ACTA

UNI V E R S I T A T I S

LODZIENSIS

F O L IA B IO C H 1M IC A F T B IO P H Y S IC A 14, 1999

Z ofia Walter, Joanna M ankiewicz

APOPTOZA 1 METODY JEJ BADANIA

A p o p to z a to jeden z typów śmierci k o m ó rk i. P raca om aw ia m orfologiczne i biochem iczne zm iany pojaw iające się podczas „sam o b ó jstw a k o m ó rk i” . Z ostały opisane czynniki aktyw ujące ten proces oraz specyficzne geny, b iałka i enzym y pojaw iające się w kolejnych etap ach . P o n a d to zostały p rzedstaw ione zalety i w ady w ybranych m etod badaw czych stosow anych w analizie zm ian ap optotycznych.

W STĘP

A poptoza to program ow ana, aktyw na śmierć kom órki, nazyw ana śmiercią: fizjologiczną lub sam obójczą, zależna od indukcji specyficznych genów. T erm in ten został zapożyczony z języka greckiego, w którym oznacza o p ad an ie płatków kw iatów lub liści [4, 40, 41]. D okładnie pierw sza część w yrazu - apo opisuje pozorne wyciekanie um ierających kom órek d o m iejsc w okół nich, a ptosis odnosi się do usunięcia, zniknięcia kom órek z tkanki [4], A ktyw na śm ierć kom órki tow arzyszy organizm ow i od p oczątku jego rozw oju w okresie em briogenezy, m orfogenezy i jest p o dstaw ą dla praw id­ łow ego funkcjonow ania dojrzałego organizm u. Przykładem m oże być ciągła w ym iana k o m órek w tk an k ach proliferujących takich ja k skóra, nabłonki [4, 33, 40]. P ro g ram ow ana śm ierć jest niezbędna dla utrzym ania praw idłow ej hom eostazy tkankow ej, zapobiega rozrostom hiperplastycznym i neoplastycznym . A p o p to za decyduje o selekcji kom órek posiadających niewłaściwy zestaw receptorów w układzie odpornościow ym . O koło 90-95% kom órek um iera podczas dojrzew ania tym ocytów w grasicy oraz kom órek k rw io tw ó r­ czych w szpiku kostnym [30, 37]. P oza tym pro g ram o w an a śm ierć kom órki zw iązana jest z elim inacją blisko 50% kom órek nerw ow ych w rozw ijającym się m ózgu [33]. W stanach patologicznych zw iązanych z neurodegradacją procesow i ap o p to zy ulegają kom órki nerw ow e, co w ystępuje przy ch o ro b ach A lzheim era, H u n tin g to n a, P arkinsona, oraz przy zaburzeniach neuroroz-

w ojowych zw iązanych z autyzm em czy schizofrenią [33, 37], P odobnie lim focyty C D 4+ u ludzi chorych na A ID S um ierają poprzez pro g ram o w an ą śm ierć kom órki [37], K om órki now otw orow e rów nież um ierają śm iercią sam obójczą w yw oływaną spontanicznie lub indukow aną przez p rom ienio­ w anie jon izu jące i cytotoksyny [1, 27, 28, 37]. O prócz tego a p o p to zę w yw ołują kancerogeny np.: K 2C r20 7 [6, 16]. N iektóre leki przeciw now otw orow e aktyw ują proces apoptozy w zaatakow anych kom ó rk ach , należą do nich pochodne związków platyny takie ja k C D D P (ang. cis diam m ine d ichloro platinum ); JM 149 (ang. cis am m ine dichloro (cyclohexylam inc) trans dih y d ro xo platinum (IV)), J M 335 (ang. trans am m ine dichloro (cyclohexylam ine) dihydroxo platinum (IV)), [17, 23, 26], leki alkilujące, winkry sty n a, m e ta tre k sa t, etopozyd, n iektóre an ty m etab o lity , d ek sam etazo n , cykloheksam id.

Z M IA N Y M O R F O L O G IC Z N E I B IO C H E M IC Z N E Z A C H O D Z Ą C E W K O M Ó R C E PO D C ZA S PR O C ESU A PO PTO ZY

P odczas apoptotycznej śmierci kom órki w pierwszym etapie dochodzi d o obkurczenia kom órki co wiąże się z aktyw acją enzym ów proteolitycz­ nych, błona kom órkow a traci swą asym etryczną stru k tu rę co zw iązane jest z przem ieszczeniem fosfatydyloseryny do zewnętrznej w arstw y błony. G łów ­ nym m iejscem a ta k u jest ją d ro kom órkow e gdzie zagęszczeniu i m a r­ ginalizacji ulega chrom atyna tw orząc tzw. „półksiężyce” um iejscow ione przy błonie jądrow ej [4, 7, 21]. W ażną jed n o stk ą biorącą udział w apoptozie są rów nież m ito ch o n d ria - centra energetyczne kom órki, w których dochodzi do utraty potencjału transm em branow ego PT [9], Spadek p o ten c­ jału jest jednym z wcześniejszych sygnałów apoptotycznych pow iązanym ze w zrostem produkcji białka Bcl-2 [10]. W końcow ej części pierw szego etapu aktyw nej śmierci kom órki dochodzi do fragm entacji D N A . C h ro m aty n a ulega w ielostopniow ym podziałom , zależnym od aktyw ności endonukleaz. Pierwszym sygnałem jest fragm entacja na długie odcinki 700, 300, kilo p ar zasad (kpz) [2, 8, 18, 34, 39, 43], O dcinki o długości 300 kpz od p o w iad ają heksam erycznym pętlom , znanym jak o stru k tu ra rozety [34], N astępnie dochodzi d o pow stania m niejszych fragm entów o długości 50 kpz o d ­ p o w iad ający m pojedynczym pętlom D N A [34]. W późniejszym okresie m oże dojść do fragm entacji n a regularne odcinki o długości 200 p ar zasad (pz), w idoczne podczas analizy m etodam i konw encjonalnej elektroforezy na żelu agarozow ym w postaci charakterystycznej „drabinki apo p to ty czn ej” [4, 7, 37], D rugi etap wiąże się z pow staw aniem „ciałek apoptotycznych” poprzez uw ypuklanie się błony cytoplazm atycznej (aktyw acja transferaz). „C iałk a

ap o p to ty czn e” zaw ierają dobrze zachow ane składniki kom órki o raz ją d ra kom órkow ego i są szybko usuw ane z przestrzeni m iędzykom órkow ej dzięki procesow i fagocytozy, przy udziale kom órek żernych - m akrofagów [4, 7], Proces ten zapobiega pow staw aniu stanu zapalnego, co pow oduje m inim alne zakłócenia stru k tu ry tkanki. Podczas pierwszego etapu apoptozy: kurczenie się kom órki, m arginalizacja ch ro m aty n y m oże dojść do napraw y uszkodzeń, czyli cofnięcia procesu program ow anej śmierci kom órki. Po fragm entacji D N A k o m ó rk a traci m ożliw ość napraw y.

A K TY W A TO R Y A P O P T O Z Y

A p o p to za ja k o proces zapew niający utrzym anie praw idłow ej hom eostazy organizm u zw iązana jest z działaniem wielu czynników środow iska we­ w nątrzkom órkow ego (szok biologiczny). D o takich czynników wew nętrznych pobudzających proces program ow anej śmierci kom órki, ważnej przy np.: regulacji dojrzew ania tym ocytów w grasicy, należą glukortykoidy - horm ony sterydow e [30, 37]. Czynniki m artw icy now otw orów (T N F -a) - p rodukow ane przez m akrofagi, (TN F-//) produkow ane przez limfocyty regulują występowanie procesu apoptozy w lim focytach. K om órki B i T zaw ierają n a swojej pow ierzchni receptory (T N F R 1) dla czynnika T N F , których aktyw ację m oże h am ow ać in h ib ito r ap o p to zy M nS O D [4, 5, 25, 33], K olejnym czynnikiem wewnętrznym aktyw ującym proces apoptozy jest receptor F as (znany także ja k o APO-1 czy CD95). Należy on do I grupy białek błonowych lim focytów T [37], jest receptorem dla przeciwciał F as/A P S [4, 25, 33], R ów nież n ied o b ó r czynników w zrostu, m oże prow adzić do sp adku ekspresji genów rodziny Bcl-2 oraz uaktyw nienia genów takich ja k c-myc, p53 czy b ax [5, 37], Po aktyw acji apoptozy w dalszym etapie sygnał przekazyw any jest przy udziale kolejnych przekaźników - białek cytoplazm atycznych: F A D D , M O R T-1 (wiążą F as) i T R A D D (wiążą T N R F -1 ) o raz ceram idów , co prow adzi d o aktyw acji rodziny białek IC E , a inaktyw acji rodziny białek Bcl-2. Zwiększenie poziom u jonów C a 2+ w kom órce zapew nia działanie enzym ów z klas: endonukleaz, p ro teaz, tran sg lu tam in az. D och o d zi do zm ian m orfologicznych i biochem icznych w kom órce apoptotycznej. T w orzą się now e m arkery powierzchniowe np.: kom pleksy F asL /F as i T N F /T N F R -1 , co pobudza m akrofagi do procesu fagocytozy, zapobiega to stanom zapalnym k o m órki.

A K T Y W A C JA G E N Ó W Z W IĄ Z A N Y C H Z P R O C E S E M A P O P T O Z Y

A p o p to za jest procesem aktyw nym , zależnym od indukcji i represji specyficznych genów. G eny uczestniczące w zm ianach ap o p to ty czn y ch m ożem y podzielić na: 1) m ające związek tylko ze śm iercią p rogram ow aną, 2) biorące udział w innych procesach zachodzących w kom órce. D o pierwszej grupy należą geny: ced-3, ced-4 i ced-9 zidentyfikow ane u nicienia Caenorhabditis elegans. G eny ced-3 i ced-4 ulegają ekspresji w k om órkach um ierających śm iercią naturalną podczas procesu m orfogenezy, kiedy dokładnie 131 kom órek, z ogólnej liczby 1090, jest elim inow anych [4, 7, 33], Odpow iednikiem genu ced-3 u ssaków jest gen kodujący inform ację dla białka IC E (ang. interleukin-1 [i-converting enzym e) należącego d o grupy p ro teaz cysteinowych, odgryw ających decydującą rolę podczas apoptozy. G en ced-4 jest ważny dla w iązania w apnia, co um ożliwia aktyw ację proteaz, endonukleaz i transglutam inaz. G eny ced-3 i ced-4 działają przeciw staw nie d o an ty apoptotycznego genu ced-9, którego aktyw acja m a ograniczać proces śmierci k o m órki, podobnie ja k gen bcl-2 u ssaków [7, 13, 15, 25, 32, 33]. D o wspólnej rodziny białek obok Bcl-2 należą również: Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 (podobnie ja k Bcl-2 ham ujące proces apoptozy) oraz Bax, Bik, Bak, Bad, Bcl-xs (aktyw ujące proces apoptozy). B iałka te w ystępują w form ie h etero d im eró w np. Bcl-2, Bcl-xs. P odczas aktyw acji procesu ap o p to zy pojaw ia się fo rm a hom odim erów np.: B ax\B ax, a odw rotnie kiedy w ystępuje n adw yżka białek: Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 pow stają hom odim ery np.: B cl-2\B cl-2, co ham uje, ogranicza program ow aną śm ierć ko m ó rk i [4, 5, 7, 25, 33], O prócz tego zm ianie m oże ulec stru k tu ra białka kodow anego przez gen bcl-x. Białko Bcl-x podczas zm ian apoptotycznych przyjm uje postać łańcucha krótszego w stosunku do form y dłuższej charakterystycznej dla procesu h am ow ania apoptozy. D o drugiej grupy genów aktyw nych nie tylko w procesie ap o p to zy należą p ro to o n k o g en y : c-m yc, c-fos, c-jun, pełniące funkcję czynników transkrypcyjnych [36], Również podw yższona ekspresja genu p53 jest częstym ind u k to rem program ow anej śmierci kom órki, np. w tym ocytach [20, 24, 33, 35, 37, 42],

A K TY W A C JA E N Z Y M Ó W B IO R Ą C Y C H U D Z IA Ł W P R O C E S IE P R O G R A M O W A N E J Ś M IE R C I K O M Ó R K I

Inicjacja apoptozy zw iązana jest z aktyw acją trzech grup enzymów: endonukleaz, p ro teaz i transglutam inaz. N apływ do w nętrza kom órki jonów C a 2+ rozpoczyna proces sam obójczej śmierci kom órki.

Z nane są trzy endonukleazy m ogące brać udział w procesie apoptozy: N U C -18 i D N A -za I (zależne od jonów C a 2 + i M g 2 + , ich działanie jest ham ow ane przez jo n y cynku) o raz D N A -za li [7, 11, 31, 32, 37], Enzym y endonukleolityczne b iorą udział w degradacji D N A (fragm enty: 700-30 kpz, 200-180 pz), ich działanie pow oduje zrywanie w iązań internuklcosom alnych. K olejną grupę enzym ów biorących udział w apoptozie tw orzą proteazy, k tó re uczestniczą w proteolizie, niszczeniu cytoszkieletu co pow oduje kurczenie się kom órki. Ogólnie grupę tych proteaz cysteinow ych oznaczono ja k o IC E, co łączy się z aktyw acją \-/i interleukiny pośredniczącej w reakcjach zw iązanych ze stanem zapalnym kom órek. O becnie w yróżniono w rodzinie p ro teaz dziesięć odrębnych białek - kaspaz (aspaz), należących do trzech podrodzin: kaspazy-1 (IC E), kaspazy-2 (IC H -l/N e d d ), kaspazy-3 (C PP32/Y A M A ). Poszczególne kaspazy ró żn ią się rodzajem su b strató w , np. d la kaspazy-1 substratem jest p ro -IL lfi (pro-interleukina 1-/0 oraz p ro-kaspaza 3 i 4; dla kaspazy-3 substratem jest P A R P (polim eraza poli(A D P-rybozy)), p ro -k asp aza 6 i 9 oraz SR EB P 1 i 2 (czynnik przyłączający białko regula­ torow e steroli); dla kaspazy-6 substratem jest P A R P i lam ina (A, B1/B2, C). P roteazy IC E w ystępują w cytoplazm ie w postaci nieaktyw nej ja k o proenzym y, ich aktyw acja wiąże się z pojawieniem czynnika apoptotycznego oraz inaktyw acją białek Bcl-2 i Bcl-xL [4, 7, 21, 25, 33], Inhibitorem p ro teaz IC E /C P P 3 2 /Y A M A jest białko C rm A [5], Z a pow staw anie w iązań krzyżow ych pom iędzy białkam i cytoplazm atycznym i, ich polim eryzację oraz tw orzenie „ciałek apop to ty czn y ch ” odpow ie­ dzialn a jest trzecia grupa enzym ów - transglutam inazy [10]. Enzym y te rów nież biorą udział w stabilizacji i integrow aniu stru k tu r kom órkow ych w pow stających „ciałkach apoptotycznych” [29].

M E TO D Y BADAŃ A P O PT O Z Y

Z m iany zachodzące w kom órce apoptotycznej m ożem y b adać stosując różne m etody analizy m orfologicznej i biochem icznej, biorąc pod uwagę całą populację ko m órek lub też pojedyncze kom órki. A naliza m orfologiczna pojedyńczych kom órek wiąże się z obserw acją m ik ro sk o p o w ą. Stosując różne techniki barw ienia kom órek np.: barw nikiem G iem sa lub błękitem trypanu, m ożem y obserw ow ać w m ikroskopie świetlnym (m aksym alne powiększenie) lub elektronow ym kondensację i m arginalizację chrom atyny oraz tworzenie się „ciałek apoptotycznych” [22], Po zastosow aniu barw ników fluorescencyjnych, np. oran ż akrydyny - A O , jo d ek propidyny P I, lub aneksyny m ożem y obserw ow ać tworzenie się „ciałek apoptotycznych” przy użyciu m ik ro sk opu fluorescencyjnego [10, 22],

K o lejn ą techniką o p artą na analizie pojedynczych kom órek przy użyciu m ik ro sk o p u świetlnego jest m etoda T U N E L [22], Polega ona n a włączaniu biotynylow anej trójfosforodeoksyurydyny łącznie z term inalną deoksynukleotydylotransferazą T dT w m iejsca pęknięć D N A . W ym ienione techniki są powszechnie stosow ane przy analizie apoptozy, ale um ożliw iają one jedynie obserwację w ybranych pojedynczych kom órek. Byw ają przypadki b ra k u zm ian m orfologicznych w ap o p to ty czn y ch k o m ó rk a c h , d lateg o też o b o k analizy m orfologicznej należy sto so w ać analizę biochem iczną o p a rtą n a bad an iu całych populacji kom órek. D egradację D N A m ożem y śledzić przy użyciu różnych technik elektroforetycznych. A nalizę dużych fragm entów D N A : 700 kpz, 500 kpz, 300 kpz, 50 kpz umożliwia stosowanie elektroforezy pulsacyjnej PA C E lub elektroforezy w odw róconym polu F IG Ę [2, 8, 18, 34, 39, 43], D alszą degradację D N A 200 pz zw iązaną z pow staw aniem „drabinki apoptotycznej” m ożem y badać stosując klasyczną elektroforezę n a żelu agarozow ym [4, 7, 40]. A nalizę fragm entów D N A o długości 200 pz um ożliwia również technika kom etkow a, ale opiera się o n a na analizie pojedynczych kom órek. N ależy podkreślić, że podczas ap optozy nie zawsze dochodzi d o tw orzenia się „drabinki a p o p ­ totycznej” , wówczas degradacja D N A zatrzym uje się na etapie tw orzenia dużych fragm entów D N A . P o n ad to w ym ienione techniki elektroforetyczne w ym agają dużej ilości k o m ó rek użytych do eksperym entu. K olejnym problem em m o g ą być różne stadia rozw oju kom órek w badanych populacjach. In n ą techniką opierającą się n a analizie biochem icznej populacji kom órek jest cytom etria przepływ ow a [10, 12, 14, 19, 22]. O p a rta n a w ykorzystaniu techniki laserowej oraz użyciu barw ników fluorescencyjnych: oranżu akrydyny, jo d k u propidyny, aneksyny, co um ożliw ia śledzenie zm ian w D N A , analizę specyficznych białek np.: Bcl-2, p53, onkoprotein, badanie zm ian w potencjale transm em branow ym PT w m itochondriach oraz zm ian w błonach k o m ó r­ kow ych (przem ieszczanie się fosfatydyloseryny PS d o zewnętrznej części błony k o m órkow ej). C zęsto podczas jednej analizy cytom etrycznej po zastosow aniu m ieszaniny barw ników fluorescencyjnych m ożem y badać je d ­ nocześnie zm iany apoptotyczne zachodzące w różnych m iejscach w kom órce. Przykładem m oże być jednoczesne zastosow anie jo d k u propidyny PI i anek­ syny, co um ożliw ia śledzenie zm ian zachodzących zarów no w jąd rz e k o m ó r­ kow ym - PI i błonie kom órkow ej - aneksyna. W adą tej m etody jest m ożliw ość błędnej interpretacji w yników zw iązana z an a liz ą k o m ó rek znajdujących się w późnym stadium apoptozy, wówczas kom órki m o g ą być p o trak to w a n e ja k o nekrotyczne (drugi rodzaj śmierci kom órki). N ajnow szą techniką o p a rtą n a śledzeniu zm ian m orfologicznych w a p o p ­ totycznych kom ó rk ach jest w ideom ikroskopia [22]. M eto d a ta polega n a ciągłej obserw acji k om órek przy użyciu w ideom ikroskopu, gdzie klatk a

film ow a zm ienia się co 3-5 m in w przypadku populacji kom órek lub co 10-20 s. w przypadku pojedynczych kom órek. Jest to bardzo d o k ład n a m eto d a um ożliw iająca uchwycenie wszystkich etapów apoptozy, co nic jest m ożliw e w przypadku stosow ania innych m etod. W adą tej m etody jest potrzeba zapewnienia sterylnych w arunków w pomieszczeniu doświadczalnym , odpow iedniej tem peratury, wilgotności. O pisane m etody badań apoptozy uśw iadam iają konieczność stosow ania złożonej analizy polegającej na jednoczesnej obserw acji m orfologicznej i biochem icznej kom órek.

LIT E R A T U R A

[1] B e r g s t r o m P , J o h n s s o n A , C a v a l l i n - S t a h l E , B e r g e n h e i m T., H e n ­ r i k s s o n R. (1997), E ur. I. C a n , 33, 153-159. [2] B i c k n e l l G. R , C o h e n G . M . (1995), Biochem . Biophys. Res. C o m , 207, 40-47. [3] B l a n k e n s h i p L. J , M a n n i n g F. C. R , O r e n s t e i n J. M , P a t i e r n o S. R. (1994), T ox. A pp. P h a rm a c o l, 126, 75-83. [4] B o y c e B. F. (1996), Principles o f Bone Biology, A cadem ic Press, 53, 739-753. [5] B r e d e s e n D . E. (1995), A nn. N e u ro l, 38, 839-851. [6] B r i d g e w a t e r L. C , M a n n i n g F. C. R , P a t i e r n o S. R. (1994), C arcinogenesis, 15, 2421-2427. [7] B r o m m e H. J , H o l t z J. (1996), M ol. Cell. B io ch e m , 163/164, 261-275. [8] B r o w n D . G „ S u n X .- M , C ohen G . M . (1992), J. Biol. C h e m , 269, 3037-3039. [9] C o h e n G. M , R a f f r a y M . (1997), P harm acol. T h r , 75, 3, 155-177. [10] D a r z y n k i e w i c z Z , J u a n G , L i X , G o r c z y c a W , M u r a k a m i T , T r a g a n o s F. (1997), C ytom etry, 27, 1-20. [11] G a i d o M. L „ C i d l o w s k i J. A. (1991), J. Biol. C h e m , 226, 18580-18585. [12] G a a l A , B o c s i J , F a l u s A , S z e n d e B , C s a b a G . (1997), Life S r i, 61, 23, 339-342 . [13] H e n g a r t n e r M. O , H o r v i t z H. R. (1994), N a tu re, 369, 318-320. [14] H e r t v e l d t K , P h i l i p p e J , T h i e r e n s H , C o r n e l i s s e n M , V r a l A . (1997), In t. J. R a d ia t. B io l, 71, 4, 429-433. [15] H o c k e n b e r y D. M , O l t v a i Z. N , Y i n X .- M , M i l l i m a n C. L , I C o r s m e y e r S. J. (1993), Cell, 75, 241-251. [16] H u v i n e n M , U i t t i J , Z i t t i n g A , R o t o P , V i r k o l a K , K u i k k a P , L a i p p a I a P , A i t i o A. (1996), O ccupational and E n v ironm ental M edicine, 53, 741-747. [17] K e l l a n d L. R , M i s t r y P , A b e l G , L o h S. Y „. O ’Neil C. O , M u r r e r B. A , H a r r a p K . R. (1992), Can. R e s , 52, 3857-3864. [18] L a g a r k o w a M. A , I a r o v a i a O. V , R a z i n 20239-20241. [19] L a m m G. M ,

S te in le in P, C o t t e n

M,

S. V. (1995), J. Biol. C h e m , 270,

Christofori

G . (1997), N uc. A cid.

R e s , 25, 23, 4855-4857. [20] M a i c o m s o n R. D. G , C l a r k e A. R , P e t e r A , C o u t t s S. B , H p w i e S. E. M , H a r r i s o n D . J. (1997), J. P a th o l, 181, 166-171. [21] M a r t i n s L. M , E a r n s h a w W. C. (1997), T ren Cell B io l, 7, 111-114. [22] M e C a r t h y N. J , E v a n G . I. (1998), C ur. T op. D evelopm ental Biol. 36, 259-278.

[23] M e l l i s h K. J., B a r n a r d Ch. F. J., M u r r e r B. A., K e l l a n d L. R . (1995), In t. J. C ancer 62, 717-723. [24] M i c h a l o v i t z D. , H a r v r y O., O r e n M. (1990), Cell, 69, 671-680. [25] N a g a t a S. (1997), Cell, 88, 355-365. [26] O ’ N e i l l C. F. , O r m e r o d M. G. , R o b e r t s o n D. , T i l l e y J. C., C u m b e r - W a l s w e e r Y. , K e l l a n d L. R. (1996), Br. J. C an., 74, 1037-1045. [27] O r m e r o d M. G. , O ’ N e i l l C., R o b e r t s o n D. , K e l l a n d L. R., H a r r a p K . R. (1996), C an. C hem other. P harm acol., 37, 463-471. [28] O t t o A. M. , P a d d e m b e r g R. , S c h u b e r t S., M a n n h e r z H . G . (1996), C an. Res. C lin. O ncol., 122, 603-612. [29] P a r a s k e v a s S., D u g u i d W . P. (1996), Cellular Jnter-relationship in the Prancreas - Im plications fo r Islet Transplantion, eds. L. R o s e n b e r g , W. P. D u g u i t , R G L andes C om pany, 5, 99-122. [30] P a l l i c c i a r i C., B o t t o n e M. G. , S c h a a c k V., B a r n i S., M m a n f r e d i A . A. (1996), Exp. Cell R es., 229, 370-377. [31] P e i t s c h M. C., M a n n h e r z H. G. , T s c h o p p J. (1994), T rends. Cell. Biol., 4, 37-41. [32] R a d z i s z e w s k a E. (1995), Post. Biol. K om ., 22, 248-263. [33] R u d i n Ch. M. , T h o m s o n C. B. (1997), A nnu. Rev. M ed., 48, 267-281. [34] S e s t i l i P., C a t t a b e n i F., C a n t o n i O. (1996), FE B S, 396, 337-342. [35] S h a w L., B o v e y R. , T r d y S., S a h l i R. , S o r d a t B., C o s t a J. (1992), Proc. A cad. [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43]

Sei. U S A , 89, 4495-4499. S i k o r a E. (1993), Post. B ioch., 39, 212-220. S i k o r a E. (1994), Post. B ioch., 40, 150-160. S m e t s L. A. (1994), A nti-C ancer D rugs., 5, 3-9. W a l k e r P. R. , W e a v e r V. M. , L a c h B., L e

B l a n c J., S i k o r s k a

M. (1994),

E xp. Cell Res., 213, 100-106. W y l l i e A. H. , K e r r J. F. R. , C u r i e A . R. (1980), Int. Rev. C yt., 68, 251-306. W y l l i e A . H. (1992), C an. M etast. Rev. 11, 95-103. Y o n i s h - R o u a c h E., R e s n i t z k y D. , L o t e m J., S a c h s L., K i m c h i A. , O r e n M . (1991), N a tu re, 353, 345-347. Z h i v o t o v s k y B., C e d e r v a l l B., J i a n g S., N i c o t e r a P., O r r e n i u s S. (1994), Biochem . B iophys. R es. C om ., 202, 120-127.

W płynęło d o R edakcji F o lia biochim ica et biophysica 24.04.1998

K a te d ra G enetyki M o lekularnej U niw ersytet Ł ódzki

Z o fia W alter, Joanna M ankiew icz

A P O P T O S IS A N D M E T H O D S O F IN V E S T IG A T IO N S

A p o p to sis is one o f the kinds o f cell d e ath . T his p a p er presents the m o rp h o lo g ic al and biochem ical changes w hich are connected w ith a p o p to tic cell d eath . T h e factors, w hich activate th is process, are described in this article. M o reo v er the groups o f genes, p ro tein s and enzym es th a t p a rticip a te in the „call suicide” are characterised. T h e advantages and d isad v an tag es of th e chosen m eth o d s o f investigations are discussed.