Photomorphogenese: Wirkung des Lichts auf die Entwicklung von Pflanzen

Literatur • L. Taiz, E. Zeiger: Physiologie der Pflanzen Spektrum Verlag • H.W. Heldt, B. Pichulla: Pflanzenbiochemie Spektrum Verlag • Brennicke, Schopfer: Pflanzenphysiologie Spektrum Verlag

Licht = Elektromagnetische Strahlung : 350 bis 780 nm

-> der für das Auge sichtbare Bereich

Lichtperzeption Pflanzen können Licht wahrnehmen: - Licht

- Lichtrichtung

Spektrale Verteilung von Licht. Tageslicht

- Lichtintensität - Dauer der Belichtung

- Spektralbereich (Qualität) Baumkrone Dämmerung

Was ist Licht für die Pflanze? - Energiequelle - Signal für die Steuerung einer Vielzahl von Entwicklungsprozesse

Licht steuert die Enwicklung von Pflanzen Photomorphogenese

Licht-gekeimte Pflanzen

Skotomorphogenese

Dunkel-gekeimte Pflanzen

Photorezeptoren der Pflanzen – Phytochrom (Hellrot- und Dunkelrotlicht, 660 bzw. 730 nm): • steuern Wachstums- und Entwicklungsvorgänge von Pflanzen • Schattenvermeidung, Blühinduktion, Phototaxis

– Cryptochrom (UV-A und Blaulicht, 340 bis 520 nm): • Aufrechterhaltung der circadianen Rhythmik • steuern Photomorphogenese und Blühinduktion

– Phototropin (UV-A und Blaulicht, 340 bis 520 nm) • vermittelt effiziente Lichtnutzung und Phototropismen • auch an der Chloroplastenbewegung, der Stomataöffnung beteiligt

– UV-B-Photorezeptor (280 bis 350 nm) • Schutzfunktion

Photorezeptoren der Pflanzen

Yuling Jiao, On Sun Lau & Xing Wang Deng Nature Reviews Genetics 8, 217-230 (March 2007) doi:10.1038/nrg2049

Photorezeptoren • Photorezeptoren sind Chromoproteine - Chromophore: absorbiert Licht - Apoprotein: Konformationsänderung führt zur Signalübertragung

• Informationsübertragung verläuft über

Signalkaskaden

Klassische Phytochromwirkungen Skotomorphogenese

Dikotyle • Keimung oft Licht abhängig • 3 Kriterien der Photomorphogenese:

- Hypokotyl-Elongation - Öffnung des Hypokotylhakens - Entwicklung von Kotyledonen

Sinapis alba

Photomorphogenese SB21.17

Monokotyle • Alternative Entwicklungsstrategie - Streckung der Koleoptile im Dunkeln

Klassische Phytochromwirkungen • Rotlicht aktiviert die Keimung von Salat-Samen (Lactuca sativa) • dunkelrotes Licht revertiert diese Aktivierung (Keimung gehemmt)

Lettuce seed germination is a typical photoreversible response controlled by phytochrome (Taiz L., Zeiger E., 2010)

Klassische Phytochromwirkungen • Erlangung der Blühfähigkeit auf bestimmte Tageslängen angewiesen: Unterscheidung von Kurztagpflanzen und Langtagpflanzen

Taiz L., Zeiger E., 2010

Klassische Phytochromwirkungen • Plastidendifferenzierung ist lichtabhängig

Das Phytochrom-System • In Pflanzen gibt es mehrere Phytochrome - von verschiedenen Proteinen expremiert - zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung • Es gibt 5 Phytochrom-Gene in Arabidopsis (Dikotyle): phyA, phyB, phyC, phyD, phyE • Monokotyle (z.B. Mais) haben weniger Phytochrom-Gene: phyA, phyB, phyC

• Alle Phytochrome haben den selben Chromophor - unterscheiden sich in ihrer Sensitivität zu Licht

• Unterschiedliche Phytochrome sind für unterschiedliche Prozesse

verantwortlich.

Phytochrome exists in 2 states (Pr and Pfr) Pr form: -

absorbs at a peak of 666 nm

-

is the form synthesized in dark

-

when Pr absorbs red light, it is converted to the Pfr form

Pfr form: -

absorbs at a peak of 730 nm

-

Pfr form is the active form that initiates biological responses

-

when Pfr absorbs far red light, it is converted to the Pr form

-

Pfr can also spontaneously revert to the Pr form in the dark

Pr = Phytochrome red light absorbing, inactive

Pfr = Phytochrome far-red light absorbing, active

The photoconvertible Pr and Pfr forms

Pr = Phytochrome red light absorbing, inactive Pfr = Phytochrome far-red light absorbing, active

Absorptionsspektrum von Phytochrom • Absorptionspektren von Pr und Pfr überlappen  the Pr form absorbs maximally at 660‐670nm (R)  the Pfr form absorbs maximally at 725‐735nm (FR)

- Aufgrund überlappender Absorptionsspektren liegt immer ein Gleichgewicht von Pr und Pfr vor: o Gleichgewicht in Rotlicht: 85% Pfr und 15% Pr -> Pfr absorbiert R-Licht

o Gleichgewicht in Dunkelrotlicht: 97% Pr und 3% Pfr

-> Pr absorbiert etwas DR-Licht

Struktur des Chromophors • Das Protein (Apoprotein) ist kovalent an ein Chromophor gebunden. • Der Chromophor ist ein linearer Tetrapyrrol (Phytochrombilin). • Beide sind über eine Thioetherbrücke miteinander verbunden. • Pflanzliche Phytochrome sind Homodimere (bestehend aus 2 gleichen

Polypetiden).

Struktur des Chromophors • Rotlicht bewirkt die reversible Isomerisierung zwischen den Tetrapyrrolringen C und D. • Diese Veränderung am Chromophor verändert die

Konformation des Proteins.

Domänenstruktur

N-Terminus:

C- Terminus:

- Phy-Spezifität

- Dimerisierungsdomäne

- Chromophorbindung

- Ubiquitinbindung

- PEST für Degradation

- Signalweiterleitung - Serin/Threonin-Kinase Domäne

Domänenstruktur

R/DR-Lichtverhältnis

R/DR-Lichtverhältnis µmol m-2 s-1

R/FR ratio

Day

1900

1.19

Sunset

26.5

0.96

Under Canopy

17.7

0.13

5mm deep in Soil

8.6

0.88

3 Arten der Phytochrom-Antworten • Einteilung ist abhängig von der Lichtintensität: 1. VLFR (very low fluence responses) •

< 10-3 µmol photons/m2

2. LFR (low fluence responses) •

1-1000 µmol photons/m2

3. HIR (high irradiance responses) •

>1000 µmol photons/m2

3 Arten der Phytochrom-Antworten • Niederflußantwort (LFR, low fluence response) - RL durch DR revertierbar

- Phytochrom B (auch C, D und E) • Hochintensitätsrekation (HIR, high irradiance reaction) - Wirkung bei Dauerbestrahlung - energieflußabhängig - nicht revertierbar - v.a. Phytochrom A, z.T. Phytochrome B • Niedrigstflußreaktion (VLFR, very low fluence response) - benötigt < 0.01% Pfr

- nicht revertierbar - Phytochrom A

Low fluence response (LFR) • abhängig von R/DR Verhältnis • reguliert:

- Keimung -> Licht stimuliert oder hemmt Keimung (Spezies-spezifisch) -> z.B. Salat -> RL stimuliert Keimung -> bis zu 8h nach Bestrahlung durch DR revertierbar

- De-Etiolierung -> Ergrünen von etiolierten Keimlingen bei Belichtung ( nach erreichen der Erdoberfläche bzw. durchbrechen der Blattschicht/Vegetation)

-> massive Chlorophyllsynthese, heterotropher -> autotropher Stoffwechsel

Phytochrom-abhängige Keimung

Red

Dark

Red Far-red

Dark

Dark (control)

Red Far-red Red

Dark

Red Far-red Red Far-red

• Rotlicht fördert Keimung, Dunkelrot hemmt Keimung

• Etioliert: -

kein Chlorophyll -> Etioplasten Hypokotyl lang geschlossener Hypokotylhaken kleine Blätter

• De-etioliert: -

Chlorophyll -> Chloroplasten grüne, entfaltete Blätter Hemmung des Längenwachstums

Schattenvermeidung

Shaddow

• Pfr > Pr • long hypokotyl • field – plants at the edges are shorter, because less shaded

High irradiance response (HIR) • ist abhängig von der Dauer (Kontinuität) und der Intensität (Photonenflussrate) der Bestrahlung • ist unabhängig von R/DR-Verhältnis • reguliert:

- Chlorophyllsynthese - Plastidendifferenzierung - Keimung von Samen - Hemmung des Längenwachstums - De-Etiolierung

- zirkadiane Rhythmik

Es gibt 5 Phytochrom-Gene in Arabidopsis: PhyA-E • Phytochrom A - Licht-instabil - Hauptform in Samen und etiolierten Pflanzen

• Phytochrom B-E - Licht-stabil - Hauptform in de-etiolierten Pflanzen

Phytochrome haben überlappende Funktionen HIR

LFR

Mutants: • Chromophor mutants ->all phytochromes are affected • Apoprotein mutants • loss of function mutants -> e.g. defect in signaling component Muramoto et al., 1999

• gain of function mutants -> e.g. constitutive active signaling component

Phenotypes: - dark phenotype in light - light phenotype in dark

Photorezeptor-Mutanten von Arabidopsis

Phenotype of phy mutants (phy = phytochrome); Li et al., 20011

Photorezeptor-Mutanten von Arabidopsis

Phenotypes of 4-d-old WT, phyA, phyB, and phyAB mutant plants

Phytochrome regulieren Genexpression • Gen-Aktivierung während der Photomorphogenese: –

1979: Lhcb-Gene (Antennenprotein der PS-Komplexe) in Gerste

– heute: > 1500 Gene sind Phytochrom-reguliert:

- Photosynthese-Gene - N/S-Metabolismus - Gene für Plastiden-lokalisierte Protein - Pigment-Gene (Anthocyane und Flavonoide)

• Phytochrom-Level kontrolliert eigene Expression (phyA) über negative

feedback-Schleife

Expression von Phytochrom-Genen

Phytochrom-Biosynthese

Wie reguliert Phytochrom die Genexpression? (i) Pfr reguliert Transkriptionsraten im Kern Signaltransduktion 1.Konformationsänderung von Pr zu Pfr in Rotlicht 2.Translokation von Pfr in den Zellkern 3.Pfr assoziiert mit regulatorischen Proteinen

(Transkriptionsfaktoren wie z.B. PIFs = phytochrome interacting factors) 4.Aktivierung lichtregulierter Gene 5.Autophosphorylierung von Pfr  Ein kleiner Teil der Pfr-Form bleibt in Cytosol –> vermittelt cytosolische Phyochromantworten  Phosphorylierungsgrad (pY) von Phytochrom entscheidend für Signaltransduktion -> phosphorylierte Pfr-Form ist im Kern inaktiv

Nito et al, 2013

Phytochrom-Signaltransduktion

Interaktion mit Transkriptionsfaktoren -

Interaktionspartner identifiziert (mittels yeast two-hybrid-Screens und Mutantenanalysen)

-

am besten untersucht sind phytochrome-interacting factors (PIFs), z.B. PIF3

-

PIFs sind basische Helix-Loop-Helix (bHLH) Transkriptionsfaktoren

-

PIFs sind im Kern lokalisiert und binden an G-Box-Motive (= light responsive element) in den Promotoren lichtregulierter Gen (z.B. MYB (Transkriptionsfaktor)

-

im Licht interagiert Pfr mit PIFs -> führt zur deren Abbau

-

Proteolyse von PIFs aktiviert Expression lichtregulierter Gene („early genes“; z.B. MYB)

-

diese Proteine aktivieren „late genes“

-

physiologische Reaktionen auf Licht

Wie reguliert Phytochrom die Genexpression? (ii) Proteolyse von Repressoren der Photomorphogenese -

Repressoren (neg. Regulatoren) z.B. COP1, COP10, COP9 und SPA -> sind im Kern lokalisiert

-

COP1 besitzt eine E3 Ubiquitin-Ligase Aktivität

-

kann sich selbst und andere interagierende Proteine (Transkriptionsfaktoren

z.B. HY5 und LAF1) ubiquitinylieren -

reguliert dadurch den Abbau (oder die Akkumulation) verschiedener Transkriptionsfaktoren im Dunkeln (bzw. Licht)

-> TF werden im Dunkel durch den COP1 /SPA-Komplex abgebaut -> im Licht wird COP1-SPA-Komplex inaktiviert und TF stabilisiert

Phytochrome signaling pathway

Li et al., 20011

• PIFs inhibieren durch Licht induzierte Antworten • HY5, HFR1 und LAF1 mit positiver Wirkung auf lichtabhängige Antworten

Phototropismus Phototropismus: Wachstumsbewegung von Pflanzen in Abhängigkeit des Lichtreizes – positiver Phototropismus -> Krümmung zum Licht hin – negativer Phototropismus -> Krümmung vom Licht weg

Light Time  0 min

Time  90 min (b) Coleoptiles before and after light exposures

Phototropic effectiveness

1.0

436 nm

0.8 0.6 0.4 0.2 0

400 450 500 550 600 650 700

Wavelength (nm) (a) Phototropism action spectrum

Blaulicht: 400 – 500 nm

Blaulichtrezeptoren Pflanzen detektieren Richtung, Intensität und Wellenlänge. • Phototropine (NPH)

• Cryptochrome (CRY) • (Photolyasen)

Phototropin-gesteuerte Reaktionen • Phototropismus

• Chloroplastenbewegung • Stomataöffnung • teilw. überlappende Funktion mit Phytochromen:

o Stomataöffnung o Genexpression o Pototaxis o Hemmung des Hypokotylwachstum

Phototropin-gesteuerte Reaktionen in Arabidopsis: WT: Wild-type

p1p2: phototropin-deficient Arabidopsis mutant

Phototropine – Struktur: • zwei LOV Domänen (Light oxygen voltage): LOV1 und LOV2 • eine Proteinkinasedomäne • Flavin (FAD) dient als Chromophor

• Phototropine sind in Plasmamembran verankert

Modell zur Aktivierung der Phototropine: • im Dunkeln ist Phototropin inaktiv -> da Proteinkinasedomäne durch LOV2 blockiert

• Blaulicht bewirkt Änderung der Struktur: -> Aktivierung der Kinasedomäne -> Autophosphorylierung der Phototropine -> Signalweitergabe -> Änderung der Genexperession

Phototropin photoreaction R

R CH3

N

Flavin >

5

CH3

N

O

SH SH

N

O

BL

CH3

N

4a NH NH

5 N N H

CH3 O

NNHH

O S

Slow dark recovery

Cystein

4a

O

O N

Redox reaction !!!!!!!

Cysteinyl-C(4a) adduct Batschauer

Nach Belichtung verändern sich die Konformation. Dadurch bindet das Chromophor kovalent das Protein – kovalente Bindung zw. C(4a) des FMN und einem Cystein-Rest der LOV-Domäne.

Phototropin-mediated reactions •

Phototropismus

•

Chloroplasts movement

•

Stomata opening

• 2 Phototropine in Arabidopsis: phot1 und phot2 -> One of the two phototropins is responsible for low light responses, the other for high light responses.

Blue light induces chloroplast movement low light

high light

WT

phot1

phot2

phot1/ phot2 TIPS

Genotype

Phototropismus

Chloroplast movement

Stomata opening

Blue light induces chloroplast movement

Blue light directs auxin to the shaded side to induce phototropic curvature

Blue Light directs stomata opening

Guard cells with chlorophyll

fluorescence

…. However stomata opening is regulated by many factors

Cryptochrome (Cry) • in Pflanzen, Bakterien und Tieren identifiziert • in Sequenz und Struktur den Photolyasen sehr ähnlich, haben jedoch keine Photolyase-Aktivität (keine DNA-Reparatur)

• Vorwiegend im Zellkern lokalisiert, auch im Cytoplasma

Pterin

Flavin

Cryptochrom-gesteuerte Reaktionen •Hemmung des Sproßwachstums •De-etiolierung

•Blühinduktion •Stimulation der Anthocyanin-Biosynthese

•Circadianer Rhythmus

Cryptochrom – Struktur: • Binden zwei Co-Faktoren: i.

Flavin (FAD) -> dient als katalytisches Chromophor

ii.

Pterin (MTHF) - > fungiert als Antennenpigment

• Signalweitergabe durch Phosphorylierung und Protein-Interaktion

Cryptochrome is central for the control of circadian rhythm

Linnès „Blumenuhr“

Neben Cryptochromen auch Phytochrome beteiligt!

Linnés Blumenuhr

Tagesrhythmische Blattbewegung von Mimosa pudica

Blattgelenk mit Leitbündelverlauf

Tagesperiodische Blattbewegungen von Phaseolus-Pflanzen

A und B: Nacht- und Tagstellung der Blätter C: Tagesperiodische Bewegung, Aufzeichnung dieser Bewegung über mehrere Tage, die ersten zwei Tage mit Licht-Dunkel-Wechsel, dann Dauerdunkel

Biologische Rhythmen • Biologische Rhythmen: Phänomene, die sich in regelmäßigen Zeitabständen wiederholen, z.B. einem Tag, Monat oder Jahr. 

circadianen Rhythmen (~1 Tag)



lunar (~ 1 Monat



annual (~ 1 Jahr)

• zyklischer Wechsel mit Licht-Dunkel, Wärme-Kälte, Luftfeuchte und Gravitation • Rhythmen werden durch „innere Uhren“ (Zeitmesssysteme) erzeugt • Phasenlage synchronisieren mit äußeren Faktoren (den „Zeitgeber“)

Grundorganisation circadianer Systeme Exogene Zeitgeber: Temp, Licht, Luftfeuchtigkeit

endogener Schrittmacher: (clock-Gene z.B. per, tim, frq, toc)

Response:

Metabolismus, Verhalten, Aktivität

Input: Aufnahme exogener Rhythmen Oszillator: fortlaufende Oszillation mit endogener Periode Output: vom Oszillator geregelte Prozesse

Merkmale circadianer Systeme 1)

werden durch Umweltreize (Licht, Temperatur) synchronisiert (Entrainment: Fähigkeit der täglichen Synchronisation der Phasenlage mit exogenen Umweltfaktoren)

2) laufen mit einer individuellen Periodenlänge von ~ 24 Stunden

3)

sind temperaturkompensiert, d.h. Periodenlänge bleibt über einen weiten Temperaturbereich hinweg konstant Q10: 0.8- 1.3 Erhöhung der Temperatur um 10°C führt zur Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit um den Faktor 0.8- 1.3

• toc1 (timing of CAB/Lhcb expression)

• Identifikation genetischer Komponente: period, timeless, clock, cycle • Mechanistisches Grundprinzip: Oszillatoren werden durch Rückkopplungsschleifen der Transkription und Translation angetrieben, d.h. Protein hemmt die Transkription des eigenen Gens  Fliegen (Drosophila melanogaster) – Period & Timeless – Clock und Cycle  Isolierung von Mutanten (gestörte Rhythmik des Lokomotorverhaltens und Schlüpfens)  Idendentifizierung der Gene perl, pers, pera – Fliegen lang, kurz, arhythmisch  Neurospora, Chlamydomonas, Arabidopsis, Maus

Rückkopplungsschleife der Genexpression in Drosophila:  Clock (CLK) und Cycle (CYC) bilden Heterodimere im Kern •

CLK und CYC sind Transkriptionsfaktoren (besitzen bHLH- und PAS-Domänen)

 binden an Promotoren (E-Box-Sequenzen) von period und timeless  aktivieren daraufhin die Transkription von period (PER) und timeless (TIM) •

PER und TIM sind Transkriptionsfaktoren (besitzen PAS-Domänen)

 mRNAs wandern vom Zellkern ins Cytosol ->Translation im Cytosol  PER und TIM wandern in Kern  De-aktivierung des CLK-CYC-Komplexes -> Transkription von per und time gehemmt

Gonyaulax polyedra: •

Biolumineszenz in der Nacht

•

Zellteilung bei Morgendämmerung

•

Photosynthese am Tag

•

Zellaggregration am Tag Fluorescence of luciferin

•circadiane Kontrolle erfolgt über Regulation der Translation - nicht transkriptionell -> Biolumineszenz: Regulation der Translation des Luciferinbindeprotein

Photolyases • Vorkommen in prokaryotischen und in eukaryotischen Organismen

• Strukturell den Cryptochromen ähnlich • Flavin (FAD) und Pterin als Chromophore • Photolyasen sind Enzyme, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind

-> DNA-Reparatur erfolgt mit Hilfe von Blaulicht • sind keine Photorezeptoren

Photo-reactivation by blue light

…. In summary: BL and RL

UV-B Rezeptor • absorbiert bei 290-350 nm

• seit 70er Jahre physiogisch charakterisiert – Induktion von Flavonen/Flavonoiden/Anthocyane -> Schlüssenenzyme dieses Syntheseweges

• 2011 UVR8 (UV resistance locus 8) identifiziert • im Pflanzenreich ubiquitär verbreitet • Schutzfunktion (UVB-Schäden) • steuert Entwicklungsprozesse

UV-B Rezeptor-Struktur • liegt in zwei strukturellen Zuständen vor: Licht- und Dunkelform

-> im Dunklen als Homodimer

-> in UVB-Licht Monomer

• besitzt Tryptophan-Pyramide als Chromophor -> diese fungiert als UV-B Lichtsensor

UV-B-vermittelte Signaltransduktion

• monomere Form bindet an das Signalprotein COP1 (COP1 = constitutively photomorphogenic 1)

• Bindung an COP1 löst Signaltransduktionskaskade aus -> Geneexpression -> Einleitung des genetischen Schutzprogramms