PCR Múltiplex Listeria monocytogenes

PCR-múltiplex • En una sola reacción de PCR se amplifican al mismo tiempo 2 o más genes • Condiciones similares de PCR para los genes amplificar: ▫ Desnaturalización ▫ Alineamiento ▫ Extensión

• Se emplean mas de 1 par de primers (fw y rv; 1 par por cada gen)

Primers para PCR múltiplex (características) • Específicos para cada gen • No hibridar en zonas donde no se requiere sobre todo en zonas del otro gen a amplificar • No hibridar entre ellos

Internalina A

Internalinas

MÉTODO Nota: Utilizar guantes a lo largo de todo el protocolo.

PCR MASTER MIX • Verifique que los tubos de reacción se encuentre perfectamente descongelados antes de su utilización

PCR MASTER MIX • Mantenga los tubos que contienen la Taq Polimerasa recombinante Fermentas, el DNA templado, los primers y los dNTP’s a -20°C hasta el momento de uso

PCR MASTER MIX • Centrifuga (PIN-PULSO CENTRÍFUGA) brevemente el contenido de los tubos antes de usar

• En un microtubo de centrífuga de 1.5 a 2.0 mL preparar la siguiente mezcla de reacción • Considerar que la siguiente proporción de reactivos considera solamente 1 reacción MÚLTIPLEX de amplificación.

PCR múltiplex MASTER MIX L. monocytogenes Master Mix Buffer (KCl)

VOLUMEN PARA UNA REACCIÓN 5.0 µL

MgCl2 (2.5 mM)

5.0 µL

dNTP (0.2 µM)

1.0 µL

inlA Fw (1 µM)

2.9 µL

inlA Rv (1 µM)

2.4 µL

inlC Fw (1 µM)

2.8 µL

inlC Rv (1 µM)

2.8 µL

Agua grado biología molecular

25.85 µL

Taq polimerasa (Fermentas®)

1.25 µL

DNA Templado

1.0 µL

Volumen total

50.0 µL

•

Realizar los cálculos pertinentes para el número de muestras a amplificar además de 1 reacción de exceso por errores en pipeteo

PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 1. Amortiguador-KCl 10X

10.0 µL

Seleccionar volumen Tomar punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Al ser el primer reactivo y tener el tubo vacío colocarlo en el fondo del microtubo de 2.0 mL-master mix

PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 2. Magnesio-MgCl2 (2.5 mM)

Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo de 2.0 mL-master mix y oprimir a segundo tope

10.0 µL

PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso)

3. dNTP’s Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de eppendorf-master mix y oprimir a segundo tope

2.0µL

PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 4. Primer Forward (inlA Fw) Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope

5.8L

PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 5. Primer Reverse (inlA R) Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope

4.8 L

PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 6. Primer Forward (inlC F) Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope

5.6 L

PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 7. Primer Reverse (inlC R) Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope

5.6 L

PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) Realiza cálculos sumar volúmenes del resto de componentes y por diferencia con 100 µL determinar la cantidad de agua a adicionar 8. AGUA GRADO BIOL MOL Seleccionar pipeta y volumen Tomar punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope

51.7 µL

PCR-MASTER MIX para 2 reacciones (1 reacción de exceso) 9. Taq polimerasa recombinante (Fermentas) 2.5 µL Seleccionar pipeta y volumen Tomar punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en pared de microtubo-master mix y oprimir a segundo tope

1o.TRANSFERENCIA MASTER-MIX A TUBO PCR MASTER MIX Seleccionar pipeta y volumen Tomar punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Apoyar punta en la pared del microtubo para PCR y oprimir a segundo tope

49 µL

PCR-MASTER MIX 11. DNA TEMPLADO Seleccionar volumen Cambio de punta Oprime botón a primer tope Pipetear el volumen, Libera lentamente pistón Introducir punta DENTRO DE LA SOLUCIÓN CONTENIDA EN el microtubo de PCR y oprimir a segundo tope Tapar PERFECTAMENTE

1.0 L

PCR MASTER MIX 12. Mezclar el contenido, dando golpes suaves al fondo del microtubo de PCR ( con lo cual se mezcla toda la MASTER MIX-TEMPLADO)

TERMOCICLADOR 13. Introduce los tubos de PCR con la MASTER MIX-TEMPLADO al termociclador

14. Programación del termociclador BioRad MyCycler: • 1 ciclo de desnaturalización:

95.0° C 5.0 min

• 30 ciclos de amplificación: desnaturalización

95.0° C 1.0 min 58.7° C 1.0 min 72.0° C 1.5 min 72.0° C 5.0 min

Alineamiento amplificación • 1 ciclo de amplificación final

• Refrigeración

4°C

FUNCIONAMIENTO/ PROGRAMACIÓN TERMOCICLADOR Se proporcionará la explicación por equipo

¿Tengo que venir a la 1 o 2 pm cuando acabe la amplificación? ¡¡NO!! Los profesores se e encargarán de retirar el tubo de PCR con tu multiplex inlA /inlC de Listeria monocytogenes amplificado del termociclador

Se recomienda almacenar el producto de PCR a –20 ºC. (será realizado por los Profesores)

LA PRÓXIMA SESIÓN REALIZAREMOS LA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA A PARTIR DEL PRODUCTO MULTIPLEX inlA/inlC DE PCR