MANUAL DE USO

DEL MICROSCOPIO

AXIOIMAGER A1

El presente es un manual abreviado pero suficiente para el correcto manejo y obtención de máximo rendimiento del equipo.

IMPORTANTE CONOCER DE NUESTRO MICROSCOPIO Tipos de visualización posibles con nuestro microscopio Zeiss Axio Imager A1 Luz transmitida ( TL) -

Campo claro

-

Contraste de fases

-

Contraste interferencial diferencial ( DIC ) o Nomarsky

-

Campo oscuro

Luz reflejada o fluorescencia ( RL) Nuestro microscopio presenta cuatro filtros de excitación / emisión que permiten la visualización de fluorocromos que emiten en el azúl hasta el rojo lejano. Información acerca de los distintos objetivos disponibles y la visualización permitida en cada caso Contraste de Fases: 10x---ph1

Dependiendo de la fase del objetivo seleccionaremos la posición

20x---ph2

adecuada 1,2 o 3 en el condensdor. La rueda de filtros siempre en

40x---ph3

posición1.

DIC 63x y 10X. Rueda de filtros en posición 6 ( analizador) Condensador en posición III ( polarizador) Se recomienda trabajar con mas luz que en campo claro Corredera de Normasky o prisma de DIC, localizado junto al objetivo, ajustar la visualizacion con rueda moleteada. Importante Objetivo 63x no preparado para DAPI.

VISTA GENERAL DEL AXIOIMAGER A1 Recordar que al tratarse de un manual completo aunque abreviado, sólo se incluye lo mas destacable e imprescindible a conocer para el correcto manejo del equipo.

1. Oculares.

6. Platina

2. Tubo binocular

7. Revolver porta objetivos

3. Lámpara para luz reflejada (HBO 100)

8. Condensador

4. Estativo del microscopio, manual

9. Revolver de reflectores

5. Lámpara para luz transmitida (HAL 100)

Varilla de empuje para la salida óptica izquierda a la cámara Localizada a la derecha de los oculares. Permite la desviación de la trayectoria de los rayos a la salida óptica izquierda a la cámara. Posibilidades ofrecidas: Varilla introducida: 100% observación por los oculares. Varilla sacada: 100% observación a la cámara fotográfica Varilla semi-introducida: 50% :50% de la trayectoria a oculares/ cámara fotográfica ( dotada de espejo divisor)

Mandos en el estativo del microscopio. 1. Tecla RL- Obturador para luz reflejada ON/OFF con LED de control. Localización: frontal, lateral inferior derecho del estativo. Permite la apertura o cierre de la trayectoria de la luz reflejada. El LED de control está encendido cuando el obturador está abierto. NOTA: la luminosidad de la lámpara de Mercurio puede ser ajustada. Para ello utilizar la rueda nombrada como FL, lateral derecho parte superior del microscopio. Permite atenuar la trayectoria de fluorescencia. Posee seis posiciones, que se ajustan por giro de la rueda moleteada. 2. Tecla TL- Obturador para luz transmitida ON/OFF. Localización: frontal, lateral interior derecho del estativo. Permite la apertura o cierre de la trayectoria de luz transmitida. El LED de control está encendido cuando el obturador está abierto. NOTA: la alimentación de tensión continua de la lámpara halógena puede ser regulada. Los LEDs dispuestos de forma anular indican la tensión ajustada en 15 escalones. El regulador de la intensidad luminosa se localiza junto a las teclas mencionadas: frontal, lateral inferior derecho del estativo. 3. Tecla 3200K- Temperatura de color 3200K ON/OFF con LED de control. Regula la tensión de la lámapra halógena al valor que corresponde a la temperatura de color de 3200K. La temperatura de color de 3200K se requiere para tomar fotografías de color. El LED de control está encendido cuando el obturador está abierto. Condensador. Condensador universal con disco de revólver equipado para las distintas visualizaciones de luz transmitida. Por giro de la rueda del revólver , se intercala el inserto de campo claro o bien los diafragmas de contraste. La posición del revolver se indica de forma abreviada en la denominada ventana del revólver. Las distintas posiciones se corresponden con:

H: Campo claro

1,2,3: Contraste de fases ( depende de la fase del objetivo)

D: Campo oscuro

III: Contraste interferencia-DIC

Revolver de reflectores o Rueda de filtros. Dicho revolver presenta distintas posiciones cambiables para módulos reflectores o módulo analizador. La configuración de nuestro microscopio es la siguiente: Posición1: Posición vacía. Campo claro, Contraste de fases y Campo oscuro.

Posición 2: Luz reflejada. Filtro que excita en el UV y recoge la emisión en el azúl.

Posición 3: Luz reflejada. Filtro que excita en las longitudes de onda del azúl y recoge la emisión en el verde.

Posición 4: Luz reflejada. Filtro que excita en las longitudes de onda del verde y recoge emisión en el rojo.

Posición 5: Luz reflejada. Filtro que excita en las longitudes de onda del azúl y verde, recoge emisión en el verde y rojo.

Posición 6: En dicha localización se encuentra el analizador a interponer para visualización del DIC.

ADQUISICIÓN DE IMÁGENES. PASOS A SEGUIR. 1. Encendido del equipo Encender el ordenador. Clave CSIC

Encender el microscopio mediante el interruptor ON/OFF dispuesto en el lado izquierdo del estativo. Encendido de la lámpara de fluorescencia. La fuente de alimentación de la lámpara de fluorescencia y su temporizador se encuentran en repisa sobre mesa del microscopio.

-

Encender el interruptor ROJO del temporizador Encender el interruptor de la fuente de alimentación de la lámpara

El temporizador sirve para limitar el uso de la lámpara en su periodo de enfriamiento. Se recomienda esperar algún tiempo hasta que la lámpara funcione al 100% previo a la adquisición de imágenes. En el apagado seguir el orden inverso: interruptor de la fuente de alimentacion de la lámpara e interruptor del temporizador. NOTA: Si no han transcurrido 30 minutos desde el apagado de la lámpara y volvemos a pulsar el interruptor del temporizador, éste no se enciende y se vuelve a reiniciar el tiempo de espera. Importancia de anotar hora de inicio y apagado de lámpara. 2. Enfoque de la muestra Tener en cuenta todo lo comentado en los apartados: “Importante conocer de nuestro microscopio” , “Vista general de AxioImager A1 ”. A continuación se expone una Guia rápida de los pasos a dar para las distintas visualizaciones posibles: VISUALIZACIÓN DE LUZ REFLEJADA/ FLUORESCENCIA Pulsar RL ( estativo del microscopio) Condensador: su posición no influye para luz reflejada. Revolver de reflectores o rueda de filros: 2: azul

3: verde

4: rojo

5: verde y rojo

VISUALIZACIÓN DE CAMPO CLARO Pulsar TL ( estativo del microscopio) Condensador: posición H Revolver de reflectores o rueda de filtros: 1 NOTA: Para máximo rendimiento en la imagen, Ajuste de Kohller. VISUALIZACIÓN DE CONTRASTE DE FASES Pulsar TL ( estativo del microscopio) Condensador: distintas posiciones posibles dependiendo de la fase del objetivo a utilizar. Objetivo 10x ( ph1): posición 1

Objetivo 20x ( ph2): posición2

Objetivo 40x ( ph3): posición3 Revolver de reflectores o rueda de filtros: 1 NOTA: Para máximo rendimiento en la imagen, es imprescindible correcto ajuste de Kohller y centrado de las fases para cada objetivo. Este último ajuste se lleva a cabo periódicamente por el técnico responsable del servicio. VISUALIZACIÓN DE CAMPO OSCURO Pulsar TL ( estativo del microscopio) Condensador: posición D Revolver de reflectores o rueda de filtros: 1 NOTA: Se recomienda trabajar con fuerte intensidad de iluminación. VISUALIZACIÓN DEL DIC Pulsar TL ( estativo del microscopio) Condensador: posición III ( polarizador) Revolver de reflectores o rueda de filtros: 6 ( analizador) Además de los dos elementos anteriores ( analizador/ polarizador) para la visualización del DIC es necesario otro elemento: prisma del DIC ( cada objetivo preparado para DIC, tiene su propia corredera del DIC, es la que termina en anillo moleteado). NOTA: Para máximo rendimiento: ajuste de Kohller con campo claro y objetivo a utilizar o más próximo posible, trabajar con fuerte iluminación, con rueda moleteada del prisma del DIC pasar a la zona con poca luz que se corresponde a la de máximo relieve.

3. Ajuste de la imagen y adquisición ( software Axio Vision AC Image). Ajuste de la imagen. Pulsar CAMERAS y aparece submenú Axio  Cam MR. Pulsar live si no marcado.           

Tres lenguetas desplegables en submenú Axio Cam MR: ADJUST/ FRAME/ GENERAL. A nivel usuario para el ajuste de la imagen es necesario conocer:   Submenú FRAME: Camera Mode. Te permite  la selección de distintos formatos. El usado  como norma general que se selecciona por  defecto es 1388x1040. 

Ajuste de la imagen: para ello nos valemos de Exposure ( submenú ADJUST) y Gain factor (submenú GENERAL). La intensidad de luminosidad de lámpara halógena ( en caso de campo claro) como se expuso puede ser modulada manualmente en el estativo del microscopio.    

NOTA IMPORTANTE: se ruega no tocar el resto de opciones disponibles tales como Black reference/ Shanding correction/ Refresh Overview puesto que alteran la configuración actual del equipo Para el ajuste de la imagen se recomienda habilitar el icono Over Exposure ( marca la sobreexposición en rojo). Localizado en menú que aparece bajo la pantalla de imagen.

Adquisición y grabado de imágenes. Tras los ajustes necesarios para la correcta adquisición, adquirir la imagen SNAP para cada canal ( en su caso). Las fotografías realizadas van quedando en pantallas abiertas. Al tratarse de cámara monocromática, debo recordar el orden de las imágenes para no cometer errores en su posterior montaje con ImageJ/ Fiji/ Photoshop. Guardar las fotografías mediante File- Save as ( formato .tiff) Guardar siempre en la carpeta de usuarios y posteriormente pasar la carpeta a unidad externa de almacenaje ( nombrada como Z) para poder ser recuperada desde el laboratorio. Se ruega eliminar periódicamente las imágenes almacenadas en el ordenador de adquisición para el correcto funcionamiento del equipo. Para acceder desde cualquier equipo del centro a dicha unidad externa o virtual, proceder del siguiente modo: Inicio_ Ejecutar/ Run_ \\temporal.ipb.csic.es\public

Laura Montosa Hidalgo