PAPEL DE LOS RECEPTORES TIPO NMDA EN EL VESTIBULO DEL AJOLOTE

Tesis que para obtener el título de

Maestro en Ciencias Fisiológicas presenta

Carlos Eróstegui Revilla

Departamento de Ciencias Fisiológicas

Instituto de Ciencias Universidad Autónoma de Puebla 1992

Director de la tesis: Dr. Enrique Soto

INDICE

RESUMEN

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INTRODUCCION

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Farmacología de los AAE RECEPTORES TIPO NMDA

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Agonistas del receptor NMDA

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Antagonistas competitivos

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Receptores NMDA y Mg

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Antagonistas no competitivos

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Receptor NMDA y glicina

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Receptor NMDA y poliaminas

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SISTEMA VESTIBULAR

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

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MATERIAL Y METODOS

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Disección

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Registro

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Diseño Experimental

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RESULTADOS

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Efectos del NMDA

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Interacciones entre NMDA y Mg++

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Interacciones entre NMDA y glicina

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Efectos del APV

30

Efectos del 7ClKyn

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DISCUSION

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BIBLIOGRAFIA

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RESUMEN

Diversos trabajos apoyan la idea de que un aminoácido excitador (AAE) del tipo del glutamato es el neurotransmisor entre las células ciliadas y las fibras aferentes en el sistema acústico-lateral. Particularmente en el caso del sistema vestibular de anfibios, existen múltiples trabajos de tipo fisiológico y farmacológico que apoyan esta hipótesis. Sin embargo, hasta ahora no se ha logrado aún determinar con precisión el papel funcional de los diferentes receptores a los AAE en la transmisión aferente. Por estas razones, decidimos estudiar el efecto de algunos agonistas y antagonistas del N-MetilD-Aspartico (NMDA), sobre la actividad eléctrica de las aferentes primarias en el sistema vestibular del axolotl (Ambystoma tigrinum).

Los resultados que hemos obtenido indican que el NMDA ejerce un efecto excitadordependiente de la concentración sobre las aferentes vestibulares. La curva concentración efecto para el NMDA presenta una forma sigmoidea con una DE50 de 300 µM.

El estudio de las interacciones entre el NMDA y la glicina muestra que ésta, potencia los efectos del NMDA. El ácido 2-amino-5-fosfono valérico (APV) que es un antagonista competitivo del receptor NMDA, en concentraciones de 0.1 y 1 mM, bloquea la actividad basal de las aferentes vestibulares y el efecto excitador del NMDA. Antagonistas indirectos como el ácido 7 cloro kynurénico (7ClKyn) en concentraciones de 0.01 y 0.1 mM producen también un claro efecto inhibitorio sobre la actividad basal y aquella evocada por el NMDA sobre las aferentes vestibulares. El incremento de la concentración de Mg++ en el medio extracelular produce también una disminución de las respuestas evocadas por el NMDA.

Nuestros resultados sugieren que en el sistema vestibular del axolotl se encuentran receptores tipo NMDA, los cuales son modulados positivamente por glicina y negativamente por el Mg++ extracelular.

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INTRODUCCION

En los últimos treinta años, la investigación en el campo de la neurotransmisión ha tenido un desarrollo rápido con descubrimientos importantes que han permitido avanzar en la comprensión de la fisiología y bioquímica del Sistema Nervioso Central (SNC). Entre estos avances está el descubrimiento del papel neurotransmisor de algunos aminoácidos, a los que se los ha denominado aminoácidos excitadores (AAE) (Watkins y Evans, 1981; DiChiara y Gessa, 1981; Foster y Fagg, 1984).

Existen dos clases de aminoácidos que tienen un profundo efecto sobre el sistema nervioso, y que están presentes en altas concentraciones en el líquido extracelular: los aminoácidos inhibitorios GABA y glicina, y los AAE glutamato y aspartato (McLennan, 1981).

A partir del descubrimiento de los AAE, se han buscado derivados tanto naturales como sintéticos para poder estudiar las propiedades farmacológicas de los receptores, y entender así su papel funcional en diferentes tejidos excitables. Actualmente se sabe que los receptores a AAE están distribuidos en múltiples regiones del SNC, tanto de vertebrados como de invertebrados (Watkins y Evans, 1981; Mayer y Westbrook, 1987; Stone y Burton, 1987). Además en invertebrados se ha logrado demostrar fehacientemente que el glutamato es el neurotransmisor de la unión neuromuscular (Takeuchi y Takeuchi, 1964; Shinozaki, 1988).

La existencia de venenos específicos que pueden bloquear la neurotransmisión mediada por el glutamato y el hecho de que estos venenos se encuentren en múltiples especies, refuerzan la idea de que el ácido glutámico es un neurotransmisor ampliamente distribuído. Por ejemplo, se ha logrado aislar una toxina de bajo peso molecular de arañas tejedoras denominada argiotoxina que es un potente antagonista de alta especificidad para el receptor a ácido quiscuálico (Jackson y Usherwood, 1988). Esta toxina, bloquea la transmisión en la unión neuromuscular de la langosta, y en la sinapsis del ganglio estrellado del calamar. Estas toxinas se han usado para diferenciar

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entre los distintos tipos de receptores a AAE. Por ejemplo, la toxina de araña joro (JSTX), no inhibe el receptor acoplado a proteína G (Sugiyama y cols, 1987). Por otra parte, la filantotoxina tiene una mayor afinidad por los receptores ionotróticos a AAE. La amplia distribución de los receptores a AAE en la escala filogenética es una clara evidencia de su importante papel funcional. En la década de los cincuenta, se encontró que el SNC de los mamíferos contenía concentraciones de ácido aspártico y especialmente de ácido glutámico, mucho mayores que cualquier otro tejido, lo que hacía pensar que el papel del ácido glutámico en el tejido nervioso era importante en su metabolismo o como compensador del déficit aniónico. Esta idea estuvo presente hasta principios de los años 60, cuando demostró que el glutamato poseía una acción excitadora potente cuando se aplicaba a la mayoría de las neuronas centrales (Curtis y Watkins; 1960, Curtis y cols. 1963). Curtis y Eccles en 1958 encontraron, utilizando la técnica de microiontoforesis, que la aplicación de glutamato y aspartato a neuronas aisladas de médula espinal, producía despolarización (Curtis y Eccles 1958). Sin embargo, a pesar de la demostración del efecto del glutamato y aspartato sobre las células nerviosas, no se aceptó la idea de que fueran neurotransmisores, por el hecho de que mostraban un efecto excitador en prácticamente cualquier tejido excitable en que se aplicaran, y principalmente porque no satisfacían todos los criterios establecidos para considerar una substancia como neurotransmisor (McLennan, 1987).

Farmacología de los AAE

Los primeros estudios de los receptores a AAE se llevaron a cabo en base al descubrimiento del efecto convulsivante del glutamato, y a su capacidad de despolarizar y excitar neuronas centrales aisladas. Posteriormente estudiando la relación estructura-actividad de los ácidos glutámico, aspártico y otros compuestos similares, se encontraron nuevos derivados a los que el cambio de la posición de los grupos funcionales o la sustitución de estos por otros, les conferían mayor, igual o menor potencia que el glutamato para despolarizar neuronas de médula espinal (Curtis y Watkins; 1960). La actividad óptima del glutamato requería la presencia de dos

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grupos acídicos y un grupo básico (amino). Este último óptimamente situado en el carbono α para el grupo carboxilo, y el otro grupo acídico situado en el carbono _ separado por dos o tres átomos del primer grupo acídico (Curtis y Watkins, 1960; Watkins y Cols., 1990), (Fig. 1). También se reconocieron los determinantes estereoquímicos de la potencia; los isómeros L del glutamato eran por lo menos dos veces más potentes que los isómeros D (Curtis y Watkins, 1963; Hall, 1979. Citados en McLennan., 1987). Sin embargo, en los derivados N-alquil, como es el ácido NMDA, el isómero D es muchas veces más potente que las formas L.

Con la demostración en los años sesenta de que diferentes AAE mostraban grados de potencia variables en distintas regiones del SNC, y con el desarrollo de agonistas y antagonistas selectivos, se estableció definitivamente la existencia de receptores a AAE. A finales de los 70 el NMDA era el agonista más potente conocido. La excitación inducida por el NMDA era inhibida por el D-α-amino adipato (D α-AA), el ácido D-amino pimélico (DAP), el ácido 3-amino-l-hidroxi-pirrolidina (HA-966), y el Mg++, pero estos no tenían efecto sobre las respuestas inducidas por otros agonistas o por el glutamato en otras regiones del SNC (Watkins y Evans, 1981; Watkins y Olverman, 1987) (ver tabla I). Estas observaciones llevaron a pensar que había más de un receptor al glutamato, lo cual se confirmó con el descubrimiento de otros agonistas naturales como el ácido kaínico (AK) (derivado cíclico del glutamato), y el ácido quiscuálico (AQ). Posteriormente se encontró que las respuestas evocadas por el AK y el AQ eran insensibles a los antagonistas de NMDA, pero antagonizados por el dietil éster del ácido glutámico (GDEE), el cual no tenía ningún efecto sobre la depolarización inducida por NMDA. En base a esto los receptores a AAE se clasificaron como NMDA y no-NMDA (Watkins y Evans, 1981; Watkins, 1978; Watkins y Olverman, 1987; Watkins y cols, 1990). En la médula espinal de la rata el AK evocaba respuestas mayores y distintas que el AQ (Watkins y Olverman 1987), mientras que en los crustáceos el AQ es mucho más potente que el AK (Watkins y Cols, 1990), además de que este último y su análogo el ácido α- amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxasolpropiónico (AMPA), son antagonizados por

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Figura 1. Agonistas y antagonistas de los receptores a aminoácidos excitadores. Agonistas: NMDA, ácido N-metil-D-aspártico; AMPA ácido α-amino-3-hidroxi-5isoxasolpropiónico. Antagonistas: GDEE, dietilester del ácido glutámico; HA-966, 3amino-l-hidroxipirrolidina 2; DAP, ácido α-ε-diaminopimélico; DαAA, ácido aminoadípico; δDGG, δ-D-glutamil glicina;L- AP4, ácido fosfonobutírico.

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GDEE y no así el AK, en base a lo cual se estableció una diferenciación entre los receptores no NMDA: el receptor sensible a AK y el sensible a AQ (Foster y Fagg, 1984; Watkins y Cols, 1990).

Se encontró también en estudios de ligando, que el ácido 2-amino fosfono-butírico (AP4 o APB) se une con alta afinidad a algunos sitios de la membrana y desplaza al glutamato. Además se ha demostrado que la aplicación de AP4 induce una respuesta inhibitoria en vías hipocámpicas y espinales (Harris y cols., 1987; Shinozaki 1988; Mayer y Westbrook 1987; Pullan y Cols. 1987). A partir de estos estudios se propuso un cuarto tipo de receptor denominado APB (actualmente AP4) ( Foster y Fagg, 1984; Watkins, 1978; Watkins y Olverman, 1987; Watkins y Cols, 1990). Este receptor ha sido comúnmente localizado presinápticamente, y se postula que funcione como autorreceptor controlando la liberación de glutamato (Watkins y Cols., 1990). Sin embargo aún no se conocen agonistas ni antagonistas específicos para este receptor, aunque hay reportes de que la cistina podría ser un agonista selectivo (Homma, 1983; Pullan y Cols. 1987).

Estos hallazgos han sido reforzados por estudios de unión de ligandos radioactivos, en los que se ha demostrado que el AMPA y el AK marcados, son radioligandos específicos para los receptores AQ y AK respectivamente (Foster y Cols., 1987), mientras que el AQ es menos específico que el AMPA, ya que también presenta afinidad moderada por los sitios de unión del AK. Esta característica del AQ junto con el hecho de que el AMPA y el AQ son antagonizados por el GDEE, sugiere la existencia de un subtipo particular de receptor a AQ propio de los vertebrados, pues el AMPA no tiene efecto sobre la uniones neuromusculares de los insectos, (Watkins y Cols, 1990). Por estas razones actualmente se denomina al receptor AQ como receptor a AMPA, para diferenciarlo de un quinto tipo de receptor, el receptor metabotrópico (tabla I).

En 1987 Sugiyama y colaboradores reportaron que oocitos de rana inyectados con RNA mensajero extraído de cerebro de rata, expresan receptores a glutamato cuya activación

inducía

cambios

en

el

metabolismo

del

inositol

trifosfato

(IP3).

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Posteriormente se encontró que este tipo de receptores asociados al metabolismo de fosfolípidos muestran una afinidad especial por el AQ y el 1-trans-3-amino ciclopentano (ACPD) (Monahan y Cols., 1989). Este receptor es el denominado metabotrópico o ACPD, y es antagonizado por la toxina pertussis, y se piensa que podría estar involucrado en el desarrollo de la plasticidad.

Tabla 1. Clasificación de receptores a aminoácidos excitatorios _____________________________________________________________________ Tipo de receptor

Subtipo de receptor

Ionotrópicos

NMDA

No NMDA

Principales agonistas NMDA

Acido Kaínico AMPA

AP4 o APB

metabotrópico

Acido Kaínico

Ac. Quiscuálico Trans ACPD

____________________________________________________________________ Abreviaturas: NMDA, Ac. N-Metil-D-aspártico; AMPA, Ac. _-amino metil isoxasol propiónico; AP4. Ac. aminofosfonobutírico; ACPD, Ac. Trans-1-amíno ciclopentil-1, 3 dicarboxílico.

RECEPTORES TIPO NMDA

Los receptores tipo NMDA han sido los más estudiados por sus características muy particulares y su posible papel crítico en varios eventos neurofisiológicos, como son la potenciación a largo plazo, el aprendizaje y la memoria.

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Agonistas del receptor NMDA

Aunque inicialmente se pensó que el agonista endógeno más potente para el receptor NMDA debía ser un componente con la misma estructura enantiomérica, es decir, un isómero D como el ácido aspártico, más tarde en experimentos electrofisiológicos y de ligandos se demostró que agonistas que mostraban más actividad eran los isómeros L.

Así, el L-glu es más afín al receptor NMDA que el D-glu con una Ki de 0.9 y 49 µM respectivamente. Parece que el ácido aspártico no tiene una estereoespecificidad importante por el receptor y que las conformaciones L y D tienen una Ki prácticamente igual de 11 y 10 µM respectivamente. La metilación del D-Aspártico no modifica la afinidad por el receptor NMDA, la cual es de 11µM, sin embargo, la N-metilación del Laspártico decrementa la afinidad, así la Ki del NMLA es mucho menor, 160 µM (Aebischer y cols, 1989).

En estudios de ligando con antagonistas específicos tritiados como el ácido aminofosfovalérico (APV), se ha encontrado que los agonistas endógenos más afines al receptor NMDA son los isómeros L con grupos terminales ácidos, COOH, SO2H, o SO3H, siendo el más potente el L-glutamato (Watkins y Olverman, 1987; Watkins y Cols. 1987).

Antagonistas Competitivos

El ácido kynurénico es una sustancia de ocurrencia natural, y es uno de los antagonistas competitivos no selectivos con mayor potencia para antagonizar al receptor NMDA. También se han propuesto otros aminoácidos endógenos que desplazan al APV y AP7, y que podrían actuar como antagonistas sobre el receptor NMDA, entre los cuales están la L-cisteína, el L-glutamato sulfinato y la L-homocisteína sulfonato, (Do y cols, 1986; Watkins y cols. 1987; Pullan y cols. 1987; Stone y Burton, 1987; Dunlop y cols, 1989).

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Los antagonistas del receptor NMDA son aminoácidos de cadena más larga que el glutamato, son D-isómeros y tienen un radical terminal carboxi o fosfono, siendo los de mayor actividad los que poseen el radical fosfono, como el APV y el AP7 (Fig. 2). Otros compuestos que tienen actividad antagónica sobre el efecto del NMDA son los derivados de la piperazina. De estos los más potentes son el CPP, y el ácido 3-(E)-(2carboxipiperazina-4-il) -propenil-1-fosfónico, (CPP-ene), de los cuales los de mayor potencia son también los isómeros D (ver Tabla II).

Tabla 2. Clasificación de los agonistas y antagonistas del receptor NMDA ____________________________________________________________________ AGONISTAS Selectivos

NO selectivos

ANTAGONISTAS

NMDA

APV

HCSA

AP7

PDA

CPP

L-Glutamato

D-α- AA

Ac.Aspártico

D-α- AS

Ac.Homocisteico

DAP

Ac. Iboténico Ac. Quinolínico NO Competitivos

MK-801 Fenciclidina SKF 10047 Ketamina Mg++

Alostericos

Glicina

HA-966

D-serina

7-Cl-kynurenico

_____________________________________________________________________ ABREVIATURAS: HCSA, Ac. Homocisteico sulfínico; PDA, Ac. Piperidín Dicarboxílico; AP-7, Amino Fosfoheptanoico; CPP, Ac. 3-3(2-Carboxi piperazina-4-il) propil-1fosfónico; D-_-AA, Ac. Amino Adípico; D-_-AS, Ac. Amino Subérico; DAP, Ac. Amino Pimélico; HA-966, 3-amino-1-hidroxi-Pirrolidina.

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Después de examinar varios antagonistas competitivos a AAE, se reportó que los más potentes y selectivos para el receptor tipo NMDA eran en orden decreciente: el CPP, el APV y el AP7, con constantes de afinidad de 0.28 µM para el CPP, entre 0.6 y 5 µM para el APV y 1.7 µM para el AP7 (Watkins y cols., 1984; Olverman y cols., 1984; Fagg y cols, 1986; Davies y cols., 1986; Watkins y Olverman, 1987 ).

FORMULA ESTRUCTURAL DE ALGUNOS ANTAGONISTAS COMPETITIVOS DEL RECEPTOR NMDA

Figura 2. Estructura de algunos de los antagonistas más potentes y específicos del receptor tipo NMDA. Abreviaturas: D-Asp-AMP, ácido á- aspartilaminometil fosfónico. Para las otras abreviaciones ver el texto.

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Otros antagonistas competitivos son los ácidos 1-p-clorobenzoil (PCB), y 1-pbromobenzoil-piperazina-2-3 dicarboxílico (PBB-PzDA), los cuales tienen menor potencia que el ácido kynurénico para antagonizar la respuesta de receptores tipo NMDA y son de igual potencia que los receptores AK y AQ (Watkins y cols, 1987). Ninguno de estos antagonistas alcanza la potencia ni es tan selectivo como el CPP y el APV, por lo que este último se ha considerado como el antagonista específico de los receptores tipo NMDA.

Receptores NMDA y Mg++

En experimentos de fijación de voltaje en neuronas aisladas, se ha analizado la permeabilidad iónica de los receptores NMDA usando como agonistas el NMDA y el Laspartato. Las curvas corriente voltaje muestran que en presencia del agonista, el receptor NMDA se comporta de manera similar a los canales del receptor a acetilcolina de las uniones neuromusculares, produciendo corrientes de entrada (Na+) y de salida (K+). Maniobrando la composición iónica intra y extracelular, se encontró que el canal tenía un potencial de inversión cercano a 0 mV, y que éste cambiaba cuando se alteraba la concentracion extracelular de Ca++ (Mayer y Westbrook, 1987). Este hecho sugiere que el canal asociado al receptor NMDA no solo es permeable a los cationes en general, sino principalmente al Ca++, mientras que el canal asociado a los receptores no NMDA es bastante inespecífico. En adición a esto, se ha reportado que la activación del receptor NMDA incrementa la concentración intracelular de Ca++ libre (McDermott y Dale, 1987), y por otra parte, parece que las dihidropiridinas interactuan con la corriente de Ca++ evocada por NMDA, razon por la cual se piensa que ésta podría estar mediada por un canal catiónico con caracteristicas similares al canal voltaje dependiente tipo 'L' de Ca++ (Hashim y cols, 1989). Estos hechos sugieren que el rol del receptor NMDA es principalmente metabólico, más que de neurotransmisión, pues la entrada de Ca++ inducida por los agonistas del recptor NMDA, desencadena procesos fisiológicos como la potenciación a largo plazo, producción de ácido araquidónico, actividad rítmica etc., además que explica la toxicidad de los agonistas NMDA (Ascher y Johnson, 1989).

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Las corrientes y el incremento del Ca++ intracelular inducidos por los agonistas del receptor NMDA , pueden ser bloqueadas por el Mg++ dependiendo del potencial de membrana de la célula (Ascher y Nowak, 1987; Nowak y cols., 1984; Mayer y Westbrook, 1987; Foster y Fagg, 1987). En soluciones libres de Mg++, la sensibilidad del canal hacia el voltaje disminuye dramáticamente, deduciendose de esto, que el canal asociado al receptor no tiene dependencia intrínseca del voltaje, sino que la sensibilidad a éste depende de la presencia de Mg++ u otro catión divalente (Co++, Mn++, Ni++, etc.) (Mayer y Westbrook, 1987).

Mediante fijación de voltaje se ha encontrado que el Mg++ aumenta su afinidad por el canal cuando la membrana se hiperpolariza hasta alrededor de -90 mV, y disminuye cuando el potencial de membrana se hace menos negativo (Mayer y Westbrook, 1987). El Mg++ parece bloquear al canal de forma intermitente, pues con la técnica de patch clamp se ha visto que el canal presenta estados de apertura y cierre rápidos en presencia de Mg++ extracelular; sin embargo el canal permanece más tiempo abierto cuando el medio extracelular carece de Mg++, generando corrientes de larga duración.

En base a esto Mayer y Westbrook propusieron que la dependencia de voltaje del canal asociado al receptor NMDA podría ser debida a que el receptor tiene un sitio específico donde se une el Mg++, y que éste al entrar al canal quedaría dentro del campo eléctrico de la membrana, lo que conferiría al bloqueo la dependencia de voltaje. Por otra parte Ascher y Nowak en 1987 propusieron, para explicar este mismo fenómeno, que la dependencia podría deberse a que el Mg++ se deshidrata 1000 veces más lentamente que el Ca++. Ellos suponen que el canal tiene un orificio de entrada ancho, por donde penetrarían ambos cationes hidratados, sin embargo el Mg++ quedaría atrapado en un sitio estrecho del canal, al no poder deshidratarse.

Sin embargo estas hipótesis parecen ser muy simples, ya que también se encontró que el canal NMDA es sensible al Mg++ intracelular, dependiente también de voltaje pero de manera inversa a la del Mg++ extracelular, es decir que el canal es bloqueado cuando

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la célula se despolariza y se hace permeable con la hiperpolarización, además que la intermitencia de la apertura y cierre del canal registrados en patch clamp no aumenta con el incremento de la concentración de Mg++ extracelular (Ascher y Johnson., 1989). De esta manera, actualmente se buscan nuevos modelos e hipótesis que puedan explicar el bloqueo del canal por Mg++.

Antagonistas No Competitivos

A principios de los 80, se reportó que algunas sustancias con estructuras químicas muy diferentes a las de los AAE, generalmente de peso molecular alto, actuaban como antagonistas no competitivos específicos de los receptores tipo NMDA (Cotman e Iversen, 1987; Kemp y cols, 1987). Estos antagonistas no competitivos incluyen la clorpromazina, anestésicos disociativos como la fenciclidina (PCP) y la ketamina; un anticonvulsivante, el MK-801 que es el más potente de este tipo de antagonistas; derivados del benzomorfan, la N-alilnormetazocina (SKF10047) y la ciclazocina; derivados de la morfina, el dextrorfan, el dextrometorfan y otros (Fig. 3). Los estereoisómeros (+) de estos compuestos muestran mayor potencia que los (-). En experimentos con ketamina, fenciclidina y MK-801 (Lehmann y cols, 1987; Contreras y cols, 1987; Greenberg y Maks, 1988), se ha visto que su efecto es dependiente de voltaje (aunque de manera mucho menor que el Mg++), y de la activación del canal con un agonista.

Ni el glutamato ni los antagonistas competitivos desplazan (en estudios de ligandos), ni tampoco bloquean (en experimentos electrofisiológicos), el efecto de la PCP y sustancias similares. Estos hallazgos sugieren que los antagonistas no competitivos actúan de la misma forma que el Mg++, es decir se unen al interior del canal impidiendo el paso de los iones (Foster y Fagg, 1987; Kemp y cols, 1987), pero aparentemente en un sitio distinto al de Mg++, ya que no hay correlación entre el efecto de estos antagonistas y el de Mg++, (fig 4).

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FORMULA ESTRUCTURAL DE ALGUNOS ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR NMDA

Figura 3. Fórmula estructural de algunos antagonistas no competitivos del receptor NMDA. Abreviaturas: PCP, Fenciclidina; SKF 10047, n-alilnormetazocina; LY 154045 Benz (f) isoquinolina; MK 801, Dibenzocicloheptenaimina.

En estudios electrofisiológicos se ha visto que la activación del receptor NMDA está relacionada con los otros tipos de receptores a AAE (AK y AQ), pues en los potenciales postsinápticos excitatorios (PPSE) inducidos por AAE, la fase rápida de la descarga es mediada por receptores no NMDA y la fase lenta y de larga duración por receptores NMDA (MacDermott y Dale, 1987). En base a esto se ha propuesto un posible mecanismo en el cual la despolarización producida por los receptores AK y AQ, induciría a la apertura del canal mediado por el receptor NMDA, el cual sería modulado

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por el Mg++ y un agonista no competitivo para dar un potencial lento y de larga duración. Estas características del receptor NMDA apoyan la hipótesis de que este receptor participa en los fenómenos de aprendizaje y plasticidad del SNC mediante la potenciación de largo plazo (Collingridge y Bliss, 1987; Cotman, 1988).

Receptores NMDA y glicina

Otro aspecto del receptor NMDA es el de su modulación por la glicina, la cual contrariamente a su acción inhibidora clásica, potencia las respuestas evocadas por agonistas del receptor NMDA, (Ascher y Nowak, 1987; Kleckner y Dingledine, 1988).

En 1987 Johnson y Ascher descubrieron en experimentos de patch clamp en neuronas, que la corriente y el tiempo de apertura del canal, aumentaba con concentraciones submicromolares de glicina. Demostraron además, que este efecto de la glicina era insensible a la estricnina que es un antagonista de los receptores inhibitorios de glicina. A este descubrimiento siguieron otros trabajos que demostraron que la glicina prevenía la desensibilización del receptor (Mayer y Westbrook, 1987) y que la unión de los antagonistas (competitivos y no competitivos) al receptor NMDA, dependía de la presencia de glicina en el medio. Incluso en algunas preparaciones se encontró que la glicina era un requerimiento absoluto para inducir una respuesta con NMDA (Kleckner y Dingledine, 1988). Con base en estos hallazgos se postuló la existencia de un sitio alostérico en el receptor cuyo agonista era la glicina. Para demostrar esto se buscaron sustancias que antagonizaran la acción de la glicina, encontrándose un derivado del ácido kynurénico, el 7-Cl-kynurénico (Kemp y Cols., 1988), que inhibe la potenciación por glicina, y un antagonista del receptor NMDA el HA966, cuyo antagonismo es revertido solamente por la glicina (Drejer y Cols., 1989). Se ha reportado también que el CNQX y el DNQX afectan la unión de glicina a su sitio en el receptor, aunque el CNQX es 20 veces más afin al receptor AMPA (Honore y cols, 1987; Kessler y cols, 1989).

Por otra parte se encontró que en algunas regiones del SNC la presencia de glicina incrementa considerablemente la unión del glutamato y de los agonistas del receptor

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NMDA, y decrementa esta afinidad para los antagonistas, mientras que en presencia del antagonista del sitio de glicina, el HA-966, sucede lo contrario, es decir que se incrementa la afinidad por los antagonistas y disminuye por los agonistas (Brugger y Cols., 1988). Aunque se ha visto que la glicina puede cambiar el estado de preferencia del receptor por un antagonista a un estado de preferencia por un agonista, y que estimula la unión del glutamato marcado a los sitios con preferencia de antagonista, la diferencia regional de afinidad por uno y otro parece ser independiente. Por esto se postula la existencia de subtipos del receptor NMDA a los que la glicina modularía su afinidad hacia los agonistas o antagonistas (Monahan y Cols., 1988; Watkins y Olverman., 1989).

En base a estos hechos se concluyó que el receptor NMDA tiene un sitio específico insensible a estricnina, donde se une la glicina y actúa como agonista alostérico o coagonista, potenciando la respuesta producida por el NMDA, de manera semejante a como lo hacen los derivados de las benzodiazepinas en el receptor de GABA (Cotman e Iversen, 1987; Kleckner y Dingledine, 1988).

La acción de la glicina no depende del potencial de membrana, y aunque no está claro el mecanismo de acción, se propone que podría producir un cambio conformacional en el complejo receptor canal, esencial para la apertura de este último o para la unión del agonista. Por analogía, se piensa que como en el caso del receptor colinérgico, el de NMDA requiere la unión de dos moléculas del agonista para activarse, sin embargo uno de los sitios de unión para el agonista, podría haber cambiado su especificidad aceptando a la glicina en lugar de la segunda molécula de agonista (Kleckner y Dingledine, 1988).

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Esquema del Receptor NMDA

Figura 4. Modelo del complejo receptor-canal NMDA. Se esquematizan los posibles sitios a los que se unen los agonistas y antagonistas, y los sitios alostéricos para la glicina, el zinc, los agonistas no competitivos, el Mg++, y las poliaminas. Abreviaturas DET: dietilentriamina; DA10 1-10 diaminodecano; 7-ClKyn, ácido 7-Cloro Kynurénico; el resto igual a las figuras anteriores.

Receptor NMDA y poliaminas

Las poliaminas del tipo de la espermina, espermidina, polilisina y lisil-lisina; se unen al receptor de NMDA, produciendo una modulación positiva del mismo. Todas ellas son policationes: espermina (+3), espermidina (+4). Estas dos últimas se encuentran y producen en el SNC, particularmente durante el desarrollo. Sin embargo, su producción es intracelular lo que obliga a pensar en la posibilidad de que el sitio de unión también sea intracelular (Reynolds y Miller, 1989). La interacción de poliaminas con la unión de

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TCP al receptor de NMDA fue reportada por Ransom y Stec (1989). Parecería que la glicina, el NMDA y las poliaminas interactúan positivamente en el sitio de la glicina , y que para que actúen las poliaminas se requiere que estén activados los sitios para el NMDA y la glicina, (Canton y cols, 1989), y probablemente los tres para que el canal se pueda abrir.

En 1988 Foster y Fagg desarrollaron un modelo del receptor NMDA (fig 4) en el que se propone que éste tendría un sitio para los agonistas y antagonistas competitivos, otro donde se uniría la glicina y los antagonistas a ésta, un tercer sitio para el Mg++ situado dentro del canal cercano a la cara interna de la membrana y un cuarto sitio activo también dentro del canal pero más exterior, donde se unirían los antagonistas no competitivos (fig. 4). Este complejo tendría también un sitio donde se unen las poliaminas del tipo de la espermina y la espermidina (Ransom y Steck, 1989; Ransom y Deschenes, 1990). Y un sexto sitio de unión donde se une el Zn++, el cual es diferente al sitio activo del Mg++, ya que no está asociado al canal y no presenta dependencia del voltaje (Peters y cols, 1987). En la corteza de rata, la potencia para la unión en este sitio es la siguiente: Zn>La=Cd>Mn>Co>Ni=Mg (Greenberg y Marks, 1988; Westbrook y Mayer, 1987).

SISTEMA VESTIBULAR

Fisiológicamente el vestíbulo es un sistema de transducción que convierte la energía mecánica en señales eléctricas que llevan hasta el cerebro información sobre la posición de la cabeza en el espacio, y respecto al cuerpo. Esta labor es ejecutada por un sistema complejo de neuronas aferentes y eferentes, y células especializadas llamadas células ciliadas, las cuales son estimuladas cuando sus cilios (kinocilios y estereocilios) son desplazados. Las células ciliadas están situadas en la cúpula de los tres canales semicirculares formando hileras orientadas transversalmente respecto al eje del canal, con los kinocilios dirigidos hacia el lumen del canal, y en el sáculo y utrículo donde tienen una distribución más o menos circular, con los cilios dirigidos hacia la membrana otolítica.

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Las células ciliadas reciben inervación aferente y eferente, y en condiciones naturales liberan neurotransmisor(es) constantemente, de tal manera que producen una actividad tónica en las fibras aferentes. Aunque no se sabe con precisión el mecanismo de acción de esta liberación tónica de neurotransmisor, se cree que es debida a una entrada constante y en pequeña magnitud, principalmente de K+ y Ca++ a través de los canales de transducción situados en el extremo apical de las células ciliadas, el cual está en contacto con la endolinfa. Esta entrada de iones produciría una despolarización de las células y desencadenaría los eventos intracelulares necesarios, como es la liberación de Ca++ de los depósitos intracelulares, para inducir la liberación de neurotransmisor.

La descarga tónica de las fibras aferentes es incrementada por el desplazamiento de los estereocilios hacia el kinocilio (desplazamiento positivo), o inhibida si se alejan de éste (desplazamiento negativo). El mecanismo de la transducción no está claro todavía, sin embargo, hay evidencias que sugieren que los canales de transducción son activados mecánicamente por un elemento elástico cuando los estereocilios son desplazados positivamente (Howard y Cols., 1988). La apertura de estos canales permite la entrada de K+ y Ca++ (Huspeth, 1983; Valli y Cols., 1979), despolarizando de esta manera la célula e incrementando la liberación de neurotransmisor y, como consecuencia, aumentando la descarga de las fibras aferentes. La descarga tónica de las fibras aferentes, es también modulada por las fibras eferentes, y se ha encontrado que en la mayoría de los vertebrados, esta modulación es inhibitoria.

Aunque ya se ha establecido que el neurotransmisor eferente es la acetilcolina (Klinke, 1986; Norris y cols, 1988), la identidad del neurotransmisor de la sinapsis entre las células ciliadas y las fibras aferentes todavía no es clara. Hay evidencias que indican que el neurotransmisor podría ser el glutamato, ya que la aplicación de éste o agonistas similares (aspartato, quiscualato, etc.), incrementan la tasa de descarga de las fibras aferentes tanto en registros multiunitarios como intracelulares (Annoni y cols, 1984; Valli y cols., 1985; Soto y Vega, 1988). Sin embargo, se encontró que los potenciales excitatorios presinápticos disminuyen en frecuencia y amplitud en presencia de ácido D-

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_-amino-adípico (D-_-AA), un antagonista de los receptores glutamatérgicos (Valli y cols., 1985), y aumentan en frecuencia con la aplicación de AQ, AK, y NMDA (Prigioni y cols., 1990), lo que sugiere que el sitio de acción de este antagonista podría ser no solamente postsináptico, sino también sobre las células ciliadas. Por otra parte, hasta ahora tampoco se ha podido demostrar la presencia de las enzimas necesarias para la producción y degradación del glutamato en la sinapsis, por lo cual a pesar de las fuertes evidencias que apuntan al glutamato como el neurotransmisor de la sinapsis aferente, este no llena los criterios necesarios para ser aceptado como tal.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Si bien es cierto que aún no se acepta al glutamato como el neurotransmisor endógeno de la sinapsis aferente en el sistema vestibular, tambien está claro que los AEE son las únicas sustancias que evocan una respuesta en esta sinapsis. Por lo tanto es un hecho ya establecido que en la sinapsis aferente, ya sea en las células ciliadas o en las terminales dendríticas de las fibras aferentes, existen receptores a AEE.

En un estudio previo del efecto de los AAE sobre el vestíbulo del ajolote (Soto y Vega, 1988), se reportó que la aplicación de AK y AQ evocaba respuestas de considerable magnitud, pero no así la aplicación de NMDA, el cual indujo respuestas irregulares y de pequeña magnitud, y que parecían no ser afectadas significativamente por el el Mg++ extracelular. Por otra parte, en estudios de cromatografía líquida de alta presión de la perilinfa y endolinfa del sistema vestibular de cobayo, rata y caballo (Drescher y cols., 1983; Thalman y Cols, 1981), se ha encontrado que estos fluidos contienen, entre otros aminoácidos, glicina, glutamato y aspartato (Medina y Drescher, 1981), y se ha demostrado en coclea de cobayo, que éstos son liberados cuando se induce despolarización por K+ (Jenison y Cols. 1985). En base a lo anterior, cabe preguntarse si la presencia del receptor NMDA en la sinapsis vestibular es realmente significativa, y de ser así, qué significado tiene la presencia de la glicina y su liberación hacia la perilinfa y endolinfa ante un estímulo despolarizante, es decir, si la glicina actúa como modulador del receptor NMDA o si solamente tiene un papel metabólico. Podemos

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suponer que si la glicina modula la respuesta de los receptores NMDA en otras regiones del sistema nervioso, y si el receptor NMDA del vestíbulo tiene propiedades similares al reportado en la literatura, entonces es posible que la glicina module a este receptor en el vestíbulo, potenciando su respuesta.

Los objetivos de este trabajo son caracterizar adecuadamente las respuestas inducidas por el NMDA y sus agonistas y antagonistas en el vestíbulo; definir si la respuesta es modulada por glicina, y si esta modulación es afectada por los antagonistas del sitio de glicina. Finalmente determinar si existe o no, antagonismo del Mg++ para las respuestas evocadas por el NMDA.

MATERIAL Y METODOS

Los experimentos se realizaron en el órgano vestibular del Axolotl (Ambystoma tigrinum), sin diferenciación de sexo ni peso.

Disección

Para disecar la cápsula ótica, se decapitó al axolotl, y se procedió a eliminar la mandíbula inferior y la piel de toda la cabeza, descubriendo así la base del cráneo. Posteriormente bajo el microscopio, se quitó el tejido óseo que cubre a la cápsula ótica para disecar y liberar los canales semicirculares y los órganos otolíticos. Luego se disecaron en todo su trayecto, desde las ámpulas hasta el cerebro, los nervios provenientes de los canales semicirculares anterior y lateral, y se seccionaron lo más cercanamente posible al tallo cerebral. Se procedió a aislar la capsula ótica del resto del cráneo, obteniendo así una preparación del laberinto aislado. La preparación se colocó en una cámara de registro de aproximadamente 2 ml de volumen, y se perfundió con Ringer de anfibio con flujo constante de 1.2 ml/min, cuya composición fue: NaCl, 111 mM; KCl, 2.5 mM; CaCl2, 1.8 mM; MgCl2, 1 mM; HEPES, 5 mM; Glucosa, 10 mM, ajustado a pH de 7.4. En la mayor parte de los experimentos se perfundió con Ringer

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modificado en el cual se eliminó completamente el MgCl2 (Ringer sin Mg++), en tanto que en otra serie experimental, el MgCl2 se elevó a 1 o 3 mM (Ringer con alto Mg++).

Registro

El registro extracelular, se hizo mediante un electrodo de succión (fig. 5). Este electrodo está formado por un tubo de plástico, al cual se le coloca en la punta una pipeta de vidrio, con un extremo cónico pulido al cual se introducirá el nervio. El electrodo está conectado mediante una manguera a una jeringa con la que se ejerce presión negativa. En su interior el electrodo tiene un alambre de plata clorurada. Para llevar a cabo el registro la pipeta de vidrio y el electrodo se llenan con solución Ringer hasta que la punta del alambre de plata quede sumergido en éste. Una vez hecho esto se afrontan el electrodo y el nervio, y con la jeringa se ejerce presión negativa para succionar el extremo libre del nervio e introducirlo dentro del electrodo y formar así un sello de alta resistencia eléctrica. La presión negativa se mantiene a lo largo del experimento, asegurando así que se mantenga el nervio dentro del electrodo.

La señal proveniente del nervio se amplificó 1000 veces mediante un amplificador ACDC Grass P-16, y de este se derivó a un osciloscopio y a un sistema de grabación para su ulterior procesamiento. La actividad eléctrica de las aferentes se procesó mediante un programa de captura de datos con el que se construyen histogramas de frecuencia contra tiempo (Soto y Vega, 1987). El registro para cada prueba se hizo durante 10 minutos, aplicando la droga 2 minutos después de tener un registro basal estable, y se continuó el registro durante 8 minutos.

Posteriormente se lavó la preparación hasta asegurar que el efecto de la droga hubiese terminado, tomando como criterio que la frecuencia de descarga sea igual a la control. Las drogas utilizadas fueron: NMDA, 7-KClKyn (Cambridge Research Biochemicals); glicina (J.T. Baker); APV, AQ y D-serina (Sigma Chemicals Co.).

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Esquema del método de registro

Figura 5. Esquema del sistema de registro de la actividad eléctrica de las aferentes primarias del órgano vestibular. Para la descripción veáse el texto.

La aplicación del NMDA y el APV, y de una serie de experimentos con glicina, se hizo a través de un sistema de microperfusión, en el que mediante una microjeringa (Hamilton) conectada a una pipeta de vidrio se inyectaron 20 µl de la droga diluida en Ringer. La droga se aplicó aproximadamente a 0.5 mm, de distancia del origen visible de las fibras nerviosas en las ámpulas de los canales semicirculares anterior y lateral. La glicina, Dserina y el 7ClKyn, se perfundieron por sustitución del baño.

Diseño Experimental

Para poder responder a las preguntas planteadas, dividimos el trabajo experimental en cinco fases. En la primera fase se estudió el efecto del NMDA sobre la descarga basal de las fibras aferentes vestibulares. Para ello, se aplicó NMDA a concentraciones crecientes de 0.01, 0.1, 1, y 50 milimolar. La segunda fase consistió en estudiar el efecto de la glicina sobre la descarga espontanea, y sobre la curva dosis efecto del

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NMDA, para lo cual, en una serie de experimentos la glicina se perfundió en el baño a concentraciones de 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 y 100 µm. En otra serie, la glicina se microperfundió conjuntamente con el NMDA. En esta última serie los experimentos se llevaron a cabo en base al diseño del cuadrado latino (Cochran y Cox, 1981), en el cual se combinaron las concentraciones de NMDA y glicina de tal manera que el orden de las aplicaciónes de las drogas fué realizada completamente al azar. En la tercera fase se probó el efecto del antagonista competitivo, APV y del antagonista del sitio de glicina, el 7ClKyn, sobre la descarga inducida por el NMDA. En la cuarta fase se estudió la capacidad de la D-serina para revertir los efectos del 7ClKyn. En la última fase, se probó el efecto del Mg++ sobre las respuestas inducidas por el NMDA, perfundiendo para esto con Ringer conteniendo 1 y 3 mM MgCl2.

Para determinar la significancia estadística del efecto de cada una de las drogas en una misma preparación, se usó la prueba no paramétrica de U-Mann-Whitney (Soto y cols, 1989), comparando la actividad eléctrica de las aferentes antes de la aplicación de la droga durante un período establecido de 2 min como control, y en el pico de la respuesta después de aplicada la droga. Con los resultados obtenidos en diferentes experimentos y a diferentes concentraciones de las drogas, se construyeron curvas dosis-efecto, en las cuales las respuestas intereventos se normalizaron como el porcentaje de aumento con respecto al control. Para la comparación de los efectos de las diferentes concentraciones se usó la prueba de t de student.

RESULTADOS

Efectos del NMDA

Se usaron 85 ajolotes en los cuales se hizo registro extracelular multiunitario. En los experimentos que se realizaron para estudiar los efectos del NMDA, la preparación se perfundió con Ringer de anfibio libre de Mg++. Se probó la respuesta al NMDA en 68 ocasiones y se exploraron 5 concentraciones que van de 1 µM a 5 mM. Se encontró

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que el NMDA induce un efecto excitador dependiente de la concentración sobre la actividad

Figura 6. Gráficas de frecuencia contra tiempo que muestran el efecto típico del NMDA sobre la actividad eléctrica de las aferentes vestibulares. Los tres histogramas corresponden a registros de la misma preparación. Luego de un registro control (2 min), se aplicó NMDA (flecha) a las concentraciones indicadas en cada gráfica.

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eléctrica de las aferentes vestibulares. La respuesta a la aplicación del NMDA se presenta en los primeros 30 segundos después de inyectada la droga, y el efecto tiene una duración de aproximadamente 5 minutos, aunque ésta muestra una clara dependencia de la concentración a la que se aplica la droga (Fig. 6), registrándose en algunos casos respuestas con una duración de 20 minutos. Como se esperaba, la curva concentración efecto, presenta una forma sigmoidea con una dosis media efectiva (DE50) de aproximadamente 300 µM (Fig. 7). A concentraciones de 1 y 10 µM, prácticamente no hay incremento sobre la descarga basal, pero a concentraciones mayores el NMDA induce un efecto excitador significativo de la actividad basal. Cabe destacar que la relación concentración-efecto del NMDA muestra una pendiente muy grande para concentraciones entre 0.1 y 1 mM.

Interacciones entre NMDA y Mg++

Para ver el efecto del Mg++ sobre la descarga evocada por el NMDA, se realizaron 6 experimentos en los que hicieron 31 aplicaciones de NMDA (1-1000 µM) sobre la preparación perfundida con Ringer con 1 o 3 mM de Mg++. El aumento en el Mg++ extracelular produjo una disminución de las respuestas inducidas por el NMDA.

Este efecto también mostró ser dependiente de la concentración, ya que la perfusión con Ringer con 3 mM de Mg++, causa un desplazamiento significativo de la curva dosis-efecto del NMDA, mientras que con 1 mM, el Mg++ induce un decremento de la respuesta al NMDA, el cual no es significativo (Fig. 7).

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Curva dosis-efecto del NMDA a diferentes concentraciones de Mg+ en el perfusado

Figura 7. Curva concentración efecto del NMDA (N=69) sobre la actividad basal de las aferentes vestibulares. En Ringer libre de Mg++, el NMDA produce un efecto dosis dependiente con una DE50 de aproximadamente 0.3 mM. Cuando se añadió MgCl2 1 o 3 mM al Ringer con que se perfunde la preparación, las respuestas evocadas por el NMDA disminuyeron hasta en 10 y 50% respectivamante, indicando que al igual que en otras preparaciones, el Mg++ ejerce un efecto inhibidor sobre las respuestas evocadas por el NMDA. Los puntos representan la media de 5 a 6 determinaciones ñ la desviación estandar.

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Interacciones entre NMDA y glicina

En 31 experimentos se estudió el efecto de la microperfusión (20 µl) de glicina en concentraciones de 0.1, 1, 10, 100 µM, 1 y 10 mM sobre la descarga basal de las aferentes vestibulares. En ningún caso, la microperfusión de glicina fue capaz de evocar un incremento significativo de la actividad eléctrica multiunitaria basal de las aferentes vestibulares, a excepción de una aplicación de 10 mM de glicina que produjo un incremento visible de la actividad basal.

Para estudiar el efecto de la glicina sobre el NMDA, se realizaron dos tipos de experimentos, en unos la glicina y el NMDA se perfundieron al mismo tiempo diluidas en una misma solución (20 µl de cada una), n=20. En otro grupo de experimentos, la glicina se perfundió de manera continua en el baño, n=54. En ambos tipos de experimento se combinaron las concentraciones de ambas sustancias de tal manera que se hicieron entre 4-6 pruebas para cada combinación. El procedimento estadístico para estos experimentos fue el mismo que el empleado para la curva dosis-efecto del NMDA. Los resultados obtenidos muestran que los dos tipos de aplicacion producen esencialmente los mismos efectos. Con casi todas las concentraciones de NMDA con glicina en el perfusado o en la pipeta de inyección, hubo un incremento en relación a la descarga inducida por NMDA (fig 8). Es decir que tomando como control la respuesta de cada una de las concentraciones de NMDA, el efecto a esta misma concentración de NMDA pero con glicina en el medio, fue mayor, excepto en el caso de NMDA 10 mM con glicina 0.001 µM, en la que obtuvimos una inhibición del efecto del NMDA.

Además de modificar la amplitud de la respuesta excitadora inducida por el NMDA, la glicina parece modificar también la duración del efecto del NMDA, prolongando el tiempo de descarga de manera dosis dependiente. La glicina 1 µM produce en promedio una incremento de alrededor del 30% en la duración del efecto del NMDA 0.1 y 1 mM (tomando como tiempo de duración de la respuesta desde que el efecto es evidente hasta que la descarga basal retorna al valor control).

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Gráfica concentración-efecto de la glicina sobre la descarga evocada por NMDA

Figura 8. Gráfica concentración-efecto de NMDA en presencia de diferentes concentraciones de glicina. Cada una de las barras es la combinación de NMDA aplicado en microperfusión y en el perfusado. Cada barra representa la media y el error estandard de 4-6 pruebas. La gráfica esta normalizada respecto a la magnitud de la descarga producida por NMDA 0.01 mM y glicina 1 nM.

Como se ve, la decarga evocada por NMDA en presencia de glicina a las concentraciones indicadas, es mayor que NMDA solo, sin embargo estadisticamente esta diferencia no es significativa. El mayor incremento porcentual fue registrado cuando se aplicó NMDA 1 µM y glicina 0.01 µM pues la respuesta con glicina aumenta significativamente respecto a su valor control en más del doble, mientras que a dosis mayores de NMDA el efecto de la glicina es mínimo. La gráfica muestra que no hay una buena correlación entre la concentración de glicina y el aumento en la respuesta al NMDA. Esto probablemente es debido en parte a la gran variabilidad que se observa en

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los resultados. En términos generales nuestros resultados sugieren que la glicina ejerce un efecto modulador favorable solo para las concentraciones muy bajas de NMDA .

Efectos del APV

En 21 experimentos se estudió el efecto del APV sobre la actividad basal de las aferentes. El APV en concentraciones de 0.01 a 10 mM indujo una disminución reversible y dependiente de la concentración de la actividad basal (Fig. 9). La inhibición inducida por el APV sobre la descarga basal tiene una DI50 de aproximadamente 1 mM. La duración de su efecto inhibidor también depende de la concentración. Para las concentraciones usadas fluctúa entre 3 y 10 minutos.

El efecto inhibidor del APV sobre la descarga espontanea puede calificarse como de poca potencia cuando se le compara con la inhibición producida por el ácido kynurénico o la estreptomicina (Soto y cols, 1988; Soto y cols., 1990). Pensamos que esto podría deberse a que aunque el APV es considerado como antagonista específico de los receptores NMDA, el hecho de que la dosis requerida para obtener un inhibición significativa sea tan alta, 1 mM, sugiere que su acción es inespecífica, y podria estar actuando sobre los otros tipos de receptores. Esta acción inespecífica lleva a pensar que la descarga basal no es mediada por receptores NMDA, sino principalmente por receptores tipo AK y AQ.

Cuando se perfundieron conjuntamente el APV y el NMDA (N=16), se encontró que el APV bloquea la excitación inducida por el NMDA. Cabe destacar que el efecto antagonico del APV no se logró contrarrestar aún con concentraciones máximas efectivas de NMDA, lo que sugiere que el receptor NMDA del órgano vestibular, podría ser del subtipo que tiene preferencia por los antagonistas (Olverman y Watkins., 1989).

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EFECTO DEL APV Y 7ClKyn Y CURVA DOSIS-RESPUESTA

Figura 9. Gráficas de frecuencia contra tiempo y curva dosis efecto de APV y 7ClKyn. En A y B los efectos típicos de la aplicación de 20 µl de ambos antagonistas a concentración de 1 mM. El efecto se inicia lentamente y es de larga duración (5 min para el APV, 10 min para el 7ClKyn). En C, curvas concentración efecto.

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Efectos del 7ClKyn

Se estudió el efecto de la microperfusión de 7ClKyn 0.01 a 10 mM en 8 experimentos. El 7ClKyn produce una disminución reversible de la actividad basal de las aferentes vestibulares, dependiente de la concentración y con una DI50 de alrededor de 0.1 mM. El efecto inhibidor del 7ClKyn se inicia rápidamente y alcanza su máximo aproximadamente 1 minuto después de su aplicación, regresando posteriormente al nivel de descarga basal en aproximadamente de 10 minutos (Fig. 9).

El 7ClKyn bloquea de manera dosis dependiente la respuesta provocada por el NMDA 1 mM, y es aproximadamente 10 veces más potente que el APV. Probablemente el efecto inhibitorio del 7ClKyn se deba en parte a su efecto sobre el receptor AK, ya que a pesar de que se ha propuesto que es un antagonista específico del sitio de glicina en el receptor NMDA (Kemp y cols, 1988), en nuestra preparación el 7ClKyn 0.5 mM también bloquea completamente la respuesta inducida por el ácido kaínico 0.1mM (fig. 11), lo que concuerda con otros reportes (McNamara y cols., 1990).

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EFECTO DEL 7-CLORO-KYNURENICO SOBRE LA ACCION DEL ACIDO KAINICO

Figura 10. Gráfica frecuenca contra tiempo que muestra el efecto inhibidor de 7- cloro kynurénico 0.5 mM sobre las respuesta inducida por el ácido kaínico 0.1 mM. A los dos minutos de registro se aplicó el AK y 10 segundos despés el 7ClKyn. Vease como el 7ClKyn bloquea total e inmediatamente el efecto de AK. Al minuto siete la gráfica se interrumpe y reinicia cerca de 20 minutos después mostrando la reversibilidad de los efectos.

7-Clkyn y D-serina

Para investigar la especificidad del 7ClKyn sobre el sitio de glicina, aplicamos 7ClKyn 1 mM en presencia de glicina, y encontramos que esta última es incapaz de evitar o revertir el efecto inhibitorio del 7ClKyn aun perfundiendo a concentraciones equimolares. Una razon por la que la glicina no podría revertir el efecto del 7ClKyn, es que podría ser activamente capturada por los tejidos del oído interno, disminuyendo así

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su concentración efectiva. Por esta última razón es que decidimos sustituir en estos experimentos la glicina INTERACCION DE LA D-SERINA Y EL 7-CLORO-KYNURENICO

Figura 11. Efecto de la D-serina sobre la inhibición de la descarga basal, producida por el 7ClKyn. La primera gráfica muestra el efecto de la aplicación de NMDA (control). Posteriormente se perfundió 7ClKyn, y se repitió la aplicación de NMDA. Finalmente se perfundieron 7-KClKyn y D-serina. Véase que en ésta última la preparación responde a la aplicación de NMDA. 34

por la D-serina, la cual ha sido descrita como un agonista potente del sitio de glicina, y además no es un substrato adecuado para el sistema de transporte de alta afinidad. Con la perfusión de 10 µM de D-serina, el efecto inhibitorio del 7ClKyn, tanto sobre la actividad basal como la descarga evocada por el NMDA, fue revertido (Fig 11).

Esto sugiere que la D-serina tiene una mayor afinidad por el sitio de glicina del receptor NMDA, y probablemente también por los otros receptores a AAE, ya que la actividad basal de las aferentes primarias está mediada principalmente por receptores no NMDA. Sin embargo esto no descarta la posibilidad de que la incapacidad de la glicina en revertir el efecto del 7ClKyn, se deba a la baja afinidad de ésta por el receptor, y no a su captura. Más bien apunta al hecho de que la D-serina podria ser el neurotransmisor endógeno para el sitio de glicina.

DISCUSION

Nuestros resultados indican que el NMDA ejerce un efecto excitador sobre la actividad eléctrica de las aferentes provenientes de los canales semicirculares. Esto apoya la hipótesis de que el receptor NMDA también participa en la neurotransmisión en la sinapsis aferente del órgano vestibular. El efecto del NMDA es dependiente de la concentración y es bloqueado por el aumento en la concentración del Mg++ extracelular. Por otra parte la glicina no tiene efecto por si misma sobre la actividad basal de las aferentes. Sin embargo, cuando se aplica conjuntamente con el NMDA, potencia el efecto excitador de este último, aunque esta potenciación no muestra una buena correlación con respecto a la concentración de glicina utilizada. El APV y el 7ClKyn inducen una disminución de la actividad basal de las aferentes vestibulares, y también disminuyen el efecto excitador del NMDA. En conjunto, estos resultados apoyan la hipótesis de que en la sinapsis aferente vestibular existen receptores tipo NMDA, los cuales al igual que en el SNC son bloqueados por el Mg++ extracelular y modulados positivamente por glicina.

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El efecto excitador obtenido con NMDA difiere significativamente del que inducen el AK y el AQ. El NMDA es aproxiamdamente 1000 veces menos potente que el AK y AQ. El efecto del AK en las aferentes vestibulares se caracteriza por una rápida excitación seguida de un período inhibitorio. El efecto del AQ es un poco más lento, pero también de corta duración, no más de 5 minutos, en cambio, el NMDA induce una excitación que se inicia lentamente y permanece elevada por varios minutos volviendo al nivel basal muy lenamente. Indudablemente estas diferencias pueden deberse a la farmacocinética particular de cada droga, ya que para alcanzar la región sináptica estas sustancias deben difundir a través del epitelio de los canales. En el caso particular del AK se ha pensado que podría activar receptores extrasinápticos, lo cual explicaría la corta latencia en el inicio de su efecto. Sin embargo, también estas diferencias pueden deberse a propiedades en el tipo de corrientes iónicas que se activan al unirse el agonista al receptor. De hecho se ha encontrado mediante la técnica de clamp de voltaje que las corrientes iónicas debidas a la activación de receptores tipo NMDA son más lentas, pero de mayor intensidad y duración que aquellas inducidas por la activación de receptores no NMDA.(Johnson y Ascher, 1987).

Los resultados obtenidos cuando se perfunde con glicina añadida al Ringer, muestran que efectivamente la glicina potencia la respuesta de las aferentes al NMDA, aunque nuestros resultados son variables. Creemos que esta variabilidad se debe a que todos los tejidos son particularmente ricos en glicina, y el tejido lesionado durante la disección y el no lesionado liberan glicina al medio, por lo que cuando se aplica el NMDA la concentración de glicina sobrepasaría la requerida (del orden de nanomolar) por los receptores NMDA, así los sitios de glicina ya estarían ocupados, y esta ocupación diferiría de un experimento a otro probablemente en función de la masa de tejido de la preparación. Esta variabilidad también es observada en experimentos de células aisladas, ya que el efecto de la glicina es claramente observado solo si se lleva a cabo una perfusión rápida (Johnson y Ascher, 1987). Pensamos que ésta es la causa de la variabilidad que hemos observado, y de la falta de correlación entre la concentración de glicina que administramos y la potenciación de la respuesta al NMDA. Si suponemos que los receptores involucrados en la respuesta de las aferentes vestibulares al NMDA

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son similares a los que se han reportado en la literatura, y si como se postula, la glicina es un requerimiento absoluto del receptor NMDA (Kleckner y Dingledine, 1988), nosotros al aplicar NMDA sin glicina en el Ringer, no deberíamos obtener ninguna respuesta, sin embargo aplicando concentraciones de 0.1 y 1M, siempre registramos un aumento significativo en la frecuencia de descarga, lo cual implica que existen al menos trazas de este u otro aminoácido similar en la preparación.

También nuestros resultados muestran que a dosis mayores de NMDA, el efecto de la glicina sobre la respuesta es menor, y esto probablemente se deba a que estas concentraciones (1 y 10 mM) son dosis de saturación como se ve en la gráfica dosis efecto del NMDA. A estas concentraciónes, el incremento producido por la glicina sobre la descarga evocada por NMDA es muy difícil de observar, ya que probablemente la mayor parte de los receptores esten activos con la consiguiente despolarización de las fibras, lo que da un registro de frecuencia alto, y la glicina aunque esté presente a concentraciones altas, no afectaría mayormente a la frecuencia de disparo. Así a medida que se aumenta la concentración de glicina, el efecto de ésta también es menor por que la dosis de saturación de la glicina para el receptor NMDA es de 1 µM, concentración con la que obtuvimos las máximas respuestas.

Como se esperaba, la excitación inducida por el NMDA en las aferentes vestibulares está en relación inversa con la concentración extracelular de Mg++. Esto indica que los receptores que median la respuesta al NMDA comparten esta propiedad con los que se han descrito en otras áreas del SNC en vertebrados. Cabe mencionar sin embargo, que la modulación por Mg++ extracelular es mucho menor en comparación con los resultados de clamp de voltaje en células aisladas reportados por otros autores (Nowak y cols, 1984; Mayer y cols., 1984). El Mg++ en concentración 1 mM tiene muy poco efecto sobre las respuestas inducidas por el NMDA, y su acción inhibidora se hace patente solo cuando el medio contiene concentraciones de Mg++ de 3 mM o mayores.

Este resultado que en un principio nos hizo pensar que los receptores para NMDA en el vestíbulo no eran sensibles a la concentración extracelular de Mg++, parece

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reproducirse en otros sistemas. Un análisis más cuidadoso de la bibliografía nos ha mostrado que son pocos los sistemas en los que se han hecho curvas dosis efecto del NMDA en presencia de diferentes concentraciones de Mg++, y que como ya anotamos, casi todos los reportes de la literatura se refieren a células aisladas. Una posible explicación para las discrepancias que se observan en el efecto del Mg++ entre los experimentos de clamp de voltaje en células aisladas y los experimentos como los nuestros en sistemas y tejidos aislados, puede ser el hecho de que el efecto del Mg++ depende del potencial de membrana, y por tanto en preparaciones como la nuestra que están sometidas a una constante activación sináptica y consecuente generación de potenciales

excitatorios

postsinápticos,

el

efecto

del

Mg++

se

reduce

considerablemente. Por otra parte cuando se trabaja con sistemas aislados, particularmente en el registro multiunitario, las mediciones de los eventos son indirectas (por ejemplo nosotros medimos el número de espigas, las cuales son suma de varios potenciales de acción), y el número de variables que no se pueden controlar y que intervienen en las respuestas es mucho mayor. Así en el caso nuestro el Mg++ no solamente afecta al receptor NMDA, sino también a las células ciliadas, las fibras nerviosas y las terminaciones dendriticas.

Los efectos del NMDA no son de tipo inespecífico, debidos a cambios en el pH o algún otro factor, ya que la presencia de un segundo ácido como el APV bloquea completamente y de manera reversible el efecto del NMDA. El APV bloquea la respuesta inducida aún por dosis máximas efectivas de NMDA, lo que sugiere alta especificidad para este receptor, sin embargo aun aplicando dosis máximas de APV no se consigue bloquear totalmente la descarga espontanea. Esto sugiere que los receptores NMDA son responsables de solo parte de la descarga espontanea de las aferentes vestibulares y más bién podrían participar en la generación de la descarga evocada (Guth y cols. 1990). Sin embargo los experimentos en los que se ha estudiado el efecto del APV sobre la respuesta evocada por estimulación (Soto y cols., 1988), demuestran que el APV no bloquea la respuesta ante estímulos mecánicos, (inclinaciones). Esto indica que los receptores tipo NMDA no participan en la respuesta evocada del órgano vestibular, lo que apoya la idea de que estos receptores más bien

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participen en la generación de la descarga tónica espontánea, y probablemente también en procesos plásticos y tróficos sobre las aferentes vestibulares (McDonald y Johnston, 1990; Choi, 1990).

Por otra parte, la inhibición de la descarga basal producida por el 7ClKyn podría deberse a que efectivamente el 7ClKyn actúe sobre el sitio de glicina desplazando a esta última y de esta manera modularía negativamente al receptor NMDA, inhibiendo así, como dijimos anteriormente, parte de la descarga espontanea. Esta interpretación se basa en que tanto, el APV como el 7ClKyn, han sido propuestos como antagonistas específicos para el sitio NMDA y para el sitio de glicina respectivamente en este mismo receptor (Kemp y cols, 1988; Watkins y Olverman, 1987).

Sin embargo el 7ClKyn es capaz de bloquear completamente la actividad espontanea, de la cual la mayor parte no puede ser explicada por el bloqueo sobre el receptor NMDA, como lo demuestra el debil efecto del APV. Los resultados obtenidos con el 7ClKyn, que se hallan en contradicción con lo que se ha reportado en la literatura, pueden deberse a varios factores, sin embargo la posibilidad que nos parece más plausible es que realmente el 7ClKyn se comporte como un antagonista inespecífico de los receptores a los AAE, ya que se reporta que en experimentos de clamp de voltaje en ovocitos de Xenopus, el 7CLKyn es solamente 40 veces más específico por el sitio de glicina que por el receptor AK (McNamara y cols., 1990). De esta manera, la inhibición total de la descarga espontanea producida por el 7ClKyn, creemos que es debida a que el 7ClKyn actúe compitiendo con el neurotransmisor natural por el receptor AK, ya que nuestros propios resultados demuestran que en nuestras condiciones experimentales y a las concentraciones usadas, el 7ClKyn se comporta como un potente antagonista de las respuestas inducidas por el AK. De todo ello se desprende que debe tenerse cautela al interpretar el efecto de los antagonistas ya que su especificidad no siempre es tan alta como puede inferirse a partir de datos en otras preparaciones.

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Los experimentos en los que se perfundió D-serina confirman la presencia del sitio de glicina en los receptores NMDA. Por otro lado aunque el efecto del 7ClKyn es inespecífico, su acción sobre el sitio de glicina parece ser clara, ya que el efecto del NMDA es revertido en presencia de d-serina. El hecho de que sea la D-serina y no la glicina la que revierta el efecto del 7ClKyn, sugiere que el sitio de glicina en los receptores NMDA del vestíbulo son más afines a la D-serina, pues se considera que ambas tienen la misma potencia para revertir el efecto del 7ClKyn, (Brugger y cols. 1990), y por lo tanto posiblemente también la potenciación del efecto del NMDA sea mayor con D-serina que la que obtuvimos con glicina. Por otra parte el efecto de la Dserina en revertir el efecto del 7ClKyn sobre la actividad basal, indica que la d-serina también es inespecífica en términos de farmacocinética pero no en su acción farmacológica, pues es capaz de desplazar al 7ClKyn de los receptores no NMDA, pero no tiene efecto sobre estos.

Debido a que nuestros registros son multi-unitarios, no es posible definir si los receptores tipo NMDA, AQ y AK coexisten en una misma fibra aferente. A pesar de esto, es importante tratar de definir el papel funcional que cada tipo de receptor tiene en la codificación de la información vestibular. Por los efectos que inducen, creemos que los receptores tipo NMDA median respuestas lentas y de larga duración, en tanto los de AK y AQ, respuestas rápidas y de corta duración. Esta diferencia podría ser debida al rol fisiológico que cada uno de los subtipos de receptores a AAE desempeña en las sinapsis aferentes vestibulares. Así, para explicar la descarga espontánea de esta sinapsis se ha postulado, en base a algunas evidencias, que el neurotransmisor de esta sinapsis tiene también acción presináptica, es decir sobre las células ciliadas (Prigioni y cols., 1990), dando lugar a un sistema de autorreceptor, similar al descrito para neuronas de hipocampo (Martín y cols., 1991; Bliss y Lynch., 1986). En este sentido, los efectos de larga duración del NMDA en el vestíbulo, podrían ser parte de este sistema, pues el canal asociado es permeable a Ca++ y permanece largo tiempo abierto, de manera que el Ca++ entraría a las células ciliadas desencadenando los eventos intracelulares como es la liberación de calcio intracelular, (McDermott y Dale, 1987; Lynch y Voss., 1991), el cual produciría una liberación sostenida de neurotransmisor

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dando lugar así a la descarga tónica espontánea, y a su vez el neurotransmisor liberado actuaría otra vez sobre los receptores presinápticos conformando un sistema de retroalimentación positiva modulado por el Mg++, la glicina, el ácido kynurénico, las poliaminas etc.

Otra posibilidad para explicar esta diferencia, es la de que algunas fibras aferentes podrían tener principalmente receptores tipo AK o AQ dando una respuesta rápida, mientras que otras contendrían mayor número de receptores NMDA dando respuestas más prolongadas. Para dilucidar esta y otras interrogantes será necesario llevar a cabo experimentos que nos permitan contestar cuestiones más específicas y a mayor profundidad dentro la fisiología del oído interno.

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