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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 074 965 kN´umero de solicitud: 9400172 kInt. Cl. : C12N 7/01

11 N.◦ de publicaci´ on: 21

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˜ ESPANA

C12N 15/38 C12N 15/63 A61K 39/265

k

PATENTE DE INVENCION

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k kFecha de publicaci´on de la solicitud: 16.09.95

22 Fecha de presentaci´ on: 31.01.94 43

Fecha de concesi´ on: 22.03.96

k kFecha de publicaci´on del folleto de patente:

45 Fecha de anuncio de la concesi´ on: 01.05.96 45

01.05.96

B1

k

73 Titular/es: Laboratorios Hipra, S.A.

Avda. La Selva, s/n 17170 Amer, Gerona, ES

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72 Inventor/es: Rebordosa, Xavier;

Pi˜ nol, Jaume; Perez-Pons, Josep Antoni; Lloberas, Jorge y Querol, Enrique

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74 Agente: Isern Jara, Jorge

k kResumen:

54 T´ıtulo: Virus mutante recombinante de Rinotraqueitis infecciosa Bovina y vacunas que lo contienen.

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Virus mutante de Rinotraqueitis infecciosa Bovina y vacunas que lo contienen. El virus obtenido, caracterizado como BHV1 FM gII−, es el resultado de una delecci´on, de una inserci´on, o de una sustituci´on (deleci´on e inserci´on) en el gen gII del Hepesvirus Bovino 1 (BHV1), que no producen ning´un poli´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII. El virus BHV1 FM gII se utiliza para la preparaci´ on de vacunas contra la Rinotraqueitis infecciosa Bovina, y de kits de diagn´ostico para distinguir serol´ogicamente entre animales vacunados e infectados por virus de campo.

Aviso:

Se puede realizar consulta prevista por el art◦ 37.3.8 LP. Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 074 965 B1 DESCRIPCION Virus mutante recombinante de rinotraqueitis infecciosa bovina y vacunas que lo contienen. 5

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Campo de la invenci´ on La presente invenci´on se refiere en general a vacunas v´ıricas basadas en virus mutantes, y en particular al virus de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (Herpesvirus Bovino 1), a la localizaci´ on, clonaje y secuenciaci´on de la glicoprote´ına gII y a la creaci´on de mutantes conteniendo deleciones o inserciones o ambas en el locus del gen de la glicoprote´ına gII, y a su utilizaci´on en una vacuna en forma de un virus defectivo de dicha prote´ına, de manera que no se producen polip´eptidos antig´enicos codificados en el mencionado gen. Los animales vacunados con estos virus mutantes no desarrollan anticuerpos contra la glicoprote´ına gII del virus por lo que pueden ser distinguidos serol´ ogicamente de aquellos animales infectados con cepas de campo del virus IBR. La presente invenci´ on tambi´en est´a relacionada con vacunas contra la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina basadas en estos virus mutantes, m´etodos de producci´ on, formulaci´ on y utilizaci´on de las mismas, as´ı como m´etodos de diagn´ ostico para distinguir serol´ ogicamente entre animales vacunados e infectados por virus de campo. Definiciones de t´ erminos que faciliten la interpretaci´ on de la invenci´ on

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Se incluyen las siguientes definiciones con objeto de interpretar de forma clara y consistente las especificaciones de las reivindicaciones. Adyacente: Cualquier posici´ on en la secuencia de nucle´otidos que est´e situada justo al lado 5’ o 3’ respecto a una secuencia definida. Cultivo celular: Una masa de c´elulas en proliferaci´on y que puede estar en un estado diferenciado o indiferenciado. Se utilizar´ a tambi´en de forma intercambiable con los t´erminos c´elula y l´ınea celular. Todas estas designaciones incluyen progenie, pero no todos los componentes de la progenie tienen que ser exactamente id´enticos en su secuencia de DNA. Deleci´ on: Eliminar un fragmento de la secuencia de DNA, sin especificar su longitud. Gen: Regi´on discreta de a´cido nucleico responsable de un producto discreto (RNA y/o polip´eptido).

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Glicoprote´ına: Prote´ına que puede contener restos de az´ ucares unidos de forma covalente. gII: glicoprote´ına II y gen de la glicoprote´ına gII del Herpesvirus Bovino 1.

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Homolog´ıa de secuencia substancial: Cuando distintas secuencias de nucle´otidos son substancialmente (funcionalmente) equivalentes entre s´ı. Las diferencias no afectan a la funcionalidad de los productos codificados en las diferentes secuencias. Inserci´ on: Introducir un fragmento de secuencia de DNA, sin especificar su longitud, en medio de otra secuencia de DNA. Marco de lectura: se refiere a la regi´on de secuencia nucleot´ıdica de un gen que codifica para un polip´eptido.

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Operativamente ligada: Se refiere a la asociaci´on funcional de los componentes. As´ı, una secuencia codificadora operativamente ligada a secuencias de control indica una asociaci´ on en la que la secuencia codificadora puede ser expresada bajo control de la secuencia controladora. p.f.u.: Unidades formadoras de calva.

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Secuencia codificadora: Una secuencia de DNA cuya transcripci´ on y traducci´ on da lugar a la formaci´on de una prote´ına celular o una secuencia de RNA que al ser traducida da lugar a la formaci´ on de una prote´ına celular. Secuencia de control: Se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresi´on de una secuencia codificadora operativamente ligada en un organismo hospedador determinado. Las secuencias de control incluyen promotor, estimuladores de transcripci´ on, se˜ nales de terminaci´on, se˜ nales de poliadenilaci´on y posiblemente otras secuencias todav´ıa no bien establecidas. 2

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Secuencia flanqueante: se trata de las secuencias de DNA contiguas, en 5’ y 3’ de la secuencia codificadora. En ellas se encuentran secuencias de control. 5

Sistema de expresi´ on: Se refiere a secuencias de DNA que contienen una secuencia codificadora definida y secuencias de control en una asociaci´ on operativa de forma que estas secuencias son capaces de producir la prote´ına codificada. Para poder efectuar la transformaci´ on, el sistema de expresi´on puede incluirse en un vector. En algunos casos el DNA relevante puede integrarse en un cromosoma de la c´elula hu´esped.

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Sustituci´ on: Reemplazar un fragmento de secuencia de DNA, cuya longitud no tiene por qu´e estar especificada, por otro fragmento de secuencia de DNA, cuya longitud tampoco tiene por qu´e estar especificada. 15

Transformantes: C´elulas que, por diferentes mecanismos, adquieren secuencias de DNA externas, que a su vez pueden dar lugar o no a cambios en las c´elulas hu´esped. Vector: Secuencia de DNA apropiada para vehicular otras secuencias de DNA.

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+/-: S´ımbolos indicadores de presencia/ausencia de una funcionalidad en una c´elula o virus. 1.- Antecedentes de la invenci´ on. La Rinotraqueitis Infecciosa Bovina.

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El Herpesvirus Bovino tipo 1 (a partir de ahora “BHV-1”), tambi´en conocido como virus de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (a partir de ahora “IBRV”), es un agente pat´ ogeno fundamental asociado con un amplio abanico de patolog´ıas, tales como problemas respiratorios (causantes de menor tasa de crecimiento y disminuci´on de la vitalidad de los terneros), problemas reproductivos (abortos, infertilidad y esterilidad), p´erdidas en el rendimiento lechero, enteritis, meningitis, conjuntivitis, da˜ nos en el sistema nervioso central, e infecciones d´ermicas en el ganado, entre otros (Hagan and Buner’s Microbiology and Infectious Diseases of Domestic Animals (1988) Comstock Publishing Associates, 8th ed., Ithaca. pp 594-601). La gravedad del s´ındrome causado por el IBRV depende de la cepa del virus y de la edad del animal afectado. De todos los problemas antes mencionados, los m´ as comunes son los respiratorios. La incidencia de tales enfermedades respiratorias se estima en el 2% del vacuno adulto y en el 10-30% de los terneros, siendo el promedio de mortalidad en terneros del 10%. S´ olo en terneros las p´erdidas anuales a nivel mundial atribuibles al IBR se estiman en 3.000 millones de d´ olares (Animal Pharm, Supplement 17, May 1992). Como miembro de la familia Alphaherpesviridae, el BHV-1 presenta un elevado neurotropismo, permaneciendo latente en el sistema nervioso del animal tras recuperarse de la infecci´ on. As´ı, los animales pueden presentar reca´ıdas en la enfermedad sin haber estado reexpuestos al virus (Rock, D.L. et al. (1986) J. Gen. Virol. 67:2515-2520). Este hecho es especialmente importante en los programas de inseminaci´ on artificial, puesto que los sementales infectados producen virus de forma recurrente. Algunos tratamientos con f´ armacos (p.e. dexametasona) pueden tambi´en provocar secreci´on nasal del virus, con o en ausencia de s´ıntomas cl´ınicos de IBRV activo. Como consecuencia, pueden aparecer brotes de IBR a partir de virus latente procedente de ganado infectado pero asintom´ atico. Estos hechos hacen que sea muy u ´til el dise˜ no de sistemas no solo vacunales sino tambi´en de diagn´ ostico diferencial, especialmente en programas de erradicaci´ on de la enfermedad. Genoma y prote´ınas del Herpesvirus Bovino 1

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El genoma del HVB-1 consiste en una mol´ecula lineal de DNA de doble hebra, de aproximadamente 135 kilobases (kb) de longitud. Este genoma se halla estructurado en dos secuencias u ´nicas; una larga de unas 100 kb (denominada UI) y otra corta de unas 13 kb (denominada Us), esta u ´ltima se halla flanqueada por dos secuencias repetidas inversas una interna y otra terminal (“Internal Repeat short” o IRs y “Terminal Repeat short” o TRs respectivamente), ambas de unas 11,5 kb de longitud (Hammerschmidt, W. et al. (1986) J. Virol., 58: 49; Engels, M. et al. (1986 y 1987) Virus Res., 6:57-73; Mayfield, J.E. et al. (1983) J. Virol., 47:259-264). Este tipo de genoma corresponde a lo que ser´ıa un genoma de herpesvirus clase D, que tambi´en se encuentra en el virus de la Pseudorabia (a partir de ahora PRV), en los Herpesvirus Equinos tipos 1 y 3 (a partir de ahora EHV-1,-3) y en el Virus Varicella-Zoster (a partir de ahora VZV). Una caracter´ıstica del genoma de los herpesvirus es la capacidad de invertir la orientaci´ on de las secuencias u ´ nicas franqueadas por secuencias repetidas inversas (la Us en el caso de los virus antes citados). De este modo podemos encontrar dos isoformas del genoma del HVB-1, que se 3

ES 2 074 965 B1 presentan de forma equimolar en cualquier preparaci´ on de DNA viral.

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Se han descrito los mapas de restricci´on de los genomas de varias cepas de IBR (Mayfield, J.E. et al. (1983) J. Virol.,47:259-264; Simard C. et al. (1990) Arch. Virol., 110:63-75 ). A partir de los mapas se han establecido tres diferentes grupos de genomas v´ıricos, sin correlaci´ on ninguna con su epidemiologia (Engels, M. et al. (1986 y 1987) Virus Res., 6:57-73). A pesar de que el genoma del HVB-1 puede codificar m´ as de 33 polip´eptidos estructurales (Misra, V. et al. (1981)) J. Virol., 40:367-378), muy pocos de ellos han sido identificados y localizados en su genoma. Glicoprote´ınas del IBR De los m´as de 33 polip´eptidos estructurales que codifica el genoma del HVB-1, 11 aparecen glicosilados (Misra, V. et al. (1981) J. Virol., 40:367-378; Van Drunen-Littel-van den Hurk, S. et al. (1986) J. Virol., 59:401-410; Badia & Querol (1988) J. Virol. Meth., 22: 23-29). Las glicoprote´ınas tienen un papel importante en el reconocimiento, uni´ on y penetraci´ on del virus en la c´elula hu´esped, as´ı como en la respuesta inmune del animal infectado (neutralizaci´ on del virus, destrucci´ on de la c´elula infectada e inducci´ on de los mecanismos de inmunidad celular). A su vez, los az´ ucares de las glicoprote´ınas tienen un papel importante en la generaci´on de la glicoprote´ına funcional, en el reconocimiento y en la propiedades inmunol´ ogicas de tales glicoprote´ınas (Olofsson S. (1992) APMIS Suppl 267, 100: 84-95; Van Drunen Littel-van den Hurk, S., et al. (1990) J. Gen. Virol., 71: 2053-2063). La caraterizaci´on de estas glicoprote´ınas mediante anticuerpos monoclonales contra el HVB-1, ha dado lugar a la identificaci´ on y caraterizaci´ on de las cuatro glicoproteinas principales de la envoltura del HVB-1; gI, gII, gIII y gIV. La gI es sintetizada en forma de un polip´eptido de 105 kDa (kilodaltons de masa molecular relativa), que en su forma madura (totalmente N-glicosilado y procesado proteoliticamente) da lugar a un heterod´ımero de 130 kDa formado por dos mon´ omeros; uno de 75 kDa y otro de 55 kDa, que se hallan unidos por puentes disulfuro. La gII aparece en forma de un precursor no glicosilado de 90 kDa, que da lugar a una glicoprote´ına madura de 108 kDa. Por su parte, la gIII tambien es aislada en forma homodim´erica de 180 kDa, a partir de un mon´ omero que en su forma madura (N- y O - glicosilada) presenta 91 kDa. Por u ´ ltimo, la gIV presenta una masa molecular relativa de 71 kDa en su forma madura (N - y O-glicosilada), hall´ andose tambi´en en forma homodim´erica de 140 kDa. Todas estas glicoprote´ınas se encuentran tambi´en en la superficie de las c´elulas infectadas por BHV-1, y reaccionan con anticuerpos neutralizantes, monoespec´ıficos o monoclonales (Van Drunen Littel-van den Hurk, S. et al. (1984) Virology. 135:466-479; Van Drunen Littel-van den Hurk, S. et al. (1986) J. Virol., 59:401-410; Marshall, R.L. et al, J. (1 986) Virol., 57:745-753; Fitzpatrick, D.R., et al. (1988) J. Virol. 62:4239-4248; Van Drunen Littel-van den Hurk, S. et al. (1989) J. Virol. 63:2159-2168). Diversas prote´ınas v´ıricas est´an involucradas en la respuesta inmune contra los herpesvirus con fomaci´on de anticuerpos neutralizantes y respuesta citot´ oxica (Norrild, B. et al (1979) J. Virol., 32:741-748; Balachandran, N. et al. (1982) Infect. Immun., 37:1132-1137; Hampl, H. et al. (1984) J. Virol., 52:583590; Ben Porat, T. et al. (1986) Virol., 154:325-334; and Wathen, L.M.K. et al. (1985) Virus Res., 4:19-29). En el caso del BHV-1 se han descrito como principales prote´ınas involucradas en la inducci´ on de anticuerpos neutralizantes las gI, gIII y gIV (Babiuk, L.A. et al. (1987) Virol., 159:57-66). Estos datos son importantes para dise˜ nar una estrategia de vacuna por subunidades, ya sean enteras o pept´ıdicas. Adem´as, para la creaci´on de una vacuna de virus defectivo, asociada a un kit de diagn´ ostico diferencial entre animales vacunados e infectados por virus de campo, se requiere utilizar como indicador una prote´ına que no sea esencial para la replicaci´on del virus. Por otra parte la deleci´ on de una prote´ına que simplemente induzca una fuerte respuesta inmune neutralizante no tiene por que ser la estrategia m´ as id´ onea para el dise˜ no de una vacuna por virus defectivo. Es m´ as interesante delecionar una prote´ına que, adem´as de no ser necesaria para la replicaci´ on del virus, interfiera en las contramedidas que el sistema inmune del hu´esped desencadena tras la infecci´on. Las glicopote´ınas gI y gIV de IBR no parecen buenas candidatas para el desarrollo de una vacuna delectiva, ya que sus homologas en HSV y PRV (gB, gD, gX y gp50) o bien resultan esenciales para la replicaci´ on en cultivo celular, o bien juegan un papel muy importante en la entrada en las c´elulas susceptibles de ser infectadas, disminuyendo de este modo la tasa de replicaci´ on del virus (Desai, W. et al. (1988) J. Virol. 62:2596-2604; Ligas, W.L. y Johnson, D.C. (1988) J. Virol. 62:1486-1494; Liang, X. (1991) J. Virol. 65:1124-1132; Card, J.P. et. al. (1992) J. Virol. 66:3032-3041). En la regi´ on Us de varios miembros de la familia Alphaherpesviridae se han descrito algunos genes que codifican glicoprote´ınas dispensables para su amplificaci´on en cultivo celular (para HSV-1 v´ease Longnecker, R. et al. (1987) Science, 236:573-576; para PRV v´ease Petrovskis, E.A. et al. (1986) J. Virol., 60:1166-1169; Petrovskis, E.A. et al. (1987) Virol., 159:193-195; Mettenleiter, T.C. et al. (1987) J. Virol., 61:2764-2769; and Thomsen, D.R. et al. (1987) J. Virol., 61:229-232). Concretamente en el caso de HVB-1 hallamos el gen de la glicoprote´ına gII, la cual ser´ıa la hom´ ologa a la glicoprote´ına gI del 4

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virus PRV, que ya ha permitido crear una cepa delectiva vacunal contra la pseudorabia (Lomniczi, B. et al. (1984) J. Virol., 49: 970-979; Mettenleiter, T.C. et al. (1985) J. Virol., 53:52-57). Por otra parte, en la regi´ on UI del HVB-1 encontramos el gen de la glicoprote´ına gIII, que tampoco resulta esencial para la replicaci´on en cultivo celular del virus, aunque su deleci´on lleva consigo una menor adsorci´ on celular y de este modo un retraso en la replicaci´on viral (Liang, X. (1991) J. Virol. 65:1124-1132). Esta glicoprote´ına ya ha sido objeto de una solicitud de patente europea, n◦ 88118266.1. Muchos virus, entre ellos los herpesvirus, presentan prote´ınas que interfieren con el sistema inmunitario del hu´esped -ya sea con citoquinas o con el sistema complemento, etc- (Gooding L. Cell (1992) 71: 5-7). En el caso del HSV, se ha descrito que las glicoprote´ınas gE y gI se unen a la regi´ on Fc de las IgG, lo que provoca el bloqueo de la lisis de las c´elulas infectadas mediada por el sistema complemento (Bell S. et al. (1990) J. Virol., 64: 2181-2186). Este tipo de actividades son totalmente prescindibles para la replicaci´on del virus en cultivo celular, ya que act´ uan como mecanismos contra el sistema de defensa inmune del hu´esped. De este modo, la deleci´on de estas glicoprote´ınas no representa un gran problema para el crecimiento y la replicaci´on in vitro del virus (Gooding, L. Cell (1992) 71: 5-7; Post L. y Roizman B. (1981) Cell 25: 227-232). Son as´ı, candidatas perfectas para crear vacunas delectivas, ya que su ausencia, por una parte, no impide el crecimiento del virus en cultivo, y por otra, impide la interferencia con el sistema inmune del hu´esped. Por ello, una de estas prote´ınas, la gII de BHV-1, hom´ ologa de la gI de PRV y a la gE de HSV, constituye el objetivo de la presente invenci´ on.

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Con el objeto de cartografiar e identificar el gen de la glicoprote´ına gII de BHV-1, en la presente invenci´on partimos del supuesto de que dicho gen se hallaba en la regi´ on Us, al igual que sus equivalentes en otros herpesvirus (Wirth U. et al. (1989) J. Virol., 65: 4882-4889). Todos los datos conocidos de otros miembros de la familia Alphaherpesviridae sugieren que existe una secuencia de 5 genes que ocupan posiciones conservadas a lo largo de la regi´on Us. Estos son: US4(gG) US5, US6(gD), US7(gI) y US8(gE) en HSV-1; US4(gG2) US5, US6(gD2), US7(gI2) y US8(gE2) en HSV-2 y gX, gp50, gp63 y gI en PRV (McGeoch D.J. (1990) J. Gen. Virol., 71: 2361 -2367). El VZV s´ olo posee los genes correspondientes a la US7 y US8; gpIV y gpI, ya que su Us es mucho m´ as corta que en los tres casos anteriores. Asimismo, la secuencia completa del EHV-1 publicada recientemente confirma la estructura descrita para el HSV (Telford E. et al. (1992) Virology, 189:304-316). Desde el punto de vista de la seguridad hay que destacar que la deleci´ on del gen de la glicoprote´ına gI del virus PRV, hom´ ologa a la glicoprote´ına gII de IBRV, altera el neurotropismo y reduce la neuroviruiencia del PRV cuando es inyectado intraocularmente en ratas de laboratorio (Card et al., (1992) J. Virol., 66, 3032-3041). Este extremo podr´ıa representar una ventaja adicional de cara a la deleci´on del gen de esta glicoprote´ına en el BHV-1. As´ı, su deleci´on, presenta, frente a otras posibles o a la de la gIII objeto ya de una patente, una ventaja adicional doble: (a) como se ha mencionado anteriormente, la glicoprote´ına gII, que ser´ıa hom´ ologa a la gE de herpes simplex humano, es una prote´ına que permite al virus establecer contramedidas frente al sistema inmunol´ ogico del animal infectado, y (b) la cepa de a una menor neuroviruiencia. Todo ello en a˜ nadidura a las caracter´ısticas comvirus IBR gII− presentar´ partidas con la mencionada glicoprote´ına gIII, que son: (a) dar lugar a una cepa v´ırica viable a pesar de ser delectiva y, (b) ser suficientemente inmun´ ogena como para poder desarrollar un kit de diferenciaci´ on entre animales vacunados e infectados. En la presente invenci´on se ha identificado, cartografiado en la regi´ on Us, clonado y secuenciado, el gen de la glicoprote´ına gII (gE-like) del Herpesvirus Bovino 1 o IBRV. A partir del gen de la glicoprote´ına gII se ha creado una cepa de virus BHV-1 delectivo (gII− ). Por otra parte, tambi´en se ha demostrado que el gen de la prote´ına gII no es esencial para la replicaci´on del virus en cultivos celulares. Asimismo, se ha demostrado que la prote´ına gII es inmun´ ogena y, por tanto, reune todas las caracter´ısticas que permiten utilizarla como marcador en el dise˜ no de una vacuna que permita distinguir entre animales infectados y vacunados. Vacunas fundamentales descritas contra el Sindrome Respiratorio Bovino o IBR.

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Existen diversas vacunas contra IBR, obtenidas a partir de virus enteros inactivados mediante agentes qu´ımicos o f´ısicos. Hipra S.A. posee alguna de tales vacunas. Tambi´en se han descrito vacunas con virus IBR modificado, por ejemplo por atenuaci´ on mediante pases sucesivos en cultivo, alteraci´on del hu´esped celular o modificaci´on de las condiciones de cultivo. Asimismo, se han descrito varias vacunas “por subunidades”, es decir, vacunas obtenidas por solubilizaci´on (por ejemplo, mediante detergentes) de componentes de la cubierta v´ırica (Babiuk, L.A. et al. (1987) Virology, 159:57-66). Todas las vacunas anteriores presentan inconvenientes. Las que utilizan virus IBR entero e inacti5

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vado, pueden dar lugar a reacciones al´ergicas o de hipersensibilidad. Las vacunas por subunidades, si bien son menos t´ oxicas que las anteriores y pueden permitir incluso el dise˜ no de ensayos de diferenciaci´on serol´ ogica entre animales infectados y vacunados, presentan un elevado coste de purificaci´on y requieren dosis repetidas para ser eficaces. Las vacunas basadas en virus modificados son m´as eficaces en cuanto activan la respuesta inmune tanto humoral como celular pero, al no eliminar la latencia del virus, ´este puede ser transmitido a otros animales susceptibles. Con virus modificados tambi´en se han descrito casos de regresi´on a virulencia. Asimismo, se ha descrito una incidencia elevada de abortos con vacunas administradas intramuscularmente. En todo caso, las m´ as in´ ocuas, al menos en cuanto a la prevenci´on de abortos, ser´ıan las variantes administradas intranasalmente, pero presentan diversos problemas de administraci´on. Tambi´en se han descrito vacunas dise˜ nadas a partir de virus IBR modificado, virus mutantes timidinquinasa negativos (tk− ) y resistentes a temperatura. Por ejemplo, existen las solicitudes de Patente USA N◦ 4.569.840 y 4.703.011 basadas en estos tipos de mutantes. Sin embargo, tales mutantes tk− no resuelven el problema de la diferenciaci´on entre animales infectados y vacunados, diferenciaci´ on necesaria para campa˜ nas de erradicaci´ on del IBR. La vacuna m´ as cercana a los objetivos de la presente invenci´on, en cuanto trata de superar el problema de la latencia del IBRV y permitir la distinci´ on entre un animal vacunado de otro infectado, corresponde a la solicitud de Patente Europea 88118266.1 (inventores K. Malon, S. Malon & H. Otsuka) presentada por Novagene, Inc, en la que se describe la creaci´on de una vacuna mediante DNA recombinante. La vacuna consiste en un virus IBR mutante por deleci´on de una glicoprote´ına mayoritaria, la gIII. Asimismo, se describe la posibilidad de distinci´ on serol´ ogica entre animales infectados y vacunados con la citada cepa de IBRV. Dicha solicitud se basa en la glicoprote´ına gIII, distinta de la que se describe en la presente invenci´on, la glicoprote´ına gII del IBRV. 2.- Compendio de la invenci´ on

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Es un objeto de la presente invenci´on la obtenci´ on de un virus mutante del Herpesvirus Bovino 1 (BHV-1), caracterizado como BHV-1 FM gII− . Es otro objeto de la presente invenci´ on la obtenci´ on de un virus mutante del BHV-1, por deleci´ on, inserci´on o sustituci´ on (deleci´on e inserci´on) en el gen gII del virus BHV-1.

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Es tambi´en objeto de la invenci´on la obtenci´ on de un virus mutante del BHV-1 de forma que, por deleci´on, inserci´on o ambas, en el gen gII del BHV-1 no se produce ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII. Constituye tambi´en un objeto de la invenci´ on el procedimiento de preparaci´on del virus mutante BHV-1 FM gII− a partir del BHV-1. Es asimismo objeto de la invenci´on las vacunas contra la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina que contieon. nen el virus BHV-1 FM gII− , y los m´etodos de preparaci´

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Son, por u ´ltimo, objeto de la invenci´ on los m´etodos de diagn´ ostico para distinguir serologicamente a los animales vacunados de los animales infectados por virus de campo. Breve descripci´ on de las figuras

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– La Figura 1A muestra un an´ alisis mediante enzimas de restricci´on de la cepa BHV-1 FM donde los tama˜ nos relativos de los marcadores de movilidad electrofor´etica aparecen en kb A su vez, en la columna de la derecha, aparecen los fragmentos correspondientes a la digesti´on con Hind III. Los pesos moleculares obtenidos est´an comparados con los publicados por Mayfield et al.,(1983) J.Virol 47:259-264, para la cepa Cooper de BHV -1.1. Como puede comprobarse en la tabla adjunta (Figura 1B), existe una gran correspondencia entre los valores de peso molecular (en kb) de los fragmentos obtenidos en ambas cepas. El patr´ on de bandas HindIII es el mismo en ambas cepas y el patr´on de bandas EcoRI presenta tan s´ olo ligeras diferencias de peso molecular entre algunas de las bandas obtenidas. Ello permite afirmar que la cepa BHV-1 FM pertenece al subtipo 1.1 de Herpesvirus Bovino. – La Figura 2 muestra una digesti´ on HindIII de los pl´asmidos h´ıbridos p1K1, p1L3 y p1J1 junto a una digesti´on del genoma de la cepa BHV-1 FM con el mismo enzima. Como puede observarse, el peso molecular del fragmento clonado en el pl´ asmido recombinante p1K1 se corresponde perfectamente 6

ES 2 074 965 B1 con el de la banda K de la digesti´ on HindIII del DNA de BHV-1 FM.

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– La Figura 3 ilustra esquem´ aticamente el mapa de restricci´on obtenido para el inserto clonado en el pl´ asmido recombinante p1K1. Se detallan las dianas para las enzimas de restricci´ on con un solo corte en el fragmento clonado (NcoI, BstEII, NheI, Sac I y BstBI), as´ı como las dianas para las enzimas restricci´on con varios cortes en el fragmento clonado (SmaI, SaII, PstI y XhoI). Los tama˜ nos de los fragmentos resultantes aparecen en la tabla inferior en pb (pares de bases). – La Figura 4A muestra la tinci´ on con bromuro de etidio de la electroforesis de las digestiones del DNA de la cepa BHV-1 FM con los enzimas de restricci´ on HindIII, XhoI, SaII, SmaI y EcoRi+HpaI. La Figura 4B ilustra el resultado de la hibridaci´ on de los digeridos de la Figura 4A con el fragmento SaI1a descrito en la Figura 3. El estudio de las bandas detectadas por el fragmento Sal1a muestra la existencia de un fragmento de aproximadamente 6.2 kb SaII-EcoRI (SE1) que solapa con el fragmento K HindIII por su extremo derecho. Este fragmento fue utilizado para determinar la secuencia correspondiente al extremo 3’ del gen de la glicoprote´ına gII y para la construcci´ on del pl´ asmido p∆gII. – La Figura 5 muestra esquem´aticamente las regiones de los pl´asmidos recombinantes p1K1 y pSE1 utilizadas para la secuenciaci´on del gen correspondiente a la glicoprote´ına gII de BHV-1 FM. Tambien estan detallados los subclones obtenidos de dichos pl´ asmidos recombinantes as´ı como las direcciones de las reacciones de secuenciaci´on. – La Figura 6 muestra la construcci´ on de los pl´ asmidos empleados en la presente invenci´on. Espec´ıficamente, la Figura 6 muestra la construcci´ on del pl´ asmido p∆gII. que fue usado para la cotransfecci´on con DNA de BHV-1 FM gII+ para obtener virus recombinante BHV-1 FM gII− . En primer lugar, el pl´ asmido recombinante p1K1 (descrito en la Figura 2) fue digerido con los enzimas de restricci´on SmaI y PstI. El fragmento C1 de 1,2 kb fue aislado y subclonado en un pl´ asmido pUC118 cortado con los mismos enzimas. El pl´ asmido recombinante obtenido fue denominado pC1. Por otra parte, el pl´ asmido pSE1 (obtenido mediante la inserci´ on del fragmento de 6,2 kb SaII-EcoRI del genoma de BHV-1 FM en un pl´asmido pUC118) fue cortado con el enzima de restricci´ on EcoNI tratado con la nucleasa mung bean. Este tratamiento elimina el extremo 5’ de cadena sencilla de la secuencia: 5’-CCTCC3’ 3’-GGAGGC5’

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dejando el siguiente extremo romo:

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5’-CCTCC3’ 3’-GGAGG5’ El plasmido lineal resultante fue cortado con el enzima de restricci´ on EcoRI y el fragmento obtenido fue subclonado en el pl´ asmido pC1 cortado con los enzimas de restricci´on SmaI y EcoRI, dando lugar al pl´ asmido recombinante pC1SE1a. Finalmente, el plasmido recombinante pC1SE1a fue cortado con el enzima de restricci´ on PstI. El fragmento de 3kb resultante fue aislado y clonado en un pl´ asmido pUC118 cortado con PstI. El pl´ asmido recombinante obtenido fue denominado p∆gl. – La Figura 7A muestra el patr´ on de restricci´ on con el enzima HindIII de la cepa BHV-1 FM gII− compar´ andolo con el de la cepa BHV-1 FM gII+ . En la Figura 7B se muestra el procedimiento de b´ usqueda del virus gII− . Espec´ıficamente, la Figura 7B muestra el aspecto que presentan las c´elulas asmido p∆gII. GBK despu´es de ser cotransfectadas con DNA infectivo de BHV-1 FM gII+ y el pl´ Despu´es de la hibridaci´ on in situ (v´ease apartado 4.1.J2) aparecen calvas con efecto citop´ atico oscuras (Figura 7B(1)) y calvas con efecto citop´atico claras (Figura 7B(2)). Debido a que la sonda utilizada (v´ease apartado 4.1.J2) detecta las calvas producto de la infecci´ on por BHV-1 FM gII+ , las − calvas claras son producto de la infecci´ on por virus gII . La progenie viral gII− fue aislada (v´ease apartado 4.1.J3) y su DNA analizado mediante el enzima de restricci´on HindIII. Espec´ıficamente, la Figura 7A muestra una tinci´ on con Bromuro de Etidio de una electroforesis de agarosa en la que se compara la digesti´on con el enzima de restricci´on HindIII de la cepa originaria BHV-1 FM gII+ y de la cepa mutante BHV-1 FM gII− . Como puede observarse, en la cepa mutante desaparecen las bandas C, F y K, apareciendo dos nuevas bandas de 21,2 y 24,7 kb respectivamente. La desaparici´ on de las bandas C, F y K, junto con la aparici´ on de dos nuevas, se debe a la deleci´on del gen de la glicoprote´ına gII en el genoma de BHV-1 FM. 7

ES 2 074 965 B1 3. Descripci´ on detallada de la invenci´ on

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Como ya se ha mencionado, los objetivos de la presente invenci´ on se han alcanzado mediante la construcci´ on de un virus mutante de Rinotraquitis Infecciosa Bovina que no produce ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII como resultado de deleci´on o inserci´on o ambas en el gen gII del virus IBR, y una vacuna contra la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina que comprende (1) una cantidad, farmac´euticamente efectiva, del mencionado virus y (2) un “carrier” o diluente farmac´euticamente aceptable. En la forma de realizaci´on preferida de la presente invenci´ on, los objetivos anteriormente descritos se han alcanzado mediante un proceso para producci´ on de un IBRV que no produce ning´ un polip´eptido gII antig´enico como resultado de una deleci´ on en el gen gII. La realizaci´on comprende: (1) Construcci´ on de un primer vector h´ıbrido que consta del DNA del vector de clonaje y de un fragmento de DNA del virus IBR que incluye 1200 pb de la regi´ on flanqueante 5’ del gen de la glicoprote´ına gII y 104 nucle´otidos de la secuencia codificante del mismo gen;

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(2) Construcci´ on de un segundo vector h´ıbrido que consta del DNA del vector de clonaje y un fragmento de DNA del virus IBR que incluye 1740 pb de la regi´ on flanqueante 3’ del gen de la glicoprote´ına gII y un nucle´ otido del cod´ on de stop del mismo gen;

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(3) Construcci´ on de un tercer vector h´ıbrido que consta del DNA del vector de clonaje y el fragmento de DNA del virus IBR descrito en el paso (1) fusionado al fragmento de DNA de virus IBR descrito en el paso (2). Este tercer vector h´ıbrido es portador de una deleci´ on, de 1619 pb, en el gen de la glicoprote´ına gII; (4) Co-transfecci´ on del vector h´ıbrido descrito en el paso (3) en c´elulas hu´esped de virus IBR con DNA de IBR gII+ ; y

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(5) Rastreo de la progenie de virus obtenidos en el paso (4) para identificar y obtener IBRV mutantes que como resultado de la deleci´on en el gen de la glicoprote´ına gII no produzcan ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII. En una forma de realizaci´ on adicional de la presente invenci´ on, una secuencia de DNA for´ aneo es insertado en lugar de secuencias del gen gII delecionado del IBRV en el paso (3) de forma que no se producen polip´eptidos antig´enicos de gII de IBRV y de forma que se retienen las secuencias de DNA de IBRV adyacentes a cada lado del gen gII de IBRV delecionado. Como resultado, los mutantes de IBRV del paso (5) no producen ning´ un polip´eptido antig´enico de gII de IBRV debido a la combinaci´on de mutaciones por deleci´on e inserci´on en el gen gII de IBRV.

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En otra forma de realizaci´ on, los pasos (1-3) fueron realizados de forma que se insertaron secuencias de DNA for´ aneo en el vector de recombinaci´on de forma que las secuencias de DNA del virus IBR adyacentes a cada lado del sitio de inserci´ on se reten´ıan no obteni´endose polip´eptidos antig´enicos gII de virus IBR. Como resultado, el virus IBR mutante del paso (5) no produce ning´ un polip´eptido antig´enico de gII debido a la mutaci´ on por inserci´on en el gen gII de IBRV. Las mutaciones en el gen gII de IBRV de la presente invenci´on pueden producirse por ejemplo por (a) deleci´on de un fragmento de DNA de IBRV de forma que se elimine o altere substancialmente el marco de lectura del gen gII y la s´ıntesis del polip´eptido en ´el codificado (b) deleci´ on de las secuencias nucleot´ıdicas de ep´ıtopos del polip´eptido gII del IBRV (c) inserci´on en el gen gII de IBRV de secuencias de DNA externas al mismo de forma que se elimine o altere el marco de lectura del gen gII (d) combinaci´on de deleci´on de secuencias de nucle´otidos del gen gII de IBRV con inserci´on de secuencias de DNA extra˜ no al mismo, de forma que se altere el marco de lectura del gen gII de IBRV y la s´ıntesis del polip´eptido en ´el codificado (e) creaci´on de mutaciones puntuales en la secuencia del gen gII de IBRV de forma que se altere el marco de lectura del gen gII de IBRV o la s´ıntesis del polip´eptido en ´el codificado o los ep´ıtopos del polip´eptido de la glicoprote´ına gII de IBRV (f) alteraci´ on de la expresi´ on del gen de la glicoproteina gII del virus IBR, por deleci´on, inserci´on o mutaci´ on puntual de las secuencias nucleot´ıdicas reguladoras flanqueantes del gen de la glicoprote´ına gII de IBRV de forma que el mencionado gen no se transcriba. Las deleciones pueden crearse de diferentes maneras, por ejemplo (a) cortando el gen gII de IBRV, insertado en un vector de clonaje, con una o m´ as endonucleasas de restricci´on de forma que el gen gII resulte cortado en uno a m´ as sitios y religando, posteriormente, de forma que se eliminen secuencias 8

ES 2 074 965 B1 nucleot´ıdicas del gen gII de IBRV; (b) cortando el gen gII de IBRV, insertado por un extremo en un vector de clonaje, y trat´ andolo con exonucleasa de forma que se eliminen nucle´ otidos 5’ y/o 3’ del corte y religando posteriormente; (c) cortando el gen gII de IBRV ytrat´ andolo con exonucleasas de forma que se eliminen nucle´otidos 5’ y 3’ y religando posteriormente. 5

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En la presente invenci´on, el mutante por deleci´ on, BHV-1 FM gII− descrito en detalle m´as adelante, se obtuvo por eliminaci´on de un fragmento SmaI-EcoNI, de 1619 pb, que contiene substancialmente todas las secuencias codificadoras del gen gII del virus IBR (ver Figura 7). El tama˜ no de esta deleci´on asegura que (a) no se pueda producir un polip´eptido que contenga determinantes antig´enicos capaces de inducir anticuerpos antigII de IBRV en animales vacunados, o capaces de reaccionar con antisueros contra glicoprote´ına gII de IBRV producida en animales infectados con cepas de IBRV de campo, y (b) que sea virtualmente imposible que se pueda producir una reversi´ on por mutaci´ on a un virus IBR gII+ . En otra forma de realizaci´ on, los mutantes por deleci´on o inserci´on pueden contener una secuencia de DNA for´ aneo en lugar del gen gII delecionado del IBRV o a˜ nadida a la secuencia del gen gII del IBRV. Por secuencia de DNA for´ aneo se indica: (1) cualquier secuencia de DNA, de cualquier origen -procariota, eucariota o incluso oligonucle´otidos sint´eticos- que no codifica un gen, (2) cualquier secuencia de DNA que codifique un gen distinto al gII de IBRV, y (3) cualquier secuencia de DNA de IBRV que haya sido trasladada de su localizaci´on normal en el genoma del IBRV a otra posici´ on en el mismo genoma. Los tama˜ nos de las secuencias for´aneas aqu´ı mencionadas no son cr´ıticos, pudiendo ser desde oligonucle´ otidos de unas pocos pares de bases -4, por ejemplo- hasta genes de gran tama˜ no, de miles de pares de bases. La forma de inserci´on de secuencias de DNA for´aneo es muy variada mediante procedimientos muy bien conocidos (p.e., Sambrook. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Mediante una elecci´on apropiada de la longitud de la secuencia de DNA for´ aneo, se pueden crear mutaciones por corrimiento del marco de lectura en el gen gII de IBRV que den lugar a formas de virus IBR gII− . Los vectores de clonaje que pueden utilizarse para construir vectores h´ıbridos que contengan fragmentos de DNA del virus IBR (el gen de la glicoprote´ına gII y secuencias flanqueantes) son numerosos. En la descripci´on posterior de la forma preferida de la presente invenci´on se detallar´an los utilizados en la misma. El hospedador espec´ıfico para clonar los vectores h´ıbridos no es cr´ıtico para realizar lo descrito en la presente invenci´on. En la descripci´on posterior de la forma preferida de la presente invenci´on se detallar´ an los utilizados en la misma. Se pueden emplear vectores y hu´espedes alternativos a E. coli (p.e., levadura) para realizar lo descrito en la presente invenci´ on. Las secuencias del gen gII que deben de estar presentes en los vectores h´ıbridos de los pasos (1) a (3) anteriormente descritos depender´an de las secuencias elegidas para la deleci´on y/o inserci´on as´ı como de los enzimas de restricci´on y exonucleasas que vayan a ser utilizados en el dise˜ no del mutante de deleci´on y/o inserci´on. Las secuencias espec´ıficas de DNA del virus IBR, adyacentes al sitio de deleci´on y/o inserci´on en el vector, que se requieren en los pasos (1) y (2) as´ı como su longitud depender´ an de la deleci´on y/o inserci´on espec´ıfica a realizar. En la descripci´on posterior de la forma preferida de la presente invenci´on se detallar´an los utilizados en la misma. La cepa espec´ıfica de virus IBR empleada para la realizaci´ on de la presente invenci´ on, de la que se obtiene la secuencia del gen de la glicoprote´ına gII, y la secuencia de DNA del gen gII utilizada en los pasos conducentes a crear la forma mutante gII− , no son cr´ıticos. Tampoco lo es el que la cepa sea resistente o sensible a la temperatura. En la presente invenci´ on se ha utilizado la cepa de IBRV de campo aislada por laboratorios HIPRA y denominada “FM” (a partir de ahora se denominar´ a “BHV-1 FM”). Esta cepa ha sido depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, del Institut Pasteur con el n´ umero I-1393.

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Las c´elulas hu´esped de cultivo del virus IBR empleadas en la presente invenci´on no son cr´ıticas para la consecuci´on de la misma, con tal que permitan el crecimiento y propagaci´on del virus IBR. En la descripci´on posterior de la forma preferida de la presente invenci´on se detallar´an las utilizadas en la misma. 55

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El m´etodo a utilizar en el rastreo de los IBR mutantes del paso (5) de la presente invenci´on no es cr´ıtico para la consecuci´on de la misma. Por ejemplo, se puede realizar el rastreo mediante hibridaci´ on molecular con sondas de DNA marcado radiactivamente o no. Las sondas contendr´an secuencias de DNA del gen gII del virus IBR que vayan a estar ausentes en los IBR mutantes por deleci´ on, o pueden contener secuencias que vayan a estar presentes en los virus IBR mutantes por deleci´on, o pueden contener secuencias de DNA for´aneo que vayan a estar presentes en los virus IBR mutantes por inserci´on o por deleci´on/inserci´on. Los rastreos por hibridaci´ on molecular pueden hecerse tambi´en con sondas de RNA. El rastreo de los virus IBR mutantes del paso (5) puede hacerse tambi´en por m´etodos que no hagan uso 9

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de sondas de nucle´ otidos. Por ejemplo, mediante anticuerpos monoclonales o monoespec´ıficos contra la glicoprote´ına gII del virus IBR, identificando por m´etodos inmunol´ ogicos las placas cuyos virus no expresen la glicoprote´ına gII. Tambi´en se puede hacer uso de anticuerpos policlonales anti-IBRV, o anticuerpos monoclonales o monoespec´ıficos contra otra prote´ına del virus IBR, y/o anticuerpos monoclonales o monoespec´ıficos contra otra anti-prote´ına for´ anea expresada en los virus IBR. De esta forma pueden ser identificados y aislados los virus mutantes por deleci´ on y/o inserci´on. on de la forma descrita puede ser utilizado El virus mutante IBR gII− obtenido en la presente invenci´ como vacuna de tipo virus vivo modificado contra la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina, o como vacuna de tipo virus inactivado. La inactivaci´ on de la infectividad del virus IBR se realiza mediante tratamientos qu´ımicos o f´ısicos (formaldehido, irradiaci´ on ultravioleta, etc). Cualquiera de los tipos de vacuna descritos da lugar en el animal inoculado a respuesta humoral y celular, de anticuerpos protectores y de c´elulas T citot´ oxicas. Estos virus mutantes IBR gII− tambi´en pueden utilizarse para obtener vacunas por subunidades, tras extraer y purificar las glicoprote´ınas mediante procedimientos conocidos. Asimismo, pueden ser utilizados para obtener a partir de ellos otros mutantes que presenten deleciones y/o inserciones adicionales, por ejemplo el gen de la timidinquinasa, otras glicoprote´ınas, etc. Los virus descritos en la presente invenci´on pueden ser utilizados para la preparaci´on de una vacuna eficaz contra la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina. Para ello, se combina una cantidad de virus eficaz con un “carrier” o un diluyente apropiado. Como ejemplos de “carriers” y diluyentes utilizables en la presente invenci´on podemos destacar la utilizaci´on de sales de s´ılice, hidr´ oxido de aluminio, saponinas tales como el QuilA, hidr´ oxido c´ alcico, y otros adyuvantes cuya funci´on principal consiste en la potenciaci´ on de los componentes antig´enicos de la formulaci´ on vacunal. Adem´ as, el virus mutante puede ser adyuvantado R R , Drakeol y otros bajo diversas formulaciones en forma de en aceites minerales tales como el Markol emulsiones (o/w, w/o/w y w/o). La forma de conservaci´ on preferente de los virus IBRgII− descritos en la presente invenci´on es en suspensi´on con un t´ıtulo de 105 a 106 p.f.u./mL y congelados por debajo de -70◦C en presencia de glicerol al 10%, o liofilizados y conservados entre -4◦C y -20◦C. Los virus liofilizados pueden ser reconstituidos mediante agua destilada est´eril o con tampones apropiados, conteniendo o no agentes conservantes. La dosis a administrar en el proceso de inmunizaci´ on var´ıa en funci´ on de la edad, peso, modo de administraci´on y especie animal. Utilizado como vacuna tipo virus modificado, la dosis est´ andard puede variar por ejemplo de 104.5 a 107 p.f.u/animal, preferentemente de 104−5 a 105.5 p.f.u./animal. Utilizado como vacuna tipo virus inactivado, la dosis apropiada puede ser, por ejemplo, de entre 5 y 10 veces mayor que en el caso anterior. Las vacunas mediante el virus IBR gII− descrito en la presente invenci´on pueden ser administradas intramuscularmente, intrad´ermicamente, intranasalmente o subcutaneamente, siendo el modo preferido de administraci´on la v´ıa intramuscular. A continuaci´ on se describe un ejemplo que ilustra el modo preferente de desarrollo de la presente invenci´on, pero no pretende abarcar todas las posibilidades de dise˜ no y aplicaci´ on de los descrito en la presente invenci´on. 4.- Ejemplo preferido de realizaci´ on de la invenci´ on

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Los objetivos de la presente invenci´on est´an relacionados con la obtenci´ on de una cepa mutante del Herpesvirus Bovino 1, por deleci´ on/inserci´on de DNA en el locus del gen de la glicoprote´ına gII. Como resultado, el virus no producir´ a y presentar´ a la glicoprote´ına gII en su c´ apside. La invenci´on incluye la creaci´on de una cepa de virus BHV1 utilizable como vacuna contra la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina, cepa que resulta atenuada por la deleci´ on del gen de la glicoprote´ına gII, as´ı como la preparaci´ on de vacunas con la presente cepa. Asimismo, incluye la descripci´ on de un sistema de diagnostico diferencial entre animales infectados con cepas gII− y animales vacunados con la presente cepa v´ırica, gII− . La descripci´on de la invenci´ on (apartado 4.) se divide en las siguientes subapartados: 4.A. a 4.G. Localizaci´on, clonaje, secuenciaci´on e identificaci´on del gen de la glicoprote´ına gII de IBR.

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4.H. a 4.J. Dise˜ no de un vector de clonaje h´ıbrido que contenga las secuencias flanqueantes 5’ y 3’ del gen de la glicoprote´ına gII. 10

ES 2 074 965 B1 4.K. Procedimiento de delecci´ on de la secuencia del gen de la glicoprote´ına gII, de forma que la cepa v´ırica resultante carezca de la citada glicoprote´ına, mediante la introducci´ on del vector h´ıbrido, junto con DNA desnudo del virus salvaje (gII+ ), en cultivos de c´elulas capaces de producir el virus IBR. 5

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4.L. a 4.M. Procedimiento de rastreo de la progenie de virus producida seg´ un lo descrito en el apartado 4.K., con objeto de identificar y aislar part´ıculas v´ıricas recombinantes que incorporen la mutaci´on en el locus correspondiente al gen de la glicoprote´ına gII. (i.e., gII− ). 4.N. An´alisis del DNA purificado de los virus gII− de BHV-1 con objeto de comprobar que la progenie de los virus aislados en el paso anterior era homog´enea en cuanto a presentar una deleci´on en el locus gII. 4.O. Secuencias de DNA y prote´ına.

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Todas estas etapas se describen detalladamente a continuaci´on. Subapartados 4.A. a 4.G.: Localizaci´ on, clonaje, secuenciaci´ on e identificaci´ on del gen de la glicoprote´ına gII del virus IBR.

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4.A. Cultivos celulares y obtenci´ on de virus. Las c´elulas utilizadas para la propagaci´ on y obtenci´ on de los virus BHV-1 fueron las l´ıneas celulares MDBK (Mandi-Darby Bovine Kidney) y GBK (Georgia Bovine Kidney), proporcionadas por los laboratorios HIPRA S.A. Estas l´ıneas celulares se cultivaron adheridas en frascos de cultivo de tipo Falcon en un incubador de CO2 a 37◦ C, en medio GMEM (Glasgow modified Minimum Essential Medium Eagle, CULTEK S.A.) suplementado con Suero Bovino Fetal (de ahora en adelante “SBF”) al 10%, triptona al 0,2%, piruvato s´odico a 0,5 mM y gentamicina a 0,1 mg/mL (de ahora en adelante “medio GMEM completo”). La pureza de las l´ıneas celulares utilizadas fue comprobada efectu´andose las pruebas pertinentes para excluir la presencia de virus adventicios (BDV, enterovirus y rotavirus) as´ı como la presencia de micoplasmas. La cepa de virus BHV-1 utilizada en la presente invenci´on fue aislada a partir de un brote infeccioso de campo por los laboratorios HIPRA S.A. La cepa se denomin´o “FM” por HIPRA S.A. Como se indicar´ a posteriormente, el mapa de restricci´ on de esta cepa v´ırica es similar al de la cepa ”Cooper” del mismo virus (i.e., BHV-1). Los virus se conservaron a -80◦ C en medio GMEM completo que conten´ıa glicerol al 10%. La cepa “FM” se amplific´o y propag´ o sobre monocapas confluentes de c´elulas MDBK cultivadas en el medio y condiciones descritos m´as arriba. Estos cultivos se infectaron a una multiplicidad de infecci´ on (de ahora en adelante “M.O.I.”) comprendida entre 0,1 y 0,01. M´ as detalladamente, se prepararon diluciones de virus a la M.O.I deseada en el medio GMEM completo pero suplementado con SBF al 1%; las monocapas celulares se cubrieron con la diluci´on de virus a raz´ on de aproximadamente 0,04 mL/cm2 y se dejaron adsorber los virus durante 2 h a 37◦ C. Transcurrido este tiempo, se a˜ nadi´ o medio GMEM completo con SBF al 1% y se dej´o progresar la infecci´on hasta observar un efecto citop´atico extensivo (normalmente, al cabo de 48 h). Alternativamente, tras las 2 h de adsorci´ on, se retir´ o la diluci´ on de virus y se cubri´ o la monocapa con medio GMEM completo, suplementado con SBF al 1%. Los virus procedentes de las infecciones as´ı realizadas se obtuvieron de la siguiente manera: se recogi´ o el medio de o durante 20-30 min a 500-1000 xg y 4◦ C para secultivo (30-35 mL por frasco de 175 cm2 ) y se centrifug´ dimentar c´elulas y restos celulares. A continuaci´on, se recuper´ o el sobrenadante y se centrifug´ o durante 3 on h a 48000xg y 4◦ C, obteni´endose un sedimento compuesto mayoritariamente por virus. Esta preparaci´ de virus se conserv´ o en las condiciones mencionadas m´as arriba o se utiliz´o directamente para obtener el DNA viral (v´ease subapartado 4.B.). Alternativamente, se introdujo un paso adicional de purificaci´ on de las part´ıculas v´ıricas, basado en su sedimentaci´on en un gradiente de tartrato pot´ asico, que se describe a continuaci´on. El sedimento de virus se resuspendi´ o en tamp´ on Tris-HCl 10 mM (pH 8.0), EDTA 1 mM, NaCl 0,2 M (de ahora en adelante “STE”) a raz´ on de 0,5 mL de tamp´ on STE por sedimento procedente de 30-35 mL de cultivo original y esta suspensi´ on se aplic´o en la parte superior de un gradiente discont´ınuo de tartrato s´ odico-pot´ asico formado por cuatro capas de las siguientes concentraciones: 20, 30, 40 y 50% (p/v). A continuaci´on, los gradientes se centrifugaron durante 3 h a 100.000 xg (26.500 rpm en rotor Beckmann SW-27) y a 20◦ C. De este modo, las membranas celulares contaminantes, debido a su baja densidad, flotan en la parte superior del gradiente separ´ andose de los viriones con envoltura intacta que sedimentan sobre la capa de tartrato al 50%. Las nucleoc´ apsides v´ıricas desnudas sedimentan formando una corona blanca en el fondo del tubo. Tras la centrifugaci´ on, se recuper´ o la banda correspondiente a los viriones intactos, se diluy´o 4 veces con tamp´on STE y se recogieron los virus mediante centrifugaci´on o en tamp´ on a 4800xg y 4◦ C durante 3 h. Finalmente, el sedimento de viriones obtenido se resuspendi´ 11

ES 2 074 965 B1 STE a raz´on de aproximadamente 50 µL de tamp´ on por cada 30-35 mL de cultivo original.

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Particularmente, cuando interes´ o titular las preparaciones de virus, se utiliz´ o la t´ecnica de infecci´on en medio s´olido: en este caso las c´elulas se cultivaron en placas de Petri de 90 mm de di´ ametro, aptas para cultivo celular, en medio GMEM completo con SBF al 10% hasta obtener una monocapa confluente. A continuaci´ on y como en el caso anterior, se retir´o el medio y la monocapa se cubri´ o con diferentes diluciones de virus (normalmente 10−4 a 10−8 ) en medio GMEM completo con SBF al 1%, permiti´endose su adsorci´on durante 2 h a 37◦C. Transcurrido este tiempo, se retiraron los virus y se cubrieron las c´elulas con 15 mL de medio GMEM completo pero suplementado con SBF al 2% y agarosa de baja temperatura de fusi´ on (Bio-Rad) al 1 %. Una vez solidificada la capa de agarosa, se incubaron las placas a 37◦ C hasta observar puntos discretos con efecto citop´atico correspondientes a puntos de infecci´on (normalmente, 3 d´ıas). A este respecto cabe comentar que el efecto citop´atico avanzado provoca que las c´elulas que est´an produciendo virus se desprendan de la superficie del frasco o placa de cultivo (adem´ as de experimentar otras alteraciones morfol´ ogicas) lo que da lugar a puntos o zonas sin c´elulas adheridas que denominamos “calvas”. Ya que las calvas son perfectamente visibles incluso a simple vista, mediante esta t´ecnica se pueden realizar recuentos precisos del n´ umero de part´ıculas infectivas presentes en una preparaci´ on problema. Alternativamente, el recuento de calvas se realiz´o ti˜ nendo la monocapa celular (p. ej., con colorante de Giemsa), una vez retirada la capa de agarosa. En este caso, las calvas se observaban claramente como puntos o zonas no te˜ nidas sobre un fondo de c´elulas te˜ nidas.

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4.B. Purificaci´ on del DNA de BHV-1 FM.

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El DNA de BHV-1 FM se purific´o a partir de virus, obtenidos como se ha descrito en el subapartado 4.A., de acuerdo con el protocolo que se describe a continuaci´on. Se resuspendieron los virus en tamp´ on STE, a raz´on de 2 mL de tamp´ on por sedimento de virus procedente de 30-35 mL de cultivo original. Una vez resuspendidos, se a˜ nadieron 100 µL de SDS al 10% y proteinasa K (Boehringer Mannheim) a la on, se realiconcentraci´on final de 200 mg/mL, incub´ andose la mezcla durante 1 h a 37◦ C. A continuaci´ zaron dos extracciones (desproteinizaciones) con un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoam´ılico (25:24:1 v/v/v) y se recuper´o la fase acuosa (i.e., fase superior) tras una centrifugaci´ on a 1000-2000xg durante 3 minutos. Para eliminar el fenol residual, la fase acuosa se extrajo de nuevo con un volumen de cloroformo-alcohol isoam´ılico (24:1 v/v). La precipitaci´ on del DNA se realiz´ o de la manera habitual a˜ nadiendo a la fase acuosa 0,1 vol´ umenes de acetato s´odico 3 M (pH 5,2), y 2 vol´ umenes de etanol absoluto. Tras mezclar suavemente por inversi´on, se recogi´o el DNA precipitado por decantaci´ on en un microtubo de centrifugaci´ on de 1,5 mL. Mediante una breve centrifugaci´ on a 12000 xg se sediment´o el DNA, se lav´ o dos veces con 1 mL de etanol al 70%(v/v) y tras un breve secado al vac´ıo se resuspendi´ o en tamp´ on Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM (de ahora en adelante “TE”), a raz´on de 50 µL de tamp´ on por cada 30-35 mL de cultivo original. El DNA as´ı obtenido se cuantific´ o midiendo la absorbancia de varias diluciones a 260 nm y su pureza se determin´o por espectrofotometr´ıa (barrido 320-220 nm) y electroforesis en gel de agarosa, como se detalla en el subapartado 4.C.

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4.C. An´ alisis de restricci´ on del genoma del BHV-1 FM.

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Para realizar el an´alisis del mapa de restricci´on, 0,4 mg del DNA obtenido como se describe en el subapartado 4.B., fueron digeridos por separado con dos enzimas de restricci´ on diferentes: Hind III y Eco RI (Boehringer Mannheim), y analizado en geles de agarosa al 0,6% (p/v) en tamp´on Tris-acetato 40 mM (pH 8,1) y EDTA 1 mM (de ahora en adelante “TAE”), que fueron corridos a 35 mA, durante 16h a temperatura ambiente. Una vez finalizada la electroforesis, los fragmentos de DNA fueron te˜ nidos por inmersi´ on del gel de agarosa en tamp´on TAE que conten´ıa 0,5 mg/mL de bromuro de etidio, durante 20 minutos, y se visualizaron mediante un transiluminador de UV de longitud de onda larga y se fotografiaron. El mapa de las digestiones con los enzimas de restricci´on Hind III y Eco RI del DNA del virus BHV-1 FM, se puede ver en la Figura 1A. Los patrones de digesti´ on obtenidos fueron comparados con los patrones electrofor´eticos descritos en la bibliograf´ıa. Concretamente observamos que el patr´on de restricci´on de la cepa del virus BHV-1 FM es id´entica al descrito para la cepa Cooper (Mayfield, J.E. et al., J. Virol., 47:259-264 (1983); Whetstone, C.A. et al., Arch. Virol., 106: 261-279 (1989)) (Figura 1B). Se pudo observar que el patr´ on de digesti´ on con Hind III presenta una banda de unos 8,4 kb, que segun toda la bibliograf´ıa corresponder´ıa a un fragmento que abarca casi toda la Us del BHV-1 (Whetstone, C.A. et al., (1989) Arch. Virol., 106:261-279; Simard C. et al. (1990) Arch. Virol., 110:63-75; Bulach y Studdert, (1990) Arch. Virol., 113; 17-34). Este dato indicar´ıa que ser´ıa aqu´ı donde deber´ıa estar localizada, total o parcialmente, la glicoprote´ına gII del BHV-1 FM. Del mismo modo, la banda de 16,2 kb del patr´ on Eco RI ser´ıa la que contendr´ıa la totalidad de la Us del BHV-1, siendo otra banda que deber´ıa de contener la secuencia de la glicoprote´ına gII.

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Seg´ un la hip´ otesis de partida desarrollada en la presente invenci´ on, la prote´ına gII se localizar´ıa en la banda K (Hind III) (Figura 1). La hip´ otesis de que el gen de la prote´ına gII se halla en la regi´on Us est´a de acuerdo con los datos procedentes de otros miembros de la familia Alphaherpesviridae en los que se observa una secuencia de 5 glicoprote´ınas que ocupan posiciones muy conservadas a lo largo del genoma. Concretamente se trata de los genes US4 (gG),US5, US6 (gD), US7 (gI) y US8 (gE) de HSV-1, que tienen su contrapartida en las US4 (gG2), US5, US6 (gD2), US7 (gI2) y US8 (gE2) de HSV-2 o las gX, gp50, gp63 y gI de PRV, y las gpIV y gpI de Virus Varicela-Zoster (VZV) (McGeoch D.J. (1990) J. Gen. Virol., 71: 2361-2367). Teniendo en cuenta todos los datos bibliogr´ aficos, era de esperar que esta glicoprote´ına se localizara en esta zona.

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4.D. Clonaci´ on del DNA de BHV-1 FM.

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Los fragmentos de restricci´on HindIII del genoma de BHV-1 FM fueron clonados en la diana HindIII del pl´ asmido pTZ18u (United States Bichemical, Corp.), seg´ un los protocolos est´ andar. De forma detallada: 2 mg del DNA del virus BHV-1 (FM), fueron disueltos en tamp´ on Tris-HCl 10mM (PH 8.0), MgCl2 5 mM, NaCl 100 mM y mercaptoetanol 1 mM (de ahora en adelante “tamp´ on de digesti´ on Hind III”). El on HindIII por DNA se digiri´o a 37◦ C durante 1 hora con 2 unidades de Hind III. El enzima de restricci´ calor a 65◦ C durante 20 minutos. Los fragmentos de DNA as´ı obtenidos se mezclaron con el pl´asmido pTZ18u cortado con HindIII de la siguiente manera: 2 mg del DNA de BHV-1 FM digerido con HindIII se mezclaron con 100 ng del DNA de pTZ18u digerido con HindIII en un volumen de 20 µL de un disoluci´ on que conten´ıa Tris-HCl 66mM (pH 7,5), on de ligaci´on”), y 2 unidades MgCl2 5mM, ditioeritritol 1 mM, ATP 1 mM (de ahora en adelante “tamp´ de DNA ligasa de fago T4 (Boheringer Mannheim). La mezcla se incub´ o durante una noche a 16◦ C. Los pl´ asmidos h´ıbridos resultantes se utilizaron directamente para transformar bacterias E. coli XL1 Blue, como se describe a continuaci´on:

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Las bacterias se prepararon para la transformaci´ on utilizando CaCl2 (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). De forma detallada, a partir de un cultivo de 10 mL de E. coli XL1 Blue con una densidad de 2 (A600 ), se inocularon 200 mL de un medio que conten´ıa bactotriptona al 1,6% (p/v), extracto de levadura al 1% (p/v) y NaCl al 0,5% (p/v) (a partir de ahora o a 37◦ C a 300 rpm de agi“medio 2xYT”), a una densidad inicial de 0,02 (A600 ). El cultivo se incub´ taci´on durante 6-7 horas. Las bacterias se recogieron por centrifugaci´on y se resuspendieron en 1/2 del on de bacterias 5 minutos en hielo, volumen original en CaCl2 0,1 M fr´ıo. Despu´es de incubar la suspensi´ se centrifug´ o y las bacterias sedimentadas se resuspendieron en 1/15 del volumen original en CaCl2 0,1 M fr´ıo.

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Posteriormente, se a˜ nadieron 20 µL del DNA de los pl´ asmidos h´ıbridos a 0,2 mL de bacterias tratadas con CaCl2 . La mezcla se dej´o en hielo durante 30 minutos y se incub´o durante 90 segundos a 42◦C. A la mezcla se a˜ nadi´ o 0,5 mL de medio 2xYT y se incub´ o a 37◦C durante 1 hora. La mezcla fue plaqueada sobre placas de Petri que conten´ıan 20 mL de medio s´ olido compuesto por triptona al 1% (p/v), extracto de levadura al 0,55% (p/v) y NaCl al 1% (p/v) (de ahora en adelante “medio LB”). Y suplementado con 60 mg/mL de ampicilina, 0,04 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3 indolil-β-D-galact´osido (de ahora en adelante “X-gal”) y 0,04 mg/mL de isopropiltio-β-D-galact´osido (de ahora en adelante “IPTG”). El an´ alisis r´ apido de los clones resultantes que conten´ıan el DNA plasm´ıdico h´ıbrido deseado (de ahora en adelante “cribado r´ apido”), se realiz´ o de la siguiente manera: Cada colonia a analizar se inocul´o en 5 mL de medio 2xYT suplementado con 60 mg/mL de ampion. Se centrifug´ o el cultivo y se obtuvo cilina, y se cultiv´o toda la noche a 37◦ C y 300 rpm de agitaci´ un sedimento bacteriano que se resuspendi´ o en 0,2 mL de glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM (pH 8,0) y EDTA 10 mM (de ahora en adelante “disoluci´ on I”). Posteriormente se a˜ nadi´ o 0,4 mL de un soluci´ on compuesta por NaOH 0,2N y dodecil sulfato s´odico al 1 % (p/v) (de ahora en adelante “SDS”) (de ahora en adelante ”disoluci´on II”), a la suspensi´on bacteriana. El tubo se agit´ o suavemente hasta la disgregaci´ on completa de las c´elulas y despu´es se a˜ nadieron 0,3 mL de acetato pot´ asico 3M y ´acido ac´etico 2M (de ahora en adelante “disoluci´ on III”). Despu´es de mezclar suavemente el contenido del tubo se incub´o en hielo durante 5 minutos para permitir que el DNA cromos´omico, las prote´ınas y el RNA de gran tama˜ no precipitaran. A continuaci´ on, el tubo se centrifug´o durante 10 minutos a 13000xg y el sobrenadante resultante se transfiri´ o a otro tubo donde fue extra´ıdo con 1 volumen de fenol/cloroformo/alcohol 13

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isoam´ılico (25/24/1 v/v/v). Para ello se agit´o vigorosamente y se centrifug´ o 5 minutos a 13000xg para separar las fases org´ anica y acuosa. La fase acuosa superior se transfiri´ o a otro tubo donde fue extra´ıda con volumen de cloroformo/alcohol isoam´ılico (24/1 v/v) y repiti´endose la agitaci´on y la centrifugaci´ on para separar las fases. Se recuper´ o la fase acuosa, se le a˜ nadieron 2,5 vol´ umenes de etanol absoluto y se on, se centrifug´ o a 4◦ C durante 10 minutos a 13000xg, recogi´endose dej´ o 30 minutos a -20◦ C. A continuaci´ el DNA plasm´ıdico h´ıbrido precipitado. Este sedimento se lav´ o con etanol al 70% (v/v) y se sec´ o al vac´ıo durante 3-4 minutos. Finalmente el sedimento seco se resuspendi´ o en 200 µl de tamp´ on TE. De este modo se tomaron 9 µl del DNA plasm´ıdico h´ıbrido de cada uno de los clones, se a˜ nadi´ o 1 µl de tamp´ on de digesti´ on Hind III concentrado diez veces y 2 unidades de Hind III. Despu´es de una incubaci´ on on que conten´ıa azul de de 3 horas a 37◦C, cada muestra se mezcl´o con 1/10 de volumen de una disoluci´ bromofenol al 0,4% (p/v), EDTA 125 mM y glicerol al 50% (v/v). La disoluci´ on resultante se carg´o en un gel de agarosa al 0,8% (p/v) horizontal para su an´ alisis electrofor´etico. Este an´ alisis revel´o los pl´asmidos que conten´ıan un inserto Hind III procedente de BHV-1 FM, de modo que se pudo saber el tama˜ no del inserto en kb. Se aisl´o un pl´ asmido h´ıbrido de 11,26 kb, que conten´ıa un inserto de 8,4 kb que comigraba en electroforesis de geles de agarosa con el fragmento Hind III-K de BHV-1 FM; este pl´asmido se denomin´ o p1K1 (Figura 2).

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La preparaci´ on a gran escala de DNA plasm´ıdico h´ıbrido se llev´ o a cabo esencialmente con un facto de 100 veces respecto a la preparaci´ on de DNA plasm´ıdico para la criba r´ apida, a excepci´ on de que despues de la adici´on de la disoluci´ on III y la posterior centrifugaci´on, el sobrenadante se mezcl´ o con 0,6 vol´ umenes de isopropanol para precipitar el DNA plasm´ıdico. Despues se dej´o la disoluci´on 5 minutos a temperatura ambiente y se centrifug´o a 13000xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento resultante se resuspende en 3 mL de tamp´ on TE. Se a˜ naden 3 g de ClCs a los 3 mL de disoluci´ on de DNA plasm´ıdico y se disuelve a la perfecci´on. Se a˜ naden 0,8 mL de una disoluci´ on de bromuro de etidio a una concentraci´ on de 10 mg/mL, por cada 10 mL de disoluci´on de DNA plasm´ıdico y cloruro de cesio. La mezcla de ambas disoluciones debe dar una densidad de 1,55 g/mL, que representa un ´ındice de refracci´on de 1,3860. La disoluci´on se pasa a un tubo adecuado, para una centrifugaci´ on en un rotor on es vertical Beckmann VTi65, a 45000 rpm durante 16 horas a 20◦ C. El resultado de la centrifugaci´ la aparici´on de una banda intensa en el centro del tubo correspondiente al DNA del pl´ asmido h´ıbrido superenrrollado. Este DNA se rescata del tubo mediante la punci´ on por debajo de la banda con una aguja hipod´ermica. Para eliminar el bromuro de etidio de la disoluci´on de DNA plasm´ıdico h´ıbrido, se a˜ nadi´ o 1 volumen de 1-butanol saturado con eter, se mezclaron las dos fases y se centrifugan a 30 segundos a 13000xg a temperatura ambiente, para obtener dos fases. La superior contiene bromuro etidio, que pasa a la fase org´anica y se elimina. La extracci´on se repite 8 veces hasta que ha desaparecido cualquier resto de color ros´ aceo de la fase org´anica. A continuaci´ on se a˜ naden 3 vol´ umenes de agua a la disoluci´on de DNA plasm´ıdico y posteriormente se a˜ naden 2 vol´ umenes de etanol absoluto fr´ıo. se deja la disoluci´ on final 15 minutos a 4◦ C y se centrifuga a 10000xg durante 15 minutos a 4◦ C. Recogiendose en el sedimento el DNA plasm´ıdico h´ıbrido, disolviendose en tamp´ on TE en un volumen adecuado. Finalmente se analiza y cuantifica la pureza del DNA plasm´ıdico h´ıbrido mediante absorbancia (A260 y A280). 4.E. Localizaci´ on del gen estructural gII de BHV-1 FM.

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Inicialmente para poder localizar el gen estructural en la banda Hind III-K de BHV-1 (FM), fue necesario determinar la localizaci´on de dianas de restricci´ on apropiadas en la banda Hind III-K de BHV-1 FM. Esto se hizo de la siguiente manera: 50

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Inicialmente se localizaron cuatro dianas u ´ nicas en la banda Hind III-K correspondientes a los enzimas: BstE II, Nco I, Nhe I y Sac I.(Figura 3). Se tom´ o pl´ asmido p1K1 y se linealiz´o con el enzima de restricci´on Eco RI, que dejaba intacto el inserto Hind III-K. Una vez linearizado se realizaron digestiones de este pl´asmido p1K1 lineal con los siguientes enzimas de restricci´ on: Sal I, Xho I, Pst I, Sma I, en condiciones sub´ optimas a las recomendadas por el fabricante y a diferentes tiempos, de modo que se obtienen digestiones parciales de la banda K insertada en el pl´ asmido h´ıbrido p1K1. Mediante transferencia Southern y la utilizaci´ on como sonda de pUC118 (Sambrook J. et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), linealizado con el enzima de restricci´on Eco RI y marcado con DIG mediante la t´ecnica de marcaje por cebadores al azar (Boheringer Mannheim). De este modo se obten´ıa un escalado en el que iban apareciendo desde los fragmentos m´as pr´ oximos al pl´ asmido (fragmentos m´as alejados del punto de carga) hasta aquellos m´as alejados de este (fragmentos m´as pr´ oximos al punto de carga). Con esta informaci´ on y conociendo 14

ES 2 074 965 B1 los fragmentos a que daba lugar la digesti´on l´ımite del DNA plasm´ıdico h´ıbrido p1K1 con los diferentes enzimas antes citados se pudo confeccionar el mapa de restricci´on del inserto de 8,4kb del DNA clonado en el pl´ asmido p1K1 (Figura 3). El sistema fue el siguiente: 5

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Estas digestiones se somet´ıan a electroforesis en un gel de agarosa al 1% (p/v), en tamp´on TAE a temperatura ambiente a 16 V durante 16 horas. El gel se ti˜ ne con una disoluci´ on de bromuro de etidio de 0,5 mg/mL en tamp´ on TAE y se fotografiaba en un transiluminador de UV. Posteriormente el gel de electroforesis se coloca en una bandeja de vidrio que contiene una disoluci´on de KOH 1 M, durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se transfiere a otra bandeja con Tris-HCl 1 M (pH 7,0) y NaCl 0,6M durante 60 minutos a temperatura ambiente. El gel tratado de esta forma se transfiere a un aparato de transferencia, seg´ un el modelo cl´asico por capilaridad. Se humedeci´ o un filtro de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell), en agua durante 10 minutos y en un tamp´ on NaOH 3M y citrato s´ odico 0,3M (pH 7,0) (de ahora en adelante “20xSSC”). Utilizando 20xSSC como fase l´ıquida m´ ovil de la transferencia Southern, se dej´ o que se llevase a cabo la transferencia durante 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo se desengancha el papel de nitrocelulosa del gel de agarosa y se lava con 6xSSC, se seca a temperatura ambiente y se hornea en vacio a 80◦ C durante 2 horas. El filtro de nitrocelulosa se introduce en una bolsa que contiene 20 mL de 5x(ficoll al 0,1% (p/v), polivinilpirrolidona al 0,1% (p/v) y alb´ umina s´erica bovina al 0,1% (p/v)) (de ahora en adelante “disoluci´ on Denhardt”), 5xSSC, formamida al 50% (v/v) y 100 mg/mL de DNA de esperma de salm´ on (de ahora en adelante “disoluci´ on de Prehibridaci´ on”). El DNA de esperma de salm´on se obtiene de una disoluci´ on madre de 5 mg/ml preparada disolviendo 50 mg de DNA de esperma de salm´on en 10 mL de NaOH 0,2M, calentado a 100◦ C durante 20 minutos para desnaturalizar y cortar el DNA en fragmentos de 0,5 kb con una jeringa de paso estrecho, para luego neutralizar con 0,2 mL de HCl 10M. La bolsa con el filtro de nitrocelulosa se incuba durante 2 horas a 42◦C. Mientras tanto la sonda marcada con digoxigenina (de ahora en adelante “DIG”) (subapartado 4.F.), se a˜ nade a una disoluci´ on de 5xSSC, formamida al 45%(v/v), disoluci´ on 5xDenhardt, sulfato de dextrano al 7,5% (de ahora en adelante “disoluci´ on de hibridaci´ on”), se calienta a 100◦C durante 3 on sea˜ naden 3 mL de que minutos, a continuaci´ on se coloca rapidamente en hielo a 4◦C. A continuaci´ contiene de 50 a 100 ng de sonda marcada con DIG y desnaturalizada, por cada 100 cm2 de filtro de on el filtro se lava dos nitrocelulosa, en una nueva bolsa y se incuba toda la noche a 42◦ C. A continuaci´ on 2XSSC y SDS al 0,1% (p/v). Posteriormente se lava el filtro dos veces de 15 minutos a 42◦C con tamp´ on 0,1xSSC y SDS al 0,1%(p/v). A continuaci´ on se realiza veces m´as durante 15 minutos a 68◦C en tamp´ la detecci´on de los h´ıbridos: se lava el filtro en tamp´ on Tris-ClH 100mM (pH 7,5), NaCl 150 mM (de ahora en adelante “tamp´ on 1”), a continuaci´ on se incuba 30 minutos en 100ml de tamp´ on de reactivo de bloqueo (Boheringer Mannheim) al 0,5% (p/v) en tamp´ on 1 (de ahora en adelante “tamp´ on 2”). Se lava el filtro brevemente con tamp´ on 1. Se incuba con 20 mL de tamp´ on 2 que contiene 150mU/mL (1/5000) de anticuerpo antiDIG conjugado con fosfatasa alcalina (Boheringer Mannheim), durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Posteriormente se lava el filtro 2 veces durante 15 minutos en 100 mL de tamp´ on 1. A continuaci´on se equilibra el filtro en 20 mL de tamp´ on Tris-HCl 100mM (pH 9,5), NaCl 100mM on 3”), durante 2 minutos. Finalmente se incuba el filtro y MgCl2 50 mM (de ahora en adelante “tamp´ en la oscuridad con 10 mL de disoluci´on que contiene 45 µL de sal azul de nitrotetrazolio 75 mg/mL en dimetilformamida al 70% (v/v), 35 µL de una disoluci´ on que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, sal de toluidinio 50 mg/mL en dimetilformamida y 10 mL de tamp´ on 3. (de ahora en adelante “disoluci´ on de revelado”). Cuando aparecen las bandas deseadas se puede detener la reacci´on de revelado, incubando el filtro durante 5 minutos en 50 mL de tamp´ on TE.

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4.F. Preparaci´ on de sondas para la hibridaci´ on molecular.

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Se parte de un DNA lineal purificado mediante una extracci´ on con fenol/cloroformo y precipitado con etanol. El DNA se desnaturaliza mediante calentamiento a 95◦ C durante 10 minutos y rapidamente se on, a 4◦ C, se a˜ nade: 1 mg del DNA desnaturalizado, 2 µL enfr´ıa a 4◦ C. En un microtubo de centrifugaci´ de una mezcla de hexanucle´otidos (Boheringer Mannheim), 2 µL de mezcla dNTP de marcaje (ATP 1 mM, CTP 1 mM, GTP 1 mM, DTTP 0,65 mM, DIG-dUTP 0,35 mM (pH 6,5)), a˜ nadir agua destilada hasta 19 µL, y a˜ nadir 1 µL de enzima Klenow (2U/ml). Centrifugar brevemente e incubar el microtubo nadiendo 2 µL de EDTA 0,2 M (pH 8,0). Precipitar el a 37◦ C durante 20 horas. Detener la reacci´on a˜ DNA marcado a˜ nadiendo 2,5 µL de acetato s´odico 3 M (pH 4,9-5) y 75 µl de etanol absoluto a -20◦ C. Incubar 30 minutos a -80◦C. Centrifugar a 12000xg durante 10 minutos, lavar el sedimento con etanol al 70% (v/v), secar el DNA bajo bomba de vacio y disolverlo en 50 µ.L de tamp´ on TE. 4.G. Secuencia del gen gII de BHV-1 FM.

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Con objeto de determinar la localizaci´on exacta del gen de la prote´ına gII y a partir del mapa de restricci´on obtenido, se subclonaron 2 fragmentos distribuidos a lo largo del fragmento Hind III-K. Los 15

ES 2 074 965 B1 fragmentos se subclonaron en el pl´ asmido pUC118, mediante la digesti´ on del pl´ asmido p1K1 con los enzimas de restricci´on Sal I y Pst I., y separados por electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v), ya descrita anteriormente. Las bandas de inter´es se rescatan del gel mediante el sistema de Geneclean (Bio 101), segun se detalla a continuaci´ on: 5

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Una vez realizada la electroforesis de agarosa en tamp´ on TAE se ti˜ ne con bromuro de etido seg´ un se ha descrito. Se visualizan los fragmentos de DNA mediante UV de longitud de onda larga, y se recortan los fragmentos de agarosa que incluyen los fragmentos de DNA de inter´es. Estos fragmentos se depositan en un microtubo de centrifugaci´ on y se a˜ nade 2,5 vol´ umenes de la disoluci´on 6 M INa respecto al peso de los fragmentos de agarosa (mg/mL). Se incuba el microtubo a 55◦C durante 5 minutos hasta la total disoluci´ on de la agarosa. Se a˜ nade al microtubo 10 µL de la suspensi´ on de la matriz de silica y se incuba el microtubo a temperatura ambiente durante 5 minutos, agitando el tubo cada 2 minutos. Centrifugar durante 5 segundos a 13000xg el microtubo y eliminar el sobrenadante cuidadosamente. A continuaci´ on a˜ nadir al sedimento y resuspenderlo en 0,7 mL de disoluci´ on de lavado, centrifugar a 13000xg durante 10 segundos y descartar el sobrenadante; repetir este paso dos veces m´ as. Para finalizar resuspender el sedimento en 10 µL de tamp´ on TE e incubar a 55◦C durante 5 minutos. Centrifugar a 13000xg durante 10 segundos y rescatar el sobrenadante. A continuaci´on el DNA rescatado se puede utilizar directamente o precipitado con etanol previa acidificaci´ on de la disoluci´ on. Los fragmentos subclonados fueron el fragmento denominado Sal I-A de 1095 pb y el fragmento denominado Pst I-C de 1654 pb (Figura 3). A continuaci´ on se realiz´ o un segundo subclonaje para generar fragmentos de menor tama˜ no y poderlos secuenciar.

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El fragmento SaI I-A, purificado previamente con Geneclean, se digiri´ o por separado con los enzimas de restricci´ on Pst I para dar lugar a los subclones SaI A1, SaI A4 y SaI A5; con el enzima Sma I para dar lugar a los subclones SaI A2 y SaI A3; y con Sac 1 y Pst 1 para dar lugar para dar lugar a los subclones SaI A31 y SaI A33 (Figura 5).

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El fragmento Pst I-C, purificado previamente con Geneclean, se digiri´o por separado con el enzima de restricci´on Sma I para dar lugar a los subclones Pst C1 y Pst C2; y con el enzima Sac I para dar lugar al subcl´ on Pst C3 (Figura 5). Dado que los datos bibliogr´ aficos indicaban que el gen de la prote´ına gII pod´ıa localizarse en uno de los extremos de el fragmento Hind III-K, se secuenciaron todos los fragmentos subclonados.

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El DNA plasm´ıdico h´ıbrido de cada uno de los subclones se obtuvo a partir de cultivos de noche de 3 mL, mediante el protocolo descrito para el cribado r´ apido y posterior purificaci´ on utilizando Geneclean. Una vez se ha obtenido el DNA plasm´ıdico h´ıbrido a partir del protocolo de cribado r´ apido, se a˜ nade al microtubo 3 vol´ umenes de 6 M INa y 5-10 µL de suspensi´ on de matriz de s´ılica, la mezcla se incuba 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar durante 5 segundos a 13000xg el microtubo y eliminar el sobrenadante cuidadosamente. A continuaci´ on a˜ nadir al sedimento y resuspenderlo en 0,7 mL de disoluci´on de lavado, centrifugar a 13000xg durante 10 segundos y descartar el sobrenadante; repetir este paso dos veces m´as. Para finalizar resuspender el sedimento en 10 µL de tamp´ on TE e incubar a 55◦ C durante 5 minutos. Centrifugar a 13000xg durante 10 segundos y rescatar el sobrenadante. A continuaci´ on el DNA rescatado se puede utilizar directamente o precipitarlo con etanol previa acidificaci´ on de la disoluci´ on. Las reacciones de secuenciaci´on se llevaron a cabo mediante el sistema convencional de terminaci´on de cadena por didesoxinucle´ otido (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74; 5463-5467). La mezcla de reacci´on conten´ıa como molde un pl´ asmido pUC118 con inserto de DNA de BHV-1 FM desnaturalizado por alcali, para iniciar la s´ıntesis de DNA se utilizaron como cebadores los oligonucle´otidos denominados “reverse” y “universal” correspondientes al pl´ asmido pUC118 (Sambrook J. et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), (α−35 S)dATP como sustrato de marcaje, Mg++ , los desoxirribonucle´osidos trifofato y los didesoxirribonucle´osidos trifofato no marcados apropiados y la T7 DNA polimerasa (Pharmacia). La reacci´on se detuvo mediante la adici´ on de una disoluci´ on de azul de bromofenol al 0,3% (p/v) y xilencianol FF, EDTA 10 mM (pH 7,5) y formamida al 97,5% (v/v) o en un gel de secuenciaci´on del 6% (p/v), desionizada. Se calent´ o a 90◦C durante un minuto y se carg´ compuesto por acrilamida al 5,7% (p/v), bisacrilamida al 0,3% (p/v), urea al 32% (p/v), TEMED al 0,003% (p/v) y persultato am´ onico al 0,007% (p/v). El an´ alisis de las secuencias obtenidas mostr´o un alto grado de identidad entre la secuencia correspondiente al fragmento SaII-A y las correspondientes al extremo 5’ de los genes g1(PRV), ge(HSV-1) y ge(EHV-1). 16

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A la vista de la secuencia obtenida a partir del extremo 3’ del fragmento Hind III-K, ´este no contiene toda la secuencia codificante para la prote´ına gII de BHV-1 FM. Con objeto de obtener el extremo 3’ completo del gen, se hizo uso de una estrategia de “paseo” a lo largo de la secuencia Us del genoma viral. Para ello se digiri´ o el DNA de BHV-1 FM con una serie de enzimas de restricci´on que presentaban diana en el fragmento Hind III-K y que por lo tanto deb´ıan generar fragmentos que fueran m´as all´ a de su extremo 3’. Concretamente se utilizaron los enzimas; Hind III (control), Xho I, SaI I, Sma I, EcoRI/Hpa I, Nco I, Bst EII y Sac I. Los digeridos del DNA viral fueron analizados en geles de agarosa (0.8%), separados por electroforesis y m´ as tarde transferidos a filtros de nitrocelulosa, donde fueron hibridados, en condiciones altamente restrictivas como se ha descrito anteriormente, con la banda aSaII marcada con DIG. Los fragmentos que hibridaron con la banda SaII-A se utilizaron para elaborar un mapa de restricci´on orientativo de la regi´ on 3’ del fragmento Hind III-K, que permitiera el posterior clonaje y secuenciaci´on de ´esta. Los resultados de esta hibridaci´ on se muestran en la Figura 4. Los resultados de la transferencia Southern determina la existencia de un fragmento Sal I-Eco RI (5,2 kb), que se solapan con el extremo 3’ del fragmento Hind III -K. A partir de estos resultados se decidi´ o aislar en primer lugar el fragmento EcoRI-C (Figura 1A y B). Para ello se digiri´ o el genoma viral con EcoRI/HpaI esta digesti´ on fue sometida a electroforesis de agarosa al 0.5% (p/v), durante 48h con objeto de resolver el fragmento EcoRI-C. La digesti´on adicional con HpaI ten´ıa por objeto cortar otra banda de 15 kb que pod´ıa comigrar con la banda Eco RI-C. Esta banda fue extra´ıda del gel y el DNA purificado mediante Geneclean. El fragmento resultante fue posteriormente cortado con SaII para poder clonar la secuencia correspondiente al extremo 3’ del gen gII. de BHV-1 FM. El DNA plasm´ıdico h´ıbrido que contiene un inserto de 5,2 kb ser´ a conocido a partir de ahora como pSE1.

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Seguidamente se realiz´ o un mapa de restricci´on de pSE1 por los m´etodos antes descritos y con los enzimas de restriccion: Bst EII, Nhe I, Pst I, Sac I y Xho I, se procedi´o a subclonar los fragmentos m´as pr´ oximos al extremo 5’ de pSE1 (Figura 5). 30

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A partir del fragmento Sal I-Eco RI insertado en el pl´ asmido h´ıbrido pSEI, se obtuvo el fragmento Pst I-Pst 1 de 2400 pb, que se subclon´ o en pUCl 18, para dar lugar al DNA plasm´ıdico h´ıbrido pSE10. A partir del inserto de pSE10, se generaron varios subclones cercanos al extremo 5’de pSE1. Este fragmento Pst I-Pst I se digiri´ o con: Xho I y se obtuvieron los subclones pSE13 y pSE14; con Sac I se obtuvieron los subclones pSE12; con SacI y Nhe I se obtuvo el subcl´ on pSE 121; con Acc I se obtuvo el subcl´ on PSE141 (Figura 5). Las t´ecnicas de secuenciaci´on de estos fragmentos fueron identicas a las descritas anteriormente. La secuencia nucleot´ıdica del gen II de BHV-1 FM, aparece en el subapartado 4.0.. En la Tabla 1 se muestran las dianas de restricci´on predichas seg´ un la secuencia.

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TABLA 1 Dianas de restricci´ on predichas a partir de la secuencia del gen gII de BHV-1 (FM) 45

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Posici´on del primer nucle´ otido en la secuencia Endonucleasas de retricci´on

(Nucle´otido N◦ )

Acc I Bst BI Eco NI Hind III Pst I Sac I Sal I Sma I

507,1083,1425,1785 370,2214 2111 1504 924,1122,1482 728 507 491,1091

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Para el an´ alisis de estas secuencias se hizo uso del programa FastA (GCG Sequence Analysis Software Package; Madison, Wisconsin, USA) sobre un sistema VAX/VMS, programa que hace uso del algoritmo de Pearson y Lipman para buscar similitudes entre una secuencia dada y un banco de secuencias. Las secuencias de las diferentes prote´ınas frente a las que se realiz´ o el an´ alisis fueron obtenidas a partir del GeneBank. Se realizaron estudios de homolog´ıa entre diferentes glicoprote´ınas de diferentes herpesvirus. Concretamente se tomaron secuencias del HSV-1, HSV-2, PRV y HVB-1. La Tabla 2 muestra los resultados obtenidos, en los que se observa que, si hacemos referencia a los genes de la Us, la gI (PRV) presenta el mejor nivel de homolog´ıa con la gE (HSV-1), prote´ına que se considera homologa en cuanto a funci´ on. Tambi´en presentan cierta homolog´ıa con esta glicoprote´ına de HSV-1, la gp50 o la gp63 de PRV. En el caso de la gp63 el solapamiento de secuencias es muy peque˜ no (181 pb) lo que hace que esta homolog´ıa sea poco significativa. En el caso de la gp50, aun siendo el solapamiento m´as importante (719 pb), esta claro que la m´axima homolog´ıa se da con la gD, que por otro lado tambi´en es la prote´ına considerada homologa de la gp50 en cuanto a funci´ on. La secuencia nucleot´ıdica contiene un marco de lectura (575 codones), que codifica para un polip´eptido con un peso molecular de 65 kDa. El cod´ on de iniciaci´ on de la traducci´ on (ATG) se encuentra 20 nucle´ otidos por detr´ as de la primera diana Bst BI. El marco de lectura de 1725 nucle´otidos est´ a definido por un codon de terminaci´ on (TAG), que se encuentra dentro de la diana Eco NI (Figura 5 y Tabla 1). No se ha encontrado ninguna evidencia de la existencia de una se˜ nal de poliadenilaci´ on por detr´ as del marco de lectura. Este hecho tambi´en se da en los genes hom´ologos de HSV-1 y de EHV-1, donde el gen gII y el gen contiguo comparten la misma se˜ nal de poliadenilaci´ on (McGeoch, D.J. et al. (1985) J. Mol. Biol., 181:1-13; Telford, E. et al. (1992) Virology, 189:304-316). Se ha encontrado una se˜ nal de transcripci´ on TATA a 131 nucle´otidos por delante del cod´ on de inicio. Esta secuencia difiere ligeramente con el consenso (Bucher P., J. Mol. Biol., 212: 563-578 (1990)), aunque tambi´en se ha descrito en el gen TK (Bello, L.J. et al. (1992) Virology, 189:407 -414) de BHV-1, y en diversos genes de la regi´on Us de HSV-1 (McGeoch, D.J. et al. (1985) J. Mol. Biol., 181:1-13; Bucher P.,(1990) J. Mol. Biol., 212:563-578). Se han encontrado dos cajas GC, en las posiciones -169 y -226, que est´an relacionadas con la eficiencia de transcripci´on (Kozak, M., (1984) Microbiol. Rev, 47:1-45; Kozak. M., (1984) Nature, 308:241-246). No se ha hallado ninguna secuencia CCAT por delante de la caja TATA, de todos modos la ausencia de una caja CCAT ya ha sido descrita en la mayor´ıa de los genes de la regi´ on Us de HSV-1 (McGeoch, D.J. et al. (1985) J. Mol. Biol., 181:1-13). Por u ´ ltimo, en la posici´ on -102 se ha identificado una caja cap relacionada con la ARN polimerasa II y el factor de transcripci´ on TFIID (Bucher P., J. Mol. Biol., 212: 563-578 (1990)).

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El analisis de la secuencia de amino´ acidos, predicha para el marco de lectura descrito, revela que presenta todas las caracter´ısticas esenciales de una glucoprote´ına de membrana. El algoritmo de KyteDoolittle predice la existencia de dos regiones hidrof´ obicas, compatibles con secuencias generadoras de h´elices a amfip´aticas. El primer dominio se extiende desde el amino´ acido 11 hasta el 31, y contiene una secuencia de reconocimiento para proteasas entre los amino´acidos 26 y 27 (von Heijne G. (1986) Nucleic Acid Res., 14: 4683-4690). Estos datos sugieren la presencia de un p´eptido se˜ nal desde el amino´ acido 1 hasta el 26 (posee una regi´ on N-terminal con amino´ acidos cargados (3 argininas); una regi´on central rica en amino´acidos hidrof´ obicos (9 leucinas y una fenilalanina sobre 14 residuos); y una regi´ on C-terminal con residuos de cadena lateral corta (dos alaninas), donde se encuentra la zona de procesamiento del p´eptido), modelo seg´ un (Perlman D. y Halvorson H.O., J. Mol. Biol., 167:391-409 (1983)). Este p´eptido se˜ nal permitir´ıa el transporte de la prote´ına al ret´ıculo endoplasm´ atico donde se iniciar´ıa la glucosilaci´on de la prote´ına. La segunda regi´on hidrof´ obica se extiende desde el residuo 413 hasta el 443. Su localizaci´on cerca del extremo C-terminal y la gran propensi´ on que presenta un segmento, comprendido entre los amino´ acidos 422 al 442, para formar una estructura secundaria de h´elice a hidrof´ obica (von Heinje, G., (1992) J. Mol. Biol., 255:487-494; Sipos, L. y von Heinje, G, (1993) Eur. J. Biochem., 213:1333-1340) hace que esta regi´ on sea una excelente candidata para definir un dominio transmembrana. Todas estas caracter´ısticas y la presencia de dos regiones susceptibles de N-glucosilaci´ on (secuencia; 141: AQLGR NAT GVLIA y secuencia; 343: HLRPA NNS VDLVF; ver subapartado 4.0.) indican que el polip´eptido codificado en el gen de la presente invenci´ on se trata de una glicoprote´ına.

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En conjunto, la secuencia de DNA obtenida presenta unos elevados niveles de identidad (cercanos al 60%) respecto a las secuencias de prote´ınas supuestamente homologas a la gII de otros herpesvirus (gI de PRV;gE de HSV-1 y gE de HVE-1). 60

Uno de los rasgos remarcables de esta secuencia es su elevado contenido en prolina (63 prolinas: 15% en n´ umero y un 9,9% del peso molecular). Al parecer ´esta es una caracter´ıstica t´ıpica no tan s´ olo de otras glicoprote´ınas hom´ ologas de herpesvirus, sino tambi´en del resto de glucoproteinas de BHV-1 descritas 18

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en la bibliograf´ıa (gI: 6.5%, gIII: 12.3% y gIV: 12,5%) (Tabla 2). Por otra parte, el gen secuenciado no s´olo coincide en el contenido de prolina sino en la posici´on que ocupan cuando se comparan con la gE de HVE-1 (con la cual muestra un mayor nivel de identidad); as´ı de las 63 prolinas presentes, 19 ocupan la misma posici´on (31,7%), 5 ocupan posiciones similares (8,3%), 13 son cambios muy conservados (21.7%) y 23 ocupan posiciones diferentes (38,3%), hall´ andose cinco de estas u ´ ltimas dentro del p´eptido se˜ nal. Del mismo modo, los an´alisis de homolog´ıa con las otras glicoprote´ınas antes mencionadas dieron unos valores de identidad muy elevados: 32,5% de identidad en un solapamiento de 532 amino´ acidos con la gE de EHV-1, 33,4% de identidad sobre 386 amino´ acidos con la gI de PRV y 24,5% de identidad con un solapamiento de 502 amino´ acidos con la gE de HSV-1. A la vista de los resultados expuestos, podemos afirmar que el gen secuenciado en la presente invenci´on corresponde a la secuencia completa de la glucoprote´ına gII del BHV-1 FM. TABLA 2

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% en n´ umero

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N◦ de aas

Peso mol. (D)

Alanina

Glicina

Leucina

Prolina

573 576 550 550

61474 62173 61143 59056

15.0 11,8 6,2 10,9

7,2 8,2 5,3 6,9

9,8 8,9 9,6 7,5

11,0 10,8 7,8 11,8

gII (HVB-1) gI (PRV) gE (EHV-1) gE (HSV-1)

Subapartados 4.H. a 4.J.: Dise˜ no de un vector de clonaje h´ıbrido que contenga las secuencias flanqueantes 5’ y 3’ del gen de IA glicoprote´ına gII. 4.H. Construcci´ on del pC1.

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El objetivo de este paso era seleccionar un fragmento de 1200 pb por delante del gen gII de BHV-1 FM y que contuviera el p´eptido se˜ nal del gen gII de BHV-1 FM, a partir del inserto presente en p1K1. 1 mg de p1K1 se digiri´ o con 2 unidades de Pst I y de Sma I en 20 µL de tamp´ on que conten´ıa Trisasico 66 mM y ditiotreitol 0,5 mM, durante 5 horas acetato 33 mM (pH 7,9), MgCl2 10 mM, acetato pot´ o por Geneclean un fragmento a 37◦ C. Mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v), se purific´ de 1200 pb Pst I-Sma I de BHV-1 FM, como se ha descrito. A su vez se prepar´ o pUC118 cortado con Pst I y Sma I en las mismas condiciones. Ambos DNA se ligaron con T4 ligasa, y el producto resultante se utiliz´o para transformar E. coli XL1 Blue tratada con CaCl2 , como se ha descrito anteriormente. Se seleccionaron colonias resistentes a ampicilina y de color blanco en presencia de X-gal e IPTG. Las colonias analizadas conten´ıan un pl´ asmido con un inserto de 1200 pb. Este pl´ asmido fue designado como pC1. (Figura 6) 4.I. Construcci´ on del pC1SE1a.

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El objetivo de este paso era seleccionar un DNA plasm´ıdico h´ıbrido que contuviera un fragmento de 4800 pb compuesto por: (1) un fragmento de 1200 pb por delante del gen gII de BHV-1 FM y que contuviera el p´eptido se˜ nal del gen gII de BHV-1 FM fusionado con (2) un fragmento de DNA de 3600 pb por detr´ as del gen gII de BHV-1 FM que contuviera el cod´ on de STOP del gen gII de BHV-1 FM a partir del inserto presente en p1K1. 2 mg de pSE1 se digiri´ o con 2 unidades de Eco NI (BioLabs), en 20 µL de tamp´ on que conten´ıa acetato pot´ asico 50 mM, Tris-acetato 20 mM (pH 7,9), acetato magn´esico 10 mM, ditiotreitol 1 mM, o por Geneclean durante 5 horas a 37◦C. Mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v), se purific´ el pl´ asmido lineal. A continuaci´on se transformaron los extremos cohesivos del pl´asmido pSE1 lineal en extremos romos, mediante el uso de la nucleasa Mung Bean (Boheringer Mannheim). Para ello se incub´ o el pl´ asmido lineal pSE1 con 10 unidades de nucleasa Mung Bean en 100 µL de una disoluci´ on que conten´ıa acetato s´odico 20 mM (pH 4,6), cloruro s´ odico 50 mM, acetato de zinc 1 mM y Triton X-100 19

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al 0,001% (v/v), durante una hora a 25◦ C. El pl´ asmido lineal pSE1 tratado de este modo se le a˜ nadi´ o 1/10 de volumen de acetato pot´ asico 3 M, se extrajo con un volumen igual de fenol/cloroformo (1/1) y se precipit´o con 2 vol´ umenes de etanol. Posteriormente se digiri´o con 2 unidades de Eco RI en 20 µL de tamp´ on que conten´ıa Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, cloruro s´odico 100 mM y ditiotreitol o por 1 mM, durante 3 horas a 37◦ C. Mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v), se purific´ Geneclean un fragmento de 3600 pb Eco Ni romado-Eco RI de BHV-1 FM. Paralelamente 2 mg de pC1 se digirieron con 2 unidades de Sma I en 20 µL de tamp´ on Tris-acetato asico 66 mM y ditiotreitol 0,5 mM, durante 3 horas a 25◦ C. 33 mM (pH 7,9), MgCl2 10 mM, acetato pot´ Posteriormente la mezcla de digesti´on se ajust´ o a una concentraci´on final de cloruro s´ odico 100 mM en un volumen de 40 µL en presencia de 2 unidades de Eco RI y se incub´o 2 horas a 37◦C. El fragmento de 4,4 kb resultante de esta digesti´on se aisl´o por electroforesis en gel de agarosa al 1 % (p/v), purific´andose mediante Geneclean. Este DNA presentaba un extremo Sma I romo y un extremo Eco RI cohesivo. Finalmente se tom´ o el fragmento de DNA de 3,6 kb Eco Ni romado-Eco RI de BHV-1 FM y el fragmento de DNA de 4,4 kb que presentaba un extremo Sma I romo y un extremo Eco RI cohesivo procedente de pC1 y se ligaron con T4 ligasa. El producto de la ligaci´on se utiliz´o para transformar E. coli XL1 Blue asmido tratada con CaCl2 , como se ha descrito anteriormente. Las colonias analizadas conten´ıan un pl´ con un inserto de 4,8 kb y la totalidad del DNA plasm´ıdico h´ıbrido era de 8 kb, correspondiendo a la uni´ on del pl´ asmido pCl (4,4 kb) y el fragmento de 3,6 kb Eco NI romado-Eco RI de BHV-1 FM. Este pl´ asmido fue designado como pC1SE1a (Figura 6). 4.J. Construcci´ on del p∆gII.

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El objetivo de este paso era seleccionar un DNA plasm´ıdico h´ıbrido que contuviera un fragmento de 3 kb compuesto por: (1) un fragmento de 1,2 kb por delante del gen gII de BHV-1 FM y que contuviera el p´eptido se˜ nal del gen gII de BHV-1 FM fusionado con (2) un fragmento de DNA de 1,8 kb por detr´ as del gen gII de BHV-1 FM que contuviera el cod´ on de STOP del gen gII de BHV-1 FM.

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Se digirieron 2 mg de pC1SE1 a con 2 unidades de Pst I en 20 µL de tamp´ on que conten´ıa Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, cloruro s´odico 100 mM y ditiotreitol 1 mM, durante 3 horas a 37◦ C. Mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) y Geneclean se purific´o un fragmento de 3 kb Pst I-Pst I de BHV-1 FM, como se ha descrito.

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Se digirieron 2 mg de pUC118 con 2 unidades de Pst I en 20 µL de tamp´ on que conten´ıa Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, cloruro s´odico 100 mM y ditiotreitol 1 mM, durante 3 horas a 37◦ C. Al pl´ asmido lineal pUC118 tratado de este modo se le a˜ nadi´ o 1/10 de volumen de acetato pot´ asico 3 M, se extrajo con un volumen igual de fenol/cloroformo (1/1) y se precipit´ o con 2 vol´ umenes de etanol.

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El fragmento de 3 kb Pst I-Pst I de BHV-1 FM y el pl´asmido lineal pUCl 18 se ligaron con T4 ligasa, y el producto de ligaci´ on se utiliz´o para transformar E. coli XL1 Blue tratada con CaCl2 , como se ha descrito anteriormente. Se seleccionaron colonias resistentes a ampicilina y de color blanco en presencia de X-gaI e IPTG. Las colonias analizadas conten´ıan un pl´ asmido con un inserto de 3 kb. Este pl´ asmido fue designado como p∆gII (Figura 6).

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Subapartado 4.K.: Procedimiento de delecci´ on de la secuencia del gen de la glicoprote´ına gII, de forma que la cepa v´ırica resultante carezca de la citada glicoprote´ına, mediante la introducci´ on del vector h´ıbrido, junto con DNA desnudo del virus salvaje en cultivos de c´ elulas capaces de producir el virus IBR. 50

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4.K. Obtenci´ on de la cepa viral BHV-1 FM gII− . El virus BHV-1 FM gII− , que carece de la capacidad para producir cualquier polip´eptido antig´enico de gII de BHV-1 FM,se obtuvo a resultas de una deleci´ on en el gen gII de BHV-1 FM, mediante cotransfecci´on mediante electroporaci´ on de c´elulas GBK con el DNA gII+ de BHV-1 FM y p∆gII digerido con Pst I. Se obtuvo p∆gII purificado mediante centrifugaci´ on en ClCs como se describe en el subapartado 4.D. Se digirieron 10 mg de p∆gII con 10 unidades de Pst I en 100 µL de tamp´ on que conten´ıa Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, cloruro s´odico 100 mM y ditiotreitol 1 mM, durante 3 horas a 37◦C. Al DNA lineal resultante tratado de este modo se le a˜ nadi´ o 1/10 de volumen de acetato pot´ asico 3 M, se extrajo con un volumen igual de fenol/cloroformo (1/1) y se precipit´ o con 2 vol´ umenes de etanol. El sedimento resultante se resuspendi´ o en 20 µL de tamp´ on TE est´eril. 20

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Se obtuvo DNA de BHV-1 FM gII+ mediante el protocolo descrito en el subapartado 4.B.

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Las c´elulas GBK se prepararon para la electroporaci´ on de la siguiente manera: 5,8x106 c´elulas GBK 2 se inocularon por frasco de cultivo de 175 cm con 35 mL de medio GMEM completo. A las 72 horas de cultivo se obtiene una monocapa al 60-70% de confluencia. A continuaci´ on, se elimina el medio y se lavan las c´elulas con un tamp´ on que contiene cloruro pot´ asico al 0,04% (p/v), cloruro s´ odico al 0,68% (p/v), bicarbonato s´ odico al 0,22% (p/v), dihidr´ ogenofosfato s´odico al 0,014% (p/v), D -glucosa al 0,1% (p/v) y EDTA al 0,02% (p/v) (de ahora en adelante “EBSS-EDTA”). Se elimina el EBSS-EDTA y se desprenden las c´elulas de cada frasco de cultivo con 3,5 mL de una disoluci´ on que contiene EDTA al 0,02% (p/v) y tripsina al 0,05% (p/v), que se deja actuar durante 3-5 minutos. La tripsina se inhibe mediante la adici´on de 3,5 mL de medio GMEM completo. A continuaci´ on, se centrifugan las c´elulas a 800xg a 4◦ C durante 10 minutos y se elimina el sobrenadante. El sedimento de c´elulas se resuspende en asico 5 mM, 20 mL de un tamp´ on a 4◦ C que contiene HEPES20 mM, cloruro s´odico 137 mM, cloruro pot´ hidr´ ogenofosfato bis´ odico 0,7 mM y D-glucosa 5 mM (pH 7,1) (de ahora en adelante “HEPES salino”), y se centrifuga a 800xg a 4◦ C durante 10 minutos. Se elimina el sobrenadante y el sedimento se lava dos veces consecutivas con tamp´on HEPES salino en las mismas condiciones antes descritas. Finalmente el sedimento de celulas se resuspende en tamp´on HEPES salino a raz´ on de 7x106 c´elulas/mL. En una cubeta de electroporaci´ on de 0,4 cm de paso (BioRad) enfriada en hielo, se dispensan 0,8 mL de la suspensi´on de c´elulas GBK en tamp´on HEPES salino y se a˜ nade 1 mg de DNA gII+ de BHV-1 FM y 0,5 mg de p∆gII digerido con Pst I. Se incuban las c´elulas con los DNA durante 10 minutos en hielo y, seguidamente, se somete la cubeta a 2 pulsos de 280 V y 250 mF (lapso de descarga 3-5 milisegundos), dejando la cubeta 20 segundos en hielo entre cada pulso. A continuaci´ on, se dejan reposar las c´elulas 10 minutos en hielo, y se transfieren a una placa de Petri de 90 mm de di´ ametro para cultivo celular con 15 mL de medio GMEM completo. Las c´elulas se incuban a 37◦C durante 5 horas, al cabo de las cuales se elimina el medio y se cubre la monocapa celular con 15 mL de medio GMEM completo, suplementado con SBF al 2% (v/v) y agarosa de bajo punto de fusi´ on (BioRad) al 0,8% (p/v), atemperado a 42◦ C. Se deja enfriar el medio a temperatura ambiente hasta la solidificaci´ on completa de la agarosa y se incuban las placas a 37◦ C. Transcurridas 72 horas se pueden apreciar a simple vista calvas en la monocapa celular, que denotan efecto citop´ atico por infecci´ on v´ırica. La eficiencia de transformaci´ on, por el sistema de electroporaci´ on, fue de aproximadamente de 2,5x103 pfu/mg de DNA gII+ de BHV-1 FM. Subapartados 4.L. a 4.M.: Procedimiento de rastreo de la progenie de virus producida seg´ un lo descrito en el subapartado 4.K., con objeto de identificar y aislar part´ıculas v´ıricas recombinantes que incorporen la mutaci´ on en el locus correspondiente al gen de la glicoprote´ına gII. (i.e., gII-). 4.L. Detecci´ on de los virus gII− de BHV-1 FM.

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Cuando las calvas son perfectamente visibles en las placas de Petri de cultivo, se a˜ naden sobre el medio con agarosa 10 mL de agarosa grado DNA (Ecogen) al 1,8% (p/v) que se dejan solidificar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esta capa de agarosa tiene como finalidad dar consistencia a la agarosa de bajo punto de fusi´ on. A continuaci´ on, se marcan tanto la placa de Petri como las dos capas de agarosa, para poder orientarlas correctamente, y se desprende toda la agarosa de la placa de Petri. Esta agarosa se guarda en una placa de Petri nueva a 4◦ C. Posteriormente, las placas que contienen la monocapa de c´elulas se lavan con 10 mL de un tamp´ on que contiene cloruro s´ odico al 0,8% (p/v), hidr´ ogenofosfato s´odico al 0,144% (p/v), dihidr´ ogenofosfato pot´ asico al 0,024% (p/v) y cloruro pot´ asico al 0,02% (p/v) (de ahora en adelante “PBS”). Este lavado se repite una segunda vez. A continuaci´ on, se elimina el PBS y se a˜ naden 10 mL de etanol absoluto durante 10 minutos. Seguidamente, se elimina el etanol absoluto y se a˜ naden 10 mL de etanol al 70% (v/v) durante 10 minutos, del mismo modo se a˜ nade despu´es 10 mL de etanol al 50% (v/v) y finalmente se realiza un u ´ ltimo lavado con etanol al 30% (v/v). Despu´es se lava la placa de Petri dos veces con tamp´on PBS con MgCl2 5 mM. Se elimina el tamp´ on y se incuba la placa de Petri con 10 mL de HCI 0,2M, durante 20 minutos. Tras este lavado, se on, se trata con 5 mL a˜ naden 10 mL de 2xSSC y EDTA 5 mM durante 30 minutos a 50◦C. A continuaci´ de tamp´ on PBS, que contiene 1 mg/mL de Proteinasa K (Boheringer Mannheim), durante 15 minutos a on PBS que contiene glicina al 37◦C. Despu´es se realizan dos lavados de 5 minutos, con 10 mL de tamp´ 0,2% (p/v). Se fija la muestra con un lavado de 30 minutos con 10 mL de PBS y paraformaldehido al 4% (p/v). Por u ´ltimo, se lava la placa de Petri dos veces con 10 mL de tamp´ on PBS con MgCl2 5 mM, durante 10 minutos. La placa de Petri se incuba con 10 mL de disoluci´ on de prehibridaci´ on, se calienta la placa durante 3 minutos a 95◦ C, se pasa despu´es a 42◦ C durante 20 minutos. Se repite el calentamiento a 95◦ C durante 3 minutos y finalmente se enfria la placa sobre hielo picado. Despu´es se vac´ıa la placa y se a˜ naden 3 mL de disoluci´ on de hibridaci´ on con la sonda apropiada de DNA marcada con DIG. En 21

ES 2 074 965 B1 este caso la sonda utilizada fue el inserto SaI I-Sma I de 570 pb de DNA de BHV-1 FM obtenido en el subclonaje para secuenciaci´on y denominado SaI A3 (subapartado 4.G.).

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La sonda fue obtenida mediante la digesti´ on secuencial de 5 mg de DNA plasm´ıdico h´ıbrido del subclon SaI A3 con 2 unidades de SaI 1 en 20 µL de un tamp´ on que conten´ıa Tris-HCk 50 mM (pH 7,5), on, al MgCl2 10 mM, cloruro s´odico 100 mM y ditiotreitol 1 mM, durante 3 horas a 37◦ C. A continuaci´ pl´ asmido lineal tratado de este modo se a˜ nadi´ o 1/10 de volumen de acetato pot´ asico 3 M, se extrajo con un volumen igual de fenol/cloroformo (1/1) y se precipit´ o con 2 vol´ umenes de etanol. El sedimento se resuspendi´ o en 20 µL de tamp´ on TE y se digiri´ o con 2 unidades de Sma I en 20 µL de un tamp´ on que asico 66 mM y ditiotreitol 0,5 mM, conten´ıa Tris-acetato 33 mM (pH 7,9), MgCl2 10 mM, acetato pot´ on se aplica en un gel de agarosa al 1 % (p/v) para electroforesis y durante 3 horas a 37◦C. Esta digesti´ se a´ısla el fragmento de 570 pb mediante Geneclean. Despu´es se marca con DIG como se especifica en el subapartado 4.F. (de ahora en adelante “sonda gII− ”). El revelado de la hibridaci´ on sobre las placas de Petri se llev´ o a cabo siguiendo el mismo procedimiento utilizado en el subapartado 4.E.. El resultado final fue la aparici´ on de halos oscuros alrededor de las calvas generadas por el efecto citop´atico (de ahora en adelante “calvas hibridadas”). Cuando no se detectaron halos oscuros alrededor de las calvas (de ahora en adelante “calvas no hibridadas”), se asumi´ o que ´estas proced´ıan de la progenie de virus mutantes gII− de BHV-1 FM (Figura 7B(1,2)). A partir de este dato se calcul´o que se hab´ıan generado aproximadamente 2.2 recombinantes por cada 100 pfu. 4.M. Purificaci´ on de los virus gII− de BHV-1 FM

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Una vez localizadas sobre las placas todas las calvas no hibridadas, se marcaron y se orient´ o la agarosa de cada placa. Con unahoja de bistur´ı se cortaron fragmentos de 0,5 cm de lado de la agarosa correspondientes a las calvas blancas m´as sobresalientes o aisladas respecto a calvas hibridadas. Estos trozos de agarosa se introdujeron en microtubos con 0,5 mL de medio GMEM completo, y se mantuvieron en agitaci´ on permanente durante 12 horas a 4◦ C. Las calvas no hibridadas as´ı seleccionadas fueron denominadas: G1, E7, EB y E9. Se titularon (ver subapartado 4.A.) las suspensiones virales de cada calva no hibridada, resultando un promedio de 60 pfu/mL. Con estos sobrenadantes se infectaron 3 placas de Petri con monocapas de c´elulas GBK (ver subapartado 4.A.) a raz´ on de 1 µL por placa y calva original y se sigui´ o el protocolo de agarosa antes descrito. Se dejaron transcurrir 72 horas hasta la aparici´ on de calvas con efecto citop´atico. Una placa de cada calva se utiliz´o, como se ha descrito anteriormente, para realizar on mostr´ o en promedio 8 recombinantes por la hibridaci´ on con la sonda gII− . El resultado de la hibridaci´ cada 100 pfu, indicando que se hab´ıa producido un factor de enriquecimiento de 3.5 respecto al inicial. De las dos placas restantes de las calvas G1 y E9 se seleccionaron 96 calvas que se numeraron individualmente. Cada calva se pic´o con un palillo y se inocul´ o en 200 mL de medio GMEM completo en placas de 96 pocillos. Una vez picadas las placas de Petri, se desprendi´o la agarosa y se realiz´ o el protocolo de on mostr´o que se hab´ıan aislado al menos hibridaci´ on con la sonda gII− . El resultado de esta hibridaci´ cuatro clones de virus mutantes gII− de BHV-1 FM, denominados: G1B-1, G1B-9, E9A-47 y E9B-22. A partir de 20 mL del medio GMEM completo de los pocillos de cada uno de los cuatro clones,se infectaron monocapas completas de c´elulas GBK en placas de Petri siguiendo el protocolo del subapartado 4.A.. Al cabo de 72 horas las clavas se hibridaron con la sonda gII− siguiendo el protocolo del subapartado 4.L. y se comprob´o que todas las calvas resultaron no hibridadas, confirmando la homogeneidad de la progenie viral. La producci´on de virus a mayor escala y su posterior purificaci´ on se realiz´ o seg´ un se ha descrito en el subapartado 4.B.. Subapartado 4.N.: An´ alisis del DNA purificado a partir de los virus gII-, con objeto de comprobar que la progenie de los virus aislados en el paso anterior era homogenea en cuanto a presentar una deleci´ on en el locus correspondiente al gen de la glicoprote´ına gII. 4.N. An´ alisis del DNA purificado de los virus gII− de BHV-1 FM.

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Se prepar´ o DNA viral a partir del clon recombinante E9B-22, seg´ un se ha descrito en el subapartado 4.B.. El DNA obtenido se digiri´ o con Hind III, y los fragmentos de restricci´on se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% (p/v), en tamp´on TAE, a temperatura ambiente, a 16 V durante 16 horas. Como control se a˜ nadi´ o DNA del virus parental gII+ de BHV-1 FM, tratado de igual manera. El gel resultante fue te˜ nido con 0,5 mg/mL de bromuro de etidio en tamp´ on TAE y fotografiado sobre un transiluminador de UV. Los resultados se presentan en la Figura 7A. En el patr´ on de digesti´ on del clon E9B-22 se puede apreciar la p´erdida de las bandas Hind III-K de 8,4 kb, HindIII-C de 15.9 kb y 22

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Hind III-F de 12.8 kb, debido a la desaparici´ on de la diana Hind III en posici´ on 1504 (ver Tabla 1) que se halla en el interior del gen gII de BHV-1 FM. A su vez se generan dos nuevas bandas: (1) 24,7 kb correspondiente a la fusi´ on de los fragmentos Hind III-K y Hind III-C en una de las isoformas de BHV-1 FM y (2), otra de 21,2 kb correspondiente a la fusi´ on de los fragmentos Hind III-K y Hind III-F de la segunda isoforma de BHV-1 FM, que cornigra con la banda Hind III-A. Este resultado junto con el hecho de que las calvas procedentes del clon E9B-22 no hibridan con la sonda gII− muestran de manera concluyente que los virus recombinantes del clon E9B-22 carece del fragmento de 1,6 kb de la regi´ on que codifica el gen gII de BHV-1 FM y que estos virus recombinantes se han asmido producido por recombinaci´ on hom´ ologa entre la cepa v´ırica parental gII+ de BHV-1 FM y el pl´ p∆gII. El clon E9B-22 se ha seleccionado para futuros estudios y se ha designado BHV-1 FM gII− .

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4.O. Lista de secuencias. SEQ ID NO:1 LOCUS DEFINICION CARACTERISTICAS

BHV-1(gII) 2336 bp DNA gen´ omico lineal de doble h´elice gen de la glicoprote´ına gII de BHV-1 FM Localizaci´on/Calificadores misc 165..170 /nota=“1a¯ caja GC de la glicoprote´ına gII” misc 221..226 /nota=“2a¯ caja GC de la glicoprote´ına gII” misc. 259..264 /nota=“caja TATA de la glicoprote´ına gII” misc 288..294 /nota=“caja CAP de la glicoprote´ına gII” CDS 391..2117 /nombre-standard=“gII” /producto=“glicoprote´ına gII” n.. 391..467 p´eptido se˜ /nota=“precursor de la glicoprote´ına-gII” /codon de inicio=1 ORIGEN DE LA MOLECULA: (a) Organismo:Herpesvirus Bovino tipo1 (b) Cepa:BHV-1 FM COMPOSICION DE BASES 345 A 865 C 780 G 346 T

(Ver secuencias en las p´aginas siguientes)

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ES 2 074 965 B1 REIVINDICACIONES

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1. Un virus mutante de Rinotraqueitis Infecciosa Bovina caracterizado porque es el resultado de una deleci´on, de una inserci´ on o de una sustituci´ on (deleci´on e inserci´on), en el gen gII del Herpesvirus bovino 1 (BHV-1) y/o secuencias de control del mismo, que no produce ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII, y cuyas caracter´ısticas lo identifican como BHV-1 FM gII− (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, del Institut Pasteur con el n´ umero I-1393).

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2. Un virus mutante, seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque el citado virus BHV-1 FM un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII como resultado de una deleci´ on, de gII− no produce ning´ tama˜ no variable pero compatible con la viabilidad del virus, en el gen gII del virus BHV-1 y/o secuencias de control del mismo.

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3. Un virus mutante, seg´ un las reivindicaci´ on 2, caracterizado porque la mencionada deleci´ on es preferentemente de un tama˜ no comprendido entre 1 y 1619 pb. 4. Un virus mutante, seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque no se produce ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII como resultado de una inserci´ on, de tama˜ no variable pero compatible con la viabilidad del virus, en el gen gII del virus BHV-1 y/o secuencias de control del mismo.

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5. Un virus mutante seg´ un la reivindicaci´on 4, caracterizado porque la mencionada inserci´ on es preferentemente de un tama˜ no comprendido entre 1 y 1400 pb. 6. Un virus mutante seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque no se produce ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII como resultado de una sustitici´ on (deleci´on e inserci´on), de tama˜ no variable pero compatible con la viabilidad del virus, en el gen gII del virus BHV-1 y/o secuencias de control del mismo. 7. Un virus mutante, seg´ un la reivindicaci´ on 6, caracterizado porque la mencionada sustituci´ on es preferentemente de un tama˜ no comprendido entre 1 y 3072 pb. 8. Un virus mutante, seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque el mencionado virus est´ a liofilizado.

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9. Un virus mutante, seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque no se produce alguno o algunos de los determinantes antig´enicos de la glicoprote´ına gII como resultado de deleci´on, inserci´on o sustituci´ on (deleci´on e inserci´on), en el gen gII del virus BHV-1. 10. Un procedimiento para la obtenci´ on de un virus mutante de Rinotraqueitis Infecciosa Bovina que no produce ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII como resultado de una deleci´ on de DNA en el gen gII del virus BHV-1, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: (1) Construcci´ on de un primer vector h´ıbrido que comprende el DNA del vector de clonaje y un fragmento del DNA del virus BHV-1 que incluye 1200 pb de la regi´ on flanqueante 5’ del gen de la glicoprote´ına gII y 104 nucle´ otidos de la secuencia codificante del mismo gen; (2) Construcci´ on de un segundo vector h´ıbrido que comprende el DNA del vector de clonaje y un fragmento del DNA del virus BHV-1 que incluye 1740 pb de la regi´ on flanqueante 3’ del gen de la glicoprote´ına gII y el primer nucle´ otido del cod´ on de stop del mismo gen;

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(3) Construcci´ on de un tercer vector h´ıbrido que comprende el DNA del vector de clonaje y el fragmento de DNA de virus BHV-1 descrito en el paso (1) fusionado al fragmento de DNA de virus BHV-1 descrito en el paso (2). Este tercer vector h´ıbrido es portador de una deleci´on de 1619 pb en el gen de la glicoprote´ına gII; (4) Co-transfecci´ on del vector h´ıbrido descrito en el paso (3) en c´elulas huesped de BHV-1 con DNA de BHV-1; y (5) Rastreo de la progenie viral obtenida en el paso (4) para identificar y obtener BHV-1 mutantes que, como resultado de la deleci´on en el gen de la glicoprote´ına gII, no produzcan ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII.

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ES 2 074 965 B1 11. Un procedimiento, seg´ un la reivindicaci´ on 10, caracterizado porque el vector h´ıbrido resultante del paso (3) es el p∆gII.

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12. Un procedimiento, seg´ un la reivindicaci´ on 10, caracterizado porque el mencionado virus obtenido se liofiliza. 13. Un procedimiento, seg´ un la reivindicaci´ on 10, caracterizado porque se inserta una secuencia for´ anea en lugar de la secuencia del gen de la glicoprote´ına gII delecionada del BHV-1 en el paso (3), de forma que las secuencias de DNA del BHV-1 adyacentes a cada lado de la secuencia gII de BHV-1 delecionada sean retenidas, y de forma que los BHV-1 mutantes resultantes del paso (4) no pueden producir ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII de BHV-1 como resultado de la inserci´on en el gen de la glicoprote´ına gII de BHV-1. 14. Un procedimiento, seg´ un la reivindicaci´ on 13, caracterizado porque la secuencia de DNA for´ aneo es preferentemente de un tama˜ no de 1 a 1400 pb. 15. Un procedimiento, seg´ un la reivindicaci´ on 10, caracterizado porque se sustituye toda o parte de la secuencia de DNA del gen de la glicoprote´ına gII por una secuencia de DNA for´ aneo de forma que los virus BHV-1 mutantes resultantes del paso (4) no pueden producir ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII de BHV-1 como resultado de sustituci´ on de DNA en el gen correspondiente a la glicoprote´ına gII de BHV-1. 16. Un procedimiento, seg´ un la reivindicaci´ on 15, caracterizado porque la secuencia de DNA for´ aneo sustituido es preferentemente de un tama˜ no comprendido entre 1 y 3072 pb.

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17. Una vacuna contra la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina caracterizada porque contiene:

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un la reivindicaci´ on 1, que (1) Una cantidad farmac´euticamente eficaz del virus BHV-1 FM gII− , seg´ no produce ning´ un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII como resultado de una deleci´ on, de una inserci´on, o de una sustituci´ on (deleci´on e inserci´on) en el DNA correspondiente al gen de la glicoprote´ına gII del BHV-1; y (2) Un veh´ıculo o diluente farmac´euticamente aceptable.

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18. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 17, caracterizada porque el mencionado virus BHV-1 FM un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII como resultado de gII− que contiene, no produce ning´ una deleci´ on, de tama˜ no variable pero compatible con la viabilidad del virus, en el gen gII del virus BHV-1 y/o secuencias de control del mismo.

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19. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 18, caracterizada porque la mencionada deleci´ on es preferentemente de un tama˜ no comprendido entre 1 y 1619 pb.

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20. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 17, caracterizada porque el mencionado virus BHV-1 FM un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII como resultado de una gII− que contiene no produce ning´ inserci´on, de tama˜ no variable pero compatible con la viabilidad del virus, en el gen gII del virus BHV-1 y/o secuencias de control del mismo. 21. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 20, caracterizada porque la mencionada inserci´ on es preferentemente de un tama˜ no comprendido entre 1 y 1400 pb.

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22. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 17, caracterizada porque el mencionado virus BHV-1 FM un polip´eptido antig´enico de la glicoprote´ına gII como resultado de gII− que contiene no produce ning´ una sustituci´ on (deleci´on e inserci´on), de tama˜ no variable pero compatible con la viabilidad del virus, en el gen gII del virus BHV-1 y/o secuencias de control del mismo. 55

23. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 22, caracterizada porque la mencionada sustituci´ on es preferentemente de un tama˜ no comprendido entre 1 y 3072 pb.

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24. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 17, caracterizada porque el virus BHV-1 FM gII− est´a liofilizado. 25. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 17, caracterizada porque la cantidad farmace´ uticamente 30

ES 2 074 965 B1 eficaz del virus BHV-1 FM gII− contenido en la vacuna est´a comprendida entre 104.5 a 107.0 p.f.u por dosis vacunal.

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26. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 17, caracterizada porque el veh´ıculo o diluente aceptable es un medio fisiol´ogico tamponado conteniendo un 2.5-15% (v/v) de suero libre de anticuerpos contra la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina. 27. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 26, caracterizada porque el mencionado suero es uno de entre los sueros de cerdo, caballo, bovino y cordero.

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28. Una vacuna, seg´ un la reivindicaci´ on 17, caracterizada porque la preparaci´ on del virus BHV-1 un la reivindicaci´ on 10. FM gII− se corresponde al procedimiento seg´

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29. Una vacuna antiviral viva para el control de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina, caracterizada un la reivindicaci´ on 1, porque contiene una cantidad efectiva de virus recombinante BHV-1 FM gII− seg´ formulado con excipientes o adyuvantes de la inmunidad. 30. Una vacuna universal inactivada para el control de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina, caracteun la reivindicaci´ on rizada por contener una cantidad eficaz del virus recombinante BHV-1 FM gII− , seg´ 1, formulada con excipientes o adyuvantes de la inmunidad. 31. Una vacuna universal, seg´ un la reivindicaci´ on 29, caracterizada por contener una cantidad efectiva de virus BHV-1 FM gII− recombinante vivo, mezclado con otros virus respiratorios (por ejemplo nados BVD, Pl3 , BRSV) y/o ent´ericos (por ejemplo Rotavirus, Coronavirus) vivos o inactivados, acompa˜ o no de organismos bacterianos, partes de los mismos, productos y toxinas de su metabolismo, adem´ as de un adyuvante de la inmunidad adecuado para estimular la respuesta inmune. 32. Una vacuna universal, seg´ un la reivindicaci´ on 30, caracterizada por contener una cantidad eficaz de virus BHV-1 FM gII− recombinante inactivado, mezclado con otros virus respiratorios (por ejemplo nados BVD, Pl3 , BRSV) y/o ent´ericos (por ejemplo Rotavirus, Coronavirus) vivos o inactivados, acompa˜ o no de organismos bacterianos, partes de los mismos, productos y toxinas de su metabolismo, adem´ as de un adyuvante de la inmunidad adecuado para estimular la respuesta inmune. 33. Un m´etodo para la obtenci´ on de una vacuna viva, seg´ un reivindicaci´ on 29, caracterizado por:

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a) La replicaci´on del virus BHV-1 FM gII− en cualquier sustrato permisible (por ejemplo c´elulas MDBK, GBK o cultivos primarios) entre 36◦C y 38◦C.

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b) La cosecha del virus, cuando se observa un efecto citop´ atico m´ aximo normalmente entre las 40 y las 50 horas post-infecci´ on de la monocapa celular.

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c) La liofilizaci´ on de la suspensi´on v´ırica viva, previa adici´ on de estabilizantes adecuados y/o de adyuvantes de la inmunidad, ya sea mediante la adici´ on conjunta o bien mediante una preparaci´ on extratemporea en la cual el liofilizado y el adyuvante o diluyente se encuentran en distintos viales y se mezclan en el momento de la administraci´ on. 34. Un m´etodo para la obtenci´ on de una vacuna inactivada, seg´ un la Reivindicaci´ on 30, caracterizado por:

50

a) La replicaci´on del virus BHV-1 FM gII− en un sustrato permisible (por ejemplo c´elulas MDBK, GBK o cultivos primarios) a temperaturas comprendidas entre 36◦ C y 38◦ C. b) La cosecha del virus, cuando se observa un efecto citop´ atico m´ aximo, normalmente entre las 40 y las 50 horas post-infecci´ on de la monocapa celular.

55

c) La inactivaci´on de la cosecha v´ırica mediante la adici´ on de un inactivante (por ejemplo formaldehido, aziridinas, BPL) a una temperatura y tiempo determinados.

60

d) La emulsificaci´on de la cosecha v´ırica inactivada obtenida en c) con adyuvantes oleosos de forR R o Drakeol ) o no oleosos (saporninas, mulaci´on o/w, w/o o w/o/w (utilizando preferiblemente Markol hidr´ oxido alum´ınico u otros).

31

ES 2 074 965 B1 35. Un m´etodo, seg´ un la reivindicaci´ on 29, caracterizado porque el virus vivo liofilizado se disuelve con una vacuna inactivada que contiene otros virus, bacterias o combinaciones de ambos.

5

36. Un m´etodo, seg´ un la reivindicaci´ on 30, caracterizado porque el virus inactivado se mezcla con otros virus inactivados o vivos, adyuvantado o no, para ampliar el espectro de ant´ıgenos de la vacuna.

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kES 2 074 965 kN. solicitud: 9400172 kFecha de presentaci´on de la solicitud: 31.01.94 kFecha de prioridad:

11

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

21

˜ ESPANA

◦

22 32

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

k

51 Int. Cl.6 :

C12N 7/01, 15/38, 15/63, A61K 39/265

DOCUMENTOS RELEVANTES Categor´ıa

X

Y

Documentos citados

Reivindicaciones afectadas

WO-9302104-A (SYNTRO CORPORATION) 04.02.1993 * P´ag. 22, l´ıneas 34-37; p´ag. 23, l´ıneas 1-6; p´ag. 28, l´ıneas 25-31; p´ag. 70, l´ıneas 26-28; ejemplo 13; reivindicaciones 5-9,20-23,107 * * Ejemplo 13 *

1-9,17-27, 29,30 31-36

Y

WO-8700862-A (THE UPJOHN CO.) 12.02.1987 * Todo el documento *

31-36

A

US-4703011-A (MALON KIT & SAUL KIT) 27.10.1987 * Todo el documento *

1-36

A

US-4569840-A (SAUL KIT) 11.02.1986 * Todo el documento *

1-36

A

ISABELLA RAUH et al. Pseudorabies virus mutants lacking the essential glycoprotein gII can be complemented by glycoprotein gI of bovine herpesvirus 1. Journal of Virology. Febrero 1991, p´aginas 621-631 * Todo el documento *

Categor´ıa de los documentos citados X: de particular relevancia

on no escrita O: referido a divulgaci´

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la

on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´

misma categor´ıa A: refleja el estado de la t´ecnica

de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu´ de presentaci´ on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado × para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci´ on del informe 23.03.95

para las reivindicaciones n◦ : Examinador N. Urqu´ıa Fern´andez

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