Mitochondrien und oxidativer Stress in nozizeptiven Prozessen
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt im
Lehrstuhl für Tierphysiologie
vorgelegt von
Ben Novak
aus
Lüdenscheid
Bochum Februar, 2011
Mitochondria and oxidative stress in nociceptive processes
Dissertation to obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr.rer.nat.) at the Faculty of Biology and Biotechnology Ruhr-University Bochum
International Graduate School of Biosciences Ruhr-University Bochum Department of Animal Physiology
submitted by
Ben Novak
from
Lüdenscheid, Germany
Bochum February 2011
Referent: Prof. Dr. H. Lübbert Korreferent: Prof. Dr. S. Wiese
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... IV Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen ......................................................... VII
1. Einleitung ............................................................................................................... 1 1.1 Oxidativer Stress und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) .............................................. 1 1.2 Experimentelle und therapeutische Erzeugung von ROS in Zellen ............................... 3 1.3 Photodynamische Therapie: Mechanismen und Herausforderungen ............................ 5 1.4 Photodynamische Therapie und Schmerz .................................................................. 10 1.5 Molekulare und zelluläre Mechanismen der Nozizeption ............................................ 12 1.6 Mitochondrien, ROS und Kalzium in der Physiologie und Pathophysiologie des peripheren Nervensystems............................................................................................... 14 1.7 DRG Neurone in Zellkultur als pharmakologisches und zellbiologisches Modellsystem für nozizeptive Mechanismen ........................................................................................... 16 1.8 Zielsetzung der Doktorarbeit....................................................................................... 17
2. Material und Methoden ....................................................................................... 19 2.1 Material ...................................................................................................................... 19 2.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung ............................................................................. 19 2.1.2 Zelllinien............................................................................................................... 19 2.1.3 Laborchemikalien, Reagenzien, Puffer und Medien ............................................. 19 2.1.4 Laborgeräte ......................................................................................................... 26 2.1.5 Antikörper und Oligonukleotide ............................................................................ 26 2.2 Methoden ................................................................................................................... 27 2.2.1 Anlegen der Primärkulturen aus dem Hinterwurzelganglion der Ratte .................. 27 2.2.2 Kultivierung von HaCaT-Zellen............................................................................. 28 2.2.3 Immunzytochemische Färbungen......................................................................... 29 2.2.4 Aufnahme von 5-ALA und MAL ............................................................................ 30 2.2.5 Aufnahme von 5-ALA und MAL in Gegenwart von Inhibitoren .............................. 31 2.2.6 Analyse der PpIX-Synthese.................................................................................. 31 2.2.6.1 Mikroskopische Analyse der PpIX-Bildung .................................................... 31 2.2.6.2 Analyse der PpIX-Bildung im Fluorimeter ...................................................... 32 2.2.7 Photodynamische Behandlung in vitro ................................................................. 33 2.2.8 Analyse der PDT-vermittelten Zellschädigung ...................................................... 34 2.2.8.1 Analyse der Zellmorphologie und Videomikroskopie...................................... 34 2.2.8.2 Analyse des mitochondrialen Membranpotentials mit dem Farbstoff JC-1 ..... 34 2.2.8.3 Analyse der mitochondrialen Enzymfunktion (MTS-Test)............................... 35 2.2.8.4 Bestimmung des zellulären Energiehaushalts durch ATP-Messung .............. 36 2.2.8.5 Morphometrie der neuronalen Fortsätze ........................................................ 36 2.2.8.6 Bestimmung der potentiell apoptotischen Zellpopulation ............................... 37 2.2.8.7 Bestimmung der potentiell nekrotischen Zellpopulation ................................. 38 2.2.9 Analyse der PDT-induzierten neuronalen Aktivität ............................................... 38
I
Inhaltsverzeichnis 2.2.9.1 Kalzium-Mikrofluorimetrie mit dem ratiometrischen Farbstoff Fura-2/AM (calcium imaging) ...................................................................................................... 38 2.2.9.2 Kombination des calcium imaging mit der in vitro PDT .................................. 39 2.2.10 Analyse der Genexpression mittels RT-PCR ...................................................... 41 2.2.11 Analyse der ATP-Freisetzung aus Keratinozyten ............................................... 42 2.2.12 Analyse der Zellvitalität mit Fluorescein Diazetat (FDA) ..................................... 42 2.2.13 Computergestützte Auswertung ......................................................................... 43 2.2.14 Statistische Auswertung und Formeln ................................................................ 43
3. Ergebnisse ........................................................................................................... 44 3.1 Charakterisierung des Testsystems............................................................................ 44 3.2 5-ALA und MAL induzierte PpIX-Fluoreszenz in DRG Neuronen ................................ 45 3.2.1 Mikroskopischer Nachweis................................................................................... 45 3.2.2 Analyse der PpIX-Bildung im Fluoreszenz-Multiplate Lesegerät .......................... 49 3.3 Analyse des Aufnahmewegs von 5-ALA und MAL in kultivierte DRG Neurone ........... 53 3.3.1 Einfluss des Kulturmediums und der Aminosäuren auf die Aufnahme.................. 54 3.3.2 Einfluss der Substrate und Blocker von GABA-Transportern auf die Aufnahme ... 58 3.3.3 Additiver Effekt von Arginin und β-Alanin, sowie die Bedeutung extrazellulärer Esterasen ..................................................................................................................... 63 3.4 Expression der GABA-Transporter mRNA in DRG-Zellkulturen .................................. 65 3.5 Analyse der durch photodynamische Behandlung vermittelten Zellschädigung .......... 67 3.5.1 Neuronale Morphologie nach der in vitro PDT ...................................................... 67 3.5.2 Mitochondriales Membranpotential (∆ΨM) nach der in vitro PDT .......................... 70 3.5.3 Mitochondriale Enzymaktivität und zellulärer Energiehaushalt nach der in vitro PDT ..................................................................................................................................... 71 3.5.4 Formen des Zelltods nach der in vitro PDT .......................................................... 77 3.5.4.1 Apoptose ....................................................................................................... 77 3.5.4.2 Nekrose ......................................................................................................... 81 3.5.5 Neuritendegeneration........................................................................................... 84 3.6 Analyse der PDT-vermittelten zellulären Aktivität ....................................................... 86 3.6.1 ROS-vermittelte Veränderungen des intrazellulären Kalziums in sensorischen Neuronen ...................................................................................................................... 87 3.6.2 PDT-induzierte Sekretion von ATP aus epidermalen Zellen ................................. 91
4. Diskussion ........................................................................................................... 94 4.1 Kritische Evaluation des gewählten Testsystems ....................................................... 95 4.2 Aufnahme von 5-ALA und MAL durch Neurone .......................................................... 96 4.3 Auswirkung der in vitro PDT auf kultivierte sensorische Neurone des Hinterwurzelganglions .................................................................................................... 104 4.3.1 Mitochondriale Funktion ..................................................................................... 105 4.3.2 Zelltod nach der PDT ......................................................................................... 108 4.3.3 Neuronale Aktivierung ........................................................................................ 112 4.4 PDT und Zell-Zell-Kommunikation ............................................................................ 118 4.5 Übertragbarkeit auf die klinische Situation ................................................................ 120 4.6 Schlussbetrachtung und Ausblick ............................................................................. 122
5. Zusammenfassung ............................................................................................ 125 6. Summary ............................................................................................................ 128 II
Inhaltsverzeichnis 7. Literatur .............................................................................................................. 130 Danksagung ........................................................................................................... 143 Lebenslauf und Veröffentlichungen .................................................................... 144 Erklärung................................................................................................................ 146
III
Abkürzungsverzeichnis µ 5-ALA 5-HT A A. dest Abb. AIF AK ANOVA ATP BNPP bp c Casp-3 CGRP cl CytC ∆ DAB div DMEM DMSO DNA DRG ∆ΨM
Mikro δ-Aminolevulinsäure 5-Hydroxytryptamin; Serotonin Ampere destilliertes Wasser Abbildung Apoptose induzierender Faktor Aktinische Keratose Varianzanalyse Adenosintriphosphat (bis-[p-Nitrophenyl] phosphat) Basenpaare Zenti Caspase-3 calcitonin gene related peptide gespalten Cytochrom C Differenz 3,3'-Diaminobenzidintertrahydrochloriddihydrat Tage in Kultur Dulbecco's Modified Eagle Medium Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Hinterwurzelganglion mitochondriales Membranpotential
EC50
excitatory concentration 50%
EDTA EGTA ER F12 FACS FCCP FCS FDA g GABA GAT GDP h HEPES IB4
Ethylendiaminteratacetat Ethylenglycoltetraacetat Endoplasmatisches Retikulum Nährstoffmixtur Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung Carbonyl-Cyanid 4-(Trifluoromethoxy)phenylhydrazon Fötales Kälberserum Fluorescein-Diazetat Gramm, kursiv: Erdbeschleunigung γ-Aminobuttersäure GABA Transporter Guanosindiphosphat Stunde 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure Isolectin B4
IC50
inhibitory concentration 50%
J
ICC J JC-1
K
Ki / pKi
Immunzytochemie Joule 5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'tetraethylbenzimidazolylcarbocyanin Iodid Dissoziationskonstante / -log Ki
A
B C
D
E
F
G
H I
IV
Abkürzungsverzeichnis L M
l L-Arg m M MAL min mPTP mRNA MTS
N
P
R
S
T
n NaC NADH NET NGF NHEK NHS NO p PB PBS PDT PEPT PFA Phase PI PNS PpIX R² RFU Rhod-123 RLU RNA ROI ROS rpm RT RT-PCR s SEM SOD Stabw. Tab. TBS Thaps. TrkA TRP
Liter L-Arginin Milli, Meter oder Steigung einer Geraden molar (mol/l) Methy-Aminolevulinsäure Minute mitochondriale Permeabilitätstransitionspore messenger RNA [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 5-(3carboxymethonyphenol)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium, inneres Salz] Nano oder Stichprobenumfang N-acetyl-L-Cystein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid neuropathy target esterase nerve growth factor normale humane epidermaler Keratinozyten normales Pferdeserum Stickstoffmonoxid Pico Phosphatpuffer Phosphat gepufferte Saline Photodynamische Therapie Peptid-Transporter Paraformaldehyd Phasenkontrast Propidiumiodid Peripheres Nervensystem Protoporphyrin IX Bestimmtheitsmaß relative Fluoreszenzeinheiten Rhodamine-123 relative Lumineszenzeinheiten Ribonukleinsäure region of interest reaktive Sauerstoffspezies Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur reverse Transkriptase PCR Sekunde Standardfehler des Mittelwerts Superoxiddismutase Standardabweichung Tabelle Tris gepufferte Saline Thapsigargin neurotrophic tyrosine kinase receptor type 1 transient receptor potential V
Abkürzungsverzeichnis
U V
W X Y Z
TTX UTP V v/v VE VGCC VGSC vs. W w/v x Ψ ZNS
Tetrodotoxin Uridintriphosphat Vehikel oder Volt Volumenprozent voll entsalzt spannungsgesteuerter Kalziumkanal spannungsgesteuerter Natriumkanal gegen Watt Gewichtsprozent mal (Vielfaches) Membranpotential Zentrales Nervensystem
VI
Abbildungen und Tabellen Abbildungen Abbildung 1.1: Skizze des PpIX (Häm)-Syntheseweges.
7
Abbildung 1.2: Mechanismen der Kalziumregulation in sensorischen Neuronen.
14
Abbildung 2.1: Durchführung der 5-ALA und MAL Experimente.
30
Abbildung 2.2: Standard–Mess-Spur.
40
Abbildung 3.1: Charakterisierung des Zellkultur-Testsystems.
45
Abbildung 3.2: 5-ALA und MAL induzierte PpIX-Fluoreszenz in kultivierten DRG-Neuronen.
46
Abbildung 3.3: Konfokale Darstellung der 5-ALA induzierten Fluoreszenz, Metascan und mitochondriales Netzwerk in DRG Neuronen.
48
Abbildung 3.4: 5-ALA und MAL induzierte PpIX-Fluoreszenz in DRG Kulturen.
50
Abbildung 3.5: Zeitabhängigkeit der PpIX-Bildung aus 5-ALA und MAL.
52
Abbildung 3.6: Nichtlineare Fits zur PpIX-Bildung aus 5-ALA und MAL nach 2 h Synthese.
53
Abbildung 3.7: Einfluss von Aminosäuren auf die Aufnahme von 5-ALA und MAL in kultivierte DRG Neurone.
56
Abbildung 3.8: Einfluss von Arginin auf die PpIX-Bildung aus 5-ALA und MAL.
57
Abbildung 3.9: Einfluss von Substraten und Blockern der GABA-Transporter auf die PpIX-Bildung aus 5-ALA und MAL.
59
Abbildung 3.10: Pharmakologie der Inhibitoren Guvacine und (S)-SNAP-5114.
61
Abbildung 3.11: Additiver Effekt von L-Arginin und β-Alanin und Beteiligung
64
extrazellulärer Esterasen. Abbildung 3.12: Expression der mRNA der GABA-Transporter in DRG-Zellkulturen.
66
Abbildung 3.13: Einfluss der 5-ALA PDT auf die Zellmorphologie in den Neuronenkulturen.
68
Abbildung 3.14: Einfluss der 5-ALA PDT auf das mitochondriale Membranpotential in den Neuronenkulturen (JC-1 Assay).
70
Abbildung 3.15: Einfluss der PDT auf mitochondriale Enzymaktivität und zelluläre ATP-Produktion.
73
Abbildung 3.16: Korrelation der Parameter MTS-Signal und ATP-Gehalt
VII
Abbildungen und Tabellen mit der PpIX-Fluoreszenz.
75
Abbildung 3.17: Einfluss eines Antioxidans auf die mitochondriale Aktivität nach der PDT.
76
Abbildung 3.18: Immunzytochemischer Nachweis gespaltener Caspase-3 in den Neuronen aus DRG-Kulturen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der PDT.
78
Abbildung 3.19: Korrelation von Caspase-3 Expression und PpIX-Fluoreszenz.
80
Abbildung 3.20: Nekrotischer Zelltod in DRG-Neuronen eine Stunde nach 5-ALA PDT.
82
Abbildung 3.21: Einfluss der PDT auf die Neuritenlänge kultivierter sensorischer Neurone.
85
Abbildung 3.22: Beispielspuren der calcium imaging- Experimente.
88
Abbildung 3.23: Zusammenfassung der calcium imaging Experimente.
89
Abbildung 3.24: PDT-induzierte Abgabe von ATP aus epidermalen Zellen.
92
Abbildung 4.1: Skizze zu den Zelltodprozessen in kultivierten sensorischen Neuronen nach PDT.
112
Abbildung 4.2: Drei Möglichkeiten der Interaktion der PDT mit membranständigen Kanälen.
117
Abbildung 4.3: Mechanismus der Induktion von Nozizeption bei der PDT von Hauterkrankungen.
122
Tabellen Tabelle 1.1: Einige biologisch relevante ROS
2
Tabelle 1.2: Einige Studien zur zellulären 5-ALA- und MAL-Aufnahme
6
Tabelle 2.1: Laborchemikalien und Reagenzien
19
Tabelle 2.2: Liste der Laborgeräte
26
Tabelle 2.3: Liste der verwendeten Antikörper und Detektionsreagenzien
26
Tabelle 2.4: Liste der verwendeten Oligonukleotide für die PCR
27
Tabelle 2.5: Zelldichte der DRG-Neurone in verschiedenen Kulturgefäßen
28
Tabelle 3.1: Pharmakologische Parameter des 5-ALA- und MAL-Transports
63
Tabelle 3.2: Zusammenfassung der calcium imaging Ergebnisse
90
VIII
1. Einleitung 1. Einleitung 1.1 Oxidativer Stress und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Die Nutzung des Sauerstoffs (O2) als reaktionsfreudiges Oxidationsmittel ist das Schlüsselkonzept der Energiegewinnung auf zellulärer Ebene. Seit die ersten aeroben Mikroorganismen entstanden sind, ist die kontrollierte Übertragung von Elektronen aus den Nahrungsstoffen auf den Sauerstoff, und die damit verbundene Energiegewinnung auf zellulärer Ebene erhalten geblieben und optimiert worden. Stark vereinfacht ausgedrückt, werden die Nährstoffe der Zellen durch Sauerstoff oxidiert, während O2 selbst zu H2O reduziert wird. Dies ist das Prinzip der Verbrennung. Sauerstoff ist aufgrund seiner Reaktivität, d.h. der Tendenz, Elektronen an sich zu binden, ein potentiell hochtoxisches Gas. Er kann durch Oxidation Makromoleküle wie Proteine und DNA schädigen. Dennoch basiert ein Großteil des bekannten Lebens auf Sauerstoff-abhängigen Prozessen. Die Oxidationsprozesse müssen, um Gefährdungen zu entgehen und um maximalen Nutzen zu erhalten, kontrolliert und katalysiert ablaufen. Daher rührt auch die stufenweise und damit „sanfte“ Energieübertragung von Elektronen im Rahmen der Atmungskette, die in Eukaryoten in den Mitochondrien abläuft (Alberts et al. 2002; Thoms, SP 2005) Vom Sauerstoff als mächtige Energiequelle geht also eine ständige Gefahr für die Zelle aus. Diese wird dadurch maximiert, dass neben dem molekularen Sauerstoff (O2), der bereits ein reaktives
Molekül
ist,
im
Rahmen
des
Energiestoffwechsels
weitaus
reaktivere
Sauerstoffspezies entstehen können. Diese werden im englischen als reactive oxygen species
(ROS)
bezeichnet.
Per
Definition
ist
dies
der
Überbegriff
für
sowohl
Sauerstoffradikale (Moleküle mit einem oder mehreren ungepaarten Elektronen), als auch nicht-Radikale, die trotzdem aufgrund der Konformationen ihrer Hüllelektronen (z.B. deren Spins) entweder oxidierend wirken oder leicht in Radikale umgewandelt werden können. Somit sind nicht alle ROS Radikale, aber alle Radikale sind ROS. Der Reaktionsraum der Zellatmung sind die Mitochondrien. ROS entstehen hier konstant als „Abfallprodukt“ der Zellatmung. Eine unvollständige Übertragung von Elektronen auf den molekularen Sauerstoff, z.B. der Übergang eines einzelnen Elektrons erzeugt bereits das Superoxidradikal O2-. Der Anteil des in der Atmung nicht vollständig reduzierten Sauerstoffs wird auf 2-10% beziffert, dabei verbleiben 98% der so entstehenden ROS in den Mitochondrien (Brookes et al. 2004), und stellen somit eine starke Schadensquelle dar. Um dieser Tendenz entgegenzuwirken, müssen ROS intramitochondrial reguliert werden. Zum einen geschieht dies durch die Lokalisierung der Zellatmung in den dynamischen und durch eine doppelte Membran umschlossenen Mitochondrien, um die potentielle Gefährdung zunächst räumlich zu beschränken. Weiterhin kann eine effiziente Entsorgung der ROS 1
1. Einleitung durch
verschiedene
mitochondrial
lokalisierte
Enzyme
geschehen,
wie
die
Superoxiddismutase, die O2- in H2O2 umwandeln kann, und die Katalase, die H2O2 zu Wasser konvertiert. Ebenso können zwei Moleküle des körpereigenen Antioxidans Glutathion mit H2O2 zu Glutathiondisulfid und Wasser reagieren (Moreira et al. 2010). Auch Vitamine wie Ascorbinsäure können ROS effektiv entgiften (Halliwell, B 2006). Tabelle 1.1: Einige biologisch relevante ROS
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Radikal Nichtradikal Name Summenformel Name Summenformel Superoxid-Anion Hydroxyl-Radikal Hydroperoxyl-Radikal
O2
••
OH
HO2
•
Wasserstoffperoxid
H2O2
Ozon
O3
Singulett-Sauerstoff
1
O2
Überwindet die Entstehung von ROS jedoch die endogenen Gegenmaßnahmen, entsteht ein Szenario, das als oxidativer Stress (OxStress) bezeichnet wird. Die gemeinhin anerkannte Definition für oxidativen Stress durch Helmut Sies (1991) bezeichnet diesen als „eine Störung in der Pro-Oxidant – Antioxidant Balance zugunsten des Ersteren, die zu einer potentiellen Schädigung führt“. Ein moderater Spiegel von Sauerstoffradikalen wird jedoch benötigt, um zelluläre Grundfunktionen aufrechtzuerhalten, die auf Redox-Signalkaskaden aufbauen. Hierzu gehören Prozesse wie der Zellzyklus, Proliferation, Sauerstoff-Wahrnehmung (oxygensensing) im vaskulären Bereich, sowie die Funktion einer Zahl von Enzymen und Transkriptionsfaktoren (Brookes et al. 2004). Aktive Erzeugung von ROS durch Zellen des Immunsystems dient zudem der Pathogenabwehr. Oxidativer Stress im Sinne der obigen Definition jedoch führt zu einer oxidativen Schädigung zellulärer Moleküle und Makromoleküle. Hierbei attackieren Radikale und nicht-Radikale Bindungen innerhalb von Molekülen. Oxidative Schäden können dabei im Laufe der Lebenszeit einer Zelle oder eines Organismus akkumulieren. Ein weithin anerkanntes Modell der zellulären Seneszenz und des Alterns eines Organismus beruft sich auf diese Prozesse (Harman, D 2001; Moreira et al. 2010). Die Mitochondrien als Reaktionsraum der zellulären Atmung sind hiervon initial und am stärksten betroffen. ROS schädigen die mitochondriale DNA durch Oxidation der DNA-Basen, besonders betroffen ist hierbei das Guanosin. Auch Lipide können von ROS geschädigt werden, hierbei spricht man von der Lipidperoxidation, die Biomembranen schädigt und ihre Integrität reduziert, was im Falle der Mitochondrien zu einem Verlust des Protonengradienten über die innere Membran führt, und letztlich eine Entkopplung der Zellatmung zur Folge hat. Darüber hinaus können Proteine oxidativen 2
1. Einleitung Schaden nehmen, was strukturelle und funktionale Konsequenzen hat (Turrens, JF 2003; Valko et al. 2007). Werden die Reparatur- und Kompensationsmechanismen, die den Zellen zur Verfügung stehen (DNA-Reparatur, Ersatz beschädigter Proteine und Membranen) überschritten, droht ein Ausfall der mitochondrialen Funktion, ein rascher Mangel an ATP als Energieäquivalent sowie die anschließende Aktivierung von Zelltod-Signalwegen, zum Beispiel der Apoptose (siehe 1.3). Im akuten Fall von erhöhtem oxidativen Stress kann somit eine Zelle zunächst funktionell stark eingeschränkt und letztlich auch zerstört werden. Dieses Konzept wird insbesondere in Zellen mit hohem Energiebedarf und einer starken Polarisierung wie den Neuronen als pathologischer Mechanismus diskutiert. Da Neurone im Nervensystem in der Regel kaum ersetzt werden können, hat durch oxidativen Stress bedingter Zelltod hier schnell fatale Konsequenzen für das gesamte Organsystem. Das Auftreten von ROS kann in sehr vielen neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet werden (z.B. bei M. Parkinson, M. Alzheimer, M. Huntington, Amyotropher Lateralsklerose und Friedreichs Ataxie; Calabrese et al. 2005; Lin & Beal 2006; Reddy, PH 2009; Moreira et al. 2010; Shi et al. 2010). Allerdings ist vielfach noch nicht geklärt, ob ROS hier die Ursache oder lediglich Mediatoren der Erkrankung sind. Die besondere Rolle der ROS in neuronalen Zellen wird in 1.6 vertieft. 1.2 Experimentelle und therapeutische Erzeugung von ROS in Zellen In der biomedizinischen Forschung besteht ein großes Interesse daran, die Entstehung und die Konsequenzen des oxidativen Stresses besser zu verstehen. Zum einen um gezielt Therapeutika zu entwickeln, die an dieser Stelle in den Verlauf von Erkrankungen eingreifen und diese durch Reduktion von Sauerstoff- und anderen Radikalen abmildern, zum anderen aber auch, um das Gegenteil möglich zu machen, nämlich die gerichtete Erzeugung von ROS in Zellen. Dieses Bestreben kann experimentelle Gründe haben. Mit Hilfe von gezielt erzeugten ROS z.B. in einem zellulären System wie kultivierten Nervenzellen, lassen sich Konsequenzen des oxidativen Stresses genau untersuchen und Antioxidantien testen. Man bedient sich hierbei häufig zwei verschiedener Gruppen von ROS-erzeugenden Systemen. Zum einen können bestimmte ROS direkt in Zellen eingeschleust werden, was z.B. mit H2O2 gezielt möglich ist, da dieses über Aquaporine die Zellmembran überquert (Henzler & Steudle 2000). Zum anderen werden Redox-Systeme (Hypoxanthin / Xanthinoxidase; WadaTakahashi & Tamura 2000) oder Metallionen (z.B. Fe2+) eingeschleust, die intrazellulär Radikale generieren (Lehtinen & Bonni 2006). Hierbei besteht oft die Beschränkung, dass die subzelluläre Lokalisation der ROS-Donoren nicht zwingend der in vivo Situation entspricht, weil ROS dann eventuell im Zytoplasma und nicht in den Mitochondrien generiert werden. Ein häufig genutzter Mechanismus zur Erzeugung intramitochondrialer ROS 3
1. Einleitung hingegen ist der Einsatz von Blockern der NADH-Dehydrogenase (EC 1.6.5.3), also des Komplex I der Atmungskette. Hier ist Rotenone das bekannteste so verwendete Molekül. Wird die in der Atmungskette die Elektronenübertragung zum Ubichinon gestört, akkumulieren Elektronen in der mitochondrialen Matrix und können mit dem dort vorhandenen Sauerstoff Superoxid-Radikale bilden. Der Vorteil solcher Methoden ist die mitochondrial lokalisierte Reaktion. Ein Nachteil als Modell für oxidativen Stress ergibt sich daraus, dass die ROS sekundär zur Blockade der Atmungskette erzeugt werden, wodurch sich ein starker zellulärer Energieverlust durch die Entkopplung der Atmungskette ergibt, und die folgenden zellulären Konsequenzen eventuell nicht allein auf die ROS zurückzuführen sind (siehe Aksenova et al. 2005; Halliwell & Whiteman 2004). Trotzdem können anhand solcher und anderer Modelle wichtige Erkenntnisse zum oxidativen Stress als treibende Kraft der Neurodegeneration gewonnen werden. Der zweite wichtige Grund, aus dem versucht wird, ROS in Zellen erzeugen zu können, ist die gezielte Vernichtung von Tumorzellen. In diesem Zusammenhang ist insbesondere die sogenannte photodynamische Erzeugung von ROS von größtem experimentellem und klinischem Interesse. Hierbei werden den zu behandelnden Zellen oder Tumoren sogenannte Photosensitizer zugeführt. Diese Moleküle sind in der Regel per se nicht zytotoxisch, können aber nach Anregung mit Licht bestimmter, individueller Wellenlängen in Gegenwart von O2 reaktive Sauerstoffspezies erzeugen. Der hierfür erforderliche Mechanismus besteht in dem Übergang von Elektronen aus konjugierten Doppelbindungen des Kohlenstoffs im Photosensitizer-Molekül in einen energetisch angeregten Zustand, und der anschließenden Reaktion mit molekularem Sauerstoff. Daher finden sich unter den verschiedenen derart photoaktivierbaren Molekülen häufig solche mit mehreren Kohlenstoff-Ringstrukturen oder Kohlenstoff-Stickstoff Heterozyklen. Hierbei wird ein besonderer chemischer Mechanismus beschritten. Die Anregung eines Elektrons aus dem Grundzustand in den angeregten Singulett-Zustand ist entweder kurzlebig und ein rascher Rückfall in den Grundzustand erzeugt eine Fluoreszenz. Alternativ kann sich aber, aufgrund der besonderen molekularen Architektur der Photosensitizer, die Multiplizität des Elektronenspins ändern. Hier beobachtet man den seltenen Prozess des intersystem crossings der das Elektron in den Triplett-Zustand überführt, in dem aus Sicht des Spins zwei ungepaarte Elektronen auf der Hülle des angeregten Moleküls vorliegen. Dieser Zustand ist sehr stabil und hochgradig reaktiv. Von hier aus sind zwei physikalische Interaktionen möglich. Entweder, es werden direkt Elektronen oder Protonen auf O2 übertragen (OH- oder O2- entstehen; Typ I Reaktion), oder es findet eine Veränderung des Spins der Elektronen auf der Hülle des Sauerstoffs als Reaktionspartner statt (Typ II Reaktion). Ob es zur Typ I oder Typ II Reaktion kommt, ist von dem photoaktivierbaren 4
1. Einleitung Molekül abhängig (Nyman & Hyninnen 2004). O2 wird durch die Typ II Reaktion zum 1O2, dem Singulett-Sauerstoff. Dieser ist formal zwar kein Radikal, aber aufgrund der Konformation seiner Elektronenhülle hochgradig reaktionsfreudig (z.B. Calvazara-Pinton et al. 2007). Eine Gruppe von häufig eingesetzten Photosensitizern sind Derivate des endogenen HämGrundgerüstes Porphyrin. Hierbei wird besonders oft auf Protoporphyrin IX zurückgegriffen. Porphyrine sind lipophile, mehrkernige Heterozyklen, weshalb sie bei exogener Zugabe zu Zellen und Geweben vielfach in den Plasmamembranen verbleiben. Die von ihnen erzeugten Singulett-Sauerstoffe haben allerdings eine sehr kurze Diffusionsstrecke (0,01 – 0,02 µm) und reagieren daher in unmittelbarer Umgebung ihres Entstehungsortes. Ein häufiges Ziel der klinisch eingesetzten photodynamischen Mechanismen - also der Photodynamischen Therapie (PDT) – ist es, tumorartige Zellen in die Apoptose zu zwingen. Hier ist ein ROSAngriff auf die Zellmembranen eine suboptimale Strategie. Direkte PlasmamembranSchäden führen eher zum nekrotischen Zelltod (Ji et al. 2006). Dieser ist vielfach mit einer Immunreaktion, also einer Gewebsentzündung verbunden, was im klinischen Bereich unerwünscht ist, da nekrotische Prozesse die Abheilung verlangsamen. Ein idealer Photosensitizer vereinigt die phototoxischen Mechanismen der Porphyrine mit einer mitochondrialen Lokalisation (Hilf, R 2007). Dies bewirkt nämlich eine Primärschädigung ebendieser Zellorganellen, was vielfach zu einer Initiation apoptotischer Signalwege führt. Das Schrumpfen und Zerfallen apoptotisch sterbender Zellen lässt eine Beseitigung durch phagozytierende Zellen des Immunsystems oder sogar Nachbarzellen zu; entzündliche Reaktionen bleiben häufig aus (Dougherty et al. 1998). Da Protoporphyrin IX (PpIX) ein natürliches Intermediat der Häm-Biosynthese ist, welche größtenteils in den Mitochondrien abläuft, ist vielfach versucht worden, Zellen mit PpIX-Vorläufermolekülen (precursor oder prodrugs) zu beladen, um sie dazu zu veranlassen den Photosensitizer selbst an der geeigneten Stelle zu synthetisieren. Die negative Rückkopplung in der Häm-Biosynthese wirkt vom Endprodukt auf die ALA-Synthase, die aus Glyzin und Succinyl-Koenzym A die δAminolevulinsäure (5-ALA) herstellt. Diese Endprodukthemmung kann umgangen werden, wenn man zusätzliches 5-ALA in die Synthesekaskade einbringt (Peng et al. 1997; McCormack et al. 2007). Dieser Ansatz, die Photodynamische Therapie mit δAminolevulinsäure, kurz 5-ALA-PDT, soll im folgenden Abschnitt genauer erläutert werden. 1.3 Photodynamische Therapie: Mechanismen und Herausforderungen Die erste erfolgreiche Studie zur Behandlung oberflächlicher Tumore der Haut mit 5-ALAPDT wurde 1990 von Pottier & Kennedy publiziert. Seitdem werden die Mechanismen dieser Form der Photodynamischen Therapie intensiv erforscht. Dabei ergeben sich vier zentrale 5
1. Einleitung Fragestellungen: (1) Wie funktioniert die Aufnahme des hydrophilen 5-ALA in Zellen, und besteht Selektivität gegenüber Tumorzellen im Vergleich zu gesunden Nachbarzellen? (2) Wie ändert sich dieser Prozess, wenn tendenziell lipophilere, mit alipathischen Alkoholen veresterte ALA-Derivate eingesetzt werden? (3) Unterscheidet sich die zelluläre Fähigkeit zur PpIX-Synthese in bösartigem und gesundem Gewebe? (4) Wie müssen die experimentellen oder klinischen Parameter der Behandlung gewählt werden, um optimale Ergebnisse zu erreichen, z.B. vorwiegend apoptotischen Zelltod. Die Aufnahme des stark hydrophilen 5-ALA (Verteilungskoeffizient log P Oktanol/Wasser = -1,51692; Uehlinger et al. 2000), wird, je nach untersuchtem Zelltyp, verschiedenen Membrantransportern zugeschrieben. Eine einzige Studie (Bermudez-Moretti et al. 2002) diskutiert dennoch eine 5-ALA Aufnahme durch einfache Diffusion bei 4°C. Die am häufigsten diskutierten Transportproteine sind Transporter der Beta-Familie, zum Beispiel die γ-Aminobuttersäure (GABA) Transporter 1-3 (GAT-1; -2; -3). Eine Reihe von Tumorzelllinien nimmt 5-ALA auf diesem Weg auf (siehe Tabelle 1.2). Tabelle 1.2: Einige Studien zur zellulären 5-ALA- und MAL-Aufnahme Autor
Jahr
Substanz
Bermudez-Moretti et al.
2002
5-ALA
Döring et al.
1998
5-ALA
Frølund et al.
2010
5-ALA
Gederaas et al.
2001
MAL
Rodriguez et al.
2006
5-ALA
Rud et al.
2000
5-ALA MAL
Washbrook & Riley
1997
5-ALA
Xiang et al.
2006
5-ALA
Zelltyp LM3 murines Adenokarzinom Xenopus laevis Oozyten und Hefe Picha pastoris nach Überexpression der PEPT-1 und -2 Gene des Kaninchens Caco-2 Zellen (human) WiDr humanes Adenokarzinom LM3 murines Adenokarzinom WiDr humanes Adenokarzinom Epithelzelllinie aus der Ratte CNCM-I221 Kultivierte Astrozyten aus Ratte und Maus
Transportweg GAT, BGT-1, TAUT und passive Diffusion
PEPT-1 und -2
hPAT1 (Prolin-Transporter) PEPT-1 Transporter für unpolare Aminosäuren (L-Met; L-Trp; L-Ala; Gly) 5-ALA: GAT, BGT-1, TAUT MAL: anderes Transportsystem 5-ALA: GAT, BGT-1, Transporter für polare Aminosäuren MAL: anderes Transportsystem GABA und Glutamat beeinflussen die Aufnahme nicht PEPT-2
Für den ebenfalls hydrophilen Methyl-Ester des 5-ALA, Methyl-Aminolevulinsäure (MAL; log P(Oktanol/Wasser) -0,94233) wurde ein solcher Transportweg in zwei verschiedenen Adenokarzinom-Zelllinien (LM3 und WiDr) in drei unabhängigen Studien nicht bestätigt (Rud 6
1. Einleitung et al. 2000; Gederaas et al. 2001; Rodriguez et al. 2006). Hier stellte man jedoch, trotz des noch deutlich hydrophilen Charakters von MAL, eine Aufnahme durch passive Diffusion bei 0°C fest. 5-ALA Ester mit längeren Alkoholen (ab C-2) zeigen deutlich lipophilere Eigenschaften (log P > 0), und werden daher primär passiv in die Zellen aufgenommen, da sie Lipidmembranen passieren können (z.B. Uehlinger et al. 2000). Für Hexyl-ALA und Undodekyl-ALA wurde zudem die umgekehrte Eigenschaft berichtet, nämlich BETATransporter blockieren zu können (Rodriguez et al. 2006). Weitere nennenswerte Transportwege für 5-ALA sind Peptid-Transporter (z.B. PEPT-2 in Astrozyten; Xiang et al. 2006) und verschiedene Aminosäuretransporter (z.B. System B0,+ oder SLC36A1; Rud et al. 2000; Frølund et al. 2010). Tabelle 1.2 liefert einen Überblick über einige experimentelle Arbeiten zum Aufnahme-Mechanismus von 5-ALA und seinen Methylestern.
5-ALA / MAL EXTRAZELLULÄRRAUM PBGD URO III Cosynth
5-ALA / MAL
URO III Decarb.
C-Esterase
5-ALA
CYTOPLASMA
PBG
URO III
CpIII CpIII Oxidase
ALAD
5-ALA Häm Ferrochelatase ALAS
+ Fe2+
PpIII
Hemmung
Glyzin + Succinyl CoA
PpIX
PpIII Oxidase
MITOCHONDRIUM
Abbildung 1.1: Skizze des PpIX (Häm)-Syntheseweges. Pfeile mit durchgezogenen Linien beschreiben eine enzymatische Umwandlung, gestrichelte Pfeile einen Transportprozess über eine Membran. Im Falle der CpIII Oxidase geschieht dies in einem gemeinsamen Schritt. Die verantwortlichen Enzyme sind kursiv notiert, rote Pfeile bedeuten eine Aktivitätsveränderung in neoplastischem Gewebe. Pfeil nach oben: Steigerung; Pfeil nach unten: Reduktion. ALAS: ALA-Synthase; ALAD: ALA-Dehydratase; PBG: Porphobillinogen; PBGD: PBG-Deaminase; URO III: Uroporphyrinogen III; Cosynth: Kosynthase; Decarb: Decarboxylase; CpIII: Coproporphyrinogen III; PpIII: Protoporphyrinogen III; C-Esterase: Carboxyesterase / unspezifische Esterase.
7
1. Einleitung Voraussetzung für eine Tumorselektivität auf Ebene des Membrantransports ist eine ektopische Expression solcher Transporter in pathologisch veränderten Zellen. In der Epidermis exprimieren jedoch sowohl pathologisch unveränderte humane Keratinozyten (NHEKs) als auch Zellen der Tumorzelllinie A-431 (Basalzellkarzinomzellen) mRNA des GABA Transporters GAT-3. Daher ist eine Selektivität wie oben angesprochen nicht gegeben (Schulten R.; eigenes Labor, persönliche Mitteilung). Die Synthese von Tetrapyrrolen wie Protoporphyrin IX ist eine generelle Fähigkeit der eukaryotischen Zellen, sofern sie Mitochondrien besitzen. Abbildung 1.1 zeigt eine Skizze des PpIX-Syntheseweges; hier wird auch verdeutlicht, welche beteiligten Enzyme in Tumoren eine veränderte Expression und Aktivität aufweisen. Zum einen kann eine erhöhte Aktivität der ALA-Dehydratase und der Porphobilinogendeaminase (als PpIX-anabole Komponenten) und eine reduzierte Aktivität der Ferrochelatase (als katabole Komponente) in verschiedenen Tumoren relativ zu gesundem Gewebe berichtet werden (Van Hillegersberg et al. 1992; Peng et al. 1997). Diese enzymatische Disposition führt zu einer verstärkten Akkumulation von PpIX. Zudem ist bekannt, dass metabolisch sehr aktive Zellen, sowie solche mit hoher mitochondrialer Aktivität oder einem ausgeprägten mitochondrialen Netzwerk, hohe PpIX-Syntheseraten aufweisen (Calvazara-Pinton et al. 2007). Verschiedene Parameter definieren das Schicksal PDT-behandelter Zellen. Die Gesamtdosis der PDT setzt sich aus zwei Größen zusammen, einerseits aus der PpIX-Menge, die in den Zellen synthetisiert wurde, andererseits aus der eingesetzten Lichtenergie. Diese wird in der Regel als total fluence bezeichnet und in J/cm² angegeben. Sie ist also abhängig von der Leistung der verwendeten Lichtquelle pro Fläche (in W/cm²), sowie der Dauer der Bestrahlung. In der klinischen Anwendung hat sich zudem langwelliges Licht bewährt, da es zwar eine geringere Energie aufweist, aber dank seiner höheren Wellenlänge tiefer in Gewebe eindringen kann (MacCormack et al. 2008). Jedoch ist die Gesamtstärke der Therapie nicht einfach als Menge des entstehenden Singulett-Sauerstoffs definiert, sondern auch abhängig von dessen Entstehungsort. Dies ist in einer Reihe von Untersuchungen beschrieben worden (z.B. Moreno et al. 2001; Oleinick et al. 2002 und Buytaert et al. 2007). Die zielgerichtete Erzeugung von ROS in der mitochondrialen Matrix, wie sie beim Einsatz von PpIX als Photosensitizer auftritt, führt zu einer Reihe von molekularen Konsequenzen, die die apoptotische Form des programmierten Zelltods auslösen. Zum einen kann es durch eine Zerstörung der inneren und äußeren mitochondrialen Membran (IMM & OMM) zu einer Abgabe des Cytochrom C (CytC) in das Zytosol kommen. CytC ist einer der stärksten proapoptotischen
Reize,
und
nahezu
alle
Zellen
reagieren
auf
CytC-Freisetzung 8
1. Einleitung unwiderruflich mit Apoptose (Buytaert et al. 2007). CytC aktiviert, zusammen mit weiteren mitochondrialen Faktoren wie Smac/DIABLO oder Omi/HtrA2 die sogenannte CaspaseKaskade, eine Sequenz aus proteolytischen Spaltungen von Aspartat-Proteasen der Caspase-Familie, die für die meisten Apoptose-Formen unerlässlich sind. Eine der wichtigsten Caspasen ist die Caspase-3, eine Effektor-Caspase, und die Nahtstelle für das Zusammenlaufen
des
extrinsischen
und
des
intrinsischen
Apoptose-Signalweges.
Gespaltene Caspase-3 aktiviert Endonukleasen, die die Apoptose-typische Fragmentierung der DNA katalysieren. Zudem setzen Mitochondrien bei Ruptur ihrer Membranen noch weitere Caspase-unabhängige proapoptotische Faktoren frei, zum Beispiel den apoptosisinducing-factor AIF oder Endonuclease G. Neben der Ruptur der Membran gibt es einen weiteren Weg zur Freisetzung pro-apoptotischer Faktoren aus Mitochondrien, nämlich die Öffnung der Permeabilitätspore (permeability transition pore; PTP). Die PTP ist ein Proteinkomplex zwischen IMM und OMM, der als unselektive Pore bei Öffnung Moleküle bis zu 1.5 kD aus den Mitochondrien entlassen kann. Dieser Prozess führt zudem zu einem Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials (MMP; ∆ΨM). PTP-Öffnung wurde nach Exposition gegenüber ROS genauso beschrieben wie nach Kalzium-Überladung der Mitochondrien (zur mitochondrialen Kalziumregulation siehe 1.6). Apoptotische Prozesse sind dabei stets von zellulärer Energie in Form des ATP abhängig und resultieren in morphologischen Charakteristika wie Chromatinkondensation, Zellschrumpfung, vesikulären Abschnürungen der Plasmamembran, deren Integrität dabei jedoch bestehen bleibt, sowie der Bildung großer Abschnürungen, den apoptotic bodies (Oleinick et al. 2002; Almeida et al. 2004; Buyteart et al. 2007). Nekrotischer Zelltod wird häufig dann nach der PDT gefunden, wenn eine sehr hohe Dosis an ROS in kurzer Zeit generiert wird (Noodt et al. 1996; Buytaert et al. 2007), oder wenn vor allem die Plasmamembran betroffen ist (Ji et al. 2006). Bei einem schnellen Verlust der Membranintegrität kann eine Zelle ihren Ionenhaushalt nicht mehr regulieren und verliert Proteine und Energieträger in den Extrazellulärraum. Da Nekrose auch als das Ergebnis einer bioenergetischen Katastrophe auf zellulärer Ebene beschrieben werden kann, ist klar, dass sie (1) ATP-unabhängig abläuft, und (2) genau dann ausgelöst wird, wenn ein drastischer Verlust zellulärer Energie in kurzer Zeit auftritt. Dies wäre bei einer sehr starken ROS-Produktion in den Mitochondrien zu erwarten, wenn der zelluläre Energiehaushalt mit einem Mal kollabiert. Somit kann auch ein mitochondrial lokalisierter Photosensitizer Nekrose auslösen, wenn die Gesamtdosis der PDT sehr hoch ist, oder wenn sich im Laufe der Inkubation der sensitizer von seinem Bildungsort wegbewegt. Dies ist bei lipophilen Substanzen wie dem PpIX experimentell gezeigt worden (Krammer & Überrigler 1996).
9
1. Einleitung Eine wenig untersuchte Zelltodform nach PDT ist die Autophagie. Autophagie-Prozesse, in denen beispielsweise beschädigte Zellorganellen in Autophagosome aufgenommen werden, dienen vielfach der zellulären Schadensreparatur. Autophagie in sehr großem Maßstab kann allerdings auch zum Zelltod führen, wenn übermäßig viele lebenswichtige Organellen, wie z.B. Mitochondrien auf diesem Weg den Autophagosomen und anschließend den Lysosomen zugeführt werden (Buytaert et al. 2007). Da PDT in beschädigten Zellorganellen oder auch in Aggregaten quervernetzter Proteine resultiert, ist es schlüssig, dass Autophagie nach PDT stattfindet, einige Veröffentlichungen belegen dies (Buytaert et al. 2007; Kessel, D 2006) . Autophagie-assoziierter Zelltod wurde nach PDT besonders dann beobachtet, wenn apoptotischer Zelltod nicht möglich ist. Dies kann vorkommen, wenn Elemente der apoptotischen Kaskade selbst durch die PDT geschädigt sind (Kessel & Oleinick 2009). 1.4 Photodynamische Therapie und Schmerz Für die Behandlung dermatologischer Erkrankungen (z.B. Aktinische Keratose, AK) sind zur Zeit 5-ALA (USA) und MAL (USA, Europa) als PpIX-Vorläufer zugelassen. Eine der entscheidenden Nebenwirkungen, die bei der klinischen Anwendung der ALA/MAL–PDT festgestellt wird, ist das Auftreten teils starker Schmerzen in den behandelten Hautarealen während der Lichtaktivierungsphase (Grapengiesser et al. 2002; Ericson et al. 2004; Lindeburg et al. 2007). Diese Schmerzen werden sowohl bei Behandlung mit 5-ALA (Sandberg et al. 2006) als auch MAL (Lindeburg et al. 2007), sowie bei der Behandlung gesunder Haut (Wiegell et al. 2003), Aktinischer Keratose (Ericson et al. 2006; Lindeburg et al. 2006) und von Hauttumoren (z.B. Basalzellkarzinom; Grapengiesser et al. 2002) beobachtet. Zwei Studien beschreiben hierbei, dass die PDT mit MAL weniger schmerzhaft sei, als 5-ALA-PDT (Wiegell et al. 2003; Kasche et al. 2006). Weitere Beobachtungen aus der Klinik sind eine positive Korrelation der Schmerzen mit Größe und Rötung der behandelten Läsionen (Sandberg et al. 2006), jedoch besteht keine Abhängigkeit der Stärke der verspürten Schmerzen von der eingesetzten Lichtenergie (Ericson et al. 2004). Ericson und Mitarbeiter konnten in dieser Studie zudem zeigen, dass der anfängliche Schmerz bei PDT-Anwendung in der Regel stärker ist, als der Schmerz zu späteren Zeitpunkten derselben Behandlungssitzung. Dies lässt auf eine periphere Desensibilisierung der beteiligten Nervenfasern schließen. Dem entgegen steht die Beobachtung, dass eine einwöchige Vorbehandlung der Haut mit Capsaicin keine Reduzierung des Schmerzes nach PDT bewirkt (Sandberg et al. 2006). Lindeburg et al. (2007) fanden zudem heraus, dass die zweite Anwendung der PDT vielfach als schmerzhafter beurteilt wird, als die erste. Nervenblockaden mit Lokalanästhetika bewirken eine Reduktion der Schmerzen während der MAL-PDT von AK-Läsionen (Paoli et al. 2008; Halldin et al. 2009). 10
1. Einleitung Bezüglich der zellulären Mechanismen der PDT-induzierten Schmerzentstehung bei der Behandlung von Hautläsionen lassen sich zwei grundsätzliche Hypothesen aufstellen: (1) Der Schmerz entsteht zellautonom in den Nervenfasern, die die Haut innervieren (vgl. dazu 1.5). Eine unerlässliche Vorbedingung hierfür ist die Aufnahme von 5-ALA bzw. MAL in periphere Neurone sowie die anschließende Bildung von PpIX in diesen Zellen. Diese beiden Bedingungen sind bisher noch nie experimentell belegt worden. Dennoch gibt es Spekulationen, die über diesen Mechanismus die verschieden starken Schmerzen nach 5-ALA bzw. MAL-PDT erklären. Hier wird vermutet, dass MAL, welches im Gegensatz zu 5-ALA in manchen Tumorzelllinien nicht durch GABA-Transporter aufgenommen wird (siehe oben), aus eben diesem Grund schlechter in neuronalen Strukturen akkumuliert (Rud et al. 2000; Casas et al. 2002; Sandberg et al. 2006). Das Vorhandensein von GABA-Transportern wird hier den sensorischen Neuronen des PNS zugesprochen, wofür es allerdings auch nahezu keine empirischen Belege gibt, außer einer immunhistochemischen Studie für GAT-3 im Ganglion Nodosum der Ratte (Shoji et al. 2010). Diese Studie erschien allerdings erst nach den oben genannten Hypothesen zur 5-ALA-induzierten Schmerzentstehung. Für die Theorie, dass der Schmerz autonom in Neuronen entsteht, ist es zudem unerlässlich, dass die PpIX-basierende PDT einen Einfluss auf neuronale Aktivität und Erregung hat. Auch hierfür gibt es bisher keine experimentellen Belege. Ein möglicher Ansatzpunkt ist allerdings der Anstieg von zytosolischem Kalzium, der in verschiedenen nicht-neuronalen Zelltypen nach PDT gemessen werden konnte (zusammengefasst in Almeida et al. 2004). Einige Berichte belegen die Beteiligung membranständiger Kanäle an diesem Prozess (Joshi et al. 1994; Hill et al. 2009). Kalzium ist ein universeller zellulärer Signalstoff, und erhöhtes zytosolisches Ca2+ ein sinnvoller Maßstab für neuronale Aktivität (z.B. Berridge 1998). Zudem gibt es Studien, die ROS-vermittelte Modifikationen an neuronalen Ca2+-Kanälen dokumentieren (siehe auch 1.6). Eine alternative Hypothese (2) zur PDT-vermittelten Schmerzentstehung ist die Induktion eines zellulären Kommunikationsschrittes zwischen epidermalen Zellen (z.B. Keratinozyten oder Tumorzellen) als Antwort auf den oxidativen Stress. Mechanischer Stress kann z.B. die Sekretion von Botenstoffen aus Keratinozyten auslösen (siehe auch 1.5), außerdem sekretieren manche Tumorzellen nach PDT immunmodulatorische Substanzen (z.B. Interleukin 6; Almeida et al. 2004), für die auch periphere Neurone Rezeptoren tragen (Üceyler et al. 2009). Diese beiden Hypothesen schließen sich dabei nicht gegenseitig aus. Eine Vielzahl von Reizen in der Haut wird durch interzelluläre Kommunikation von Neuronen und epidermalen Zellen wahrgenommen und integriert. Eine aktuelle Perspektive auf die hierfür relevanten 11
1. Einleitung molekularen und zellulären Aspekte der Schmerzwahrnehmung liefert das anschließende Kapitel. 1.5 Molekulare und zelluläre Mechanismen der Nozizeption Die Umwandlung eines mit Gewebsschädigung assoziierten Reizes in ein primäres neuronales Signal bezeichnet man als Nozizeption. Im Gegensatz zu Schmerz, für dessen Empfindung
eine
kognitive
und
emotionale
Verarbeitung
eines
sensorischen
Eingangssignals benötigt wird, ist Nozizeption gegeben, wenn Primärafferenzen ein Signal detektieren und melden. Ob aus diesem primären Eingang eine Schmerzwahrnehmung wird, entscheidet sich an einer Vielzahl übergeordneter neuronaler Schnittstellen im Rückenmark, im Hirnstamm sowie im Thalamus und im Neokortex (Basbaum et al. 2009). Der ultimate Nutzen des Schmerzempfindens ist es, eine Abwendung von einer weiteren Schädigung des Gewebes zu ermöglichen. Die Komplexität der spezialisierten nozizeptiven Strukturen ermöglicht die Wahrnehmung einer Vielzahl potentiell schädlicher Stimuli. Die herausragenden zur Nozizeption befähigten Strukturen sind spezialisierte Neurone des peripheren Nervensystems. Diese innervieren nahezu sämtliche Organe des Körpers und ihre Zellkörper befinden sich entweder in den Hinterwurzelganglien (DRGs) oder, für die Innervierung des Kopfes, im trigeminalen Ganglion (Basbaum & Jessel 2000). Aufgrund des Schwerpunkts der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Studien auf Nozizeption im Bereich der Haut, sollen im Folgenden die molekularen und zellulären Mechanismen in diesem Organ genauer beschrieben werden. Eine Vielzahl verschiedener sensorischer Fasern innerviert die Haut. Diese können sehr allgemein nach ihrem Durchmesser, ihrer Leitgeschwindigkeit und dem Grad ihrer Myelinisierung in Aβ, Aδ und C-Fasern unterschieden werden. Insbesondere die C-FaserNeurone stellen die wichtige Klasse der polymodalen Nozizeptoren dar. Aufgrund ihrer Ausstattung mit einer Vielzahl verschiedenster Rezeptoren für Temperatur, starke mechanische und diverse chemische Stimuli, sind sie in der Lage ein extrem breites Spektrum an Indikatoren für bestehende und potentielle Schädigungen zu detektieren (Belmonte & Viana 2008). Viel Aufmerksamkeit wurde in diesem Zusammenhang den verschiedenen Rezeptoren der transient receptor potential (TRP) Familie gewidmet. Die unterschiedlichen TRP Rezeptor-Subtypen besitzen jeweils einzigartige Aktivierungsprofile bezüglich genau definierter Temperaturbereiche und chemischer Stimuli. Beispielhaft seien der TRPV1 Rezeptor, aktiviert durch Temperaturen über 42°C sowie Capsaicin aus Chilifrüchten, und der TRPM8, aktiviert durch Temperaturen unter 28°C und Menthol aus der Minze,
genannt.
Zudem
gibt
es
spezialisierte
Rezeptorproteine
für
Protonen, 12
1. Einleitung proinflammatorische
Zytokine,
Lipide
(Prostaglandin),
Peptide
(Bradykinin)
Adenosintriphosphat (ATP), Neurotransmitter (5-HT) und Neurotrophine (z.B. NGF). Häufig versammeln einzelne C-Fasertypen mehrere dieser Rezeptoren in ihrer Membran, so dass eine definierte Gruppe von sensorischen Neuronen z.B. auf Hitze und die Freisetzung von ATP mit einem Aktionspotential reagiert, während eine andere Gruppe tendenziell stärker auf Kälte reagiert (Snider & McMahon 1998; Lumpkin & Caterina 2007). Zudem werden die CFaser Nozizeptoren in zwei Gruppen unterteilt, je nachdem ob sie die Neuropeptide CGRP und Substanz P exprimieren oder nicht (Stucky & Lewin 1999). Neuropeptid-negative CFaser Neurone lassen sich vielfach mit bestimmten Pflanzenlektinen anfärben und identifizieren (Priestley et al. 2002). Eindeutige Zuordnungen zwischen diesen beiden CFaser Typen und einer Subtyp-selektiven Rezeptorausstattung sind Gegenstand intensiver Forschung (Lawson, SN 2002; Wu et al. 2004; Braz et al. 2005). Bisher lieferten Studien oft gegensätzliche Resultate, zudem werden auch Unterschiede zwischen Spezies (z.B. Ratte und Maus) vermutet (Cavanaugh et al. 2010). Die Interaktion der sensorischen Fasern mit Zellen der Epidermis und die Beteiligung des wichtigsten epidermalen Zelltyps, des Keratinozyts, an nozizeptiven Prozessen ist ein neuer, wichtiger Aspekt in der Erforschung sensorischer Prozesse (Chateau & Misery 2004). Mindestens zwei Typen der C-Faser Neurone senden Fortsätze bis in die Epidermis (Lumpkin & Caterina 2007). Zum einen werden verschiedene Nozizeptions-assoziierte Rezeptoren auch von Keratinozyten exprimiert, so zum Beispiel der P2X3 Rezeptor (ATP) oder der oben bereits erwähnte TRPV1 Rezeptor (Denda et al. 2006). Somit sind auch Keratinozyten dazu in der Lage externe Reize wahrzunehmen. Manche TRP-Kanäle sind zudem exklusiv in Keratinozyten exprimiert, nicht aber in den Fortsätzen sensorischer Neurone (z.B. TRPV3; Peier et al. 2002). Weiterhin können Keratinozyten, da sie durch gap junctions verbunden sind, eine lokale Aktivierung durch trans-zelluläre Kalziumwellen an Nachbarzellen kommunizieren und ausweiten (Tsutsumi et al. 2009). Eine wichtige Form der Kommunikation zwischen Keratinozyten und sensorischen Neuronen ist über sekretiertes Adenosintriphosphat (ATP) vermittelt (Koizumi et al. 2004; Denda & Denda 2007). Nach mechanischem, thermalem und chemiosmotischem Stress sekretieren Keratinozyten verstärkt ATP. Dieses kann von sensorischen Neuronen über ihre ATP-Rezeptoren (z.B. P2X3 oder P2X2/3 wahrgenommen werden; Burnstock, G 2000).
13
1. Einleitung 1.6 Mitochondrien, ROS und Kalzium in der Physiologie und Pathophysiologie des peripheren Nervensystems Neurone müssen zur Bewahrung ihrer Funktion und zur Sicherung ihres Überlebens ihren zellulären
Kalziumhaushalt
genau
regulieren.
Daher
ist
die
zytosolische
Kalziumkonzentration vielfach um den Faktor 104 geringer als die im Extrazellulärraum. Störungen im neuronalen Kalziumhaushalt führen zu gestörter zellulärer Aktivität, Verlust der Kontrolle über die Freisetzung von Transmittern und über die Genexpression und zu einem deregulierten Energiehaushalt (z.B. Berridge et al. 1998; Chen & Chan 2006) Sensorische Neurone aus dem DRG sind zur effektiven Regulation des zytosolischen Kalziums auf ihre Mitochondrien angewiesen (Werth et al. 1994; Svichar et al. 1997; Shishkin et al. 2002).
Ca2+ VGCC
EXTRAZELLULÄRRAUM
? ROS
Ca2+ Uniporter
mPTP CytC
Ca2+ ROS Apoptose
Atmungskette
Ca2+
Ca2+/H+ Antiporter
ATP MITOCHONDRIUM
CYTOPLASMA Abbildung 1.2: Mechanismen der Kalziumregulation in sensorischen Neuronen. Ein depolarisierender Stimulus vermittelt einen Kalziumeinstrom. Ist dieser von physiologischer Stärke, kann er von den Mitochondrien reguliert werden (siehe Text). In diesem Fall kann der Zellmetabolismus zudem erhöht werden (grüne Symbole). Ist der Einstrom sehr groß und/oder mit einem pathologischen Stimulus kombiniert, kommt es zur Kalziumüberladung, die ROS erzeugt, die Atmungskette hemmt und über die mPTP (mitochondriale Permeabilitätspore) Apoptose auslösen kann (siehe Text) . Zudem können ROS Membranproteine schädigen (rote Symbole).
Bei einer Depolarisation der Zellmembran, zum Beispiel durch ein Aktionspotential, öffnen sich verschiedene Typen von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen (voltage gated calcium channels; VGCCs), die unterschiedliche Leitfähigkeiten und Aktivierungscharakteristika 14
1. Einleitung aufweisen. Gemeinsam sorgen sie allerdings für einen Kalziumanstieg im Zytosol, den das Neuron regulieren muss. Einige Studien konnten zeigen, dass Mitochondrien hier als schnelle Kalziumpuffer mit hoher Kapazität und geringer Affinität agieren (Shishkin et al. 2002). Folgender Mechanismus wird dabei angenommen: Die Mitochondrien werden mit Hilfe des Zytoskeletts
in
der
Nähe
der
Plasmamembran
positioniert.
Bei
einem
depolarisationsbedingten Kalziumanstieg wird die Kalziumkonzentration in Membrannähe so hoch, dass der mitochondriale Kalziumuniporter Kalzium in die Organellen aufnimmt. Mit einer Ki > 25 µM ist er unter Bedingungen des Ruhehaushalts an Kalzium inaktiv (Pozzan et al. 2000). Das so gespeicherte Kalzium wird, zum Beispiel über den mitochondrialen Ca2+/H+ Antiporter dem Zytosol langsam wieder zugeführt (Jouaville et al. 1998). So wird für eine Regulation
sowie
eine
Verlängerung
der
Kalziumsignale
gesorgt
und
eine
Kalziumüberladung im Zytosol vermieden. Insbesondere DRG-Neurone, welche die CFasern generieren, bedürfen dieses Mechanismus‘, da in ihnen die Kalziumregulation durch das Endoplasmatische Retikulum nur eine untergeordnete Rolle spielt (Shmigol et al. 1994). Dauerhafte Kalziumüberladung der Mitochondrien kann allerdings auch zu einer oxidativen Schädigung der Organellen führen (Brookes et al. 2004). Da den Mitochondrien in der Physiologie des Ionenhaushalts der Nozizeptoren eine solch zentrale Rolle zukommt, ist es nicht verwunderlich, dass Erkrankungen mit mitochondrialen Pathologiekomponenten häufig Symptome in diesen Neuronentypen verursachen. Für viele verschiedene Erkrankungen wurde dies bereits gezeigt. Besonders nennenswert ist in diesem Zusammenhang die Diabetes-Neuropathie (Verkhratsky & Fernyhough 2008). Übermäßige Exposition von DRG-Neuronen gegenüber Glukose führt zu einer erhöhten metabolischen Aktivität, welche in gesteigerter ROS-Produktion resultiert. Dies verursacht mitochondriale Dysfunktion gemäß den oben geschilderten Mechanismen (Russell et al. 2002). Damit ist auch die neuronale Kalziumregulation betroffen (Svichar et al. 1998; Kostyuk et al. 1999), was zu einer Beeinträchtigung vieler zellulärer Funktionen führt. Weitere pathophysiologische Szenarien, die vergleichbare sensorische Neuropathien verursachen, sind bestimmte antivirale Behandlungen (Hucho & Levine 2006; Joseph & Levine 2006) sowie die Chemotherapie mit einigen Zytostatika (Andre et al. 2002; Quasthoff & Hartung 2002; Jin et al. 2008). In vielen dieser Fälle vermutet man ROS als Mediator dieser Neuropathologie, die Schmerzen und anschließende Taubheit als Symptome aufweist.
15
1. Einleitung Es existieren kaum Beschreibungen über den Einfluss von PDT-verursachten ROS auf neuronale Strukturen. Ein aktueller Bericht über die Auswirkungen der mTHPC-vermittelten PDT zeigte ROS-bedingten Zelltod in kultivierten DRG-Neuronen (Wright et al. 2009). Weiterhin existieren Studien über PDT-bedingte Veränderungen der Erregbarkeit und der elektrophysiologischen
Entladungsfrequenz
an
isolierten
Mechanorezeptoren
des
Galizischen Sumpfkrebses (Astacus leptodactilus; Uzdensky et al. 2001). Hier konnte allerdings eine starke Reduktion der neuronalen Spontanaktivität nach PDT mit Deuteroporphyrin IX beschrieben werden. Neurotoxizität des Protophorpyrin IX ohne Bestrahlung wurde in einem Modellsystem von kultivierten peripheren Neuronen des Haushuhns (Gallus gallus) beschrieben (Riopelle et al. 1982). Hier wurde herausgearbeitet, dass Protoporphyrin-Derivate per se neurotoxisch sein können, 5-ALA aber bis in den millimolaren Bereich nicht toxisch ist. Es lässt sich also ableiten, dass sensorische Neurone des peripheren Nervensystems sehr anfällig gegenüber mitochondrialer Dysfunktion sind. Dies ist nicht zuletzt auf den hohen neuronalen Energiebedarf, die starke zelluläre Polarisierung und die Notwendigkeit der Zellen, Fortsätze zu unterhalten, die oft mehr als ein tausendfaches des Durchmessers ihres Somas betragen, zurückzuführen. 1.7 DRG
Neurone
in
Zellkultur
als
pharmakologisches
und
zellbiologisches
Modellsystem für nozizeptive Mechanismen Kultivierte sensorische Neurone aus dem Hinterwurzel- oder dem trigeminalen Ganglion stellen ein wichtiges und weitverbreitetes Modellsystem zur Beschreibung sensorischer Prozesse und ihrer Pharmakologie dar. Eine Reihe für die in vivo Situation gültiger Eigenschaften wurden zunächst an kultivierten sensorischen Neuronen untersucht. Hierbei gilt es zu beachten, dass bestimmte Rezeptoren, Ionenkanäle und Transporter, die in einem in vivo stark polarisierten und differenzierten Neuron nur z.B. peripher oder synaptisch lokalisiert sind, in vitro über die gesamte Zelle verteilt zu finden sind (Kress et al. 1996). Dies kann daran liegen, dass eine Zellkultur, die auf einem homogenen Substrat wächst, keine peripher-zentrale Differenzierung erfährt, da richtungsweisende Signalmoleküle nicht vorhanden sind. Dies führt auch dazu, dass in vitro keine Ausbildung der in vivo typischen pseudounipolaren Fortsätzen zu finden ist, und sich keine Unterscheidung in periphere und zentrale Afferenzen bzw. Efferenzen treffen lässt. Dies bietet den Vorteil, dass viele eigentlich Fortsatz-spezifische Prozesse auch am Soma messbar sind (Vyklicky & KnotkovaUrbancova
1996).
Dies
ist
insbesondere
bei
elektrophysiologischen
und
fluoreszenzbasierten Messmethoden dynamischer Vorgänge von Bedeutung, da die Somata 16
1. Einleitung experimentell wesentlich leichter erreichbar sind als die Neuriten. Die in vitro Analyse dieser Zellen
bietet
zudem
den
entscheidenden
Vorteil,
dass
die
experimentellen
Rahmenbedingungen sehr gut kontrolliert und manipuliert werden können. Ein Beispiel für die beschriebene Situation ist die mitochondriale Kalziumakkumulation in DRG Neuronen nach einem Kalziumeinstrom. Diese wurde zunächst im Zellsoma beobachtet (siehe 1.6). Eine spätere Studie konnte den identischen Prozess auch für die Neuriten belegen (Medvedeva et al. 2008). 1.8 Zielsetzung der Doktorarbeit Übergeordnetes Ziel dieser Doktorarbeit war es, anhand einer Reihe von experimentellen Studien
in
einem
geeigneten
Zellkulturmodell,
Wirkmechanismen
der
reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS) in der Pathophysiologie des sensorischen Nervensystems aufzuklären. Als Modellsystem wurden hierfür kultivierte sensorische Neurone aus dem Hinterwurzelganglion der Ratte eingesetzt. Ein für die hier vorgesehenen Experimente gut geeignetes Szenario ist die Photodynamische Therapie (PDT) mit δ-Aminolevulinsäure (5-ALA). Im Rahmen dieser Tumortherapie, die auf der gezielten Produktion von ROS in erkranktem Gewebe z.B. der Haut beruht, tritt nachweislich Schmerz auf. Dieser koinzidiert mit der Entstehung der ROS, gleichzeitig bieten die epidermalen Nozizeptoren einen potentiellen Wirkort für die Schmerzentstehung, genauso wie die Berührungsfläche von epidermalen Zellen und Fortsätzen der Nervenzellen. Als erstes experimentelles Ziel galt es zu untersuchen, ob sensorische Neurone von der PDT betroffen sein können. Hierzu musste ein geeignetes in vitro Kultursystem, welches die entsprechenden nozizeptiven Neurone enthält, generiert werden. Es sollte an diesem Testsystem auf Basis von fluorimetrischen Untersuchungen festgestellt werden, ob DRG Neurone nach Zugabe von 5-ALA oder Methyl-ALA (MAL) den Photosensitizer PpIX bilden können. Die Kinetiken der hierfür verantwortlichen Prozesse sollten genauso beschrieben werden,
wie
potentielle
Wege
der
zellulären
Aufnahme
der
beiden
PpIX-
Vorläufersubstanzen. Auf Basis eines solchen Zellkulturmodells sollten in der Folge verschiedene
Pathologie-relevante
Parameter
untersucht
werden.
Hierbei
sollten
Untersuchungen zur mitochondrialen Funktion und Dysfunktion Fluoreszenz-mikroskopisch und anhand verschiedener biochemischer Analysemethoden durchgeführt werden. Dazu kamen Untersuchungen zu den nach der PDT auftretenden Zelltodformen. Insbesondere sollen das Auftreten von Apoptose und Nekrose begutachtet und mit den PDT-Bedingungen korreliert werden. Ein weiterer zentraler Themenkomplex war die Analyse des Einflusses PDT-induzierter ROS auf die neuronale Aktivität. 17
1. Einleitung Diese Untersuchungen wurden mittels der Kalzium-Mikrofluorimetrie (calcium imaging) durchgeführt. PDT-induzierte Veränderungen des zytosolischen Kalziums sollten dabei mit pharmakologischen
Methoden
untersucht
und
beeinflusst
werden.
Effiziente
Kalziumregulation ist absolut zentral für eine einwandfreie Funktion neuronaler Zellen, und deren ROS-vermittelte Beeinträchtigung kann ein Schlüsselkonzept zum Verständnis der Schmerzentstehung in der PDT sein. Zudem sollte die mögliche Freisetzung pro-nozizeptiver Botenstoffe aus epidermalen Zellen in Antwort auf PDT-bedingte ROS analysiert werden. Der Fokus wurde dabei auf Adenosintriphosphat als bekanntes intraepidermales Signalmolekül gelegt. Es sollte hierzu eine Analysemethode etabliert werden, mit der die Freisetzung von ATP aus Zellen der epidermalen Linie HaCaT quantifiziert werden kann. Folglich ergab sich ein zweigeteilter wissenschaftlicher Anspruch des Projekts: (1) Auf präklinischer Seite wurde der Frage nachgegangen, welche Rolle die Sauerstoffradikale in der Aktivierung der schmerzsensitiven Nervenzellen spielen und welche molekularen Mechanismen dem zugrunde liegen. Zudem wurde untersucht, ob freie ROS die Zellen der Haut dazu anregen, mit Neuronen zu kommunizieren. (2) Aus einer klinischen Perspektive sollten die Auswirkungen der Photodynamischen Therapie auf sensorische Neurone auf Basis der gewonnenen Daten besser verstanden werden, um diese Form der Behandlung in Zukunft weiter optimieren zu können.
18
2. Material & Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung Als Versuchstiere wurden Ratten des Auszuchtstammes Wistar der Firma Janvier (Le Genest Saint Isle, Frankreich) sowie deren in der eigenen Tierhaltung erzeugten Nachzuchten verwendet. Die Tiere wurden in einem 12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus in Markrolon Typ IV Käfigen gehalten und hatten stets freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Umgebungstemperatur wurde bei 24°C konstant gehalten. Alle tierexperimentellen Arbeiten wurden
unter
Einhaltung
der
aktuellsten
Bestimmungen
der
Deutschen
Tierschutzverordnung durchgeführt. Ratten beiden Geschlechts wurden im Alter von drei bis sieben Tagen nach der Geburt den Versuchen zugeführt. 2.1.2 Zelllinien Für die sekundäre Zellkultur wurden Zellen der Linie HaCaT (Cell Lines Service, Eppelheim Deutschland) in den Passagen 50 – 70 verwendet. Bei HaCaT-Zellen handelt es sich um eine aus normalen, nichtpathologischen humanen Keratinozyten in vitro spontan immortalisierte Zelllinie. Die Zellen wurden unter S1-Bedingungen in einem hierfür zugelassenen Labor kultiviert und bearbeitet.
2.1.3 Laborchemikalien, Reagenzien, Puffer und Medien Tabelle 2.1: Laborchemikalien und Reagenzien
Substanz 1,2 Diaminocyclohexan-NNNtetra-Essigsäure (CDTA) Adensosintriphosphat (ATP) β-Alanin Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)
Quelle Merck Applichem Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich
Coenzym A x 2 H2O
Applichem
Collagenase Typ I δ-Aminolevulinsäure HCl Dimethyl sulfoxid 3-3‘-Diaminobenzidin (DAB)
Worthington Biofrontera AG Sigma-Aldrich Fluka
DTT
Applichem 19
2. Material & Methoden
EDTA Fluorescein Diacetat (FDA) Fura-2/AM
Applichem
γ-Aminobuttersäure (GABA)
Sigma-Aldrich
Glyzin
Sigma-Aldrich
Guvacine
Sigma-Aldrich
Hoechst 33342
Sigma-Aldrich
JC-1 L-Alanin Laminin
Molecular Probes Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich
L-Arginin
Sigma-Aldrich
L-Asparagin L-Cystein L-Glutamat
Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich
L-Glutamin
Sigma-Aldrich
L-Histidin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin L-Methionin L-Phenylalanin L-Threonin L-Tyrosin L-Valin Methyl-aminolevulinsäure HCl Mibefradil Dihydrochlorid Hydrat N-Acetyl-L-Cystein Nerve Growth Factor, 2.5S murine Nimodipine Paraformaldehyd Poly-D-Lysin Propidium Iodid Rhodamine-123 (S)-SNAP 5114 Thapsigargin Triton X-100 TRIzol® Trypsin Trypsin/EDTA, 1x (0,25% Trypsin, 1 mM EDTA) ω-Conotoxin MVIIC
Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Promega Tocris Sigma-Aldrich Gibco Sigma-Aldrich Molecular Probes Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Invitrogen Gibco
Sigma-Aldrich Invitrogen
Invitrogen Tocris Bioscience
20
2. Material & Methoden
Kit CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS-Test) CellTiterGlo® ATP Assay RevertAid® cDNA Synthese Kit
Quelle Promega Promega Fermentas
Alle weiteren Chemikalien wurden im höchsten erhältlichen Reinheitsgrad bei folgenden Herstellern bezogen: J.T. Baker, Merck, Riedel-de Haen, Sigma-Aldrich.
Liste der Puffer und Medien A: Puffer und Medien für die Zellkultur Medium zur Kultiverung der HaCaT-Zellen Dulbeccos’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Gibco) + 10% Fötales Kälberserum (FCS; Invitrogen) Medium zur Kultivierung der DRG Neurone (Vollmedium) Dulbeccos’s Modified Eagle’s Medium: F12 Nutrient Mixture mit GlutaMax® (DMEM/F12 1:1; Gibco) mit Phenolrot + 10% Normales Pferdeserum (NHS; Invitrogen) + 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco) + 50 ng/ml Nerve Growth Factor (NGF) 2,5 S Medium für die 5-ALA und MAL Aufnahme (Aufnahmemedium) Dulbeccos’s Modified Eagle’s Medium: F12 Nutrient Mixture mit GlutaMax® (DMEM/F12 1:1; Gibco) ohne Phenolrot + 50 ng/ml Nerve Growth Factor (NGF) 2,5 S Waschmedium (für die Aufnahmeexperimente) Dulbeccos’s Modified Eagle’s Medium: F12 Nutrient Mixture mit GlutaMax® (DMEM/F12 1:1; Gibco) ohne Phenolrot
21
2. Material & Methoden Aufnahmepuffer (nach Gederaas et al. 2001) 10 mM HEPES
6 mM KOH
150 mM NaCl
5 mM Glucose in
1,2 mM CaCl2 0,64 mM MgCl2
pH auf 7.4 eingestellt mit 5 M NaOH
Phosphat - gepufferte Saline (PBS) pH 7,4 137 mM NaCl;
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
1,76 mM KH2PO4
in A. dest. gelöst und sterilfiltriert Lysepuffer 125 mM TRIS/HCl pH 7,8
10% (v/v) Glycerol
2 mM DTT
1% (v/v)Triton X-100
2mM CDTA
in A. dest.; sterilfiltrieren
Extraktionspuffer 17,5 ml Methanol 5 ml Perchlorsäure 12,5 ml A. dest.
B: Puffer für die Immunzytochemie 0,2 M Phosphatpuffer (PB), pH 7,4 27,34 g
Na2HPO4
6,35 g
NaH2PO4 ad 1 l VE H20
22
2. Material & Methoden 4% (w/v) Paraforaldehyd (PFA), pH 7,4 400 ml
A. bidest.
40 g
PFA Bei max 60°C unter Rühren lösen 2 NaOH Plätzchen zufügen Lösung filtrieren
500 ml
0,2 M PB mit VE H20 auf 1 l auffüllen
0,01 M Phosphat-gepufferte Saline (PBS), pH 7,4 50 ml
0,2 M PB
950 ml
VE H2O
9g
NaCl
Diaminobenzidine (DAB) – Stammlösung 7g
DAB
100 ml
0,1 M PB
DAB – Gebrauchslösung 2 ml
DAB – Stammlösung ad 200 ml 0,1 M PB, filtriert
Lösung A: 3% Methenamin 6g
Methenamin
200 ml
VE H2O
Lösung B: 2,5% Di-Natriumtetraborat 0,5 g
Di-Natriumtetraborat
20 ml
VE H20 23
2. Material & Methoden Goldchloridlösung (AuCl4) 20 µl
5% Goldchlorid-Stammlösung
2 ml
VE H2O
Lösung D: 2,5% Natriumthiosulfat 5g
Natriumthiosulfat
200 ml
VE H2O
Silbernitratlösung 0,5 g
Silbernitrat
10 ml
VE H2O
C: Puffer für die Kalzium-Mikrofluorimetrie Extrazellulärlösung mit 2 mM Kalzium 140 mM NaCl
2 mM CaCl2
5 mM KCl
10 mM HEPES
1 mM MgCl2
pH 7,4; 300 mOsm
Kalziumfreie Extrazellulärlösung 140 mM NaCl
10 mM EGTA
5 mM KCl
10 mM HEPES
1 mM MgCl2
pH 7,4; 300 mOsm
Depolarisierende Extrazellulärlösung mit hohem Kaliumgehalt (High K+) 100 mM NaCl
10 mM EGTA
50 mM KCl
10 mM HEPES
1 mM MgCl2
pH 7,4; 300 mOsm
24
2. Material & Methoden Natriumfreie Extrazellulärlösung 140 mM Cholin
2 mM CaCl2
5 mM KCl
10 mM HEPES
1 mM MgCl2
pH 7,4; 300 mOsm
D: Puffer und Lösungen für die molekularbiologischen Methoden TE – Puffer 0,1 M
Tris/HCl, pH 7,4
0,01 M
EDTA
Ethidiumbromid – Lösung 10 mg/ml
Ethidiumbromid
50-fach TAE – Puffer, pH 8,0 2M
Tris-HCl
1M
Essigsäure
50 mM
EDTA
DNA – Gel – Ladepuffer 40% (w/v)
Saccharose
0,025% (w/v) Bromphenolblau 0,025% (w/v) Xylencyanol
25
2. Material & Methoden 2.1.4 Laborgeräte Tabelle 2.2: Liste der Laborgeräte
Gerät
Typ
Hersteller
Aufrechtes Mikroskop Inverses Mikroskop I Inverses Mikroskop II Inverses Mikroskop III Konfokales Mikroskop Argon-Laser Ti:Sapphire Laser Kameras für die mikroskopische Fotodokumentation CCD-Kameras für die Mikrofluorimetrie Fluoreszenz - Multiplate-Lesegrät Mikrotiterplattenleser
Axioskop 2 DMI 4000 B Axiovert 200 TMS LSM 510 META
Zeiss Leica Zeiss Nikon Zeiss Spectra Physics Spectra Physics
DFC 350 FX
Leica
Axiocam MRM Mithras LB 940 Multiskan RC RoboCycler Gradient
Zeiss Berthold Labsystems
Thermocycler
Stratagene
2.1.5 Antikörper und Oligonukleotide Tabelle 2.3: Liste der verwendeten Antikörper und Detektionsreagenzien
Antigen
Antikörper/ Detektionsreagenz
Hersteller
Verdünnung
β Tubulin isotype III
Maus-anti-βIII-Tubulin Monoklonal (Klon SDL.3d10)
Sigma
1:1000
calcitonin gene related peptide
Schaf-anti-CGRP Polyklonal
Biomol
1:2000
Isolectin B4
Invitrogen
1:250
Kaninchen-anti-clCasp-3 polyklonal
Cell Signaling
1:400
Primär
N-acetyl-DGalactosamin gespaltene Caspase-3 (17/19 kD Fragment) Sekundär
Maus IgG (Fc)
CY3-konjugierter-PferdJackson anti-Maus IgG ImmunoResearch polyklonal
1:400
Schaf IgG (Fc)
biotinylierter-KaninchenJackson anti-Maus IgG ImmunoResearch polyklonal
1:300
Kaninchen IgG (Fc)
iotinylierter-Ziege-antiKaninchen IgG polyklonal
Jackson ImmunoResearch
1:300
26
2. Material & Methoden Tabelle 2.4: Liste der verwendeten Oligonukleotide für die PCR
Gen
Basen
Oligonukleotid Sequenzen (5' → 3')
Produktgröße (bp)
GAT-1
757-776 903-922 18-37 183-202 398-417 569-588
GGCTAGACAAGCCAGGACAG CCACGGAAGAACAGGATGAT CATCCGGTAGAACGGAAAGA TCCTCCACCTTCTCCATGAC ATGCAACACAGGTGATCGAG CTGCAGGGACACATGACTGT
166
GAT-2 GAT-3
185 191
Die Primer wurden unter Verwendung von GeneBank Sequenzen mit Hilfe der Primer3 Software erzeugt. Optimale Paare wurden ausgewählt und mit anderen klonierten Genen mit Hilfe von BLAST Suchen verglichen, um hohe Spezifität zu garantieren.
2.2 Methoden 2.2.1 Anlegen der Primärkulturen aus dem Hinterwurzelganglion der Ratte Es wurden hierzu zunächst die Hinterwurzelganglien von 3 -7 Tage alten Ratten-Jungtieren präpariert. Die verwendete Methode basiert auf der Vorgehensweise, die Malin et al. (2007) für adulte Mäuse beschrieben haben, wobei einige Schritte abgeändert und angepasst wurden. Die Ratten wurden durch Dekapitieren getötet und der dorsale Teil der Wirbelsäule wurde entfernt. Die Hinterwurzelganglien konnten nun einzeln mit Pinzetten entnommen werden, wobei zervikal begonnen und sich auf das sakrale Ende zugearbeitet wurde. In etwa 40 Ganglien konnten so pro Tier gesammelt werden. Diese wurden in eiskaltem Leibovitz L-15 Medium (Sigma-Aldrich) gesammelt. Für den enzymatischen Verdau wurden die Ganglien nach Abtrennung verbleibender Nervenwurzeln in vorgewärmtes L-15 Medium mit 0,1% (w/v) Collagenase Typ I (Worthington) und 0,25% (w/v) Trypsin (Invitrogen) überführt und darin für 45 min bei 37°C inkubiert. Danach wurden die verdauten Ganglien für 3 min bei 163 x g abzentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 2 ml DRG-Kulturmedium (DMEM/F12 1:1; Invitrogen) mit 10% (v/v) normalem Pferdeserum (NHS), 100 Units/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomyzin (Gibco) resuspendiert. Die Gewebestücke wurden danach einige Male durch eine 1000 µl Pipettenspitze trituriert, bis sich eine leicht trübe Suspension ohne erkennbare Gewebestücke bildete. Diese Zellsuspension wurde dann durch ein Zellsieb (BD Falcon) mit einer Maschenweite von 100 µm gegeben. Das Zellsieb wurde daraufhin mt 10 ml Kulturmedium gewaschen und die erhaltenen 12 ml Zellsuspension wurden bei 17 x g für 12 min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das erhaltenen Pellet wurde vorsichtig in 1 ml Kulturmedium, diesmal mit zusätzlich 50 ng/ml Nervenwachstumsfaktor NGF (nerve growth factor; 2,5S aus der Maus; Promega), resuspendiert. Die Zellzahl wurde mittels einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Hierbei wurden immer alle acht Zählfelder ausgewertet und der Mittelwert 27
2. Material & Methoden berechnet. Die Zellen wurden dann in der benötigten Dichte in verschiedenen Kulturgefäßen (siehe hierzu die individuellen Versuchsbeschreibungen) ausgesät. Hierbei wurde nun immer das Kulturmedium mit 50 ng/ml NGF verwendet. Nach 24 h in Kultur bei 37°C und 5% CO2 wurde die Hälfte des Kulturmediums abgenommen und durch frisches Kulturmedium ersetzt. Die Versuche wurden immer 48 h nach dem Anlegen der Zellkulturen durchgeführt. Tabelle 2.5: Zelldichte der DRG-Neurone in verschiedenen Kulturgefäßen Kulturgefäß
Zellzahl
Volumen (Medium)
Verwendung PpIX - Messung (Lysat)
96-Well-Platte
5.000 Neurone / Well
100 µl / Well
MTS-Test ATP-Assay Immunzytochemie
24-Well-Platte
15.000 Neurone / Well
500 µl / Well
Apoptosenachweis Nekrosenachweis Morphologie PpIX – Messung
30 mm Schale
30.000 – 50.000 Neurone / Schale
(Mikroskop) 1,5 ml / Schale
JC-1 Assay calcium imaging
2.2.2 Kultivierung von HaCaT-Zellen In flüssigem N2 kryokonservierte HaCaT-Zellen wurden wie folgt in Kultur genommen: Die Zellen wurden dem Tank entnommen und sofort für 2 min im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. In einem 15 ml Zentrifugenröhrchen wurden 4 ml Kulturmedium (DMEM mit 10% FCS) vorgelegt. Der Inhalt des Kryoröhrchens wurde daraufhin in das Zentrifugenröhrchen gegeben und für 5 min bei 163 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, und das Zellpellet in 4 ml (für 60 mm Schalen, T25 Flaschen) bzw. in 12 ml (für 10 mm Schalen, T75 Flaschen) des entsprechenden Mediums resuspendiert. Die Suspension wurde in das vorbereitete Kulturgefäß transferiert und im CO2-Inkubator bebrütet. Nach 24 h wurde das Medium abgesaugt, die Zellen durch Zugabe von PBS gewaschen und ein entsprechendes Volumen neuen Kulturmediums (DMEM, 10 % FCS) zugegeben. Beim Erreichen konfluenten Wachstums wurden die Zellkulturen subkultiviert, um sie zu erhalten, bzw. in größere Gefäße zu expandieren. Von konfluenten Kulturen wurde das Medium abgesaugt. Die Zellen wurden in einem halben Mediumvolumen mit PBS gewaschen und entsprechend des Kulturgefäßes mit Trypsin/EDTA versetzt. Nun erfolgte 28
2. Material & Methoden eine Inkubation im Brutschrank bei 37°C für 3-5 min. Anschließend wurden die Trypsinierung DMEM mit 10% FCS gestoppt und die Zellen bei 163 x g pelletiert. Nach Resuspension in DMEM mit 10% FCS wurde die Zellzahl bestimmt, wenn die Zellen für die ATP-Messungen in einer Dichte von 100.000 Zellen / ml in Multiwellplatten (100 µl pro Well) ausgesät werden sollten. Ansonsten wurde zum Erhalt der Kulturen bei einem Faktor von 1:10 subkultiviert. Die Zellen wurden jeweils 48 h vor den ATP-Messungen ausgesät. 2.2.3 Immunzytochemische Färbungen Die hier beschriebenen Methoden beziehen sich auf die Färbungen mit neuronalen und Subtyp-Markern. Da zum Nachweis der Immunreaktivität gegenüber gespaltener Caspase-3 ein anderes Protokoll verwendet wurde, ist dieses weiter unten separat aufgeführt. Die verwendeten Antikörper und Färbereagenzien sind Abschnitt 2.1.3 zu entnehmen. Zellen, die für die Immunzytochemie bestimmt waren, wurden für 48 h auf 10 mm Deckgläsern kultiviert und anschließend unter Einsatz von 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei 4°C fixiert. Danach wurden die Zellen dreimal mit 0,01 M Phosphat-gepufferter Saline (PBS; Gibco) gewaschen, woraufhin eine 5% - Lösung des Serums derjenigen Spezies in PBS zugegeben wurde, in der der zu verwendende Sekundärantikörper erzeugt wurde. Dies diente dem Blockieren von unspezifischer Bindung. Dieser Lösung wurde zusätzlich 0,1% (v/v) Triton X-100 (Sigma) zur Permeabilisierung der Zellmembran beigefügt. Bei Doppelfärbungen wurde hier 5% FCS eingesetzt. Der Blockierungsschritt dauerte 45 min bei RT. Nun wurde, ohne weiteres Waschen, die Blockierungslösung durch die in 0,01 M PBS verdünnten Primärantikörper ersetzt. Tabelle 2.1 fasst die eingesetzten Antikörpern und Verdünnungen zusammen. Wenn eine Färbung mit Isolectin B4 durchgeführt wurde, wurden dem PBS noch 1 µM CaCl2 hinzugefügt. Die Zellen mit den Primärantikörpern oder IB4 wurden daraufhin über Nacht bei 4°C inkubiert. Am Folgetag wurde der Primärantikörper enfernt und die Ansätze dreimal mit PBS gewaschen. Danach erfolgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper für 60 min bei Raumtemperatur. Wenn ein biotinylierter Sekundärantiköper verwendet wurde, wurde eine Inkubation mit Avidin-Fluorescin D (AviFiTC; Vector Labs) für 45 min bei RT angeschlossen. Eine Kernfärbung wurde mit einer Lösung von 10 µg/ml Hoechst 33342 (Sigma) in 0,01 M PBS durchgeführt. Hierfür wurden die Zellkulturen nach dreimaligem Waschen nach Entfernen des Sekundärantikörpers (oder AviFiTC) für 20 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläser mit VectaShield Eindeckmedium (Vector Labs) auf Superfrost® Objektträger (Thermo Fisher Scientific) aufgezogen und bis zum Mikroskopieren bei 4°C dunkel gelagert. Die mikroskopische Analyse erfolgte an einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop, hierbei wurden Standardfilter
29
2. Material & Methoden für die gewählten Fluoreszenzeigenschaften (FiTC; TriTC und Hoechst) verwendet. Die Dokumentation erfolgte über digitale Fotographie (zu den Kameras siehe 2.1.4).
2.2.4 Aufnahme von 5-ALA und MAL Die Experimente zur 5-ALA oder MAL Aufnahme und somit induzierter PpIX-Synthese erfolgten in zwei Schritten: (1) dem Aufnahmeschritt, der konstant 30 min lang war und (2) dem Syntheseschritt, der in seiner Länge variiert wurde. Zwischen diesen beiden Schritten erfolgte immer ein Waschschritt mit DMEM/F12. Der Syntheseschritt wurde mit 1 h, 2 h oder 4 h bemessen, oder in einigen Fällen auch weggelassen, in diesen Fällen sind 0 h Synthese angegeben. Auch die später beschriebenen, funktionellen Untersuchungen basieren auf dieser Zweiteilung von Aufnahme und Syntheseintervall. Abbildung 2.1 veranschaulicht die Vorgehensweise.
Waschen 5-ALA MAL
PpIX - Messung
(+/- Block)
PpIX Synthese
30 min
0–4h in vitro PDT
Abbildung 2.1: Durchführung der 5-ALA und MAL Experimente. Der grundsätzliche Aufbau der Experimente wurde stets gleich gehalten. Zu Beginn erfolgte immer die Inkubation mit dem PpIXVorläufer für 30 min, gefolgt von einem Waschschritt und verschieden langen Synthesephasen für PpIX. Am Ende dieser Phase wurde entweder das gebildete PpIX gemessen, oder die Zellkulturen wurden der in vitro PDT zugeführt. Hier schlossen sich verschiedene weitere Analysen an.
Die Inkubation mit 5-ALA oder MAL erfolgte entweder in DMEM/F12 ohne Phenolrot aber mit 50 ng/ml NGF (Aufnahmemedium) oder in einem Aufnahmepuffer nach Gederaas et al. (2001). Die Zusammensetzung dieses Puffers ist unter 2.1.3 aufgeführt. Es wurden 5-ALA und MAL Konzentrationen von 0,6 mM, 1,8 mM und 6 mM eingesetzt. Die Kontrollbedingung, bei der zwar Aufnahmemedium oder Puffer verwendet wurden, aber kein 5-ALA oder MAL eingesetzt wurde, werden in der Folge auch Vehikel-Bedingung genannt. Der pH-Wert der 5ALA oder MAL Stammlösungen, die täglich frisch angesetzt wurden, wurde mit 5 M NaOH 30
2. Material & Methoden auf 7,4 eingestellt. Nach Aufnahme- und Syntheseintervall wurden die Zellkulturen entweder den PpIX-Messungen oder der in vitro PDT zugeführt.
2.2.5 Aufnahme von 5-ALA und MAL in Gegenwart von Inhibitoren Zur Analyse der Aufnahmewege, wurden DRG Kulturen mit 5-ALA bzw. MAL und Substanzen inkubiert, die potentiell inhibitorisch auf den Membrantransport wirken. Diese Versuche wurden, wie oben beschrieben, in 96-Well-Platten durchgeführt. Bei diesen Experimenten wurden 0,6 mM 5-ALA bzw. 1,8 mM MAL mit verschiedenen Konzentrationen der Blocker und Inhibitoren zu den Zellen gegeben. Die gemeinssame Inkubation erfolgte während der Aufnahmephase für 30
min, beide Substanzen wurden dabei im
Aufnahmepuffer gelöst. Nach Beendigung der Aufnahmephase erfolgte ein Waschschritt mit Aufnahmemedium ohne NGF, und die Zellen wurden wie unter 2.2.4 beschrieben der Synthesephase zugeführt. Diese dauerte bei den Inhibitionsexperimenten immer 2 h. Die PpIX-Messung erfolgte wie im kommenden Abschnitt erläutert. Alle Messungen wurden als Dreifachbestimmungen durchgeführt, und Hintergrundwerte aus Lyse- und Extraktionslösung wurden von allen erhaltenen Werten subtrahiert. Um auszuschließen, dass eine reduzierte PpIX-Synthese durch zelltoxische Eigenschaften der verwendeten Substanzen zustande kam, wurden die Zellkulturen nach dem Aufnahme- und Syntheseschritt mikroskopisch auf Anzeichen der Zellatrophie untersucht.
2.2.6 Analyse der PpIX-Synthese Die PpIX-Bildung in den kultivierten sensorischen Neuronen wurde entweder mikroskopisch oder anhand von Zelllysaten im Fluorimeter analysiert. Die mikroskopische Analyse erfolgete einerseits
auf
Basis
der
Epifluoreszenz
oder
Anhand
der
Zwei-Photonen-
Konfokalmikroskopie. Die eingesetzten Mikroskope sind unter 2.1.4 aufgelistet.
2.2.6.1 Mikroskopische Analyse der PpIX-Bildung Für die mikroskopische Analyse der PpIX-Bildung wurden DRG Neurone in einer Gesamtzahl von 30.000 Zellen auf 30 mm Deckgläsern verwendet. Kultur und 5-ALA bzw. MAL Aufnahme erfolgten wie zuvor beschrieben. Bei den Untersuchungen zur PpIXEpifluoreszenz wurde ein speziell angelegter Filtersatz verwendet, dieser bestand aus: einem 420 nm Anregungsfilter, einem 470 nm Strahlteiler und einem 620 nm Emissionsfilter. 31
2. Material & Methoden Anregungs- und Emissionsfilter waren beides Bandpassfilter. Als Lichtquelle diente eine 120 W Quecksilber-Kurzbogenlampe. Zellen mit neuronaler oder anderer typischer Morphologie wurden in der Phasenkontrastoptik identifiziert und dann sofort auf die PpIXFluoreszenz hin untersucht. Dabei wurde die Belichtungszeit immer konstant gehalten, und darauf geachtet, dass die Kulturen nicht unbeabsichtigt Lichtquellen ausgesetzt waren, um ein Bleichen zu reduzieren. Zellen, die nicht mit 5-ALA oder MAL inkubiert wurden dienten als Kontrollbedingung. Die Dokumentation erfolgte über digitale Fotographie (zu den Kameras siehe 2.1.4). Die Analyse der PpIX-Fluoreszenz am konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM 510 META) wurde an identisch ausgesäten Zellkulturen durchgeführt. Für die Zwei-Photonen-Anregung wurde ein im Femtosekundenbereich modengekoppelter Ti:Sapphire –Laser (110 fs; 76 MHz; Mai Tai) verwendet. Die Anregungswellenlänge betrug 820 nm, zur Detektion der Emission wurde ein 685 nm Kurzpassfilter verwendet, die Lochblende war dabei maximal geöffnet. Als Objektiv diente ein Zeiss Achroplan 40x/0,8 W. Bei der Durchführung der Meta-Scans wurde derselbe Laser verwendet, hier wurde jedoch die Intensität der emittierten Fluoreszenz mit Hilfe eines Metadetektors über ein Spektrum von 457 – 703 nm in diskreten 11 nm Schritten analysiert. Hierbei wurde ein Bereich von 512 x 512 Pixeln analysiert, dabei betrug die Messzeit pro Pixel 1,6 µs. Zur Anfärbung der Mitochondrien wurde in diesen Versuchen Rhodamine-123 in einer Konzentration von 10 µg/ml, gelöst in DMSO und verdünnt in Kulturmedium, verwendet. Die Inkubationszeit in Rhodamine-123 betrug 30 min. Zur Darstellung der RhodamineFluoreszenz wurde ein CW-Argon-Ionenlaser mit λ = 488 nm als Anregungslichtquelle eingesetzt. Das verwendete Objektiv war ein Zeiss Achroplan 40x/0,8 W.
Die Emission
wurde mit Hilfe eines 500-550 nm Bandpassfilter begutachtet.
2.2.6.2 Analyse der PpIX-Bildung im Fluorimeter Sollte die PpIX-Bildung in Zelllysaten quantitativ analysiert werden, wurden die DRG Neurone zu 5.000 Zellen pro Well in 96-Well-Platten kultiviert. Anschließend erfolgten die Schritte zur 5-ALA oder MAL Aufnahme, teilweise auch in Gegenwart von Inhibitoren oder Kompetitoren.
Bei
all
diesen
Versuchen
wurden
jegliche
Bedingungen
in
Dreifachbestimmung analysiert, zudem wurde immer Hintergrundwerte in Wells bestimmt, die keine Zellen enthielten. Hier wurden dann nur Lyse- und Extraktslösungen gemessen. Eine Interaktion der Puffersubstanzen mit PpIX, welche die Fluoreszenz beeinträchtigen könnte, wurde in Vorversuchen ausgeschlossen. 32
2. Material & Methoden Am Ende der PpIX - Synthesezeit wurde die Zellen zunächst mikroskopisch gemäß ihrer Vitalität untersucht. Versuchsbedingungen, die eine Atrophie oder ein Abschwimmen der Zellen auslösen, sollten somit rechtzeitig identifiziert werden. Das Medium wurde sodann von den Zellkulturen abgenommen, und diese dann mit 20 µl Lysepuffer versetzt (siehe 2.1.3). Dieser blieb 5 min auf den Zellen, während diese auf einem planorbitalen Schüttler bei ca. 60-80 rpm im Dunkeln geschüttelt wurden. Am Ende dieses Vorgangs wurde die Lyse der Zellen mikroskopisch kontrolliert. Nach vollständiger Lyse wurden 80 µl der PpIXExtraktionslösung zu den Lysaten gegeben (siehe 2.1.3).
Daraufhin wurden die Lysate
wiederum auf den Schüttler gestellt und im Dunklen 10 min bei 60–80 rpm planorbital bewegt wurden. Die Zellextrakte wurden im Anschluss in schwarze 96-Well-Platten (Greiner, BioOne) übertragen. Die fluorimetrischen Messungen wurden in einem Mithras LB 940 Multiplate-Lesegerät (siehe 2.1.4) durchgeführt. Es wurde eine Anregungswellenlänge von 390 nm und eine Emissionswellenlänge von 620 nm gewählt. Eine integrierte Leseperiode von
10
s
wurde
hierbei
pro
Well
gewährt.
Die
Hintergrundwerte
(Lyse-
und
Extraktionslösung ohne Zellen) wurden danach von den Messwerten abgezogen. Alle Datenpunkte wurden in Dreifachbestimmungen erhoben. Die Darstellung der Messwerte erfolgte in Form von relativen Fluoreszenzeinheiten (relative fluorescence units; RFUs).
2.2.7 Photodynamische Behandlung in vitro Um die Zellkulturen (DRG-Neurone oder HaCaT-Zellen) auf die photodynamische Behandlung in vitro vorzubereiten, wurde eine 5-ALA Aufnahme wie in 2.2.4 beschrieben durchgeführt. Die jeweilig durchgeführten Synthesezeiten und eingesetzten 5-ALA Konzentrationen sind für die einzelnen Experimente separat angegeben. Im Rahmen der funktionellen Studien wurden ausschließlich Aufnahmeschritte in Medium durchgeführt. Die Zellen verbliebem nach Ende der Synthesezeit im Aufnahmemedium, und wurden daraufhin mit einer PhotoDyn®750– DT-Lampe der Firma Hydrosun Medizintechnik (Müllheim) bestrahlt. Um ein Überhitzen der Zellkulturen zu vermeiden wurden diese hierbei auf Eis platziert. Die aus Lampenwärme und Kühlung durch Eis entstehende Temperatur auf Höhe der Zellkulturen wurde dabei überwacht und betrug ca. 25–26°C. Durch den Einsatz eines Langpassfilters (BTE 41, Hydrosun Medizintechnik), waren die Wellenlängen der Bestrahlung größer als 590 nm. Die durchschnittliche Leistung des Lichts betrug bei voll ausgezogenem Abstandhalter der Lampe (28 cm Abstand zu den Kulturen) 200 W/cm². Die Dauer der Bestrahlung betrug für die Neuronenkulturen 10 min, diese resultiert in einer Lichtdosis (total fluence) von 120 J/cm². Die HaCaT-Zellen wurden für 20 min der Lichtquelle ausgesetzt, hier betrug die Lichtdosis folglich 240 J/cm². 33
2. Material & Methoden Alle anschließenden Experimente bezüglich funktioneller Parameter oder des Zelltods wurden entweder unmittelbar nach der in vitro PDT durchgeführt, oder es wurde, wenn angegeben, eine weitere Inkubation der Zellkulturen im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 vorgenommen. Im Rahmen der mikrofluorimetrischen Analyse des zellulären Kalziums, wurde eine in vitro PDT direkt unter dem Mikroskop durchgeführt. Die dabei genutzte Methode unterscheidet sich von der hier beschriebenen, und wird in Abschnitt 2.2.9.2 im Detail erläutert.
2.2.8 Analyse der PDT-vermittelten Zellschädigung 2.2.8.1 Analyse der Zellmorphologie und Videomikroskopie Die Zellmorpholgie der Neuronenkulturen nach PDT wurde anhand der Videomikroskopie in Phasenkontrastoptik analysiert. Hierzu wurden pro Well einer 24-Well-Platte je 15.000 Neurone ausgesät, mit PDT behandelt und analysiert. Der Start der Videomikroskopie erfolgte
unmittelbar
nach
Ende
der
Bestrahlung.
Es
wurde
ein
automatisiertes
Videomikroskopiesystem der Firma Zeiss verwendet, welches an einem Zeiss-Axiovert 200 Mikroskop angebracht war. Die Betrachtungen erfolgten im Phasenkontrast mit einem 20x Objektiv. Während der Aufnahme wurden die Zellkulturplatten auf dem motorisierten Mikroskoptisch bei einer Temperatur von 37°C und einem CO2 – Gehalt von 5% inkubiert. Es wurde pro analysiertem Well ein Gesichtsfeld definiert, das mit einer Frequenz von einem Bild pro Minute über den Gesamtzeitraum von 3 h dokumentiert werden konnte. Es war Zudem möglich, mehrere Wells parallel mit vorher eingestellten Gesichtsfeldern zu dokumentieren, was eine Analyse von mehreren Bedingungen Seite an Seite erlaubte. Die erhaltenen Einzelbilder wurden mit Hilfe einer geeigneten Software zu Zeitraffer – Videos konvertiert, hierbei wurde die Bildrate pro Zeiteinheit auf 10 Bilder / Sekunde festgelegt.
2.2.8.2 Analyse des mitochondrialen Membranpotentials mit dem Farbstoff JC-1 Von dem Farbstoff JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine Iodid; Molecular Probes) wurden 1 mg/ml Stammlösungen in DMSO hergestellt. Diese wurden bei -20°C gelagert. Die Verdünnung des Farbstoffs auf die experimentell verwendete Konzentration von 2 µg/ml erfolgte in DMEM/F12 ohne Phenolrot. JC-1 wurde unmittelbar nach der PDT zu den Zellkulturen (30.000 Neurone in 30 mm Schalen) gegeben, und 20 min auf den Zellen belassen. Danach erfolgten zwei Waschschritte mit DMEM/F12 und die Zellen wurden zur Analyse am inversen Mikroskop in DMEM/F12 ohne Phenolrot, mit 50 ng/ml NGF 34
2. Material & Methoden belassen. Die Mikroskopische Analyse erfolgte, indem in der Phasenkontrastoptik (40x Objektiv) zunächst Zellen mit neuronaler Morphologie identifiziert wurden, woraufhin die Analyse im FiTC/GFP Kanal (485 nm Anregung / 535 Emission) und im TriTC/CY3 Kanal (535 nm Anregung / 580 nm Emission) erfolgte, hierbei wurden die Expositionszeiten zwischen den unterschiedlichen experimentellen Bedingungen gleich gehalten. Die Dokumentation erfolgte mit Hilfe einer geeigneten Digitalkamera. Es wurden dabei Überlagerungen der beiden Fluoreszenzkanäle erstellt.
2.2.8.3 Analyse der mitochondrialen Enzymfunktion (MTS-Test) Zur Analyse der mitochondrialen Oxidoreduktase-Funktion wurde die Substanz 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,
inneres
Salz (MTS) verwendet. Diese wurde dafür dem CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay der Firma Promega entnommen. Da die Bioreduktion von MTS zu einem löslichen Formazan-Produkt größtenteils von mitochondrialen Oxidoreduktase-Enzymen geleistet wird (Bernas et al. 2002), stellen hier erhaltene Ergebnisse eine Abschätzung der mitochondrialen Enzymfunktion dar. Die MTS-Tests wurden gemäß der Vorgaben der Firma Promega durchgeführt. Es wurden hierzu Neurone verwendet, die in 96-Well-Platten kultiviert wurden (5.000 Neurone pro Well). Nach Durchführung der in vitro PDT wurden die Zellen und die entsprechenden Kontrollen durch Zugabe von 20 µl MTS-Reagenz pro Well auf ihre Oxidoreduktase-Aktivität hin untersucht. Dies geschah entweder unmittelbar nach der PDT oder es wurde eine 2 h Inkubationszeit im Inkubator vor dem MTS-Test angesetzt. Das MTS-Reagenz wurde nach Zugabe für 75 min auf den Zellkulturen im Inkubator belassen. Im Anschluss daran erfolgte die Messung der optischen Dichte bei 450 nm im ELISA-Lesegerät (LabTek). Hintergrundwerte wurden gewonnen, indem entsprechendes Kulturmedium ohne Zellen mit dem MTS-Reagenz versetzt, und nach 75 min im Inkubator ebenfalls gemessen wurde. Als Kontrollbedingung wurden Neurone analysiert, die durchweg in Vollmedium (DMEM/F12 mit Phenolrot, 10% NHS und 50 ng/ml NGF) kultiviert waren, und nicht dem Licht der PDT-Lampe ausgesetzt wurden. Alle Datenpunkte wurden in Dreifachbestimmungen erhoben. Die hier erhaltenen Werte wurden zur Standardisierung der experimentellen Daten verwendet. In einigen Versuchen wurde die Substanz N-acetyl-L-Cystein (NaC) als Antioxidans eingesetzt. Dieses wurde, da nicht bekannt ist, ob es die 5-ALA – Aufnahme beeinflusst, erst während der Synthesephase zu den Zellkulturen gegeben. Dabei wurden verschiedene Konzentrationen verwendet. NaC blieb auch während der in vitro PDT auf den Zellkulturen. Vor der Zugabe des MTS-Reagenz wurde es allerdings durch dreimaliges Waschen mit 35
2. Material & Methoden Aufnahmemedium (DMEM/F12 ohne Phenolrot mit 50 ng/ml NGF) entfernt, da es nachweislich auch im zellfreien Ansatz MTS zu Formazan reduziert und die Experimente somit stört.
2.2.8.4 Bestimmung des zellulären Energiehaushalts durch ATP-Messung Zur Messung des intrazellulären ATP-Spiegels wurden Neurone verwendet, die in 96-WellPlatten (5.000 Neurone / Well) kultiviert wurden. Die Zellen wurden nach 5-ALA–Aufnahme und PpIX-Synthese der in vitro PDT ausgesetzt. Danach wurden sie für 30 min im Brutschrank inkubiert (37°C; 5% CO2). Anschließend wurde der CellTiterGlo® ATP Assay der Firma Promega nach Herstellerangaben durchgeführt. Für die Lumineszenzmessungen, die bei diesem Luziferase-basierenden Test nötig sind, wurden die bei der Messprozedur erzeugten Zelllysate unmittelbar vor der Messung in weiße, undurchsichtige 96-Well-Platten (Falcon) überführt. Die Messung der Biolumineszenz erfolgte im Mithras LB 940 Multiplate Lesegerät. Es wurde ein Lumineszenz-Programm mit einer integrierten Lesezeit von 1 s pro Well verwendet. Die erhaltenen Daten wurden auf Kontrollmessungen ohne 5-ALA standardisiert, zudem wurde ein Hintergrundwert mit Nachweisreagenz aber ohne Zellen erzeugt, dieser wurde von den erhaltenen Werten subtrahiert. Alle Datenpunkte wurden in Dreifachbestimmungen
erhoben.
Die
erhaltenen
Daten
sind
in
relativen
Lumineszenzeinheiten (relative luminescence units; RLUs) angegeben.
2.2.8.5 Morphometrie der neuronalen Fortsätze Zur Messung der Degeneration neuronaler Fortsätze, wurden in 24-Well-Platten (15.000 Neurone / Well) auf 10 mm Deckgläsern kultivierte Neurone zunächst der in vitro PDT ausgesetzt. Nach weiteren 60 min im Brutschrank wurden die Zellkulturen durch Zugabe von 4% PFA fixiert. Danach erfolge eine immunzytochemische Färbung (siehe 2.2.3) mit dem anti-βIII-Tubulin Antikörper (siehe Tabelle 2.1). Es wurde dann ein biotinylierter Sekundärantikörper eingesetzt, und die der Nachweis der Antikörperbindung erfolgte mittels 3,3‘-Diaminobenzidin
(DAB)
Färbung.
Hierzu
wurde
eine
Inkubation
mit
dem
Meerrettichperoxidase enthaltenden AB-Komplex (Alexis, Grünberg), (Lösungen A und B des Kits je 1:100 in 0,01 M PBS) für 45 min bei RT angeschlossen. Nach anfänglicher Inkubation in 0,1 M PB, pH 7,4, trat die Farbreaktion durch die
Zugabe von DAB und H2O2
(Endkonzentrationen: 0,07% bzw. 0,003 M) in 0,1 PB als brauner Niederschlag ein. Die Farbreaktion wurde nach 4 – 10 min durch wechseln der Lösung zu kalter 0,1 M PB – Lösung gestoppt. Anschließend wurde mehrfach durch Zugabe von A. dest. gewaschen. Es 36
2. Material & Methoden folgte eine Intensivierung der DAB – gefärbten Zellkulturen. Diese startete mit einer 10 – minütigen Inkubation in den zuvor gemischten Lösungen A und B (siehe 2.1.3) und Silbernitratlösung bei 56°C im Wärmeschrank. Nach einem Waschschritt in A. dest. erfolgte eine Inkubation in Goldchloridlösung für 2,5 min bei RT. Nach wiederholtem Waschen wurden die Färbungen in 2,5% Natriumthiosulfatlösung (Lösung D) 30 s bis 1 min bei RT differenziert. Die Glasobjektträger wurden dann unter Verwendung des Eindeckmediums ImmuMount (Thermo Fisher Scientific) auf Superfrost® Objektträger (Thermo Fisher Scientific) aufgezogen. Mikroskopische Objektträger
Fotografien
wurden
mit
von einem
drei
willkürlich
10x
Objektiv
ausgewählten angefertigt.
Gesichtsfeldern
pro
Diese
der
wurden
morphometrischen Analyse zugeführt. Hierbei wurde mit Hilfe des Programms ImageJ (Version 1.41o; NIH) jeweils die Länge des längste Neuriten eines jeden Neurons vom Soma bis zur Spitze gemessen. Es wurden daraufhin Mittelwerte pro Objektträger für jede PDTBedingung erstellt. Unbestrahlte Zellen, die in Vollmedium gehalten lieferten die Kontrollwerte, auf die die experimentellen Werte normalisiert wurden. Ein solcher Referenzwert wurde bei jeder Präparation angelegt, so dass sich die Werte immer auf begleitende Standards normalisieren ließen.
2.2.8.6 Bestimmung der potentiell apoptotischen Zellpopulation Zur Detektion der potentiell apoptotischen Zellpopulation wurden immunzytochemische Färbungen mit einem Antikörper gegen gespaltene Caspase-3 durchgeführt (siehe Tabelle 2.1). Hierbei wurden Neurone in 24-Well-Platten (15.000 Neurone pro Well auf 10 mm Glasdeckgläsern) mit 5-ALA PDT behandelt. Nach der PDT wurden die Neurone entweder sofort mit 4% PFA fixiert (20 min bei 4°C) oder zuvor noch für verschiedene Zeitspannen (30 min, 1 h, 3 h) im Brutschrank (37°C; 5% CO2) inkubiert. Danach wurde die immunzytochemische Färbung wie bereits unter 2.2.3 beschrieben durchgeführt, anstatt PBS wurde hier jedoch Tris-gepufferte Saline (TBS) verwendet (siehe 2.1.3). Die anschließende DAB-Färbung wurde wie unter 2.2.8.5 beschrieben durchgeführt. Die erhaltenen Färbungen wurden unter dem inversen Mikroskop abwechselnd im Phasenkontrast, zur Identifikation von Zellen mit neuronaler Morphologie, und im Hellfeld, zur Identifikation der gespaltene Caspase-3 positiven Zellen, begutachtet. Dabei wurden pro Deckglas drei willkürliche Gesichtsfelder ausgezählt, wobei zunächst die Gesamtzahl der Neurone im Gesichtsfeld und dann die Zahl der gespaltene Caspase-3 positiven Neurone bestimmt wurde. Somit konnte die Anzahl potentiell apoptotischer Neurone in Prozent bestimmt werden. 37
2. Material & Methoden 2.2.8.7 Bestimmung der potentiell nekrotischen Zellpopulation Zur Bestimmung der potentiell nekrotischen Zellpopulation wurden Neurone verwendet, die in 24-Well-Platten kultiviert wurden (15.000 Neurone pro Well). Nach Durchführung der in vitro PDT wurden die Kulturen für 1 h im Inkubator belassen (37°C; 5% CO2) und danach mit der Propidium Iodid (PI) - Färbelösung im Austausch gegen das Kulturmedium versetzt. Die PI–Färbelösung bestand aus 25 µg/ml Propidiumiodid (Sigma) in 0,01 M PBS (Gibco). Diese Lösung wurde für 10 min bei RT unter Lichtabschluss auf den Zellen belassen. Danach wurde zweimal mit 0,01 M PBS gewaschen und die Zellen wurden in diesem Puffer unter dem
inversen
Mikroskop
analysiert.
Hierbei
wurden
abwechselnd
Bilder
in
Phasenkontrastoptik und im CY3/TRITC Kanal aufgenommen (zwei pro experimenteller Bedingung), dabei wurde ein 10x Objektiv verwendet. Es wurde darauf geachtet, die Expositionszeit gegenüber der Fluoreszenzanregung zwischen den einzelnen Experimenten gleich zu halten. Die erhaltenen Phasenkontrast und Fluoreszenzaufnahmen wurden mit Hilfe einer geeigneten Software (ImageJ; Version 1.41o; NIH) überlagert, so dass anhand dieser Bilder Zellen identifiziert werden konnten, die einerseits neuronale Morphologie aufwiesen, und deren Zellkerne durch Propidiumiodid rot fluoreszierend angefärbt waren. Diese potentiell nekrotischen Neuronenpopulation wurde auf die Gesamtzahl der Neurone in den jeweils analysierten Gesichtsfeldern normalisiert.
2.2.9 Analyse der PDT-induzierten neuronalen Aktivität 2.2.9.1 Kalzium-Mikrofluorimetrie mit dem ratiometrischen Farbstoff Fura-2/AM (calcium imaging) Zur Analyse des Einflusses der in vitro PDT auf die neuronale Aktivität wurde die KalziumMikrofluorimetrie eingesetzt. Es wurden hierbei Neurone verwendet, die auf 30 mm Deckgläsern kultiviert wurden (30.000 Neurone pro Deckglas). Die für die Messungen und die Lichtanregung des PpIX verwendete Lichtquelle war dabei identisch, um die PDT unmittelbar unter dem Mikroskop durchführen zu können. Die Neuronenkulturen wurden mit dem ratiometrischen Kalziumsensor-Farbstoff Fura-2/AM (Grynkiewicz et al. 1985) für 45 min beladen. Hierbei wurde eine Endkonzentration von 3 µM Fura-2/AM verwendet, die durch Verdünnung aus 1 mM Stammlösungen (in DMSO) in Aufnahmemedium erzeugt wurde. Die Zellkulturen wurde sodann in einer speziell angefertigten Messkammer unter dem inversen Mikroskop (Zeiss Axiovert 200) analysiert. Die Messkammer wurde dabei mit der unter 2.1.3 beschriebenen Extrazellulärlösung mit 2 mM Kalzium gefüllt. Das monochromatische Licht für die Analyse und die PDT wurde von einem Filterrad – Monochromator (Lambda DG4, 38
2. Material & Methoden Sutter Instrument Company) erzeugt, der mit einem Uniblitz Vmm–D1 Shutter – Treiber und einem Voltakraft Kondensator verbunden war. Das verwendete Objektiv war ein fluoreszenzoptimierter 20-fach Zeiss Plan–Apochromat (20x/0,75). Die Analyse der emittierten Fluoreszenz erfolgte mit einer cooled charged device Kamera (Zeiss Axiocam MRM). Die Applikation aller während der Messungen zugegebenen Substanzen erfolgte mit Hilfe eines eigens anfertigten, luftdruckbetriebenen Applikationssystem. Das System bestand aus einer Applikationseinheit mit acht Applikationskanälen, die durch eine Bündel aus acht 2 µl Kanülen dargestellt wurde, und einer Absaugungs-Einheit aus einer einzelnen Kanüle zur unmittelbaren Absaugung von applizierten Substanzen. Eine zusätzliche Bad–Zugabe für Extrazellulärlösung und eine Bad–Absaugung, die direkt an der Messkammer angebracht waren, garantierten einen konstanten Flüssigkeitsstand während der gesamten Messung. Für die einfache Messung der Fura-2 Fluoreszenz wurde folgendes Programm verwendet: Es wurden Bildsequenzen mit den Anregungswellenlängen 340 nm und 380 nm aufgenommen. Hierbei wurden immer Bilderpaare für beide Wellenlängen generiert. Die Belichtungszeit betrug hierbei immer 100 ms, die Wiederholungsfrequenz war 1 Hz. Veränderungen des zellulären Kalziums konnten aus jedem Bilderpaar berechnet werden. Hierzu wurde der Quotient der Fluoreszenzemissionen der beiden Anregungswellenlängen 340 nm (Fura-2 Kalzium gebunden) und 380 nm Fura-2 (Kalzium frei) berechnet (f340/f380). Zuvor wurden von allen Messwerten parallel aufgenommene Hintergrundwerte subtrahiert.
2.2.9.2 Kombination des calcium imaging mit der in vitro PDT Es wurden in diesen Versuchen zwei experimentelle Gruppen an DRG Neuronen untersucht. Die eine Gruppe hatte 1,8 mM 5-ALA für 30 min erhalten, und konnte eine PpIX-Synthese über 60 min durchführen. Die andere Gruppe hatte kein 5-ALA erhalten, wurde aber ansonsten gleich behandelt. Um die oben beschriebene Mikrofluorimetrie-Prozedur mit der in vitro PDT zu kombinieren, wurde eine weiterer Schritt eigeführt. Nachdem zunächst eine Messung des zytosolischen Kalziums erfolgte, wie oben beschrieben, erfolgte der Anregungsschritt des PpIX. Hierbei wurde eine 10-minütige durchgehende Exposition gegenüber dem 380 nm Anregungslicht des Mikroskops durchgeführt. Während dieser Zeit wurden keine Emissionswerte ausgelesen. Nach diesem Schritt wurden erneut Messdaten aufgenommen.
39
2. Material & Methoden Im Folgenden wird das Messprotokoll im Detail geschildert: Während der ersten 60 s jeder Messung wurde eine erste Grundlinie der zytosolsichen Kalziumkonzentration für jede Zelle gemessen. Dann wurde ein 10 sekündiger Puls der depolarisierenden Extrazellulärlösung (mit 50 mM KCl) über das Applikationssystem zugegeben, um die neuronale Identität der gemessenen Zellen zu bestimmen. Neurone reagieren auf die Gabe einer solchen Lösung mit einem Kalziumeinstrom. Daraufhin wurde eine zehnminütige Messpause eingelegt, währen der das zelluläre Kalzium wieder zur Grundlinie zurückkehren konnte. Wenn FCCP oder Thapsigargin verwendet wurden, wurden diese Substanzen während dieser Messpause zugegeben.
Nachdem
die
Zellen
wieder
zu
einer
stabilen
Kalziumkonzentration
zurückgekehrt waren, wurde Datensatz x I aufgenommen (siehe Abbildung 2.2). Danach wurde das in vitro PDT Programm (10 min Licht von λ = 380 nm) gestartet. Die Zellen wurden während der PDT mit verschiedenen Puffern überspült. Entweder wurde die normale Extrazellulärlösung (2 mM CaCl2), eine kalziumfreie oder eine natriumfreie Lösung eingesetzt. Auch die Blocker der spannungsgesteuerten Kalziumkanäle wurden während des PDT – Intervals appliziert. Unmittelbar nach der PDT wurde eine erneute Messung des zytosolischen Kalziumgehalts durchgeführt, diese lieferte den Datensatz x II. Abbildung 2.2 zeigt eine Standard – Mess-Spur.
KCl
A V
Abbildung 2.2: Standard – Mess-Spur. Die Daten bei x I repräsentieren den zellulären Kalziumgehalt vor der PDT. Das graue Rechteck zeigt die die PDT – Phase. Die Daten bei x II repräsentieren den zellulären Kalziumgehalt nach der PDT. KCl zeigt den Testpuls an, der zur Identifikation vitaler Neurone durchgeführt wurde. Um vergeleichende Messdaten zu generieren, können zwei Quotienten gebildet werden. Entweder des werden für alle Spuren die Werte x I und x II verglichen, oder man vergleicht die Mittelwerte des Kalziumgehalts von Zellen, die mit 5-ALA behandelt wurden (x IIA) mit denen, die kein 5ALA erhalten haben (x IIV).
40
2. Material & Methoden Zum Sammeln der Daten aus den Rohdaten–Sätzen wurde das Programm Slidebook (3 I Imaging) verwendet. Messbereiche (regions of interest; ROIs) wurden um individuelle Neurone gezeichnet, um die relative Fluoreszenzintensität zu erhalten. Hintergrundwerte aus Bereichen im Gesichtsfeld, die keine Zellen enthielten, wurden stets substrahiert. Die in der Slidebook
Software
erhaltenen
Werte
wurden
zur
weiteren
Analyse
geeigneten
Tabellenkalkulations- und Grafikprogrammen zugeführt (Microsoft® Excel und Igor Pro, Wavemetrics).
2.2.10 Analyse der Genexpression mittels RT-PCR Für Genexpressionsanalysen wurde Total-RNA aus 5 x 105 DRG Neuronen, kultiviert wie zuvor beschrieben, sowie aus Gewebe des Neokortex und der Leber von Rattenjungen am fünften Postnatal-Tag extrahiert. Die RNA Extraktion wurde mit der TRIzol® Methode durchgeführt, wie in Wendt et al. (2007) beschrieben. 15 mg Total-RNA wurden der cDNA Synthese zugeführt. Hierbei wurden random hexamer Primer, M-MLV Reverse Transkriptase und das RevertAid® cDNA Synthese Kit (Fermentas) verwendet. Alle Schritte wurden gemäß der Angaben des Herstellers durchgeführt. Die dabei gewonnen cDNA-Proben wurden als +RT bezeichnet. Kontrollproben, bei denen RNA-Proben ohne Reverse Transkriptase in die beschriebene Reaktion eingesetzt wurden, wurden als –RT bezeichnet. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Expressionsanalyse wurden mit OligonukleotidPrimern durchgeführt. Diese wurden so gewählt, dass sie jeweils ein Intron überspannen, um Kontaminationen mit genomischer DNA ausschließen zu können. Die Primer sind in Tabelle 2.4 notiert. Es wurden stets 10 pmol Primer verwendet. Die PCR – Reaktionen wurden in einem automatisierten Thermocyler (RoboCycler Gradient 96; Stratagene) durchgeführt. Hierbei wurde folgendes Protokoll verwendet: Ein initialer Denaturierungsschritt von 5 min bei 95°C, gefolgt von 35 Zyklen aus einem 45 s Denaturierungsschritt bei 95°C, einem 45 s Anlagerungsschritt bei 60°C (für GAT-1 und GAT-2) bzw. 58°C (für GAT-3) und einem 30 s Elongationsschritt bei 72°C. Nach den 35 Zyklen wurde ein finaler Elongationsschritt von 3 min bei 72°C durchgeführt. Alle Kontrollproben wurden ebenso wie die +RT – Proben behandelt. Die PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese in einem 2% Agarosegel, gefärbt mit 0,1 mg/ml Ethidiumbromid, aufgetrennt. Eine 200bp – DNA Leiter (SmartLadder, Eurogentec) wurde hierbei als Größenstandard verwendet. Die Gele wurden mit Hilfe eines GelDoc – Systems (Biorad Laboratories GmbH) und zugehöriger Software dokumentiert. 41
2. Material & Methoden 2.2.11 Analyse der ATP-Freisetzung aus Keratinozyten HaCaT – Keratinozyten, ausgesät und kultiviert, wie unter 2.2.2 beschrieben, wurden einer 5-ALA Aufnahme (siehe 2.2.4) unterzogen, hierbei wurde das Aufnahmemedium (DMEM/F12) ohne NGF verwendet. Bevor die Keratinozyten der in vitro PDT zugeführt wurde, wurde das Aufnahmemedium entfernt und durch 50 µl eines HEPES – Puffers ersetzt (140 mM NaCl; 4 mM KCl; 2 mM CaCl2; 2 mM MgCl2; 10 mM HEPES; 10 mM Glukose; pH 7,35). Dieser Puffer verblieb während der PDT mit 240 J/cm² auf den Zellen und wurde danach sogleich abgenommen und in 1,5 ml Reaktionsgefäßen gesammelt, wobei für jedes Well ein separates Gefäß verwendet wurde. Die Proben wurden daraufhin bei 800 rpm abzentrifugiert, um eventuelle Zellreste zu pelletieren. 40 µl der Proben wurden daraufhin in die Wells einer weißen, undurchsichtigen 96-Wellplatte überführt. Diesen Ansätzen wurden dann 40 µl des CellTiterGlo® ATP Assay Reagenz (Promega) zugefügt. Die 96-Wellplatte wurde daraufhin für 2 min auf dem Schüttler und dann 10 min in Ruhe bei RT dunkel inkubiert. Im Anschluss wurde die Biolumineszenz gemssen, wie unter 2.2.8.4 beschrieben, allerdings wurde eine integrierte Lesezeit von 0,5 s gewählt. ATP-Proben bekannter Konzentration wurden im oben beschriebenen Puffer erstellt und parallel gemessen, um zu jeder
Messung
eine
tagesaktuelle
Standardreihe
zur
Umrechnung
der
relativen
Lumineszenzeinheiten (RLU) in ATP-Konzentrationen zu erhalten.
2.2.12 Analyse der Zellvitalität mit Fluorescein Diazetat (FDA) Zur Analyse der Vitalität der HaCaT – Zellen nach in vitro PDT wurde eine Fluoresciein Diazetat (FDA) Färbung durchgeführt. Die verwendete Stammlösung des FDA in Azeton hatte eine Konzentration von 25 mg/ml. Hieraus wurde eine Gebrauchslösung durch 1:30 Verdünnung in PBS erzeugt. Diese Lösung wurde den HaCaT – Zellen nach in vitro PDT nach Entfernen des Zellkulturmediums zugegeben und für 5 min unter Lichtabschluss auf den Zellen gelassen. Es erfolgten danach zwei Waschschritte in PBS, in diesem Puffer verblieben die Zellen danach auch. Die Analyse der FDA – induzierten Fluoreszenz erfolgte an einem inversen Mikroskop unter Einsatz der Phasenkontrastoptik, sowie der Fluoreszenzoptik unter Verwendung geeigneter Filter (485 nm Anregung, 530 nm Emission; FiTC/GFP – Filtersatz). Hierbei wurden die Anregungswellenlängen zwischen den einzelnen Versuchsgruppen immer gleich gehalten. Die fotografische Dokumentation erfolgte mit Hilfe einer geeigneten Digitalkamera (siehe 2.1.4).
42
2. Material & Methoden 2.2.13 Computergestützte Auswertung Zur Auswertung der hier präsentierten Daten wurde verschiedene Software eingesetzt. Für Tabellenkalkulationen und das Erstellen von Graphen wurden Microsoft® Excel 2007 sowie OriginPro 8.1 G (OriginLab Cooperation) verwendet. Des weiteren wurden Adobe Photoshop CS (v. 8.0.1; Adobe Systems Inc.), ImageJ (v. 1.41o; NIH) und CorelDraw X4 (v. 14.0.0.567; Corel Corporation) zur Bearbeitung, Darstellung und Analyse von Grafiken verwendet. Die Illustrationen in dieser Dissertation wurden unter Einsatz von CorelDraw X4 und Microsoft® PowerPoint 2007 erstellt. Zur Analyse der Bilder aus der konfokalen Mikroskopie wurde der Zeiss LSM Image Browser v. 4.2.0.121 eingesetzt. 2.2.14 Statistische Auswertung und Formeln Die statistische Auswertung der erhaltenen experimentellen Daten wurde mit Hilfe der Programme WinStat® für Microsoft® Excel (v. 2007.1) sowie SigmaStat v. 3.5 (Systat Software Inc.) durchgeführt. Es wurden der U-Test nach Mann-Whitney, der T-Test nach Student (zweiseitig) sowie der H-Test nach Kruskall-Wallis (mit anschließendem Dunn’s a posteriori Test) verwendet. Der T-Test kam nur zum Einsatz, wenn Normalverteilung der Daten gegeben war (überprüft mit dem Kolmogorov – Smirnov – Test). Die Überprüfung der Korrelation zweier Parameter wurde mit dem Test eines Korrelationskoeffizienten nach Pearson durchgeführt. Dies geschah gemäß der Angaben in Lothar Sachs‘ Angewandter Statistik und unter Bezug auf die hier zu findenden Tabellen. Die Berechnung der pKi- und Ki-Werte aus den EC50 und IC50 wurde nach der Methode von Cheng und Prusoff (1973) durchgeführt. Dabei wurde folgende Formel verwendet:
pK ୧ = −log
[IC50 ] [Agonist] 1 + [EC ] ହ
43
3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Charakterisierung des Testsystems Die Präparation und Kultivierung von Neuronen aus dem Hinterwurzelganglion der Ratte liefert in der Regel eine heterogene Zellpopulation in der Kulturschale. Neben den postmitotischen neuronalen Zellen finden sich weitere, in der Regel proliferative Zelltypen. Um das in dieser Arbeit eingesetzte in vitro Testsystem bezüglich der Größe der neuronalen Population und der vorkommenden neuronalen Subtypen genau beschreiben zu können, wurden immunzytochemische Färbungen angefertigt. Eine Färbung mit einem rein neuronalen Marker, dem monoklonalen Antikörper gegen βIII-Tubulin lässt es zu, die neuronale Population zu quantifizieren, wenn man gleichzeitig alle somatischen Zellen mit dem Chromatinfarbstoff Hoechst 3342 anfärbt. Das Ergebnis einer solchen Färbung ist in Abbildung 3.1 A zu sehen. Gezeigt ist eine DRG Zellkultur nach 48 h in vitro. Es wird deutlich, dass die nicht-neuronalen Zellen einen großen Anteil an der Gesamtkultur ausmachen. Die Neurone machen zu diesem Zeitpunkt ca. 25 % der Zellzahl aus, haben allerdings bereits ein ausgeprägtes Netzwerk von Neuriten gebildet, die um ein Vielfaches länger sind als ihr Somadurchmesser. Dies wird gemeinhin als Anzeichen für in vitro Differenzierung gewertet. Auf Basis dieser Beobachtungen wurde der Zeitpunkt von 48 h nach Aussaat für alle folgenden Experimente verwendet. Hier war ein Kompromiss erreicht, zwischen ausreichender Differenzierung der Neurone einerseits und einem vertretbaren Verhältnis zwischen neuronalen und nicht-neuronalen, proliferativen Zellen andererseits. Kultivierung über einen längeren Zeitraum würde das numerische Verhältnis zu Ungunsten der Neurone verschieben, da die nicht-neuronalen Zellen dann weiter proliferieren. Da ein klarer Fokus der hier durchgeführten Studien auf Nozizeption durch intraepidermale C-Fasern lag, sollte ebenfalls analysiert werden, ob die beiden Typen an DRG Neuronen, die in vivo diese Fasern ausbilden, im Testsystem vorhanden waren. Da sie anhand je eines molekularen Markers identifizierbar sind, sind die entsprechenden Färbungen durchgeführt worden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3.1 B und C dargestellt. Die peptidergen C-Faser Neurone
exprimieren
das
Neuropeptid
calcitonin
gene
related
peptide,
CGRP.
Immunpositive Zellen für CGRP sind in 3.1 B‘ zu erkennen. Eine Gegenfärbung mit βIIITubulin konnte die neuronale Identität dieser Zellen bestätigen. Nicht-peptiderge C-FaserNozizeptoren werden häufig dadurch visualisiert, dass das Isolectin B4 (IB4) aus Griffonia simplicifolia spezifisch an von diesen Zellen exprimierte Glykosaminoglykan-Zucker bindet. In den DRG Zellkulturen konnten ebenfalls einige IB4 positive Zellen detektiert werden, deren neuronale Identität durch βIII-Tubulin Gegenfärbung gezeigt werden konnte. Ein
44
3. Ergebnisse Beispiel ist in Abb. 3.1 C‘ gezeigt. Somit kann das Vorhandensein derjenigen Neurone, die intraepidermale Nozizeptoren hervorbringen, bestätigt werden.
A (βIII-Tubulin)
A‘ (Hoechst)
A‘‘ (Überlagerung)
B‘ (CGRP)
B‘‘ (Überlagerung)
C‘ (IB4)
C‘‘ (Überlagerung)
200 µm
B (βIII-Tubulin)
50 µm
C (βIII-Tubulin)
50 µm
Abbildung 3.1: Charakterisierung des Zellkultur-Testsystems. Die dargestellten Kulturen wurden 48 h nach Aussaat fixiert und mit den angegebenen Antikörpern bzw. Reagenzien behandelt. Die Fluoreszenzfärbung wurde durch Inkubation mit Fluorochrom-gekoppelten Sekundärantikörpern bzw. Biotin durchgeführt. βIII-Tubulin wurde dabei durch ein rotes (Cy-3) und CGRP (B) bzw. IB4 (C) wurden durch ein grünes (AlexaFluor-488) Fluorochrom markiert. A zeigt zudem eine Färbung aller in der Kultur vorhandenen Zellkerne mit Hoechst 3342.
3.2 5-ALA und MAL induzierte PpIX-Fluoreszenz in DRG Neuronen 3.2.1 Mikroskopischer Nachweis Um den Nachweis zu erbringen, ob eine Inkubation mit den PpIX-Vorläufern 5-ALA und MAL eine PpIX-Fluoreszenz erzeugt, wurden Zellkulturen mit entweder 6 mM 5-ALA, MAL oder Vehikel (farbloses Kulturmedium) für 4 h inkubiert. Danach wurde die PpIX Fluoreszenz nach folgenden
Parametern
mikroskopisch
analysiert:
Anregungswellenlänge
420
nm,
Emissionswellenlänge 630 nm mit einem 470 nm Strahlteiler, um nur längerwelliges Licht passieren zu lassen. Es wurde ein Epifluoreszenz-Ansatz gewählt, um die verschiedenen 45
3. Ergebnisse Ebenen der Kultur gemeinsam darzustellen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Abbildung 3.2 zu sehen.
B Phase Autofluoreszenz
ex 420 / em 630 f luo.
6 mM MAL (4 h Inkubation)
Neurone Fibroblasten Schwannzellen
6 mM ALA (4 h Inkubation)
A Phase
ex 420 / em 630 f luo.
C Phase
ex 420 / em 630 f luo.
Abbildung 3.2: 5-ALA und MAL induzierte PpIX-Fluoreszenz in kultivierten DRGNeuronen. In A dargestellt ist die Fluoreszenz nach 5-ALA (6 mM) Inkubation für 4 h. Die drei verschiedenen, anhand von Phasenkontrastbildern identifizierten Zelltypen sind der Beschriftung links zu entnehmen und anhand von Pfeilen hervorgehoben. B zeigt den Grad an Autofluoreszenz bei den eingesetzten Wellenlängen. In C ist die durch MAL (6 mM; 4 h) induzierte PpIX Fluoreszenz dargestellt. Die Maßstabsbalken stehen für eine Länge von 50 µM.
Ein Vergleich von 3.2 A und B zeigt deutlich, dass es durch Inkubation mit 5-ALA zu einem Anstieg der PpIX-typischen Fluoreszenzemission bei 630 nm kommt. Das Fluoreszenzsignal in den als Neurone identifizierten Zellen ist, bei identischer Belichtung, intensiver als in den anderen Zelltypen. Neurone wurden in den zugehörigen Phasenkontrastaufnahmen anhand 46
3. Ergebnisse ihrer typischen klar sphärischen Morphologie und anhand ihrer Neuriten identifiziert. Fibrobalsten in Kultur weisen eine anamorphe, und flächige Struktur auf. Diese Zellen konnten klar im Phasenkontrast identifiziert werden. Hier konnte keine so deutliche PpIX Fluoreszenz detektiert werden, wie in den benachbarten Neuronen. Nadelförmige Zellen mit deutlichen Fortsätzen sind Schwannzellen in Kultur. Diese wiesen in den hier durchgeführten Untersuchungen keine PpIX-typische Fluoreszenz auf. Eine Analyse der MAL induzierten PpIX-typischen Fluoreszenz nach 4 h Inkubation zeigt ein sehr ähnliches Bild. Der wesentliche Anstieg an Fluoreszenzemission ist bei denjenigen Zellen auszumachen, die morphologisch klar den Neuronen zuzuordnen sind. Diese Ergebnisse stellen die Neurone als hauptsächliche Träger der von 5-ALA und MAL induzierten PpIX-Fluoreszenz im heterogenen DRG-Kultursystem dar. Dies gestattet eine Analyse der PpIX Bildung in Neuronen anhand von Untersuchungen an Total-Lysaten der Kulturen. Zur genaueren Analyse der 5-ALA vermittelten Fluoreszenz in kultivierten Neuronen, wurde zusätzlich ein konfokal-mikroskopischer Ansatz gewählt. Der Einsatz eines 2-Photonen Lasermikroskops
und
eines
zugehörigen
Metadetektors
erlaubt
es,
eine
Anregungswellenlänge auszuwählen und das emittierte Licht ohne Beschränkungen der Wellenlänge
in
diskreten
Schritten
zu
messen.
Hierdurch
kann
ein
in
vitro
Emissionsspektrum über einen großen Wellenlängenbereich generiert werden. Es wurde die 2-Photonen
Wellenlänge
von
820
nm
gewählt.
Diese
liegt
nahe
am
PpIX
Anregungsmaximum von ca. 390 nm. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Abbildung 3.3 zusammengefasst. In Abb. 3.3 A ist im linken Bild ein virtueller Schnitt durch eine Ebene dargestellt, in der die Neurone liegen. Die runden Somata sind deutlich zu erkennen. Im Zytosol der Zellen ist klar eine Emissionsantwort bei 630 nm auf die 820 nm 2-Photonen Anregung erkennbar. Die Kernbereiche der Zellen erscheinen ausgespart. Perinukleär ist teilweise eine besonders intensive Fluoreszenz zu verzeichnen. Insgesamt erscheint das Färbemuster granulär, erstreckt sich aber über den ganzen zytosolisch definierten Bereich. Das Bild links zeigt eine Vergrößerung einer Neuronengruppe aus dem Übersichtsbild. Hier sind die granuläre Färbung und die Aussparung des Zellkerns, insbesondere bei der Zelle rechts oben deutlich sichtbar. Die sogenannte region of interest (ROI), für die der Metascan spektral ausgemessen wurde ist durch den weißen Kreis markiert. Das Ergebnis des Scans ist in Abb. 3.3 B dargestellt. Der abgetastete Bereich erstreckt sich von λ = 400-720 nm und die gemessene Intensität ist in relative fluorescence units (RFU) angegeben. Hier ist ein deutliches Maximum im Bereich von ca. 630-650 nm zu erkennen. 47
3. Ergebnisse
A
PpIX
ROI1
Intesität [RFU]
B 180
C
Rhod-123
160 140 120 100 80
Intensität ROI 1
60 400
500
600
700
800
Emissionswellenlänge[nm] bei 820 nm 2-Photonen Anregung
Abbildung 3.3: Konfokale Darstellung der 5-ALA induzierten Fluoreszenz, Metascan und mitochondriales Netzwerk in DRG Neuronen. In A ist eine konfokale Darstellung der PpIX Fluoreszenz bei 820 nm 2-Photonen Anregung zu erkennen. Im Detailbild links markiert der weiße Kreis die region of interest, für die der Metascan durchgeführt wurde. B zeigt das Ergebnis des Metascans bei 820 nm 2-Photonen Anregung über einen Wellenlängenbereich von 400 bis 720 nm. Auf der y-Achse sind relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) aufgetragen. C zeigt eine Darstellung des mit Rhodamine-123 gefärbten mitochondrialen Netzwerks in DRGNeuronen.
Die hier zu erkennende diskrete Spitze ist typisch für die Fluoreszenz des PpIX. Mit dem Farbstoff Rhodamine-123 (Rhod-123) lassen sich selektiv Mitochondrien lebender Zellen markieren. Dies kann durch die positive Ladung des Fluorochroms erklärt werden, das hierdurch in das deutlich elektronegative Innere der Mitochondrien transloziert wird und auf 488 nm Laser-Anregung im grünen Spektrum emittiert. Die hier zu beobachtende Fluoreszenz ist auch als klar granulär zu bezeichnen. Sie ist nahezu gleichmäßig über das gesamte Zytoplasma verteilt und spart, wie an der 12-Uhr-Position der Zelle zu erkennen ist den Zellkern aus (Abb. 3.3 C). Die vom Zellsoma ausgestreckten Neuriten enthalten ebenfalls gefärbte Strukturen, hier sind diskrete längliche Formen zu erkennen. Die mit Rhod-123 erzielte Färbung sprich für ein weitreichendes, komplexes und stark verteiltes mitochondriales Netz in kultivierten DRG Neuronen. Die Fluoreszenzen des PpIX und des Rhod-123 sind somit zellulär sehr ähnlich verteilt. Eine gemeinsame Färbung der beiden 48
3. Ergebnisse Komponenten in einer Zelle konnte aufgrund einer untrennbaren Überlappung der Anregungsspektren nicht sauber dokumentiert werden. Zudem ist die Emissionsintensität des Rhod-123 um ein solches Maß höher als die des PpIX, dass in Doppelfärbungen das PpIX-Emissionsspektrum vom Rhod-123-Signal gänzlich überlagert wird.
3.2.2 Analyse der PpIX-Bildung im Fluoreszenz-Multiplate Lesegerät Obwohl die Neurone in den zu analysierenden Gesamtkulturen einen geringeren Anteil ausmachen als die nicht-neuronalen Zellen, deuten die Daten aus 3.2.1 auf einen überwiegenden neuronalen Beitrag an der PpIX Bildung hin. Daher konnte nun auch die neuronale PpIX-Bildung, die eigentlicher Gegenstand dieser Untersuchung war, anhand von Zelllysaten analysiert werden. Hierzu wurden die Neurone in 96-Well-Platten kultiviert (5000 pro Well) und nach dem 5-ALA / MAL-Aufnahme und der PpIX-Synthese Lysate generiert, PpIX extrahiert und im Multiplate-Reader bei 390 nm Anregung und 620 nm Emission fluorimetrisch analysiert (siehe 2.2.6). Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind in Abb. 3.4 zusammengefasst
und
als
Konzentrations-Wirkungs-Diagramme
eingeteilt
nach
Synthesedauer dargestellt. Es lässt sich sogleich erkennen, dass die Inkubation mit den Testsubstanzen in nahezu allen Bedingungen zu einem klaren Anstieg der PpIX Fluoreszenz führt. Betrachtet man zunächst die nach 0 h messbare Fluoreszenz, zeigt sich bei beiden Testsubstanzen über alle drei Konzentrationen ein nahezu gleichmäßiger Anstieg der Fluoreszenz-Intensität. Eine schwache Sättigungskinetik ist erkennbar, doch liegen alle gemessenen Werte um ca. 200 RFU. Eine Verlängerung der Synthesezeit auf 1 h resultiert in einer deutlichen Erhöhung der maximal messbaren Fluoreszenz, diese liegt nun für 5-ALA und MAL bei etwas weniger als 1000 RFU nach Inkubation mit 6 mM. Die Werte zeigen einen deutlichen Sättigungsverlauf, so dass der Fluoreszenzanstieg zwischen 1,8 und 6 mM Testsubstanz am geringsten ausfällt. Bei Inkubation mit 0,6 mM Pro-Pharmakon bildet sich aus 5-ALA klar fast doppelt so viel PpIX wie aus MAL. Währenddessen nähern sich die Werte bei Inkubation mit 1,8 bzw. 6 mM wieder stark aneinander an.
49
3. Ergebnisse
Abbildung 3.4: 5-ALA und MAL induzierte PpIX-Fluoreszenz in DRG Kulturen. Die Analyse der PpIX-Fluoreszenz ist dargestellt nach jeweils 30 min Aufnahme der Pro-Pharmaka und ansteigenden Synthesephasen. A nach 0 h; B nach 1 h; C nach 2 h und D nach 4 h. Die Daten sind als Konzentrations-Wirkungs-Diagramme dargestellt. Aufgetragen ist das PpIX-typische Signal in RFU gegen die eingesetzte Konzentration an 5-ALA bzw. MAL. Eine klar größere PpIX-Bildung aus 5-ALA mit steigender Synthesezeit lässt sich erkennen. Die Anzahl der unabhängigen Wiederholungen der Experimente sind den Diagrammen zu entnehmen. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. Die y-Achsenabschnitte sind aus Gründen der Lesbarkeit für die einzelnen Diagramme unterschiedlich gewählt.
Eine weitere Verlängerung der Synthesezeit führt im Falle von 5-ALA zu einem klaren Anstieg der PpIX-Fluoreszenz bei allen drei Konzentrationen. Das Sättigungsverhalten der Kurve bleibt bestehen, der Maximalwert liegt nun aber mit ca. 2000 RFU doppelt so hoch wie nach 1 h. Die von 0,6 mM 5-ALA erzeugte PpIX-Fluoreszenz steigt dabei nur von ca. 720 auf 1080 RFU. Die Kurve zur MAL-induzierten Fluoreszenz sieht nach 2 h Synthese erstmalig deutlich anders aus als die Kurve zu 5-ALA nach 2 h. Am auffälligsten ist die Beugung der Kurve bei 0,6 mM MAL. Hierdurch entsteht ein leicht sigmoidaler Kurvenverlauf. Im Vergleich zu den Daten nach 1 h Synthese halbiert sich die von 0,6 mM MAL generierte Fluoreszenz. Gleichzeitig ist der bei 6 mM MAL erreichte maximal gemessene Wert nicht deutlich kleiner
50
3. Ergebnisse als der für 5-ALA bei gleicher Bedingung. Insgesamt erscheint die MAL-Kurve nach rechts verschoben im Vergleich zur 5-ALA-Kurve. Dieses differentielle Verhalten der PpIX-Bildung aus 5-ALA und MAL tritt nach 4 h Synthesezeit noch klarer zu Tage. Hier lässt sich für 5-ALA wieder ein Sättigungsverhalten bestätigen, allerdings wirkt die Konzentrations-WirkungsBeziehung weniger klar hyperbolisch als zuvor, da zwischen 1,8 mM und 6 mM 5-ALA erstmalig ein klarer Anstieg um ca. 1100 RFU zu verzeichnen ist. Bei der geringsten 5-ALA Konzentration ist hingegen nur ein Wert von ca. 930 RFU zu messen, dieser liegt unter dem Wert nach 2 h Synthese. MAL verhält sich bezüglich der PpIX-Bildung unter dieser Bedingung klar anders. Nach 0,6 mM MAL Inkubation ist gar kein Anstieg der Fluoreszenz relativ zur Kontrolle - messbar. Zwischen 1,8 und 6 mM MAL besteht eine nahezu lineare Beziehung, es liegt ein Anstieg von 600 auf ca. 2500 RFU vor. Insgesamt betrachtet weisen 5-ALA und MAL nach 0 h und 1 h sehr ähnliche Kinetiken in der PpIX-Bildung auf. Diese unterscheiden sich aber nach 2 h und 4 h maßgeblich voneinander. Hier ist 5-ALA als potenterer PpIX-Generator zu bezeichnen. In der geringsten MAL Konzentration ist zudem ein Nachlassen der gebildeten PpIX-Menge im Zeitverlauf messbar. Die SynthesezeitAbhängigkeit lässt sich in der alternativen Darstellung der Daten, einer Zeit-WirkungsBeziehung, noch genauer verfolgen. In Abbildung 3.5 lässt sich der Einfluss des Faktors Zeit auf die PpIX-Bildung aus 5-ALA bzw. MAL sehr deutlich ablesen. In 3.5 A ist die Bildung des PpIX aus 0,6 mM 5-ALA bzw. MAL dargestellt. Für MAL zeigt sich klar, dass die PpIX-Bildung bereits nach 1 h maximal ist und danach bis nach 4 h völlig verschwindet. Für 5-ALA ist hier ebenfalls eine Tendenz zum Abfall der PpIX-Fluoreszenz nach 4 h zu verzeichnen, die maximale Menge kann nach 2 h detektiert werden. In 3.5 B zeigt sich, dass bei Inkubation mit 1,8 mM MAL ein solches Maximum nach 2 h zu verzeichnen ist, jedoch liegen die PpIX-Fluoreszenzstärken nach 1 h und 2 h sehr nah aneinander. Ein Absinken ist nach 4 h klar zu beobachten. Für 5-ALA verhält es sich vollkommen anders: Bei Inkubation mit 1,8 mM ist ein steter Anstieg über den gesamten Zeitraum messbar, dieser erscheint linear zwischen 0 und 2 h, nach 4 h ist ein leichtes Absinken des Werts zu beschreiben, wodurch kein lineares Verhältnis mehr entsteht. Werden die Zellen mit 6 mM der Testsubstanzen inkubiert, ergibt sich für MAL kein Abfallen der Werte im Zeitverlauf mehr, die PpIX-Fluoreszenz ist hier nach 4 h klar maximal. Allerdings sorgt hier, wie bei 1,8 mM 5-ALA in 3.5 B, ein leichter Abfall des Wertes nach 4 h dafür, dass kein linear erscheinendes Verhältnis zustande kommt. Eine nahezu lineare Beziehung zwischen PpIX-Bildung und Synthesezeit ist allerdings für die Inkubation mit 6 mM 5-ALA erkennbar (Bestimmtheitsmaß R²=0,9997). Gemäß der anzunehmenden Geradengleichung steigt die PpIX-Fluoreszenz aus 5-ALA im betrachteten Zeitraum pro Stunde um ca. 900 RFU. 51
3. Ergebnisse
[RFU]
A
0
C
B
3500
1,8 mM MAL
5000
1,8 mM 5-ALA
4000
6,0 mM MAL
3000
2000
[RFU]
[RFU]
2500
1500
6,0 mM 5-ALA
3000 2000
1000
1000
500 0
0 0
1
2 3 Synthesezeit [h]
4
5
0
1
2 3 Synthesezeit [h]
4
5
Abbildung 3.5: Zeitabhängigkeit der PpIX-Bildung aus 5-ALA und MAL. Die Daten aus 3.4 sind hier als Zeit-Wirkungs-Diagramme formuliert. Auf der x-Achse ist die Synthesezeit nach der Aufnahme aufgetragen, die y-Achse zeigt die zugehörige PpIX-Fluoreszenz in RFU. A zeigt die Daten für 0,6 mM 5-ALA bzw. MAL, B für 1,8 mM und C für 6 mM. Die Anzahl der unabhängigen Wiederholungen ergibt sich aus den Angaben zu 3.4. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) wieder. Die y-Achsenabschnitte sind aus Gründen der Lesbarkeit für die einzelnen Diagramme unterschiedlich gewählt.
Zur genaueren pharmakologischen Charakterisierung der PpIX-Synthese aus 5-ALA und MAL wurden die Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen für die 2 h Synthesezeit einer nichtlinearen Regression unterzogen. Hierbei wurde der jeweils mathematisch am ehesten geeignete Regressions-Algorithmus eingesetzt: für 5-ALA die hyperbolische Regression und für MAL der Dose-Response-Algorithmus. Aus beiden Operationen kann man die halbmaximale Bildung der PpIX-Fluoreszenz mit der eingesetzten Konzentration der Substanz in Bezug setzen. Diese Parameter werden in der Folge als EC50 bezeichnet
52
3. Ergebnisse (excitatory concentration 50 %; mit Bezug auf Entstehen der Fluoreszenz). Die Ergebnisse der Fits sind im Diagramm unter 3.6 dargestellt.
[RFU]
2000
1000
0
0
Abbildung 3.6: Nichtlineare Fits zur PpIX-Bildung aus 5ALA und MAL nach 2 h Synthese. Für 5-ALA wurde ein hyperbolischer, für MAL ein dose-response Fit durchgeführt. Ablesbar sind die EC50 Werte zur PpIX Bildung von 0,734 mM (5-ALA) und 1,641 mM (MAL). Das Bestimmtheitsmaß der Fits beträgt 0,99768 für 5-ALA und 5-ALA (n=7 ± SEM) 0,99625 für MAL. Die Anzahl MAL (n=5 ± SEM) der unabhängigen Datenfit: ALA: EC50 = 0,734 ± 0,091 mM Wiederholungen ist dem Datenfit: MAL: EC50 = 1,641 ± 0,046 mM Diagramm zu entnehmen, die Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts 2 4 6 (SEM) an c Testsubstanz [mM]
Aus Abbildung 3.6 lassen sich die Konzentrationen der halbmaximalen PpIX-Bildung nach 2 h Synthese ablesen. Der EC50 (5-ALA) liegt bei 0,734 ± 0,091 mM; der EC50 (MAL) ist mehr als doppelt so hoch und liegt bei 1,641 ± 0,046 mM. Das Bestimmtheitsmaß (R²) für die mathematischen Angleichungen liegt bei 0,99768 (5-ALA) und 0,99625 (MAL). Eine klare Rechtsverschiebung in der halbmaximalen Effizienz der Testsubstanzen ist zwischen 5-ALA und MAL auszumachen, so dass 5-ALA bei dieser Synthesezeit mehr als doppelt so effizient in der Induktion der PpIX-Fluoreszenz in kultivierten DRG Neuronen ist. Die EC50-Werte finden sich in Tabelle 3.1. Bei den im Anschluss dargestellten Blocker-Experimenten zur Analyse des Aufnahmewegs der Testsubstanzen in die Zellen wurden 0,6 mM 5-ALA und 1,8 mM MAL eingesetzt, um die EC50 Werte zu berücksichtigen
3.3 Analyse des Aufnahmewegs von 5-ALA und MAL in kultivierte DRG Neurone Zur Analyse des Aufnahmewegs der PpIX-Vorläufer 5-ALA und MAL in kultivierte DRGNeurone wurden Kompetitionsversuche in Multiwell-Platten durchgeführt. 5-ALA und MAL wurden dabei alleine und in Gegenwart von Substanzen zu den Zellen gegeben, die somit
53
3. Ergebnisse darauf überprüft werden sollten, ob sie in der Lage sind die Aufnahme der PpIX-Vorläufer zu unterbinden. Die hier möglichen Effekte wurden indirekt, nämlich über eine Messung der PpIX-Bildung, quantifiziert. Um zu vermeiden, dass verringerte PpIX-Bildung aus toxischen Gründen besteht, wurden die Zellkulturen bei Inkubation mit potentiellen Kompetitoren und Blockern besonders eingehend mikroskopisch auf morphologische Anzeichen von Toxizität untersucht. Ein Auftreten solcher Anzeichen, wie z.B. dystrophischer Neuriten, inhomogener Erscheinungsbilder der Zellsomata oder gar Zellschwellung führten sofort zum Verwerfen der Experimente. Alle Inkubationen wurden, wenn nicht anders angegeben, für 30 min mit anschließender 2 h Synthesezeit durchgeführt. Für die Aufnahme Schritte wurde ein spezieller Puffer (siehe 2.1.3) benutzt. Ausgemessen wurde die PpIX-Fluoreszenz in den Zelllysaten.
3.3.1 Einfluss des Kulturmediums und der Aminosäuren auf die Aufnahme Es konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass 5-ALA und MAL über Transportsysteme ins Zellinnere gelangen, die zum Transport von Aminosäuren dienen (Rud et al. 2000; Gederaas et al. 2001). Es gibt eine große Vielzahl dieser Transportsysteme mit jeweils unterschiedlichen Transportprofilen. Über ihr Expressionsmuster in kultivierten DRG Neuronen aus der Ratte sind keine publizierten Studien verfügbar. Da das Kulturmedium jedoch alle 20 biogenen Aminosäuren in unterschiedlichen Konzentrationen enthält, sollte zunächst herausgearbeitet werden, ob die PpIX-Bildung aus 5-ALA und MAL in einem Aminosäure-freien
Puffer
(siehe
Methoden)
größer
ist.
Dem
sollten
sich
Kompetitionsexperimente anschließen. Bei diesen wurden die 15 der 20 im Kulturmedium vorhandenen Aminosäuren zusammen mit den Pro-Pharmaka zu den Zellen gegeben, um den Einfluss auf die PpIX-Bildung und damit die Aufnahme zu ermitteln. Mittels dieser Auswahl an Aminosäuren, die sich aus allen Typen (aliphatisch, aromatisch, polar, unpolar) rekrutiert, sollten alle wichtigen Transporter abgedeckt worden sein. Die Ergebnisse dieser beiden Versuchsreihen sind in Abbildung 3.7 zusammengefasst. Werden die DRG Neuronenkulturen mit in Puffer gelöstem 5-ALA (0,6 mM) inkubiert, steigt die Menge des gebildeten PpIX klar gegenüber der Bedingung, in der 5-ALA in DMEM/F12 zu den Zellen gegeben wird. Es ist ein Anstieg von 1261 auf 1760 RFU zu verzeichnen. Dies entspricht einer relativen Zunahme der PpIX-Bildung um 39,6%. Dieser Effekt ist bei n=10 für beide Bedingungen als statistisch signifikant zu bezeichnen (p
