DNA-Fragmente im Plasma von Tumorpatienten Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften an der Universität Konstanz

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie

vorgelegt von

Sabine Jahr Tag der mündlichen Prüfung: 9. Februar 2001 Referent: Prof. Dr. R. Knippers Referent: Prof. Dr. R.-D. Hesch

Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit sind in folgende Publikationen eingegangen:

• Jahr S*, Hentze H, Englisch S, Hardt D, Fackelmayer FO, Hesch RD, Knippers R, (2000), DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells, Cancer Res. (im Druck).

• Jahr S*, Czekelius P, Krause U, Hesch RD, Knippers R, (2001), Quantitation of tumor DNA in plasma of breast cancer patients and the effect of therapy, (in Vorbereitung).

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Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG..................................................................................................................1 1.1 KREBS UND TUMORENTSTEHUNG ...................................................................................1 1.1.1 Molekulare Ursachen der Krebsentstehung ............................................................1 1.1.2 Instabilität des Genoms ..........................................................................................2 1.2 TUMORAUSBREITUNG UND METASTASENBILDUNG ..........................................................3 1.3 TUMORE UND ZELLULÄRE IMMUNANTWORT ...................................................................4 1.4 VASKULARISIERUNG IM TUMORGEWEBE .........................................................................5 1.4.1 In situ Karzinom.....................................................................................................5 1.4.2 Invasiver Tumor .....................................................................................................5 1.5 APOPTOSE UND NEKROSE VON TUMORZELLEN ................................................................6 1.5.1 Hypoxie und Zelltod im Tumorgewebe....................................................................6 1.5.2 Apoptose-Resistenz und Nekrose im malignen Tumor .............................................6 1.5.3 Chemotherapie und Bestrahlung.............................................................................7 1.6 IST EINE FREISETZUNG VON DNA INS BLUTPLASMA MÖGLICH?.......................................7 1.7 DNA IM PLASMA VON TUMORPATIENTEN .......................................................................7 1.7.1 Tumorpatienten weisen erhöhte Mengen an DNA im Plasma auf ............................7 1.7.2 Tumor-DNA im Plasma von Tumorpatienten ..........................................................8 1.7.3 Ursprung der Plasma-DNA ....................................................................................8 1.7.4 Mechanismus der Freisetzung der DNA ins Blut.....................................................9 2 ZIELSETZUNG.............................................................................................................10 3 MATERIAL UND METHODEN..................................................................................11 3.1 MATERIAL ...................................................................................................................11 3.1.1 Tumorpatienten und Kontrollpersonen .................................................................11 3.1.2 Mäuse ..................................................................................................................11 3.2 METHODEN ..................................................................................................................12 3.2.1 Isolierung von Plasma..........................................................................................12 3.2.2 DNA-Isolierung aus Patientenproben ...................................................................12 3.2.2.1 Plasmaproben .......................................................................................................... 12 3.2.2.2 Gewebeproben......................................................................................................... 12

3.2.3 Quantifizierung der Plasma-DNA.........................................................................13 3.2.3.1 Kompetitive PCR .................................................................................................... 13 3.2.3.2 Realtime-PCR ......................................................................................................... 13

3.2.4 Detektion von Mutationen ....................................................................................14 3.2.4.1 Mutationen in TP53 ................................................................................................. 14 3.2.4.2 K-ras-Mutationen .................................................................................................... 15

ii 3.2.5 Analyse des Methylierungsstatus von CDKN2A ....................................................16 3.2.5.1 CpG-Methylierung der Positivkontrolle ................................................................... 16 3.2.5.2 Desaminierung der DNA durch Na-Bisulfit.............................................................. 16 3.2.5.3 Methylierungs-spezifische PCR............................................................................... 16

3.2.6 Quantifizierung von Tumor-DNA im Plasma ........................................................17 3.2.6.1 Plasma-DNA-Aufreinigung und Desaminierung der DNA ....................................... 17 3.2.6.2 Quantitative methylierungs-spezifische PCR ........................................................... 17

3.2.7 Nachweis von T-Lymphozyten-DNA im Plasma ....................................................18 3.2.7.1 Nachweis von Endothelzell-DNA im Plasma ........................................................... 18

3.2.8 Fragmentlängen-Bestimmung...............................................................................19 3.2.8.1 Radioaktive Endmarkierung der Plasma-DNA einer Kontrollperson......................... 19 3.2.8.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA von Tumorpatienten....................... 19

3.2.9 In vitro Apoptose und Nekrose von Jurkat-T-Lymphozyten ...................................19 3.2.9.1 Isolierung der DNA aus dem Überstand................................................................... 20 3.2.9.2 Quantifizierung der DNA aus dem Überstand .......................................................... 20 3.2.9.3 Apoptose-Nachweis: SAF-A-Spaltung..................................................................... 20

3.2.10In vivo Apoptose und Nekrose bei Mäusen............................................................20 3.2.10.1 Plasma-Gewinnung und DNA-Isolierung .............................................................. 21 3.2.10.2 Quantifizierung der Plasma-DNA.......................................................................... 21 3.2.10.3 Fragmentlängen-Bestimmung der freigesetzten DNA ............................................ 21

4 ERGEBNISSE................................................................................................................22 4.1 TUMORPATIENTEN HABEN ERHÖHTE MENGEN AN DNA IM BLUTPLASMA ......................22 4.1.1 Quantifizierung der Plasma-DNA von Kontrollpersonen ......................................23 4.1.2 Quantifizierung der DNA im Plasma von Tumorpatienten ....................................24 4.2 TUMORZELLEN ALS QUELLE DER PLASMA-DNA VON TUMORPATIENTEN ......................26 4.2.1 Mutationen im TP53 Tumorsuppressor-Gen .........................................................26 4.2.2 Mutationen im KRAS Onkogen .............................................................................27 4.2.3 Hypermethylierung des CDKN2A Tumorsuppressor-Gen-Promotors....................29 4.3 QUANTIFIZIERUNG DER METHYLIERTEN DNA AUS TUMORZELLEN ................................31 4.4 PLASMA-DNA STAMMT NUR IN WENIGEN FÄLLEN AUS T-ZELLEN .................................34 4.5 PLASMA-DNA STAMMT NICHT AUS ENDOTHELZELLEN .................................................36 4.6 DNA-FRAGMENTE WEISEN MEIST MONONUKLEOSOMEN-GRÖßE AUF ............................40 4.6.1 Größenbestimmung der Plasma-DNA einer Kontrollperson..................................40 4.6.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA einiger Patienten........................42 4.7 APOPTOTISCHE UND NEKROTISCHE ZELLEN SETZEN IN VITRO DNA FREI.........................44 4.7.1 Quantifizierung der freigesetzten DNA .................................................................45 4.7.2 Apoptose-Nachweis ..............................................................................................46 4.8 NACH INDUKTION VON APOPTOSE UND NEKROSE IN VIVO ERSCHEINEN DNA-FRAGMENTE UNTERSCHIEDLICHER GRÖßE IM BLUTPLASMA ..............................................................47 4.8.1 Quantifizierung der freigesetzten Plasma-DNA ....................................................47 4.8.1.1 Dosisabhängige Freisetzung von DNA ins Plasma bei Apoptose-Induktion.............. 48 4.8.1.2 Freisetzung von DNA ins Plasma nach Apoptose- und Nekrose-Induktion ............... 49

iii 4.8.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA ...................................................50 4.9 PLASMA-DNA IM THERAPIEVERLAUF VON BRUSTKREBS-PATIENTINNEN ......................51 4.9.1 DNA-Mengen in präoperativen Plasmaproben der Patientinnen...........................52 4.9.2 Plasma-DNA-Konzentrationen von gesunden Frauen ...........................................54 4.9.3 Plasma-DNA der Brustkrebs-Patientinnen im Therapieverlauf .............................55 4.9.4 Anteil der Tumor-DNA im Plasma der Patientinnen im Therapieverlauf...............57 4.9.4.1 DNA aus dem Tumorgewebe ist nur präoperativ nachweisbar.................................. 57 4.9.4.2 Anteil der Tumor-DNA im Plasma der Brustkrebs-Patientinnen............................... 59

4.9.5 Korrelation der Daten zur Plasma-DNA mit der Klinik der Patientinnen..............60 4.9.5.1 Patienten mit Karzinom weisen höhere DNA-Werte auf als die ohne Karzinom ....... 61 4.9.5.2 Korrelation zwischen präoperativer DNA-Menge und Tumorgröße.......................... 63

4.10 PLASMA-DNA BEI GESUNDEN FRAUEN ......................................................................64 4.10.1Während der Menstruation ist die Plasma-DNA-Menge erhöht ............................65 4.10.2Menge an DNA im Plasma scheint unabhängig von Östrogenexposition...............66 5 DISKUSSION ................................................................................................................68 5.1 KONZENTRATION DER DNA IM PLASMA .......................................................................68 5.2 URSPRUNG DER PLASMA-DNA: TUMORZELLEN ............................................................69 5.2.1 Detektion von Tumor-DNA im Plasma..................................................................70 5.2.2 Quantifizierung der Tumor-DNA im Plasma.........................................................71 5.3 URSPRUNG DER PLASMA-DNA: UMGEBENDE ZELLEN DES TUMORS ..............................74 5.4 URSPRUNG DER DNA BEI GESUNDEN KONTROLLPERSONEN ..........................................75 5.5 MECHANISMUS DER FREISETZUNG DER DNA INS PLASMA ............................................76 5.6 GRÜNDE FÜR DIE ANWESENHEIT VON DNA IM PLASMA ................................................78 5.7 PLASMA-DNA: AUSBLICK UND POTENTIELLER MEDIZINISCHER NUTZEN .......................79 6 ZUSAMMENFASSUNG ...............................................................................................80 7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................81 8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS....................................................................................82 9 TABELLENVERZEICHNIS ........................................................................................83 10 ANHANG .......................................................................................................................84 11 LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................................85

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1 Einleitung 1.1 Krebs und Tumorentstehung Krebs ist nach Herz- und Kreislauferkrankungen mit einer Häufigkeit von 20% die zweithäufigste Todesursache in den westlichen Industrieländern (Alberts et al., 1995). Man unterscheidet heute etwa 100 verschiedene Krebsarten, deren Einteilung sich hauptsächlich nach dem Gewebe richtet, in dem sie ursprünglich entstanden sind, und nach den Zelltypen, aus denen sie hervorgehen (Hanahan und Weinberg, 2000). Am häufigsten sind Karzinome, also bösartige Entartungen von Epithelzellen, z.B. der Lunge, des Brustgewebes oder des Dickdarms. Andere Tumoren entstehen aus Zellen des Bindegewebes oder Muskelzellen (Sarkome) oder wie bei Leukämie aus den blutbildenden Zellen des Knochenmarks und der Lymphknoten. Zu den häufigsten Krebsarten in Deutschland gehören Tumoren der Lunge, Darm, Prostata und Brust (Alberts et al., 1995). Das Auftreten jeder Krebsart wird in unterschiedlicher Weise von Karzinogenen beeinflußt; insbesondere von Umweltfaktoren. Darunter sind physikalische (verschiedene Strahlen wie beispielsweise UV-Strahlen), chemische (z.B. Asbest, Nickel, Chrom) und biologische Agenzien (Tumorviren). Diese Agentien bewirken DNA-Schädigungen in Form von Mutationen, Strangbrüchen, Translokationen oder Chromosomenbrüchen (Alberts et al., 1995). Ein Tumor entsteht allerdings erst dann, wenn sich über die Zeit innerhalb einer Zelllinie mehrere Mutationen in den verschiedenen Tumorsuppressor-Genen oder Onkogenen angesammelt haben, die zu einer ungehinderten Proliferation dieser Zellen führen (Nowell, 1976).

1.1.1 Molekulare Ursachen der Krebsentstehung Bisher wurden verschiedene Mutationen entdeckt, die Onkogene mit dominantem Funktionsverlust oder Tumorsuppressor-Gene mit rezessivem Funktionsverlust erzeugen (Hanahan und Weinberg, 2000). Zu den Genen, die am häufigsten Mutationen aufweisen, gehört TP53, das Gen eines wichtigen zellulären Tumorsuppressors. Schätzungen gehen davon aus, dass bei über 50% aller Krebsfälle Mutationen in diesem Gen vorliegen (Levine, 1997; Soussi, 2000a). TP53 fungiert in der Zelle als Tumorsuppressor, indem es sowohl Wachstumsarrest als auch apoptotischen Zelltod geschädigter Zellen induziert (Prives C, 1994; Yonish-Rouach et al., 1991). Ein weiteres Gen, das häufig von Mutationen betroffen ist, ist das Gen des K-ras Proto-

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Onkogens (Minamoto et al., 2000). Bei Adeno-Karzinomen des Pankreas liegt die Häufigkeit bei über 90 Prozent; bei Colon-Karzinomen und Schilddrüsen-Tumoren bei 50% und bei Lungenkrebs bei 30% (Longnecker und Terhune, 1998; Bos, 1989). Das K-ras-Protein gehört zu der Familie der GTPasen und ist am Signalweg von der Zelloberfläche zum Zellkern beteiligt (Hernandez-Alcoceba et al., 2000). Neben TP53 und K-ras (KRAS) sind bisher über 160 verschiedene Gene bekannt, die in den Tumorzellen der verschiedenen Krebsarten verändert sein können (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CGAP/hTGI/; Portal des Cancer Genome Anatomy Project). Eine weitere Veränderung von Tumorsuppressor-Genen oder Proto-Onkogenen in Tumorzellen liegt in der Regulation ihrer Expression. So können Gene durch Hypermethylierung der CpGInseln in den Promotor-Bereichen vollständig stillgelegt werden (Baylin et al., 1998). Beispiele hierfür sind das Gen eines wichtigen Inhibitors cyclinabhängiger Kinasen, CDKN2A, oder das Gen ER des Östrogen-Rezeptors (Baylin et al., 1998; Liggett und Sidransky, 1998).

1.1.2 Instabilität des Genoms Es sind mehrere genetische Veränderungen notwendig bis eine Zelle zur Krebszelle wird. Man vermutet, dass die meisten der weiteren Veränderungen in Tumorzellen direkt oder indirekt auf Veränderungen der Genome der Krebszellen selbst zurückzuführen sind; d.h. dass die Genome von Tumorzellen eine gesteigerte Mutationsfrequenz aufweisen. Für Tumorzellen mit einer solchen erhöhten Mutationsfrequenz wird die Bezeichnung „Mutator-Phänotyp“ verwendet (Loeb, 1991). Vermutlich ist diese gesteigerte Mutationshäufigkeit eine Folge von gestörten Funktionen spezifischer Wächter der Zelle; beispielsweise der Proteine der Mismatch-RepairProteine (Lengauer et al., 1998). Eine Folge davon ist eine Instabilität des Genoms, die sich meist auf der Chromosomen-Ebene zeigt; seltener auch auf dem Nukleotid-Level. Diese GenomInstabilität äußert sich zum Beispiel in veränderten Chromosomenzahlen, ChromosomenTranslokationen, Gen-Amplifikationen oder Deletionen und Insertionen von Nukleotiden (Lengauer et al., 1998). Zu den Folgen des Mutator-Phänotyps gehören auch Veränderungen der Mikrosatelliten-Sequenzen wie das Auftreten von Deletionen ganzer Mikrosatelliten (loss of heterozygosity; LOH) oder Veränderungen der Mikrosatelliten-Längen (Yamasaki et al., 2000).

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1.2 Tumorausbreitung und Metastasenbildung Durch die Akkumulation genetischer Veränderungen in den Tumorzellen kommt es zu einer ungehinderten Proliferation der betroffenen Zellen, die schließlich zu der Bildung eines schnell wachsenden Tumors führt. Ob ein solcher Tumor aber gut- oder bösartig ist, hängt vor allem von der Fähigkeit der Tumorzellen zur Metastasenbildung ab. Für eine erfolgreiche Metastasierung müssen die Tumorzellen zahlreiche Eigenschaften aufweisen: sie müssen sich aktiv vom Primärtumor ablösen, in die Bindegewebsmatrix zwischen den Zellen eindringen und die Wand eines Blutgefäßes durchbrechen können (Abb. 1). Danach muss die metastasierende Tumorzelle die Passage im Blutstrom überstehen und an einer geeigneten Stelle wieder austreten, ohne vom Immunsystem erkannt zu werden (Hausen, 1992). Schließlich muss gewährleistet sein, dass sie das Wachstum neuer Blutgefäße veranlassen kann, die den neuen Tumor versorgen (Abb. 1; 1.4).

Abb. 1: Entstehung von Metastasen im Körper Bei der Metastasierung lösen sich Zellen des Primärtumors ab, gelangen über den Blutstrom in andere Teile des Körpers und erzeugen dort einen Sekundärtumor. Für diese Schritte sind mehrere Fähigkeiten der Tumorzellen nötig: die Invasion in das umliegende Gewebe um den Primärtumor, die Penetration, also das Eindringen in eines der umliegenden Blutgefäße, und der Austritt der Tumorzelle durch die Endothelzellen eines Blutgefäßes. Aus: Hausen, 1992.

Vergleichende Untersuchungen der Genexpressions-Profile zwischen metastasierenden und nicht-metastasierenden Tumorzellen haben gezeigt, dass einige Gene unterschiedlich exprimiert werden (Yokota J, 2000). Tumorzellen können beispielsweise nur dann die Basalmembran durchdringen, wenn sie geeignete Integrine exprimieren, die die Anheftung an die Basalmembran ermöglichen. Für den Abbau der Membran müssen die metastasierenden Tumorzellen spezielle Kollagenasen auf ihrer Oberfläche tragen (Hausen, 1992).

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1.3 Tumore und zelluläre Immunantwort Das Immunsystem hat die natürliche Fähigkeit, solche entarteten Zellen eines Tumors zu erkennen und zu zerstören. Diese zelluläre Immunantwort, die sich auch gegen körperfremde Gewebe und infizierte körpereigene Zellen richtet, wird von T-Lymphozyten vermittelt, einer Klasse der weißen Blutzellen. Es gibt verschiedene Arten von T-Lymphozyten: T-Helferzellen, die die Immunantwort fördern, und cytotoxische T-Zellen, die fremdartige Zellen abtöten. Wie die B-Zellen tragen auch die T-Zellen spezifische Rezeptoren auf ihrer Oberfläche. Wenn eine T-Zelle auf einer entarteten Zelle ihr eigenes Antigen erkennt und daran andockt (Abb. 2A), wird sie aktiviert, tötet die fremde Zelle ab (Abb. 2B) und kann sich selbst vermehren (Robins, 1986; Alberts et al., 1995). Der Mechanismus, über den die T-Lymphozyten die Tumorzellen eliminieren, findet über eine Induktion des apoptotischen Zelltodes statt (Cotter et al., 1990). So beobachtet man in vielen Tumoren eine Akkumulation von T-Zellen, die man als tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) bezeichnet (Kradin und Bhan, 1993; Halapi, 1998).

Abb. 2: Angriff eines T-Lymphozyten auf eine Krebszelle A: Ein T-Lymphozyt (links) dockt an eine weit größere Tumorzelle (rechts) an. B: Die entartete Zelle wird durch Substanzen der T-Zelle lysiert. Aus: Feldman und Eisenbach, 1988

Einige der Antigene, die Tumorzellen im Gegensatz zu gesunden Zellen auf ihrer Oberfläche tragen können und von den T-Lymphozyten erkannt werden, sind bereits bekannt. Bei Brustkrebs beispielsweise zeigt sich häufig eine Überexpression des HER-2/neu Proteins (Robbins und Kawakami, 1996). Nach der Immunisierung von Ratten mit HER-2/neu-Peptiden zeigte sich eine vermehrte Bildung von spezifischen T-Lymphozyten (Disis et al., 1996), so dass dieses Protein ein potentielles Target-Antigen für eine Immuntherapie bei Brustkrebspatienten darstellen könnte.

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1.4 Vaskularisierung im Tumorgewebe 1.4.1 In situ Karzinom Eine Ansammlung von malignen Zellen, die noch nicht die Fähigkeit zu rascher Proliferation und invasivem Wachstum erlangt hat, wird als In situ Karzinom bezeichnet. In diesem Stadium besitzt der Tumor noch kein eigenes Blutgefäßsystem, das ihn mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt. Da der Transport von Nährstoffen in diesem Stadium rein auf Diffusion angewiesen ist, kann ein solcher Tumor eine Größe von wenigen Millimetern nicht überschreiten. Es sterben in diesem Ruhestadium, das mehrere Jahre andauern kann, genauso viele Zellen ab wie neue gebildet werden (Folkman und Haudenschild, 1980).

1.4.2 Invasiver Tumor Erst wenn der Tumor vaskularisiert, kann sich diese Ansammlung von ruhenden Tumorzellen in ein bösartiges, schnell wachsendes Geschwulst verwandeln. Dies geschieht, indem die Tumorzellen Tumor-Angiogenese-Faktoren (TAF) freisetzen, die nahegelegene Blutgefäße zur Bildung neuer Kapillaren anregen – ein Prozess der Angiogenese genannt wird. Wie diese Gefäßneubildung durch die Tumorzellen induziert wird, ist noch nicht völlig verstanden (Griffioen und Molema, 2000). Die Tumoren scheinen das Gleichgewicht von AngiogeneseInduktoren und -Inhibitoren zu verändern (Hanahan und Weinberg, 2000). Zum einen ist bekannt, daß Sauerstoffmangel (Hypoxie) zu Gefäßneubildung führen kann; zum anderen wird berichtet, dass bestimmte genetische Veränderungen in den Tumorzellen Angiogenese induzieren können (Rak et al., 1995). So kann beispielsweise eine Inaktivierung des Tumorsuppressors TP53 die antiangiogene Komponente Thrombospondin herunterregulieren (Dameron et al., 1994); und mutierte Ras-Onkogene sind in der Lage, die proangiogenen Faktoren TGF-α, TGF-β und VEGF hochzuregulieren (Rak et al., 1995; Okada et al., 1998). Die neuen Kapillaren wachsen bei diesem Prozess auf den Tumor zu und dringen schließlich in die Tumorzellkolonie ein (Folkman, 1985). Diese Vaskularisierung eines Tumors ermöglicht infolge der so gewährleisteten guten Versorgung eine höhere Zellteilungsrate und beschleunigt so die Tumorprogression. Der Tumor kann in das benachbarte Gewebe einwachsen und es dadurch zerstören (Folkman, 1985). Nur ein solcher vaskularisierter Tumor ist bösartig und besitzt die Fähigkeit, Metastasen zu bilden, denn der Durchbruch eines Tumors durch die Basalmembran setzt eine Vaskularisierung des Tumors

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voraus (Folkman, 1985). Ohne Vaskularisierung wäre eine Bildung makroskopischer Tumore nicht möglich (Hanahan und Weinberg, 2000); daher werden bei einigen Tumorarten bereits Angiogenese-Hemmer als Therapie eingesetzt.

1.5 Apoptose und Nekrose von Tumorzellen 1.5.1 Hypoxie und Zelltod im Tumorgewebe Die Fähigkeit von Tumorzellen zum ungehinderten Wachstum wird nicht nur durch die Rate der Zellproliferation determiniert, sondern auch durch die Rate des Zelltodes. Im Falle eines In situ Karzinoms besitzt ein Tumor noch keine eigene Gefäßversorgung, so dass er auf die Versorgung über das bereits bestehende Blutgefäßsystem angewiesen ist (1.4.1). Da dies bei zunehmender Größe des Tumors nur über Diffusion geschehen kann, resultiert in vielen Regionen des Tumorgewebes Sauerstoffmangel (Hypoxie) und Nährstoffmangel, die Zelltod in Form von Apoptose oder Nekrose bewirken (Graeber et al., 1996). Aber auch bei bereits vaskularisierten Tumoren tritt häufig Sauerstoffmangel auf. Es konnte gezeigt werden, dass bei transformierten Zellen durch Hypoxie das Apoptose-Programm ausgelöst wird.

1.5.2 Apoptose-Resistenz und Nekrose im malignen Tumor Bei einer weiteren Anhäufung genetischer Veränderungen, wie beispielsweise Mutationen im Gen des Tumorsuppressors TP53, zeigt sich allerdings eine Reduktion dieses hypoxieinduzierten Zelltodes (Graeber et al., 1996). Diese Suppression des apoptotischen Zelltodes wird durch Mutationen in regulatorischen Onkogenen und in Genen der Sensoren und Effektoren der Apoptose-Maschinerie verursacht. Beispiele hierfür sind die Gene von Bcl-2, c-myc und TP53 (Lipponen, 1999). Durch Veränderungen in einer oder mehrerer dieser apoptotischen Sensoren und Effektoren tritt eine Resistenz gegen Apoptose ein, die man häufig in Tumorgeweben beobachtet, so dass die entarteten Zellen trotz ihrer schwerwiegenden Schäden ungehindert proliferieren können. Diese schnell wachsenden Tumore weisen fast keine apoptotischen Zellen mehr auf (Symonds et al., 1994), dagegen wird aber häufiger nekrotischer Zelltod beobachtet (Churg et al., 2000).

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1.5.3 Chemotherapie und Bestrahlung Bei der Chemotherapie von Tumorerkrankungen wird apoptotischer Zelltod der Krebszellen ausgelöst (Cotter et al., 1990), und zwar zum einen über eine Induktion der Expression sogenannter Todesrezeptor-Liganden (z.B. Fas-Ligand; Nagata 1996, 1997) und zum anderen über eine Induktion einer Cytochrom C-Ausschüttung aus den Mitochondrien (Kaufmann und Earnshaw, 2000). Auch die Bestrahlung führt zu apoptotischem Zelltod der Tumorzellen (Ross, 1999). Allerdings wird die Sensitivität der Tumorzellen gegenüber Chemotherapie bzw. Bestrahlungstherapie beispielsweise durch Mutationen in TP53 beeinflusst (Rosen et al., 1999; Pirollo et al., 2000).

1.6 Ist eine Freisetzung von DNA ins Blutplasma möglich? Der Inhalt von Zellen, die apoptotisch zugrunde gehen, wird in apoptotische Vesikel verpackt, die dann von den Makrophagen aufgenommen und abgebaut werden (Ren und Savill, 1998). Auch der Zellinhalt nekrotischer Zellen wird von den Phagozyten versorgt (Green und Beere, 2000). Somit ist eine Freisetzung der DNA und der anderen Zellbestandteile in die Blutzirkulation eigentlich unwahrscheinlich. Zudem gibt es im Blutplasma DNasen, die die DNA abbauen und katabolisieren (Napirei et al., 2000). Eine Freisetzung von DNA und vor allem deren Anwesenheit und Detektion im Blutplasma ist also eigentlich nur schwer vorstellbar.

1.7 DNA im Plasma von Tumorpatienten Dennoch wurde bereits vor mehr als 50 Jahren frei zirkulierende DNA im Blutplasma von gesunden Menschen und von Patienten mit unterschiedlicher Krankheiten wie rheumatischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen entdeckt (Mandel und Métais, 1948).

1.7.1 Tumorpatienten weisen erhöhte Mengen an DNA im Plasma auf Einige Jahre später entdeckte Leon, dass Tumorpatienten im Vergleich gesunden Personen erhöhte Mengen an DNA im Serum aufweisen (Leon et al., 1975). Die Quantifizierung dieser freien DNA im Serum von Patienten verschiedener Tumorarten und gesunder Menschen über die indirekte Methode des Radioimmunassay mit anti-DNA-Antikörpern ergab, dass gesunde Kontrollpersonen im Mittel 13 ng DNA/ml Serum aufweisen, während es bei Tumorpatienten 180 ng/ml – also etwa zehnmal so viel – waren.

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Es wurde zwar keine Korrelation zwischen den zirkulierenden DNA-Mengen und der Größe oder der Art des Primärtumors entdeckt, aber Patienten mit Metastasen wiesen signifikant höhere Mengen an DNA im Serum auf (Leon et al., 1977a). Andere Studien mit Lungenkrebs-Patienten konnten zeigen, dass Patienten mit fortgeschrittener Tumorerkrankung höhere Plasma-DNA Spiegel aufweisen (Maebo, 1990; Fournié et al., 1995) und dass Patienten mit maligner gastrointestinaler Erkrankung höhere DNA-Spiegel aufweisen als Patienten mit einer gutartigen Erkrankung (Shapiro et al., 1983).

1.7.2 Tumor-DNA im Plasma von Tumorpatienten Analysen der biophysikalischen Eigenschaften dieser freien DNA bei Tumorpatienten zeigten, dass ein großer Teil der DNA aus den Tumorzellen stammt (Beljanski et al., 1981; Stroun et al., 1989). Zudem wurden in der Plasma-DNA von Patienten diverse Mutationen in Onkogenen und Tumorsuppressor-Genen gefunden, die aus dem Tumorgewebe stammen. Beispielsweise zeigten sich K-ras Mutationen in der Plasma-DNA von Pankreas-Karzinom-Patienten (Sorenson et al., 1994), oder Mikrosatelliten-Veränderungen im Plasma von Patienten mit Kopf-Hals-, Lungenoder Nieren-Karzinomen (Nawroz et al., 1996; Chen et al., 1996; Goessl et al., 1998). Mutationen und andere genetische Veränderungen wurden nicht nur in Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung gefunden, sondern auch in Patienten, die sich in einem frühen Stadium der Krankheit befinden (Anker et al., 1997; de Kok et al., 1997). Allerdings wurden in einer Studie mit Pankreas-Karzinom-Patienten deutlich mehr Mutationen in Patienten mit fortgeschrittener Tumorerkrankung detektiert (Yamada et al., 1998). Die genannten Daten belegen also, dass ein gewisser Anteil der DNA im Plasma von Tumorpatienten aus sterbenden Tumorzellen stammt.

1.7.3 Ursprung der Plasma-DNA Es ist umstritten, ob die Tumor-DNA die Hauptkomponente der DNA im Plasma von Tumorpatienten darstellt, da einige Gruppen nur dann in der Lage sind Mutationen zu detektieren, wenn sie hoch sensitive Methoden für die Mutationssuche verwenden (Sorenson et al., 1994; Anker et al., 1997, 1999), während andere aber Mikrosatelliten-Veränderungen im Plasma detektieren können, was nur dann möglich ist, wenn keine DNA aus normalen Zellen das Ergebnis maskiert (Nawroz et al., 1996; Chen et al., 1996; Sanchez-Cespedes et al., 1998; Goessl et al., 1998). Jedoch war in allen bisherigen Studien stets ein gewisser Anteil an Wildtyp-DNA im Plasma vorhanden (Anker et al., 1999). Aus welchen Zellen diese Nicht-Tumor-DNA

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stammt, bzw. wie groß der Anteil der Tumor-DNA an der gesamten Plasma-DNA wirklich ist, ist bisher nicht genau analysiert worden.

1.7.4 Mechanismus der Freisetzung der DNA ins Blut Ebensowenig wie der zelluläre Ursprung der DNA ist bisher der Mechanismus untersucht worden, über den die DNA in den Blutkreislauf gelangt. Die Hypothesen reichen von aktiver DNA-Freisetzung von Lymphozyten oder Tumorzellen bis hin zu Apoptose oder Nekrose der Tumorzellen (Anker et al., 1999), es wurden bisher aber keine Studien durchgeführt, um diese Fragen zu klären.

Zielsetzung

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2 Zielsetzung Seit mehr als 50 Jahren ist bekannt, dass beim Menschen frei zirkulierende DNA im Blutplasma vorkommt. Seitdem sind viele Arbeiten über dieses Thema erschienen, die sich zumeist mit der Suche nach Mutationen in der Plasma-DNA von Tumorpatienten beschäftigen. Tatsächlich wurden bei verschiedenen Tumorarten bereits Mutationen oder andere genetische Veränderungen in der freien DNA detektiert, die identisch mit denjenigen des Tumorgewebes waren. Es sind außerdem Studien erschienen, die versucht haben, die Menge der Plasma-DNA oder eine Detektion von Mutationen mit der klinischen Situation von Tumorpatienten zu korrelieren. Bis heute sind jedoch kaum Untersuchungen zum Ursprung dieser frei zirkulierenden DNA gemacht worden. Zudem fehlen Studien, die sich mit einer genaueren Charakterisierung dieser DNA befassen. Daher sollten in der vorliegenden Arbeit an einer Gruppe unterschiedlicher Tumorpatienten Fragen zur Herkunft der DNA beantwortet werden. Zunächst sollte die PlasmaDNA-Menge der Patienten mittels quantitativer PCR ermittelt werden. Auf dieser Basis sollte dann eine Suche nach Mutationen im Plasma bzw. im Tumorgewebe erfolgen und eine nähere Charakterisierung der DNA durchgeführt werden. Neben der Studie mit unterschiedlichen Tumorpatienten sollte in vitro und in vivo untersucht werden, ob eine Freisetzung von DNA aus sterbenden Zellen überhaupt möglich ist; bzw. ob man freie DNA nach Induktion von Apoptose und Nekrose im Überstand von sterbenden Zellen oder im Blutplasma von Mäusen mit Leberzell-Apoptose bzw. –Nekrose detektieren kann. Im Hinblick darauf war insbesondere die Frage interessant, ob die freie DNA im Plasma von Tumorpatienten aus apoptotischen oder nekrotischen Zellen des Tumorgewebes stammt. An einer Studie mit 28 Brustkrebs-Patientinnen sollte die Frage geklärt werden, ob die Menge an Plasma-DNA bzw. die Menge an Tumor-DNA im Plasma mit der klinischen Situation der Patienten korreliert. Bei diesen Patientinnen, deren Klinik detailliert am Klinikum Konstanz dokumentiert wurde, sollte die Plasma-DNA im Verlauf der Therapie beobachtet werden. Neben den Arbeiten an Tumorpatienten sollte auch die Frage der Herkunft der DNA im Plasma von Gesunden geklärt werden. Dafür sollte die DNA von mehreren Frauen im Verlauf des weiblichen Zyklus untersucht werden, um Anhaltspunkte für die Herkunft der DNA zu erhalten. Zudem sollte der Effekt von Östrogenexposition auf die Menge an DNA im Plasma von Frauen untersucht werden.

Material und Methoden

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3 Material und Methoden 3.1 Material Alle

verwendeten

organischen

und

anorganischen

Chemikalien

hatten

analytischen

Reinheitsgrad und wurden von den Firmen Fluka, Gibco, Merck, Riedel de Haën, Roth, Serva und Sigma bezogen. Die CpG-Methylierung wurde mit der SssI Methylase von der Firma BioLabs durchgeführt. Blutproben wurden in EDTA-Monovetten der Firma Sarstedt gesammelt. Lösungen und Puffer für die nachstehenden Methoden wurden nach Sambrook et al. (1989) angesetzt. H2O bedeutet im Folgenden immer doppelt destilliertes Wasser, soweit nicht anders erwähnt.

3.1.1 Tumorpatienten und Kontrollpersonen Die Mehrzahl der Untersuchungen dieser Arbeit wurden an 30 Patienten mit verschiedenen Tumoren durchgeführt, die von Prof. Müller-Esch und Dr. Hardt, Zentrum für Innere Medizin, Klinikum Konstanz bereitgestellt wurden. Die 28 Patientinnen der Brustkrebs-Studie wurden von Prof. Czekelius, Frauenklinik, Klinikum Konstanz zur Verfügung gestellt. Das Tumorgewebe der Patienten stammte von Prof. Lesch und Dr. Kind, Pathologie, und von Prof. Roth, Chirurgie, Klinikum Konstanz, und wurde bei Resektionen entnommen. Für die Studie wurden 14 gesunde Kontrollpersonen der AG Prof. Knippers, verwendet. Das Kontrollkollektiv von 54 gesunden Frauen für die Brustkrebs-Studie stammte aus der Praxis von Prof. Hesch, Konstanz. Den Personen wurde je ca. 9 ml Blut abgenommen. Alle Patienten und Kontrollpersonen wurden vor der Blutabnahme über die folgenden Untersuchungen der Plasma-DNA informiert. Die Studie wurde von der Ethik-Kommission der Universität Konstanz genehmigt.

3.1.2 Mäuse Für die in vivo Versuche wurden pathogen-freie männliche BALB/c Mäuse (ca. 25g) von der Tierforschungsanlage der Universität Konstanz verwendet. Alle Tiere wurden entsprechend den NIH Richtlinien und unter konstanten Bedingungen von 22°C, 55% Luftfeuchtigkeit und einem konstanten Tag/Nacht Zyklus von 12 h gehalten.

Material und Methoden

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3.2 Methoden Alle verwendeten Methoden werden, sofern nicht beschrieben, nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Die PCR-Amplikation erfolgt, wenn nicht anders angegeben, mit Ready To Go PCR Beads der Firma Pharmacia in einem Gesamtvolumen von 25 µl; für die PCR-Reaktion werden je 25 pmol von jedem Primer zugesetzt.

3.2.1 Isolierung von Plasma Peripheres, venöses Blut der Kontrollpersonen und Tumorpatienten wird in Monovetten mit EDTA als Antikoagulans gesammelt. Die Trennung des Blutplasmas von den Blutzellen erfolgt durch einen 20 minütigen Zentrifugations-Schritt bei 3000 rpm. Das Plasma wird mit Hilfe einer Plastik-Pasteurpipette vorsichtig abgenommen ohne die zelluläre Fraktion zu berühren. Die Plasmaproben werden bis zur DNA-Isolierung bei – 20° C aufbewahrt.

3.2.2 DNA-Isolierung aus Patientenproben 3.2.2.1 Plasmaproben Für die DNA-Aufreinigung aus Plasma wird der QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen (Hilden; Deutschland) verwendet. Dafür wird die DNA aus 2 bis 10 ml Plasma nach dem Protokoll für Blut- und Körperflüssigkeiten durch wiederholte Zentrifugationsschritte an eine Säule gebunden. Die Elution der DNA erfolgt mit 50 µl Elutionspuffer (AE). Die gewonnene DNA wird aliquotiert bei -20° C aufbewahrt. 3.2.2.2 Gewebeproben Das Tumorgewebe der Krebspatienten wird bei der Resektion gesammelt und in 10% gepuffertem Formalin fixiert. Da Formalin durch die Quervernetzung der Proteine an die DNA die PCR inhibiert, erfolgt ein Waschschritt von 3 h in PBS, um das Formalin zu entfernen. Sodann wird die DNA des Gewebes mit Hilfe des DNeasy Tissue Kit (Qiagen) isoliert. Die Elution erfolgt in 100 µl Elutionspuffer (AE). Die gewonnene DNA wird bis zur Verwendung bei –20° C aufbewahrt.

Material und Methoden

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3.2.3 Quantifizierung der Plasma-DNA 3.2.3.1 Kompetitive PCR Die Quantifizierung der DNA im Plasma von Kontrollpersonen und Tumorpatienten erfolgt zum Teil mittels kompetitiver PCR nach der Methode von Diviacco et al. (1992). Dabei wird ein Fragment des menschlichen LAMB2 Genlokus amplifiziert (Region B48; Biamonti et al., 1992), als typisches Beispiel für ein Einzelkopie-Gen. Die Herstellung des Kompetitor-Moleküls erfolgt mit Hilfe von drei PCR-Reaktionen, bei denen ein 20 bp langes Insert in ein DNA-Fragment eingebracht wird, das dieselben Primererkennungssequenzen besitzt wie die genomische DNA in dieser Region (Diviacco et al., 1992). Die Konzentration der Kompetitor-Moleküle wird nach Entfernung der PCR-Primer und der freien Nukleotide durch Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen über die optische Dichte bei 260 nm bestimmt. In der darauffolgenden kompetitiven PCR werden steigende Mengen an Kompetitor-Molekülen mit einer konstanten Menge aufgereinigter Plasma-DNA koamplifiziert. Für die Amplifikation der beiden Templates werden zwei neu entworfene, eingerückte Primer verwendet: 5’-TCCAATGATTTGTAATATAC-3’ (Q-EF) und 5’-ATCTTTCTTAGACATCCGCTT-3’ (Q-ER). Die PCR erfolgt in 40 Zyklen: 94°C 1 min, 52°C 1 min, 72°C 1 min. Nach der Amplifikation werden die beiden Produkte von 153 bp und 173 bp, die dem genomischen bzw. Kompetitor-Template entsprechen, auf einem 6% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert. Eine gleiche Bandendicke der beiden Produkte läßt den Schluss zu, dass in diesem Ansatz zu Beginn gleiche Mengen an Kompetitor-Molekülen - wie an genomischem Template vorlagen. Die Plasma-DNA-Konzentration kann so über die ermittelten genomischen Einheiten errechnet werden. Eine genomische Einheit entspricht dabei 330 ng DNA. Die Ergebnisse der kompetitiven PCR konnten mit Hilfe der Quantifizierung über Realtime-PCR bestätigt werden. 3.2.3.2 Realtime-PCR Die Quantifizierung der Plasma-DNA über Realtime-PCR wird im LightCycler-Gerät der Firma Roche Diagnostics durchgeführt. Für die Quantifizierung von Plasma-DNA wird der LightCycler Control Kit DNA verwendet, bei dem ein 110 bp großes Fragment des menschlichen β-GlobinGens amplifiziert wird. Das Produkt wird während der Realtime-PCR durch Fluoreszenz detektiert, indem man entweder den doppelstrang-bindenden Farbstoff SYBR Green I oder ein spezifisches Paar Hybridisierungssonden (LCRed640) des Kits verwendet. In die Realtime-PCR werden bei einem Gesamtvolumen von 20 µl jeweils 4µl Plasma-DNA eingesetzt. Als Standard

Material und Methoden

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wird eine Verdünnungsreihe von menschlicher genomischer DNA aus dem Kit bei jedem PCRLauf gleichzeitig mit den Plasma-DNA-Proben amplifiziert. Die PCR erfolgt in einem Gesamtvolumen von 10 µl mit jeweils 2 µl der gewonnenen Plasma-DNA-Lösung. Das PCRProgramm mit den jeweiligen Temperaturen der einzelnen Zyklen wird dem Vorschlag aus dem Kit entnommen. Die Auswertung der Quantifizierung erfolgt mit Hilfe der Software des LightCyclers, der die Konzentration der Standards gegen den Schnittpunkt ihrer logarithmischen Fluoreszenzkurven mit einer Basislinie (Crossing Point) aufträgt. Mit Hilfe dieser Standardgerade berechnet die Software des Gerätes die Anzahl der genomischen Einheiten bzw. der eingesetzten Plasma-DNA.

3.2.4 Detektion von Mutationen 3.2.4.1 Mutationen in TP53 Die Suche nach Mutationen im TP53 Tumorsuppressor-Gen erfolgt über eine Sequenzierung des gesamten Hotspotbereiches, der sich von Codon 126 bis 307, also von Exon 5 bis einschließlich Exon 8 erstreckt. Dafür wird die aufgereinigte Plasma- bzw. Tumor-DNA der Patienten in 3 PCR-Ansätzen mit drei Primerpaaren amplifiziert: 5’-TATCTGTTCACTTGTGCCCT-3’ (p53-5F) und 5’-TGACAACCACCCTTAACCCCT-3’ (p53-5R) für die Amplifikation der Exons 5 und 6, 5’-TGCTTGCCACAGGTCTCCCCAA-3’ (p53-7F) und 5’-AGAGGCTGGGGCACAGCA-3’ (p53-7R) für Exon 7 und 5’-TGATTTCCTTACTGCCTCTT-3’ (p53-8F) und 5’-AGGCATAACTGCACCCTTGGT-3’ (p53-8R) für Exon 8. Es werden je 35 PCR-Zyklen durchlaufen: 94°C 1 min, 62°C 1 min, 72°C 1 min (Exon 5, 6) bzw. 94°C 18 s, 53°C 12 s, 72°C 30 s (Exons 7 und 8). Die PCR-Produkte mit den Größen 483 bp, 222 bp und 235 bp werden vor der Sequenzreaktion mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt. Die Sequenzreaktion wird mit Hilfe des Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle Sequencing Kit (Pharmacia) durchgeführt. Es werden jeweils etwa 100 ng des aufgereinigten PCR-Produktes eingesetzt. Die verwendeten Sequenzierungsprimer sind am 5’-Ende mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Cy5 markiert: 5’-TGCCCTGACTTTCAACTC-3’ und 5’-TCCTCCCAGAGACCCCAGTT-3’ (für Exons 5 und 6), 5’-TCCCCAAGGCGCACTGGCCT-3’ (Exon 7) und 5’-TCTTGCTTCTCTTTTCCT-3’ (Exon 8). Die Sequenzierung findet in einem automatischen Sequenzierer (ALFexpress) der Firma Pharmacia statt.

Material und Methoden

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3.2.4.2 K-ras-Mutationen Für die Suche nach Mutationen im K-ras (KRAS) Onkogen werden zwei Strategien verwendet: Direkte Sequenzierung von PCR-Produkten und MASA (mutant allele specific amplification) der aufgereinigten Plasma- bzw. Tumor-DNA. Zunächst werden die Exons 1 und 2 von KRAS mit den folgenden Primern amplifiziert: 5’-GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT-3’ (Kras1F) und 5’-CTATTGTTGGATCATATTCGTCC-3’ (Kras-1R) für Exon 1 und 5’-AGTAATTGATGGAGAAACCT-3’ (Kras-2F) und 5’-AACCCACCTATAATGGTGA-3’ (Kras-2R) für Exon 2. Es werden jeweils 35 PCR-Zylen durchlaufen (94°C 18 s, 53°C 12 s, 72°C 30 s). Die Produkte haben die Größen 107 bp bzw. 166 bp. Für die Sequenzreaktion werden die beiden Produkte mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt. Es werden jeweils etwa 100 ng des aufgereinigten PCR-Produktes in jede Sequenzreaktion eingesetzt. Die verwendeten Sequenzierungsprimer sind am 5’-Ende mit Cy5 fluoreszenzmarkiert: 5’-TGCCCTGACTTTCAACTC-3’ und 5’-TCCTCCCAGAGACCCCAGTT-3’ (für die Exons 5 und 6), 5’-TCCCCAAGGCGCACTGGCCT-3’ (Exon 7) und 5’-TCTTGCTTCTCTTTTCCT-3’ (Exon 8). Die Sequenzanalyse findet in einem automatischen Sequenzierer (ALFexpress) der Firma Pharmacia statt. Bei der MASA-Methode, bei der mit Hilfe von mutationsspezifischen Primern selektiv mutierte DNA amplifiziert wird, wird das Codon 12 von KRAS auf Mutationen an Position 1 und 2 untersucht (Anker et al., 1997). Das PCR-Produkt von KRAS Exon 1 wird 1:106 verdünnt. Von dieser Verdünnung werden je 5µl für die zweite PCR eingesetzt: diese besteht aus 7 Ansätzen, die sich nur in dem mutationsspezifischen Vorwärtsprimer unterscheiden: 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG-3’ (MASA-Wt), 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ (MASA-1A), 5’ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3’

(MASA-1T),

5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’

(MASA-1C), 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3’ (MASA-2A), 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3’ (MASA-2T) und 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’ (MASA-2C). Als Rückwärtsprimer wird bei jedem der mutationsspezifischen Ansätze Kras-1R eingesetzt (siehe oben). Die PCR besteht aus 35 Zyklen: 94°C 30 s, 65°C 90 s, 72°C 30 s. Die Produkte weisen eine Größe von 95 bp auf und werden nach Auftrennung auf 6% Polyacrylamid-Gelen und Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.

Material und Methoden

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3.2.5 Analyse des Methylierungsstatus von CDKN2A 3.2.5.1 CpG-Methylierung der Positivkontrolle Eine

Positivkontrolle

mit

Hypermethylierung

im

Promotor-Bereich

des

CDKN2A

Tumorsuppressor-Gens wird hergestellt, indem DNA von menschlichen Fibroblastenzellen (normal human dermal fibroblast cells, NHDF) in vitro mit der CpG Methylase der Firma New England BioLabs methyliert wird. Diese Methylase methyliert alle Cytosine in CpGDinukleotiden in der gesamten behandelten DNA. 3.2.5.2 Desaminierung der DNA durch Na-Bisulfit Der

Nachweis

hypermethylierter

CpG-Inseln

in

der

Promoterregion

des

CDKN2A

Tumorsuppressor-Gens erfolgt durch methylierungs-spezifische PCR nach Desaminierung der Plasma-DNA bzw. der Tumor-DNA durch Na-Bisulfit. Bei dieser Prozedur werden unmethylierte Cytosinreste zu Uracil desaminiert, methylierte Cytosine dagegen werden nicht desaminiert und bleiben Cytosine. Dafür wird der CpGenome DNA Modification Kit der Firma Intergen verwendet. Für die Untersuchungen im Laufe der Brustkrebsstudie wird die Desaminierung nach dem Rezept von Herman et al. (1996a) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: es wird zu der zu modifizierenden DNA 1 µg Fremd-DNA aus E.coli zugegeben, die Entfernung des Bisulfits nach der Inkubation bei 50°C über Nacht erfolgt mit Hilfe des QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen und die Elution des DNA-Pellets nach Vollendung der Desaminierung erfolgt mit 50 µl 10 mM Tris pH 8. 3.2.5.3 Methylierungs-spezifische PCR Die Plasma-DNA bzw. die DNA aus Tumorgewebe wird nach erfolgter Desaminierung mit Hilfe einer methylierungs-spezifischen PCR nach der Methode von Herman et al. (1996a) in zwei parallelen Ansätzen mit den beiden Primerpaaren p16-U und p16-M (Herman et al., 1996a) auf Hypermethylierung der Promotorregion des CDKN2A-Gens untersucht. Bei der BrustkrebsStudie wird für die methylierte Reaktion ein anderes Primerpaar verwendet: 5’-GGTGGGGCGGATCGC-3’ (P16-MF) und 5’-CCGAACCGCGACCGTAA-3’ (P16-MR). Die PCR verläuft in 35 Zyklen (95°C 45 s, 65°C 45 s, 72°C 60 s). Die Produkte mit den Größen 151 bp (unmethyliertes Allel) bzw. 150 bp (methyliertes Allel) werden nach Elektrophorese auf einem 6% Polyacrylamid-Gel mit Ethidiumbromid unter UV sichtbar gemacht.

Material und Methoden

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3.2.6 Quantifizierung von Tumor-DNA im Plasma Bei den Tumorpatienten, die eine Hypermethylierung im Promotor-Bereich von CDKN2A im Tumorgewebe aufweisen, kann mit Hilfe einer entwickelten methylierungs-spezifischen Realtime-PCR der Anteil der Tumor-DNA an der gesamten DNA im Plasma bestimmt werden. 3.2.6.1 Plasma-DNA-Aufreinigung und Desaminierung der DNA Die DNA der Patienten wird aus dem Plasma isoliert wie unter 3.2.2.1 beschrieben. Als Kontrolle für hypermethylierte CDKN2A-Sequenzen wurde DNA von Raji-Zellen verwendet (Burkitt-Lymphom-Zellen) bzw. in vitro methylierte DNA (3.2.5.1). Die Desaminierung der unmethylierten Cytosinreste erfolgt mit Natrium-Bisulfit, wie vor der normalen methylierungsspezifischen PCR (3.2.5.3). 3.2.6.2 Quantitative methylierungs-spezifische PCR Das Verhältnis zwischen DNA mit unmethylierter und hypermethylierter CDKN2A-Promotorregion im Plasma von Tumorpatienten wird mit methylierungs-spezifischer Quantifizierung im LightCycler System der Firma Roche Diagnostics durchgeführt. Für die Amplifizierung der unmethylierten DNA werden die Primer von Herman et al. (1996a) verwendet. Für die hypermethylierte p16-Region wird das folgende Set von PCR-Primern verwendet: 5’-GGTGGGGCGGATCGC-3’ und 5’-CCGAACCGCGACCGTAA-3’. Für die Detektion der RealtimePCR-Produkte werden LC-Red640 markierte Hybridisierungssonden verwendet, die ebenfalls methylierungs-spezifisch sind: Für die unmethylierte Reaktion 5’-CTCCCCACCACCCACTACCTACTCT-3’ (p16N FL) und 5’-CCCCTCTCCACAACCACCAAACAC-3’ (p16N LC), für die methylierte Reaktion 5’-CCGCCGCCCGCTACCTACTCT-3’ (p16M FL) und 5’-CCTCTCCGCAACCGCCGAAC-3’ (p16M LC). Die PCR besteht aus 40 Zyklen (Denaturierung von 10 s bei 95°C, Annealing von 10 s bei 65°C bzw. 67°C, Extension von 10 s bei 72°C) und wird mit dem LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit von Roche Diagnostics durchgeführt. Es werden jeweils 4 µl desaminierte Plasma-DNA in jedem PCR-Ansatz eingesetzt bei einem Gesamtvolumen von 20 µl. Für die Untersuchung der Proben der Brustkrebsstudie wird jeweils nur der halbe Ansatz verwendet, also 2 µl Plasma-DNA bei einem Gesamtvolumen von 10 µl. Als Standards für die Quantifizierung der methylierten und unmethylierten CDKN2A-Region werden jeweils angegebene Mengen von desaminierter DNA aus Raji-Zellen (3.2.5.1) bzw. DNA aus normalen menschlichen Lymphozyten verwendet (3.2.6.1).

Material und Methoden

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3.2.7 Nachweis von T-Lymphozyten-DNA im Plasma Die Anwesenheit von T-Lymphozyten-DNA in den Plasmaproben der Tumorpatienten wird durch PCR-Amplifikation einer Region der beta-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) untersucht, die ein somatisches Rearrangement durch VDJ-Rekombination aufweist (Zemlin et al., 1998). Für die Amplifikation wird eine Mischung aus den beiden Vorwärtsprimern (Vßz5 und Vßz6) und einem Rückwärtsprimer (Jß1i) benutzt (Zemlin et al., 1998). Dies führt zur Amplifikation von DNA-Fragmenten definierter Größen (907, 767 und 155 bp), je nach rearrangiertem JßElement. DNA von Jurkat T-Lymphozyten, HeLa-Zellen und menschlichen Lymphozyten werden als interne PCR-Kontrollen verwendet. Die Germline-Konfiguration der TCR-Region, die alle Nicht-T-Lymphozyten aufweisen, wird ebenfalls mit spezifischen Primern amplifiziert: 5’-AATGATTCAACTCTACGGGA-3’ (G1F) und 5’-TGAGTCCTCCACTTGTGAG-3’ (G1R). Bei der PCR ergibt sich ein Produkt von 250 bp. Bei beiden PCR-Reaktionen werden jeweils 100 ng DNA eingesetzt. Die PCR-Produkte werden mittels 6% Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert. 3.2.7.1 Nachweis von Endothelzell-DNA im Plasma Um die Anwesenheit von Endothelzell-DNA im Plasma nachzuweisen, wird eine methylierungsspezifische PCR-Methode etabliert. Nach Desaminierung der gereinigten Plasma-DNA durch Na-Bisulfit (CpGenome Modification Kit; Intergene; 3.2.5.2) wird eine methylierungsspezifische PCR in der Promotorregion des Selectin E Gens (SELE) durchgeführt. Es werden zwei verschiedene Sets von Primern verwendet, die die unmethylierte von der hypermethylierten SELE Promotorregion unterscheiden. Für die Amplifikation der unmethylierten Allele werden die folgenden Primer verwendet: 5’-ATTTTAAGTATTGTGGATATTTTTG-3’ und 5’-CAAAAACAACTAAACACTACTTCA-3’; für die Amplifikation der hypermethylierten Allele: 5’TTTAAGTATCGTGGATATTTTCG-3’ und 5’-AAAAACAACTAAACACTACTTCG-3’. Die sequenzspezifischen Primer bedecken drei CpG-Inseln, von denen zwei am 3`-Ende der Primer liegen. Es werden 35 PCR-Zyklen durchgeführt (1 min 94°C, 1 min 50°C, und 1 min 72°C). DNA von HeLa- bzw. HL60-Zellen und menschlichen Endothelzellen (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) dienen als Negativ- bzw. Positivkontrollen. Die resultierenden PCRProdukte mit einer Größe von 151 bp werden nach 6% Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert.

Material und Methoden

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3.2.8 Fragmentlängen-Bestimmung Die Größenverteilung der Plasma-DNA-Fragmente wird untersucht, indem die DNA entweder markiert oder unmarkiert gelelektrophoretisch aufgetrennt und dann visualisiert wird. 3.2.8.1 Radioaktive Endmarkierung der Plasma-DNA einer Kontrollperson Für die Bestimmung der Fragmente der Plasma-DNA einer gesunden Kontrollperson wird zunächst die freie DNA aus 600 µl Plasma isoliert (3.2.2). Als Kontrolle wird genomische, zelluläre DNA derselben Person verwendet. Die DNA wird zunächst über Nacht bei 37°C dephosphoryliert, und nach einer Phenol-Chloroform-Extraktion über Nacht gefällt. Das Pellet wird in 24 µl H2O gelöst. Für die Phosphorylierung der 5`-Enden wird die gesamte DNA in einem Endvolumen von 30 µl mit γ-ATP (P32) und T4 Polynukleotid-Kinase (8 Units/µl) versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Die freien radioaktiven Nukleotide werden durch Zentrifugation über Sephadex-Säulen entfernt. Die Analyse der Fragmente erfolgt über 1% Agarose-Gelelektrophorese und darauffolgende Autoradiographie. 3.2.8.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA von Tumorpatienten Die Bestimmung der Fragmentlängen von Plasma-DNA aus Tumorpatienten erfolgt ohne vorherige Markierung. 20 bis 30 µ l der Plasma-DNA werden nach der Extraktion (3.2.2) auf einem 6% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Die Visualisierung der Fragmente erfolgt unter UV nach Färbung mit Ethidiumbromid.

3.2.9 In vitro Apoptose und Nekrose von Jurkat-T-Lymphozyten Die Induktion von Apoptose und Nekrose in vitro erfolgt an Jurkat T-Lymphozyten. Die Zellen werden in RPMI1640-Medium mit 10% fetalem Kälberserum bei 37°C gezogen und werden alle 3 Tage durch 5-fache Verdünnung in frisches Medium umgesetzt. Vor der Induktion von Apoptose und Nekrose werden die Zellen durch Zentrifugation bei 190 g für 5 min pelletiert und zweimal in serumfreiem Medium (PBS pH 7,4) gewaschen. Nach dem zweiten Waschschritt werden die Zellen in serumfreiem Medium mit Zusatz von 2 mM Pyruvat resuspendiert. Jeder Ansatz enthält ca. 2 x 106 Zellen in 1 ml Volumen. Apoptose wird durch 1,2 µM Staurosporin ausgelöst; Nekrose durch 2,5 µM Oligomycin und 1,2 µM Staurosporin (Leist et al., 1997). Zunächst werden die Zellen in PBS mit Pyruvat 30 min bei 37°C inkubiert, dann erfolgt die Zugabe von Oligomycin (Nekrose-Ansätze). Nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 min

Material und Methoden

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erfolgt dann die Zugabe von Staurosporin. Zu verschiedenen Zeiten nach Zugabe von Staurosporin werden die Zellen abgeschabt. Sodann wird der Überstand durch einen Zentrifugationsschritt bei 13 000 g für 2 min von den Zellen getrennt. 3.2.9.1 Isolierung der DNA aus dem Überstand Die freigesetzte DNA der Überstände wird mit Hilfe des QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen aufgereinigt wie die DNA aus Plasma (3.2.2). Die Elution erfolgt in je 60 µl Elutionspuffer. 3.2.9.2 Quantifizierung der DNA aus dem Überstand Die DNA-Konzentrationen in den verschiedenen Überständen werden mittels kompetitiver PCR quantifiziert (3.2.3.1). In jeden Ansatz werden 5µl der eluierten DNA eingesetzt. 3.2.9.3 Apoptose-Nachweis: SAF-A-Spaltung Die beiden unterschiedlichen Arten des Zelltodes werden bestätigt über Analyse der Spaltung des SAF-A (scaffold attachment factor) Proteins in den Proben, das nur während Apoptose, nicht aber während Nekrose durch die Caspase-3 gespalten wird (Göhring et al., 1997; Kipp et al., 2000). Dafür werden die Proteine der Zellen nach Abnahme des Überstandes für die DNAUntersuchungen nach der Methode von Wessel und Flügge gefällt (Wessel und Flügge, 1984) und über ein 10% SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt (Lämmli, 1970). Nach einem WesternTransfer (Towbin et al., 1979) mit affinitäts-gereinigtem Antikörper und Peroxidasegekoppeltem Sekundär-Antikörper (Sigma) erfolgt der Nachweis des SAF-A Proteins mit ECL (enhanced chemiluminescent detection) der Firma Amersham.

3.2.10 In vivo Apoptose und Nekrose bei Mäusen Die Induktion von Leberzell-Apoptose wird durch intravenöse Injektion von 1 bzw. 2 µg antiCD95 Antikörper (αCD95, Klon Jo-2 der Firma PharMingen) pro Tier erreicht. Die Injektion erfolgt in einem Volumen von 300 µl endotoxin-freier Salzösung mit Zusatz von 0,1% menschlichem Serum-Albumin (Ogasawara et al., 1993; Hentze et al., 2000). Nekrose der Leberzellen wird induziert durch intraperitoneale Injektion von 250 mg/kg Acetaminophen (Firma EGA) in 300 µl endotoxine-freier Saline (Hentze et al., 2000). Nach verschiedenen Zeitpunkten werden die Mäuse durch intravenöse Injektion von 150 mg/kg

Material und Methoden

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Pentobarbital mit Zusatz von 1,2 mg/kg Na-Citrat als Antikoagulans narkotisiert. Durch Herzpunktion wird den Mäusen Blut entnommen. Das Ausmaß des Leberschadens wird durch Messung der Alanin-Aminotransferase (ALT) Aktivität mit einem EPOS 5060 Gerät (Netheler & Hintz) nach der Methode von Bergmeyer ermittelt (1983). 3.2.10.1 Plasma-Gewinnung und DNA-Isolierung Das Plasma der Mäuse wird durch einen Zentrifugations-Schritt (5 min, 14000 g, 4°C) von den Zellen getrennt. Die DNA aus ca. 50 µl Plasma wird mit Hilfe des QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen isoliert. Die Elution erfolgt in 50 µl Elutionspuffer (3.2.2.1). 3.2.10.2 Quantifizierung der Plasma-DNA Die Quantifizierung der ins Plasma freigesetzten DNA erfolgt über Realtime-PCR mit dem LightCycler der Firma Roche Diagnostics. Dabei wird ein Teil des Exons 3 des alpha-AktinGens amplifiziert. Die verwendeten Primer 5’-TGAACATGGCATCATCACC-3’ (Aktin-mouseF) und 5’-CTGGATAGCCACATACATG-3’ (Aktin-mouse-R) ergeben ein Produkt von 199 bp. Die Realtime-Quantifizierung wird mit dem SYBR-Green I Reaktionsmix (Roche Diagnostics) durchgeführt. Es werden jeweils 4 µl der eluierten DNA in jeden PCR-Ansatz eingesetzt. Die PCR wird in 40 PCR-Zyklen durchgeführt (1 s 95°C, 5 s 55°C, und 10 s 72°C). 3.2.10.3 Fragmentlängen-Bestimmung der freigesetzten DNA Die Bestimmung der Fragmentlängen der DNA erfolgt wie unter 3.2.8.2 angegeben, jedoch werden zur Auftrennung der Fragmente 1% Agarose-Gele verwendet.

Ergebnisse

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4 Ergebnisse Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stehen zwei wichtige Fragen: aus welchen Zellen stammt die DNA im Plasma von Tumorpatienten und wie gelangt diese DNA in den Blutkreislauf? Die Frage nach dem zellulären Ursprung der DNA im Plasma sollte durch eine Untersuchung der Plasma-DNA verschiedener Tumorpatienten erfolgen. Dafür wurde zunächst die Plasma-DNA von 30 Tumorpatienten unterschiedlicher Krebsarten analysiert (4.1 bis 4.6), und darauf aufbauend die DNA im Plasma von 28 Brustkrebs-Patientinnen (4.9). Die Frage nach dem Mechanismus der Freisetzung dieser DNA in den Blutkreislauf sollte an in vitro und in vivo Modellen beantwortet werden (4.7 bzw. 4.8). Im letzten Kapitel sollte weiterhin noch die Frage der Herkunft der DNA im Plasma von gesunden Menschen geklärt werden (4.10).

4.1 Tumorpatienten haben erhöhte Mengen an DNA im Blutplasma In einem ersten Schritt sollten die DNA-Mengen im Plasma von Tumorpatienten ermittelt werden. Da mit den bisher angewandten Methoden die Menge der DNA nicht quantifizierte werden konnte, wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die DNA im Plasma nachweisbar und quantifizierbar ist: die kompetitive PCR. Bei dieser besonderen Form der quantitativen PCR wird die Plasma-DNA gemeinsam mit einer bekannten Menge an KompetitorMolekülen amplifiziert. Diese Kompetitor-Moleküle weisen dieselbe Sequenz auf wie die des genomischen Targets, tragen jedoch ein 20 bp langes Stück Fremd-DNA in der Mitte (Abb. 3A). Die kompetitive PCR erfolgt mit Primern, die ein 153 bp großes Stück eines Einzelkopie-Genes amplifizieren (3.2.3.1; Abb. 3A). Nach der kompetitiven PCR läßt sich durch einen Vergleich der Bandenstärke der beiden unterschiedlichen Produkte (Plasma-DNA bzw. KompetitorTemplate; Abb. 3B) die Menge an eingesetzter Plasma-DNA berechnen. Vor der Quantifizierung wurde das Plasma von den zellulären Bestandteilen des Blutes getrennt (3.2.1) und die DNAFragmente aus dem Plasma isoliert (3.2.2.1). Die Ergebnisse, die mit der kompetitiven PCR erhalten wurden, konnten über Realtime-Quantifizierung mit dem LightCycler System der Firma Roche Diagnostics bestätigt werden (3.2.3.2), wobei die Abweichung der beiden Methoden etwa 11% beträgt.

Ergebnisse

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Abb. 3: Kompetitive PCR A: Die bei der kompetitiven PCR amplifizierte Region liegt zwischen den Genen LAMB2 und PPV1 (19p13.3). Das Kompetitor-Molekül trägt ein 20 bp Insert in der Mitte (hellgraue Balken). B: Die PCR mit den Primern Q-EF und Q-ER ergibt Produkte von 153 bp (Plasma-DNA) bzw. 173 bp (Kompetitor-DNA). Bei einem Verhältnis der beiden Produkte von 50% (*) ist die eingesetzte Plasma-DNA-Menge gleich der des Kompetitors.

4.1.1 Quantifizierung der Plasma-DNA von Kontrollpersonen Mit Hilfe dieser Methode erfolgte zunächst die Quantifizierung der frei zirkulierenden DNA im Plasma von gesunden Kontrollpersonen. Es zeigte sich, dass die Plasma-DNA-Mengen von 14 Kontrollpersonen einen Mittelwert von nur 3,14 ng DNA/ml Plasma aufweisen, wobei die meisten Personen keine nachweisbare DNA im Plasma aufweisen (Abb. 4). Die Nachweisgrenze der kompetitiven PCR liegt bei etwa 2 ng DNA/ml Plasma. Den höchsten Spiegel an PlasmaDNA zeigt Kontrollperson 7 mit 15 ng DNA/ml Plasma (Abb. 4).

Ergebnisse

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Abb. 4: Plasma-DNA in gesunden Kontrollpersonen Gezeigt sind die Plasma-DNA-Mengen von 14 Kontrollpersonen wie sie über kompetitive PCR ermittelt wurden. Die genauen Werte der einzelnen Personen sind in Tab. 4 im Anhang aufgelistet.

4.1.2 Quantifizierung der DNA im Plasma von Tumorpatienten Die DNA-Mengen im Plasma von 30 Tumorpatienten mit unterschiedlichen Tumorarten (siehe Tab. 1 auf Seite 39), die sich ausnahmslos in einem sehr weit fortgeschrittenen Stadium der Krebserkrankung befinden und in der Mehrzahl bereits Fernmetastasen aufweisen, liegen im Mittel bei 219 ng DNA/ml Plasma. Dabei zeigen die ermittelten DNA-Werte eine starke Streuung in einem Bereich von 10 ng/ml bis 1200 ng/ml (siehe Abb. 5), sind aber – mit Ausnahme des einen Patienten mit Kopf-Hals-Tumor (C12) mit nur 10 ng/ml Plasma-DNA – stets höher als die der Kontrollpersonen (Abb. 4).

Abb. 5: Plasma-DNA-Quantifizierung der 30 Tumorpatienten Über kompetitive PCR ermittelte Plasma-DNA-Mengen von 30 Tumorpatienten. Die genauen Werte der Plasma-DNA finden sich zusammen mit den klinischen Daten und den Code-Bezeichnungen der Patienten in Tab. 1 auf Seite 39.

Ergebnisse

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Werden diese Ergebnisse nach Art des Primärtumors geordnet, so fällt auf, dass die Werte auch innerhalb einer Tumorart weit streuen (Abb. 6). Eine Korrelation zwischen den Konzentrationen der DNA im Plasma und der klinischen Situation der Patienten kann also nicht beobachtet werden. Beispielsweise weisen die Patienten C14 und C20, die beide an fortgeschrittenem Pankreas-Karzinom leiden, sehr unterschiedliche Mengen an DNA im Plasma auf: Patient C20 besitzt nur 48 ng DNA/ml, während bei Patient C14 1200 ng DNA/ml Plasma nachgewiesen wurden (Abb. 6; Tab. 1 auf Seite 39).

Abb. 6: DNA-Mengen im Plasma von Tumorpatienten geordnet nach Tumorart Gezeigt sind die Plasma-DNA-Mengen von Tumorpatienten bzw. Kontrollpersonen wie sie durch kompetitive PCR ermittelt wurden. Die Tumorpatienten sind nach der jeweiligen Lage des Primärtumors geordnet. Kontrollen: 14 gesunde Kontrollpersonen.

Ergebnisse

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Ein erhöhter Spiegel an DNA im Plasma ist also ein Charakteristikum der meisten, aber nicht aller Krebserkrankungen, wobei die Werte der einzelnen Individuen unabhängig von der Art des Primärtumors und der klinischen Situation stark streuen (Abb. 6).

4.2 Tumorzellen als Quelle der Plasma-DNA von Tumorpatienten Patienten mit Tumorerkrankungen weisen erhöhte Mengen an DNA im Plasma auf (4.1.2, Leon et al., 1977a; Stroun et al., 1989; Silva et al., 1999). Eine Hypothese für dieses Phänomen besagt, daß die DNA aus Tumorzellen stammt, die infolge des Tumorwachstums zugrunde gehen (Anker et al., 1999). Wenn der Zellinhalt dieser Zellen teilweise in die Blutbahn gelangt, würde sich die Tumor-DNA im Plasma anreichern und wäre mit den üblichen Methoden der Mutationsdetektion nachweisbar. Aus diesem Grund wurde die Plasma-DNA der 30 Tumorpatienten im Folgenden auf genetische Veränderungen in den häufigsten Tumorsuppressor-Genen bzw. ProtoOnkogenen analysiert.

4.2.1 Mutationen im TP53 Tumorsuppressor-Gen Zunächst wurde die Plasma-DNA der 30 verschiedenen Tumorpatienten auf Mutationen im p53 (TP53) Tumorsuppressor-Gen untersucht, da Mutationen in TP53 mit einer Häufigkeit von über 50 Prozent aller Krebsfälle die häufigsten genetischen Veränderungen menschlicher Tumoren darstellen (Soussi, 2000a). Das Gen kodiert für das Tumorsuppressor-Protein P53, das unter anderem eine wichtige Funktion bei der Apoptose-Induktion bzw. der Reparatur geschädigter Zellen besitzt (Yonish-Rouach et al., 1991). Die kodierende Region des TP53-Gens weist neben einigen häufig mutierten Codons wie Codon 175, 248 und 273 keine klar definierten Hotspots für Mutationen auf; allerdings liegt die Mehrzahl der bekannten Mutationen in der spezifischen DNA-Bindedomäne des Gens (Malkin, 1994; Soussi et al., 2000b). Daher wurde bei den PlasmaDNA-Proben der Tumorpatienten dieser gesamte Bereich des Gens, der sich von Exon 5 bis 8 erstreckt, mit Hilfe von PCR amplifiziert. Die erhaltenen drei PCR-Produkte wurden dann direkt sequenziert (3.2.4.1). Es zeigte sich jedoch, dass bei keinem der 15 untersuchten Patienten durch direkte Sequenzierung der Plasma-DNA eine Mutation in TP53 nachgewiesen werden konnte (siehe Tab. 1 auf Seite 39). Das Tumorgewebe war nur von 6 Patienten vorhanden, daher konnte nur die DNA dieser Gewebeproben analysiert werden, die allerdings keine Mutation in TP53 aufweist. In einem Kontrollversuch, bei dem vor der PCR verschiedene Mengen DNA mit einer

Ergebnisse

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definierten homozygoten Mutation mit normaler DNA versetzt wurden, konnte allerdings gezeigt werden, daß ein Drittel der eingesetzten DNA eine gegebene Mutation aufweisen muß, damit sie als solche bei der Auswertung erkannt wird. Es läßt sich also sagen, daß – unter anderem auf Grund der wenig sensitiven Methode des direkten Sequenzierens von PCR-Produkten – im Plasma von 15 Patienten keine Mutation in p53 nachweisbar ist.

4.2.2 Mutationen im KRAS Onkogen Ein Gen, das ebenfalls sehr häufig bei verschiedenen Tumoren mutiert ist, stellt das KRAS (Kras) Onkogen dar (Minamoto et al., 2000). Beim Pankreas-Karzinom liegt die Häufigkeit sogar bei über 90 Prozent (Longnecker und Terhune, 1998; Bos, 1989). Das K-ras-Protein, das zu der Familie der GTPasen gehört, ist an der Plasmamembran lokalisiert und hat eine wichtige Funktion innerhalb des Signalweges von der Zelloberfläche zum Zellkern (Hernandez-Alcoceba et al., 2000). Wie bei TP53 (4.2.1) konnte auch in KRAS bei keinem der 25 untersuchten Tumorpatienten durch direkte Sequenzierung der Exons 1 und 2 eine Mutation nachgewiesen werden. Daher wurde im Folgenden eine hoch sensitive Methode verwendet, die MASA-PCR (mutant allele specific amplification; 3.2.4.2). Die Besonderheit dieser Methode ist die Verwendung mutationsspezifischer Primer, die selektiv nur mutierte Allele des KRAS Onkogens amplifizieren (Abb. 7A), sodass eine Mutation auch in Anwesenheit eines Überschusses an normaler DNA nachweisbar ist. Das K-ras-Onkogen besitzt einige klar definierte Hotspots für Mutationen: Codons 12, 13, und 61. Von diesen finden sich bei vielen verschiedenen Tumorarten am häufigsten Mutationen in Codon 12 (Bos, 1989). Deshalb wurde die Plasma-DNA der Tumorpatienten in sieben verschiedenen PCR-Ansätzen mit den sechs sequenzspezifischen Vorwärts-Primern für alle möglichen Mutationen an Position 1 oder 2 des Codons 12 und – als PCR-Kontrolle – mit dem Wildtyp-Vorwärtsprimer amplifiziert (Abb. 7A, B). Der Rückwärtsprimer der sieben Ansätze war jeweils identisch.

Ergebnisse

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Abb. 7: Nachweis von Mutationen im KRAS Onkogen über MASA-PCR A: Codon 12 (GGT) kann an Position 1 bzw. 2 (*) eine Mutation aufweisen. Die mutierte DNA wird selektiv mit mutationsspezifischen Vorwärts-Primern für die 1. oder die 2 Position amplifiziert. Wt, Wildtyp-Primer. B: Alle MASA-Ansätze der Plasma-DNA von Patient C15 mit Colon-Karzinom. M, Größenmarker in bp. C: MASA von Patient T1 mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (non small cell lung cancer, NSCLC). Gezeigt ist das Ergebnis der MASA mit Vorwärtsprimer 1C. Wt, Wildtyp-Primer. Ko, Lymphozyten-DNA einer Kontrollperson. Plasma / Tumor: DNA aus Plasma bzw. Tumorgewebe des Patienten.

Mit dieser Methode wurde die Plasma-DNA der 30 verschiedenen Tumorpatienten auf Mutationen in KRAS untersucht. Es konnte jedoch nur bei einem Patienten, T1, mit nichtkleinzelligem Lungen-Karzinom (NSCLC) eine Mutation detektiert werden (Abb. 7C; Tab. 1 auf Seite 39). Dieser Patient weist sowohl in der Tumor-DNA als auch in der Plasma-DNA eine Mutation in Codon 12 von GGT nach CGT auf. In Abb. 7C ist das Ergebnis der MASA mit dem mutationsspezifischen Primer 1C gezeigt. Es resultiert bei Amplifikation der Tumor-DNA als auch der Plasma-DNA des Patienten ein PCR-Produkt von 95 bp. Der Basenaustausch bedingt einen Austausch von Glycin nach Valin in diesem Codon. Bei Lungenkrebs liegt die Inzidenz von KRAS-Mutationen bei 30% (Bos, 1989). Die Analyse dieses Patienten zeigt, daß ein Teil der Plasma-DNA aus dem Tumorgewebe stammt, da im Plasma die gleiche KRAS-Mutation detektiert wurde wie in den Tumorzellen.

Ergebnisse

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4.2.3 Hypermethylierung des CDKN2A Tumorsuppressor-Gen-Promotors Ein sehr häufiges genetisches Kennzeichen von Tumorzellen ist neben Mutationen in ProtoOnkogenen oder Tumorsuppressor-Genen die Stillegung ganzer Gene über eine Änderung des Methylierungsstatus. Ein Beispiel hierfür ist die Hypermethylierung der Promotorregion des CDKN2A Tumorsuppressor-Gens, die im Folgenden untersucht wurde. Das Gen CDKN2A kodiert für einen Inhibitor von Cyclin-abhängigen Kinasen, p16INK4A, und spielt eine wichtige regulatorische Funktion im Zellzyklus (Serrano et al., 1993). Es ist bekannt, daß der CDKN2A Genpromotor in einer großen Zahl von menschlichen Krebsarten hypermethyliert und somit inaktiviert ist (Merlo et al., 1995; Baylin et al., 1998; Liggett und Sidransky, 1998). Der Methylierungsstatus des CDKN2A Promotors in der Plasma-DNA der Tumorpatienten wurde mittels methylierungs-spezifischer PCR (MSP) untersucht (3.2.5.3). Der Vorteil dieser Methode liegt darin, daß unmethylierte und hypermethylierte DNA nebeneinander nachgewiesen werden, so daß man bereits abschätzen kann, wie groß der Anteil der tumor-spezifischen DNA in den jeweiligen Plasma-DNA-Proben ist. Der erste Schritt der Prozedur ist eine Desaminierung aller Cytosin-, nicht aber 5-Methylcytosinreste durch Natrium-Bisulfit (Herman et al., 1996a, 3.2.5.2). Durch die Bisulfit-Behandlung erhalten unmethylierte CpG-Inseln stromaufwärts des CDKN2A Gens mehrere Uracilreste, während hypermethylierte Bereiche ihre 5-Methylcytosine behalten. In der darauffolgenden methylierungs-spezifischen PCR werden durch die Verwendung von spezifischen Primern entweder die unmethylierten oder die hypermethylierten Sequenzen des CDKN2A Gens amplifiziert (Herman et al., 1996a; 3.2.5.3). Mit Hilfe dieser methylierungs-spezifischen PCR wurden 25 Plasma-DNA-Proben und teilweise Tumorgewebeproben

verschiedener

Tumorpatienten

untersucht.

Die

Ergebnisse

der

methylierungs-spezifischen PCR einiger Patienten und Kontrollen sind in Abb. 8 gezeigt. Als Kontrollen für unmethylierte CDKN2A-Promotorsequenzen wurde DNA einer menschlichen Fibroblasten-Zellline (NHDF) verwendet. Diese DNA ergibt nur mit den Primern für die unmethylierte Promotorregion ein Produkt (Abb. 8A). Als Kontrolle für die methylierte CDKN2A-Promotorregion wurde in vitro methylierte Lymphozyten-DNA verwendet, die mit Hilfe einer CpG-Methylase hergestellt wurde (3.2.5.1). Diese methylierte DNA ergibt nur mit den Primern für die methylierte Promotorregion ein Produkt (Abb. 8A). Bei 11 der 25 untersuchten Patienten mit unterschiedlichen Primärtumoren (44%) konnte eine Hypermethylierung der CDKN2A-Promotorregion im Plasma detektiert werden. Exemplarisch sind die Ergebnisse der methylierungs-spezifischen PCR der Patienten C11, C12 und T2 in Abb.

Ergebnisse

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8B gezeigt. Die Plasma-DNA von Patient C11 weist nur in der unmethylierten Reaktion ein PCR-Produkt auf, nicht aber in der methylierten Reaktion (Abb. 8B). Es liegt bei diesem Patienten also keine CDKN2A-Hypermethylierung im Plasma vor. Patient C12 dagegen zeigt PCR-Produkte bei beiden Ansätzen, weist also zu einem gewissen Anteil der DNA Hypermethylierung des CDKN2A-Promotors auf (Abb. 8B). Von Patient T2 lag neben der Plasmaprobe noch ein Stück des Tumorgewebes vor. Sowohl die Plasma-DNA als auch die Tumor-DNA weist bei diesem Patienten eine Hypermethylierung von CDKN2A auf (Abb. 8B). Alle positiven Plasma-DNA-Proben enthalten stets sowohl methylierte als auch unmethylierte CDKN2A-Promotor-Sequenzen, wie in Abb. 8B exemplarisch gezeigt.

Abb. 8: Detektion von Hypermethylierung des CDKN2A-Promotors über methylierungs-spezifische PCR A: Methylierungs-spezifische PCR von Kontrollen: NHDF, menschliche Fibroblasten-Zelllinie; HeLa-Zellen und in vitro methylierte DNA (3.2.5.1). U, M: unmethylierte bzw. methylierte PCR-Reaktion. B: MSP einiger repräsentativer Plasma-DNA-Proben (Patienten-Codes siehe Tab. 1 auf Seite 39).

Ergebnisse

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Die Patienten, bei denen Hypermethylierung des CDKN2A-Promotor-Bereiches detektiert wurde, haben Brustkrebs (C8, C10 und C23), Angiosarkom (C2), Ewing Sarkom (C9), Kopf-HalsTumor (C12), malignes Melanom (C13), und Karzinome des Pankreas (C20), der Lunge (T1), des Colon (T2) und des Oesophagus (T3). Diese Ergebnisse aller Patienten sind zusammen mit der Klinik und der DNA-Mengen im Plasma in Tab. 1 auf Seite 39 zusammengestellt.

4.3 Quantifizierung der methylierten DNA aus Tumorzellen Die DNA im Plasma von Tumorpatienten besteht offensichtlich nicht gänzlich aus zugrunde gegangenen Tumorzellen (4.2). Ein großer Anteil der DNA scheint aus anderen Zellen zu stammen, vermutlich aus umgebenden Zellen des Tumors. Im Folgenden wurde daher versucht, den Anteil der Tumor-DNA an der gesamten Plasma-DNA zu ermitteln. Wie bereits erwähnt, ist es bei der Methode der methylierungs-spezifischen PCR der CDKN2A-Promotorregion möglich, in derselben Plasma-DNA-Probe selektiv nur unmethylierte Nicht-Tumor- bzw. hypermethylierte Tumor-DNA zu amplifizieren. Um diese beiden Bestandteile der Plasma-DNA zu quantifizieren, konnte eine methylierungs-spezifische Realtime-PCR-Methode entwickelt werden (3.2.6.2), die nach der Desaminierung der Plasma-DNA durch Natrium-Bisulfit (3.2.6.1) durchgeführt wird. Es werden für den Realtime-Ansatz PCR-Primer verwendet, die wie die Primer der normalen methylierungs-spezifischen PCR selektiv nur unmethylierte bzw. methylierte CDKN2A-Sequenzen amplifizieren. Der Nachweis der Produkte in der RealtimePCR erfolgt mit zwei Sets an Hybridisierungssonden, die ebenfalls methylierungs-spezifisch sind (3.2.6.2). Die Spezifität der Methode, d.h., dass in der unmethylierten Reaktion auch tatsächlich nur unmethylierte CDKN2A-Sequenzen amplifiziert werden und in der methylierten nur die methylierten Sequenzen, konnte anhand eines Kontrollversuches gezeigt werden (Abb. 9). Dafür wurden jeweils gleiche Mengen CDKN2A-hypermethylierter DNA aus Raji-Zellen (3.2.6.1) und unmethylierter DNA aus Lymphozyten nach der Desaminierung durch NatriumBisulfit (3.2.5.2) in die unmethylierte (Abb. 9: U) bzw. methylierte (Abb. 9: M) methylierungsspezifische Realtime-PCR eingesetzt. Es zeigt sich spezifisch nur bei der jeweils adäquaten DNA ein PCR-Produkt. In der Realtime-PCR präsentiert sich die Anwesenheit eines PCR-Produktes an einer logarithmischen Zunahme der im LightCycler gemessenen Fluoreszenz (siehe Abb. 9).

Ergebnisse

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Abb. 9: Spezifität der methylierungs-spezifischen Realtime-PCR U/M: Realtime-Reaktion für unmethylierte bzw. hypermethylierte CDKN2A-Sequenzen. Gezeigt ist die Amplifikation gemessen an Zunahme der Fluoreszenz im Verlaufe mehrerer PCR-Zyklen (cycle number). Unmethylierte DNA: DNA aus Lymphozyten einer Kontrollperson. Methylierte DNA: DNA aus Raji-Zellen. Keine DNA: PCR-Kontrolle mit H2O statt DNA.

Für die Analyse der methylierten und unmethylierten Anteile im Plasma der Tumorpatienten wurden jeweils zwei unterschiedliche Realtime-PCR-Reaktionen durchgeführt: eine für die Quantifizierung der unmethylierten und die zweite für die der hypermethylierten CDKN2AMengen im Plasma. In beiden Ansätzen wird jeweils die gleiche Menge an desaminierter Plasma-DNA der Patienten eingesetzt. Bei beiden Realtime-Reaktionen wird eine Verdünnungsreihe der jeweiligen Standard-DNA (unmethylierte oder methylierte DNA, 3.2.6.2) mit

Ergebnisse

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amplifiziert. Die Software des LightCyclers berechnet dann anhand der vorgegebenen StandardDNA-Mengen die Konzentrationen der eingesetzten methylierten bzw. unmethylierten CDKN2A-Sequenzen. Setzt man die Ergebnisse beider Reaktionen zusammen gleich 100%, ergeben sich die prozentualen Anteile der unmethylierten bzw. methylierten DNA an der gesamten Plasma-DNA. Die Ergebnisse der methylierungs-spezifischen Quantifizierung der Plasma-DNA aller sechs untersuchten Tumorpatienten sind in Abb. 10 gezeigt.

Abb. 10: Quantifizierung der Tumor-DNA im Plasma von Tumorpatienten A: Schema der Realtime-PCR mit Lage der methylierungsspezifischen PCR-Primer (Pfeile) und methylierungsspezifischen Hybridisierungssonden (graue Balken) im Promotor-Bereich von CDKN2A. B: Prozentuale Anteile von methylierter und unmethylierter DNA im Plasma von sechs Tumorpatienten. C: Menge an Gesamt-Plasma-DNA [ng/ml] und Art des Primärtumors der sechs in B untersuchten Patienten.

Ergebnisse

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Der Anteil der DNA mit hypermethyierten CDKN2A-Promotorsequenzen variiert von Patient zu Patient sehr stark. So weist Patient C10 mehr als 90% auf, während beispielsweise Patient C23 nur 10% hypermethylierte Tumor-DNA im Plasma besitzt. Interessanterweise gehören die Patienten mit einem hohen Anteil an tumor-spezifischer hypermethylierter DNA zu einer Gruppe mit eher wenig zirkulierender DNA im Plasma: C10 (Brustkrebs, 20 ng DNA/ml Plasma), C2 (Angiosarkom, 19 ng DNA/ml Plasma) und C13 (Melanom, 20 ng DNA/ml Plasma) (siehe Abb. 10 B und C). Dagegen besitzt Patient C23 (Brustkrebs) weniger als 10% tumor-spezifische, methylierte DNA in einer Plasma-DNA-Menge von 360 ng DNA/ml Plasma.

4.4 Plasma-DNA stammt nur in wenigen Fällen aus T-Zellen Bei einigen Tumorpatienten stammt nur ein Bruchteil der Plasma-DNA aus dem Tumor (4.3); die Quelle der restlichen Plasma-DNA jedoch ist bisher unbekannt. Da Tumorpatienten erhöhte Mengen an Plasma-DNA aufweisen, liegt die Wahrscheinlichkeit nahe, dass Zellen in der unmittelbaren Umgebung des Tumors zugrunde gehen und ihre DNA in den Blutkreislauf gelangt. T-Lymphozyten beispielsweise infiltrieren in ihrer Funktion als zelluläre Immunabwehr in das Tumorgewebe (Robins et al., 1986; Kradin et al., 1993). Diese Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) weisen einen hohen Turnover auf (Soares et al., 2000) und können sogar von den Tumorzellen selbst zur Apoptose getrieben werden (O`Connell et al., 2000). Die DNA der apoptotischen T-Lymphozyten könnte somit zur Plasma-DNA der Tumorpatienten beitragen. T-Lymphozyten weisen eine VDJ-Rekombination der Gene des T-Zell-Rezeptors auf (Lewis und Wu, 1997), so dass sich diese Genregion zwischen T-Lymphozyten und allen anderen Körperzellen unterscheidet. Für den Nachweis von T-Lymphozyten-DNA im Plasma der Tumorpatienten wurden daher zwei Sets von PCR-Primerpaaren ausgewählt: ein Primerpaar amplifiziert rearrangierte Gene der T-Zell-Rezeptor-β-Kette (TCR; 3.2.7; Zemlin et al., 1998), die nur reife T-Lymphozyten aufweisen, während das zweite Primerpaar nur an die GermlineKonfiguration bindet, die bei allen Nicht-T-Lymphozyten gefunden wird (Abb. 11A; 3.2.7). Bei der T-Lymphozyten-spezifischen PCR sind unterschiedliche Produkte möglich (907, 767 und 155 bp); je nach Art des vorliegenden Rearrangements, d.h. je nach rearrangiertem J-Element (siehe Abb. 11A). Bei Verknüpfung des D-Segmentes mit dem J1.1-Element resultiert ein Produkt von 907 bp, bei Verknüpfung mit J1.2 von 767 bp und mit J1.3 von 155 bp.

Ergebnisse

Abb. 11: PCR-Nachweis der DNA von T-Lymphozyten A: Schematische Darstellung der Methode mit Lage der Primer (Pfeile); links: VDJRekombination der TCR β-Kette mit V-, D- und J-Elementen; rechts: Germline-Konstellation der TCR β-Kette. B: T-Lymphozyten-spezifische PCR von sechs repräsentativen Plasma-DNA-Proben verschiedener Tumorpatienten und drei Kontrollen. H: HeLa-Zellen; J: Jurkat T-Lymphozyten; B: weiße Blutzellen. Gezeigt sind nur die beiden größten Produkte mit 907 bp (*) und 767 bp (**).M, Größenstandard in bp. C: Germline-PCR derselben DNA-Proben. Produkt: 250 bp.

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Ergebnisse

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Als Kontrollen wurden DNA-Proben von Jurkat-T-Lymphozyten, weißen Blutzellen und HeLaZellen verwendet. Im PCR-Ansatz mit den T-Lymphozyten-spezifischen Primern resultiert bei der Jurkat-T-Lymphozyten-DNA ein Produkt von 767 bp. Dies entspricht der monoklonal rearrangierten genomischen Sequenz der Jurkat-Zelllinie wie sie in Abb. 11B in Spur J dargestellt ist (Kneba et al., 1995). Bei der DNA der weißen Blutzellen (Abb. 11B, Spur B) resultieren, wie bei der Anwesenheit aller möglichen TCR-Rearrangements im Blut erwartet, drei Produkte (907 bp, 767 bp und 155 bp), von denen in der Abbildung nur die beiden großen Produkte gezeigt sind. Bei der HeLa-DNA ist wie erwartet kein PCR-Produkt erkennbar (Spur H; Abb. 11B). Dagegen amplifiziert das Primerpaar, das spezifisch für die GermlineKonfiguration ist, die erwartete Sequenz der DNA von HeLa-Zellen und der von weißen Blutzellen, nicht aber die von Jurkat-T-Lymphozyten (Abb. 11C; Spuren H, J und B), da der verwendete Rückwärts-Primer bei dieser PCR im Intron hinter dem D1-Element der beta-Kette des T-Zell-Rezeptors bindet, das im Laufe der VDJ-Rekombination der T-Lymphozyten deletiert wird (Abb. 11A). Mit diesen Primern konnte in 2 von 20 untersuchten Plasma-DNA-Proben T-Lymphozyten-DNA nachgewiesen werden: Bei Patient C14 (Pankreas-Karzinom; 1200 ng DNA/ml Plasma) (Abb. 11B) und bei Patient T5 (Magenkrebs, 500 ng/ml Plasma-DNA), während alle anderen PlasmaDNA-Proben keine nachweisbaren Mengen an T-Lymphozyten-DNA aufweisen (siehe Tab. 1 auf Seite 39). Alle Plasma-DNA-Proben jedoch ergeben Produkte in der Germline-PCR (Abb. 11C). Das bedeutet, daß T-Lymphozyten zumeist keine Quelle der DNA im Plasma von Krebspatienten darstellen.

4.5 Plasma-DNA stammt nicht aus Endothelzellen Eine ebenfalls denkbare Quelle der nicht aus dem Tumor stammenden DNA im Plasma von Krebspatienten könnten zugrunde gegangene Endothelzellen darstellen. Für das Wachstum eines Tumors und auch für Metastasierung muss eine ausreichende Versorgung der Tumorzellen mit Blutgefäßen gewährleistet sein (1.4). Tumorzellen besitzen daher die Fähigkeit, die Angiogenese, also eine Bildung neuer Blutgefäße, anzudrehen (Griffioen et al., 2000). Dabei werden die bestehenden Blutgefäße des Tumorgewebes zunächst abgebaut; ein Prozeß bei dem u.a. Apoptose der Endothelzellen beteiligt ist. Weiteres Tumorzell-Wachstum führt dann zur Initiation von Angiogenese (Holash et al., 1999). Es wäre also möglich, dass ein Teil der Endothelzell-DNA im Blutkreislauf erscheinen würde. Um diese Hypothese zu überprüfen,

Ergebnisse

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wurde eine Methode enwickelt, mit deren Hilfe ein Nachweis von Endothelzell-DNA im Plasma möglich ist. Die Methode basiert auf einer Untersuchung des Selectin E Gens, da dieses spezifisch nur in Endothelzellen exprimiert wird. Das menschliche Selectin E (SELE) kodiert für das endotheliale Leukozyten-Adhäsionsmolekül 1 (ELAM 1), das eine wichtige Membrankomponente der Endothelzellen darstellt (Bevilacqua et al., 1989). Es wurde beschrieben, daß der Promotor von SELE in Endothelzellen unmethyliert, in anderen Zellen dagegen hypermethyliert vorliegt (Smith et al., 1993). Zunächst wurden diese Beobachtungen anhand mehrerer menschlicher Zelllinien bestätigt. Der Methylierungsstatus des SELE Promotors wurde über eine methylierungs-spezifische PCR analysiert (3.2.7.1). Die verwendeten Primer binden an Sequenzen, die stromaufwärts des SELE Gens liegen und drei CpG-Inseln mit einschließen (Abb. 12A).

Ergebnisse

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Abb. 12: Methylierungs-spezifische PCR der Promotorregion des Selectin E Gens (SELE) A: Schematische Darstellung der unmethylierten und methylierten PCR-Reaktionen. Die sequenzspezifischen Primer (Pfeile) bedecken drei CpG-Inseln (Rauten) in der Promotorregion von SELE. B: Methylierungs-spezifische PCR der Kontrollen: menschliche Endothelzellen (HUVEC), HeLa-Zellen und HL60-Zellen. C: Methylierungs-spezifische PCR von repräsentativen Proben: DNA aus Tumorgewebe von Patient T2 und Plasma-DNA der Patienten C11 und C14. U / M: unmethylierte bzw. methylierte Reaktionen.

Mit Hilfe dieser methylierungs-spezifischen PCR-Methode wurde zunächst der Methylierungsgrad des Selectin E Gens bei diversen Kontrollen analysiert. Wie vermutet, liegt der Promotor in einer menschlichen Endothelzelllinie (HUVEC) unmethyliert vor, während er in menschlichen HeLa-Zellen und HL60-Zellen hypermethyliert ist (Abb. 12B). Bei der Analyse der DNA von Tumorgewebeproben, wie z.B. eines menschlichen Colon-Karzinoms (Patient T2) liegt stets ein kleiner Anteil von unmethylierter DNA in einem Überschuss von methylierter SELE

Ergebnisse

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Genpromotor-DNA vor (Abb. 12C). Dies entspricht der Erwartung, da Endothelzellen in einer Gewebeprobe zu einem kleinen Anteil vorhanden sind. Dagegen wurden in allen neun untersuchten Plasma-DNA-Proben keine unmethylierten SELE Genpromotor-Sequenzen detektiert: C4, C8, C11, C14, C23, T2, T3, T6 und T7 (Abb. 12C; Tab. 1 auf Seite 39).

Patient C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 T1 T2 T3 T5 T6 T7 T8

Tumor Colon Angiosarkom NSCLC Brust Brust SCLC Brust Brust Ewing-Sarkom Brust NSCLC Kopf-Hals malign. Melanom Pankreas Colon Colon Colon Brust Brust Pankreas HCC Urothel-Karzinom Brust NSCLC Colon Oesophagus Magen Colon Colon Colon

DNA [ng/ml] 167 19 100 66 134 33 170 83 60 20 84 10 20 1200 67 25 50 38 90 48 84 168 360 550 555 833 500 980 38 34

TP53 − − − − − − − − − − − − − nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd

KRAS − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − + − − − − − −

CDKN2A Tumor-DNA [%] T-Zellen − − − + 86 nd nd nd − − − − nd nd − nd nd − nd nd − + 9 − + nd − + 93 nd nd − − + 51 nd + 74 nd + − − − − − nd nd nd nd − − nd − − − − − + nd − − − − − − − + 3 − + nd − + nd − + nd − + − − − − − nd − − nd − −

Tab. 1: Klinik und Zusammenfassung der Ergebnisse der 30 verschiedenen Tumorpatienten Tumor: Lage des Primärtumors; DNA: Plasma-DNA-Menge; NSCLC, nicht kleinzelliger Lungenkrebs; SCLC, kleinzelliger Lungenkrebs; HCC, Leber-Karzinom. TP53 / KRAS: +/-, An- bzw. Abwesenheit von Mutationen innerhalb der Exons 5 bis 8 des p53 Tumorsuppressor-Gens bzw. Mutationen in Codon 12 des KRAS Onkogens. CDKN2A: +/-, An- bzw. Abwesenheit von Hypermethylierung des CDKN2A Gen-Promotors. % Tumor-DNA: Anteil der Tumor-DNA im Plasma. T-Zellen bzw. Endothelzellen: +/-, Anwesenheit oder Abwesenheit von TLymphozyten- bzw. Endothelzell-DNA im Plasma; nd: nicht untersucht.

Ergebnisse

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4.6 DNA-Fragmente weisen meist Mononukleosomen-Größe auf Um weitere Hinweise über die Herkunft der DNA im Plasma von Tumorpatienten und Kontrollpersonen zu erhalten, sollte die Plasma-DNA genauer charakterisiert werden. Insbesondere war die Analyse der Fragmentgröße der DNA im Plasma von besonderem Interesse, die im Folgenden untersucht wurde.

4.6.1 Größenbestimmung der Plasma-DNA einer Kontrollperson Zunächst wurden die Fragmente der DNA im Plasma von gesunden Kontrollpersonen analysiert. Da gesunde Personen im Schnitt weniger als 2 ng DNA/ml Plasma aufweisen (4.1.1), erfolgte die Analyse der Fragmentgrößen mit Hilfe einer hoch sensitiven radioaktiven 5`-Endmarkierung der DNA (3.2.8.1). Neben der Plasma-DNA wurde auch zelluläre DNA einer gesunden Kontrollperson markiert. Nach der Dephosphorylierung der DNA erfolgte eine Phosphorylierung der 5`-Enden mit γ-ATP (3.2.8.1). Die so markierten Fragmente wurden auf 1% Agarose-Gelen aufgetrennt und über Autoradiographie sichtbar gemacht (Abb. 13, 3.2.8.1).

Ergebnisse

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Abb. 13: Plasma-DNA-Fragmente einer gesunden Kontrollperson M1: 200 bp-Leiter (Größenstandard) M2: 1 kb-Leiter (Größenstandard) G: Genomische, zelluläre DNA P: Plasma-DNA derselben Person.

Die zelluläre DNA und die Plasma-DNA zeigen deutlich unterschiedliche Fragmentmuster. Die zelluläre DNA verbleibt auf Grund ihrer Größe in der Tasche des Agarose-Gels (Abb. 13, Spur G), während die Plasma-DNA vorwiegend aus Fragmenten mit einer Größe von ca. 200 bp besteht (Abb. 13, Spur P). Das Plasma von gesunden Menschen enthält also geringe Mengen frei zirkulierender DNA in Form kleiner Bruchstücke mit einer mehr oder weniger definierten Größe von etwa 200 bp.

Ergebnisse

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4.6.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA einiger Patienten Die Größenverteilung der DNA-Fragmente im Plasma von Tumorpatienten konnte aufgrund der größeren DNA-Mengen ohne vorhergehende Markierung analysiert werden. Die Fragmente wurden über Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe von Ethidiumbromid visualisiert (3.2.8.2), wenn ausreichende Mengen an Plasma-DNA vorhanden waren (Abb. 14). Die Größenverteilung unterscheidet sich von Patient zu Patient, jedoch sind am häufigsten Fragmente von ca. 180 bp Größe erkennbar, die oft von DNA-Fragmenten mit dem zwei-, dreioder vierfachen dieser Größe begleitet werden (Abb. 14, Patienten C7, T5 und T6). Es gibt aber auch Patienten, die hochmolekulare DNA-Fragmente in ihrem Plasma aufweisen (Abb. 14, Patienten C4 und C9). Die Plasma-DNA eines Patienten (C14) besteht aus beiden Arten von Fragmentgrößen (Abb. 14).

Ergebnisse

43

Abb. 14: Größe der DNA-Fragmente im Plasma einiger Tumorpatienten M: Größenstandard in bp C4-T6: Plasma-DNA von Tumorpatienten Mo: Mononukleosomale Fragmente Di: Dinukleosomale Fragmente Tri: Trinukleosomale Fragmente

Ergebnisse

44

Die Größenverteilung der DNA-Fragmente in Vielfachen von 180 bp erinnert an die Oligonukleosomen-DNA-Leiter, die charakteristisch ist für apoptotischen Zelltod, bei dem das zelluläre Chromatin von einer Caspase-aktivierten DNase abgebaut wird (Nagata et al., 2000). Dagegen könnten DNA-Fragmente mit einer Größe von über 10000 bp aus Zellen stammen, die durch nekrotischen Zelltod zugrunde gegangen sind.

4.7 Apoptotische und nekrotische Zellen setzen in vitro DNA frei Die Hypothese, daß die DNA im menschlichen Plasma aus sterbenden Zellen des Körpers stammen könnte, wurde im Folgenden an Modellsystemen überprüft. Es wurde untersucht, ob DNA tatsächlich aus sterbenden Zellen freigesetzt wird, da dies eine notwendige Bedingung für deren Anwesenheit im Plasma ist. Das erste Modellsystem waren Jurkat T-Lymphozyten, bei denen sowohl apoptotischer als auch nekrotischer Zelltod induziert wurde. Die Zellen wurden dafür in serumfreies Medium ohne Glucose mit Pyruvat als Energiequelle umgesetzt. Apoptose und Nekrose wurde mit Staurosporin bzw. Staurosporin und Oligomycin induziert (3.2.9). Staurosporin ist ein Proteinkinaseinhibitor, Oligomycin ein Inhibitor der ATPSynthese in den Mitochondrien. Staurosporin alleine bewirkt den Tod der Zelle. Wenn die Zellen noch Energie in Form von ATP gewinnen können, gehen sie mittels Apoptose zugrunde (Leist et al., 1997). Kann jedoch kein ATP mehr hergestellt werden wie im Falle der Zellen, die gleichzeitig dem Inhibitor der mitochondrialen ATP-Synthetase Oligomycin ausgesetzt werden, erfolgt nekrotischer Zelltod (Leist et al., 1997). Als Kontrolle wurden Zellen ohne Inhibitor inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten nach Induktion des Zelltodes wurden die Zellen abzentrifugiert und der Überstand abgenommen (3.2.9).

Ergebnisse

45

4.7.1 Quantifizierung der freigesetzten DNA Nach der DNA-Isolierung aus den Zellkultur-Überständen (3.2.9.1), erfolgte die Quantifizierung der DNA über kompetitive PCR (3.2.3.1). Die ermittelten DNA-Mengen in den Überständen der apoptotischen bzw. nekrotischen Zellen sind in Abb. 15 dargestellt.

Abb. 15: DNA-Freisetzung von Jurkat T-Lymphozyten nach Induktion von Apoptose bzw. Nekrose Apoptose der Jurkat T-Lymphozyten wurde durch Staurosporin induziert, Nekrose durch Staurosporin plus Oligomycin. Die DNA der Überstände wurde mit kompetitiver PCR zu den angegebenen Zeitpunkten quantifiziert.

Drei Stunden nach Zugabe der Zellgifte ist ein deutlicher Anstieg an freier DNA im ZellÜberstand messbar (Abb. 15). Die Kinetik der DNA-Freisetzung bei den unterschiedlichen Formen des Zelltodes ist ähnlich. Bei den nekrotischen Zellen ist die DNA-Freisetzung nach 5 Stunden jedoch deutlich höher als die der apoptotischen Zellen. Die DNA-Menge, die sich zu diesem Zeitpunkt im Überstand der nekrotischen Zellen befindet, entspricht etwa 15% der Gesamt-DNA der Zellen im Ansatz.

Ergebnisse

46

4.7.2 Apoptose-Nachweis Der apoptotische bzw. nekrotische Zelltod wurde über den Nachweis der Spaltung des SAF-A Proteins in Westernblot-Analysen bestätigt (3.2.9.3). SAF-A wird nur während apoptotischem, nicht aber während nekrotischem Zelltod von der Caspase-3 geschnitten (Göhring et al., 1997; Kipp et al., 2000). Die Proteine der Zellfraktionen der einzelnen Ansätze wurden aufgereinigt und auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Das SAF-A Protein bzw. das SAF-ASpaltprodukt wurde nach Western-Transfer mit einem spezifischen Antikörper nachgewiesen (Abb. 16; 3.2.9.3).

Abb. 16: Detektion der SAF-A-Spaltung Die Proteine der Jurkat-T-Lymphozyten wurden zu den angegebenen Zeiten nach Apoptose-, bzw. NekroseInduktion isoliert, auf einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und das SAF-A-Protein nach Western-Transfer mit einem spezifischen Antikörpers detektiert. Kontrolle: keine Zugabe der Zellgifte; SAF-A: ungeschnittenes SAF-A-Protein; SAF-A*: Spaltprodukt des SAF-A-Proteins. N: Nullkontrolle, d.h. Zellen vor Zugabe der Zellgifte.

Bei den Kontrollen, also den Zellen ohne Zugabe von Staurosporin bzw. Oligomycin, ist nach 300 min ein SAF-A-Spaltprodukt zu erkennen; d.h. einige der Zellen sterben auch ohne Giftzugabe zum Schluß des Versuches apoptotisch (Abb. 16, Kontrolle). Bei den ApoptoseZellen ist bereits ab einem Zeitpunkt von 90 min nach Apoptose-Induktion gespaltenes SAF-AProtein nachweisbar (Abb. 16, Apoptose). Das Spaltprodukt, und somit auch der apoptotische Zelltod, nimmt dann bis 300 min nach Staurosporinzugabe stetig zu. Die Nekrose-Zellen zeigen wie erwartet kein gespaltenes SAF-A (Abb. 16, Nekrose). Nach 300 min ist die SAF-A-Bande

Ergebnisse

47

nur sehr schwach; eine Erklärung hierfür könnte sein, dass sich das SAF-A der nekrotischen Zellen zu diesem Zeitpunkt zu einem Großteil im Überstand befindet. Zusammenfassend läßt sich sagen, dass bei Zellen, die durch Apoptose bzw. Nekrose zugrunde gehen, mit der Zeit zunehmende Mengen an frei zirkulierender DNA im Überstand erscheinen.

4.8 Nach Induktion von Apoptose und Nekrose in vivo erscheinen DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe im Blutplasma Sowohl nekrotischer als auch apoptotischer Zelltod in vitro bewirkt, dass DNA aus den sterbenden Zellen in die Umgebung abgegeben wird (4.7). Ob dies auch für die in vivo Situation gilt, d.h. ob zugrunde gehende Zellen im Organismus DNA freisetzen, die sich dann auch im Blutkreislauf wiederfindet, wurde an etablierten Mausmodellen untersucht. Dabei läßt sich Apoptose oder Nekrose der Leberzellen durch Injektion von anti-CD95 Antikörper (αCD95) bzw. Acetaminophen (Paracetamol) induzieren (Ogasawara et al., 1993; Leist et al., 1998; Hentze et al., 2000). Der anti-CD95-Antikörper bindet an den Apoptose-Rezeptor CD95, der sich auf der Oberfläche der meisten Zellen befindet und induziert dadurch die Apoptose-Kaskade in der Zelle. Paracetamol dagegen bewirkt nekrotischen Tod von Leberzellen (Hentze et al., 2000).

4.8.1 Quantifizierung der freigesetzten Plasma-DNA Nach Induktion von Apoptose bzw. Nekrose durch Injektion von anti-CD95 Antikörper bzw. Acetaminophen wurde den Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten Blut entnommen (3.2.10). Nach der Gewinnung von Plasma und darauffolgender Aufreinigung der Plasma-DNA (3.2.10.1) erfolgte die Quantifizierung der DNA über Realtime-PCR mit dem LightCycler System. In der Realtime-Reaktion wurden Primer verwendet, die ein 199 bp großes Stück des alpha-Aktin Gens der Maus amplifizieren (3.2.10.2).

Ergebnisse

48

4.8.1.1 Dosisabhängige Freisetzung von DNA ins Plasma bei Apoptose-Induktion In einem ersten Versuch wurde bei sechs Mäusen Apoptose ausgelöst: eine Dreiergruppe erhielt eine Dosis von 1 µg αCD95, die andere von 2 µg pro Tier. Nach 0, 3, 4, 6 und 8 Stunden wurde den Mäusen Blut entnommen und die Plasma-DNA im LightCycler quantifiziert (3.2.10.2). Die Mittelwerte der Plasma-DNA-Konzentrationen beider Mäusegruppen über die Zeit sind in Abb. 17 gezeigt. Die genauen Messwerte befinden sich in Tab. 5 im Anhang.

Abb. 17: Dosisabhängige DNA-Freisetzung ins Plasma nach ApoptoseInduktion durch antiCD95-Antikörper Gezeigt sind die Mittelwerte der Plasma-DNA-Konzentrationen von je 3 Mäusen nach Induktion von Apoptose mit 1 bzw. 2 µg antiCD95Antikörper zu den angegebenen Zeitpunkten. Die Quantifizierung erfolgte über Realtime-PCR.

Die Ergebnisse der Quantifizierung nach Apoptose-Induktion zeigt, daß bei allen Mäusen nach etwa 4 Stunden eine dramatische Freisetzung der DNA ins Plasma stattfindet. Dabei ist eine klare Abhängigkeit der DNA-Freisetzung von der injizierten Dosis αCD95-Antikörper erkennbar. Nach 8 Stunden liegt der Mittelwert der Gruppe mit 1 µg αCD95 pro Individuum bei 6,1 µg DNA/ml Plasma, während er bei den Mäusen mit 2 µg αCD95 bei dem Zehnfachen, also bei 71 µg DNA/ml Plasma liegt. Parallel zum Anstieg der DNA im Plasma der Mäuse verlief

Ergebnisse

49

auch eine zunehmende Gewebeschädigung der Tiere, die von Hannes Hentze (AG Wendel; Universität Konstanz) anhand einer Messung der Plasma-ALT-Mengen analysiert wurde. 4.8.1.2 Freisetzung von DNA ins Plasma nach Apoptose- und Nekrose-Induktion Das Erscheinen von DNA im Plasma wurde daraufhin parallel zur Apoptose auch bei der Nekrose untersucht. Dafür wurde bei 3 Mäusen Nekrose der Leberzellen durch Injektion von 250 mg/kg Acetaminophen induziert, während 3 weiteren Mäusen für die Apoptose-Induktion je 2 µg αCD95-Antikörper pro Tier injiziert wurden (3.2.10). Nach 0, 3, 4, 6 und 8 h wurde den Apoptose-Mäusen Blut entnommen; bei den Nekrose-Mäusen nach 0, 3, 4 und 6 h. Die DNA wurde dann aus dem Plasma isoliert (3.2.10.1) und über Realtime-PCR quantifiziert (3.2.10.2). Die Ergebnisse der Quantifizierung der einzelnen Mäuse sind in Tab. 6 im Anhang aufgeführt; die Mittelwerte der Plasma-DNA-Konzentrationen der beiden Gruppen über die Zeit zeigt Abb. 18:

Abb. 18: DNA-Freisetzung ins Plasma bei Induktion von Apoptose und Nekrose in vivo Gezeigt sind die Mittelwerte der DNA-Mengen im Plasma von je 3 Mäusen nach Apoptose- bzw. NekroseInduktion mittels antiCD95-Antikörper bzw. Acetaminophen zu den angegebenen Zeitpunkten nach Induktion des Zelltodes. Die DNA wurde mit Realtime-PCR quantifiziert.

Wie in Abb. 18 gezeigt, konnte ein deutlicher Anstieg der DNA im Plasma der mit αCD95 behandelten Mäuse verzeichnet werden. Das Erscheinen der Plasma-DNA 3 Stunden nach Apoptose-Induktion verlief parallel mit einem Ansteigen des Leberschadens gemessen anhand der von Hannes Hentze bestimmten Alanin-Aminotransferase (ALT) Aktivität im Plasma (3.2.10). Die Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierung der Mäuse nach Injektion von Acetaminophen sind ebenfalls in Abb. 18 gezeigt. In diesem Nekrose-Modell verläuft der Anstieg der Plasma-DNA mit ähnlicher Kinetik wie bei der des Apoptose-Modells, erreicht aber

Ergebnisse

50

deutlich höhere DNA-Werte. So werden 6 h nach Nekrose-Induktion über 150 µg DNA/ml Plasma gemessen, während es bei dem Apoptose-Modell zu dieser Zeit nur 12 µg DNA/ml Plasma sind.

4.8.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA Ein Anteil der DNA der durch Apoptose oder Nekrose zugrunde gegangenen Leberzellen der Mäuse erscheint also im Blutkreislauf. Um diese DNA näher zu charakterisieren, wurde eine Analyse der Fragmentlängen dieser ins Plasma freigesetzten DNA durchgeführt (3.2.10.3). Aufgrund der hohen DNA-Konzentrationen konnte die DNA ohne vorhergehende Markierung analysiert werden. Die DNA aus 25-50 µl Plasma des vorherigen Versuches (4.8.1.2) wurde zu diesem Zweck isoliert (3.2.10.1), auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt (3.2.10.3). Die Fragmentlängen der Plasma-DNA der Mäuse nach Apoptose- bzw. Nekrose-Induktion sind in der folgenden Abbildung gezeigt (Abb. 19).

Abb. 19: Analyse der DNA-Fragmente nach in vivo Apoptose und Nekrose Fragmente der freigesetzten DNA zu den angegebenen Zeitpunkten nach Induktion von Leberzell-Apoptose (links) bzw. Leberzell-Nekrose (rechts). M: Größenstandard in bp. Mo, Di: Mono- bzw. Dinukleosomale DNAFragmente.

Ergebnisse

51

Im Plasma der Mäuse, bei denen Apoptose der Leberzellen induziert wurde, sind über die Zeit steigende Mengen an DNA-Fragmenten im Plasma erkennbar, die die Größe von mono- bzw. dinukleosomaler DNA aufweisen (Abb. 19, links). Im Gegensatz dazu findet sich im Plasma der Mäuse mit Leberzell-Nekrose ein ebenfalls zeitabhängiger Anstieg von DNA-Fragmenten, die größer sind als 10 000 bp. (Abb. 19, rechts). Es findet also sowohl bei apoptotischem als auch bei nekrotischem Zelltod eine dramatische Zunahme von frei zirkulierender DNA im Plasma statt, deren Fragmentlängen sich jedoch deutlich voneinander unterscheiden.

4.9 Plasma-DNA im Therapieverlauf von Brustkrebs-Patientinnen Die bisherigen Untersuchungen zeigen, dass im Blutplasma von Tumorpatienten deutlich erhöhte Mengen an frei zirkulierender DNA vorkommen (4.1) und dass ein gewisser Anteil dieser DNA aus dem Tumorgewebe stammt

(4.2, 4.3). Allerdings wurden die vorhergehenden

Untersuchungen stets an einem Kollektiv von Patienten mit unterschiedlichen Tumorarten durchgeführt, bei denen die Klinik meist unzureichend bekannt war, was eine Untersuchung von Korrelationen zwischen den erhaltenen Daten und der Klinik der Patienten verhindert. Infolgedessen wurde in Kooperation mit dem Klinikum Konstanz eine Studie mit BrustkrebsPatientinnen geplant und durchgeführt. Die Klinik der 28 Patientinnen dieser Studie ist in allen Einzelheiten bekannt, insbesondere Tumorart, Tumorgröße, Tumorstaging, Anwesenheit von Lymphknoten- bzw. Fernmetastasen und der Rezeptorstatus des Tumorgewebes. Eine genaue Auflistung der Klinik der Patientinnen zeigt Tab. 3 auf Seite 61. Insbesondere sollte in dieser Studie die Verfolgung der Plasma-DNA im Verlaufe einer Therapie untersucht werden, da dies weitere Aufschlüsse über die Herkunft der Plasma-DNA geben könnte. Daher erfolgten bei jeder Patientin drei Blutabnahmen: die erste präoperativ, die zweite 7 Tage und die dritte 3 Monate nach der Tumor-Resektion (siehe Abb. 20). Die meisten der Patientinnen erhielten einige Wochen nach der Operation lokale Bestrahlung oder Chemotherapie. Die Behandlung in Form von Chemotherapie oder Bestrahlung erfolgte stets erst nach der zweiten Blutabnahme und zumeist vor der dritten Blutabnahme.

Ergebnisse

52

2

1

OP

3

Bestrahlung / Chemotherapie

Abb. 20: Zeitpunkte der Blutabnahmen für die Brustkrebs-Studie Die Blutabnahmen für die Brustkrebs-Studie erfolgen präoperativ (1), 7 Tage (2) und 3 Monate (3) nach der Tumor-Resektion (OP). Die Patienten erhalten meist Bestrahlung bzw. Chemotherapie, die stets nach der zweiten Blutabnahme beginnt.

4.9.1 DNA-Mengen in präoperativen Plasmaproben der Patientinnen Zunächst wurden die DNA-Mengen der präoperativen Plasmaproben von 28 Patientinnen bestimmt. Zu diesem Zeitpunkt war ein entsprechender Tumor noch vorhanden und es war noch keine Therapie erfolgt. Die Quantifizierung der DNA im Plasma erfolgte über Realtime-PCR, wobei ein 110 bp großes Fragment des menschlichen beta-Globin-Gens amplifiziert und in der Realtime-PCR mit spezifischen Hybridisierungssonden detektiert wird (3.2.3.2). Die DNAMengen jeder Probe werden dann anhand einer Verdünnungsreihe von genomischer StandardDNA von der Software des LightCyclers berechnet. Die Ergebnisse der Quantifizierung aller 28 Patientinnen sind in der folgenden Abbildung gezeigt (Abb. 21).

Ergebnisse

53

Abb. 21: Präoperative Plasma-DNA-Mengen von 28 Brustkrebs-Patientinnen Gezeigt sind die Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierungen der Patientinnen B1 bis B28 (1-28). Die Klinischen Parameter der Patientinnen zeigt Tab. 3 auf Seite 61.

Die DNA-Mengen im Plasma reichen von 0,03 ng/ml bis 237 ng/ml Plasma und zeigen wie auch die Werte der gemischten Tumorpatienten eine weite Streuung (4.1.2). Der Mittelwert der präoperativen Plasma-DNA-Konzentrationen liegt bei 35,1 ng/ml. Die genauen Werte der DNA im Plasma zeigt Tab. 2 auf Seite 55. Unter den achtundzwanzig Brustkrebs-Patientinnen befinden sich acht, bei denen nach der Operation festgestellt wurde, dass kein Karzinom vorlag. Diese Patientinnen befinden sich auch in der Grafik: B3, B8, B10, B11, B14, B20, B25 und B26.

Ergebnisse

54

4.9.2 Plasma-DNA-Konzentrationen von gesunden Frauen Als Kontrolle wurde die DNA im Plasma von 54 gesunden Frauen (3.1.1) quantifiziert. Die Quantifizierung erfolgte ebenfalls über Realtime-PCR (3.2.3.2). Die ermittelten DNA-Mengen im Plasma dieser gesunden Kontrollen sind in der folgenden Abbildung dargestellt (Abb. 22).

Abb. 22: Plasma-DNA von 54 gesunden Frauen Plasma-DNA-Werte von 54 gesunden Frauen wie sie über Realtime-PCR quantifiziert wurden.

Gesunde Frauen weisen demnach sehr viel geringere DNA-Mengen im Plasma auf als die Brustkrebs-Patientinnen, wobei die Werte auch hier stark streuen: von 0,028 ng DNA/ml bis 30 ng DNA/ml Plasma. Der Mittelwert der DNA-Konzentrationen im Plasma liegt bei 1,5 ng/ml und entspricht somit

in etwa dem Wert, der auch bei der Quantifizierung der

14 Kontrollpersonen für die erste Studie ermittelt wurde (4.1.1). Die Quantifizierung über Realtime-PCR weist eine deutlich höhere Sensitivität auf als die kompetitive PCR (3.2.3.1), weshalb bei dieser Methode auch DNA-Werte unter 1 ng/ml Plasma bestimmt werden konnten.

Ergebnisse

55

4.9.3 Plasma-DNA der Brustkrebs-Patientinnen im Therapieverlauf Die Quantifizierung der DNA in den Plasmaproben, die den Patientinnen 7 Tage nach Resektion des Tumors abgenommen wurden, zeigt, daß die DNA in 11 der 19 Fälle (58%) im Vergleich zu den präoperativen Proben zunimmt und in 7 (37%) abnimmt (Tab. 2). Bei einer Patientin blieb die DNA-Menge trotz Operation konstant (B9).

Patient B1 B2 B3* B4 B5 B6 B7 B8* B9 B10* B11* B12 B13 B14* B15 B16 B17 B18 B19 B20* B21 B22 B23 B24 B25* B26* B27 B28

DNA präop. 9 5,1 1,6 82,8 200 7,1 236,7 5,6 9,5 28,1 42,5 4,4 2,2 70,1 6,4 0,7 116,9 44,3 9,5 1,3 11,6 1,2 53,6 0,03 17,7 6,1 2,8 5,4

DNA 7d post 4,4 14,1 479 86,9 13,9 4,4 9,5 565,8 39,9 123 55,7 6,4 27 2 5,3 4,3 0,8 2,4 203

DNA 3mon post 4,5 794 26,6 16,6 3,3 2,7 16,5 2,1 -

Tab. 2: Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierung der 28 Brustkrebs-Patientinnen präop, 7d post, 3 mon post: Plasma-DNA [ng/ml] der Proben vor und 7 Tage bzw. 3 Monate nach operativer Tumor-Entfernung. Bei 8 Fällen (*) liegt nur die präoperative Probe vor, da sich bei der Tumor-Resektion herausstellte, dass diese Patientinnen kein Karzinom aufweisen. Patientin B15 erhält vor der TumorResektion erst eine Chemotherapie.

Ergebnisse

56

Die Plasmaproben, die den Patientinnen 3 Monate nach der operativen Entfernung des Tumors abgenommen wurden, weisen dagegen deutlich geringere DNA-Mengen auf: bei 7 von 8 Patientinnen geht die DNA-Menge stark zurück (Abb. 23; Tab. 2). Die DNA-Menge bei diesen 7 Patientinnen liegt im Bereich der gesunden Kontrollfrauen. Lediglich Patientin B2 zeigt einen deutlichen Anstieg der Plasma-DNA nach 3 Monaten auf einen Wert von fast 800 ng DNA/ml Plasma (Abb. 23).

Abb. 23: DNA im Plasma von Brustkrebs-Patientinnen im Therapieverlauf Gezeigt ist die Entwicklung der DNA im Plasma von 8 Patientinnen vor Tumorentfernung (prä) und 7 Tage bzw. 3 Monate danach (7d / 3mon post) in ng DNA/ml Plasma. Die Klinik der Patientinnen ist in Tab. 3 auf Seite 61 aufgelistet. Die genauen Werte der Quantifizierung zeigt Tab. 2 auf Seite 55.

Ergebnisse

57

4.9.4 Anteil der Tumor-DNA im Plasma der Patientinnen im Therapieverlauf Nach der Quantifizierung der gesamten DNA im Plasma sollte im Folgenden der Anteil der DNA bestimmt werden, der aus dem Tumorgewebe stammt. Dafür wurde dieselbe Methode angewandt wie bei den verschiedenen Tumorpatienten (4.3). In einer ersten Realtime-PCR wurde die desaminierte Plasma-DNA mit Primern und Hybridisierungssonden, die spezifisch für die hypermethylierten CDKN2A-Sequenzen sind, amplifiziert (3.2.6.2). Dabei ergeben nur die DNA-Proben ein Produkt, deren aus dem Tumorgewebe stammende Plasma-DNA eine Hypermethylierung im Promotor-Bereich des CDKN2A-Gens aufweist. Als Kontrolle dafür, dass diese hypermethylierten Sequenzen aus dem Tumorgewebe kommen, wurden Tumorgewebe-Proben der meisten Patientinnen mit derselben Methode untersucht. In einer zweiten Realtime-PCR wurde die desaminierte Plasma-DNA mit Primern amplifiziert, die spezifisch nur an die unmethylierten CDKN2A-Sequenzen binden. Nach den beiden unterschiedlichen Realtime-PCRReaktionen, bei denen jeweils die gleiche Menge an desaminierter Plasma-DNA der Patienten eingesetzt wurde, lassen sich die jeweils ermittelten DNA-Mengen der unmethylierten bzw. hypermethylierten CDKN2A-Sequenzen ins Verhältnis zueinander setzen. 4.9.4.1 DNA aus dem Tumorgewebe ist nur präoperativ nachweisbar Es wurden Plasmaproben aller Brustkrebs-Patientinnen analysiert, von denen bekannt ist, dass sie ein Karzinom besitzen (siehe Tab. 2 und Tab. 3). Bei vier (20%) dieser zwanzig untersuchten Patientinnen sind hypermethylierte CDKN2A-Promotorsequenzen im Plasma nachweisbar: bei den Patientinnen B2, B4, B15 und B22. Die Realtime-Reaktion mit der Detektion der hypermethylierten DNA von drei der Patienten ist in Abb. 24 gezeigt. Interessanterweise ist diese Tumor-DNA bei den Patientinnen B2, B4 und B22 jedoch nur präoperativ in Form methylierter CDKN2A-Sequenzen detektierbar. Bei allen drei Patientinnen kann sieben Tage nach operativer Entfernung des Tumors keine methylierte Tumor-DNA mehr im Plasma nachgewiesen werden (Abb. 24, A-C). In allen desaminierten DNA-Proben aber wurden die unmethylierten CDKN2A-Sequenzen detektiert, sodass die fehlende Amplifikation nicht daran liegen kann, dass in diesen Proben keine DNA vorhanden sein könnte (Abb. 24, D). Die vierte Patientin (B15) wurde nicht operiert; sie erhält vor der Tumor-Resektion erst Chemotherapie, weshalb hier keine postoperative Probe vorhanden ist. Die Klinik der Patienten ist in Tab. 3 auf Seite 61 aufgelistet. Von den Patientinnen B2 und B4 waren bereits die Plasma-Proben von 3 Monaten nach der Operation vorhanden; bei beiden Proben war keine methylierte DNA aus dem Tumor mehr nachweisbar.

Ergebnisse

58

Abb. 24: Detektion von methylierten CDKN2ASequenzen im Plasma von drei Patientinnen A, B, C: Patientinnen B2 (A), B4 (B) und B22 (C) weisen in dem RealtimeAnsatz, der spezifisch nur methylierte CDKN2A-Sequenzen amplifiziert, nur in der präoperativen Probe (prä) ein Produkt auf, nicht aber in der Probe, die 7 Tage nach Tumor-Resektion abgenommen wurde (post). D: Patientin B22 im unmethylierten RealtimeAnsatz, bei dem sowohl die prä- als auch die postoperative DNA ein Produkt ergeben.

Ergebnisse

59

4.9.4.2 Anteil der Tumor-DNA im Plasma der Brustkrebs-Patientinnen Berechnet man den prozentualen Anteil der methylierten Tumor-DNA dieser 4 Patientinnen an der gesamten Plasma-DNA, so stellt sich heraus, dass der Anteil an DNA, der bei diesen vier Patientinnen aus dem Primärtumor stammt, im Vergleich zu der Studie mit den weit fortgeschrittenen Tumorpatienten (4.3) sehr gering ist. Patientin B4 weist lediglich 0,3% methylierte DNA auf, bei Patientin B22 sind es 2,1%, bei Patientin B15 2,4% und bei Patientin B2 sind es 6,8% methylierte DNA (siehe Abb. 25).

Abb. 25: Anteile der methylierten DNA an der gesamten DNA A: Gezeigt sind die Anteile der methylierten CDKN2A-Sequenzen in Prozent von der gesamten präoperativen Plasma-DNA wie sie über methylierungs-spezifische Realtime-PCR ermittelt wurden. B: Gesamte Plasma-DNA [ng/ml] und errechnete DNA-Mengen aus dem Tumor in ng methylierte DNA pro ml Plasma.

Ergebnisse

60

Der Anteil der DNA mit hypermethyierten CDKN2A-Promotorsequenzen variiert wie auch bei den verschiedenen Tumorpatienten (4.3) von Patient zu Patient sehr stark; auch bei klinisch ähnlichen Fällen wie B2 und B22, die beide ein In situ Karzinom aufweisen (Tab. 3). Wie auch bei den anderen Tumorpatienten gehören die Patienten mit einem hohen Anteil an tumorspezifischer hypermethylierter DNA zu einer Gruppe mit eher wenig zirkulierender DNA im Plasma und umgekehrt. Beispiele hierfür sind B2 (6,6% Tumor-DNA in 5,1 ng DNA/ml Plasma) und B4 (0,3% Tumor-DNA in 82,8 ng DNA/ml Plasma). Die errechnete Menge an DNA, die aus dem Primärtumor kommt, variiert von 30 pg (B22) bis 330 pg (B2) DNA/ml Plasma. Die Werte der gesamten Plasma-DNA der Patientinnen als auch die berechneten Mengen an hypermethylierter DNA in ng pro ml Plasma sind in Abb. 25 B gezeigt.

4.9.5 Korrelation der Daten zur Plasma-DNA mit der Klinik der Patientinnen Von allen 28 Patientinnen der Brustkrebs-Studie sind alle klinischen Einzelheiten wie Tumorgröße, Tumorklassifizierung und Art der Therapie festgehalten worden. In der folgenden Tabelle sind die klinischen Daten aller Patientinnen gezeigt (Tab. 3).

Pat. Alter

Tumor

[cm]

Ly.

T

N

M

LK

G

Ö-rez.

P-rez.

Prolif.

HER

OP

Therapie

B1

50

Ductal

1,1

-

1

0

0

0/24

1–2

mäßig

mäßig

2-5

-

b.e.

B/T

B2

30

CIS

1,2

-

is

0

0

0/19

2

neg.

gering

neg

-

b.e.

B

B3

nd

kein Ca

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

-

B4

42

Ductal

nd

+

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

B5

80

Lobulär

3

+

2

1

0

3/21

2

stark

mäßig

5

+++

M.

B/T

B6

56

CIS

2,5

-

is

0

0

nd

nd

stark

gering

20

+++

b.e.

-

B7

45

Ductal

5

-

2

0

0

0/23

3

mäßig

mäßig

2-5

+++

M.

C/T

B8

nd

kein Ca

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

-

B9

49

Ductal

5

-

2

0

nd

0/17

2

stark

mäßig

2-3

+++

M.

B/C

B10

nd

kein Ca

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

-

B11

nd

kein Ca

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

-

B12

67

Lobulär

2

+

2

0

nd

0/33

3

stark

mäßig

2-5

+++

b.e.

B/C/T

B13

37

Ductal

1,8

-

1

1

0

14/19

3

neg

neg

85

-

b.e.

B/C

B14

nd

kein Ca

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

-

B15

68

Lobulär

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

stark

mäßig

30

+

-

C vor OP

B16

33

Lobulär

2,3

-

2

0

0

0/51

2

mäßig

mäßig

2–5

+

b.e.

B/C/T

B17

62

Lobulär

5

-

2

1

0

3/29

2

mäßig

gering

15

+++

M.

B

B18

53

Ductal

1

-

1

0

0

0/16

2

mäßig

mäßig

2-5

+

b.e.

T

B19

69

Ductal

1,2

-

1

0

0

0/20

2

stark

mäßig

2-3

++

b.e.

B/T

Ergebnisse

61

Pat. Alter

Tumor

[cm]

Ly.

T

N

M

LK

G

Ö-rez.

P-rez.

Prolif.

HER

OP

Therapie

B20

nd

kein Ca

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

-

B21

81

Muzinös

3

+

2

0

0

0/15

2

stark

gering

15

++

M.

T

B22

57

CIS

1,1

-

is

0

0

nd

nd

mäßig

gering

20

+++

M.

C/T

B24

59

Du-Lob

2,2

-

2

1

nd

2/24

2

neg

neg

5

+++

b.e.

B/T

B25

nd

kein Ca

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

-

B26

nd

kein Ca

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

-

B27

75

Medullär

1,1

+

1

1

0

1/29

3

neg

neg

70

++

b.e.

B/B

B28

56

Ductal

3

+

2

0

0

0/32

2

stark

mäßig

30

++

M.

C/T

Tab. 3: Klinik der 28 Brustkrebs-Patientinnen Abkürzungen: Pat.: Patientencode; Tumor: Art des Primärtumors; [cm]: Größe des Primärtumors in cm; Ly.: Anbzw. Abwesenheit (+ / -) von Lymphangiosis; T, N, M: Werte der TNM-Klassifikation des Primärtumors; LK: Zahl der befallenen Lymphknoten von der Zahl der untersuchten; G: Grading; Ö/Prez.: Östrogen- bzw. Progesteronrezeptorstatus des Tumors; Prolif.: Proliferationsgrad in %; HER: HER-2neu-Expression (Tumormarker; siehe 1.3); OP: Art der Operation: brusterhaltend (b.e.) oder Mastektomie (M.); Therapie: Bestrahlung (B), Chemotherapie (C), Tamoxifen (T). Patientin B4 hat ein Lymphknotenrezidiv, daher sind keine Daten zum Primärtumor angegeben. Patientin B15 erhält vor der Operation erst Chemotherapie. nd: nicht definiert bzw. erfasst.

4.9.5.1 Patienten mit Karzinom weisen höhere DNA-Werte auf als die ohne Karzinom Wie in Tab. 3 gezeigt, sind unter den 28 Patientinnen 8 Fälle, bei denen nach der Operation das Vorliegen eines Karzinoms ausgeschlossen werden konnte. Aus diesem Grund liegt von diesen Patienten nur die präoperative Blutprobe vor (Tab. 2 auf Seite 55). Bei dem Vergleich der präoperativen Plasma-DNA-Mengen dieser Patientinnen ohne Karzinom mit denen, die ein Karzinom besitzen, zeigt sich, dass die DNA-Konzentration im Plasma bei der Gruppe mit Karzinom höher ist als bei der ohne Karzinom (Abb. 26).

Ergebnisse

62

Abb. 26: DNA-Mengen im Plasma von 8 Patienten ohne Karzinom und 20 Patienten mit Karzinom.

Der Mittelwert der präoperativen Plasma-DNA bei 20 Patientinnen mit Karzinom liegt bei 41 ng DNA/ml Plasma, während er bei Patientinnen ohne Karzinom bei nur 22 ng DNA/ml Plasma liegt. Trotzdem existieren auch Patientinnen ohne Karzinom, die Werte von 70 ng DNA/ml Plasma (B14) oder 42 ng DNA/ml Plasma (B11) aufweisen.

Ergebnisse

63

4.9.5.2 Korrelation zwischen präoperativer DNA-Menge und Tumorgröße Ein Tumor wird klinisch nach der sogenannten TNM-Klassifikation eingeteilt. Dabei steht “T” für Größe des Primärtumors. “T1” bedeutet, dass der Tumor einen maximalen Durchmesser von 2 cm oder weniger aufweist; ein Tumor, der als “T2” klassifiziert wird hat dagegen einen Durchmesser von 2 bis 5 cm. Ein In situ Karzinom (1.4), also eine Ansammlung maligner Zellen, die noch keine eigene Blutversorgung besitzen und die noch nicht die Fähigkeit zu rascher Proliferation und invasivem Wachstum erlangt haben, werden daher in der TKlassifikation gesondert als “is” (in situ) aufgeführt (Tab. 3). Beim Vergleich der präoperativen DNA-Mengen im Plasma mit den verschiedenen T-Werten der Primärtumore konnte eine Korrelation nachgewiesen werden (Abb. 27).

Abb. 27: Korrelation zwischen Tumorgröße und präoperativer Menge an Plasma-DNA Vergleich der präoperativen Plasma-DNA-Mengen verschiedener TKlassifikations-Werte. is: In situ Karzinom (n=3), 1: Tumorgröße 2 cm oder weniger (n=5), 2: Tumorgröße 2 bis 5 cm (n=11).

Ergebnisse

64

Der Mittelwert der präoperativen Plasma-DNA bei Patientinnen mit In situ Karzinom (is) liegt bei 4,5 ng/ml. Dagegen weisen Patientinnen mit einem T1-Tumor im Mittel 13,6 ng und Patientinnen mit einem T2-Primärtumor 65,6 ng DNA/ml Plasma auf (Abb. 27). Bei der Korrelation der reinen Tumorgröße – ohne Berücksichtigung der Besonderheit des In situ Karzinoms - ergibt sich ein Mittelwert der präoperativen Plasma-DNA von 7,9 ng DNA/ml Plasma in Patientinnen mit einem Primärtumor kleiner als 2,5 cm Durchmesser und von 80 ng DNA/ml Plasma bei einem Tumor, der größer ist als 2,5 cm. Die übrigen klinischen Daten wie Tumorart, Alter, Grading, Rezeptorstatus des Tumors, Proliferationsgrad und HER2neu-Expression zeigten keine Korrelation mit der präoperativen Plasma-DNA-Menge.

4.10Plasma-DNA bei gesunden Frauen Die DNA-Konzentration im Plasma von gesunden Frauen ist sehr gering. Wie in Abb. 22 auf Seite 54 gezeigt, streuen die Werte von 54 Frauen von 28 pg bis 30 ng pro ml Plasma und zeigen einen Mittelwert von nur 1,5 ng/ml (4.9.2). Um die Frage der Herkunft der DNA von gesunden Frauen aufzuklären, wurde untersucht, ob die DNA-Menge im Plasma zyklus- bzw. hormonabhängig schwankt. Dafür wurden von zwei Frauen, die keine Hormone wie die “Pille” und auch keine Hormonsubstitution erhalten, während verschiedener Tage des weiblichen Zyklus Blutproben abgenommen. Die Plasma-DNA wurde dann isoliert (3.2.2.1) und mit Hilfe der Realtime-PCR quantifiziert (3.2.3.2).

Ergebnisse

65

4.10.1 Während der Menstruation ist die Plasma-DNA-Menge erhöht Die Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierung von zwei unterschiedlichen Frauen im Verlauf des weiblichen Zyklus zeigt die folgende Abbildung (Abb. 28).

Abb. 28: Plasma-DNA im Verlaufe des weiblichen Zyklus A: Werte der DNA im Plasma von Frau 1 über den Zyklus (Zyklustage 1 bis 28) ermittelt über Realtime-Quantifizierung. Die Messwerte bzw. Blutabnahmen stammen von mehreren Zyklen. B: Plasma-DNA von Frau 1 im Verlaufe eines weiblichen Zyklus. C: DNA im Plasma von Frau 2 im Verlaufe eines Zyklus.

Von einer der beiden Frauen (Frau 1) lagen Blutproben von mehreren Zyklen vor. Die PlasmaDNA zeigt hier deutlich erhöhte Werte während der Menstruation (Zyklustage 1 bis 5 in Abb. 28A). Die höchsten Werte lagen bei 6,4 ng und 13,5 ng DNA/ml Plasma und stammten von den Zyklustagen 3 und 4 während der Menstruation. Deutlich niedrigere DNA-Konzentrationen waren beispielsweise an den Zyklustagen 15 mit nur 0,4 ng DNA/ml Plasma und 25 mit 0,8 ng

Ergebnisse

66

DNA/ml Plasma messbar. Von derselben Frau wurde zur genaueren Analyse ein einzelner Zyklus analysiert. Dafür erfolgten Blutabnahmen an sechs aufeinanderfolgenden Zyklustagen: 28, 1 (Beginn der Menstruation), 2, 3, 4, 5 und 6. Die DNA-Konzentrationen im Plasma zeigten bei der Analyse dieser Proben einen deutlichen erhöhten Wert an Tag 4 (Abb. 28B). Der DNASpiegel an diesem Zyklustag beträgt etwa 14 ng DNA/ml Plasma, während der normale Wert bei etwa 2 ng DNA/ml Plasma liegt. Die Analyse eines gesamten weiblichen Zyklus wurde noch an einer anderen Frau durchgeführt (Frau 2). Auch bei dieser Frau zeigt sich ein erhöhter DNAWert während der Menstruation: Am Zyklustag 3 zeigt sich ein DNA-Spiegel von 3 ng DNA/ml Plasma, während der normale Level bei etwa 0,5 ng DNA/ml Plasma liegt (Abb. 28C). Die absoluten DNA-Mengen im Plasma dieser beiden Frauen sind unterschiedlich hoch: der normale Level bei Frau 1 liegt bei etwa 3 ng DNA/ml Plasma, während er bei Frau 2 bei etwa 0,5 ng DNA/ml Plasma liegt. Dennoch ist aber bei beiden eine deutliche Erhöhung während der Menstruation erkennbar.

4.10.2 Menge an DNA im Plasma scheint unabhängig von Östrogenexposition Die Frage, ob die Menge der Plasma-DNA hormonabhängig schwankt, lässt sich gut an hysterektomierten Frauen untersuchen, also Frauen, denen die Gebärmutter vor einiger Zeit entfernt wurde. Solche Frauen benötigen Östrogenpräparate, so dass es erforderlich war, den Frauen in wöchentlich steigenden Dosen Östrogen zu verabreichen, um die optimale Dosis zu ermitteln. Die Östrogenmengen von 0,3 mg bis 0,8 mg Presomen sind alle im Rahmen medizinisch angewandter Dosen. Es wurden also die Plasma-DNA-Mengen von drei hysterektomierten Frauen mit wöchentlich steigenden Östrogenmengen bestimmt (Abb. 29).

Abb. 29: Plasma-DNA von drei Frauen unter steigender Östrogenexposition Gezeigt sind die Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierung von drei hysterektomierten (d.h. ohne Gebärmutter) Frauen unter wöchentlich steigender Östrogenexposition: von 0 bis 0,8 mg Presomen. Die Blutproben wurden nach je einer Woche unter der angegebenen Östrogenexposition abgenommen.

Ergebnisse

67

Die Blutabnahmen und somit auch die DNA-Messungen erfolgten jeweils vor Beginn der Östrogenexposition und dann nach je einer Woche der angegebenen Östrogenmenge (Abb. 29). Bei einer der Frauen ist eine Zunahme der DNA im Plasma erkennbar (Abb. 29, mitte). Bei den anderen beiden Frauen jedoch zeigt sich keine deutliche tendenzielle Änderung der DNA-Menge im Plasma. Es ist allerdings interessant, dass die drei Frauen sehr unterschiedliche Mengen an Plasma-DNA aufweisen, die dann trotz Östrogenexposition etwa gleich bleibt. Während die erste Frau (Abb. 29, links) im Mittel etwa 4 ng DNA/ml Plasma aufweist, hat die zweite Frau eine sehr viel geringere DNA-Menge von nur 0,08 ng/ml im Plasma (Abb. 29, mitte) und die dritte Frau weist um die 8 ng DNA/ml Plasma auf (Abb. 29, rechts).

Diskussion

68

5 Diskussion 5.1 Konzentration der DNA im Plasma In der Studie mit den 30 unterschiedlichen Tumorpatienten konnte gezeigt werden, dass Tumorpatienten mit durchschnittlich 219 ng DNA/ml Plasma (Abb. 30) im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen mit nur 3,14 ng DNA/ml Plasma deutlich erhöhte Mengen an frei zirkulierender DNA im Plasma aufweisen (4.1). Die Studie an 20 Patientinnen mit Brustkrebs zeigte einen Mittelwert von 41 ng DNA/ml Plasma (Abb. 30) im Gegensatz zu 54 gesunden Kontrollen, die nur 1,5 ng/ml Plasma aufweisen (4.9.1, 4.9.2). Diese Tatsache, dass die Tumorpatienten der ersten Studie deutlich höhere DNA-Mengen im Plasma aufweisen ist insofern interessant, da sich die 30 Patienten der ersten Studie alle in einem sehr weit fortgeschrittenen Stadium der Krankheit befinden. Die

meisten

dieser

Patienten

Fernmetastasen auf und zeigen

weisen inoperable

Tumore im Endstadium. Dagegen weist keine der Patientinnen der Brustkrebsstudie Fernmetastasen auf und die Tumore zeigen höchstens Stadium T2, also eine Tumorgröße von kleiner als 5 cm Durchmesser. Diese Tendenz, dass Patienten mit weiter fortgeschrittenen Tumoren eine größere Menge an DNA im Plasma aufweisen als Patienten mit kleinen Tumoren ohne Metastasen zeigte sich auch bei der Korrelation von Plasma-DNA und

Abb. 30: DNA-Mengen im Plasma beider Tumorpatientengruppen Gezeigt sind die Mittelwerte der über kompetitive PCR bzw. Realtime-PCR ermittelten DNA-Mengen im Plasma von 68 Kontrollpersonen (Ko), 20 BrustkrebsPatientinnen (1) und 30 Patienten mit verschiedenen, aber weit fortgeschrittenen Tumorerkrankungen (2).

Tumorgröße der Brustkrebsstudie. Dort zeigten Patientinnen mit T2-Tumoren (Tumorgröße von 2-5 cm) mit 65,6 ng DNA/ml Plasma deutlich höhere DNA-Mengen als die Patientinnen mit einem T1-Tumor (13,6 ng/ml; Tumorgröße 1-2 cm) oder einem In situ Karzinom (4,5 ng/ml; 4.9.5.2). Auch bei der Korrelation der reinen Tumorgröße – ohne Berücksichtigung der Besonderheit des In situ Karzinoms - ergab sich ein Mittelwert der Plasma-DNA von 7,9 ng DNA/ml Plasma in Patientinnen mit einem Primärtumor

Diskussion

69

kleiner als 2,5 cm Durchmesser und von 80 ng DNA/ml Plasma bei einem Tumor, der größer ist als 2,5 cm (4.9.5.2). Betrachtet man die DNA-Mengen im Plasma aller Tumorpatienten der beiden Studien, so zeigt sich insgesamt eine weite Streuung: von 30 pg DNA/ml Plasma (Patientin B24 der Brustkrebsstudie) bis zu 1200 ng DNA/ml Plasma bei einem Patienten mit Pankreas-Karzinom (C14). Demnach zeigen die DNA-Mengen im Plasma von Tumorpatienten keine klare Korrelation zur Art des Primärtumors. Außerdem sind die individuellen Unterschiede in der Plasma-DNA-Menge oft trotz ähnlichem klinischem Status des Patienten groß (4.1; 4.9.1). Diese Variationen der Plasma-DNA mit ähnlichem klinischem Bild wurde auch von anderen Gruppen gefunden (Leon et al., 1975 und 1977a; Anker et al., 1999). Eine mögliche Erklärung dafür könnten individuelle Unterschiede im Katabolismus der DNA in verschiedenen Patienten sein; eine Hypothese, die sich durch die Plasma-DNA-Messung gesunder Frauen erhärtet, die deutliche Unterschiede von Probandin zu Probandin zeigen, die von 0,08 bis 8 ng DNA/ml streuen (4.10.1; 4.10.2). Eine DNA-Menge von 100 ng DNA/ml Plasma stammt von ca. 50 Millionen Zellen, wenn man davon ausgeht, dass die frei zirkulierende DNA im Plasma aus zugrunde gegangenen Zellen des Körpers stammt. Ein Tumor von 1 Kubikzentimeter besteht nach Folkman aus bis zu 1 Milliarde Zellen (Folkman, 1985). Daher würde die DNA eines Patienten mit 100 ng DNA/ml Plasma aus etwa 50 mm3 Tumorgewebe bzw. umliegendem Gewebe stammen. Bei gesunden Kontrollpersonen, die im Schnitt etwa 2 ng DNA/ml aufweisen, würde die DNA im Plasma aus 1 Million Körperzellen stammen.

5.2 Ursprung der Plasma-DNA: Tumorzellen Eine der zentralen Fragen dieser Arbeit ist die Herkunft der Plasma-DNA. Es ist bisher nicht untersucht worden, aus welchen Zellen die DNA im Plasma stammt (Anker et al., 1999). Grundsätzlich kann die DNA im Plasma von Tumorpatienten aus dem Tumorgewebe selbst stammen, oder aus anderen Zellen, die den Tumor umgeben. Es besteht aber auch die Möglichkeit, dass die DNA beispielsweise aus tumorinfiltrierenden T-Lymphozyten stammt (TIL; 1.3), die während ihrer Interaktion mit den Tumorzellen zugrunde gehen.

Diskussion

70

5.2.1 Detektion von Tumor-DNA im Plasma Um die Frage zu untersuchen, ob die DNA im Plasma von Tumorpatienten aus dem Tumorgewebe selbst stammt, wurde in der DNA nach tumorbedingten genetischen Veränderungen gesucht. Zunächst wurde die DNA über direktes Sequenzieren auf Mutationen in TP53 untersucht, da bei mehr als 50% aller Krebsfälle Mutationen in diesem Gen vorliegen (1.1.1; Levine, 1997; Soussi, 2000a). Es wurde dafür bei 15 unterschiedlichen Tumorpatienten der gesamte Hotspotbereich des Gens, der sich von Exon 5 bis Exon 8 erstreckt, mit Hilfe von PCR amplifiziert und die Produkte über direktes Sequenzieren analysiert. Mit dieser Methode wurde bei keinem Patienten eine Mutation in TP53 detektiert. Durch einen Kontrollversuch konnte gezeigt werden, dass die Sensitivität der direkten Sequenzierung von PCR-Produkten nicht sehr hoch ist, da etwa 30% der DNA eine gegebene Mutation aufweisen muss. Das Ergebnis der Suche nach TP53-Mutationen impliziert also, dass bei diesen Patienten entweder keine Mutation in diesem Gen vorliegt, oder - und das scheint aufgrund der Häufigkeit von 50% bei verschiedenen Tumorarten wahrscheinlicher - dass der Anteil der DNA aus dem Tumorgewebe weniger als 30% der gesamten Plasma-DNA ausmacht. Neben Mutationen in TP53 wurde die Plasma-DNA noch auf Mutationen in einem weiteren Gen untersucht, dem Gen des K-ras Proto-Onkogens. Die Häufigkeit von KRAS-Mutationen liegt beim Pankreas-Karzinom bei über 90 Prozent, bei Colon-Karzinomen und SchilddrüsenTumoren bei 50% und bei Lungenkrebs bei 30% (Longnecker und Terhune, 1998; Bos, 1989). Durch direkte Sequenzierung der 4 Hotspot-Codons (4.2.2) konnte auch in KRAS bei keinem der 25 analysierten Tumorpatienten eine Mutation nachgewiesen werden. Um das Problem der Sensitivität zu lösen, wurde im Folgenden eine Methode verwendet, die dadurch hoch sensitiv ist, dass man selektiv nur mutierte Sequenzen des KRAS Onkogens amplifiziert. Mit dieser Methode wurde in einem von 30 untersuchten Patienten mit kleinzelligem Lungen-Karzinom (T1) eine Mutation detektiert, die identisch mit der des Tumorgewebes ist (3.2.4.2). Bei Lungenkrebs liegt die Inzidenz von KRAS-Mutationen bei 30% (Bos, 1989). Diese Mutation war mit der direkten Sequenzierung nicht nachweisbar, d.h. dass in diesem Patienten ein Anteil von weniger als 30% der Plasma-DNA aus dem Tumorgewebe stammt. Neben Mutationen wurde in der Plasma-DNA auch nach einer Hypermethylierung des CDKN2A-Promotor-Bereiches gesucht, einer epigenetischen Modifikation, die charakteristisch für die DNA in vielen verschiedenen Tumorarten ist (Baylin et al., 1998; 1.1.1). Der Methylierungsstatus dieses Promotor-Bereiches wurde mit Hilfe einer methylierungsspezifischen PCR untersucht, bei der methylierte und unmethylierte Allele nebeneinander

Diskussion

71

analysiert werden können. Mit Hilfe dieser methylierungs-spezifischen PCR wurde bei 11 der 25 untersuchten

Patienten

mit

unterschiedlichen

Primärtumoren,

also

bei

44%,

eine

Hypermethylierung der CDKN2A-Promotorregion im Plasma detektiert. Die positiven Patienten haben Krebsarten, bei denen bereits von CDKN2A-Hypermethylierung berichtet wurde: beispielsweise Brustkrebs, Kopf-Hals-Karzinom (Sanchez-Cespedes et al., 2000), ColonKarzinom und Lungenkrebs (Herman et al., 1995), malignes Melanom (Gonzalgo et al., 1997), und Pankreas-Karzinom (Ueki et al., 2000). Bei dem Angiosarkom des Herzens, wurde der Methylierungsstatus des CDKN2A-Promotors bisher allerdings nicht untersucht; bisher wurden bei dieser Krebsart nur Mutationen in KRAS und TP53 detektiert (Naka et al., 1997; Garcia et al., 2000). Der Prozentsatz von 44% positiven Patienten entspricht in etwa den bisher beobachteten Häufigkeiten

von

Hypermethylierung

des

CDKN2A-Genpromotors

im

Tumorgewebe

verschiedener Tumorpatienten (Merlo et al., 1995; Baylin et al., 1998; Costello et al., 1996; Herman et al., 1995, 1996b; Cairns et al., 1995; Reed et al., 1996). Bei den Patienten, bei denen neben der Plasmaprobe noch ein Stück des Tumorgewebes vorlag, wies sowohl die Plasma-DNA als auch die Tumor-DNA CDKN2A-Hypermethylierung auf. In der Brustkrebs-Studie zeigten 4 von 20 (20%) untersuchten Patientinnen hypermethylierte CDKN2A-Sequenzen im Plasma. Dies entspricht der Häufigkeit von anderen Studien, in der der Methylierungsgrad dieses Gens im Brustkrebsgewebe untersucht wurde: einen Prozentsatz von ebenfalls 20% detektierte Hui (Hui et al., 2000), 23% bzw. 31% wurden bei anderen Gruppen angegeben (Silva et al., 1999 bzw. Baylin et al., 1998; Herman et al., 1995).

5.2.2 Quantifizierung der Tumor-DNA im Plasma Entscheidend für die Herkunft der DNA im Plasma von Tumorpatienten ist, dass alle positiven Plasma-DNA-Proben sowohl methylierte als auch unmethylierte CDKN2A-Promotor-Sequenzen enthalten. Ein Teil der DNA im Plasma von Tumorpatienten stammt demnach aus den Tumorzellen, während ein gewisser Anteil der DNA aus anderen Quellen zu kommen scheint. Daher sollte im Folgenden der Anteil der DNA, der aus dem Tumorgewebe stammt, bestimmt werden. Aus methodischen Gründen wurde dafür die Hypermethylierung des CDKN2APromotors benutzt. Es wurde eine neue Methode etabliert, die es ermöglicht, hypermethylierte Tumor-DNA und unmethylierte DNA von Nicht-Tumorzellen in parallelen Ansätzen mit Hilfe einer quantitativen methylierungs-spezifischen Realtime-PCR zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, daß manche Plasma-DNA-Proben zu einem hohen prozentualen Anteil aus

Diskussion

72

hypermethylierter Tumor-DNA stammen, während andere vor allem aus Nicht-Tumorzellen stammen (4.3, 4.9.4). Beim Vergleich der beiden unterschiedlichen Patientenstudien fällt auf, dass die prozentualen Anteile der Tumor-DNA bei den Patienten mit fortgeschrittener Tumorerkrankung höher sind als die der Brustkrebs-Patientinnen, die keine Fernmetastasen und nur Tumore bis zu einer Größe von 5 cm Durchmesser aufweisen (Abb. 30). Eine Korrelation zwischen dem Anteil der methylierten Tumor-DNA und der Größe des Primärtumors oder anderen klinischen Daten ist schwierig, weil nur von zwei der vier Patientinnen der Brustkrebsstudie genügend bekannt ist. Patientin B4 hat ein Lymphknotenrezidiv, daher gibt es keine Angaben zu einem Primärtumor und Patientin B15 wurde noch nicht operiert, so dass man über die Größe des Tumors bisher nichts aussagen kann. Interessanterweise ist aber die Menge der Tumor-DNA innerhalb der beiden verschiedenen Studien oft größer, wenn der Spiegel an gesamter Plasma-DNA niedrig ist. Vergleicht man die Ergebnisse der Gesamt-Plasma-DNA und dem Anteil der methylierten Tumor-DNA mit der Klinik der Patienten, so ergibt sich das folgende Bild: Tumorpatienten mit Metastasen weisen eine große Menge an Plasma-DNA auf, von der ein sehr großer Anteil aus dem Tumor kommt (5.1). Eine Erklärung für die hohe Menge an Gesamt-Plasma-DNA wäre, dass der invasive Tumor zum einen in das

umgebende

gesunde

Gewebe

infiltriert und somit eine Zerstörung der umgebenden Zellen bewirkt (Folkman, 1985) und zum anderen gehäuft Tumorzellnekrose auftritt (Churg et al., 2000). Der hohe Anteil an methylierter DNA aus dem Tumor könnte durch die Metastasierung kommen, denn die Mehrzahl der Metastasen werden in der Blutzirkulation von den T-Zellen erkannt und durch

Abb. 31: Prozentuale Anteile der methylierten Tumor-DNA im Plasma der Tumorpatienten Gezeigt sind die Anteile der methylierten DNA in Prozent von der gesamten Plasma-DNA. Die Patienten mit fortgeschrittener Tumorerkrankung stammen von der ersten Studie und haben unterschiedliche Primärtumore; die Patienten ohne Metastasen sind die Brustkrebs-Patientinnen.

Induktion von apoptotischem Zelltod abge tötet (1.2; Hausen, 1992). Patienten mit invasivem, großem Tumor aber ohne Fernmetastasierung weisen höhere DNA-Mengen im Plasma auf als Patienten mit kleinerem Tumor (4.9.5), zeigen

Diskussion

73

aber wenig methylierte DNA aus dem Tumor (5.1). Eine Erklärung für die erhöhte DNA-Menge im Plasma wäre ebenfalls die Infiltration und Zerstörung des umliegenden Gewebes (Folkman, 1985). Der hypoxie-induzierte apoptotische Zelltod der Tumorzellen nimmt allerdings aufgrund von erworbener Apoptoseresistenz in diesem Stadium eines schnell wachsenden Tumors meist stark ab (Symonds et al., 1994; Graeber et al., 1996; 1.5.2), und die Tumorzellnekrose ist geringer als im metastasierten Zustand (Churg et al., 2000), was den geringen Anteil an DNA aus dem Tumor erklären würde. Im Falle eines In situ Karzinoms, einem Frühstadium in dem der Tumor noch kein eigenes Blutgefäßsystem besitzt (1.4), sterben genausoviele Tumorzellen ab wie neue gebildet werden (Folkman und Haudenschild, 1980). Das könnte eine Erklärung dafür sein, dass bei dieser Frühform eines Tumors, bei der die Plasma-DNA-Konzentrationen im Vergleich mit denen der Kontrollpersonen kaum eine Erhöhung aufweisen (4.9.5.2), dennoch Tumor-DNA im Plasma gefunden werden kann (4.9.4.2). Die geringen Mengen an Plasma-DNA bei diesem Tumortyp lassen sich vermutlich darauf zurückführen, dass noch keine Invasion des Tumors ins umliegende Gewebe stattgefunden hat, die eine Zerstörung der umgebenden Zellen bewirken könnte. Berechnet man aus dem prozentualen Anteil der methylierten Tumor-DNA die absolute Menge an methylierter DNA, so kommt man auf Werte von im Mittel 12 ng DNA/ml bei den fortgeschrittenen Tumorerkrankungen und von nur 0,2 ng DNA/ml bei den BrustkrebsPatientinnen. Diese DNA-Mengen entsprechen zwischen 105 und 106 zugrunde gegangene Tumorzellen im gesamten Plasma, die eine CDKN2A-Hypermethylierung aufweisen. Nach den Berechnungen von 5.1 stammt diese DNA aus etwa 0,1 mm3 bis 6 mm3 Tumorgewebe. Wenn man jedoch die einzelnen Patienten betrachtet, sind die Unterschiede in Plasma-DNA und Gesamt-Plasma-DNA oft trotz sehr ähnlicher klinischer Situation sehr unterschiedlich, was mit individuellen Unterschieden im Katabolismus der DNA zu erklären sein könnte. Insgesamt kann man feststellen, dass die Tumor-DNA – insbesondere bei einem relativ früh erkannten Tumor – nicht die Hauptkomponente der Plasma darstellt. Dies wird indirekt auch von anderen Gruppen gezeigt, da diese nur mit hoch sensitiven Methoden der Mutationsdetektion wie MASA-PCR (3.2.4.2) oder RFLP-PCR (restriction fragment length polymorphism) Mutationen detektieren konnten (Sorenson et al., 1994; Anker et al., 1997, 1999). Obwohl Änderungen im Methylierungsstatus des CDKN2A-Tumorsuppressorgenes zu den frühen genetischen Veränderungen während der Tumorentwicklung gehören (Belinsky et al., 1998; Nuovo et al., 1999; Warnecke und Bestor, 2000), ist es aber entscheidend, die Anwesenheit von methylierter DNA

Diskussion

74

nicht mit Tumor-DNA gleichzusetzen, da ein Tumor insbesondere bei weiter fortgeschrittener Erkrankung nicht aus einem Klon gleichartiger Zellen mit denselben genetischen Veränderungen besteht. Die Menge an Tumor-DNA kann also bei weitem höhere Werte ausmachen als die anhand der CDKN2A-Hypermethylierung bestimmten Tumor-DNA-Mengen.

5.3 Ursprung der Plasma-DNA: Umgebende Zellen des Tumors Es konnte gezeigt werden, dass nicht die gesamte Plasma-DNA aus Tumorzellen stammt. So haben auch andere Gruppen stets Wildtyp-DNA im Plasma aller Tumorpatienten detektiert (Anker et al., 1999). Eine denkbare Quelle für diese DNA könnten tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL, 1.3) darstellen, die in ihrer Aktion als zelluläre Immunabwehr in vielen Tumoren akkumulieren (Kradin und Bhan, 1993; Halapi, 1998). Diese Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) weisen einen hohen Turnover auf (Soares et al., 2000) und können sogar von den Tumorzellen selbst zur Apoptose getrieben werden (O`Connell et al., 2000). Die DNA der apoptotischen T-Lymphozyten könnte somit zur Plasma-DNA der Tumorpatienten beitragen. Mit Hilfe einer T-Lymphozyten-spezifischen PCR konnte in dieser Arbeit allerdings gezeigt werden, dass nur bei zwei der zwanzig untersuchten Tumorpatienten T-Lymphozyten-DNA im Plasma vorhanden war (4.4): bei einem Patienten mit Pankreas-Karzinom (C14) und bei einem Patienten mit Magen-Karzinom (T5). Das bedeutet, daß T-Lymphozyten zumeist nicht die Quelle der Nicht-Tumor-DNA im Plasma von Krebspatienten darstellen. Neben den T-Lymphozyten wurde zudem die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass Anteile der Plasma-DNA aus Endothelzellen stammen. Denn während der Vaskularisierung eines entstehenden Tumors, der durch die Tumorzellen selbst angeregt wird (Rak et al., 1995; Griffioen und Molema, 2000; Hanahan und Weinberg, 2000) kommt es zur Gefäßneubildung, der Angiogenese (1.4). Die neu gebildeten Kapillaren wachsen dann in Richtung Tumor und dringen in die Tumorzellkolonie ein (Folkman, 1985). Beim Prozess der Angiogenese kommt es vor der Gefäßneubildung zu einem Abbau der alten Endothelzellen an dieser Stelle (Folkman, 1985), sodass es vorstellbar wäre, dass die DNA dieser zerstörten Endothelzellen sich im Plasma von Tumorzellen wiederfindet. Durch die Entwicklung einer methylierungs-spezifischen PCRMethode konnte allerdings gezeigt werden, das bei keinem der untersuchten Tumorpatienten Endothelzell-DNA nachweisbar war (4.5). Die Nicht-Tumor-DNA im Plasma von Tumorpatienten scheint also zumeist weder aus TLymphozyten noch aus Endothelzellen zu stammen. Die Herkunft dieser Wildtyp-Plasma-DNA

Diskussion

75

wurde in dieser Arbeit erstmalig untersucht. Am wahrscheinlichsten ist, dass der wachsende Tumor das ihn umgebende Gewebe partiell zerstört, indem es von der Sauerstoff- bzw. Nährstoffzufuhr abgedrängt wird, und diese Zellen des normalen Gewebes um den Tumor apoptotisch oder nekrotisch zugrunde gehen. Untersuchungen an Leberkarzinomen zeigen sogar, dass Tumorzellen Apoptose der umgebenden Zellen induzieren können. Es wird darin von einer verstärkten Expression von sowohl Fas, dem Rezeptor für Apoptose (1.5.3; Nagata, 1996), als auch von dessen Rezeptor, dem Fas-Liganden, in den Hepatozyten um den Tumor berichtet, während innerhalb des Tumors keine Überexpression dieser Proteine beobachtet werden konnte (Roskams et al., 2000). Auch Untersuchungen an Hirntumoren zeigen degenerative Veränderungen des Gewebes um den Tumor (Majchrowska et al., 1995). Dies spricht also dafür, dass zumindest ein Teil der erhöhten DNA-Mengen im Plasma von Tumorpatienten aus apoptotisch zugrunde gehenden Zellen des Tumor-umgebenden Gewebes stammt.

5.4 Ursprung der DNA bei gesunden Kontrollpersonen Gesunde Personen weisen sehr geringe, aber stets messbare Mengen an DNA im Plasma auf (4.1.1; 4.9.2). Dabei streuen die DNA-Konzentrationen der verschiedenen Probanden von nur 0,03 ng bis zu 30 ng DNA/ml Plasma. Eine DNA-Menge von 2 ng DNA/ml stammt aus etwa 1 Million zugrunde gegangener Zellen des Körpers. Die Herkunft dieser DNA konnte aufgrund der geringen Mengen nicht genauer analysierte werden, beispielsweise mit dem für die Tumorpatienten entwickelten Endothelzell- oder TLymphozyten-Test. Die wahrscheinlichste Quelle sind einerseits bei der Prozedur der PlasmaIsolierung zerstörte Blutzellen und andererseits apoptotisch zugrunde gegangene Zellen des Immunsystems wie T- oder B-Lymphozyten oder der anderen weiße Blutzellen, die bekanntlich einen hohen Turnover aufweisen (Soares et al., 2000), sowie anderer apoptotischer Zellen des Körpers. Um der Frage der Herkunft der DNA im Plasma gesunder Menschen näherzukommen, wurden zwei Hypothesen an gesunden Frauen untersucht: die Zyklusabhängigkeit und die Hormonabhängigkeit der DNA-Spiegel im Blutplasma. Zunächst wurde untersucht, ob die DNA im Plasma im Verlaufe des weiblichen Zyklus schwankt. Tatsächlich konnte an zwei Frauen gezeigt werden, dass die DNA-Menge im Plasma während der Menstruation – genauer gesagt am 3. bis 4. Zyklustag – deutlich erhöhte Werte zeigt: Bei einer Frau liegt eine Erhöhung von 2 ng bis auf 14 ng DNA/ml Plasma vor, also ein

Diskussion

76

Anstieg von 700%, während er bei der zweiten Frau von 0,5 ng auf 3 ng DNA/ml Plasma ansteigt, was einem prozentualen Anstieg von 600% entspricht (4.10.1). Die DNA scheint also während der Menstruation erhöht zu sein. Während dem Abstoßprozess des Endometriums kommt es zu einer massiven Gewebsdestruktion (Tabibzadeh, 1996; Tschugguel et al., 1999), sodass es naheliegend ist, dass die DNA einiger dieser Zellen in den Blutkreislauf gelangen könnte. Zudem konnte eine Studie, die den apoptotischen Index des Endometriums – also die Zahl der apoptotischen Zellen pro Quadratmillimeter Gewebe – während dem weiblichen Zyklus analysiert hat, zeigen, dass der apoptotische Index zwei Tage vor der Menstruation ansteigt und einen Peak am Ende der Menstruation bei Zyklustag 2 aufweist (Dahmoun et al., 1999). Eine andere Arbeitsgruppe konnte nachweisen, dass die Zahl der apoptotischen Zellen im Endometrium während der Menstruation doppelt so hoch sind wie in der proliferativen Phase (Tschugguel et al., 1999). Neben der Zyklusabhängigkeit der Plasma-DNA-Spiegel in gesunden Frauen wurde auch noch die Frage der Hormonabhängigkeit untersucht. Da Östrogene eine gesteigerte Proliferation und genetische Veränderungen der hormonabhängige Zellen wie z.B. der Brust bewirken (Souza et al., 1988), besteht die Möglichkeit, dass die DNA dieser apoptotischen Zellen im Blutplasma erscheint und dort nachweisbar wäre. Bei einer Erhöhung der Östrogenmenge im Körper sollte nach dieser Hypothese auch die Erhöhung der DNA-Menge im Plasma messbar sein. Um diese Frage zu untersuchen, wurden drei hysterektomierte Frauen, also Frauen ohne Gebärmutter, mit wöchentlich steigenden Östrogenmengen exponiert. Es zeigte sich bei einer der drei Frauen eine Erhöhung der DNA von 215% nach Gabe von 0,6 mg Presomen im Vergleich zu 0 mg Presomen; die anderen beiden Frauen zeigten aber keine deutliche dosisabhängige Zunahme der DNA im Plasma (4.10.2). Für eine klare Aussage darüber wäre eine Untersuchung weiterer Frauen, vielleicht mit einer noch sensitiveren Methode, nötig. Somit kann die Hormonabhängigkeit der Plasma-DNA-Spiegel nicht ausgeschlossen werden kann.

5.5 Mechanismus der Freisetzung der DNA ins Plasma Der Mechanismus, über den die DNA in den Blutkreislauf gelangt, ist bisher noch kaum untersucht worden (Anker et al., 1999). Es gibt zwar Untersuchungen, die zeigen dass beispielsweise T-Lymphozyten oder ganze Organe aktiv DNA freisetzen, so dass ein aktiver DNARelease von Tumorzellen eine viel diskutierte Hypothese über den Ursprung der DNA im Plasma ist (Rogers et al., 1972, 1976; Anker et al., 1975; Anker et al., 1999), aber eine weitaus naheliegendere Hypothese ist, dass die DNA aus sterbenden Zellen des Körpers ausgeschüttet

Diskussion

77

wird und so in den Blutkreislauf gelangt. Die hauptsächlichen Formen des Zelltodes im Körper sind Apoptose und Nekrose (1.5). Um die Frage zu klären, ob DNA aus sterbenden Zellen überhaupt in die Umgebung freigesetzt wird - eine Voraussetzung für das Erscheinen von DNA im menschlichen Blutplasma - wurden zunächst in vitro Versuche durchgeführt. Bei Jurkat TLymphozyten, die in Zellkultur durch Zugabe von Staurosporin bzw. Oligomycin und Staurosporin in Apoptose bzw. Nekrose getrieben wurden, zeigt sich bei beiden Ansätzen tatsächlich ein dramatischer Anstieg von DNA im Überstand, wobei der Anstieg bei den nekrotischen Zellen noch steiler ist (4.7). Im Körper wird die DNA der apoptotischen und nekrotischen Zellen gewöhnlich von Makrophagen aufgenommen und abgebaut (Ren und Savill, 1998; Green und Beere, 2000). Daher sollte die DNA sterbender Zellen im Körper eigentlich nicht im Blutkreislauf erscheinen. Um dieses Paradoxon zu untersuchen, wurden in vivo Versuche an einem etablierten Mausmodell durchgeführt, bei denen mit anti-CD95 und Paracetamol Apoptose bzw. Nekrose der Leberzellen induziert werden konnte (3.2.10). Es zeigte sich, dass in beiden Situationen frei zirkulierende DNA in Form von Chromatinfragmenten ins Blutplasma ausgeschüttet wurde. Eine Analyse dieser DNA zeigte interessanterweise, dass die Fragmente, die durch Apoptose und Nekrose ins Plasma freigesetzt werden, unterschiedliche Größenmuster aufweisen. Während Apoptose von Leberzellen DNA-Fragmente von 180 bp und Vielfachen davon erzeugt, sind es bei der Nekrose große Fragmente von mehr als 10 000 bp (4.8.2). Da die DNA im Plasma von Tumorpatienten aus diesen beiden unterschiedlichen Fragmentmustern besteht (4.6.2), und Kontrollpersonen Fragmente von 180 bp Länge aufweisen (4.6.1), liegt die Vermutung nahe, dass die DNA im Plasma von gesunden Menschen aus apoptotischen Zellen des Körpers stammt, wie z.B. weißen Blutzellen, und bei Tumorpatienten aus Zellen, die durch Apoptose und/oder Nekrose im expandierenden Tumorgewebe zugrunde gehen (5.2). So ist z.B. bekannt, dass der Mechanismus, über den die T-Lymphozyten die Tumorzellen eliminieren, über eine Induktion von Apoptose stattfindet (Cotter et al., 1990). Nekrotischer Zelltod ist ebenfalls wahrscheinlich, da man beispielsweise erhöhte Plasma-DNA-Mengen in Patienten nach Bestrahlungstherapie findet (Holdenrieder et al., 1999) und man höhere DNAMengen im Plasma von Patienten mit großen Tumoren und mit Metastasen gefunden hat (4.9.5.2, Leon et al., 1977a; Maebo, 1990; Fournie et al., 1995). Die Untersuchungen an Jurkat T-Lymphozyten und an Mausmodellen verbunden mit den Analysen der Plasma-DNA beim Menschen machen es folglich sehr wahrscheinlich, dass die DNA im Plasma von Tumorpatienten und von Kontrollpersonen aus sterbenden Zellen des Körpers stammt.

Diskussion

78

5.6 Gründe für die Anwesenheit von DNA im Plasma Wenn man davon ausgeht, dass die DNA im Plasma von Tumorpatienten und auch von Gesunden aus Zellen des Körpers stammt, die durch apoptotischen und/oder nekrotischen Zelltod zugrunde gehen, ist es eigentlich ungewöhnlich, Teile dieser zellulären DNA im Blutplasma wiederzufinden. Denn aus Gründen der Gefahr von lokalen Entzündungen und Autoimmunreaktionen wird die DNA aus solchen sterbenden Zellen gewöhnlich von Phagozyten aufgenommen und versorgt. Der Inhalt von Zellen, die apoptotisch zugrunde gehen, wird in apoptotische Vesikel verpackt, die dann von den Makrophagen aufgenommen und abgebaut werden (Savill, 1998; Ren und Savill, 1998). Auch der Zellinhalt nekrotischer Zellen wird von den Phagozyten entsorgt und beseitigt (Green und Beere, 2000). Es kann sein, dass – insbesondere an Orten mit hoher Gewebsdestruktion – die Phagozyten nicht in der Lage sind, sämtliche Bestandteile der sterbenden Zellen aufzunehmen, und ein Teil der DNA so die Möglichkeit hat, in die Blutzirkulation zu gelangen. Ein weiterer Punkt, der eigentlich gegen eine Anwesenheit von DNA im Blutplasma spricht, ist die Anwesenheit von DNasen, die die DNA abbauen und katabolisieren (Napirei et al., 2000). Allerdings konnten einige Untersuchungen zeigen, dass die DNA aus apoptotischen und nekrotischen Zellen sofort mit einem Schutzprotein umgeben wird, dem SAP-Protein (Serum amyloid P component). SAP ist ein konstitutiv exprimiertes, hoch konserviertes Plasmaprotein, das mit etwa 30 mg/l Plasma im Plasma vorkommt (Pepys und Butler, 1987) und zur Familie der Pentraxine gehört. Es wurde gezeigt, dass SAP kalziumabhängig an DNA, Chromatin und Nukleosomen-Core-Partikel bindet (Pepys und Butler, 1987) und durch diese Bindung die H1Histone verdrängt (Butler et al., 1990). Durch diese Bindung wird langes natives Chromatin löslich, das in den physiologischen Bedingungen der extrazellulären Flüssigkeiten unlöslich ist (Butler et al., 1990). Zudem weiß man, daß SAP in vivo an die Vesikel apoptotischer Zellen und an Zellkernstücke aus nekrotischen Zellen bindet (Breathnach et al., 1989). Untersuchungen an SAP-knockout-Mäusen zeigen, dass SAP in vitro und in vivo eine verlangsamte, kontrollierte Chromatin-Degradation bewirkt und somit Autoimmunerkrankungen durch freies Chromatin verhindert. Mäuse ohne SAP entwickeln eine Autoimmunerkrankung, die dem menschlichen SLE (systemischer Lupus Erythematodes) sehr ähnlich ist: einer Autoimmunerkrankung, die durch die Anwesenheit von Autoantikörpern gegen DNA und Chromatin gekennzeichnet ist (Bickerstaff et al., 1999). Die Hauptfunktion von SAP ist also die Bindung an freie DNA oder freies Chromatin im Plasma und die dadurch vermittelte Interaktion mit Komplementkomponenten (Hicks et al., 1992), die zur Clearance der DNA bzw. des Chromatins führen (Paul

Diskussion

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und Carroll, 1999). Bisher wurde eine Bindung von SAP an die Plasma-DNA nicht nachgewiesen, aber da die DNA offensichtlich nur langsam abgebaut wird und im Plasma nicht immunogen wirkt, ist dies höchst wahrscheinlich.

5.7 Plasma-DNA: Ausblick und potentieller medizinischer Nutzen In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Tumorpatienten erhöhte Mengen an DNA im Plasma aufweisen und dass die DNA-Menge im Plasma mit der Größe des Primärtumors korreliert. Allerdings ist die Anwesenheit einer gesteigerten DNA-Menge im Plasma kein Zeichen dafür, dass ein Tumor im Körper vorliegt, da auch Patienten mit anderen Erkrankungen wie Rheuma oder Autoimmunerkrankungen einen erhöhten Spiegel an DNA im Plasma aufweisen (Leon et al., 1975; Leon et al., 1977b; Raptis und Menard, 1980; Rumore und Steinman, 1990). Auf der anderen Seite ist aber auch ein niedriger Plasma-DNA-Wert kein Beweis dafür, dass kein Tumor vorliegt, da einige Patienten trotz fortgeschrittener Erkrankung keinen erhöhten DNA-Spiegel im Plasma aufweisen. Eine Detektion von Mutationen oder anderen genetischen Veränderungen in der DNA dagegen könnte für eine mögliche Frühdiagnose von Tumoren im Rahmen der Krebsvorsorge insbesondere familiär vorbelasteter Menschen von medizinischem Nutzen sein. Allerdings müsste dafür die Zahl der untersuchten Gene sehr hoch, und die Methode der Detektion genügend sensitiv sein, wie an der Studie mit den Brustkrebs-Patientinnen zu sehen ist, die weniger als 10% methylierte DNA aus dem Tumor in ihrem Plasma aufweisen. Die vorgestellte Quantifizierung von Tumor-DNA im Plasma könnte sich für eine Therapieverfolgung von Patienten als hilfreich erweisen, da ein Tumorrezidiv mit dieser Methode eventuell schneller erkennbar wäre als mit den herkömmlichen Methoden. Allerdings müsste auch für diesen Zweck eine Vielzahl von Onkogenen oder TumorsuppressorGenen analysiert werden, um bei möglichst vielen Patienten genetische Veränderungen zu detektieren. Ungeachtet der aufgeführten methodischen Schwierigkeiten ist die Analyse der Plasma-DNA von primärem Interesse für die moderne Biomedizin, da nunmehr eine nicht invasive Methode verfügbar ist und somit bei vielen Menschen routinemäßig durchgeführt werden könnte. Darüber hinaus gibt es auch Bestrebungen, die fötale DNA, die sich im Plasma werdender Mütter findet (Lo et al., 1997), auf Gendefekte zu untersuchen, was ebenfalls nicht invasive Alternative zur Fruchtwasseruntersuchung darstellen würde. Aus diesen Gründen wird das Thema Plasma-DNA in der Zukunft, wenn noch mehr über dieses Thema bekannt ist, vielleicht eine wichtige Verwendung in der modernen medizinischen Diagnostik finden.

Zusammenfassung

80

6 Zusammenfassung Im Blutplasma von Tumorpatienten zirkulieren DNA-Fragmente, von denen viele klinisch orientierte Studien berichten, aber von denen bisher keine genauere Charakterisierung erfolgt ist. Besonders der Ursprung der Plasma-DNA oder der Mechanismus über den die DNA in die Blutzirkulation gelangt, waren bisher unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die DNA im Plasma von Tumorpatienten mit Hilfe von kompetitiver PCR und Realtime-PCR quantifiziert werden. Es stellte sich nicht nur heraus, dass Tumorpatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen deutlich erhöhte Spiegel an DNA im Plasma aufweisen, sondern es zeigte sich zudem auch, dass Patienten mit weiter fortgeschrittener Erkrankung und Fernmetastasen größere DNA-Mengen aufweisen als Patienten ohne Metastasen. Des weiteren konnte an BrustkrebsPatientinnen eine Korrelation zwischen der DNA-Konzentration im Plasma und der Größe des Primärtumors identifiziert werden. In einer Studie mit Brustkrebs-Patientinnen zeigte sich, dass die präoperativ erhöhten Plasma-DNA-Mengen 3 Monate nach Tumorresektion wieder auf normale Werte fielen. Die Plasma-DNA wurde zusätzlich im Verlauf bzw. die Menge an TumorDNA im Plasma mit der Klinik der Patienten korreliert. Bei diesen Patientinnen, deren Klinik im Detail bekannt ist, wurde die Plasma-DNA im Verlauf der Therapie beobachtet. Eine nähere Charakterisierung dieser DNA zeigte, dass sich genetische Veränderungen in der freien DNA finden, die identisch mit denjenigen des Tumorgewebes sind. Da sich neben der mutierten Tumor-DNA stets auch Wildtyp-DNA im Plasma befindet, wurde eine Methode etabliert, die es ermöglicht, den Anteil der Tumor-DNA an der gesamten Plasma-DNA zu quantifizieren. Hierbei zeigte sich, dass die Mengen an DNA aus dem Tumor individuell weit streuen, dass aber Patienten mit Fernmetastasen höhere Anteile an DNA aus dem Tumor aufweisen als Patienten mit weniger weit fortgeschrittener Erkrankung. Die Anwesenheit von Tumor-DNA im Plasma konnte nur präoperativ festgestellt werden; 7 Tage nach Tumorresektion war auch die DNA aus dem Tumor verschwunden. Daraufhin wurde die der zelluläre Ursprung der Nicht-Tumor-DNA untersucht, wobei sich herausstellte, dass diese DNA meist nicht aus T-Lymphozyten und nie aus Endothelzellen stammt. Neben den Arbeiten an verschiedenen Tumorpatienten konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, dass apoptotische und nekrotische Zellen DNA freisetzen und dass sich die Fragmentgrößen dieser freigesetzten DNA je nach Art des Zelltodes deutlich voneinander unterscheiden. Der Vergleich dieser DNA-Fragmente mit denen der Tumorpatienten und Kontrollpersonen lässt den Schluss zu, dass die DNA im Plasma aus apoptotisch bzw. nekrotisch zugrunde gegangenen Zellen stammt.

Abkürzungsverzeichnis

81

7 Abkürzungsverzeichnis Abb

Abbildung

n

nano (10-9)

ALT

Alanin-Aminotransferase

N

Lymphknotenmetastasen

ATP

Adenosintriphosphat

NHDF

normal human

bp

Basenpaare

BSA

Rinderserumalbumin

NSCLC

non small cell lung cancer

°C

Grad Celsius

OD

Optische Dichte

CIS

Carcinoma in situ

OP

Operation

DNA

Desoxyribonukleinsäure

p

pico (10-12)

DNase

Desoxyribonuklease

p16

CDKN2A-Tumorsuppressor

dNTP

Desoxynukleotid-

p53

TP53-Tumorsuppressor

Triphosphat

PCR

Polymerase-Kettenreaktion

Enhanced Chemolumi-

PBS

phosphatgepufferte

ECL

dermal fibroblast cells

nescence EDTA

Salzlösung

Ethylendiamin-

R

Rückwärtsprimer

Tetraessigsäure

rpm

Umdrehungen pro Minute

F

Vorwärtsprimer

SCLC

small cell lung cancer

g

Erdbeschleunigung

SELE

Selectin E

g

Gramm

T

Staging des Tumors

h

Stunden

HCC

hepatocellular carcinoma

Tab

Tabelle

HUVEC

human umbilical vein

TCR

T-Zell-Rezeptor

endothelial cell

TIL

tumor-infiltrierende

nach Größe des Primärtumors

l

Liter

Lymphozyten

kb

Kilobasen

LOH

loss of heterozygosity -6

µ

mikro (10 )

m

milli (10-3)

M

Fernmetastasen

MASA

mutant allele specific amplification

min

Minuten

MSP

methylierungs-spezifische PCR

Tris

Tris-(hydroxymethyl)aminomethan

Abbildungsverzeichnis

82

8 Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Entstehung von Metastasen im Körper ............................................................................................. 3 Abb. 2: Angriff eines T-Lymphozyten auf eine Krebszelle ........................................................................... 4 Abb. 3: Kompetitive PCR .......................................................................................................................... 23 Abb. 4: Plasma-DNA in gesunden Kontrollpersonen .................................................................................. 24 Abb. 5: Plasma-DNA-Quantifizierung der 30 Tumorpatienten.................................................................... 24 Abb. 6: DNA-Mengen im Plasma von Tumorpatienten geordnet nach Tumorart......................................... 25 Abb. 7: Nachweis von Mutationen im KRAS Onkogen über MASA-PCR ................................................... 28 Abb. 8: Detektion von Hypermethylierung des CDKN2A-Promotors über methylierungs-spezifische PCR . 30 Abb. 9: Spezifität der methylierungs-spezifischen Realtime-PCR ............................................................... 32 Abb. 10: Quantifizierung der Tumor-DNA im Plasma von Tumorpatienten ................................................ 33 Abb. 11: PCR-Nachweis der DNA von T-Lymphozyten............................................................................. 35 Abb. 12: Methylierungs-spezifische PCR der Promotorregion des Selectin E Gens (SELE)......................... 38 Abb. 13: Plasma-DNA-Fragmente einer gesunden Kontrollperson.............................................................. 41 Abb. 14: Größe der DNA-Fragmente im Plasma einiger Tumorpatienten.................................................... 43 Abb. 15: DNA-Freisetzung von Jurkat T-Lymphozyten nach Induktion von Apoptose bzw. Nekrose.......... 45 Abb. 16: Detektion der SAF-A-Spaltung .................................................................................................... 46 Abb. 17: Dosisabhängige DNA-Freisetzung ins Plasma nach Apoptose-Induktion durch antiCD95Antikörper ......................................................................................................................................... 48 Abb. 18: DNA-Freisetzung ins Plasma bei Induktion von Apoptose und Nekrose in vivo............................ 49 Abb. 19: Analyse der DNA-Fragmente nach in vivo Apoptose und Nekrose ............................................... 50 Abb. 20: Zeitpunkte der Blutabnahmen für die Brustkrebs-Studie............................................................... 52 Abb. 21: Präoperative Plasma-DNA-Mengen von 28 Brustkrebs-Patientinnen ............................................ 53 Abb. 22: Plasma-DNA von 54 gesunden Frauen ......................................................................................... 54 Abb. 23: DNA im Plasma von Brustkrebs-Patientinnen im Therapieverlauf................................................ 56 Abb. 24: Detektion von methylierten CDKN2A-Sequenzen im Plasma von drei Patientinnen...................... 58 Abb. 25: Anteile der methylierten DNA an der gesamten DNA .................................................................. 59 Abb. 26: DNA-Mengen im Plasma von 8 Patienten ohne Karzinom und 20 Patienten mit Karzinom........... 62 Abb. 27: Korrelation zwischen Tumorgröße und präoperativer Menge an Plasma-DNA.............................. 63 Abb. 28: Plasma-DNA im Verlaufe des weiblichen Zyklus......................................................................... 65 Abb. 29: Plasma-DNA von drei Frauen unter steigender Östrogenexposition.............................................. 66 Abb. 30: DNA-Mengen im Plasma beider Tumorpatientengruppen............................................................. 68 Abb. 31: Prozentuale Anteile der methylierten Tumor-DNA im Plasma der Tumorpatienten....................... 72

Tabellenverzeichnis

83

9 Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Klinik und Zusammenfassung der Ergebnisse der 30 verschiedenen Tumorpatienten ...................... 39 Tab. 2: Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierung der 28 Brustkrebs-Patientinnen ................................ 55 Tab. 3: Klinik der 28 Brustkrebs-Patientinnen ............................................................................................ 61 Tab. 4: Plasma-DNA-Mengen von 14 Kontrollpersonen. ............................................................................ 84 Tab. 5: In vivo Apoptose mit 1 bzw. 2 µg anti-CD95 pro Maus................................................................... 84 Tab. 6: In vivo Apoptose und Nekrose ........................................................................................................ 84

Anhang

84

10 Anhang Kontrollperson Ko 1 Ko 2 Ko 3 Ko 4 Ko 5 Ko 6 Ko 7 Ko 8 Ko 9 Ko 10 Ko 11 Ko 12 Ko 13 Ko 14

Plasma-DNA [ng/ml] 1 1 1 1 3 2 15 10 1 1 1 1 3,5 2,5

Tab. 4: Plasma-DNA-Mengen von 14 Kontrollpersonen.

Zeit [h] 1 µg anti-CD95 2 µg anti-CD95 0,000046 0,00004 0,0000065 0,00024 0,00013 0,00017 0 0,001102 0,001112 0,001838 0,001438 0,00023 0,0044 3 0,0001 0,00002 0,04405 0,00548 0,00534 0,001557 4 0,1728 2,421 1,423 7,845 0,5993 0,3672 6 1,381 1,443 15,458 70,583 48,525 93,083 8 Tab. 5: In vivo Apoptose mit 1 bzw. 2 µg anti-CD95 pro Maus Gezeigt sind die Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierungen in µg DNA/ml Plasma. Je 3 Mäuse erhielten 1 µg bzw. 2 µg anti-CD95 pro Tier.

Zeit [h] 0 3 4 6

0,052 3,743 3,26 219,47

Nekrose 0,134 4,395 29,629 107,955

0,235 7,085 4,224 -

Nekrose MW 0,140 5,074 12,371 163,713

Zeit [h] 0 3 4 6 8

0,043 0,524 2,733 14,57 27,758

Apoptose 0,018 0,166 1,393 4,000 25,985

0,034 0,989 10,667 16,13 19,333

Apoptose MW 0,0317 0,560 4,931 11,567 24,359

Tab. 6: In vivo Apoptose und Nekrose Apoptose: je drei Mäusen wurde 2 µg anti-CD95-Antikörper injiziert; Nekrose: je drei Mäusen wurde 250 mg/kg Acetaminophen injiziert. Zu den angegebenen Zeiten erfolgte eine Blutentnahme und die Quantifizierung der ins Plasma freigesetzten DNA. MW: Mittelwert.

Literaturverzeichnis

85

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