuje stałe napięcie przezbłonowe. •Prąd NIE PŁYNIE STALE LECZ W POSTACI „IMPULSÓW”. •Zwiększenie stężenia acetylocholiny (Ach) nie powoduje zmiany natężenia prądu lecz wzrost PRAWDOPODOBIEŃSTWA otwarcia kanału! •Czas otwarcia jest różny ale „amplituda” (natężenie prądu) zawsze ta sama. •Efekt postsynaptyczny jest wynikiem sumowania potencjałów z wielu kanałów jonowych. •WNIOSKI: Po związaniu z NT częstotliwość i średni czas otwarcia kanału są niezależne od napięcia jednak kierunek i amplituda prądu zależy od napięcia. Kierunek prądu „dąży” do osiągnięcia równowagi zgodnie z równaniem Goldmana-Hodgkina-Katza.

Badania prądów w złączu nerwowo-mięśniowym •EPP – potencjał płytki końcowej; EPC – prąd postsynaptyczny •EPC jest proporcjonalny ○do ilości otwartych kanałów ○do różnicy między danym napięciem i potencjałem odwrócenia ○do przewodnictwa błony aktywowanej acetylocholiną •W normalnym mięśniu dośrodkowy EPC depolaryzuje błonę •Powstająca zmiana potencjału błonowego nazywana jest EPP (potencjałem płytki końcowej) •Kierunek i wielkość prądu EPC zależą od zastosowanego postsynaptycznego napięcia błonowego •Przy -110 mV prąd (ładunki +) jest dośrodkowy, przy napięciu 0 mV prąd jest zerowy (EPC=0) a powyżej 0mV prąd zaczyna się odwracać na dozewnątrz •Potencjał 0mV nazywamy dlatego „reverse potential” (potencjał odwrócenia) Potencjał odwrócenia „leży” pomiędzy potencjałami równowagi dla jonów ECl, ENa ○obniżenie zewnątrzkomórkowego Na powoduje przesunięcie „reversal potential” w stronę wartości ujemnych ○podwyższenie zewnątrzkomórkowego stężenia jonów K powoduje przesunięcie „reversal potential” w stronę wartości dodatnich •Dla typowego potencjału spoczynkowego mięśnia w EPC dominuje prąd dośrodkowy jonów Na (dlatego efekt netto prądów obu jonów Na i K jest też dośrodkowy) •Prądy dla potencjału powyżej „potencjału odwrócenia” hyperpolaryzują komórkę postsynaptyczną a dla potencjału poniżej „potencjału odwrócenia” depolaryzują komórkę. Prąd jonowy przez otwarty kanał jonowy po związaniu z ligandem (neurotransmiterem) „stara się” zmienić potencjał spoczynkowy w kierunku wartości potencjału odwrócenia danego kanału. •W przypadku komórki mięśniowej praktycznie każdy EPP wywołuje Pcz •W przypadku komórek nerwowych rezultat zależy od „sumacji” potencjałów postsynaptycznych (PSP) w tym pobudzających i hamujących •Glutaminian zwykle również powoduje otwarcie kanałów przepuszczalnych zarówno dla Na jak i K dlatego ogólny opis zależności jest podobny jak w złączu nerwowo-mięśniowym

Różnica między EPSP i IPSP •EPSP (pobudzający) charakteryzuje się tym, że jego potencjał odwrócenia (Erev) jest bardziej dodatni niż próg pobudliwości komórki •IPSP (hamujący) charakteryzuje się tym, że jego potencjał odwrócenia jest bardziej ujemny niż potencjał progowy. •Ważna uwaga: EPSP jest depolaryzujący ale IPSP jest zwykle hyperpolaryzujący ale nie musi (w pewnych warunkach może być depolaryzujący! Wystarczy aby jego Erev był poniżej progu pobudzenia czyli powstania potencjału czynnościowego) •Hamowanie (inhibicja) neuronów 1.Poprzez wytwarzanie IPSP (hamującego potencjału postsynaptycznego) a zatem najczęściej poprzez hyperpolaryzację 2.Poprzez „przeciek” (shunting inhibition) – neutralizacja potencjału jonami Cl-

17

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I Otwarcie kanału jonowego dla Cl- w sytuacji gdy w jego „rejonie” potencjał spoczynkowy jest równy potencjałowi równowagi dla chloru (i wobec tego nie ma prądu jonowego) umożliwia obniżenie oporu błonowego oraz powoduje, że napływające wzdłuż depolaryzującego się dendrytu dodatnie jony osiągnąwszy rejon otwartego jonu chlorowego zaczynają być „neutralizowane” przez jony chlorkowe napływające przez otwarty kanał. W rezultacie dochodząca do wzgórka aksonalnego depolaryzacja jest „osłabiona”. Innymi słowy otwarcie kanałów chlorowych obniża opór elektryczny błony komórkowej i w rezultacie każdy prąd jonowy musi być większy aby wywołać zmianę napiecia błonowego (zgodnie z prawem Ohma V=I*R). •Czasowe i przestrzenne sumowanie PSP ○czasowe pozwala na integrację kolejnych potencjałów postsynaptycznych w danej synapsie ○przestrzenne pozwala na integrację postsynaptycznych potencjałów z różnych okolic neuronu

Szybkie i wolne potencjały postsynaptyczne (PSP) •Szybkie PSP (poprzez kanały jonowe) •Wolne PSP (metabotropowe) ○działają przez pośredników (np. cAMP) ○potencjał powstaje wolniej (wymaga syntezy cAMP) ale trwa wielokrotnie dłużej (Nawet gdy cAMP zakończy działanie wtórnego przekaźnika to ufosforylowany kanał potasowy dalej przepuszcza jony – aż do zdefosforylowania kanału) -jeszcze dłuższe działanie może być wtedy, gdy aktywowane są geny i modulowany metabolizm

Receptory neurotransmiterów •Receptory neurotransmiterów dzielą się na: JONOTROPOWE -tworzące i po związaniu z ligandem otwierające kanały jonowe, -dużych rozmiarów, zbudowane z podjednostek -Ich pobudzenie wywołuje szybko potencjał postsynaptyczny (PSP), który jest jednak krótkotrwały METABOTROPOWE -działające poprzez aktywację GTP-wiążących białek -utworzone przez pojedynczy polipeptyd -Ich pobudzenie wywołuje długo trwający, wolny PSP - w zależności od różnych typów białek G i aktywowania różnych wtórnych przekaźników i wewnątrzkomórkowych szlaków tramsdukcji sygnału wpływają nie tylko na zmiany funkcjonowania kanałów jonowych ale na procesy metaboliczne a nawet molekularno-genetyczne (np. ekspresja genów)

Receptory jonotropowe •Rodzina 1 (budowa pentametryczna): ○nikotynowe Ach -dla kationów ○GABAA i GABAC -dla anionów kationów •Rodzina 2 (tetrametry) ○glutamatergiczne ○purynergiczne

○glicynowe -dla anionów

○ serotoninergiczne 5-HT3 -dla

(purynergiczny receptor P2X ma budowe trimeryczną)

Przykłady jonotropowych receptorów Nikotynowy receptor Ach (nACh) •Jest receptorem ○w złączu nerwowo-mięśniowym ○w synapsach pomiędzy przedzwojowymi i pozazwojowymi neuronami obu części układu autonomicznego ○w mózgu •Kanał receptorowy jest umiarkowanie selektywny: przepuszczalny dla Na+, K+, i nieco słabiej dla Ca2+, które przechodzą zgodnie z gradientem elektrochemicznym. •Każdy receptor ma dwa miejsca wiążące Ach

18

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •Otwarcie kanału następuje na skutek zmian konformacyjnych białek receptora po przyłączeniu Ach• Agonista: nikotyna •Antagonista : trimetafan •Bloker kanału jonowego: hexametonium

Ciekawostka… Miastenia gravis: jedna z najlepiej poznanych chorób autoimmunologicznych jest spowodowana autoagresją przeciw receptorom Ach w mięśniach. Podjednostki występujące w mięśniowym receptorze Ach to: α1, β1, δ, γ, ε. W miastenii przeciwciała obecne we krwi blokują wiązanie Ach do podjednostek mięśniowego AChR •Inne schorzenie: Autoimmune autonomic ganglionopathy (AAG) czyli autoimmunologiczna autonomiczna ganglionopatia- jest wywołane przeciwciałami przeciw neuronalnemu nAChR w zwojach autonomicznych.

Neuronalny nAChR•Zbudowany jest jedynie z podjednostek  i  •Zidentyfikowano wiele wariantów budowy podjednostki a (9) oraz b (4) (niektóre specyficzne dla niektórych zwierząt). •Możliwa jest kombinacja nawet tysięcy różnych „wersji” receptora z różnymi właściwościami ! •Prawdopodobnie jest odpowiedzialny za psychofizyczne efekty uzależnienia od nikotyny.

Receptor serotoninowy – (podklasa 5-HT3) •Jest receptorem jonotropowym (większość receptorów 5-HT jest metabotropowa) •Występuje w obwodowych zakończeniach nerwów czuciowych i w CNS •Jest przepuszczalny dla K+ i Na+ (nieprzepuszczalny dla Ca2+ i innych dwuwartościowych jonów, pomimo podobnej szerokości otworu jak w nACh) •Ma budowę pohdobną do nACh ale składa się z 5 kopii tej samej podjednostki (zbliżonej do podtypu a7 z nACh)

Ciekawostka… Antagoniści receptora 5-HT3 są używani jako ○leki przeciwwymiotne (ONDASETRON, GRANISETRON – blokują 5-HT3 receptory m.in. W dnie kom.IV i obwodowo w zak.nerwu X), ○leki antypsychotyczne i anksjolityki.

Receptory GABAA

GABAA to najczęściej występujący hamujący receptor GABA Agonista: muscimol Antagonista : bikukulina GABAC jest głównie w siatkówce (podobnie jak GABAA jest związany z kanałem jonowym dla Cl-.) GABAB jest metabotropowy ! •Tworzą go podjednostki (pentamer tak jak r nACh) nazwane dgba e oraz r (głównie w siatkówce); dla każdej z nich znane są różne podtypy ○w podjednostce a znajduje się miejsce wiążące ligand •Kanał jonowy receptora GABAA jest selektywny dla Cl-, co zazwyczaj (zob. komentarz poniżej) powoduje hyperpolaryzację po otwarciu kanału (stąd hamowanie i IPSP) Uwaga! Kierunek przepływu jonów chloru zależy od relacji potencjału spoczynkowego do potencjału równowagi dla chloru. W układzie nerwowym dorosłych osobników potencjał równowagi dla chloru Ecl (wyznacza go równanie Nernsta) wynosi ok. -70mV, a zatem jest nieco przesunięty w kierunku hyperpolaryzacji w porównaniu z potencjałem spoczynkowym zwykle wynoszącym ok. -60mV. Stąd otwarcie receptorowych kanałów Cl-, po związaniu z GABA spowoduje napływ jonów chloru i hyperpolaryzację (a stąd działanie hamujące). Jednak np. w życiu płodowym na skutek słabego działania kotransportera potasowo-chlorowego stężenie chloru wewnątrzkomórkowe jest wyższe niż u dorosłych osobników i zgodnie z równaniem Nernsta Ecl jest przesunięte powyżej potencjału spoczynkowego komórki a nawet powyżej potencjału progowego. Wtedy jony chloru po otwarciu kanałów są „wypychane” poza komórkę i w rezultacie następuje depolaryzacja a nawet możliwe jest przekroczenie potencjału progowego, (czyli efektem GABA może być pobudzenie!). Ponadto trzeba pamiętac, że otwarcie kanałów chlorowych nawet jeśli nie ma w nich przepływu prądu (gdy wartości potencjału równowagi dla chloru i spoczynkowego sa podobne) powoduje

19

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I zmniejszenie oporu przezbłonowego i zgodnie z równaniem Ohma V=IR, gdy opór jest mniejszy konieczny wiekszy prąd aby zmienić potencjał komórki. Powoduje to efekt zmniejszenia wpływu jakichkolwiek pobudzających neuron oddziaływań neurotransmiterów i prądów błonowych. To jest drugi sposób hamowania neuronów przez GABA. •Receptor GABAA może być modulowany przez wiązanie różnych substancji ○barbiturany (Luminal) i benzodiazepiny (Diazepam) ,– potęgują wiązanie GABA i podwyższają hamowanie ○Picrotoxin – blokuje kanał (wywołuje drgawki) ○Bicucullin – zmniejsza wiązanie GABA (wywołuje drgawki) ○Penicylina – hamuje receptor blokując otwór dla jonów (może wywołać drgawki) Również hormony sterydowe: progesteron, kortykosteron, testosteron mają miejsce wiążące w receptorze.

Receptor glicynowy •Antagonista: strychnina •Główny receptor hamujący w rdzeniu kręgowym i pniu mózgu •Pentamer zbudowany z podjednostek a oraz b

Ciekawostka… 1. Zatrucie strychniną jest „makabryczne” bo strychnina nie ma wpływu na funkcje kognitywne (receptory glicynowe nie sa obecne w „wyższych” ośrodkach mózgu) 2.Mutacja receptora glicynowego (zamiana pojedynczego aminokwasu) jest przyczyną wrodzonego schorzenia zwanego hyperekpleksją. W chorobie tej nawet delikatny bodziec np. dotknięcie nosa wywołuje gwałtowna reakcję w postaci zesztywnienia ciała, zgięcia kończyn prowadzącego do upadku, gwałtownego krzyku. Brak jest też cech adaptacji na bodziec.

Receptory glutamatergiczne – iGluR •najliczniejsze receptory pobudzające w CSN •Składają się z 4 podjednostek (większe od podjednostek AChR) •Nazwy podgrup wywodzą się od nazw specyficznych agonistów iGluR, ○NMDA (kwas N-metylo-D-asparaginowy) -wybitne przewodnictwo dla jonów Ca2+ i Na+ -Przewodnictwo obejmujące także Ca2+, oznacza nie tylko skutki „elektryczne” wynikające z otwarcia kanału jonowego, ale możliwość użycia wapnia jako „wtórnego przekaźnika” (aktywacja wapniowozależnych enzymów – podobnie jak to jest w receptorach metabotropowych) -napięciowo zależne blokowanie przez Mg2+ (aktywacja wymaga depolaryzacji) -glicyna związana z tzw. „miejscem glicynowym” konieczna dla efektywnego otwarcia kanału -pełnią fizjologicznę rolę w plastyczności i uczeniu się -są „detektorami jednoczesności” zdarzeń (depolaryzacja oraz wydzielenie Glutaminianu) - rola receptorów NMDA w eksytotoksyczności ○ „non-NMDA” (AMPA i kainianowe) - najważniejsze (najlepiej poznane) to receptory AMPA -zwiazane z kanałami dla Na+, K+, Ca2+ -bardzo szybkie przekaźnictwo synaptyczne (szybsze od NMDA) -czucie bólu

Receptory purynowe („purynergiczne”) • ATP jest obecne w pęcherzykach synaptycznych wszystkich typów neurotransmiterów • Ligandem jest ATP lub adenozyna lub inne analogi nukleotydów • Są one uwalniane w niektórych synapsach w sposób kwantowy (wraz z katecholaminami i Ach). • Mogą przepuszczać zarówno aniony jak i kationy Uwaga! Większość z receptorów purynowych jest jednak metabotropowa.

Receptory metabotropowe (= receptory związane z białkami G - GPCR) - działają poprzez aktywację białek wiążących GTP - utworzone przez pojedynczy polipeptyd.

20

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I - pobudzenie wywołuje długo trwający postsynaptyczny potencjał („slow-PSP”) - w zależności od różnych typów białek G i aktywowania różnych wtórnych przekaźników i wewnątrzkomórkowych szlaków tramsdukcji sygnału wpływają nie tylko na zmiany funkcjonowania kanałów jonowych ale na procesy metaboliczne a nawet molekularno-genetyczne (np. ekspresja genów) - Mogą również bezpośrednio (przez aktywację białka G bez potrzeby indukcji wtórnych przekaźników) modulować aktywność kanałów jonowych •Zidentyfikowano ponad 1000 ! Receptorów metabotropowych •Charakter „regulacyjny” - „brama” do biochemicznego i metabolicznego wnętrza komórki •Właściwsza nazwa – receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), ponieważ bardzo często poprzez aktywację białka G modulują kanały jonowe a nie bezpośrednio „wpływają na metabolizm” ○aktywacja białka G (GTP-binding protein) oznacza wymianę GDP w GTP ○zaktywowane białko zmienia aktywność enzymów oraz kanałów jonowych – powstają też wtórne przekaźniki •Typowo działanie GPCR musi być wolniejsze niż w przypadku rec. jonotropowych ale też jest zarazem znacznie dłuższe (w efektach) •Wiele małych N-T ma zarówno jono jaki metabotropowe receptory (ale katecholaminy i histamina – wyłącznie metabotropowe receptory). •Na podstawie struktury GPCR dzieli się na 3 podrodziny: ○Rodopsyny i receptorów adrenergicznych. ○Sekretyny i vazoaktywnego intest. peptydu (VIP) ○Metabotropowego receptora glutaminianergicznego •Najważniejsze receptory metabotropowe ○Muskarynowe receptory acetylocholinowe ○Receptory adrenergiczne ○Receptory dopaminergiczne ○Receptory GABAB ○Metabotropowe receptory serotoninergiczne ○Metabotropowe receptory purynergiczne ○Metabotropowe receptory glutamatergiczne ○Receptory neuropeptydów (wszystkie są GPCRs) •Budowa GPCR ○składa się z pojedynczego polipeptydu. ○receptor zawiera 7 transbłonowych helikalnych segmentów ○mogą istnieć jako pojedyncze jednostki a także tworzyć homo i heterooligomery ○zamiany pojedynczego aminokwasu może niekiedy zmniejszać siłę wiązania liganda 1000 a nawet 10000x ○związanie agonisty stabilizuje konformację aktywną i przesuwa równowagę w kierunku formy aktywnej izomeru (aktywującej białko G) •Układ sygnalizacji poprzez receptory sprzężone z białkiem G „składa się” z : ○Receptora ○ Białka G po wewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej, które może być stymulowane przez zaktywowany receptor ○Efektorowego enzymu „wytwarzającego” (zmieniającego stężenie) II-rzędowego przekaźnika lub efektorowego kanału jonowego (w odpowiedzi na aktywację białka G) ○ Białka G uczestniczące w neurotransmisji składaja się z trzech podjednostek nazywanych α β γ. Podjednostka α jest złączona z GDP W wyniku aktywacji następuje po pierwsze: utrata powinowactwa do GDP i wymiana na GTP (z cytozolu) oraz odszczepienie podjednostki α od pozostających razem podjednostek βγ. Długotrwałość aktywacji podjednostki α zależy od jej wewnętrznej aktywności GTP-azowej a zatem czasu jaki jest potrzebny do odszczepienia reszty fosforanowej od GTP i zamiany GTP w GDP co kończy aktywację białka G i pozwala na ponowne złączenie jego podjednostek. •Komórki regulują wrażliwość na agonistę: -poprzez zmianę ilości receptora ! -poprzez desensytyzacje – chroni system sygnalizacji przed saturacją. Jej efektem i zarazem wykładnikiem jest konieczność zwiększenia ilości agonisty aby wywołać mierzalne skutki aktywacji (np. ilość cAMP). >(szybka desensytyzacja) przez fosforylację receptora >(„wolna” desensytyzacja) przez endocytozę receptora

21

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I Korzyści związane z sygnalizacją poprzez receptory sprzężone z białkiem G (w porównaniu z szybką transmisją) •Amplifikacja sygnału – nawet rzędu wielu tysięcy razy poprzez aktywację enzymów i wielokrotną aktywację białka G •Duży zakres czasowy stosunkowo szybkie działanie poprzez modyfikację kanałów jonowych wydłużone działanie gdy sygnał przenoszony jest na przekaźniki wtórne •Duży zakres przestrzenny – częściowo na skutek wydłużonego działania modulacja może dotyczyć odległych w stosunku do receptora procesów komórkowych (IP3 , DAG, mogą wpływać m.in. na ekspresję genów) •.„Cross talk” – składniki transdukcji sygnału i ich enzymatyczne efektory (np. kinazy) oddziałują na siebie •Skoordynowana modulacja („orkiestracja” różnych procesów)

Przykładowe receptory metabotropowe (związane z białkami G) Receptory muskarynowe Ach (mAch) •Agonista: muskaryna •Antagonista : atropina •Pełnią dominującą rolę w cholinergicznej neurotransmisji w mózgu. •Poza mózgiem są receptorami wszystkich komórek efektorowych unerwianych przez pozazwojowe neurony układu PARASYMPATYCZNEGO (także niektórych układu sympatycznego unerwianych przez cholinergiczne neurony). •Są zarówno pre jak i postsynaptyczne a ich głównym mechanizmem jest działanie poprzez zmiany kanałów jonowych. •Kanał dla K+ w sercu, który gwałtownie wzmaga przepuszczalność w odpowiedzi na pojawienie się acetylocholiny (uwolnionej z n.X) był pierwszym kanałem jonowym, dla którego udowodniono modulację poprzez metabotropowy muskarynowy receptor dla Ach (hamuje go podjednostka βγ białka G zaktywowanego przez receptor muskarynowy). Ponadto muskarynowy receptor Ach powoduje hamowanie cyklazy adenylowej i zmniejszenie produkcji cAMP co z kolei hamuje kinazę białkową PKA i osłabia fosforylację napięciowo-zależnych kanałów wapniowych (staja się mniej reaktywne na depolaryzację). Łacznym efektem działania (pobudzenia) receptora muskarynowego, a zatem pobudzenia układu parasympatycznego na akcje serca (poprzez nerw błędny wpływający na węzeł zatokowoprzedsionkowy serca) jest jej zwolnienie. Reasumując: Zwolnienie akcji serca jest wynikiem zwiększenia polaryzacji (hyperpoplaryzacji) poprzez zaktywowany kanał potasowy i zmniejszenia aktywności kanałów wapniowych (osłabienie ich fosforylacji) w komórkach węzła zatokowo-przedsionkowego.

Ciekawostka… Odruch oczno-sercowy: ucisk na gałki oczne lub rozciąganie mięśni okoruchowych powoduje aktywację nerwu błędnego i zahamowanie węzła zatokowo-przedsionkowego) •Presynaptyczny mACh reguluje uwalnianie Ach (działa tu zazwyczaj hamująco, co prowadzi do sprzężenia zwrotnego). •Rodzina receptorów muskarynowych Ach obejmuje 5 członków m1-m5, które maja różna dystrybucję i różny mechanizm działania: ○m1, m3, m5 wiążą się z białkami G aktywującymi fosfolipazę C (PLC) ○m2, m4 wiążą się z białkami G które hamują cyklazę adenylową oraz regulującymi bezpośrednio kanały dla K+ i Ca2+

Receptory adrenergiczne (wszystkie są metabotropowe) •Agonista: Klasa a: adrenalina i noradrenalina – oraz fenylefryn Klasa b: isoproterenol (izoprenalina) •Antagonista : Klasa a: fentolamina i fenoksybenzamina Klasa b: propranolol •Receptory dla noradrenaliny, adrenaliny (obie wiążą się do tego receptora) •Dzielą się na trzy klasy a1, a2, b (każda ma 3 podklasy) •Różnice w dystrybucji receptorów adrenergicznych: ○a1 : mięśniówka większości naczyń krwion, mięsień rozszerzający źrenicę, mięśnie pilomotoryczne

22

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I ○a2 : CSN, płytki krwi, zakończenia obwodowych nerwów adrenergicznych ○b1 : serce, CSN ○b2 : drogi oddechowe, macica, mięśnie części naczyń •W mózgu głównymi receptorami adrenergicznymi są a2 i b1 •Adrenergiczne receptory a i b są typowymi receptorami neuronów pozazwojowych układu sympatycznego. •Skutki stymulacji adenergicznej zależą od rodzaju receptora. •Receptory b aktywują cyklazę adenylową a receptory a hamują cyklazę adenylową.

Receptory dopaminergiczne (wszystkie są metabotropowe) •80% receptorów dopaminergicznych w mózgu znajduje się w obrębie corpus striatum, które otrzymuje główna impulsację z substantia nigra, poza tym znajdują się w korze mózgowej. •Wyróżnia się 5 podtypów receptorów dopaminergicznych (DA1-DA5) ○D1 i D5 aktywuja cyklazę adenylową ○D2, D3 i D4 hamują cyklazę adenylową. •Receptory dopaminergiczne wiążą (ale mało swoiście) różne leki jak bromokryptyna, haloperidol, klozapina

Receptory GABAB

•Agonista: baclofen. •Obecne są w całym CSN, niekiedy kolokalizując z jonotropowymi receptorami GABA (GABAA). •Receptory postsynaptyczne GABAB: działanie hamujące - wywołują powolną hyperpolaryzacje poprzez aktywację przewodnictwa potasowego K+ •Receptory presynaptyczne GABAB są elementem mechanizmu autorecepcyjnego hamującego uwalnianie N-T poprzez aktywację kanałów K+ i hamowanie prądu wapniowego •Mogą niekiedy modulować kanały K+ bez pośrednictwa białka G.

Receptory serotoninowe: 5-HT(1,2,4,5) (Uwaga! 5-HT3 jest jonotropowy) •W mózgu: jądro szwu (n.raphae) w pniu mózgowym •Dzielą się na podtypy 5-HT1 – 5-HT5 (5-HT3 jest jonotropowym) •Receptory są sprzężone z cyklazą adenylową (pobudzając ją lub hamując) •5-HT bierze udział w modulacji rytmów dobowych, jedzenia, podwyższa ciśnienie krwi.

Receptory purynergiczne •Wiążą ATP, inne analogi nykleotydów i adenozynę (adenozyna w przeciwieństwie do ATP nie jest obecna w pęcherzykach synaptycznych dlatego jest „nieklasycznym” N-T, adenozyna akumuluje się, w stanach nadmiernego zużycia ATP i niewystarczającej regeneracji ATP, jednocześnie adenozyna przenika przez błony komórkowe i dlatego łatwo rozprzestrzenia się, stąd może nieść sygnał komunikujący o metabolicznym statusie neuronów do komórek „sąsiedztwa”.) •Receptory adenozynowe oznacza się nazwami: A1, A2a, A2b, A3 •Receptory ATP oznacza się literą: P2(x,y,z,t,u) (ale z nich P2x i P2z są jonotropowe) •Aktywacja receptora A1 (licznego w mózgu) hamuje cyklazę adenylową i powoduje wzrost fosfolipazy C.

Metabotropowe receptory glutamatergiczne •Receptory obecne są we wszystkich strukturach mózgu; •Występują też pozamózgowo w anatomicznym ukł.nerwowym, w sercu, jelitach, kościach; modulują aktywność neuronów i regulują uwalnianie GLU •W przeciwieństwie do innych metabotropowych receptorów miejsce wiążące agonistę znajduje się nie „wewnątrz” w obrębie rejonu transbłonowego ale na zewnątrz błony komórkowej. •Dzielą się na grupy: ○Grupa I – związane z aktywacją fosfolipazy C (wzrost IP3 i DAG) -działają aktywująco -receptory są zlokalizowane postsynaptycznie (obwodowe części synaps), ○Grupa II – związane z zahamowaniem cyklazy adenylowej (spadek poziomu cAMP), -działają hamująco, -receptory z grupy II i III są głównie zlokalizowane presynaptycznie ○Grupa III – mechanizm działania podobny do grupy II

23

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I -zlokalizowane bliżej centrum synapsy niż receptory gr.II Ponadto metabotropowe są receptory dla histaminy

Receptory peptydowe (dla neuropeptydów) •Bardzo (bardzo...) liczna rodzina – ale żadne nie są kanałami jonowymi •Albo są typu „metabotropowego” albo są sprzęgnięte z kinazą tyrozynową

Budowa i klasyfikacja Białek G •Białka G mają trymerową (trójzłożoną) budowę z podjednostek α β γ •Związanie z receptorem uwalnia GDP, a ponieważ w komórce jest przewaga GTP, miejsce wiążące nukleotyd zostaje zajęte przez GTP i jednocześnie następuje dysocjacja białka G na α-GTP oraz (βγ). •Oprócz heterotrymerycznych białek G (złożonych z 3 podjednostek) są także monomeryczne białka G które także biorą udział w przekaźnictwie sygnałów. ○należy do nich białko „ras” (od wirusa powodującego mięsaka szczurzego - rat sarcoma) przekazujące sygnał z receptora sprzężonego z kinazą i wpływające na różnicowanie i proliferację komórek •Znanych jest 27 różnych genów podjednostki a oraz 5 β i 13 γ (ale wszystkie teoretyczne kombinacje podtypów podjednostek są możliwe) •Specyficzność sygnalizacji przez określony receptor osiągana jest poprzez fakt, że tylko ograniczona liczba podtypów receptora oraz białek G i efektorów jest „na wyposażeniu” poszczególnych neuronów. •Ponadto istnieje „kompartmentacja” efektorów (np.. Ten sam receptor może regulować kanały Ca2+ w zakończeniu nerwowym a fosfolipazę C w dendrycie).

Ważniejsze drogi sygnalizacji poprzez receptory sprzężone z białkiem G •jedna „w kierunku” aktywacji kinazy białkowej PKA ○po złączeniu z ligandem aktywacja cyklazy adenylowej ○wytworzenie cAMP, ○aktywacja kinazy białkowej PKA •druga „w kierunku” altywacji kinazy PKC ○po złączeniu z ligandem aktywacja fosfolipazy C ○powstanie diacyloglicerolu i trójfosfoinozytolu (IP3), ○bezpośrednia aktywacja kinazy białkowej C (PKC) przez diacyloglicerol oraz pośrednia poprzez uruchomienie jonów wapnia (przez trójfosfolinozytol) z retikulum endoplazmatycznego •Jest znanych ponad 600 receptorów (w tym dla światła!), które są sprzężone z jednym lub więcej z 27 rodzajów białka G (podjednostki alfa). •Z kolei białka G regulują jeden lub więcej z dwudziestu kilku różnych kanałów i enzymów. •Białko G musi „wykryć” aktywację receptora!

Cechy sygnalizacji •Konkretny typ receptora może łączyć się na ogół (w większości) tylko z jednym rodzajem białka G •Neuron ma tylko określony podzbiór GPCR i białek G •Amplifikacja sygnału w układzie receptora typu GPCR: ○1- zaktywowany receptor może wielokrotnie aktywować białko G ○2- każda cyklaza adenylowa może zsyntetyzować wiele cAMP ○3- każda kinaza proteinowa może ufosforylować wiele kopii swojego substratu •Proces jest z początku wolniejszy (w porównaniu np. z receptorem jonotropowym) ale trwa dłużej. •Ten sam wtórny przekaźnik może jednocześnie aktywować liczne i różne szlaki metaboliczne i aktywować transkrypcję genów (tzw. „orchestrated response”.)

Szlak sygnalizacji cyklazy adenylowej i PKA •Poziom cAMP jest regulowany poprzez przeciwstawne enzymy: cyklazy adenylowe (tworzące cAMP) i fosfodiesterazy (PDEs) degradujące cAMP. •Niektóre cyklazy adenylowe (zwł tzw. grupy A) mogą być „detektorami koincydencji” poprzez sprzęganie sygnału prowadzącego do wzrostu cAMP z sygnałem (od innego neurotransmitera) wzrostu Ca2+.

24

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •N-T które używają cAMP jak wtórnego przekaźnika poprzez aktywację lub hamowanie cyklazy to m.in. : epinefryna, norepinefryna, dopamina, serotonina, VIP, somatostatyna.

cAMP-zależna kinaza białkowa (PKA) •fosforyluje reszty Ser/Tre i odgrywa rolę w wielu procesach: ○Regulacja ekspresji genów poprzez [cAMP response element-building protein] = CREB ○Regulacja syntezy katecholamin (poprzez hydrolazę tyrozyny) ○Regulacja MAP-2 (microtubule associated protein) ○Regulacja przewodnictwa błonowego (przewodnictwo kanałów K+) ○Regulacja czułości receptora AMPA •PKA jest kotwiczona do różnych miejsc przy pomocy tzw białek kotwiczących

Ca2+-Kalmodulinozależna kinaza białkowa: •Jest szczególnie obfita w neuronach •Dekoduje wszelkie sygnały które podwyższają poziom Ca2+ •Jest złożona prawdopodobnie z 14 podjednostek z których każda posiada domenę katalizującą i regulatorową •Fosforyluje : reszty Ser/Tre, hydrolazę tyrozyny, MAP-2, synapsin, kanały wapniowe, receptory glutaminianowe, Ca2+-ATPase, czynniki transkrypcyjne, •Kinaza CaMII jest aktywowana wapniem niezależnie od jego źródła •Autofosforylacja jest jedną z najistotniejszych cech CaMII. Powoduje 400x wzrost powinowactwa do kalmoduliny i w efekcie aktywność CaMII trwa wiele sekund po spadku poziomu wapnia ! •Rola wapnia w neurotransmisji ○Ca2+ jest przekaźnikiem „orkiestrującym” ○Jest zarówno elektrogennym jonem jak też wtórnym przekaźnikiem. ○Wolno dyfunduje (wiązany przez proteiny) dlatego jako przekaźnik działa lokalnie ○Najważniejszym mediatorem dla Ca2+ jest kalmodulina, która po przyłączeniu Ca2+ zmienia konformację zwiększając powinowactwo i aktywując ponad 20 enzymów m.in. różne kinazy.

„Kinazy kognitywne” •PKA, PKC, CaMKII podlegają trwałym zmianom aktywności nie ustępującym nawet po zaniknięciu stymulującego je sygnału (wtórnego przekaźnika) •Kinazy te modulują aktywność synaptyczną •Przykład wydłużenia aktywności PKA po stymulacji (długotrwałęj) serotoninergicznej: Po długiej stymulacji serotoninergicznej aktywne pojednostki C kinazy PKA dostają się do jądra gdzie stymulują syntezę genów proteinaz (fosforylacja CREB) dla podjednostki R co powoduje trwałe wydłużenie aktywności PKA (bo zniszczenie przez proteinazy podjednostki regulatorowej R uniemożliwia złączenie z podjednostką C inaktywujące kinaze PKA). Jest to tak jakby pilot bombowca startującego z lotniskowca (pod wpływem długotrwałej militarnej indoktrynacji) zbombardował macierzysty lotniskowiec i pozostało mu nieustanne latanie i bombardowanie czegokolwiek (o ile ma jeszcze bomby czy inne granaty…)

Fosfatazy proteinowe – „robota na opak” Enzymy (odwrotnie niż kinazy ale w tych samych resztach) defosforylują (hydrolizują estrowe wiązanie) ufosforylowane reszty Ser/Thr albo Tyr (albo wszystkich wymienionych) •Fosfatazy podobnie jak kinazy kontrolują procesy metaboliczne, neurotransmisji, ekspresji genów, plastyczności, wzrostu etc. •Spośród fosfataz tylko kalcineuryna odpowiada bezpośrednio na wtórny przekaźnik (wzrost Ca2+). ○jest zależna od Ca2+kalmoduliny ○jest obfita w mózgu ale zakres działalności jest w znacznej części odmienny od również Ca2+kalmodulinozależnej kinazy CaMKII dlatego sygnał wapniowy nie powoduje bezowocnego fosfo i defosforylowania.!!! •Kinazy i fosfatazy proteinowe oraz ich substraty stanowią rodzaj zintegrowanej sieci. •Pomiędzy kinazami i fosfatazami trwa rodzaj dialogu („cross-talk”)

Neurotransmisja i geny, Sygnalizacja wpływająca na ekspresję genów 25

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •Sygnalizacja m-komórkowa nie tylko ogranicza się do regulacji funkcji białek istniejących w danym momencie w komórce, ale również może prowadzić do regulacji syntezy białek poprzez ekspresję odpowiednich genów. •Wydaje się, że fosforylacja (i defosforylacja) białek oraz regulacja ich ekspresji (genetyczna) są najważniejszymi czynnikami leżącymi u podstaw plastyczności neuronalnej •Zmiany ekspresji genów prowadza do długotrwałych zmian funkcji neuronów •Aktywatory transkrypcji mogą mieć położenie odległe od podstawowego aparatu transkrypcyjnego ○Np. CREB po fosforylacji (np. przez szlaki PKA lub ras i inne) tworzy połączenie z aparatem transkrypcyjnym przez pośrednictwo białka CBP. ○CBP jest formą tzw. białka adapterowego o cechach acetylotransferazy histonów („luzującej” ich połączenie z DNA •Inne białka adapterowe maja funkcję deacetylazy histonów hamującej transkrypcję (są też metyltransferazy i demetylazy histonowe o podobnych efektach)

Czynniki transkrypcyjne •CREB ○trwale związane z regulacyjnymi cis-elementami DNA ○jest aktywowany przez aktywną podjednostkę PKA, która w tym celu musi wniknąć do jądra. ○jest aktywowane jeśli jest ufosforylowane na Ser-133 ○tylko ufosforylowane rekrutuje CBP ○może być ufosforylowane nie tylko przez aktywna podjednostkę PKA ale też inne kinazy: CaMII, CaMIV oraz kinazę RSK2 ○jeśli żadna z tych kinaz z osobna nie daje wystarczająco silnego sygnału wymagana jest KONWERGENCJA wszystkich lub wielu z nich (wymagany jest sygnał koincydencji) ○odgrywa rolę (poprzez aktywowane geny) w długotrwałej plastyczności synaptycznej, uczeniu, pamięci) •STATs „signal tranducers and activators” ○fosforylowane przez receptorowe kinazy Trk aby dostać się do jądra i łączyć z DNA •NFkB ○wyjściowo w cytoplazmie związany z IkB. ○IkB gdy ulegnie fosforylacji uwalnia NFkB i umożliwia jego wejście do jądra

Geny aktywowane transkrypcyjnie w wyniku pobudzenia synaptycznego, przez leki, lub czynniki wzrostu można podzielić na dwie grupy (podział nie jest do końca jednoznaczny): •Cellular immediate-early genes (IEGs) ○Aktywowane są gwałtownie i szybko (w ciągu minut), a także przejściowo i nie wymagają uprzedniej syntezy nowych białek. ○„Klasycznie” są to geny dla czynników transkypcyjnych. (np. gen c-fos dla białka c-Fos) ○Tych genów (białek przez nie kodowanych) zaczęto używać jako markerów (synaptycznej) aktywności neuronalnej !! ○Białkowe produkty IEGs funkcjonujące jako czynniki tranksrypcyjne wiążą się z elementami cisregulatorowymi genów odpowiedzi późnej (late-response genes) aby je aktywować lub blokować. ○Zatem IEGs można nazwać „trzeciorzędowymi przekaźnikami •Late-response genes ○Geny indukowane (lub hamowane) wolniej (w ciągu godzin) i wymagające syntezy nowych białek (czynników transkrypcyjnych) C-Fos – marker aktywności neuronów ○Białka c-Fos łącząc się ze specyficznymi sekwencjami DNA modulują ekspresję genów („ekspresjonowanych” później) ○Ponieważ wiele neuronów wykazuje ekspresję c-Fos tylko po stymulacji synaptycznej białko c-Fos lub jego mRNA może być używany jako marker aktywności synaptycznej np. immunohistochemicznie ○Dzięki temu można oceniać które neurony były aktywne po stymulacji np. określonym lekiem czy innym bodźcem. UWAGA Wiele białek neuronalnych jest produkowana w wyniku bezpośredniej indukcji bez używania „genów natychmiastowo-wczesnych” (IEGs). Np. geny kodujące neuropeptydy (proenkefalina, prodynorfina, niektóre czynniki neurotroficzne) są aktywowane w odpowiedzi na depolaryzację, lub cAMP poprzez fosforylację konstytutywnie ekspresjonowanego CREB

26

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I

Induktory ekspresji genów w układzie nerwowym •Podział na czynniki wzrostu, troficzne, cytokiny jest często arbitralny natomiast sygnałowe mechanizmy wewnątrzkomórkowe mogą być użyteczne w podziale różnych zewnątrzkomórkowych czynników sygnalizacyjnych •Czynniki działające poprzez receptorową kinazę tyrozynową ○brain derived neurotrophic factor – (BDNF), ○neurotrofina-3 (NT-3), ○epidermal growth factor (EGF), ○fibroblast growth f. (FGF) •Czynniki działające poprzez niereceptorowe kinazy tyrozynowe : ○Cytokiny: leukemia inhibitory factor (LIF), ○Ciliary neurotrophic factor (CNTF), ○Interleukina-6 (IL-6) •Receptory tych czynników współdziałają z niereceptorowymi kinazami z rodziny „Janus kinase” ○kinazy te fosforylują jedno lub więcej białek typu STAT. ○dimery STAT przechodzą do jądra gdzie rozpoznają „cytokine response elements” ○różne białka z grupy STATs są swoiście aktywowane przez różne receptory cytokinowe.

Typy komunikacji w układzie nerwowym: (w cudzysłowie nazwy autora) 1.„precyzyjny” – od neuronu do neuronu z niewielką dywergencją np. w różnych „drogach” czuciowych lub ruchowych 2.”sieciowy” – wiele wzajemnych połączeń międzyneuronalnych – autonomiczny układ nerwowy 3.”sekrecyjny” – neurony podwzgórza wydzielają neurohormony do krążenia 4. „modulacyjny-rozlany” - mózgowe neurony z neurotransmiterem typu amin biogennych i cholinergiczne neurony mózgu skupione w niewielkich jądrach lub obszarach (np. locus coeruleus czy nucleus basalis Meynerti) lecz modulujące czynność rozległych obszarów a nawet niemal całego mózgu (np. stan czuwania). Bear, Connors i Paradiso w swoim podręczniku Neuroscience porównują te systemy modulacyjne do regulatorów głośności lub brzmienia dźwięku w radiu – nie zmieniają one przekazywanych treści (np. tekstu piosenki) ale niekiedy diametralnie zmieniają jej oddziaływanie na słuchającego.

27

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I

Energetyka mózgu Zaburzenia metaboliczne i schorzenia psychiatryczne wykazują obustronne związki (zwł asocjacja cukrzycy typ 2 z ch Alzheimera, otępieniem, chorobą Huntingtona) Schizofrenię leczono śpiączką cukrzycową Oprócz schorzeń psychiatrycznych zaburzenia metabolizmu mózgu graja rolę w neurodegeneracjach i innych schorzeniach OUN Uwaga: przy trudnych zadaniach matematycznych pogłębia się oddychanie… •Na co mózg zużywa energię?

Ok. 50% całej energii z PODSTAWOWEJ oksydacji glukozy (czyli w stanie nieaktywnym neuronów) jest zużywane na utrzymanie gradientów jonowych pomiędzy błonami cytoplazmatycznymi. ○pompy a szczególnie Na+K+ATPaza ○Ok. 87% energii idzie na glutaminianowo-zależną neurotransmisję ○13% na utrzymanie potencjału spoczynkowego •Glukoza jest głównym „paliwem” dla „siłowni” komórek mózgowych (ale nie najlepszym) •Jednak w warunkach ketogennych takich jak: cukrzyca, głodzenie i karmienie piersią również ciała ketonowe mogą dostarczać energii •Waga mózgu to 2% ciała ale zużycie glukozy sięga 25% ! (zużycie tlenu nieznacznie mniej) •W mózgu glukoza niemal w 100% jest utleniana do CO2 i wody poprzez glikolizę, cykla Krebsa i oksydatywną fosforylację, które to procesy „wyciskają” z mola glukozy 36 moli ATP

Paliwo mózgowe •Mleczan i pirogronian są preferowanymi substratami dla produkcji energii w neuronach ○Spalanie oksydatywne mleczanu wytwarza 18 ATP. ○Ponadto przemiana mleczanu w pirogronian nie wymaga ATP (jak to jest w przypadku wstępnego etapu glikolizy) ○Mleczan i pirogronian są substratami dla Glu ! (stąd „rozprzęgnięcia” konsumpcji glukozy i tlenu) •Pozwalają na utrzymanie aktywności neuronalnej w izolowanym skrawku mózgu (pozbawionym krążenia !). •Jednak ich przechodzenie przez BBB choć w świetle najnowszych badań możliwe jest prawdopodobnie niewielkie? •Mózg w znacznej mierze „pracuje lokalnie”., logiczne jest zatem, że posiada mechanizmy lokalnie regulujące dopływ substratów energetycznych, a więc regulujące przepływ krwi!

Ciekawostka… Regulacja przepływu mózgowego Badania przy pomocy PET z jednoczesnym obserwowaniem współczynnika lokalnego metabolizmu tlenu Local Cerebral Metabolic Rate dla tlenu (konsumpcja tlenu), oraz dla glukozy a także przepływu krwi pozwoliły na ocenę ich wzajemnych relacji. Stwierdzono, że w ludzkim mózgu te trzy parametry metaboliczne (zużycie tlenu, glukozy i przepływ) są ze sobą związane (czyli wzrastają jednocześnie i proporcjonalnie w czasie aktywacji mózgu) ale w różnych okolicach stopień korelacji może być różny!

Rola glikogenu •Glikogen jest akumulowany głównie w astrocytach, kk. ependymy i niektórych dużych neuronach •Jest największym energetycznym rezerwuarem dla mózgu.

○W mózgu jednak w porównaniu z innymi narządami (wątroba, mięśnie) jest go 100x mniej niż w wątrobie i 10 mniej niż w mięśniach. ○Jest zatem raczej „buforem” metabolicznym niż „zapasem paliwa”. •Wymiana glikogenu w mózgu jest bardzo szybka i skoordynowana z aktywnością synaptyczną. •Magistretti i wsp. w 1993 r stwierdzili, że w ogólnym znieczuleniu gwałtownie wzrasta poziom glikogenu w mózgu. ○W hodowli samych astrocytów anestetyki nie dają tego efektu. ○Zatem jest to efekt mediowany przez neurony (zahamowanie ich aktywności wzmaga zasoby glikogenu)

Compartmentacja metabolizm energetycznego •b-oksydacja wolnych kwasów tłuszczowych odbywa się tylko w astrocytach •Oprócz glukozy jedynym potencjalnym pełnym „zamiennikiem” glukozy jest mannoza, która przenika przez BBB i

poprzez 2 reakcje jest przekształcana do fruktozo-6-fosforanu (elementu glikolizy). ○Jednak mannoza nie jest normalnie obecna we krwi. •Nowsze obserwacje wskazują, że mleczan wbrew poprzednim mniemaniom może przedostawać się przez BBB.

28

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I •Zarówno mleczan jak i pirogronian mogą być preferowanymi substratami energetycznymi dla aktywnych neuronów •Oprócz glukozy ciała ketonowe stanowią istotne „paliwo” w przypadku karmionych piersią osesków

○mleko ma 55% tłuszczu w porównaniu z 30-35% w diecie po okresie karmienia piersią, więc jest to także rodzaj adaptacji do diety •Ciałą ketonowe są też zarówno dostarczycielami energii jak i prekursorami dla lipogenezy, bardzo istotnej w okresie formowania się mieliny! ○w wieku niemowlęcym nawet glukoza może być metabolizowana do substratów dla lipogenezy (mielinizacja!). •Także wolne kwasy tłuszczowe poprzez acetyl-CoA mogą służyć do produkcji ATP •Również głodzenie (i cukrzyca) powoduje wzrost użycia ketonów, których poziomy są podwyższone z powodu katabolizmu lipidów jako dostarczycieli energii. •Oprócz ATP drugim ważnym związkiem energetycznym jest NADPH wytwarzany z glukozy w cyklu pentozowym •Jeśli potrzeba silnych związków redukujących np. do wytwarzania kwasów tłuszczowych z acetylo-CoA lub produkcji mieliny spadek NADPH aktywuje cykl pentozowy. NADPH jest konieczny dla usuwania ROS (powstałych np. w oksydatywnej fosforylacji, w wyniku działania enzymów jak: hydroksylaza tyrozyny, NOS, lipooksygenaza, cyklooksygenaza) •Zesp. Wernickego-Korskakoff’a – patogeneza związana z elementem cyklu pentozowego (transketolaza) ○dotyczy alkoholików; ○objawy: zab. pamięci, zab.chodu i mięśni okulomotorycznych. ○wynika ze zmniejszonej aktywności transketolazy i braku vit B1 (pirofosforan tiaminy jest kofaktorem transketolazy) ○u osób wrażliwych tiamina 10x słabiej łączy się z enzymem i jeśli są alkoholikami lub przewlekle niedożywionymi powstaje zespół Korsakoff’a

Metabolizm glukozy w mózgu •Jest podobny jak w innych narządach i obejmuje trzy podstawowe szlaki:

○Glikoliza ○Cykl kwasów trójkarboksylowych ○Oksydatywna fosforylacja •Mózg w sytuacji zwiększonego zapotrzebowania na energię używa przede wszystkim glikolizy a później oksydatywnej fosforylacji.

Glikoliza •Szlak od glukozy do pirogronianu daje netto 2 ATP z 1 glukozy •Gdy glikoliza „produkuje” nadmiar pirogronianu i nie jest on efektywnie utleniany w cyklu Krebsa (konsumpcja

tlenu niewspółmierna do utylizacji glukozy) wtedy powstaje nadmiar kwasu mlekowego. •Jest to sytuacja w czasie aktywacji kory i jest podobna do mięśni w czasie wysiłku. •Dehydrogenaza kwasu mlekowego (LDH) zamienia mleczan w pirogronian •Wrodzona kwasica mleczanowa (zaburzenia przemiany węglowodanów) występuje w takich stanach jak: ○Niedobór karboksylazy kwasu pirogronowego ○Niedobór kompleksu dehydrogenazy kwasu pirogronowego (PDHC) ○Niedobór enzymów łańcucha oddechowego (szczególnie kompleksu I i IV)

Oksydatywna fosforylacja •Daje 18 ATP z jednego mleczanu (pirogronianiu) •Zamiana mleczanu w pirogronian nie wymaga ATP i dlatego mleczan jest dogodniejszym „paliwem” dla neuronów

niż glukoza. •ATP i NADPH są podstawowymi nośnikami energii dla mózgu

Zużycie glukozy w mózgu •Różnica poziomu glukozy między krwią tętniczą i żylną gluc(A-V) wynosi 0,55 mmol/l •Przepływ krwi wynosi 0,55 ml/g/min •Zatem zużycie glukozy na min na gram wynosi ok. 30 mmol/100g/min → 0,52 mola/24h C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + energia (z 0,5 mola glukozy jest 3 mole CO2)

29

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I 3mole x 25,4 litra/mol gazu = 76,2 litra CO2 (w temp. 36 st C) A zatem tyle dwutlenku węgla powstanie

BILANS spalania glukozy •Przy założeniu pełnego „spalania” z 1 cząsteczki glukozy otrzymujemy 36 ATP

(z 36 ATP tylko 2 ATP z glikolizy, reszta z oksydatywnej fosforylacji) •Zużycie glukozy w mózgu ok. 30 mikromola/100g/min ○Przy założeniu pełnego „spalania” na 6 moli tlenu przypada 1 mol glukozy i rzeczywiście dla mózgu współczynnik poboru (zużycia) O2/glukoza wynosi ok. 6/1. ○Wysiłek powoduje spadek tego współczynnika a jeszcze bardziej współczynnika poboru dla węglowodanów O2/(glukoza +1/2mleczanu) bo dodatkowo jest wykorzystywany mleczan z krwi. •Zużycie tlenu przez mózg wynosi 160 mikromol tlenu/100g tkanki mózgu/1min ○Przepływ krwi w mózgu (CBF) u dorosłego wynosi 55 - 57ml/100g tkanki/1min ○Różnica zawartości tlenu między krwią tętniczą i żylną (z opuszki żyły szyjnej) wynosi 3,1mikromol/ml ○Zatem zużycie tlenu wyniesie [AO2-VO2] X przepływ[AO2-VO2] 3,1mikromol/ml x 0,55 ml/g/min = 1,705 mikromol/g/min] 1,705 mikromol/g/min = 170,5 mikromol/100g/min (to jest nieco więcej niż 160 mikromol) ○Nie mniej niezależnie od sposobów obliczania w przybliżeniu mózg zużywa ok. 20% całego tlenu zużywanego przez cały organizm i w przybliżeniu tyle samo produkuje CO2 UWAGA !!!Mózg zużywa glukozy: 30 mikromol glukozy / 100g tkanki / 1min W przypadku współczynnika oddechowego = 1 obliczenie stechiometryczne wskazuje, że 6mmol O2 potrzeba na utlenienie 1mmol glukozy. A zatem jeśli 160 mikromoli tlenu podzielimy przez 6 otrzymamy 26,7 (a więc wyraźnie mniej niż obliczone eksperymentalnie przy pomocy pomiaru glukozy w krwi tętniczej tętnic szyjnych i żylnej w opuszce żyły szyjnej) zużycie glukozy wynoszące 30mikromol/100g/min !) Na co więc idzie te „ekstra” 3,3 mikromola glukozy? •Wyjaśnienie „afery cukrowej” •Część (stosunkowo niewielka co prawda) glukozy jest „spalana” tylko do kwasu mlekowego (a zatem bez

konsumpcji tlenu) •Nieco glukozy jest „magazynowane” w postaci glikogenu •Glukoza jest konieczna dla konstrukcji makromolekuł takich jak: glikolipidy, glikoproteiny •Glukoza jest konieczna do wytwarzania 3 kluczowych neurotransmiterów : Glu, GABA, ACh.

Astrocyty i metabolizm mózgu •Potrzeby energetyczne zależą od typu, wielkości (także długości aksonu) i obciążenia pracą neuronu. •Energię dostarczaja także komórki gleju i endotelia. •Stosunek ilości astrocytów do neuronów w przybliżeniu wynosi 1:1 ale im większy mózg stosunek ten jest wyższy na

korzyść astrocytów. •Astrocyty otaczając endotelia „stópkami ssącymi” stanowią pierwszą „stację” przeładunkową (i przetwórczą) dla glukozy, jednocześnie szczelnie otaczając synapsy i wychwytując N-T są najlepszymi kandydatami do roli czujników aktywności neuronalnej. •Podstawowy poziom zużycia glukozy obliczony w hodowli mieszanej astrocytów i neuronów wynosi: ○Dla astrocytów 20 nmol/mg/min ○Dla neuronów 2 nmol/mg/min •Zatem astrocyty zużywają w warunkach podstawowych znacznie więcej glukozy niż neurony !!! ○Ale aktywowane astrocyty przy pomocy glutaminianu zwiększają zużycie glukozy w sposób zależny od stężenia Glutaminianu i zjawisko to zależy nie od receptorów glutaminianu ale od transporterów ○Transport Glutaminianu do astrocytów jest sprzężony z wprowadzaniem jonów Na+ (2-3 Na+ na 1 Glu) ○Podwyższenie stężenia Na+ w astrocytach stymuluje pompę jonową (Na+K+-ATPazę). ○Powoduje to spadek ATP co z kolei stymuluje enzymy glikolizy: fosfofruktokinazę i heksokinazę. Innymi słowy: „wpuszczanie Na+ wraz z Glu do astrocyta powoduje wzrost Na+ co stymuluje

30

Dariusz Adamek: Neurobiologia – materiały do wykładów Część I Na+K+ATPazę a ta z kolei stymuluje glikolizę. Na 1 Glu i 3 Na+ wchodzące do astrocyta przypada wejście 1 glukozy, produkcja 2 ATP i 2 mleczanów w procesie glikolizy. Z tych 2 ATP jeden „idzie” na pompę Na+K+ATPazową, drugi na syntezę Gln ○Wykazano, że ATP jest negatywnym regulatorem fosfofruktokinazy a konsumpcja (spadek ATP) wywołuje wzrost aktywności tego enzymu (który limituje glikolizę), również następuje wzrost aktywności heksokinazy (fosforylującej glukozę i 2-DG) Zatem glutaminian pobudza astrocyty do zwiększenia metabolizmu glukozy (czyli wtedy gdy neurony „bardziej pracują” uwalniając Glutaminian, astrocyty zwiększają metabolizm...) •Dominująca przemiana Glutaminianu w astrocycie to amidacja wymagająca syntazy glutaminy (GS) i ATP UWAGA! To jest też usuwanie amoniaku! ○Glutamina jest obojętna dla neurotransmisji dlatego „bezpiecznie” przenika do neuronu ○Glutaminaza w mitochondriach neuronu przekształaca glutaminę (Gln) w glutaminian (Glu) (powstaje też w tej reakcji NH4+) •Tyle o astrocytach ALE CO Z ENERGIĄ DLA NEURONÓW ? ○Wiadomo, że neuronom w hodowli „wystarcza” mleczan i pirogronian. ○Z hodowli astrocytów uwalnia się głównie mleczan, a pirogronianu 10x mniej, natomiast inne produkty glikolizy w jeszcze mniejszych wręcz śladowych ilościach (alfa-ketoglutaran, cytrynian, maleate). ○Wykazano, że aktywacja neuronów powoduje wzrost uwalniania mleczanu z astrocytów oraz wzrost jego poboru przez neurony. ○Krew najprawdopodobniej nie jest żródłem mleczanu dla mózgu a zatem jego źródłem sa astrocyty. Także spektroskopia MRJ potwierdza wzrost mleczanu w strefach aktywacji neuronów (np. w korze wzrokowej)

Astrocyt i neuron jako wspólna „jednostka metaboliczna” - Podsumowanie •Metabolizm glukozy jest regulowany czasowo, przestrzennie i funkcjonalnie i (jak się wydaje) ściśle odzwierciedla

aktywność neuronalną ! •Ale miejscem gdzie wzrasta metabolizm glukozy nie jest „ciało neuronu” ale raczej NEUROPIL, gdzie są zlokalizowane pre i postsynaptyczne struktury otoczone ściśle wypustkami astrocytów. •W odpowiedzi na wyrzut glutaminianu związany z aktywnością neuronalną astrocyty uwalniają metabolit glukozy – mleczan, który jest potrzebny neuronom jako paliwo. •Glukoza dostarcza też „węglowego szkieletu” dla odnawiania puli neurotransmitera (Glutaminianu) a kluczową rolę pełni astrocyt m.in. ponieważ wyłącznie on posiada karboksylazę pirogronianu, która przekształcając pirogronian do szczawiooctanu (tzw. reakcja anaplerotyczna) „otwiera drogę” do cyklu Krebsa, wskazuje to na wyspecjalizowanie funkcji syntezy glutaminianu i innych aminokwasów w tych komórkach. •Inny selektywny dla astrocytów enzym: syntetaza glutaminy zamienia glutaminian na glutaminę i dopiero glutamina przechodzi do neuronów gdzie (dzięki glutaminazie) jest przetwarzana w glutaminian (dzięki enzymowi glutaminazie w mitochondriach która hydorolizuje glutaminę do glutaminianu z wytworzeniem NH4+).

Encefalopatia wątrobowa- przykład jak zaburzenie metabolizmu astrocytów wpływa na funkcje całego mózgu •Astrocyty łączą z neuronami ścisłe więzy metaboliczne •Zaburzenie funkcji astrocytów w encefalopatii wątrobowej (selektywnie dotyczące tych komórek) powoduje szereg objawów neurologicznych i psychiatrycznych. Świadczy to pośrednio jak bardzo zależne są neurony od astrocytów. •Amoniak w nadmiarze wnikając do astrocytów zmusza je do detoksyfikacji (syntaza glutaminy) na co spożytkowują zarówno na bieżąco produkowaną energię jak i zapasy energetyczne (glikogen). •Astrocyty ulegają degeneracji widocznej w mikroskopie. Stają się one niewydolne w prawidłowym zaopatrywaniu neuronów w metabolity

31