Aus dem Fachbereich Klinische Medizin, Fachrichtung Innere Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes, Homburg/Saar Medizinische Klinik III des Westpfalzklinikums Kaiserslautern (Chefarzt: Prof. Dr. med. F.W. Albert)

Oxidativer Stress bei allogener Nierentransplantation

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin der Medizinischen Fakultät der UNIVERSITÄT DES SAARLANDES 2007

Vorgelegt von: Claudia Martin geb. am : 24.04.1967 in Pirmasens

Inhaltsverzeichnis

Seite

Zusammenfassung 1.

Einleitung

2.

Theoretische Grundlagen

3.

4.

5.

1

2.1

Freie Radikale – Entstehung und Folgen

3

2.2

Antioxidative Abwehr

8

2.3

Lipidperoxidation

12

2.4

Oxidativer Stress und Krankheiten

16

2.5

Hämodialyse und oxidativer Stress

18

2.6

Nierentransplantation

19

2.7

Grundlagen der Immunsuppression

20

Material und Methodik 3.1

Malondialdehydbestimmung

23

3.2

Comet-Assay zur Messung von DNA-Schäden

25

3.3

Qualitätskontrolle/Variabilitätskontrolle

30

3.4

Statistische Auswertung

30

3.5

Patienten- und Probandengruppen

31

3.6

Stammdaten der untersuchten Gruppen

32

Ergebnisse 4.1

Auswertung Comet-Assay Individualverläufe

44

4.2

Auswertung Comet-Assay alle erzielten Werte

47

4.3

Auswertung MDA

57

Diskussion 5.1

Diskussion der MDA-Werte

58

5.2

Diskussion der Comet-Ergebnisse

61

5.3

Fazit und Ausblick

67

6.

Literaturverzeichnis

7.

Anhang

69

7.1

Geräte

86

7.2

Verbrauchsmaterialien

87

7.3

Materialien, Lösungen

87

7.4

Statistische Auswertung

89

8.

Danksagung

9.

Lebenslauf

Zusammenfassung: Die Nierentransplantation ist das beste, weil nahezu physiologische Nierenersatzverfahren bei terminaler Niereninsuffizienz. Meistens handelt es sich um eine allogene Transplantation, bei der das Transplantat von einem genetisch nicht identischen Individuum stammt. Im Rahmen der allogenen Nierentransplantation sind eine Reihe von Entstehungsmechanismen für oxidativen Stress denkbar, z.B. die kalte und warme Ischämiezeit, IschämieReperfusion, die Konservierung des Transplantats und die Immunsuppression. Molekularer Sauerstoff oder Sauerstoffderivate, sogenannte reaktive Sauerstoffspezies (ROS), können unter bestimmten Bedingungen oxidativen Stress hervorrufen und eine schädigende Wirkung an Lipiden, Proteinen und DNA entfalten. Oxidativem Stress wird eine Reihe von schweren Erkrankungen zugeschrieben, u. a. das vermehrte Auftreten von Carcinomen nach einer Nierentransplantation. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, ob und wann im zeitlichen Verlauf einer Nierentransplantation erhöhter oxidativer Stress nachgewiesen werden kann. Als Parameter werden der Comet-Assay zur Detektion von DNASchädigungen und die Messung von Malondialdehyd (MDA) zur Beurteilung der Lipidperoxidation erhoben. Die beiden Parameter werden zu definierten Zeitpunkten vor und bis zu einem Jahr nach der Transplantation, zum Teil als Einzelwertbestimmungen verschiedener Patienten, zum Teil als Follow-up-Messungen des selben Patienten erhoben und mit gesunden Probanden verglichen. Im Comet-Assay haben alle Patienten zu jedem Zeitpunkt der Messung signifikant höhere Werte als gesunde Probanden. Zusätzlich bestehen bei den Patienten im Kurzzeitverlauf signifikant höhere Schädigungsparameter als vor der Transplantation. Im Langzeitverlauf - ein Jahr nach der Transplantation - sind die Grundschäden bei den Patienten signifikant geringer als zu allen Zeitpunkten vorher, ohne jedoch das Niveau gesunder Probanden zu erreichen.

Bei der Lipidperoxidation zeigen lediglich einzelne Probanden signifikant niedrigere Werte als die Patienten.

Summary: In case of end-stage renal disease the renal transplantation is the best treatment due to be a nearly physiological renal replacement. In most cases it is a matter of allogene transplantation with a graft of genetically different individuals. Molecular oxygen and its derivates, the so called reactive oxygen species (ROS), under certain conditions may cause a state of oxidative stress, which might have harmful effects on lipids, proteins and DNA. Oxidative stress is observed to be the root cause for several severe diseases, e.g. the increased incidence of cancer after renal transplantation. Especially during renal transplantation there are several causes of oxidative stress possible. The aim of the study was to investigate if and in which stage after a renal transplantation an increased oxidative stress will be detectable. The alkaline Comet assay was used as parameter to detect possible DNA strand breakages. In addition, to analyse lipid peroxidation, malondialdehyde (MDA) was measured. Both parameters where assessed before and at defined periods until one year after renal transplantation, partly as single measurements of different patients, partly as follow-up measurements of the same patient and compared to healthy probands. Using the Comet assay patients at each period of measurement obtained higher values of DNA strand breakes as healthy probands. Additional patients in short term course (2-5 days) after renal transplantation showed significantly higher values of DNA damages than before transplantation. The follow up measurements of patients one year after renal transplantation detected significantly lower basic damages of DNA compared to each previous assessment, but without reaching the levels of healthy probands.

The evaluation of lipid peroxidation revealed only single groups of probands with significantly lower values of MDA compared to patients. Further clearly time course dependent modulations concerning lipid peroxidation could not be detected.

1. Einleitung Oxidativer Stress ist ein Zustand, bei dem die Zellen exzessiv hohen Konzentrationen von molekularem Sauerstoff (O2) oder chemischen Derivaten von Sauerstoff, sogenannten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ausgesetzt sind. Bei der Derivatisierung fungiert das Sauerstoffmolekül als Elektronenakzeptor. ROS sind Hydroxy-, Alkoxy- und Superoxidanionradikale, Wasserstoffsuperoxid, Singulettsauerstoff und Ozon. Diese Sauerstoffradikale haben zum Teil nützliche Effekte, z.B. bei der Abwehr pathogener Organismen, als Neurotransmitter und Muskelrelaxantien (KELLY et al 1998). Der Bildung von ROS werden antioxidative Schutzsysteme entgegengesetzt, welche die Zellen vor schädigenden Wirkungen der teilweise hochreaktiven Moleküle schützen sollen. Der primäre antioxidative Schutz wird gebildet von enzymatischen (Katalase, Superoxiddismutase, Glutathionperoxidase, Glutathionreduktase) und nichtenzymatischen (Vitamin C, Vitamin E, Coenzym Q, Harnsäure, Glutathion) Komponenten, die als Radikalfänger fungieren und die ROS in weniger reaktive Moleküle umwandeln (HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999). In der oxidativen Stressituation kommt es durch ein Ungleichgewicht zwischen prooxidativen und antioxidativen Systemen zu schädigenden Wirkungen der ROS an Lipiden, Proteinen und DNA, die zu Funktionsänderungen der Zielzelle führen können. Bis zu einem gewissen Maß können auch sekundäre antioxidative Schutzsysteme (GSH-Synthese, NADPHSynthese, Abbau toxischer Sekundärprodukte, DNA- Reparatur) Schädigungen abfangen. Bei starken prooxidativen Prozessen kommt es jedoch zu Dauerschäden, die sich als Modifikationen an Lipiden und Proteinen oder als DNASchäden mit der Folge der Mutationsinduktion und Tumorentstehung (KELLY et al 1998, KLAUNIG et al 1998) äußern. Weitere Folgen sollen vorzeitiges biologische Altern, Immunsystemveränderungen sowie Veränderungen an Enzymen, Rezeptoren und Transport1

proteinen sein (VANHOLDER et al 1993, PEUCHANT et al 1994, BECKMAN and AMES 1998). Krankheiten, die mit oxidativem Stress in Verbindung gebracht werden, sind u. a. Arteriosklerose, Hypertonus, Diabetes mellitus, IschämieReperfusion, chronisch-entzündliche Erkrankungen und eine Reihe neurologischer Erkrankungen (Schlaganfall, M. Parkinson, Amyotrophe Lateralsklerose, Multiple Sklerose). (WESTHUYZEN et al 1995, HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999). Bei zunehmender Niereninsuffizienz reicht die renale Funktion schließlich nicht mehr aus, um harnpflichtige Substanzen (Kreatinin, Harnstoff u.a.) in ausreichendem Umfang zu eliminieren. Es treten schwerwiegende, z. T. unmittelbar lebensbedrohliche Störungen im Wasser-, Elektrolyt- und Säure-Basen-Haushalt auf. Wenn diese Störungen medikamentös nicht mehr zu kompensieren sind, kommen als Nierenersatztherapien die Dialyse oder die Nierentransplantation in Betracht. Sowohl bei den Patienten mit fortgeschrittener Niereninsuffizienz als auch unter den Bedingungen der Nierenersatzverfahren wird über deutlich erhöhten oxidativen Stress berichtet (TRACHTMAN et al 1992, WESTHUYZEN et al 1995, MONTON et al 1999, BIERNACKI et al 2002). Speziell bei der Nierentransplantation sind eine Reihe von Entstehungsmechanismen für oxidativen Stress denkbar, wie höheres Spenderalter, Organkonservierung, längere kalte oder warme Ischämiezeiten, Ischämiereperfusion, immunologische Prozesse und die Medikation zur Immunsuppression.

Fragestellung: Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, ob und wann im zeitlichen Verlauf einer Nierentransplantation erhöhter oxidativer Stress nachgewiesen werden kann.

2

2. Theoretische Grundlagen

2.1 Freie Radikale – Entstehung und Folgen Zahlreiche Basismechanismen des Zellstoffwechsels führen zur Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). In der mitochondrialen Atmungskette enstehen durch vier Einelektronenreduktionen Intermediärprodukte, die als Prooxidantien fungieren. Eine weitere Quelle von ROS sind oxidierende Enzyme (Cytochrom P 450, NADPH-Oxidase und andere Oxidasen, NO-Synthetase) und der Arachidonsäuremetabolismus (WARDLE 2005). Reduktion von O2 zu H2O (nach HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999, KELLY et al 1998): 1. O2

+

e-

→

y

O 2-

(Superoxidanionradikal)

+

+2H

2.

y

O 2-

+

e-

→

H2O2

(Hydrogenperoxid)

+

H

3. H2O2

+

e-

→

H + H2O

(Hydroxylradikal)

+

H

4. HOy

+

e-

→

H2O

Das Hydroxylradikal OHy ist hochreaktiv (SIES 1991, KELLY et al 1998). Es reagiert mit Lipiden, DNA und Proteinen. Die Reaktion mit DNA- Basen führt dabei zur Hydroxylierung, Ringöffnung und Fragmentation (KELLY et al 1998, COLLINS 1999) als eine mögliche toxische Konsequenz des oxidativen Stress (DNA-Doppelstrangbrüche).

3

Hydroxylradikal entsteht z.B. durch die eisenkatalysierte Fentonreaktion: Fe2+ + H2O2

Intermediärkomplexe

Fe(III) + OHy + OH-

Die UV-lichtinduzierte Spaltung von H2O2 in sonnenlichtexponierter Haut führt ebenfalls zur Bildung von OHy: UV

H–O–O–H

→

2OHy

(HALLIWELL and GUTTERIDGE, 1999) Weitere Quellen der Hydroxylradikalgenerierung sind Ozon, Ethanolmetabolismus, Peroxynitritzersetzung, ionisierende Strahlung, Hypochlorsäure (Reaktion mit Superoxidanionradikal), Ultraschall, Lithotripsie, Gefriertrocknung (nach HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999). Die Hauptreaktionstypen des Hydroxylradikals sind Wasserstoffabstraktion, Addition und Elektronentransfer. So ist OH durch Wasserstoffabstraktion z.B. an der Initiierung der Lipidperoxidation beteiligt. Das Superoxidradikalanion O2yreagiert mit anderen Radikalen (NOy, Eisen-Schwefel-Komplexen in Enzymen und Phenoxylradikalen). Es entsteht im Organismus durch Enzyme, die O2 zu O2- reduzieren (Peroxidasen, Xanthinoxidase, Tryptophandioxygenase, Aldehydoxidase, Cytochrom P450-Enzyme) (HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999, WEI 1998). Peroxyl- (ROOy) und Alkoxyl- (ROy) Radikale spielen durch die Wasserstoffabstraktion eine wichtige Rolle bei der Lipidperoxidation.

4

Peroxinitrit (ONOO-) NO + H2O2 → ONOO- (Peroxynitrit) Peroxynitrit ist hochreaktiv und reagiert mit Lipiden in Form von Peroxidation zu Malondialdehyd. Weiterhin reagiert Peroxynitrit mit Nukleinsäuren und initiiert DNAStrangbrüche, es inhibiert die mitochondriale Atmungskette und ist beteiligt an verschiedenen Formen von Reperfusionsschäden (SZABO 1996, MITAKA et al 2003).

Stickstoffmonoxid NOy ist ein farbloses Gas, das im Organismus mit Hilfe von NO-Synthetasen (NOSs) durch Verstoffwechselung von L-Arginin bereitgestellt wird. Drei Typen der NO-Synthetase unterliegen einem genau abgestimmten Regulationsmechanismus: die neuronale NOS (nNOS), die endotheliale (eNOS) und die induzierbare NOS (iNOS). NO wird z.B. in der vaskulären Endothelzelle synthetisiert, bindet an die Guanylatcyclase der glattmuskulären Zelle, die dadurch aktiviert wird und cGMP generiert, was den intrazellulären Ca2+ - Spiegel senkt, den Muskel relaxiert mit der Folge der Gefäßdilatation und Blutdrucksenkung. Weitere Funktionen sind die Beiteiligung an neuronalen Übertragungsmechanismen, Inhibition der Thrombocytenaggregation, Immunabwehr, Kontrolle des pulmonalen Gefäßtonus (GROENEVELD et al 1996, HARRISON 1997, HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999). Infolge der Reaktion mit Sauerstoff- und Hydroxylradikalen ausgelösten Peroxynitritbildung kommt es zu Endothelschäden (BECKMAN et al 1990; SZABO 1996).

5

Hydrogenperoxid H2O2 wird im Organismus gebildet durch mehrere Enzyme z.B. Xanthin-, Harnsäure- und D-Aminosäureoxidasen. Es ist nur schwach reaktiv und kann unmittelbar keine DNA oder Lipide oxidieren. Es kann als Coagens dennoch cytotoxisch und bakterizid wirken. So produzieren z.B. Mycoplasma pneumoniae und HIV-1virusinfizierte Zellen H2O2, welches Epithelzellen schädigt. Die wesentliche schädigende Potenz entsteht durch metallionenkatalysierte Reaktionen (Fentonreaktion), bei denen das hochreaktive OHy gebildet wird (nach SIES et al 1991, KELLY et al 1998, HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999, SUN et al 2004).

Singulettsauerstoff 1O2 Entsteht durch photosensible Reaktionen und ist in dieser Form stärker oxidierend als im Grundzustand. Es reagiert im Rahmen photodynamischer Reaktionen und schädigt z.B. Mitochondrien und Lipide. Die kutanen Porphyrien werden dadurch mitverursacht (HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999).

6

Beispiele für die Entstehung verschiedener ROS, Abwehrmechanismen und Schädigungen (s. Abbildung 2.1):

Abbildung 2.1: Grün: Entgiftung Rot: direkte Folgen von ROS-Reaktionen (modifiziert nach KELLY et al 1998, SIES, 1985) CAT: Katalase, GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: oxidiertes Glutation, GPx: Glutathionperoxidase, GSR: Glutathionreduktase, SOD: Superoxiddismutase, CYP: Cytochrom P450 abhängige Monooxygenasen

7

2.2 Antioxidative Abwehr Die antioxidativen Schutzmechanismen umfassen: a) Enzyme, die durch Katalyse ROS und andere reaktive Spezies entfernen Superoxiddismutasen (SOD), die O2- zu H2O2 und O2 abbauen SOD

2 O2- + 2H+ → H2O2 + O2 Katalasen (CAT), die H2O2 zu Wasser und O2 umsetzen 2 H2O2

CAT

→ 2 H2O + O2

Peroxidasen und Transferasen, z.B. die Glutathionperoxidase (GPX) oder die Glutation-S-Transferase, die Peroxide und H2O2 unter Verbrauch von Glutathion (GSH) reduzieren (KELLY et al 1998) 2 GSH + ROOH 2 GSH + H2O2

Transferase

→ GSSG + ROH + H2O

GPX

→ GSSG + 2 H2O

Das oxidierte Glutathion (GSSG) wird von der Glutathionreduktase (GSR) mit NADPH als Kofaktor wieder zu GSH reduziert. b) Proteine, die die Verfügbarkeit von Prooxidantien (Eisen, Kupfer, Haem) minimieren Transferrin bindet Eisen im Blutplasma, das dann nicht mehr redoxaktiv ist Haptoglobin bindet freigewordenes Hämoglobin durch Komplexbildung Coeruloplasmin bindet Kupferionen als Transport- und Speicherprotein Hämoxigenase katalysiert den Abbau des prooxidativen Haem zu Biliverdin unter Freisetzung von Eisen und Kohlenmonoxid

8

c) Proteine, die Biomoleküle gegen oxidative Schädigungen schützen, wie die Hitzeschockproteine. d) niedermolekulare Substanzen, die ROS abfangen Glutathion (GSH) reduziert ROS durch GSSG-Bildung (Abbildung 2.2):

Abbildung 2.2: Struktur von reduzierten Glutathion (GSH) und oxidiertem Glutathion (GSSG), nach HALLIWELL and GUTTERIDGE, 1999.

9

Vitamin E (Tocopherol, Tocotrienol) schützt als lipophiles Molekül vor allem Membranlipide und LDL vor der Oxidation (EISENBRAND et al 1995). Das Hauptisomer beim Menschen ist das Alpha-Tocopherol, das die größte antioxidative Aktivität besitzt (KELLY et al 1998). Es ist ein Inhibitor der Lipidperoxidation. Bilirubin das Endprodukt des Hämabbaus, das in vitro Peroxylradikale und Singulettsauerstoff abfangen kann. Die Funktion in vivo ist noch unklar. Harnsäure (s. Abbildung 2.3) wird beim Purinabbau durch die Xanthinoxidase aus Hypoxanthin oder Xanthin gebildet. Harnsäure bildet nach Oxidation durch ROS ein stabilisiertes Uratradikalanion, das nicht mehr zu einer Wasserstoffabstraktion fähig ist. Ein weiteres Abbauprodukt der Harnsäure ist das Allantoat, aus dem Harnstoff und Oxalsäure entstehen (STRYER 1996).

Abbildung 2.3: Harnsäure und Radikalabbauprodukte (nach BECKER 1993).

10

Ascorbinsäure (Vitamin C) kann direkt oder als Kofaktor in Enzymen ROS abfangen. Als wasserlösliches Antioxidans reagiert es mit yO2-, 1O2, Hypochlorsäure und Thiolradikalen. Durch Abgabe eines Elektrons entsteht Semidehydroascorbinsäure (resonanzstabilisiertes Radikalanion), durch Abgabe von zwei Elektronen Dehydroascorbinsäure (s. Abbildung 2.4). Weiterhin reduziert es das Vitamin-E-Derivat AlphaTocopherol. Durch diesen Mechanismus regeneriert Vitamin C in der wässrigen Phase das membrangebundene Alpha-Tocopherol und erhöht dadurch die Verfügbarkeit des wichtigsten Antioxidans der Lipidphase (KELLY et al 1998)

Abbildung 2.4: Struktur von Ascorbat, Resonanzstabilisierung von Semidehydroascorbat und Oxidation zu Dehydroascorbat (nach HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999)

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2.3 Lipidperoxidation Unter Lipidperoxidation versteht man den oxidativen Angriff auf Fettsäuren. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs = polyunsaturated fatty acids) enthalten zwei oder mehr Kohlenstoff-Doppelbindungen und werden umso empfänglicher für die Peroxidation, je höher die ungesättigten Anteile der Lipidkette sind (KELLY et al 1998). Die Oxidation mehrfach ungesättigter Fettsäuren der LDL-Fraktion wird gefolgt von der Fragmentierung und Freisetzung von Aldehyden, z.B. Malondialdehyd. Zellmembranen enthalten große Mengen an PUFAs als Angriffsziele der Lipidperoxidation (KELLY et al 1998, HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999). Diese verläuft in einer 3-Schritt-Kaskade (s. Abbildung 2.5): Initiation

Abstraktion eines Wasserstoffatoms von einer Methylengruppe (CH2) wodurch ein hoch reaktives Lipidradikal entsteht.

Kettenverlängerung

Molekularer Sauerstoff reagiert mit Lipidradikalen unter Bildung eines Lipidperoxylradikals (LOO•). Peroxylradikale reagieren mit weiteren Fettsäuren in Form einer Wasserstoffabstraktion. Es entsteht eine radikalische Kettenreaktion mit Bildung von Lipidhydroperoxiden (LOOH). Alternativ können Antioxidantien als Wasserstoffdonatoren LOOH generieren. LOO• kann auch Wasserstoff von Lipidmolekülen unter Radikalbildung abstrahieren.

Termination

Reaktion der Radikale mit Molekülen, die stabile Produkte bilden (KELLY et al 1998).

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Abbildung 2.5: Überblick über die Lipidperoxidation (nach KELLY et al 1998) LH: Fettsäure, Ly: Alkyl-Radikal, LOOy: Alkyl-Peroxyl-Radikal; LOOH: Alkylhydroperoxid, Ry: reaktive Spezies, X: Molekül, mit dem LOOy abreagiert.

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Malondialdehyd ist ein 3-Carbonmolekül mit zwei Aldehydgruppen, das bei der Lipidperoxidation entsteht. Es ist hochreaktiv mit anderen Biomolekülen und wirkt cytotoxisch (HANDELMANN 2000). Malondialdehydbildung (MDA) bei der Lipideroxidation (Abbildung 2.6):

Abbildung 2.6: Entstehung von MDA aus α-Linolensäure (nach BELITZ et al 1992)

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Es entsteht hauptsächlich bei der Peroxidation von PUFAs mit mehr als zwei Doppelbindungen, wie Linolsäuren und Arachidonsäuren, in Anteilen auch im Eicosanoidstoffwechsel (JANERO 1990, ESTERBAUER et al 1991), bei Entzündungen und durch ROS-Reaktionen mit der DNA (MARNETT 1999). MDA hat eine unterschiedliche Reaktivität abhängig vom pH (HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999) und reagiert mit Proteinen, Aminosäuren und DNA-Basen, was eine pathophysiologische Bedeutung z.B. bei der Mutationsinduktion durch DNA-MDA-Adduktbildungen erklärt (KLAUNIG et al 1998, HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999). Die Lipidperoxidation kann repariert werden, z.B. können peroxidierte Phospholipide in Membranen enzymatisch abgebaut werden (Glutathionperoxidase, Phospholipase) unter Ausbildung stabiler Produkte (KELLY et al 1998). Die Messmethoden für MDA basieren auf UV-Spektrometrie, Fluoreszenzspektrometrie, HPLC und messen jeweils verschiedene Fraktionen des totalen MDA-Pools mittels TBARs-Test (HANDELMANN 2000). Thiobarbitursäure reagiert mit einer Anzahl weiterer Oxidationsprodukte wie 4-Hydroxynoneal, ungesättigte Aldehyde und Endoperoxide, was den TBARs-Test unspezifisch macht (KELLY et al 1998). Verschiedene Messmethoden können deshalb nicht direkt miteinander verglichen werden.

15

2.4 Oxidativer Stress und Krankheiten

Freie Radikale und oxidative Schäden an Lipiden und Proteinen gelten als mitverursachend bei der Pathogenese vieler Erkrankungen, speziell solcher mit inflammatorischer Komponente (SPITTLE et al 2001). Gewebsverletzungen durch Infektionen, Traumen, Toxinen führen zur Produktion von Mediatoren wie Prostaglandinen, Leukotrienen und Interleukinen, die letztlich eine erhöhte Produktion von ROS bedingen (HALLIWELL et al 1992, HEROLD et al 1996). Beispiele von Erkrankungen mit oxidativer Stresskomponente in ihrer Pathogenese, die in Zusammenhang mit einer Nierentransplantation Bedeutung erlangen können: Atherosklerose Oxidative Schäden werden als Mitursache der akzelerierten Arteriosklerose vermutet und scheinen deshalb eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung cardiovaskulärer Erkrankungen zu spielen (USBERTI et al 2002). Über die Endothelschädigung kommt es zur Monocytenadhäsion mit erhöhter ROSProduktion als Initiierungsschritt der Arteriosklerose. Es folgt die LDLPeroxidation und Ingestion durch Makrophagen mit anschließender Schaumzellbildung. Das Risiko des koronaren Herztodes ist bei Niereninsuffizienten 10fach höher als bei der Normalbevölkerung (FOLEY et al 1998). Die Folgen der metabolischen Alterationen bei Nierentransplantierten können sich in der chronischen Rejektion oder der chronischen Allograftnephropathie zeigen.

Hypertonus Ein Mechanismus, der zum Hypertonus beiträgt, könnte die erhöhte Freisetzung von O2•– in der Gefäßwand sein, welches NO• durch ONOO– Formation inaktiviert (NAKAZONO et al 1991). 16

Diabetes mellitus Es wird diskutiert, ob ROS die insulinproduzierenden ß-Zellen angreifen (SUAREZ-PINZON et al 1997).

Ischämie-Reperfusion Der Reoxygenationsschaden in transplantierten Nieren ist teilweise ROSverursacht (GRANGER and KUBES 1994, LI and JACKSON 2002, BRODSKY et al 2002). Zusammenhänge zwischen oxidativem Stress des Spenders und der Nierenfunktion post transplantationem werden vermutet (KOSIERADSKI et al 2003).

Autoimmunerkrankungen wie Sklerodermie und Lupus erythematodes werden mit oxidativem Stress in Verbindung gebracht (LUNEC et al 1994, STEIN et al 1996).

Malignome ROS gehören zur Kategorie der Agentien, die DNA-Modifikationen und Strangbrüche verursachen (AMES 1989, SCHULZ et al 1994). Es können direkte DNA-Schädigungen wie z.B. hydroxylradikalinduzierte Purin- und Pyrimidinmodifikationen auftreten (HALLIWELL and GUTTERIDGE 1999, COLLINS 1999). Mutagene Effekte können auch verursacht werden durch DNA-Reparaturschädigung, Stimulation der Zellproliferation, Stimulation der Tumorgenexpression, Einfluß auf Zellkommunikationsmechanismen und Kontrolle des Zellwachstums (FEIG et al 1994, VELLANOWETH et al 1994, STORZ and POLLA 1996). Erhöhte Inzidenzen speziell von Hauttumoren, Non-Hodgkin-Lymphomen, Kaposi-Sarkomen, Zervixcarcinomen und Nierenzellcarcinomen werden bei Nierentransplantierten gefunden (VAMVAKAS et al 1996).

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2.5 Hämodialyse und oxidativer Stress Im Endstadium der Niereninsuffizienz ist unter Dialysebedingungen mit verstärkter Bildung freier, hochreaktiver Sauerstoffradikale sowohl im Gewebe als auch in der Zirkulation zu rechnen. Hämodialysepatienten scheinen durch die vermehrte Bildung hochreaktiver Sauerstoffradikale einem verstärkten oxidativen Stress ausgesetzt zu sein. Bioinkompatibilität von Dialysemembranen einerseits und Verlust von Antioxidantien (hydrophile Vitamine) während des Dialysevorgangs andererseits sollen den prooxidativen Effekt der Hämodialyse auslösen. Die Verwendung von Hämodialysatoren mit Vitamin-E-beschichteter Membran soll den oxidativen Stress vermindern (ALBERT et al 2003).

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2.6 Nierentransplantation Die beste Rehabilitation von Patienten mit terminalem Nierenversagen gelingt durch eine erfolgreiche Nierentransplantation. Aber gerade bei der Nierentransplantation sind eine Reihe von Mechanismen denkbar, die zu erhöhtem oxidativen Stress führen. Als Auslöser kommen u. a. die Ischämie-Reperfusion, immunologische Prozesse (Immunantwort des Empfängers auf Histokompatibilitätsantigene des Spenders) und die immunsupppressive Dauermedikation in Betracht (PRZEKWAS et al 2003, CAMPISE et al 2003, HA et al 2004). Produkte, die durch freie Radikale im Rahmen der Transplantation gebildet werden sollen und als Marker von oxidativem Stress gelten, sind Malondialdehyd (Serum), Lipidhydroperoxide (Lipidperoxidation) sowie Carbonyl- und Sulfhydrylgruppen (Proteinperoxidation) (BIERNACKI et al 2002).

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2.7 Grundlagen der Immunsuppression Die T-Lymphocytenaktivierungskaskade ist das Ziel der immunsuppressiven Therapie. Die Immunantwort richtet sich gegen den Major- Histokompatibilitätskomplex (MHC) des Transplantats. Die Erkennung von AlloMHC durch die Empfänger-T-Lymphocyten löst die Rejektion aus. Über eine Signalkette kommt es zur T-Lymphocytenaktivierung und zur Aktivierung von Calcineurin, welches eine Schlüsselrolle bei der Interleukin-2Gentranskription spielt. Ziel ist es, eine Über-Immunsuppression mit den möglichen Folgen von Infektionen, Organdysfunktion und Malignomen, sowie eine UnterImmunsuppression, die eine Rejektion oder den Transplatatverlust nach sich ziehen kann, zu vermeiden. Imunsuppressiva werden normalerweise kombiniert, um die Wirkung zu maximieren und Nebenwirkungen zu minimieren. Substanzen, die zur Verfügung stehen sind: Calcineurininhibitoren Cyclosporin und Tacrolimus als Basisimmunsuppressiva blockieren Calcineurinphosphatase-abhängige Vorgänge, speziell bei der frühen TZellaktivierung. ROS spielen vermutlich eine wichtige Rolle bei der cyclosporininduzierten Nephrotoxizität. Bei nierentransplantierten Patienten unter Cyclosporin-AImmunsuppression wird eine vermehrte NO-Produktion als gegenregulatorisches System der cyclosporininduzierten Hypertension bei gleichzeitig erhöhter Superoxidproduktion und ROS-Produktion als Index für oxidativen Stress beschrieben (CALO et al 2000). Andererseits berichtet eine Studie auch über einen protektiven Effekt von niedrigdosiertem Cyclosporin A gegen oxidativen Stress durch IschämieReperfusion, allerdings lediglich im Rattennierenmodell (SINGH et al 2005).

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Tacrolimus (Prograf®, Fujisawa Healthcare) ist ein Makrolid, das an einen anderen Rezeptor bindet als Cyclosporin, aber den gleichen calcineurinabhängigen Weg der T-Zellaktivierung inhibiert (SUTHANTHIRAN et al 1996). Ein Vergleich beider Calcineurininhibitoren im Hinblick auf oxidativen Stress ergab für Tacrolimus signifikant verringerte MDA-Werte im Verlauf nach der Transplantation (PERREA et al 2006). Corticosteroide wirken immunsuppressiv u.a. durch die Hemmung der Interleukin-1Produktion und der T-Zellproliferation. Für Prednisolon werden gewisse Schutzeffekte gegen cyclosporininduzierte Cytotoxizität durch Reduktion der ROS-Generation beschrieben, allerdings bisher nur im Tierversuch (JEON et al 2005). Azathioprin ist ein Purinanalogon, das die DNA-Replikation inhibiert und dadurch die Lymphocytenproliferation verzögert. Sirolimus (Rapamune®, Rapamycin) als Makrolidantibiotikum unterdrückt die T-Zellaktivierung durch Inhibition eines cytosolischen Enzyms (mTOR = mammalian target of rapamycin) welches die G1-Phase des Zellzyklus der Lymphocyten reguliert. Darüberhinaus wird die B-Zellprolifreation inhibiert und die Expression von GF (growth factor)mRNA reduziert. Durch Interaktionen mit dem Cyclosporinmetabolismus wird möglicherweise die cyclosprininduzierte Nephrotoxizität verstärkt. Mycophenolat Mofetil (Cell Cept®) blockiert speziell das Enzym Inosinmonophosphatdehydrogenase (IMPDH) bei der Neusynthese von Purinen. Dadurch werden sowohl die T- als auch B-Lymphocyten inhibiert.

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Daclizumab/Basiliximab als monoklonale IL-2-Rezeptorantikörper inhibieren die Lymphocytenaktivierung. Anti-T-Lymphocytenglobulin (ATG) als polyklonaler Antikörper ist gegen verschiedene Proteine auf der Lymphocytenmembran gerichtet mit dem Ziel der Zerstörung der TLymphocyten. Anti-CD3-Antikörper (OKT3) und Anti-CD4-Antikörper (OKT4) Sind monoklonale Antikprper gegen Zielmoleküle des T-Zellrezeptors und inaktivieren diese teils durch Überschichtung, teils durch Modulation mit Einstülpung ins Zellinnere sowie ganze Lympholyse.

Es scheint zumindest ein teilweiser Einfluß der jeweiligen Immunsuppression auf Marker oxidativer Vorgänge zu bestehen, die Studienlage ist allerdings kontrovers. So werden für mehrere Marker des oxidativen Stress, wie beispielsweise Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase, keine Unterschiede zwischen Cyclosporin-A- und Azathioprinbehandelten Patienten gefunden (Mc GRATH et al 1997). Eine weitere Studie zeigt höhere Parameter des oxidativen Stress (Malondialdehyderhöhung und Glutathionperoxidasereduktion) bei nierentransplantierten Patienten im Vergleich zu Gesunden, ohne Unterschied zwischen Cyclosporin A und Tacrolimusbehandlung (MORENO et al 2005). Ähnliche Ergebnisse bei anderen untersuchten Parametern erzielen CALO et al 2002.

22

3. Material und Methodik 3.1 Malondialdehydbestimmung Die Bestimmung des Malondialdehydgehaltes der Plasmaproben wird mit einem Kit der Firma Sobioda durchgeführt (MDA-TBARS-KIT). Das Blutplasma wird durch Zentrifugation von 1ml EDTA-Blut bei 2000 rpm (4 Minuten) gewonnen und mit 0,05% t-Buthylhydroxytoluol (BHT) in Ethanol bis zur Messung bei -70ºC gelagert. Vom MDA-Kit werden zwei Teile Thiobarbitursäure (Solution I) und ein Teil Perchlorsäurelösung (Solution II) gemischt und davon jeweils 160 µl zu 20 µl Plasma oder Standard in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Die Standardreihe wird in absteigender Verdünnung mittels der 20mM Standardlösung (Sloution III) des MDA-Kit hergestellt. Der Ansatz wird nach dem Vortexen 1 Stunde auf 95ºC erhitzt, anschließend 5 Minuten auf Eis gekühlt und zentrifugiert (5 min bei 6000rpm). Nach Zugabe von 400µl Butanol wird 1 Minute gevortext und 5 Minuten bei 6000rpm zentrifugiert. Aus der Butanolphase werden 150µl entnommen und in ein HPLC-Vial gegeben und vermessen. Die Identifikation des MDA erfolgt über die Retentionszeit, die Quantifizierung durch Vergleich der Peakflächen mit denen externer Standards (s. Abbildung 3.1) Weitere 200µl der Butanolphase werden in eine 96well-Platte gegeben und mittels Photometer alle Thiobarbitursäurederivate durch Fluoreszenzmessung bestimmt (Extinktion 516 nm, Emission 590nm). Die Messungen mit HPLC und Photometer erfolgt jeweils als Doppeltbestimmung mit je sieben Patientenproben.

23

Reaktion von MDA mit Thiobarbitursäure (Abbildung 3.1):

Ext. 532nm Em. 553nm

Messung via HPLC: Identifikation über die Retentionszeit Quantifizierung durch Vergleich der Peakflächen mit denen externer Standards Säule: LichroSpher 100 (5µm) RP-18 250mm x 4mm (Merck) Fließmittel: 57% Phosphat Puffer (12,5mM Na2HPO4, pH 7,4) mit 43% Methanol Flow: 1ml/min Injektionsvolumen: 50 µl Fluoreszenzdetektor: Extinktion 534 nm, Emission 553 nm Laufdauer: 5 min, MDA Peak 3,2 min

24

3.2 Comet-Assay zur Messung von (oxidativen) DNASchäden

PBS:

8,0

g NaCl

0,2

g KCl

0,2

g KH2PO4

1,15

g Na2HPO4

mit bidest. Wasser auf 1 Liter auffüllen und mit 1 N NaOH auf pH 7,4 einstellen NMA:

Normal Melting Point Agarose 0,5 % in PBS

LMA: Lyse-Stammlösung:

Low Melting Point Agarose 146,1 g NaCl 37,2 g EDTA 1,2 g Tris in 1 Liter bidest. Wasser lösen und mit NaOH (ca. 8g) auf pH 10 einstellen

Lyse-Gebrauchslösung:

Elektrophoresepuffer: (Stammlösung)

89 ml

Lyse-Stammlösung

1 ml

Triton-X-100

10 ml

DMSO

200 g NaOH in 500 ml bidest. Wasser 14,9 g EDTA in 200 ml bidest. Wasser

25

Elektrophoresepuffer: (Gebrauchslösung)

30 ml

NaOH-Lösung (10molar)

5 ml

EDTA-Lösung (200mM) auf 1 Liter mit bidest. Wasser auffüllen

Neutralisationspuffer:

48,5

g Tris auf 1 Liter mit bidest. Wasser auffüllen und mit HCl auf pH 7,5 einstellen

Ethidiumbromid-

10 mg in 50 ml bidest. Wasser

Stammlösung: Ethidiumbromid-

100µl Stammlösung und 900 µl

Gebrauchslösung:

bidest. Wasser

Die Agarose-Präparate (LMA und NMA) werden vor dem Gebrauch kurz in einem Mikrowellengerät erwärmt und die Temperatur auf dem Magnetrührer auf 38ºC eingestellt. Objektträger vorbereiten: 40 µl NMA werden auf einem Objektträger ausgestrichen. Nach dem Trocknen der Agarose werden zweimal je 65 µl NMA aufgebracht und sofort mit einem Deckglas (24x24 mm) bedeckt. Die vorbereiteten Objektträger werden im Kühlschrank bei 4ºC in einer feuchten Box bis zum Gebrauch aufbewahrt. Blutproben: EDTA-Monovetten werden nach der Entnahme im Kühlschrank (4ºC) gelagert und möglichst zeitnah (maximal 12 Stunden nach Entnahme) verarbeitet.

26

6 µl der Blutprobe werden in 1,5 ml Reaktionsbehälter pipettiert und mit 65 µl LMA in der Pipette gemischt und auf den vorbereiteten Objektträger verteilt, nachdem das Deckglas entfernt wurde. Die Agarose wird mit einem Deckglas bedeckt und auf Eis erkalten lassen. Lysebehandlung: Nach dem Entfernen der Deckgläser werden die Objektträger in eine mit eiskaltem Lysepuffer gefüllte Färbekammer gestellt. Die Lysezeit beträgt mindestens 1 Stunde bei 4ºC. Enzympufferbehandlung: Nach der Lyse werden die Objektträger in einer Färbekammer dreimal je 5 Minuten mit je 100 ml eiskaltem Enzympuffer gewaschen. Enzymbehandlung: 25 µl FPG werden mit 725 µl Enzympuffer gemischt und 50 µl der Enzymlösung bzw. 50 µl Enzympuffer (Kontrollen) auf das Gel gegeben, mit einem Deckglas bedeckt und 30 Minuten in ein 37ºC warmes Wasserbad gestellt. DNA-Entwindung und Elektrophorese: Nach Entfernen der Deckgläser werden die Objektträger in eine eisgekühlte Elektrophoresekammer gelegt, die mit eiskaltem Elektrophoresepuffer gefüllt wird, so dass die Gele mit Elektrophoresepuffer bedeckt sind. Die DNA-Entwindung dauert 20 Minuten bei pH > 13 bei 4ºC. Danach wird die Spannung eingestellt (25 V; 0,89 V/cm) und durch Variation der Elektrophoresepuffermenge die Stromstärke auf 300 mA reguliert. Die Elektrophoresedauer beträgt 20 Minuten und findet bei 4ºC statt. Neutralisationspufferbehandlung: Die Objektträger werden in einer Färbekammer nach der Elektrophorese dreimal jeweils 5 Minuten mit je 100 ml eiskaltem Neutralisationspuffer gewaschen.

27

Färben: Jedes Gel wird mit 40 µl Ethidiumbromid gefärbt und mit einem Deckglas bedeckt. Bis zur Auswertung werden die Objektträger in einer feuchten dunklen Box im Kühlschrank aufbewahrt.

Abbildung 3.2: Prinzip der Durchführung des Comet-Assay

Auswerten: Es werden pro Deckglas 50 Zellen am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet (s. Abbildung 3.3). Die Deckgläser werden mäanderförmig abgesucht und die einzelnen, sich nicht überdeckenden Zellen gemessen. Die Quantifizierung erfolgt über die Messung der Tail Intensity % (% der DNA im Schweif).

28

Bei den direkten DNA-Schäden (ohne FPG-Behandlung) und den FPGbehandelten Proben werden jeweils 4 Deckgläser untersucht, d.h. jeweils 200 Zellen gemessen. Die 50 Zellen pro Deckglas werden gemittelt und anschließend die Mittelwerte gemittelt.

Abbildung 3.3: Fluoreszenzmikrosopbild von zwei ungeschädigten, einem mittel geschädigten und einem stark geschädigten Zellkern im Comet Assay nach Färbung mit Ethidiumbromid

29

3.3 Qualitätskontrolle/Variabilitätskontrolle Als Parameter der internen Qualitätskontrolle bzw. zur Quantifizierung der Variabiltät der im Comet-Assay erzielten Werte werden in regelmäßigen Abständen Proben von Lymphocyten eines gesunden Probanden mitgeführt. Lymphocytenisolierung der Probandenproben: 7 ml Histopaque 1077 in 15 ml Bloomex-Röhrchen vorlegen (Dunkel bei RT lagern). Vorsichtig mit 7 ml frisch entnommenen Blut überschichten. Zentrifugation zur Ausbildung des Ficollgradienten (400 g, Raumtemperatur, 25 min ohne Bremse). Den Lymphocytenring abpipettieren und in 10 ml N-Medium (Zellkulturmedium für Säugerzellen, Fa. Gibco; RPM 1640 mit L-Glutamin, 37º C) überführen. Zentrifugation bei 250 g, 10 min, RT, ohne Bremse. Überstand abkippen, in 1ml N-Medium aufnehmen, vortexen und in Epis überführen. Bestimmung der Zellzahl mit der Neubauer-Zählkammer. Aliquotieren nach Bedarf. Zugabe von 500 µl Einfrier-Medium (9 ml Fetales Kälberserum und 1 ml DMSO). Langsam einfrieren (Nalgene; Lyco 1ºC Freezing Container, Kühlrate 1ºC/min). Bis zum Gebrauch wurden die Proben bei -70ºC gelagert.

3.4 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung erfolgt durch den verbundenen WilcoxonTest und den Mann-Whitney U-Test bei zweiseitiger Fragestellung, wenn nicht anders angegeben auf 5% Signifikanzniveau.

30

3.5 Patienten und Probandengruppen Die untersuchten Patienten und Probanden teilen sich in folgende Untersuchungsgruppen und Untersuchungsmethoden auf: 1. Gesunde Probanden Comet-Assay (n=15) 2. Gesunde Probanden Malondialdehyd (n=10) 3. Individualverläufe bis 1 Jahr nach NTX Comet-Assay (n=8) 4. Individualverläufe bis 2 Monate nach NTX Comet-Assay (n=9) 5. Einzelwertbestimmungen nach NTX Comet-Assay (n=21) 6. Individualverläufe Malondialdehyd bis 1 Jahr nach NTX (n=8) 7. Individualverläufe Malondialdehyd bis 2 Monate nach NTX (n=9) 8. Einzelwertbestimmungen nach NTX Malondialdehyd (n=8) Für die Malondialdehydbestimmungen werden die Werte sowohl mit der HPLC- als auch MR-Methode ermittelt. Bei den Messungen der Individualverläufe werden die Werte des selben Patienten zu definierten Zeitpunkten vor und im Verlauf nach der Nierentransplantation untersucht. Bei den Einzelwertbestimmungen werden Werte verschiedener Patienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Nierentransplantation erhoben.

31

3.6 Stammdaten der untersuchten Gruppen Gesunde Probanden (als Vergleichsgruppe zur MDABestimmung): Alter (Jahre) Geschlecht Proband 1

26

M

Proband 2

31

W

Proband 3

29

M

Proband 4

26

M

Proband 5

37

W

Proband 6

28

M

Proband 7

26

W

Proband 8

25

W

Proband 9

23

M

Proband 10

27

W

Gesunde Probanden (als Vergleichsgruppe zum Comet-Assay) übernommen aus C. Müller, Untersuchungen zum oxidativen Stress bei Hämodialysepatienten, 2003. Alle gesunden Probanden sind frei von akuten oder chronischen Erkrankungen und ohne regelmäßige Medikamenteneinnahme. In der untersuchten Probandengruppe befinden sich sowohl Raucher als auch Nichtraucher.

32

Patienten untersucht mittels Comet-Assay: Patient

Alter Geschlecht

Grunderkrankung

Immunsuppression

1 B.H.

65

M

Kong. Einzelniere

CyA/Siro/MMF

2 B.H.

41

W

Refluxnephropathie

Siro/Tac/MMF

3 W.H.

51

M

Proliferative GN

CyA/Aza

4 L.I.

50

W

Mesangioprol. GN

CyA/Tac/MMF

5 F.M.

51

W

Chron. GN

CyA/MMF

6 U.R.

51

M

Mesangioprol. GN

CyA/MMF

7 A.R.

46

W

Chron. GN

CyA/MMF

8 S.U.

59

M

Chron. GN

CyA/MMF

9 K.A.

43

M

Maligne

CyA/MMF

Nephrosklerose 10 M.H.

50

M

Chron. GN

CyA/MMF

11 B.G.

60

W

Mesangioprol. GN

CyA/MMF

12 S.C.

57

W

Polyzystische Nie-

CyA/MMF

rendegeneration 13 H.G.

47

M

Mesangioprol. GN

CyA/MMF

14 K.J.

39

M

Chron. GN

CyA/MMF

15 S.G.

37

W

Lupus erythematodes Siro/MMF

16 L.E.

55

W

Schrumpfnie-

CyA/MMF

re/unklare Genese 17 K.K.

43

W

V.a. Analgetikaneph-

CyA/Tac/MMF

ropathie 18 M.A.

49

W

Nicht bekannt

CyA/MMF/ATG

19 S.R.

53

M

Fokal-sklerosierende

CyA/MMF

GN 20 B.K.

51

W

Mesangioproliferative

CyA/MMF

GN 21 K.G.

48

M

Benigne Nephroskle-

CyA/MMF

rose 22 W.R.

67

M

Polyzystische Nie-

CyA/Tac/MMF 33

rendegeneration 23 G.W.

65

M

Interstitielle Nephritis

Tac/MMF

24 D.E.

54

W

Polyzystische Nie-

CyA/Siro/MMF

rendegeneration 25 W.D.

58

M

Nierenzellcarcinom

Nur Prä-NTX,

bds.

keine NTX

26 H.M.

41

W

Mesangioprol. GN

CyA/MMF

27 K.A.

54

M

Chronische GN

CyA/MMF

28 M.B.

67

M

Glomerulosklerose

CyA/Aza

bei art. Hypertonus 29 H.T.

37

M

Fokal-segm. Glome-

CyA/MMF

rulosklerose 30 J.H.

57

W

Schrumpfniere/ un-

CyA/MMF

klare Genese 31 W.H.

50

M

Polyzystische Dege-

CyA/MMF

neration 32 H.A.

38

W

Refluxnephropathie

CyA/Tac/MMF

33 P.M.

60

M

Nephrosklero-

CyA/MMF

se/Schrumpfniere 34 P.H.

67

W

Hypertensive

CyA/MMF

Nephropathie 35 B.H.

55

M

Nephrosklerose

CyA/Tac/MMF

36 W.S.

26

W

Mesangioprol. GN

Aza/CyA

37 W.B.

64

M

Mesangioprol. GN

Tac/MMF

38 F.C.

37

M

Schrumpfniere/Reflux CyA/Tac/Siro/MMF

34

Patienten MDA (MR und HPLC):

Patient Alter Ge-

Grunderkrankung

Immunsuppression

schlec ht 1 U.R. 51

M

Mesangioprol. GN

CyA/MMF

2 A.R. 46

W

Chron. GN

CyA/MMF

3 S.U. 59

M

Chron. GN

CyA/MMF

4 A.H. 61

M

Zystennieren bds.

CyA/Siro/MMF

5 B.H. 65

M

Kong. Einzelniere

CyA/Siro/MMF

6 P.H. 67

W

Hypertensive Nephropathie

CyA/MMF

7

26

W

Mesangioprol. GN

Aza/CyA

60

M

Nephrosklerose/Schrumpfniere CyA/MMF

55

W

Schrumpfniere/unklare Gene-

W.S. 8 P.M. 9 L.E.

CyA/MMF

se 10

50

M

Polyzystische Degeneration

CyA/MMF

43

W

V.a. Analgetikanephropathie

CyA/Tac/MMF

43

M

Maligne Nephrosklerose

CyA/MMF

50

M

Chron. GN

CyA/MMF

60

W

Mesangioprol. GN

CyA/MMF

57

W

Polyzystische

CyA/MMF

W.H. 11 K.K. 12 K.A. 13 M.H. 14 B.G. 15 S.C. 16

Nierendegeneration 47

M

Mesangioprol. GN

CyA/MMF

57

M

Chron. GN

CyA/Siro/MMF

H.G. 17

35

M.G. 18

67

M

W.R.

Polyzystische

CyA/Tac/MMF

Nierendegeneration

19 L.I.

50

W

Mesangioprol. GN

CyA/Tac/MMF

20

41

W

Refluxnephropathie

Siro/Tac/MMF

57

W

Schrumpfniere/ unklare Gene-

CyA/MMF

B.H. 21 J.H. 22

se 54

W

D.E: 23

CyA/Siro/MMF

Nierendegeneration 37

M

H.T. 24

Polyzystische Fokal-segm. Glomeruloskle-

CyA/MMF

rose 49

W

Nicht bekannt

CyA/MMF/ATG

48

M

Benigne Nephrosklerose

CyA/MMF

M.A. 25 K.G.

Abkürzungen: CyA= Cyclosporin A Tac=Tacrolimus Aza=Azathioprin Siro=Sirolimus MMF=Mycophenolat Mofetil ATG=Anti-T-Lymphocytenglobulin

36

4. Ergebnisse Tab. 4.1: Messung von (oxidativen) DNA-Schäden (Comet-Assay) bei gesunden Probanden (n = 15) Aus C. Müller, Untersuchungen zum oxidativen Stress bei Hämodialysepatienten, 2003. + FPG 0,38

0,47

0,48

0,37

0,54

0,54

0,53

0,94

0,37

0,56

0,28

0,57

0,17

0,53

0,20

0,82

0,21

1,31

0,31

0,35

0,32

1,03

0,49

0,90

0,41

1,07

0,53

0,68

0,59

1,11

37

Tab. 4.2: Messung von (oxidativen) DNA-Schäden (Comet-Assay) bei Patienten (n = 38) Vor NTX

2-5 d

2 Wochen

2 Monate

1 Jahr

nach NTX

nach NTX

nach NTX

nach NTX

+

+

+

+

+

FPG

FPG

FPG

FPG

FPG

0,83 8,54

0,69 2,11

1,44 4,10

Patient 1

0,61 0,79

Patient 2

2,12 2,62

1,20 3,82

1,19 1,84

1,76 2,55

0,79 1,98

Patient 3

1,31 2,41

0,98 1,21

1,07 1,46

2,14 3,60

0,67 0,87

Patient 4

1,63 1,78

2,11 1,92

2,14 3,20

2,98 4,87

0,46 1,57

Patient 5

2,42 2,84

1,80 3,28

Patient 6

1,38 2,85

0,66 0,74

0,68 1,00

0,46 0,95

Patient 7

0,70 1,23

0,63 1,63

1,04 1,21

0,72 1,58

Patient 8

0,94 0,98

0,48 0,96

0,37 1,30

0,53 1,37

Patient 9

0,77 1,15

0,84 2,92

0,43 0,62

Patient 10

0,54 0,78

0,46 1,06

0,75 2,90

Patient 11

0,62 0,78

0,36 4,80

0,69 1,47

Patient 12

0,42 1,99

0,73 2,20

1,45 2,73

Patient 13

0,45 0,90

1,02 2,19

0,75 1,39

Patient 14

2,03 3,77

2,13 3,10

1,15 2,39

3,91 5,04

Patient 15

1,25 1,32

2,55 2,87

2,79 6,31

2,22 3,25

Patient 16

0,46 2,85

0,93 1,00

0,37 1,11

Patient 17

1,01 2,24

0,89 1,08

0,50 2,22

Patient 18

0,91 1,01

Patient 19

0,91 3,24

Patient 20

1,71 1,08

0,74 2,72

2,00 5,23 1,83 3,10

2,52 3,01

Patient 21

2,71 3,35

0,71 1,00

0,62 1,54

Patient 22

2,41 2,81

1,01 2,14

1,04 3,62

Patient 23

2,21 2,63

1,17 1,47 2,82 4,36

Patient 24 Patient 25 Patient 26

0,45 1,86

2,49 3,23 2,98 5,60

38

Patient 27

2,35 3,05

0,61 0,94

Patient 28

1,23 2,05

2,72 3,15

Patient 29

2,07 4,66

0,97 3,15

2,23 3,43

Patient 30

0,97 1,78

0,25 1,99

Patient 31

0,43 1,25

1,56 1,75

0,33 1,47

Patient 32

0,73 2,14

Patient 33

0,95 2,35

Patient 34

0,87 2,03

Patient 35

0,40 2,39

Patient 36

0,52 1,05

Patient 37

2,29 2,76

Patient 38

1,1

3,2

39

6

ohne F PG mit F PG

% Tail Intensity

5

4

3

2

1

0

n n TX TX TX TX TX TX TX TX TX TX de de an ban or N v or N c h N c h N c h N c h N ac h N ach N ch N ac h N b o v a a a o a a n n en en Pr Pr rn rn en en ag T ag c hen c hen o nat ona t J ah J ah T 1 1 o o 2- 5 2 -5 2 W 2 W 2 M 2 M

Abb.4.1: Individualverläufe bis 1 Jahr nach NTX Probanden n = 15 vor NTX n = 8 2-5 Tage nach NTX n = 3 2 Wochen nach NTX n = 8 2 Monate nach NTX n = 7 1 Jahr nach NTX n = 8

40

10

Rot = Mean

% Tail Intensity

8

6

4

2

0

G X G G X X G X G FP PG TX FP PG FP NT NT NT FP NT t FP rN ne it F ch it F mit mit mit ach mi ach vo ach oh na nm TX Xm TX TX en TX en ge nn hr n NT nde hN nat or N Ta he hN Ja hN a c h and c o c c b v 5 a c 1 b o a n n 2na na Pr o 2M Pro ge 2W te ahr hen Ta ona 1J oc 2- 5 2M 2W

Abb. 4.2: Individualverläufe bis 1 Jahr nach NTX

Pat 1 Pat 2 Pat 3 Pat 4 Pat 5 Pat 6 Pat 7 Pat 8 Mean

10

% Tail Intensity

8

6

4

2

0

r vo

G X X X G G PG TX PG FP NT NT NT FP t FP it F ti F hN ch X+ ch mit ach mi NT na nac Xm na Xm TX TX en te hr n ge ch NT NT N a N a h a a n h r n c h J h T o c o c 1 vo ac ahr na na 2-5 2M 2W en en 1J ate Tag on och 2-5 2M 2W

X NT

Abb. 4.3: Individualverläufe bis 1 Jahr nach NTX erzielte Werte je Patient

41

ohne FPG mit FPG

5 ,0 4 ,5

% Tail Intensity

4 ,0 3 ,5 3 ,0 2 ,5 2 ,0 1 ,5 1 ,0 0 ,5 0 ,0 X X X X n n TX TX TX TX de NT NT de NT NT hN hN hN hN an or an or ch ch c c c c b v v b a a a a a a o o n n n n Pr Pr nn nn ge ge at e at e he he Ta Ta on on oc oc M M W W 2- 5 2 -5 2 2 2 2

Abb. 4.4: Individualverläufe bis 2 Monate nach NTX Probanden n = 15 vor NTX n = 9 2-5 Tage nach NTX n = 2 2 Wochen nach NTX n = 9 2 Monate nach NTX n = 9

42

7,0

Rot = Mean

6,5 6,0 5,5

% Tail Intensity

5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 Pro

n de ban b Pro

m en and

P it F

G

X X X X PG PG PG PG NT NT NT NT it F it F it F it F ch ch ch vor Xm na Xm Xm na na Xm e T g NT N NT NT en ate a h h r n T h h c c o o c o v a a nac 2-5 2M en te n 2W en Tag ona och 2-5 2M 2W

Abb. 4.5: Individualverläufe bis 2 Monate nach NTX

Pat 9 Pat 10 Pat 11 Pat 12 Pat 13 Pat 14 Pat 15 Pat 16 Pat 17 Mean

6,5 6,0 5,5

% Tail Intensity

5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 r vo

X NT

Xm NT vor

TX PG TX TX PG PG it F hN it F hN it F hN ac nac Xm nac Xm Xm te n NT NT en age NT a h h n h T h c c o c o na nac 2- 5 na 2M 2W ge te hen Ta ona oc 2- 5 2M 2W

PG it F

Abb.4.6: Individualverläufe bis 2 Monate nach NTX erzielte Werte je Patient 43

4.1 Auswertung Comet-Assay Individualverläufe: •

2 Gruppen von Patienten, von denen die eine bis zu einem Jahr nach der Transplantation beobachtet wird (Patienten 1-8, n=8), die andere bis zu 2 Monaten nach der Transplantation (Patienten 9-17, n=9).

•

Die Daten der Messzeitpunkte 2-5 Tage nach der Transplantation werden bei der Diskussion wegen zu kleinem n (2 bzw. 3 Messdaten) nur als Näherungswerte berücksichtigt.

•

Die erzielten Mittelwerte der Individualverläufe sind in beiden Verlaufsbeobachtungsgruppen relativ konstant.

•

Die einzelnen Messdaten der Patienten bewegen sich mit mehr oder weniger starken individuellen Streuungen um den Mittelwert, vereinzelt ergeben sich jedoch stärkere Abweichungen vom Mittelwert (Patient 1: oxidative Schäden 2 Wochen nach NTX, Patient 3 und 4: oxidative Schäden 2 Monate nach NTX, Patient 11: oxidative Schäden 2 Wochen nach NTX, Patient 14: oxidative Schäden vor NTX und 2 Monate nach NTX und Grundschäden 2 Monate nach NTX Patient 15: oxidative Schäden 2 Wochen nach NTX).

•

Es zeigen sich niedrigere Grundschäden 1 Jahr nach der Transplantation.

•

Weitere eindeutig zeitabhängige Veränderungen werden nicht beobachtet.

44

5

ohne FPG mit FPG

% Tail Intensity

4

3

2

1

0

n n TX TX TX TX TX TX TX TX TX TX de de an ban or N v or N c h N ch N c h N ch N ach N ac h N ac h N ac h N b a o v a a o a n en n n n te n te n hr n hr n Pr Pr ge g e en T a 5 T a oc h oc h Mona Mona 1 J a 1 J a 5 22- 2 W 2 W 2 2

Abb. 4.7: Alle erzielten Werte (Einzelwertbestimmungen) Probanden n = 15 vor NTX n = 24 2-5 Tage nach NTX n = 9 2 Wochen nach NTX n = 25 2 Monate nach NTX n = 23 1 Jahr nach NTX n = 19

45

ohne FPG mit FPG

3 ,2 3 ,0 2 ,8 2 ,6

% Tail Intensity

2 ,4 2 ,2 2 ,0 1 ,8 1 ,6 1 ,4 1 ,2 1 ,0 0 ,8 0 ,6 0 ,4 0 ,2 0 ,0 Probanden

Pro banden

1 Jahr nach NTX

1 Jahr n ach NTX

% Tail Intensity

Abb. 4.8: Probanden vs. Patienten 1 Jahr nach NTX

3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Pro

n de ban

it F nm nde a b Pr o

PG

rn ah 1J

X NT ach nac ahr 1J

m TX hN

PG it F

Abb. 4.9: Probanden vs. Patienten 1 Jahr nach NTX 46

4.2 Auswertung Comet-Assay aller erzielten Werte: •

Gesunde Probanden haben signifikant niedrigere Grundschäden und signifikant niedrigere oxidative Schäden zu jedem Zeitpunkt des Vergleiches mit Patienten.

•

Die oxidativen Schäden der Patienten zeigen starke individuelle Variationen.

•

Im Kurzzeitverlauf nach der NTX (2-5 Tage nach der Transplantation) zeigen sich signifikant höhere Grundschäden und oxidative Schäden als vor der Transplantation (p < 0,2).

•

Die Grundschädigung 1 Jahr nach der Transplantation ist signifikant niedriger verglichen mit Patienten vor NTX, 2-5 Tage nach NTX, 2 Wochen nach NTX und 2 Monate nach NTX (p < 0,05).

47

Tab. 4.3: Messung von Malondialdehyd (MDA) bei gesunden Probanden

MR

HPLC

1. Wert 2. Wert Mean 1. Wert

2. Wert Mean

Proband 1

7,16

7,78

7,47

1,38

1,20

1,29

Proband 2

7,47

7,83

7,65

1,47

1,45

1,46

Proband 3

7,05

7,36

7,21

1,86

1,66

1,76

Proband 4

7,29

7,53

7,41

1,52

1,44

1,48

Proband 5

8,04

7,80

7,92

1,91

1,95

1,93

Proband 6

7,75

7,68

7,72

1,63

1,49

1,56

Proband 7

7,39

10,79

9,09

1,03

1,06

1,05

Proband 8

7,88

12,07

9,98

1,28

1,54

1,41

Proband 9

7,57

13,07

10,32 1,27

1,79

1,53

Proband 10 8,00

11,96

9,98

1,44

1,38

1,32

48

Tab.4.4: Malondialdehydwerte Multiplatereader Vor NTX

2 Wochen nach NTX

2 Monate nach NTX

1 Jahr nach NTX

Patient 1.Wert 2.Wert Mean 1. Wert 2. Wert Mean 1. Wert 2. Wert Mean 1. Wert 2. Wert Mean 1

6,76

8,79

7,78

7,17

7,59

7,38

9,83

9,44

9,64

7,91

8,72

8,32

2

8,56

9,35

8,96

8,29

8,89

8,59

9,67

9,30

9,49

8,94

7,72

8,33

3

7,42

7,78

7,60

8,86

8,48

8,67

9,12

9,18

9,15

9,51

8,85

9,18

4

13,89

12,31

13,10 9,88

9,11

9,50

8,59

8,07

8,33

9,33

10,72

10,03

5

7,03

8,03

7,53

7,41

10,18

8,80

8,11

11,03

9,57

12,61

12,52

12,57

6

9,36

9,32

9,34

8,15

8,56

8,36

10,20

10,69

10,45 7,27

7,68

7,48

7

8,20

7,23

7,72

6,40

7,55

6,98

9,33

9,71

9,52

14,39

14,28

14,34

8

12,36

11,40

11,88 17,50

15,85

16,68

10,01

9,37

9,87

9

10,83

11,32

11,08 11,79

12,17

11,98 9,40

10,17

9,79

10

10,37

7,94

9,16

8,59

8,17

8,38

8,55

7,29

7,92

11

11,44

8,67

10,06 9,61

8,26

8,94

7,75

8,29

8,02

12

10,65

10,92

10,79 9,92

9,38

9,65

9,88

10,21

10,05

13

7,81

7,70

7,76

8,59

8,25

6,22

9,35

7,79

7,91

49

14

8,81

8,76

8,79

10,99

11,90

11,45 6,93

9,80

8,37

15

8,81

9,21

9,01

8,28

9,75

9,02

7,38

10,30

8,84

16

9,81

9,41

9,61

12,06

13,07

12,57 8,37

10,63

9,50

17

8,89

12,46

10,68 9,78

13,17

11,48 9,61

14,09

11,85

18

10,68

10,65

10,67

19

9,33

10,44

9,89

20

10,38

11,63

11,01

9,52

10,11

9,82

22

12,39

11,12

11,76

23

7,18

5,96

6,57

7,05

7,36

7,21

12,44

21

24 25

9,40

9,05

12,52

12,48 9,11

7,59

8,35

9,23

50

12

10

MDA (µM)

8

6

4

2

0 Pro

ban

den

v or

NT X 2W

oc

na he n

ch N

TX

o 2M

n n a te

ac h

N TX 1

c r na J ah

TX hN

Abb. 4.10: MDA-Bestimmung mittels Multiplatereader bis 1 Jahr nach NTX

12

MDA (µM)

10

8

6

4

2

0 P ro

den ban

v or

N TX 2W

TX hN nac n e oc h

2M

te n ona

N ac h

TX

51

Abb. 4.11: MDA-Bestimmung mittels Multiplatereader bis 2 Monate nach NTX

12

MDA (µM)

10

8

6

4

2

0 Pro

ban

den

v or

NT X 2W

oc

na he n

ch N

TX

o 2M

n n a te

ac h

N TX 1

c r na J ah

TX hN

52

Abb. 4.12: MDA-Bestimmung mittels Multiplatereader alle erzielten Werte (Einzelwertbestimmungen) Tab 4.5: Malondialdehydwerte HPLC Vor NTX

2 Wochen nach NTX

2 Monate nach NTX

1 Jahr nach NTX

Patient 1.Wert 2.Wert Mean 1.Wert 2.Wert Mean 1.Wert 2.Wert Mean 1.Wert 2.Wert Mean 1

1,28

1,15

1,22

1,25

1,85

1,55

1,04

1,55

1,30

1,52

1,65

1,59

2

2,08

0,92

1,50

1,65

2,30

1,98

2,51

2,09

2,30

1,66

2,37

2,02

3

2,12

1,30

1,71

0,88

1,51

1,20

1,74

1,40

1,57

1,57

1,41

1,49

4

2,26

2,12

2,19

1,90

1,70

1,80

1,57

1,44

1,51

1,94

2,13

2,04

5

1,78

1,74

1,76

1,35

1,68

1,52

1,38

1,86

1,62

2,96

3,27

3,12

6

1,67

2,07

1,87

2,02

2,13

2,08

2,36

2,41

2,39

1,57

1,76

1,67

7

1,47

1,27

1,37

0,92

1,27

1,10

1,33

1,38

1,36

2,05

2,08

2,07

8

2,59

2,48

2,54

2,04

1,85

1,95

1,74

2,14

1,94

9

2,51

2,56

2,54

2,15

2,20

2,18

2,78

1,33

2,06

10

1,92

1,52

1,72

1,80

1,29

1,55

1,13

1,42

1,28

11

2,77

1,33

2,05

1,44

1,09

1,27

1,95

1,83

1,89

53

12

2,81

0,91

1,86

1,12

1,53

1,33

1,86

1,96

1,91

13

0,87

1,34

1,11

1,39

1,32

1,36

1,45

1,86

1,66

14

1,68

1,85

1,77

2,75

2,25

2,50

1,64

2,06

1,85

15

2,06

1,93

2,00

2,55

2,06

2,31

1,57

1,92

1,75

16

2,81

2,27

2,54

2,39

2,22

2,31

1,53

1,70

1,62

17

1,57

1,65

1,61

1,29

1,27

1,28

1,59

1,87

1,73

18

1,90

2,16

2,03

19

2,56

2,50

2,53

20

2,54

2,68

2,61

2,53

2,73

2,63

22

2,25

2,86

2,56

23

1,50

1,38

1,44

1,52

1,37

1,45

2,86

21

24 25

1,35

2,17

3,05

2,96

1,56

1,15

1,36

1,76

54

2,5

MDA (µM)

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 ba Pro

nde

n

v or

NT X 2W

oc h

N a ch en n

TX

on 2M

a

ac te n

hN

TX

ac hr n 1 Ja

TX hN

Abb. 4.13: MDA-Bestimmung mittels HPLC bis 1 Jahr nach NTX

2 ,4 2 ,2 2 ,0 1 ,8

MDA (µM)

1 ,6 1 ,4 1 ,2 1 ,0 0 ,8 0 ,6 0 ,4 0 ,2 0 ,0 Pr o

den ban

v or

NTX 2W

en oc h

TX hN nac 2M

te n ona

N ac h

TX

Abb. 4.14: MDA-Bestimmung mittels HPLC bis 2 Monate nach NTX

55

2,5

MDA (µM)

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 Pro

ban

den

v or

NT X 2W

oc

na he n

ch N

TX

o 2M

n n a te

ac h

N TX 1

c r na J ah

TX hN

Abb. 4.15: MDA-Bestimmung mittels HPLC alle erzielten Werte (Einzelwertbestimmungen)

56

4.3 Auswertung MDA: •

Probanden haben bei beiden Bestimmungsmethoden signifikant niedrigere Werte (p < 0,05) als Patienten vor NTX, 2 Wochen, 2 Monate und ein Jahr nach NTX mit Ausnahme der Gruppe „2 Wochen nach NTX“ mittels HPLC (hier keine statistische Signifikanz, aber Tendenz besteht ebenfalls). Dies steht im Gegensatz zu Untersuchungen von MÜLLER 2003 und EISELT et al 2000 und in Übereinstimmung mit DASCHNER et al 1996, WEINSTEIN et al 2000, DONICA 2001, USBERTI et al 2002 a+b . Jedoch erreichen nicht alle Probandengruppen statistische Signifikanz, Signifikanzen werden überwiegend bei Messungen mittels HPLC erreicht.

•

Bei höherem n ergeben sich Hinweise auf höhere Werte des oxidativen Stress im Langzeitverlauf (1 Jahr nach NTX) verglichen mit 2 Wochen und 2 Monaten nach NTX mittels HPLC- Messung.

•

Bei niedrigeren Fallzahlen (Gruppe bis 2 Monate und Gruppe bis 1 Jahr nach NTX) zeigen die Probanden ebenfalls niedrigere Werte als die Patientengruppen (auf unterschiedlichem Signifikanzniveau).

57

5. Diskussion 5.1 Diskussion der MDA-Werte Die höheren Werte der Lipidperoxidation bei Prä- und Posttransplantationspatienten im Vergleich zu Gesunden sind gut dokumentiert (SIMIC et al 1998, FIORILLO et al 1998, VURAL et al 2005), ebenso höhere Spiegel an Lipidperoxidationsprodukten bei HD-Patienten (JACKSON et al 1995,HAKLAR et al 1995, NOUROOZ-ZADEH 1999, MIMIC-OKA et al 1999, GERARDI et al 2002). ROMERO et al (1999) beschreiben erhöhte Urin-MDA-Spiegel in der frühen postoperativen Phase (Tag 9-12 nach NTX). Die Interpretation der Messergebnisse muss berücksichtigen, dass bei der photometrischen Messung mittels Multiplatereader alle Thiobarbitursäurederivate bestimmt werden und nicht nur Malondialdehyd, was den Vergleich der Werte erschwert und dass die Bestimmungen nicht nüchtern erfolgen, d.h. es liegen individuelle Blutfettgehalte und damit ein unterschiedliches Potential an Substrat für oxidative Umwandlungsprodukte zu den jeweiligen Messzeitpunkten vor, was die Aussage stark einschränkt. Abnorme Lipidspiegel bei Prä-und Postdialysepatienten (Hypertriglyceridämie und HDL-Reduktion) sind bekannt, weiterhin könnte die Heparinbehandlung der Dialysepatienten die Plasmaspiegel an freien Fettsäuren und damit die Substrate der freien Radikale erhöhen (JACKSON et al 1995). Es fehlen bisher serielle Studien im prä- und postoperativen Verlauf sowohl die Lipidperoxidation als auch DNA-Schäden betreffend. MDA entsteht bei der Lipidperoxidation in proteingebundener Form und als freies Molekül (YEO et al 1994, LIU et al 1997). Ein weiterer Anteil wird in vitro generiert (OHKAWA et al 1979) und entsteht als Coprodukt der enzymatischen Prostaglandinsynthese (PRYOR et al 1976). MDA wird 58

außerdem renal eliminiert (GERRITSEN et al 1997), weshalb die MDAErgebnisse bei verschiedenen Messmethoden nicht direkt miteinander verglichen werden können. Als hydrophiles Produkt sind für MDA Diffusionsprozesse denkbar, die ebenfalls die Messergebnisse beeinträchtigen können, so dass die Frage der Eignung des MDA als Parameter zur Bestimmung des oxidativen Stress in unterschiedlichen klinischen Situationen gestellt werden muss. Zur genaueren Beurteilung wäre z.B. die Ratio Malondialdehyd/Gesamtcholesterin geeignet. Wie bei der Mehrzahl der vorliegenden Studien wird auch bei den eigenen Ergebnissen MDA nur als Einzelparameter bestimmt ohne Bezugbildung zur Substratmenge. Die Rolle der Lipidperoxidation wird kontrovers diskutiert, da verschiedene Studien auch zeigen, dass es zu keiner Plasma-MDA-Erhöhung bei Dialysepatienten kommt (HÄRKKO et al 1995, BANNI et al 1996, ROMERO et al 1999) und auch keine Korrelation zwischen Urin-MDA, Serumkreatinin, Diurese, Cyclosporin-A-Spiegeln oder sonstigen immunsuppressiven Medikamenten besteht (ROMERO et al 1999). Zahlreiche Studien beschreiben erhöhtes MDA und freie Radikale bei der Ischämiereperfusion als Hinweis auf eine schnelle Produktion frühzeitig nach der Transplantation (MENGER et al 1991, PRINCEMAIL et al 1993, DAVENPORT et al 1995, BIERNACKI et al 2002, PEREZ-FERNANDEZ et al 2002). Entsprechend frühe Werte für MDA fehlen in der eigenen Studie, so dass möglicherweise der Messzeitpunkt früher gewählt werden muss. Ebenso fehlt bei der eigenen Studie eine Zuordnung der Messergebnisse zu möglicherweise modulierenden Faktoren, wie der Art der Immunsuppression. Studien von MARTINEZ CASTELAO et al 2002 zeigen, dass CyA eine Hyperlipidämie induziert, während Tacrolimus die Hyperlipidämie und die Oxidation von Lipoproteinen reduziert. Eine aktuelle Studie von PERRERA bestätigt erhöhte MDA-Spiegel unter Cyclosporinimmunsuppression verglichen mit Tacrolimus, allerdings ohne statistische Relevanz (PERRERA et al 2006). Andere Studien finden keine Differenz be-

59

züglich des Lipidperoxidationsparameters MDA beim Vergleich von Cyclosporin und Tacrolimus (MORENO et al 2005). VURAL et al dagegen beschreiben in einer neueren Studie, dass Malondialdehyd nach der Transplantation absinkt und antioxidative Enzyme (SOD, GSH) ansteigen, unabhängig vom gewählten immunsuppressiven Regime (VURAL et al 2005). Die Verbesserung der Parameter der Lipidperoxidation (MDA) wird auch durch SIMIC-ORGRIZOVIC 1998 bestätigt. Sowohl die eigene Studie als auch andere Arbeitsgruppen finden bei nierentransplantierten Patienten keine Normalisierung erhöhter Produkte der Lipidperoxidation (DASGUPTA et al 1997). ANTOLINI et al zeigen, dass sich nach der Nierentransplantation Marker von glycoxidativem Stress nahezu normalisieren, dass aber eine vollständige Remission nur bei normaler Nierenfunktion erreicht wird (ANTOLINI et al 2004), was für die Detoxifikation durch die normale Nierenfunktion spricht. Ob die erhöhten Lipidperoxidationmarker bei Transplantierten durch eine verminderte Detoxifikation erklärt werden können bleibt fraglich. Eine adaptive Anpassung an Situationen mit vermehrtem oxidativem Stress wäre denkbar, da im längeren postoperativen Verlauf eine Reduktion des erhöhten MDA-Spiegels beobachtet wird (PRZEKWAS et al 2003) bzw. die Parameter abhängig von der Nierenfunktion posttransplant gemessen werden (CRISTOL et al 1998, YILMAZ et al 2006). Die eigene Studie detektiert zumindest keine statistisch relevante Modulation der Parameter im Langzeitverlauf. Abschließend stellt sich die Frage, ob es Faktoren gibt, die die erhöhte Lipidperoxidation limitieren und dadurch günstigen Einfluß auf den klinischen Verlauf nehmen können. Es gibt postive Ansätze für Nifedipin (CHANDER and CHOPRA 2005), Carvedilol (PADI and CHOPRA 2002) oder Coenzym Q 10 als Radikalfänger (DLUGOSZ et al 2004) bei Nierentransplantierten die Lipidperoxidation betreffend.

60

5.2 Diskussion der Comet-Ergebnisse Der signifikante Unterschied der Grundschäden und oxidativen Schäden zwischen Probanden und Patienten erklärt sich möglicherweise durch eine herabgesetzte DNA-Reparatur der Patienten. Genomschäden werden bereits in einer Studie von STOPPER et al 1999 durch die Evaluation von Micronuklei in peripheren Lymphocyten bei chronisch Niereninsuffizienten und Dialysepatienten in signifikant stärkerem Ausmaß gefunden. Eine herabgesetzte DNA-Reparatur bei Dialysepatienten wird in zahlreichen Artikeln beschrieben (MALACHI et al 1991, VAMVAKAS et al 1996), wobei eine Erholung zumindest teilweise in den ersten Monaten nach Aufnahme eines Dialyseverfahrens beobachtet wird. Die Ursache besteht möglicherweise in der Elimination von Urämieprodukten. Es folgt dann jedoch im weiteren Verlauf eine Reduktion der Reparatur durch Urämie, Bioinkompatibilität, Malnutrition und sekundären Hyperparathyroidismus, also Faktoren, die mit einer Langzeitdialyse assoziiert sind (VAMVAKAS et al 1996). Eine Korrelation zwischen der Schwere der renalen Insuffizienz (Kreatininwert) und der Schadenshöhe im Comet-Assay ist dokumentiert (STOPPER et al 2001). Die reduzierte DNA-Reparatur und der erhöhte chromosomale Schaden können ursächlich mit der Urämie und erhöhter ROS-Produktion bei gleichzeitig reduziertem Antioxidantienstatus verbunden sein. Eine erhöhte spontane ROS-Produktion bei Niereninsuffizienten und Dialysepatienten ist ebenso belegt (HIMMELFARB et al 1991) wie die Verstärkung des oxidativen Stress durch weitere Erkrankungen bei chronischer Niereninsuffizienz wie Hypertonus, Diabetes mellitus oder Autoimmunprozesse (VAZIRI 2004).

61

Mit der Nierentransplantation assoziierter erhöhter oxidativer Stress und verminderte antioxidative Abwehr sind dokumentiert (CRISTOL et al 1998, CAMPISE et al 2003), allerdings ohne zeitliche Zuordnung im Verlauf der Transplantation. Die eigene Studie zeigt signifikant höhere Grundschäden und oxidative Schäden im Kurzzeitverlauf (2-5 Tage) nach der Transplantation und deckt sich damit teilweise mit den Ergebnissen der Vorgängerstudie von MÜLLER (2003), der signifikant höhere direkte DNA-Schäden der Transplantationspatienten im Vergleich zu Patienten vor der Transplantation und gesunden Probanden findet. Allerdings fehlt auch bei dieser Studie die zeitliche Zuordnung der erzielten Werte im Verlauf nach der Transplantation. Die eigenen Ergebnisse werden bestätigt durch eine Studie von PRZEKWAS et al (2003), die erhöhte Parameter für oxidativen Stress (MDA, 4HNE und Carbonylgruppen) einen Tag nach der Transplantation beschreibt, die sich bis zum Tag 7 post transplantationem normalisieren. SIMMONS et al bestätigen auch für weitere Parameter von oxidativem Stress (Proteincarbonyle, F2-Isoprostane) ein schnelles und signifikantes Absinken nach der Transplantation (SIMMONS et al 2005). Es stellt sich die Frage nach den Gründen für die oxidative Belastung im Kurzzeitverlauf. Auslöser für oxidative Mechanismen in dieser frühen Phase könnten die Spenderhypotonie, kalte und warme Ischämiezeit und die Konservierungslösung sein. KOSIERADZKI et al zeigen, dass Schäden durch freie Radikale beim Donor und während der Konservierung mit der Nierenfunktion im Langzeitverlauf nach der Transplantation korrelieren (KOSIERADZKI et al 2003). Experimentelle Studien kommen allerdings zu dem Ergebnis, dass DNASchädigungen, die zu einer erhöhten DNA-Migration im Comet-Assay füh62

ren, oft nur für kurze Zeit persistieren (HARTMANN et al 1995) und möglicherweise die Resultate des Comet-Assay durch relativ schnell einsetzende Reparaturmechanismen beeinflusst werden. Die Dauer der warmen Ischämiezeit erhöht den oxidativen Stress (MDA und Protein-Carbonylgruppen) messbar, laut einer Studie von AKBULUT et al (2002) (experimentelles Modell mit Wislar Albino-Ratten). Eine verlängerte warme Ischämiezeit erhöht den Reperfusionsschaden und oxidativen Stress im Transplantat, d.h. wäre als verursachendes Prinzip für frühe toxische Effekte durch ROS denkbar. CAMPISE et al (2003) beschreiben eine Erhöhung der antioxidativen Abwehrmechanismen in einer Follow-up-Studie bis 6 Monate nach der Transplantation. Ebenfalls ist nach erfolgreicher NTX eine Verbesserung der antioxidativen Kapazität, nicht jedoch deren Normalisierung, und eine Verminderung der Lipidperoxidation beschrieben (SIMIC-OGRIZOVIC et al 1998). Dadurch erklärt sich möglicherweise die Verringerung der Grundschäden im Langzeitverlauf nach einem Jahr in unserer Studie. Ein weiterer Ansatzpunkt zur Erklärung der erzielten signifikant niedrigeren Grundschäden im Langzeitverlauf nach der Transplantation, verglichen mit dem Stadium der chronischen Niereninsuffizienz vor der Transplantation, könnte die einsetzende Detoxifikationsfunktion der transplantierten Niere sein. Die Nierentranplantation wird als die einzig effektive Methode zur Reduktion der AGEs (advanced glycation end products) als Initiatoren von oxidativem Stress auf Carbonylebene beschrieben (SLOWIK-ZYLKA 2004). Die Detoxifikationsfunktion im Hinblick auf die Reduktion von Markern des oxidativen Stress wird auch gestützt durch eine Studie von ANTOLINI et al 2005, die ähnliche Parameter des Carbonylstress bei Gesunden und Nierentransplantierten beschreibt. Eine Verbesserung der Grundschäden ist möglicherweise auch durch gewisse Adaptionsmechanismen in Situationen von längerfristiger Belastung durch oxidativen Stress gegeben. CALO et al zeigen in einer Studie eine 63

up-Regulation des NO-Systems unter Cyclosporinmedikation nach Nierentransplantation als Gegenregulation zur cyclosporininduzierten Vasokonstriktion (CALO et al 2000). Weitere Adaptionsmechanismen den GSH-Status betreffend, werden in einer Studie gefunden, die verschiedene Nierenersatzverfahren bei chronisch Niereninsuffizienten untersucht (LUCCHI et al 2005). Der Einfluß der jeweiligen Immunsuppression auf Marker oxidativer Vorgänge wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Einzelne Parameter scheinen durch die Immunsuppression beeinflusst zu werden, wie z.B. die antioxidativ wirkende Glutathionperoxidase, deren Aktivität sich unter Azathioprin erhöht (MC GRATH et al 1997). Die gleiche Studie ergibt dagegen für SOD und Glutathionperoxidase keinen Unterschied zwischen Azathioprin und Cyclosporin. Eine weitere Studie zeigt eine vergleichbare Einflussnahme von Cyclosporin und Tacrolimus auf Parameter des oxidativen Stress. Untersucht werden eNOS, mRNA, Transforming growth factor-beta (TGF-beta) und Monocyten p22 (eine NADH/NADPH-Untergruppe), die im Vergleich zu Gesunden erhöht sind, ohne Unterschied zwischen beiden Calcineurininhibitoren (CALO et al 2002). Zu ähnlichen Ergebnissen führt die Studie von MORENO et al (2005) bei anderen Untersuchungsparametern (SOD, MDA, Glutathionperoxidase, Katalase, Glutathionreduktase). In einer Studie von TRAPP und WEIS (2005) zeigen HMEC-1- Zellen (human microvascular endothelial cells) erhöhte Parameter für oxidativen Stress unter Cyclosporin, Mycophenolsäure und Rapamycin während Methylprednisolon und Tacrolimus die gleichen Parameter reduzieren Die eigene Studie zeigt sowohl bei den DNA-Schäden im Comet-Assay als auch bei den Parametern der Lipidperoxidation Hinweise für erhöhten oxidativen Stress der Nierentransplantierten gegenüber Gesunden und bestätigt damit die Literaturangaben. Bei individuellen Variationen der einzelnen Patienten wird jedoch auf eine Subgruppenanalyse nach den einzelnen Immunsuppressiva verzichtet, da die Subgruppen teilweise zu klein

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sind und nach der momentan vorliegenden Literatur hier keine weiteren Unterschiede zu erwarten sind. Durch seine einfache Durchführung und Sensitivität hat der Comet-Assay eine hohe Akzeptanz als Genotoxizitäts-Assay. Methodologische Parameter, wie Konzentration der LMA, Zusammensetzung des Lysepuffer, Bedingungen der Alkalibehandlung zur DNAEntwindung Bedingungen der Elektrophorese, Färbemethode und Auszählmethode, beeinflussen jedoch die Resultate. Problematisch bei der Interpretation der Ergebnisse sind mögliche Einflußfaktoren, wie akute Infektionen, Zeit der Blutentnahme, körperliche Aktivität, interindividuelle oder saisonale Variationen. Darüberhinaus detektiert der Comet-Assay ein großes Spektrum an DNASchäden wie Strangbrüche, oxidative DNA-Schäden und Schäden durch Alkylierungen, teilweise ausgelöst durch Genotoxine mit unbekanntem Aktionsmodus, die nicht als oxidative Schäden angesehen werden sollten. Die Schwierigkeiten bei der Interpretation macht deshalb die Kombination mit einem weiteren Parameter für oxidativen Stress (MDA) sinnvoll. In der vorliegenden Studie wird der Comet-Assay gemäß den Richtlinien der Expertenkommission (International Workshop on Genotoxicity Test Procedures Washington DC 1999) angewandt, welche als optimale Version des Genotoxizitätstest die alkalische Version (pH>13) empfiehlt (TICE et al 2000). Ein Problem des Comet-Assay bleibt dennoch die Standardisierung der Untersuchungsbedingungen und die Qualitätskontrolle. Studien hierüber finden eine große Variabilität der Resultate und teilweise auch eine große Variabilität der Ergebnisse der gleichen Proben durch den gleichen Untersucher zu verschiedenen Untersuchungszeitpunkten (COLLINS et al 1997). In der eigenen Studie wird eine regelmäßige interne Qualitätskontrolle und repetitive Messung der gleichen Probandenprobe durchgeführt. Kritisch muss allerdings gesehen werden, dass eine Verblindung der Proben oder regelmäßige Kontrollmessungen durch externe Untersucher fehlen.

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Bei der Beurteilung der Comet-Messungen und dem Vergleich mit Untersuchungsergebnissen anderer Autoren ist unbedingt die angewandte Methodik zu berücksichtigen und in die Interpretation mit einzubeziehen. Ein weiterer Diskussionspunkt ist die Heterogenität der zuerst gebildeteten Patientengruppe (Einzelwertbestimmungen). Da verschiedene Patienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transplantation untersucht werden, ist eine Vielzahl von Einflußfaktoren denkbar, die sich möglicherweise in den Ergebnissen des Comet-Assay auswirken, wie Begleiterkrankungen oder Komedikationen. Um diese Heterogenität zu minimieren, wird ein weiteres Kollektiv gebildet, bei dem der gleiche Patient im Verlauf zu jeweils definierten Zeitpunkten nach der Transplantation untersucht wird, mit dem Ziel , die patientenspezifischen Einflüsse überschaubarer zu machen. Die erzielten Ergebnisse in beiden Gruppen sind vergleichbar. Möglicherweise entwickelt nur ein Teil der Nierentransplantierten bestimmte Formen von oxidativem Stress oder wechselt zwischen Phasen mit niedrigem und hohem oxidativen Stress, was auch die Diskrepanz der Langzeitergebnisse von MDA und Comet-Assay erklären könnte. Als Konsequenz der Comet-Ergebnisse stellt sich die Frage, ob die Reduktion des oxidativen Stress in der Frühphase nach der Transplantation einen klinischen Benefit bezüglich der Tranplantatfunktion und Überlebensdauer des Transplantates bedeuten könnte. Als therapeutische Intervention in der Frühphase nach der Transplantation denkbar wäre die Verabreichung von Antioxidantien wie N-Acetyl-Cystein, Selen, Vitamin C und E. Die Studienlage hierzu ist kontrovers, eine Studie der Heart Protection Study Collaborative Group erbringt keine positiven Effekte der regelmäßigen Vitamineinnahme (VAUGHAN et al 2002). Eine neuere Studie von JEON et al zeigt protektive Effekte von Vitamin E gegen die Cyclosporininduzierte ROS-Produktion, allerdings im Zellmodell (Madin-Darby canine kidney cells). Die gleiche Studie hat als weiteres Ergebnis, dass Glukocorticoide Marker des oxidativen Stress reduzieren. Der Mechanismus hierfür ist unbekannt. (JEON et al 2005). 66

Weitere protektive Effekte werden von CHANDER und CHOPRA für den Calciumkanalblocker Nifedipin nachgewiesen, der Marker des oxidativen Stress (MDA, reduziertes Glutathion, Katalase und Superoxiddismutase) nach Cyclosporinbehandlung reduzierte, allerdings im Rattenmodell (CHANDER et al 2005). GOTTMANN et al finden eine Verbesserung des antioxidativen Status nach der Behandlung mit Carvedilol, BM 91.0228 (ein Derivat von Carvedilol mit antioxidativen Eigenschaften) und Alpha-Tocopherol im Rattenmodell (GOTTMANN et al 2003).

5.3 Fazit und Ausblick Die eigene Studie gibt Hinweise auf die Induktion von chronischem oxidativem Stress post transplantationem, mit den transplantationassoziierten Folgen wie reduzierter DNA-Reparatur, chromosomalen Schäden oder Malignomentstehung. Der Langzeitverlauf zeigt, dass der oxidative Status Gesunder auch nach einer erfolgreichen Nierentransplantation nicht wieder erreicht wird und deckt sich mit den Ergebnissen anderer Autoren (Mc GRATH et al 1997,CRISTOL et al 1998). Allerdings ist zumindest in Teilbereichen, wie der Reduktion der Grundschäden ein Jahr post transplantationem, ein gewisser Erholungseffekt zu beobachten. Sowohl die Dialyse als auch die Nierentransplantation können die hochkomplexen Leistungen der gesunden Niere nur unvollständig ersetzen, haben eigene Risiken und teilweise nicht vorhersehbare pathophysiologische Langzeiteffekte. Therapeutische Ansätze, wie z.B. Antioxidantien zur Minimierung von oxidativem Stress sind spärlich und ohne eindeutig positiven Effekt.

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Derzeit noch visionär erscheinen neue Methoden des Tissue engineering, die im Tiermodell z.B. durch Stammzellen Reparaturmechanismen nach Ischämie-Reperfusion im Nierenparenchym zeigen (DEKEL et al 2006) oder die Weiterentwicklung der bioartefiziellen Niere für den klinischen Gebrauch. Ob dadurch das Risiko oxidativer Effekte verringert wird, bleibt abzuwarten.

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84

Wei YH Oxidative stress and mitochondrial DNA mutations in human aging Proc Soc Exp Biol Med 217(1): 53-63, 1998 Weinstein T, Chagnac A, Korzets A, Boaz M, Ori Y, Herman M, Malachi T, Gafter U Haemolysis in haemodialysis patients; evidence for impaired defence mechanisms against oxidative stress Nephrol Dial Transplant 15: 883-887, 2000 Westhuyzen J, Adams CE, Fleming SJ Evidence for oxidative stress during in vitro dialysis Nephron 70(1): 49-54, 1995 Yeo HC, Helbock HJ, Chyu DW, Ames BN Assay of malondialdehyde in biological fluids by gas chromatographymass spectrometry Anal Biochem 220: 391-396, 1994 Yilmaz MI, Saglam M, Caglar K, Cakir E, Sonmez A, Ozgurtas T, Aydin A, Eyileten T, Ozcan O, Acikel C, Tasar M, Genctoy G, Erbil K, Vural A, Zoccali C The determinants of endothelial dysfunction in CKD: oxidative stress and asymmetric dimethylarginine Am J Kidney Dis 47(1): 42-50, 2006

85

7.Anhang 7.1 Geräte Wasserbad (Julabo) Zentrifuge Minifuge (Heraeus) Digitalwaage (Sartorius) Kolbenhubpipetten (Eppendorf, Gilson) Multipette (Eppendorf) Biofreezer Herafreeze (Heraeus) Zeiss Axioskop 20, Filter Set 15 (Anregung: BPersVG 546/12; Emission: LP 590) Comet II (Perspective Instruments, Suffolk, England) Elektrophoresekammer für horizontale Gelelektrophorese (Sub Cell GT Biorad) HPLC-Anlage (Jasco), bestehend aus PU 1580, DG 1580-53, LG 158002, FP 1520, UV 1575, AS 1550 Thermomixer Comfort (Eppendorf) Magnetrührer (Heidolph) Mikrowelle (Sharp) Photometer / Multiplatereader (MWG Sirius HAT) 86

7.2 Verbrauchsmaterialien EDTA-Monovetten und Kanülen steril (Sarstedt) Objektträger einseitig ganz mattiert 26 x 76 x 1,0 mm (Menzel) Deckgläser 24 x 24 mm (Menzel) LichroSpher 100 (5µm) RP-18 250mm x 4mm Reaktionsgefäße 15ml, 1,5ml, 2ml (Greiner) 96 well Platte schwarz (Nunc A/S, Denmark)

7.3 Materialien, Lösungen Butanol (Merck) Dimethylsulfoxid für UV-Spektroskopie (DMSO) (Fluka) Dinatriumhydrogenphosphat p.A. (Merck) EDTA p.A. (Severa) Ethanol (Roth) Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich) FPG (Formamidopyrimidin-DNA-Glycosylase) (Dr. A.R. Collins, Rowett Res. Inst.; Aberdeen, Scotland, UK) Histopaque (Sigma) 87

Kaliumchlorid p.A. (Merck) Kaliumhydrogenphosphat p.A. (Merck) Low Melting Point Agarose (Biomme) Malondialdehyd-Bestimmungs-Kit (Sobioda) Methanol zur HPLC (Merck) Natriumchlorid p.A. (Roth) Natriumhydroxid p.A. (Riedel de Haen) Normal Melting Point Agarose (Roth) Salzsäure (Roth) t-Butylhydroxytoluol (Sigma-Aldrich) TRIS (Roth) Triton-X-100 (Sigma-Aldrich)

88

7.4 Statistische Auswertung:

Gruppe Comet alle Werte: Probanden vs. vor NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. vor NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 2-5 Tage nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 2-5 Tage nach NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 1 Jahr nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 1 Jahr nach NTX mit FPG:

signifikant

vor NTX vs. 2-5 Tage nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

(bei α=0,2 zweiseitig: signifikant) vor NTX vs. 2-5 Tage nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

(bei α=0,2 zweiseitig: signifikant) vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

vor NTX vs. 1 Jahr nach NTX ohne FPG:

signifikant

vor NTX vs. 1 Jahr nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

2-5 Tage vs. 2 Wochen nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

2-5 Tage vs. 2 Wochen nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

2-5 Tage vs. 2 Monate nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

2-5 Tage vs. 2 Monate nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

2-5 Tage vs. 1 Jahr nach NTX ohne FPG:

signifikant

2-5 Tage vs. 1 Jahr nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 1 Jahr nach NTX ohne FPG: 2 Wochen vs. 1 Jahr nach NTX mit FPG:

signifikant nicht signifikant 89

2 Monate vs. 1 Jahr nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

(bei α=0,2 und zweiseitiger Fragestellung: signifikant) 2 Monate vs. 1 Jahr nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

Gruppe Comet nur 1-Jahreswerte: Probanden vs. 1-Jahreswerte ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 1 Jahreswerte mit FPG:

signifikant

jeweils unverbundener Wilcoxon-Test (Mann-Whitney U-Test) bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

Gruppe Comet Individualverläufe bis 1 Jahr nach NTX: Probanden vs. vor NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. vor NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 2-5 Tage nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 2-5 Tage nach NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 1 Jahr nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 1 Jahr nach NTX mit FPG:

signifikant

jeweils unverbundener Wilcoxon-Test (Mann-Whitney U-Test) bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant 90

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

vor NTX vs. 1 Jahr nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

vor NTX vs. 1 Jahr nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 1 Jahr nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 1 Jahr nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

2 Monate vs. 1 Jahr nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

2 Monate vs. 1 Jahr nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

jeweils verbundener Wilcoxon-Test bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau * bei 2-5 Tage nach NTX kein Test möglich, da n zu klein

Gruppe Comet Individualverläufe bis 2 Monate nach NTX: Probanden vs. vor NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. vor NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX mit FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX ohne FPG:

signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX mit FPG:

signifikant

jeweils unverbundener Wilcoxon-Test (Mann-Whitney U-Test) bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX ohne FPG:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX mit FPG:

nicht signifikant

jeweils verbundener Wilcoxon-Test 91

bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

Gruppe MDA alle Werte Multiplatereader Probanden vs. vor NTX:

nicht signifikant

(bei α=0,10 signifikant) Probanden vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

(bei α=0,20 signifikant) Probanden vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

(bei α=0,20 signifikant) Probanden vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

(bei α=0,20 signifikant) vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

2 Monate vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

jeweils unverbundener Wilcoxon-Test (Mann-Whitney U-Test) bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

Gruppe MDA alle Werte HPLC Probanden vs. vor NTX:

signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

(bei α=0,20 signifikant) Probanden vs. 1 Jahr nach NTX:

signifikant

vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant 92

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

(bei α=0,20 signifikant) 2 Monate vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

jeweils unverbundener Wilcoxon-Test (Mann-Whitney U-Test) bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

Gruppe MDA bis 1 Jahr nach NTX Multiplatereader Probanden vs. vor NTX:

nicht signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

(bei α=0,20 signifikant) Probanden vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

(bei α=0,20 signifikant) jeweils unverbundener Wilcoxon-Test (Mann-Whitney U-Test) bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

Gruppe MDA bis 1 Jahr nach NTX HPLC Probanden vs. vor NTX:

nicht signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

Probanden vs. 1 Jahr nach NTX:

signifikant

jeweils unverbundener Wilcoxon-Test (Mann-Whitney U-Test) bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

93

Gruppe MDA bis 1 Jahr nach NTX Multiplatereader vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

2 Monate vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

jeweils verbundener Wilcoxon-Test bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

Gruppe MDA bis 1 Jahr nach NTX HPLC vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

2 Monate vs. 1 Jahr nach NTX:

nicht signifikant

jeweils verbundener Wilcoxon-Test bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

Gruppe MDA bis 2 Monate nach NTX Multiplatereader Probanden vs. vor NTX:

signifikant

Probanden vs. 2 Wochen nach NTX:

signifikant

Probanden vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

jeweils unverbundener Wilcoxon-Test (Mann-Whitney U-Test) bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau 94

Gruppe MDA bis 2 Monate nach NTX HPLC Probanden vs. vor NTX: Probanden vs. 2 Wochen nach NTX:

signifikant nicht signifikant

(bei α=0,20 signifikant) Probanden vs. 2 Monate nach NTX:

signifikant

jeweils unverbundener Wilcoxon-Test (Mann-Whitney U-Test) bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

Gruppe MDA bis 2 Monate nach NTX Multiplatereader vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX:

signifikant

jeweils verbundener Wilcoxon-Test bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

Gruppe MDA bis 2 Monate nach NTX HPLC vor NTX vs. 2 Wochen nach NTX:

nicht signifikant

vor NTX vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

2 Wochen vs. 2 Monate nach NTX:

nicht signifikant

jeweils verbundener Wilcoxon-Test bei zweiseitiger Fragestellung auf 5% Signifikanzniveau

95

Danken möchte ich Herrn Prof. Dr. F. W. Albert und Frau Dr. U. Albert für die Bereitstellung des Themas und der Unterstützung, die zum Gelingen des Dissertationsvorhabens beigetragen hat. Herrn Prof. Dr. G. Eisenbrand und allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Fachrichtung Lebensmittelchemie und Umwelttoxikologie der Technischen Universität Kaiserslautern für die Aufnahme ins Team, sowie Frau Dr. C. Janzowski für Anregungen und Diskussionen. Besonderer Dank gilt Frau Tamara Weisel und Sylvia Schmidt für die Hilfe bei zahlreichen technisch-praktischen Fragen. Den Schwestern und Pflegern der Abteilungen Transplantationsmedizin und Nephrologische Ambulanz des Westpfalz-Klinikums Kaiserslautern für die vorbildliche und zuverlässige Zusammenarbeit, ohne die diese Studie nicht möglich gewesen wäre. Meiner gesamten Familie für die Geduld und tatkräftige Unterstützung.

96

Lebenslauf Name

Claudia Martin

Geburtsdatum

24. April 1967

Geburtsort

Pirmasens

Wohnort

Lortzingstrasse 11 66955 Pirmasens

Familienstand

Verheiratet, 2 Söhne

Schulbildung

Allgemeine Hochschulreife (1986)

Berufsausbildung

1986 bis 1989 Ausbildung als Arzthelferin Sankt-Elisabeth-Krankenhaus in Rodalben

Hochschulstudium Studium der Humanmedizin 1989 bis 1990 Ruhr-Universität Bochum ab 1990 Universität des Saarlandes in Homburg März 1992 Ärztliche Vorprüfung April 1993 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung September 1995 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Oktober 1995 bis Oktober 1996 Praktisches Jahr an der Universität des Saarlandes in Homburg 30. Oktober 1996 Drittes Staatsexamen Arbeitgeber

Dezember 1996 bis April 1998 Gemeinschaftspraxis Dres. Krämer/Walker/Lessenich Internist, Nephrologe, Gastroenterologe in Pirmasens April 1998 bis Dezember 1998 SHG Klinik in Völklingen Innere Medizin III (Nephrologie und Dialyse) seit Januar 1999 Städtisches Krankenhaus in Pirmasens Innere Medizin August 2002 bis September 2005 Elternzeit seit September 2005 Städtisches Krankenhaus in Pirmasens Innere Medizin/Kardiologie Juni 1998 Approbation als Ärztin

97