Validación del método Colilert®-18/Quanti-Tray® para el recuento de E. coli y de bacterias coliformes en muestras de agua

enero de 2008

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Validación del método Colilert®-18/Quanti-Tray® para el recuento de E. coli y de bacterias coliformes en muestras de agua 1 Introducción El método Colilert®-18/Quanti-Tray ® es una prueba diseñada específicamente para el recuento NMP (Número Más Probable) de E. coli y bacterias coliformes a partir de muestras de agua potable u otras aguas de características similares, ya sea tratada o sin tratar. Colilert-18 detecta de manera simultánea el número de coliformes totales y E. coli en el agua. Se basa en la Tecnología de Sustrato Definido (Defined Substrate Technology, DST). El reactivo DST se mezcla con 100 ml de muestra y se incuba como prueba de presencia/ausencia (PA) o prueba para determinar el número más probable (NMP). Cuando las bacterias coliformes metabolizan el nutriente indicador ONPG, el color de la muestra se vuelve amarillo. Cuando E. coli metaboliza un segundo nutriente indicador (MUG), la muestra emite fluorescencia con luz UV. El método Colilert-18 permite la detección simultánea de estas bacterias en 18 horas, a una concentración de 1 ufc/100 ml y en presencia de números tan elevados de bacterias heterótrofas como 2 x 106/100 ml de muestra. El método Quanti-Tray está diseñado para obtener recuentos bacterianos cuantitativos a partir de muestras de 100 ml utilizando los reactivos DST. La mezcla de reactivo/muestra se añade a la bolsa Quanti-Tray y, antes de la incubación, se sella utilizando el dispositivo de sellado para Quanti-Tray. La bolsa está diseñada para que, tras el sellado, 51 pocillos contengan la mezcla de reactivo/muestra. El dispositivo de sellado es un instrumento que consta de unos rodillos calientes, accionados por motor, que se ha diseñado para el sellado de las bolsas Quanti-Tray. Se cuenta el número de pocillos positivos y, a partir de la tabla correspondiente, se determina el NMP de bacterias coliformes y/o E. coli. 2 Alcance de la aplicación del método Colilert®-18/Quanti-Tray® El método Colilert®-18/Quanti-Tray ® está diseñado principalmente para el análisis de agua potable y otros tipos de agua de características similares. Cuenta con un gran número de autorizaciones en Norteamérica (EE.UU, Canadá y Méjico), Sudamérica (Brasil, Argentina, Chile y Colombia), Europa (Dinamarca, Alemania, Hungría, Islandia, Irlanda, Italia, Noruega, España y Reino Unido) y Extremo Oriente (Japón y Corea). Además, cuenta con la autorización para el análisis de aguas embotelladas (Asociación Internacional de Agua Embotellada) y para el análisis de agua purificada para uso farmacéutico (Farmacopea de los EE.UU). En los EE.UU. también recibió la autorización por parte de la EPA (Agencia de protección medioambiental) para el análisis de bacterias coliformes y E. coli en aguas de manantial y aguas freáticas, y para el recuento de E. coli en aguas ambientales, de uso recreativo y residuales. 3 Identificación de microorganismos diana (ISO/TR 13843 apartado 10.2.1 y 9.2) En el método Colilert ®-18/Quanti-Tray®, las bacterias coliformes son aquellas que producen un color amarillo por acción de la β-galactosidasa sobre el orto-nitrofenil-βD-galactopiranósido (ONPG), y E. coli son aquellas bacterias coliformes que,

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además, emiten una fluorescencia azul con luz UV por la acción de la βglucuronidasa sobre el 4-metil-umbeliferil-β-D-glucurónido (MUG). 3.1 Modelo de exposición basado en un cultivo puro (ISO/TR 13843 apartado 10.2.1) Las definiciones de las reacciones por bacterias diana y no diana se confirmaron mediante la exposición del sistema Colilert-18/Quanti-Tray a cultivos puros de cepas de referencia de E. coli, bacterias coliformes y bacterias Gram-negativas no coliformes obtenidas a partir de las colecciones de la ATCC. Las reacciones típicas de estas cepas de referencia aparecen recogidas en la tabla 1. IDEXX utiliza estas cepas para realizar los análisis de control de calidad rutinarios del método Colilert18/Quanti-Tray. Tabla 1

Cepas de referencia de E. coli, bacterias coliformes y bacterias Gram-negativas no diana, utilizadas para confirmar las reacciones positivas y negativas típicas del método Colilert®-18/Quanti-Tray®

Bacteria

Nº ATCC*

Escherichia coli

25922

Citrobacter freundii

8090

Klebsiella pneumoniae

31488

Enterobacter aerogenes

13048

Pseudomonas aeruginosa

10145

Aeromonas hydrophila

35654

Reacción método Colilert-18

Color amarillo intenso Fluorescencia azul intenso con luz UV Color amarillo intenso No emite fluorescencia con luz UV Color amarillo intenso No emite fluorescencia con luz UV Color amarillo intenso No emite fluorescencia con luz UV No hay crecimiento No hay color amarillo No emite fluorescencia con luz UV No hay crecimiento No hay color amarillo No emite fluorescencia con luz UV

* Colección Americana de Cultivos Tipo 3.2 Estudios de sensibilidad, especificidad y selectividad (ISO/TR 13843 apartado 9.2) En lo que respecta a los métodos microbiológicos, el informe técnico ISO/TR 13843 define estas características de la siguiente forma: Sensibilidad - la fracción del total de positivos que se asigna correctamente en el recuento obtenido; Especificidad - la fracción del total de negativos que se asigna correctamente en el recuento obtenido; Selectividad - el cociente ente el número de colonias diana y el número total de colonias en el volumen de muestra. En el caso del método Colilert-18/Quanti-Tray, estas características están relacionadas con el número de pocillos positivos para coliformes o E. coli que, efectivamente, contienen la bacteria diana, y con el número de pocillos negativos que realmente son negativos para la bacteria diana. La valoración de la sensibilidad,

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la especificidad y la selectividad del método Colilert-18/Quanti-Tray se logró identificando los aislamientos β-galactosidasa y β-glucuronidasa positivos de los pocillos positivos obtenidos a partir de muestras naturales en las que se añadieron cantidades conocidas de agua de río a muestras de agua potable sin cloro. Se obtuvo 1 litro de muestra de agua potable sin cloro al que se añadieron cantidades conocidas de tres fuentes de aguas superficiales (dos ríos y un embalse). Tras la incubación, se seleccionaron 100 pocillos de color amarillo, pero que no emitían fluorescencia, de las 30 muestras (3-5 pocillos por cada muestra). La selección se llevó a cabo de forma que se garantizara la inclusión de toda la gama de intensidades posibles para el color amarillo. Asimismo, se seleccionaron 100 pocillos de color amarillo, y que emitían fluorescencia, para abarcar toda la gama de intensidades posibles para la fluorescencia. De las 30 muestras, sólo se dispuso de 54 pocillos negativos, de los cuales dos mostraron un crecimiento turbio. Las reacciones β-galactosidasa y β-glucuronidasa positivas y/o negativas se verificaron y los aislamientos se identificaron utilizando paneles miniaturizados para la identificación de tipo BBL CrystalTM E/NF (Entéricos/ No Fermentadores, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EE.UU.). 3.2.1 Cálculo de la sensibilidad, especificidad, selectividad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos Para cada parámetro los datos de identificación se dividieron en cuatro categorías: a = número de pocillos positivos que contenían coliformes o E. coli (verdaderos positivos); b = número de pocillos negativos que contenían coliformes o E. coli (falsos negativos); c = número de pocillos positivos que no contenían coliformes, ni E. coli (falsos positivos); d = número de pocillos negativos que mostraban crecimiento y que no contenían ni coliformes, ni E. coli (verdaderos negativos). A partir de los datos obtenidos, la sensibilidad, especificidad, selectividad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos para coliformes y E. coli se calcularon de la siguiente forma: Sensibilidad = a / (a+b) Especificidad = d / (c+d) Selectividad = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] Tasa de falsos positivos = c / (a+c) Tasa de falsos negativos = b / (b+d) Además se calculó un parámetro adicional, la eficiencia (E; fracción de pocillos que se asignan correctamente), mediante la fórmula E = (a+d) / (a+b+c+d). 3.2.2 Coliformes distintos a E. coli De los 100 pocillos amarillos sin fluorescencia con los que se realizaron subcultivos, se obtuvieron aislamientos β-galactosidasa. En estas placas no se observaron reacciones β-glucuronidasa. En el Apéndice A1 se muestran las reacciones oxidasa e indol, los perfiles BBL CrystalTM E/NF y las identificaciones de estos aislamientos. Todos se identificaron como miembros de la familia Enterobacteriaceae distintos a E.

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coli, β-galactosidasa positivos y β-glucuronidasa negativos. En total, se recuperaron 23 especies de coliformes (Tabla 2). 3.2.3 E. coli De los 100 pocillos amarillos con fluorescencia con los que se realizaron subcultivos, se obtuvieron aislamientos β-glucuronidasa. En el Apéndice A2 se muestran las reacciones oxidasa e indol, los perfiles BBL CrystalTM E/NF y las identificaciones de estos aislamientos. Se identificaron 99 aislamientos como E. coli. El último se identificó como Klebsiella oxytoca. Este aislamiento presentó una reacción βglucuronidasa positiva en el panel CrystalTM E/NF. 3.2.4 Pocillos negativos Se realizaron subcultivos con 54 pocillos negativos, de los cuales únicamente dos habían presentado crecimiento. Estos dos pocillos presentaron colonias βgalactosidasa y β-glucuronidasa negativas, que resultaron ser oxidasa positivas e indol negativas (Apéndice A3). Ambas colonias se identificaron como Shewanella putrefaciens en el sistema BBL CrystalTM E/NF. No se obtuvo crecimiento en los 52 pocillos restantes. Tabla 2

Identificación de bacterias coliformes (número de aislamientos) recuperadas a partir de pocillos positivos Colilert®-18/Quanti-Tray® para coliformes distintos a E. coli Cedecea lapegei (1) Citrobacter amalonaticus (2) Citrobacter freundii (10) Enterobacter aerogenes (1) Enterobacter asburiae (1) Enterobacter cancerogenus (1) Enterobacter cloacae (25) Enterobacter sakazakii (7) Escherichia vulneris (4) Hafnia alvei (1) Klebsiella oxytoca (4) Klebsiella pneumoniae (6)

Kluyvera ascorbata (12) Kluyvera cryocrescens (3) Leclercia adecarboxylata (1) Pantoea agglomerans (9) Serratia fonticola (1) Serratia liquefaciens (3) Serratia marcescens (1) Serratia odorifera (1) Serratia plymuthica (4) Serratia rubidea (1) Serratia spp (1)

3.3 Determinación de las características relacionadas con la sensibilidad y la especificidad 3.3.1 Bacterias coliformes En el contexto de la prueba Colilert-18/Quanti-Tray, los coliformes son microorganismos que dan lugar a un color amarillo, emitiendo o no fluorescencia. Los resultados para los parámetros calculados son los siguientes: Sensibilidad = a / (a+b) = 200 / (200+0) = 1 Especificidad = d / (c+d) = 2 / (0+2) = 1 Selectividad = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log10 [(200+0) / (200+0+0+2)] = - 0,004 Tasa de falsos positivos = c / (a+c) = 0 / (200+0) = 0 Tasa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+2) = 0 Eficiencia (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (200+2) / (200+0+0+2) = 1

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3.2.3 E. coli En el contexto de la prueba Colilert-18/Quanti-Tray, E. coli son microorganismos que dan lugar a un color amarillo y emiten fluorescencia. Los resultados para los parámetros calculados son los siguientes: Sensibilidad = a / (a+b) = 99 / (99+0) = 1 Especificidad = d / (c+d) = 102 / (1+102) = 0,99 Selectividad = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log10 [(99+1) / (99+0+1+102)] = - 0,305 Tasa de falsos positivos = c / (a+c) = 1 / (99+1) = 0,01 Tasa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+102) = 0 Eficiencia (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (99+102) / (99+0+1+102) = 0,995 Los resultados del análisis de los datos demuestran que, para las bacterias coniformes, el método Colilert-18/Quanti-Tray tiene una sensibilidad y especificidad elevadas y una tasa de falsos positivos y falsos negativos igual a cero. El método es también muy selectivo, con un valor de - 0,004, superior al valor de referencia -1 que sugiere el informe técnico ISO/TR 13843 para los métodos de recuento de colonias. Se puede decir que el método es muy eficiente para bacterias coliformes, con un valor de eficiencia de 1. Los datos de identificación demuestran que el método Colilert-18/Quanti-Tray recupera una amplia gama de bacterias coliformes. El método Colilert-18/Quanti-Tray también es muy sensible y específico para E. coli. La selectividad (-0,305) es inferior a la obtenida para las bacterias coliformes. Este es un resultado que cabe esperar en un sistema de análisis dual en el que E. coli es un subgrupo dentro de las bacterias coliformes. Aún así, el valor sigue siendo mejor que el valor de referencia del informe técnico ISO/TR 13843. El método sigue siendo muy eficiente (E = 0,995) para la detección de E. coli. 4 Incertidumbre del recuento (ISO 13843 apartado 10.2.1 y Apéndice B) La repetibilidad y la reproducibilidad son dos estimaciones de la fiabilidad que se puede alcanzar con un método analítico. Pueden ser valoraciones respecto al método en su conjunto utilizando muestras naturales adecuadas, o respecto a la incertidumbre del recuento asociada con la lectura de resultados de un método en concreto. El resultado obtenido con cualquier método dependerá de la facilidad con la que los analistas puedan realizar un recuento de colonias o considerar una reacción NMP como positiva, lo que dependerá de lo distinta que sea la morfología de las colonias de los microorganismos diana o no diana a la hora de hacer un recuento en agar, o de la nitidez de las reacciones positivas o negativas de las pruebas NMP realizadas en caldo de cultivo. Por lo tanto, las valoraciones de la incertidumbre del recuento son una indicación de los posibles problemas que podrían darse al adoptar un método de manera generalizada. La repetibilidad (r) y la reproducibilidad (R) se definen de la siguiente forma: Repetibilidad

concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas de la misma medida, llevadas a cabo en las mismas condiciones de medición.

Reproducibilidad concordancia entre los resultados de mediciones de la misma medida, llevadas a cabo en distintas condiciones de medición.

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Cuando esto se aplica a los recuentos de colonias microbiológicas en placas de agar o reacciones positivas en una prueba NMP, esas “mismas” o “distintas condiciones” se refieren al analista que hace el recuento. Por lo tanto, en este contexto, la repetibilidad es la concordancia entre los recuentos obtenidos por un mismo analista tras repetir los recuentos y la reproducibilidad es la concordancia entre los recuentos obtenidos por dos o más analistas tras repetir los recuentos. Normalmente, la valoración de la reproducibilidad brinda más información que la valoración de la repetibilidad. El Apéndice B del informe técnico ISO/TR 13843 proporciona unas directrices sobre la valoración de la repetibilidad y la reproducibilidad del recuento utilizando desviaciones estándar relativas (DER) de los recuentos repetidos. Además, recomienda que, en el caso de cultivos puros, las DER deberían ser < 0,02 (es decir, una desviación máxima del 2 %). Los analistas de IDEXX llevaron a cabo estudios sobre la incertidumbre de los recuentos. Los datos están incluidos en el Apéndice B. El recuento se realizó de manera que cada analista desconociera los recuentos realizados por otros analistas, y los NMP resultantes se registraron como números enteros. Las DER calculadas para los NMP del sistema Colilert-18/Quanti-Tray inoculado con un coliforme típico (Klebsiella pneumoniae ATCC 33186) y E. coli (ATCC 25922) fueron: Klebsiella pneumoniae

Repetibilidad = Reproducibilidad =

0,022 0,020

Escherichia coli

Repetibilidad = Reproducibilidad =

0,000 0,007

Los valores para el coliforme típico son del orden del valor de referencia < 0,02 (ISO/TR 13843 apartado B1), mientras que los valores para E. coli están muy por debajo del valor de referencia, indicando que con el método Colilert-18/Quanti-Tray puede lograrse un recuento del NMP fiable para Klebsiella pneumoniae y para E. coli. 5 Robustez – sensibilidad a lo largo del tiempo (ISO/TR 13843 apartado 10.2.2 y B.4) Dos aspectos de la robustez son importantes para el método Colilert ®-18/QuantiTray®: el periodo de incubación recomendado de 18-22 horas y el periodo de validez de hasta 15 meses cuando Colilert-18 se almacena entre 4 y 25 ºC. En el Apéndice C se incluyen los recuentos realizados por duplicado de suspensiones con un número bajo de cultivos de referencia de E. coli, Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii tras 18 horas y 22 horas de incubación para el mismo lote de Colilert-18, almacenado durante 541 días a 25 °C. 5.1 Robustez del tiempo de incubación Se obtuvieron 48 resultados emparejados para realizar los recuentos tras 18 horas y 22 horas de la incubación. Para E. coli los 48 recuentos emparejados fueron los mismos tras los dos tiempos de incubación. Pero, para Klebsiella pneumoniae 47 de los recuentos (98 %) resultaron iguales, mientras que el último recuento emparejado mostró un incremento de un único pocillo positivo a las 22 horas de incubación. Sin embargo, para Citrobacter freundii hubo un incremento en los recuentos en 13 de las muestras (27%) tras las 22 horas de incubación, en comparación con las 18 horas de incubación. Todos estos recuentos más elevados, excepto uno, fueron incrementos en un único pocillo positivo o dos. Esta cepa de Citrobacter parece

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mostrar una tasa de crecimiento relativamente más lenta o una cinética enzimática más débil, en comparación con las otras bacterias analizadas. Los datos demuestran que para E. coli y para bacterias coliformes robustas, como Klebsiella pneumoniae, el periodo de incubación recomendado de 18-22 horas es robusto. Pero en el caso de algunas bacterias con crecimiento más lento, o productoras de enzimas débiles, puede haber un aumento en los recuentos a las 22 horas de incubación, en comparación con los recuentos obtenidos a las 18 horas de incubación. El fenómeno de los incrementos en los recuentos a lo largo de un periodo de incubación recomendado (por ejemplo, de 18-24 horas para los métodos típicos de filtración con membranas de la norma ISO 9308-1) es muy conocido, especialmente en el caso de coliformes ambientales. Sin embargo, siempre que los incrementos en los recuentos tras una incubación más larga no sean excesivos, los recuentos obtenidos a las 18 horas de incubación, con fines prácticos y operativos, se consideran aceptables. 5.3 Robustez del almacenamiento del medio Colilert-18 El medio Colilert-18 tiene un periodo de validez de 12 meses cuando se almacena entre 4 y 25 °C. Los datos de las tres bacterias analizadas con el mismo lote de medio, conservado a 25 ºC y tras 541 días de almacenamiento (muy por encima del periodo de un año establecido), no muestran ninguna diferencia en el rendimiento. Se eligió la temperatura de almacenamiento superior ya que, en comparación con un almacenamiento a temperaturas de refrigeración, representa un mayor reto a la estabilidad del medio Colilert-18. 6 Límite superior de trabajo (ISO/TR 13843 apartado 10.2.4 y 6.3.3) La prueba Colilert®-18/Quanti-Tray ® es un método de NMP con un rango de recuento arbitrario entre 0 y 201, determinado por el número de pocillos de la bolsa QuantiTray. Según el apartado 6.3.3 del informe técnico ISO/TR 13843, no puede establecerse un límite superior para los métodos de NMP por razones prácticas y estadísticas, “ya que la precisión no depende de forma sencilla del número de partículas introducido en la unidad de detección". 7 Precisión (ISO/TR 13843 apartado 10.2.5 y 9.5.5) La precisión de un método de NMP se describe mediante los intervalos de confianza del 95% calculados para cada uno de los valores de NMP (ISO/TR 13843 apartado 9.5.5). En el Apéndice D se incluyen los intervalos de confianza para los recuentos obtenidos con el método Colilert®-18/Quanti-Tray ®, calculados a partir del programa del Manual online para el Análisis Bacteriológico (Bacteriological Analytical Manual, BAM; http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#excl) de la FDA (Food and Drug Administration) de los EE.UU. Para cada NMP puede obtenerse una repetibilidad teórica, basándose en el valor de NMP y sus intervalos de confianza. En el Apéndice D también se incluyen los valores de incertidumbre relativa para cada NMP (log10DE, calculados a partir de los intervalos de confianza del 95% del NMP) y de repetibilidad (incertidumbre estándar relativa) expresados como coeficientes de variación (CV%). Estos valores de Poisson pueden utilizarse como valores de precisión mínima con los que cualquier dato apropiado que pueda tener un laboratorio (por ejemplo, sobre la variación a la hora de decantar el volumen de análisis o la incertidumbre de un recuento) puede combinarse para obtener una estimación global de la repetibilidad para cada NMP.

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8 Bibliografía 8.1 Normas ISO ISO 9308-1:2000 Water Quality – Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria – Part 1: Membrane filtration method. Ginebra: Organización Internacional para la Estandarización. ISO/TR 13843:2000(E) Water Quality – Guidance on validation of microbiological methods. Ginebra: Organización Internacional para la Estandarización.

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Apéndice A:

Datos de los estudios de sensibilidad, especificidad y selectividad (véase el apartado 3.2)

Apéndice A1

Identificación de aislamientos de pocillos amarillos sin fluorescencia del método Colilert®-18/Quanti-Tray®

Ref. aislamiento Oxidasa Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 Y11 Y12 Y13 Y14 Y15 Y16 Y17 Y18 Y19 Y20 Y21 Y22 Y23 Y24 Y25 Y26 Y27 Y28 Y29 Y30 Y31 Y32 Y33 Y34 Y35 Y36 Y37 Y38 Y39 Y40 Y41 Y42 -

Indol + + + + + + + + + + + + -

Perfil Crystal E/NF 5765637153 4764417153 4724477151 7764477153 4764477151 4724467153 5764475555 4760427053 5764637051 5766477152 7424676151 7764672153 7764476157 5764637151 5765677151 4764627151 7734457051 5765477157 7766276157 5764476153 3764217153 5764427151 7764637157 5764627452 7764627555 0764437152 7765275557 4760056153 5765276157 5764617151 5764677557 7564677151 4560477153 5464454151 5464654155 5764427151 5664456055 4764475555 5760467555 4764627051 5764677150 4760473151

9

Identificación Enterobacter sakazakii Pantoea agglomerans Kluyvera cryocrescens Enterobacter cloacae Kluyvera cryocrescens Pantoea agglomerans Klebsiella oxytoca Pantoea agglomerans Kluyvera ascorbata Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Enterobacter cloacae Enterobacter sakazakii Kluyvera ascorbata Kluyvera ascorbata Escherichia vulneris Pantoea agglomerans Klebsiella oxytoca Serratia liquefaciens Enterobacter cloacae Cedecea lapagei Pantoea agglomerans Enterobacter sakazakii Leclercia adecarboxylata Klebsiella pneumoniae Pantoea agglomerans Serratia rubidaea Enterobacter asburiae Serratia liquefaciens Kluyvera ascorbata Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Citrobacter freundii Pantoea agglomerans Citrobacter freundii Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Escherichia vulneris Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae

Confianza 0,5861 0,7217 0,9829 0,9962 0,6287 0,7127 0,9825 0,9481 0,9264 0,9886 0,9335 0,8268 0,6102 0,9925 0,8702 0,5764 0,9932 0,8524 0,5712 0,8943 0,9835 0,7613 0,9734 0,999 0,9154 0,8776 0,9942 0,9504 0,5545 0,982 0,9555 0,9987 0,9961 0,9998 0,9994 0,7613 0,9973 0,9241 0,9413 0,9475 0,8043 0,9673

Y43 Y44 Y45 Y46 Y47 Y48 Y49 Y50 Y51 Y52 Y53 Y54 Y55 Y56 Y57 Y58 Y59 Y60 Y61 Y62 Y63 Y64 Y65 Y66 Y67 Y68 Y69 Y70 Y71 Y72 Y73 Y74 Y75 Y76 Y77 Y78 Y79 Y80 Y81 Y82 Y83 Y84 Y85 Y86 Y87 Y88 Y89 Y90 Y91 Y92 Y93

-

+ + + + + + + + + + + + -

5764637151 5766476156 7765627157 5774677153 7775677555 7765627157 5464477553 7775637153 4774437151 5764677557 5464457051 7764272153 5766477152 5764476152 5764256057 5764676557 5420677151 5766476152 5470473153 5774637151 5764676153 4764476057 5766476153 7765671151 7764477153 5764276057 4675477153 5765276057 5624657151 5725654447 5766477152 5764477555 5724627052 5766476153 5420677151 7767276157 5420444051 7764276557 5766477153 5423614153 5764627151 5765677557 5765476553 5767476152 5764637051 5764276057 5664677151 4464654141 5764627051 5764455555 5765647151

10

Kluyvera ascorbata Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Kluyvera ascorbata Klebsiella pneumoniae Enterobacter sakazakii Enterobacter cloacae Enterobacter cancerogenus Kluyvera cryocrescens Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Serratia plymuthica Serratia odorifera Citrobacter amalonaticus Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Kluyvera ascorbata Kluyvera ascorbata Enterobacter sakazakii Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Serratia plymuthica Enterobacter cloacae Serratia plymuthica Citrobacter freundii Serratia fonticola Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae Escherichia vulneris Enterobacter cloacae Citrobacter amalonaticus Serratia liquefaciens Citrobacter freundii Serratia marcescens Enterobacter cloacae Hafnia alvei Kluyvera ascorbata Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Kluyvera ascorbata Serratia plymuthica Kluyvera ascorbata Citrobacter freundii Escherichia vulneris Klebsiella pneumoniae Pantoea agglomerans

0,9925 0,8111 0,9416 0,9439 0,9853 0,9416 0,9999 0,5033 0,8422 0,8747 0,9962 0,8189 0,9886 0,9048 0,8677 0,7963 0,8735 0,6927 0,9996 0,9864 0,9308 0,7089 0,6618 0,937 0,9962 0,8302 0,9921 0,6877 0,996 0,9933 0,9886 0,9919 0,9987 0,6618 0,8735 0,6819 0,9799 0,9547 0,9872 0,9847 0,9942 0,9715 0,9226 0,7434 0,9876 0,8302 0,9349 0,999 0,6454 0,9504 0,6856

Y94 Y95 Y96 Y97 Y98 Y99 Y100

-

+ + -

7765256157 5765477153 5464654151 5765637151 5764427151 5764077153 5420656050

11

Serratia spp. Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Kluyvera ascorbata Pantoea agglomerans Enterobacter cloacae Citrobacter freundii

0,9846 0,9957 0,9771 0,8306 0,7613 0,9948 0,994

Apéndice A2

Identificación de aislamientos de pocillos amarillos con fluorescencia del método Colilert®-18/Quanti-Tray®

Ref. aislamiento Oxidasa F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 F14 F15 F16 F17 F18 F19 F20 F21 F22 F23 F24 F25 F26 F27 F28 F29 F30 F31 F32 F33 F34 F35 F36 F37 F38 F39 F40 F41 F42 F43 F44 F45 F46 -

Indol + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Perfil Crystal E/NF 5464444171 5461444171 5464444171 4464444171 5465464171 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5424444171 4464444171 5424444171 5464444171 5464444171 5425444571 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5424444171 5464444171 5424444171 5465444161 5465444161 5464044171 5465446071 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5425444571 5464444171 5464444171 5424444171 5464444171 5464044171 5464444171 5464444171 5465464171 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5424444171 5464444171

12

Identificación Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli

Confianza 0,9998 0,9737 0,9998 0,9813 0,991 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9997 0,9813 0,9997 0,9998 0,9998 0,9679 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9997 0,9998 0,9997 0,9976 0,9976 0,999 0,9945 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9679 0,9998 0,9998 0,9997 0,9998 0,999 0,9998 0,9998 0,991 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9997 0,9998

F47 F48 F49 F50 F51 F52 F53 F54 F55 F56 F57 F58 F59 F60 F61 F62 F63 F64 F65 F66 F67 F68 F69 F70 F71 F72 F73 F74 F75 F76 F77 F78 F79 F80 F81 F82 F83 F84 F85 F86 F87 F88 F89 F90 F91 F92 F93 F94 F95 F96 F97

-

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

5665444171 5464444171 5465404171 5464444171 5465464171 5464444171 5464444171 5464444171 5424444171 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5464444171 5424444171 5665444171 5464444171 5464444171 5435444171 5464444171 5464444171 4464444171 5464444171 5724444571 5465464171 5424444171 5424444171 5464444171 5464444171 5464444171 5424444061 5464044171 5465446071 5464444171 5464444171 5564044171 5464444171 5464444171 5464444171 5424444171 5464444171 5464444171 5424444171 5420444571 5425444571 5464444171 5464444171

13

Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli

0,9962 0,9998 0,9314 0,9998 0,991 0,9998 0,9998 0,9998 0,9997 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9998 0,9997 0,9962 0,9998 0,9998 0,9803 0,9998 0,9998 0,9813 0,9998 0,9999 0,991 0,9997 0,9997 0,9998 0,9998 0,9998 0,8035 0,999 0,9945 0,9998 0,9998 0,9911 0,9998 0,9998 0,9998 0,9997 0,9998 0,9998 0,9997 0,9983 0,9679 0,9998 0,9998

F98 F99 F100

-

+ + +

5464444171 5465464171 5765475577

14

Escherichia coli Escherichia coli Klebsiella oxytoca

0,9998 0,991 0,7486

Apéndice A3

Ref. aislamie nto N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N13 N14 N15 N16 N17 N18 N19 N20 N21 N22 N23 N24 N25 N26 N27 N28 N29 N30 N31 N32 N33 N34 N35 N36 N37 N38 N39 N40 N41 N42 N43 N44 N45

β-Gal

Identificación de aislamientos de pocillos negativos del método Colilert®-18/Quanti-Tray®

β-Gluc Oxidasa Indol

Perfil Crystal E/NF

-

-

+

-

3103310212

-

-

+

-

3103310212

15

Identificación NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO Shewanella putrefaciens NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO Shewanella putrefaciens NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO

Confianza

0,9994

0,9994

N46 N47 N48 N49 N50 N51 N52 N53 N54

NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO NO HAY CRECIMIENTO

16

Apéndice B:

Datos de los estudios sobre la incertidumbre del recuento (véase el apartado 4)

Apéndice B1

Incertidumbre del recuento para NMP* de pocillos amarillos sin fluorescencia de un sistema Colilert®-18/Quanti-Tray® inoculado con Klebsiella pneumoniae ATCC 33186 *Número Más Probable registrado como números enteros

Lectura Lectura Analista A Analista A Analista Analista Lectura 1 Lectura 2 B C

Repetibilidad

Desv. DER al Desv. DER al Media Est. cuadrado Est. cuadrado 0,0000 0,0000 2,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 6,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 19,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 18,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 36,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 34,67 1,1547 0,0011 0,0000 0,0000 31,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 27,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 41,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 48,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 89,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000 2,8284 0,0017 68,67 2,3094 0,0011 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000 7,7782 0,0087 85,33 6,3509 0,0055 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000 4,2426 0,0019 99,00 3,4641 0,0012 4,2426 0,0024 87,00 3,4641 0,0016 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 106,33 4,6188 0,0019 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 201,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000

Muestra

NMP

NMP

NMP

NMP

Media

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

2 6 19 18 36 34 31 27 56 50 41 48 56 89 78 66 109 78 95 95 95 83 109 101 145 145 201 165 165

2 6 19 18 36 34 31 27 56 50 41 48 56 89 78 70 109 89 95 95 101 89 109 101 145 145 201 165 165

2 6 19 18 36 34 31 27 56 50 41 48 56 89 78 70 109 89 95 95 101 89 109 109 145 145 201 165 165

2 6 19 18 36 36 31 27 56 50 41 48 56 89 78 70 109 89 95 95 101 89 109 109 145 145 201 165 165

2,00 6,00 19,00 18,00 36,00 34,00 31,00 27,00 56,00 50,00 41,00 48,00 56,00 89,00 78,00 68,00 109,00 83,50 95,00 95,00 98,00 86,00 109,00 101,00 145,00 145,00 201,00 165,00 165,00

30

201

201

201

201

201,00 0,0000 Suma de DER DERc

17

Reproducibilidad

0,0000 201,00 0,0000 0,0000

0,0147 0,0221

Suma de DER DERc

0,0125 0,0204

Apéndice B2

Incertidumbre del recuento para NMP* de pocillos amarillos con fluorescencia de un sistema Colilert®-18/Quanti-Tray® inoculado con E. coli ATCC 25922 *Número Más Probable registrado como números enteros

Lectura Lectura Analista A Analista A Analista Analista Lectura 1 Lectura 2 B C

Repetibilidad

Desv. DER al Desv. DER al Media Est. cuadrado Est. cuadrado 0,0000 0,0000 6,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 11,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 9,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 29,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 32,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 21,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 36,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 32,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 48,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 46,00 1,7321 0,0014 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 66,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 101,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 89,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 130,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 74,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 101,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 118,00 0,0000 0,0000

Muestra

NMP

NMP

NMP

NMP

Media

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

6 11 9 29 32 21 36 32 56 50 48 45 78 70 66 78 95 109 101 89 130 95 70 74 109 101 145 165 118

6 11 9 29 32 21 36 32 56 50 48 45 78 70 66 78 95 109 101 89 130 95 70 74 109 101 145 165 118

6 11 9 29 32 21 36 32 56 50 48 45 78 70 66 78 95 109 101 89 130 95 70 74 109 101 145 165 118

6 11 9 29 32 21 36 32 56 50 48 48 78 70 66 78 95 109 101 89 130 95 70 74 109 101 145 165 118

6,00 11,00 9,00 29,00 32,00 21,00 36,00 32,00 56,00 50,00 48,00 45,00 78,00 70,00 66,00 78,00 95,00 109,00 101,00 89,00 130,00 95,00 70,00 74,00 109,00 101,00 145,00 165,00 118,00

30

130

130

130

130

130,00 0,0000 Suma de DER DERc

18

Reproducibilidad

0,0000 130,00 0,0000 0,0000

0,0000 0,0000

Suma de DER DERc

0,0014 0,0069

Apéndice C:

Días desde fabricación 8 15 24 30 36 44 56 84 111 138 175 205 269 319 367

Recuentos por duplicado de suspensiones de E. coli, Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii de un sistema Colilert®18/Quanti-Tray® tras 18 horas y 22 horas de incubación utilizando Colilert-18 almacenado a 25 °C durante 541 días (véase el apartado 5) Número de pocillos positivos Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii % de % de % de 18 h 22 h 18 h 22 h 18 h 22 h cambio cambio cambio 2 2 0 12 12 0 11 11 0 4 4 0 11 11 0 14 14 0 7 7 0 15 15 0 16 16 0 9 9 0 9 9 0 2 3 + 50 % 16 16 0 19 19 0 5 5 0 8 8 0 13 13 0 7 7 0 14 14 0 14 14 0 14 14 0 9 9 0 12 12 0 16 16 0 10 10 0 16 16 0 18 18 0 13 13 0 18 18 0 18 18 0 17 17 0 16 16 0 18 18 0 11 11 0 13 13 0 8 8 0 8 8 0 18 18 0 16 16 0 13 13 0 13 13 0 15 15 0 14 14 0 17 17 0 16 16 0 8 8 0 24 24 0 11 12 +9% 5 5 0 14 14 0 16 18 + 13 % 9 9 0 19 19 0 10 11 + 10 % 13 13 0 10 10 0 6 7 + 17 % 4 4 0 16 16 0 7 14 + 100 % 4 4 0 14 14 0 11 11 0 10 10 0 14 14 0 11 11 0 8 8 0 16 16 0 8 8 0 8 8 0 19 19 0 12 12 0 9 9 0 20 20 0 20 20 0 5 5 0 12 12 0 17 17 0 21 21 0 12 12 0 17 17 0 3 3 0 14 14 0 8 9 + 13 % 2 2 0 15 15 0 10 10 0 9 9 0 12 12 0 13 13 0 7 7 0 15 16 +7% 16 16 0 11 11 0 20 20 0 20 21 +5% 12 12 0 22 22 0 30 30 0 10 10 0 17 17 0 18 18 0 8 8 0 20 20 0 18 18 0 14 14 0 18 18 0 22 22 0 8 8 0 13 13 0 14 14 0 10 10 0 26 26 0 17 17 0 10 10 0 19 19 0 14 14 0 13 13 0 15 15 0 4 5 + 25 % 18 18 0 17 17 0 13 15 + 15 % 13 13 0 11 11 0 13 14 +8% 2 2 0 12 12 0 17 17 0 11 11 0 21 21 0 20 20 0

19

541

10 7 10 9

10 7 10 9

0 0 0 0

20 13 17 16

20

20 13 17 16

0 0 0 0

21 11 11 8

21 11 12 9

0 0 +9% + 13 %

Apéndice D: Intervalos de confianza del 95% y repetibilidad teórica para cada uno de los valores de NMP para el sistema Colilert®-18/Quanti-Tray® de 51 pocillos (véase el apartado 7)

Intervalos de confianza del 95%

Repetibilidad teórica

Nº de pocillos reacción positiva

NMP por 100 ml de muestra

0

200,5

146,1

infinite

-

-