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KLASSIFIZIERUNG

Listeria monocytogenes

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grampositive, nicht sporenbildende Stäbchen, deren taxonomische Zuordnung zu einer Familie noch aussteht. Genus: Listeria

1. ALLGEMEINES L. monocytogenes gilt als Erreger der weltweit, sporadisch bei Mensch und Tier auftretenden Listeriose. Diese Infektionskrankheit kann sich bei allen landwirtschaftlichen Nutz-, Heim-, Wild- und Zootieren sowie bei Vögeln unter verschiedenen Verlaufsformen manifestieren: 1. Zerebrale Form: Diese hat als Gehirnlisteriose vor allem beim Schaf eine große Bedeutung und tritt zunehmend auch beim Rind auf. 2. Septikämische Form: Geht vor allem bei lebensschwachen Neugeborenen mit herdförmigen Veränderungen in den Organen einher. Außerdem häufiges Auftreten bei Nagetieren (vor allem beim Chinchilla) sowie bei Hühnervögeln (subakuter septikämischer Verlauf). 3. Metrogene oder abortive Form: Diese ist gekennzeichnet durch Aborte und Frühgeburten oder angeborene Lebensschwäche, tritt vor allem bei Rind, Schaf und Schwein auf. 4. Mastitis. 5. Latente Ausscheider über Darminhalt.

Dem Genus Listeria (sensu strictu) gehören außer L. monocytogenes noch weitere Spezies an: L. ivanovii, gelegentlicher Aborterreger beim Schaf, sowie L. innocua, L. seeligeri und L. welshimeri. Die 3 letztgenannten Spezies kommen ubiquitär in der Umwelt (u.a. im Erdboden, Oberflächenwasser und Pflanzen) vor, gelten aber für Mensch und Tier als apathogen.

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2. UNTERSUCHUNGSMATERIAL - Von lebenden Tieren, in Abhängigkeit von Krankheitserscheinungen: Citratblut, Liquor, Kot, Mastitis-, Vaginalsekret, Nachgeburt. - Von verendeten Tieren, in Abhängigkeit vom vorangegangenen Krankheitsbild: Gehirn (Hirnstamm), veränderte Organe, abortierte Feten.

3. UNTERSUCHUNGSGANG 3.1 Mikroskopische Untersuchung - Objektträger-Ausstrichpräparate von Liquor, Mastitissekret, veränderten Organen (mit miliaren Nekrosen) nach Gram färben. - Listerien lassen sich als grampositive, intra- und extrazellulär liegende, gleichmäßig gefärbte Kurzstäbchen nachweisen. Gelegentlich Aussehen und Lagerung wie Kokken, so daß eine mikroskopische Unterscheidung von Streptokokken, Korynebakterien oder Aktinomyzeten erschwert sein kann. 3.2 Kulturelle Untersuchung - Keimarmes Material, das eine bakterielle Mischflora nicht erwarten läßt, wie z.B. Liquor,

Gehirn oder frisch entnommene, veränderte Organe (z.B. Leber) von verendeten Tieren, Mageninhalt von abortierten Feten u.a., werden direkt auf Blutagar-Platten (ANHANG: 5) fraktioniert ausgestrichen; - Untersuchungsmaterial, bei dem mit einer spärlichen oder reichlichen Bakterienmischflora zu rechnen ist, wie z.B. Kotproben, Nachgeburten u.a., wird einer Selektivanreicherung ("Wärme-Anreicherung") zugeführt. - 5 g (bzw. 1g) Probenmaterial in 45 ml (bzw. 9 ml) Anreicherungsmedium (ANHANG: 1)

geben. Diesem werden kurz zuvor jeweils 0,5 ml (bzw. 0,1 ml) Supplement I (ANHANG: 2) und II (ANHANG: 3) hinzugefügt (= 1. Anreicherung). - Bebrütung bei 30 oC für 18-22 Std. - Aussaat auf Selektivnährböden (ANHANG 6).

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- Ferner 1 ml der 1. Anreicherung überführen in 9 ml (neues) Anreicherungsmedium, dem kurz zuvor 0,01 ml Supplement III (ANHANG: 4) hinzugefügt wird (= 2. Anreicherung). - 1. Anreicherung bei 30 oC für 7 Tage weiterbebrüten. - 2. Anreicherung bei 30 oC 18-22 Std. bebrüten. - Jeweils fraktionierte Aussaat der 1. und 2. Anreicherung auf feste Selektivnährböden (ANHANG: 6) - Bebrütung 18-22 Std., besser 2 Tage, bei 37 oC . - Ist die 2. Anreicherung stark bewachsen (z.B. "Häutchenbildung"), dann davon nach Aufschütteln 1 ml mit 9 ml %iger KOH versetzen, aufschütteln und sofort fraktioniert auf feste Selektivnährböden ausstreichen. - Für epidemiologische Fragestellungen kann die 2. Anreicherung 3-6 Monate im Kühlschrank (+4 0C) aufbewahrt ("Kälteanreicherung") und danach ebenfalls auf Selektivnährboden ausgestrichen werden. Auf diese Weise ist eine Erhöhung des Listerien-Nachweises um ca. 20% möglich. 3.3

Identifizierung

3.3.1

Kultur

- Auf Blutagar wachsen Listerien nach 18-22 Std. als kleine, durchscheinende, glattrandige Kolonien, die nach 44-48 Std. eine graue Farbe annehmen. - Kolonien von L. monocytogenes sind von einem schmalen ß-hämolytischen Hof umgeben, ebenso L. seeligeri. Allerdings kann bei dieser Spezies die Hämolyse fehlen und ist oft erst nach Wegwischen der Kolonie erkennbar. - Kolonien von L. ivanovii weisen eine breite Zone von ß-Hämolyse auf und sind deshalb leicht mit ß-Streptokokken zu verwechseln. - L. innocua und L. welshimeri bilden keine Hämolyse. - Auf Oxford-Selektivagar (ANHANG: 6.1) wachsen Listerien in konkaven, dunkel-braunen Kolonien mit einem schwarzen Zentrum, evt. mit metallischem Glanz, umgeben von einem schwarzen Hof. - Auf Palcam-Agar (ANHANG: 6.2) wachsen Listerien als olivgrüne bis schwarze Kolonien, mit eingesunkenem Zentrum, umgeben von einem schwarzbraunen Hof.

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3.3.2 Mikroskop - Listerien stellen sich als grampositive, kurze Stäbchen dar, die in Palisaden, V- oder Y-Form vorliegen. 3.3.3 Biochenisch-kulturell Leitzerkmale (Screening): - Alle Listerien zeigen ein übereinstimmend positives Verhalten in der Katalase-Reaktion (ANHANG: 10), in der Äskulin-Hydrolyse (ANHANG: 8), in der Beweglichkeit (sog. Schirm-Phänomen nach 1-2tägiger Bebrütung des Beweglichkeitsagars (ANHANG: 7) bei 20-22 oC, nicht dagegen bei 37 oC).

Modifizierter CAMP-Test - Auf eine BIutagar - Platte im Abstand von 5 cm jeweils einen Staphylococcus (S. ) aureus - (z. B. ATCC 25923) und Rhodococcus (R.) equi - Stamm (z. B. NCTC 1621) strichförmig ausstreichen. - Senkrecht dazu einen L. monocytogenes-Kontrollstamm (z.B. ATCC 15313) sowie parallel dazu, jeweils im Abstand von 2-3cm, die zu überprüfenden Isolate aufbringen. - 18-22 Std., besser 2 Tage, bei 37 oC bebrüten. - Auswertung siehe Tabelle 1. 1-~

Kohlenhydrat-Spaltung: - "Purple"-Agarplatten (ANHANG: 9), die jeweils Rhamnose, Xylose und Methyl-a-D-Mannopyranosid enthalten, werden mit den zu prüfenden Isolaten punkt- bis strichförmig beimpft. - Bebrütung 1-2 Tage bei 37 oC. - Farbumschlag von lila nach gelb gilt als positiv. - Beurteilung des Reaktionsausfalles siehe Tabelle 1. Feste Nährböden eignen sich besser als flüssige Nährmedien zur Beurteilung der Kohlenhydratspaltung, dies gilt insbesondere für Xylose.

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Tabelle 1: Die wichtigsten kulturellen und biochemischen Merkmale zur Unterscheidung von Listerien-Spezies Spezies Spaltung von

CAMP-Test mit S.aureus L. monocytogenes L. ivanovii L. innocua L. seeligerl L. welshimeri L. grayi* L. murrayi*

+ + -

R.equi

D-Xylose

+ -

L-Rhanose

+ + + -

Methyl-a-Mannopyranosid + - + - v v + v(Nitrat:-) v(Nitrat:+)

+ v

v

v =variable Reaktionen * Gegenwärtig wird die Umbenennung von L. grayi bzw. L. murrayi in Murraya (M.) grayi subsp.grayi bzw. M. grayi subsp. murrayi und deren Zuordnung in die neue Gattung Murraya kontrovers diskutiert.

4.

WEITERE HINWEISE -

Die biochemische Differenzierung von Listerien kann auch mittels vorgefertigter miniaturisierter Systeme, z.B. API Listeria (bioMerieux Best.-Nr. 10300) erfolgen.

-

Die wichtigsten Kriterien zur Abgrenzung der Listerien von anderen grampositiven, nicht sporenbildenden Stäbchen sind Tabelle 2 zu entnehmen.

Tabelle 2: Die wichtigsten Kriterien zur Abgrenzung der Listerien von anderen grampositiven, nicht sporenbildenden Stäbchen Keime aus der Gattung Reaktion Katalase H2S - (TSI) Glukose Motility Äskulin Urease

Listerla + + + + -

Lactobacillus + v -

*) kein Wachstum bei 37 oC **) keine Fenmentation von Gukose

Erysipelothrlx + + -

Corynebacterium + v + v

Bronchnthrix* + + -

Kurthia** + + +

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- Eine exakte Serovar-Bestimmung (von Listerien sind derzeit 17 Serovare bekannt) ist nur durch ein Referenzlaboratorium möglich, z.B. Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV), Berlin; Institut für Medizinische Mikrobiologie der Medizinischen Hochschule Hannover; Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Halle. - Die im Handel erhältlichen Antiseren (i.d.R. Typ I und IV) erlauben nur eine beschränkte Erfassung von Serovaren. - Mit Ausnahme von Serovar 5 (L. ivanovii) sind die übrigen Serovaren nicht speziesspezifisch. - Die Lysovar-Bestimmung wird nur in wenigen Referenzlaboratorien durchgeführt, z.B. Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Halle; Bakteriologisches Institut der Süddeutschen Versuchs- und Forschungsanstalt für Milchwirtschaft, Freising-Weihenstephan (dort hauptsächlich für Listerien-Isolate aus Lebensmitteln).

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ANHANG

1.

Anreicherungsmedium Trypticase Soya Broth (z.B. BBL Art.-Nr.11768) Hefeextrakt (z.B. BBL Art.-Nr.11929) Aqua dest.

2.

-

in benötigten Mengen abfüllen (9 ml bzw. 45 ml).

-

Autoklavieren 15 Min. bei 121 oC

30 g 6g 1000 ml

Selektivsupplement I Acriflavin (z.B. Sigma Art.-Nr. A 8251)

15 mg

Nalidixinsäure (z.B. Sigma Art.-Nr. N 4382)

40 mg

Aqua dest.

10 ml

- sterilfiltrieren mit Millipore-Filter 0,22 µm.

3.

Selektivsupplemerrt II Cycloheximid (z.B. Sigma Art.-Nr. C 6255)

50 mg

Äthanol

4 ml

Aqua dest.

6 ml

- sterilfiltrieren mit Millipore-Filter 0,22 µm.

4.

Selektivsupplement III Acriflavin (z.B. Sigma Art.-Nr. A 8251)

25 mg

Nalidixinsäure (z.B. Sigma Art.-Nr. N 4382)

40 mg

Aqua dest.

10 ml

- sterilfiltrieren mit Millipore-Filter 0,22 µm.

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5.

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Blutagar - Agar-Basis (u.a. Difco Best.-Nr. 0045-02-5A. Merck Art.-Nr. 10886, Oxoid Art.-Nr. CM 55) versetzen mit Aqua dest.; Menge jeweils nach Angaben des Herstellers. Lösen, autoklavieren (15 Min. bei 121 oC) und abkühlen auf 50 oC. Zugabe von 5% defibriniertem Hammelblut. - Anschließend ausgiessen in Petrischalen.

6.

Feste Selektivnährböden 6.1 Oxford-Agar - Basis-Nährboden (z.B. Merck Art.-Nr. 7004, Oxoid Art.-Nr. CM 856) zubereiten nach Angaben des Herstellers. - Zugabe von Listeria-Selektiv-Supplement nach Oxford (z.B. Merck Art.-Nr. 7006, Oxoid Art.-Nr. SR 140) nach Angaben des jeweiligen Herstellers.

6.2 Palcm-Agar . Basis-Nährboden (z.B. Merck Art.-Nr. 11755, Oxoid Art.-Nr. CM 877) zubereiten nach Angaben des Herstellers. . Zugabe von Listeria-Selektiv-Supplement nach Palcam (z.B. Merck Art.-Nr. 12122, Oxoid Art.-Nr. SR 150) nach Angaben des jeweiligen Herstellers.

7.

Agar zur Beweglichkeitsprüfung (aNotility-Agarm) Caseinpepton (z.B. Merck Art.-Nr. 7213)

20

mg

Fleischpepton (z.B. Merck Art.-Nr. 7214)

6,1 mg

Agar (z.B. Merck Art.-Nr. 1614)

3,5 mg

Aqua dest.

1000

ml

- Nach lösen und sterilisieren im Dampftopf wird der Agar zu je 9 ml in Röhrchen abgefüllt. - Stichbeimpfung mittels Impfnadel in die Agarsäule, ca. 1-1,5 cm tief: - Bebrütung bei 20-22 oC 1-2 Tage. - Eine diffuse schirmförmige Trübung ("umbrella-Phänomen") gilt als positiv.

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8.

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Agar zum Nachweis der Äskulinhydrolyse Pepton (z.B. Oxoid Art.-Nr. L 34)

10 g

Äskulin (z.B. Merck Art.-Nr. 848)

2g

Ferri-Ammoniumcitricum (z.B. Merck Art.-Nr.3760)

1g

Agar A (z.B. Oxoid Art.-Nr. RM 10) Aqua dest.

15 g 1000 ml

(pH 7,2) - Nach lösen, sterilisieren im Dampftopf und abkühlen erfolgt das Ausgießen in Petrischalen. - Punkt- oder strichförmige Beimpfung der Agarplatte. - Bebrütung bei 37 oC für 18-22 Std. - Eine deutliche Schwarzfärbung des Agars um die Kolonie gilt als positiv.

9.

Feste Nährböden («Purple-Agar") zu Prüfung der Kohlenhydratspaltung Basisnährboden: Proteose-Pepton (z.B. Difco Best.-Nr. 3)

10 g

Fleischextrakt (z.B. Merck Art.-Nr. 3979)

1 g

NaC1 (z.B. Merck Art.-Nr. 6404)

5 g

Agar (z.B. Merck Art.-Nr. 1614)

15 ml

Bromkresolpurpur (z.B. Merck Art.-Nr.3025)

0,02 g

Aqua dest.

1000 ml

(pH 6,8 ± 0,2) - Lösen und sterilisieren im Dampftopf. - Kohlenhydrate D (+) - Xylose (z. B. Merck Art. - Nr. 8692), L(+) -Rhamnose (z. B. Merck Art. - Nr. 4736) und Methyl - a- D - Mannopyranosi d (z. B. Sigma Art.-Nr. 6882) jeweils in einer Endkonzentration von 0,5% dem Basisnährboden zugeben, anschließend in Petrischalen ausgießen. - Punkt- oder strichförmige Beimpfung der Agarplatte. - Bebrütung bei 37 oC für 1-2 Tage. - deutlicher Farbumschlag um den Impfstrich von lila nach gelb gilt als positiv.

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10.

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Katalase-Reaktion - Test-Reagenz im Handel (z.B. bioMärieux Best.-Nr. 55561, Merck Art.-Nr. 11351) erhältlich. - Material von der zu prüfenden Kolonie mit Platinöse oder Holzstäbchen entnehmen. - Aufbringen auf Objektträger. - Zugabe von 1 Tropfen Katalase-Reagenz. - Eine sich sofort entwickelnde Gasbildung gilt als positiv.

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LITERATUR BILE, J., M.P. DOYLE(1991): Listeria and Erysipelothrix. in: BALOWS, A.(ed.): Manual of Clinical Microbiology. 5th ed., S. 287-295, Amer. Soc. Microbiol. Washington, D.C. CARTER, G.R.(1990): Listeria and Erysipelothrix. in: CARTER, G.R., J.R. COLE (ed.): Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology. 5th ed., S. 253-261. Academic Press. Inc. San Diego-New York-Boston-London-Sydney-Tokyo-Toronto. FRIES, R., E. MÜLLER-HOHE (1990): Differenzierung von Listerien. Arch. Lebensmittelhyg. 41, 146-149. POTEL, J., F. BURKHARDT, R. MALOTTKE(1982): Isolierung und Identifizierung von Corynebacterium, Listeria und Erysipelothrix. Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 253, 43-60. ROCOURT, J.(1987): Identification of Listeria Isolates. Vetmed. Hefte 5, 134-145. SEELIGER, H.P.R.(1987): Classificationand Pathogenicity of Listeria. Vetmed. Hefte 5, 56-62. ZETTL, K., J. BRÖMEL(1986): Listeriose: Bildbericht, Pathogenese und Epidemiologie. Prakt. Tierarzt 86, 1033-1042.

SACHBEARBEITER Prof. Dr. Dr. habil. A. WEBER: Landesuntersuchungsamt für das Gesundheitswesen Nordbayern, Heimerichstr. 31, 90419 Nürnberg