Medizinische Mikrobiologie Pharmazie Kurs
K. Zimmermann FLI f. Medizin. Mikrobiologie
Methoden zum Nachweis von Mikroorganismen • Mikroskopie – Lichtmikroskopie • Nativpräparate • Färbungen – Übersichtsfärbungen – Differentialfärbungen
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Methylenblau Gram Ziehl-Neelsen
– Elektronenmikroskopie Kultur Serologische Methoden Molekularbiologische Methoden Zellkultur Tierversuch
Mikroskopischer Nachweis von Mikroorganismen Lichtmikroskopie - Nativpräparate: ungefärbt - Übersichtsfärbungen (ein Farbstoff) Darstellung von Strukturen - Differentialfärbungen (Färbung/Gegenfärbung) Zellwand: Gram-F., Ziehl-Neelsen-F. Kapsel / Sporen / Geißeln Elektronenmikroskopie
Ablauf Gramfärbung 1. Lufttrocknen u. Fixieren (Hitze, Ethanol) 2. Färben mit Gentianaviolett Gentianaviolett-PhenolAmmoniumoxalatlösung
anschließend spülen (H2O) 3. Beizen (Lugolsche Lösung) Jod-Kaliumjodid-Lösung
anschließend spülen (H2O) 4. Entfärben mit 96%igem Alkohol anschließend spülen (H2O)
5. Gegenfärbung mit Fuchsin Fuchsin-Phenolrot-Lösung
anschließend spülen (H2O)
Vermehrung von Mikroorganismen (Mikroorganismenkultur) Nährmedien / Kulturmedien: zur Kultivierung von Mikroorganismen dienende Substrate, die alle zum Wachstum erforderlichen Nährstoffe enthalten - synthetische Medien ↔ komplexe Medien - feste Medien ↔ flüssige Medien - Universalmedien (Komplett-, Vollmedien) ↔ Spezialmedien
Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen Nährmedium
Charakterisierung
Komplexe Medien
bestehen aus Nährstoffen deren Inhalte nicht chemisch bestimmt sind, wie zum Beispiel Rindfleisch-Extrakt, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt (z.B. Blutagar)
Synthetische Medien (def. Medien)
beinhalten eine genau bestimmte Anzahl und Menge an Inhaltsstoffen, die chemisch gereinigt werden, um Spuren von anderen Stoffen auszuschließen (z.B. Amies-Medium)
Minimalmedien
Sonderform der definierten Medien, beinhalten nur die minimal nötigen Stoffe für das Wachstum der zu kultivierenden Mikroorganismen
Flüssige Medien
Nährbouillon, Nährbrühe (z.B. Fleischwasser)
Feste Medien
Nährboden (Nährbouillon mit zugesetzten Verfestigungsmitteln, z.B. Gelatine, Agar)
Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen Agar (Agar-Agar): ● gelierfähiges Polysaccharid, vorwiegend Polygalaktane. Gewinnung hauptsächlich in Ostasien aus verschiedenen Meeres-Rotalgen (Gelidium, Gracilaria). ● Nähragar wird beim Erhitzen ab 95°C flüssig und erst arrt ab 45°C. ● Agar wird von Bakterien nicht abgebaut. Vorteil gegenüber Nährbouillon: auf festen (Agar-)Nährböden können Reinkulturen von Bakterien isoliert werden.
Blutagar: zu 100 ml verflüssigtem Nähragar (auf 50°C abgekühlt) 5-10 ml defibriniertes Blut geben, mischen und in Petrischalen ausgiessen.
Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen Nährmedium
Charakterisierung
Universalmedien (Komplettmedien)
komplexe oder synthetische Nährmedien, auf der eine Vielzahl verschiedener Mikroorganismen wachsen (z.B. Blutagar)
Spezialmedien Elektivmedien
Medien, die das Wachstum bestimmter Bakterien fördern (z.B Mannit-Kochsalz-Agar zur Anzucht von Staphylococcus aureus)
Selektivmedien
Spezialmedien, enthalten Hemmstoffe, die nur das Wachstum bestimmter Mikroorganismen zulassen (z.B. Tinsdale-Agar zur Anzucht von Korynebakterien)
Differentialmedien (Indikatormedien)
Spezialmedien, die eine Unterscheidung verschiedener Mikroorganismen ermöglicht. Sie zeigen bestimmte Stoffwechselleistungen an (z.B. MacConkey-Agar)
Nährböden • Grundbestandteile Agar-Agar Seealgen, getrocknete Kolloidsubstanz fester Nährboden = 1-2% Peptone
eiweißhaltiges Material, Fleisch, Casein, Sojabohnen, enzymat. Hydrolyse (Polypeptid, Dipeptid, Aminosäure) völlig löslich in H2O pH 5-7
Fleischextrakt Hefeextrakt
mageres Rindfleisch autolysierte Hefe (Vit. B-Komplex)
• Spezielle Nährsubstrate Serum 10% Blut 5-10% Schaf defibriniert Kochblut (hohe Ansprüche) 5-10 min 75-80°C MacConkey-Agar = Selektivnährboden (kein Blut) Eiernährboden ( Malachitgrün + Ei-emulsion)
Differenzierung grampositiver Kokken Katalase positiv
Staphylokokken
negativ
Streptokokken
Koagulase
positiv
St. aureus
Hämolyse
negativ
α
KNS
VS
β
(γ)
anhämol.Str. (ß)HS
Katalase-Reaktion Das eisenporphyrinhaltige Enzym Katalase wird von den meisten oxidasepositiven aeroben und fakutativ anaeroben Spezies - mit der wichtigsten Ausnahme STREPTOKOKKEN gebildet.
Es wandelt im Energiestoffwechsel gebildetes Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff um.
Koagulase-Reaktion Freie Koagulase (extrazelluläres Enzym) bindet an Prothrombin und aktiviert die Entstehung von Fibrin aus Fibrinogen.
Clumping Faktor (zellwandgebundenes Protein) = Fibrinogenrezeptor Differenzierung von Staphylococus aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS)
durch die Koagulase-Reaktion gebildetes Fibringerinnsel in einem Reagenzglas
Koagulase-Reaktion
Latexpartikel sind mit Fibrinogen und IgG beladen Fibrinausfällung durch Koagulase und Clumping factor Protein A von Staph. aureus bindet an den Fc Teil von Immunglobulinen, welche dann nicht mehr an den Fc-Rezeptor von Phagozyten binden Ausserdem sind die Latexpartikel mit spezifischen Antikörpern gegen die Kapselpolysaccharide von Staph. aureus beladen. Durch diese Mehrfachbeladung besteht die Möglichkeit, alle Stämme zu erfassen.
Oxidase-Reaktion •
Nachweis von Cytochromen aus der Atmungskette, die Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor im Energiestoffwechsel verwenden
•
Cytochrome ermöglichen den Eintritt von atmosphärischen Sauerstoff in den Zellstoffwechsel, indem sie durch molekularen Sauerstoff oxydiert werden
•
in der Zelle erfolgt die enzymatische Reduktion der Cytochrome
•
künstliche Substrate (N,N-Dimethyl-1,4-diaminobenzol) bewirken die Reduktion des Cytochromoxidase-Systems (d.h. sie werden oxydiert)
•
Substrate in Abhängigkeit vom Reduktions-/Oxidationszustand farblos bzw. gefärbt
Gramnegative Stäbchen: Bsp Enterobakterien: biochemische Reaktionen Kohlenhydratspaltung Abbau von Kohlenhydraten (Glucose, Lactose, Rhamnose) Säure (18 – 24 h) Indikator: Bromthymolblau Farbumschlag blaugrün (negativ) zu gelb/orange (positiv) Citrat-Abbau C-Quelle: Citrat, N-Quelle: Ammoniumsalz (Grundlage für Energie- + Baustoffwechsel) Alkalisierung Indikator: Bromthymolblau Farbumschlag grün (negativ) zu blau (positiv) H2S-Bildung - aus Eiweißkörpern bzw. S-haltigen Aminosäuren (insbes. Cystein) - aus S-haltigen, (an)organischen Zusätzen [(Thio-)Sulfaten, Sulfiten, Cystein] Indikator: Metallsalz (insbes. Ferrochlorid + Bleiacetat) Sulfid (schwarzer Niederschlag) Urease-Nachweis / Indol-Bildung Indikator: Phenolrot (durch Säurebildung aus Glucose-Abbau gelb = negativ) - Urease: Harnstoff Ammoniak + CO2 positiv (rotviolett) - Indol: Eiweißabbau (Tryptophan) Indol (Nachweis mit Kovacs Reagenz, roter Ring) - Beweglichkeit: Wachstum außerhalb des Impfstichs (wolkenartige Trübung) im Agar Ornithin-Dekarboxylierung L-Ornithin (L-Lysin u.a) [pH niedrig] Amine + CO2 (pH-Anstieg) Indikator: Bromkresolpurpur Farbumschlag von farblos/gelblich (negativ) zu violett (positiv)
Mikroflora im Menschen Standort
Keimzahl (pro ml o. g)
anaerobe Bakterien
aerobe Bakterien
Sproßpilze
Zungenoberfläche
108 – 109 (Speichel)
108
107
102
Zahnoberfläche
1010 - 1011
1011
108
102
(Plaquesubstanz)
Zahnfleischtasche
1012 - 1013
1012
108
102
Magen
104 – 105
104
104
103
oberer Dünndarm
104 – 105
104
103
102
unterer Dünndarm
107 – 108
107
105
103
Dickdarm
1011 – 1012
1011
108
103
Mikroflora im Menschen Standort
Aerobier
Anaerobier
grampositiv
gramnegativ
grampositiv
gramnegativ
Zungenoberfläche
Str. salivarius Str. mitis Str. sanguis Micrococcus, Staphylococcus Corynebacterium
Neisseria Vibrio Haemophilus Enterobacteriaceae Candida u.a.
Peptococcus Peptostreptococcus Propionibacterium Actinomyces
Veillonella Prev. melaninogenica Prev. oralis
Wangenschleimhaut
Str. sanguis Str. salivarius Str. mitis
Zahnoberfläche
Str. mutans Str. sanguis
Neisseria Hämophilus Mycoplasma Protozoa (Entamoeba gingivalis Trichomonas tenax)
Peptostreptococcus Actinomyces Nocardia Lactobacillus
Veillonella Fusobacterium Leptotrichia Prev. oralis Bact. corrodens Propionibacterium
Sulcus gingivalis
Str. sanguis Str. mitis S. epidermidis Micrococcus
Mycoplasma Entamoeba gingivalis Trichomonas tenax
Desinfektion heißt, einen Gegenstand in den Zustand versetzen, in dem er nicht mehr infizieren kann
Wirksamkeit abhängig von: • Temperatur • Einwirkungszeit • Konzentration und Art des Wirkstoffes • weitere Faktoren: inkorporierte MO (Ausscheidungen, Blut) schlecht o. nicht erreichbar
Desinfektionsverfahren Physikalisch UV-Strahlen
Filtration
Heißwasser 75 - 95°C 10 - 30 min
thermische Methoden
strömender Dampf 100°C 10 - 30 min
Niederdruckdampf 105°C, Unterdruck 1 - 15 min
Chemisch Alkohole / Aldehyde / Phenole und Derivate / Metalle / Halogene / Oberflächenaktive Substanzen / Oxidantien
Chemothermisch Kombination von feuchter Hitze (60°C) und chemischen Desinfektionsmitteln bei thermolabilen Werkstoffen
Wirksamkeit von Dekontaminationsmaßnahmen Reinigung: mechanische Entfernung Reduktion der Keimzahl (2-3 log-Stufen = 99 – 99,9 %) Antiseptik: Inaktivierung von MO auf lebendem Gewebe Desinfektion: Reduktion der Keimzahl (5 log-Stufen = 99,999 %) Inaktivierung krankheitserrregender MO Entkeimungsfiltration: Abtrennung lebender und toter MO, nicht aller Viren Sterilisation: Inaktivierung aller MO inklusive aller Sporen und Viren Keimzahlreduktion mind. 6 log-Stufen
Sporenbildende Bakterien grampositive Stäbchen aerob: anaerob:
Bacillus Clostridium
Bakteriensporen stoffwechselinaktive Dauerformen hohe Umweltresistenz
Artspezifische Sporenform und –lokalisation Sporenbildung (Sporogenese) durch Nährstoff-Mangel induziert Sporenkeimung: Aktivierung, Keimung, Auswachsen
Bacillus: aerobe sporenbildende Stäbchen Bedeutung: Toxinbildner (Lebensmittel, Bioterrorismus), Antibiotikaproduzent, Bioindikator (Phenylketonurienachweis, Sterilisatoren), Proteasebildner (Waschmittel) Bacillus subtilis
Bacillus cereus
Clostridium: anaerobe sporenbildende Stäbchen verschiedene Spezies verursachen Krankheiten durch die Produktion von potenten Protein-Ektotoxinen
Wichtige Humanpathogene Spezies: A) Clostridium botulinum B) Clostridium tetani C) Clostridium perfringens D) Clostridium difficile
Auswertung Sporenbildner Spezies
Wachstum
Makromorphologie (Blutagar)
Mikromorphologie
flache trockene Kolonien, unregelmäßiger Rand
ovale zentrale bis subterminale Spore terminale runde Spore (Trommelschläger)
aerob anaerob Bacillus subtilis
+
Clostridium tetani
+
durchsichtig, flach, stumpfe Oberfläche, unregelmäßiger Rand mit Ausläufern
Clostridium perfringens
+
flach, matt glänzend, unregelmäßiger große grampositive Rand, Doppelzonenhämolyse Stäbchen mit abgerundeten Enden
Clostridium difficile
+
Weißlich, flache Kolonien mit unregelmäßigem Rand (Geruch nach Stalldung)
Clostridium botulinum
+
schlanke Stäbchen z.T. mit ovaler subterminaler Spore subterminale ovale Spore (Tennisschläger)
Wichtige Erreger von Humanmykosen (Auswahl)
Erreger
Reservoir
Dermatophyten
Mykose/häufige Lokalisation Dermatophytose Haut, Haare, Nägel
Trichophyton spp. Microsporum spp. Epidermophyton
Mensch, Tier, Erdboden
Hefen Candida
Mensch, Tier, Nahrungsmittel
Candidose Haut, Schleimhaut, andere Organe
Cryptococcus
Vogelkot
Cryptococcose/ZNS
Schimmelpilze
ubiquitär
Aspergillose Lunge und andere Organe Mucormykose Verletzungsmykosen
Pflanzen, Erdboden
Primäre Systemmykosen
Aspergillus spp. Zygomyceten (Mucor u.a.) Dematiaceae
Dimorphe Pilze (außereuropäische Mykosen zB. Histoplasma
Dermatophyten Keratinophile Pilze, Einteilung ungeschlechtliche FortpflanzungsOrgane (Mikro-und Makrokonidien) geophil zoophil anthropophil
Erde Mensch, Kontamination selten Infektion Tier Mensch, intensiver Fellkontakt Mensch Mensch oder indirekt
Pathogenese: Sporen Keratinozyten Auskeimen zu Hyphen fungistatische Lipide und Proteine können Eindringen verhindern Infektion gesteigerte Desquamation (Schuppung) Hyperkeratose
Klinik Tinea = Sammelbegriff für oberflächliche Dermatomykose unabhängig von Spezies T.pedis (Fuß) T.capitis (Kopf) T.inguinalis (in der Leistenbeuge) T.corporis (Körper) T.barbae (Bart)
Therapie:
lokale Applikation (Salben) Azole ausgedehnte Dermatosen (Haut, Nagel, Haare) systemische Therapie Griseofulvin, Itraconazol 6 Monate (Finger) 12 Monate (Fuß)
Labordiagnostik Virus-assoziierter Erkrankungen direkter Virusnachweis mit Virusvermehrung Zellkultur Brutei Versuchstier ohne Virusvermehrung Mikroskopie (Einschluß-K.) Elektronenmikroskopie Antigen virale Nukleinsäure indirekter Virusnachweis Immunantwort des Wirtes virus-spezifische Antikörper
Methoden zum Virusnachweis
HA HHT ELISA IBL FAT CPE NAT
Hämagglutination Hämagglutinationshemmung Enzymimmunoassay Immunoblot Fluoreszenzantikörpertechnik zytopath.Effekt in der Zellkultur Nukleinsäurenachweis RT-PCR, n-PCR Real-time PCR Sequenzierung Nukleotid-alignment
direkt indirekt x x x x x x x x x
x
Polymerasekettenreaktion Nukleinsäureextraktion aus Probe Cave: RNA-Viren Reverse Transcription in c-DNA Amplifikation DNA, Primer, dNTP,Taq-Polymerase
Denaturing der Ziel-DNA Einzelstränge Temperatursenkung Anlagerung der Primer = Start der Neusynthese Temperaturanstieg Sythese-Stop erneute Denaturierung X-Zyklen (25 – 50 Kettenreaktion)
Cave: Störfaktoren Heparin, Proteinasen, Harnstoff, Phenol, Paraffin, Salze
Detection der Amplifikate a) Längenscreening im Gel Ethidiumbromid klassische PCR
b) Fluoreszenzsignale messen markierte Oligonukleotide Real-time PCR
Real-time PCR nach TaqManTM Prinzip Amplifikation in einem Reaktionsgefäß Detektion Basis: 5‘Exonuklease-Aktivität der AmpliTaqDNA-Polymerase spezielle fluorogene Sonde = Oligonukleotid markiert mit Reporter-Farbstoff (5‘Ende) Quencher-Farbstoff (3‘Ende)
Zellbiologische Verfahren Virusisolierung Versuchstier embryoniertes Hühnerei Zellkultur (monolayer) a) primär (aus Organen angezüchtet, diploid) b) diploid = Zell-Stamm (2.-50. Passage, begrenzte Lebensdauer) c) Zell-Linie = permanent (unbegrenzte Passagenzahl, tri-, tetra-, polyploid, oft tumorbildend)
Antikörper-Nachweise Neutralisationstest Hämagglutinations-Hemmtest Komplementbindungs-Reaktion Immunfluoreszenztest ELISA Immunoblot Quantitativ Serumtitration Titer Einpunktverfahren(ELISA)
ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) Detektions-Antikörper (Enzym-markiert)
Enzym setzt farbloses Substrat um
nachzuweisende Komponente aus Patientenmaterial (AK / Ag)
adsorbierter Nachweisparameter (Ag / AK)
es entsteht ein lösliches farbiges Produkt
OD-Messung
Beurteilung von Antikörperbestimmung Akute Infektion Cave:
IgM Antikörper Nachweis in einer Probe
persistierende Virusinfektionen bei Aktivierung erneut IgM-Bildung möglich
Intrauterine Infektion IgM im Serum des Embryo ab 19.SSW selbständige IgM Bildung keine Placentapassage NT und HHT Differenzierung:
Antikörperanstieg 4-fach in zwei Proben, Abstand 14 Tage akute Phase, postakute Phase
Western-Blot = Immunoblot Auftrennung der Virusproteine Molekulargewicht Nitrozellulose
Patientenantikörper
enzymgekoppelter Anti-Human IgG Antikörper
farbloses Substrat
Umwandlung in unlöslichen farbigen Niederschlag
