Pharmazeutische Technologie und Medizinprodukte;
Nanopharmazie_3
Nanopartikel zur Therapie und Diagnose nawroth @uni-mainz.de langguth @uni-mainz.de
1.
Prinzip, Typen von Nanopartikeln, Liposomen Teil 1
2.
Herstellung, Charakterisierung, Liposomen & Lipoid-Partikel Teil 2
3.
Magnetische Nanopartikel, Ferrofluide; Anwendungen
Polymere, Aerosole
Bio-Ferrofluide, Poly-Ferrofluide : magnetisch
Nanopartikel Charakterisierung
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Partikelgrößenverteilung : Dynamische Lichtstreuung DLS µs Specles
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NP‘s Bewegung
• LaserLichtstrahl
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Partikel im Laser-Lichtstrahl erzeugen Interferenzmuster (Specles, 2D) Lichtstreu-Messung bei der nicht die Winkelabhängigkeit, sondern die zeitliche Schwankung ermittelt wird Das Streulicht schwankt im Maße der Brown‘schen Molekularbewegung, d.h. der Diffusion (Temperatur-abhängig). Bei Nanopartikeln erfolgt die Variation im µsBereich –> schneller Detektor. Analyse durch Autokorrelationsfunktion (Häufigkeits-Analyse). Die Interpretation mit allgemeinen Streugesetzen (I ~r6, M ~r3 etc.) liefert die Massenzusammensetzung der Probe aus Partikelpopulationen verschiedener Größe Bei konzentrierten Proben (Pharma-NP‘s) muß in Rückstreuung gemessen werden (170°)
Nanopartikel Charakterisierung
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Partikelgrößenverteilung : Dynamische Lichtstreuung DLS
Schritte einer DLS-Untersuchung : Messung: • Bestimmung der zeitlichen Schwankung des Streulichts für ca. 30s -5 Minuten : I(t) • Automatische Ermittlung der AutoKorrelationsfunktion C(τ)
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• DLS-Untersuchung von Liposomen (Dissertation T. Peters)
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Auswertung (PC): Komponentenanalyse der AutoKorrelationsfunktion: regularized Fit - ergibt die Streubeiträge (τ) - Software: z.B. von ALV (Langen) Umrechnung in die unskalierte Partikelgrößenverteilung P(r) = Beiträge zum Streulicht Umrechnung in die massen-skalierte Partikelgrößenverteilung M(r) = Massenanteile an der Probe (Gewichts-%, relativ)
Struktur von therapeutischen Nanopartikeln : die medizinische Sicherheit hängt von den Eigenschaften ab (Charakterisierung
embolic risk limit
- 8)
Nanoparticles for therapy can carry drugs of radiation therapy targets (lanthanides). A size of 100 nm is optimal in load and avoids embolic, which appears, if >500 nm The nanoparticles are characterized by:
DLS of a disk-shaped Poly-Ferrofluid (160x10nm) for medical applications
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TEM of a liposome (SUV) bearing Gd-DTP-DMPE
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Chemical and spectroscopy analysis of target entrapping and release, and of components Average particle size estimation by dynamic light scattering DLS (PCS) Structure of individual particles by electron microscopy (TEM) Structure and dynamics investigation by neutron small angle scattering SANS and TR-SANS (time-resolved) at ILL-D22 Structure and target localization by anomalous X-ray scattering ASAXS and EXAFS at L-edges: at ESRF-ID1 Target absorption at therapeutically used K-edges : at ESRF-ID17
SANS of a liposomes yields size & volume @ ILL-D22.
Lanthanide Nano-target biocompatible Gd-citrate formulation @ ESRF-ID1
Nanopartikel Charakterisierung Zusammenfassung
Zusammenfassung Analytik: Analytik im Apothekenbereich und Klinik-Qualitätssicherung (QS) : Kostenlimit (20 – 50 000 € / Gerät) - Sterilitätstest / Mikrobiol. Untersuchung, - Photometrie, - Mikroskopie zur Partikeluntersuchung / Überprüfung - DLS (spezifische Identitätsprüfung)
Erweiterte Analytik im F&E - Bereich - Streumethoden (Röntgen-, Neutronen-Streuung - Elektronenmikroskopie, DLS, magnetische Untersuchung - Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenz-Spektroskopie, Lumineszenz - Dissolutionstest / Freisetzungsstudie - Biokompatibilität / Toxiditätsanalyse - Wirksamkeit : Zellkultur-Tests - Wirksamkeit : Tierversuche - Wirksamkeit : Klinische Tests (I, II, III)
4 Typen von Pharma- Nanopartikeln : Liposomen, Lipoid-partikel, Polymere, Ferrofluide kombinierte Partikel:
Liposome (30 – 500 nm) Lipoid-Particle Polymer Microsphere -------Aerosol particle---------
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Ferrofluid / magn-NP Poly-Ferrofluid
magnetic liposome multicomponent NP
Der in Liposomen verkapselte Wirkstoff (Target) kann jeder Wasser-lösliche Stoff sein, z.B. Metallverbindungen für die Strahlentherapie, Wirkstoffe für Chemotherapie: MDT. Der in Lipoid-Partikel oder Aerosol-Partikel gelöste Wirkstoff kann jede lipophile Verbindung sein, z.B. Wirkstoffe für die Chemotherapie, Diagnose: MDT , Bildgebung. Polymere, Membranproteine und Oberflächengebundene Peptide Magnetische Liposomen können Metall in drei Strukturen enthalten: a) Metallo-Lipid Liposomen b) Liposomen mit verkapselten Maghemite Nanopartikeln, c) Metaloxide-Lipid Doppelschalen-Liposomen. Der gebundene Wirkstoff (Target (T)) ,z.B. GdDTPA, drugs kann selektiv und zeitlich definiert freigesetzt werden (Lokalisation und Zeitsteuerung). Binäre Schalen- und Poly-Ferrofluide (d) enhalten z.B. ~ 10 - 100 magnetische Core-Partikel von 10-20 nm Größe. Durch gezielte Struktur-Synthese können 5% Wirkstoff gebunden werden.
Wirkstoff-Zielsteuerung zu Zellen : Targeting Chemotherapie, Nano-RT, -PDT, Imaging
Nanopartikel können die Therapie und Diagnose durch Lokalisierung verbessern : •
Verstärkte
(Enhanced)
mit Bio-Nanopartikeln ist möglich mit: (a) hohlen Target-Liposomen, Lipoid-Partikeln, Polymeren oder (b) binären Poly-Ferrofluiden, die ~ 1,000,000 Wirkstoffmoleküle in kolloidalen Partikeln von 100 nm Größe konzentrieren. (50-500 nm is ok.)
•
Regioselektivität kann erzielt werden durch: Diffusions-Restriktion, (c) magnetische Target-nanopartikel
•
Kompatible Methoden sind mit Nanopartikeln parallel möglich: MDT, RT, PAT, PDT, NCT, imaging: PET, MRI
Radiotherapie
in eine, magnetischen Feld-Gradienten, (d) Rezeptor-Ligand Interaction und/ oder Immuno-Nanopartikel, die specifische Antikörper, Antigene tragen.
magnetic drug targeting MDT: C. Alexiou, R. Schmid, R. Jurgons, M. Kremer, M. Wanner, C. Bergemann, E. Huenges, T. Nawroth, W. Arnold, F. Parak (2006) Eur. Biophys. J. 35, 446-450
Zielsteuerung : Magnetic Drug Targeting MDT magnetische Partikel – externe Manipulation •
Magnetische Partikel: - Kraftwirkung im magnetischen Feld-Gradienten - sekundäre Strukturbildung im magnetischen Feld
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Ferrofluide:
Technisches Ferrofluid (in Öl) im magnetischen Feld
– Superparamgnetische Partikel (keine magnetische Remanenz) – Zwei Strukturebenen möglich:
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Magnetische Kernpartikel (Cores) – typische Partikelgröße 10 nm – Bio-Ferrofluide mit hydrophiler Hülle – Technische Ferrofluide in Öl !!
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Poly-Ferrofluide – Typische Partikelgröße 100 nm – großes magnetisches Moment – im Blutstrom lokalisierbar
Ferrofluide : Magnetic Drug Targeting MDT -2 magnetische Partikel – externe Manipulation Ferrofluide: – Superparamgnetische Partikel (keine magnetische Remanenz) – Zwei Strukturebenen möglich:
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Magnetische Kernpartikel (Cores) – typische Partikelgröße 10 nm – Bio-Ferrofluide mit hydrophiler Hülle – Technische Ferrofluide in Öl !!
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Poly-Ferrofluide – Typische Partikelgröße 100 nm – großes magnetisches Moment – im Blutstrom lokalisierbar
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Gebundene Pharmaka: – Polymerhülle ums Ferrofluid – als Gegenion an einem Hüllpolymer – In Poren eines Hüllpolymers
Bio-Ferrofluide : Magnetic Drug Targeting MDT -3 magnetische Partikel – Wirkstoffbindung und Freisetzung Beladenes Ferrofluid Applikation Patient / Tier ... lokale Infusion ( 30 min ) Im Magnetfeld (Feldgradient)
Immobilisiertes Ferrofluid im Zielorgan / Tumor
+ NaCl (Blut .... 130 mM Na+) Elution des Pharmakums ( 1h )
Strukturprinzip von pharmazeutischen Hüll-Ferrofluiden: Die geladene Polymerhülle bindet den Wirkstoff als Gegenion (magnetische Ionenaustauscher)
Pharmakum-Bindung und
Beispiel: Phosphodextram + Mitoxantron
Tage -Wochen
Wirkung im Tumor
Magnetic Drug Targeting MDT -4 Chemotherapie – Anwendung (Krebstherapie) •
Chemotherapie mit magnetischem DrugTargeting MDT im Tierversuch
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Poly-Ferrofluid mit gebundenem Mitoxantron Intra-Arterielle Gabe (Arterie führt zum Tumor am Bein) Konzentration der NP‘s im magnetischen Gradienten (1,7 T) Freisetzung durch das Na+ im Blut (in 1 h)
• VX-2 squamous cell Carcinom: Kaninchen TEM des Therapiematerials (non-stained)
• •
Lit.: Alexiou, Schmid, Jurgons, Kremer, Wanner, Bergemann , Huenges, Nawroth, Arnold, Parak (2006) Eur. Biophys. J 35, 446-450
EM-Analytik: Histologie (links), EDX-Raster-EM (rechts)
Struktur Prinzipien von Target-Nanopartikeln : Magnetische Target-Liposomen
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Magnetische Liposomen können Metalle in drei Strukturen enthalten: a) Metallo-Lipid liposomen b) Liposomes mit eingeschlossenen Maghemite NanoPartikeln (cores), c) Metalloxide-Lipid Doppel-Schalen Liposomen. das wasserlösliche Strahlen-Target (T, enhancer) ist im Lumen eingeschlossen: GdDTPA, Borat, Chemotherapeutica
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Das liposomal verkapselte Target kann jede wasserlösliche Verbindung sein, z.B. Lanthanid-DTPA‘s (Gd - Lu), Hf, Boron-Diol-Ester oder Wirkstoffe für die Chemotherapie: MDT.
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Hyperthermie : Magnetische Nanopartikel können durch Mikrowellen-Absorption zur Wärmetherapie genutzt werden. Dazu genügt eine Temperatur von 42-43°C.
Elektronenmikroskopie von Metallo-Liposomen : Magnetische Target-Liposomen, Poly-Ferrofluid
• Non-stained electron micrographs of the three types of metallo-target-liposomes:
a) membrane metal liposomes (Gd outside), b) core entrapped vesicles (10nm cores), and c) shell layer metal liposomes. The images depict the burried metal directly.
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The membrane metal liposomes (a) contained 5% Gd- loaded chelate-head lipid DTPADMPE in DMPC, as in ESRF-experiments with ASAXS at ID01.
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The entrapped core vesicles (b) contained sub-nanoparticles (10-15 nm cores, chromatographically purified γ-Fe2O3) and loaded with Gd-DTPA, Eu-DTPA, as at ESRF
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The shell layer liposomes (c) had a double layer of lipid and γ-Fe2O3, and were investigated by time resolved neutron scattering TR-SANS at ILL-D22
Tris2Gd-DTPA, Polyferrofluid PF100C (FerroMed), MRI-analog: Magnevist (S h i )
Nawroth, Rusp, May (2004) Physica B350, e635-638
Struktur Prinzipien von Target-Nanopartikeln : Protein-haltige Liposomen zur Zielsteuerung
Gerichtete Protein-Rekonstitution in Liposomen (Tutus et al., Makromolecular Bioscience 8, 1034 (2008)
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Nanopartikel können durch Oberflächen-Modfikation zielgesteuert werden Geeignete Wechselwirkungen / Strukturen: - Ligand – Rezeptor-Protein: Ligand am NP , z.B. zur Endocytose - Ligand – Enzym-Protein: Ligand am NP - Ligand – Enzym-Protein: Protein am NP - Antigen – Antikörper : Antigen am NP …. Tumor-spezifische … - Antigen – Antikörper : Antikörper am NP
Membran-Proteine und Lipid-gebundene Liganden können mit Verfahren aus der Membranbiochemie gerichtet in Liposomen und NP‘s rekonstituiert werden
Indirekte Strahlentherapie IRT : sekundäre Strahlungsprodukte inaktivieren Krebs-Zellen
1) Secondary radiation or products of short range (30 µm) evolve from a local target by specific absorption of a) X-ray photons (medium energy, 60 keV) of a synchrotron : PAT, photon activation therapy (= PXT, photodynamic X-ray therapy), b) IR-light photons (water filtered) absorbed at organic target: PDT, photodynamic therapy c) Neutrons from a reactor (thermal or cold neutrons): NCT, neutron capture therapy (with Boron or Gadolinium), d) High energy photons produce DNA-lesions and free electrons : Photon therapy PT, (clinics standard: 6-15 MeV) …. four sources with a common principle 2) Chemotherapy drugs convert temporal radiation demages (single strain breaks) to letal radiation demages, which cannot be repaired by the cells. Example: cis-Platinum.
Indirekte Strahlentherapie IRT - 2 : Erzeugung der sekundäre Strahlungsprodukte
Secondary radiation or products of short range (30 µm) evolve from a local target by specific absorption of a) X-ray photons (medium energy, 60 keV) of a synchrotron : PAT, photon activation therapy (= PXT, photodynamic X-ray therapy), b) IR-light photons (water filtered) absorbed at organic target: PDT, photodynamic therapy c) Neutrons from a reactor (thermal or cold neutrons): NCT, neutron capture therapy (with Boron or Gadolinium), d) High energy photons produce DNA-lesions and free electrons : Photon therapy PT, (clinics standard: 6-15 MeV) …. four sources with a common principle
PAT Entwicklung bei ESRF : Tier-Imaging, Tests (Ratte) Therapie und Imaging von Ratten unter Anaestesie • Animals are prepared for imaging and therapy in the biomedical facility BMF: aseptic animal house, ethically correct • Transfer and treatment under anestesia • Beam from a wiggler (30-300 keV) is a line (max. 1 x 200 mm) • Monochromatic beam (double crystal): below / above K-edge (on-off) • Client is rotated and elevated (hight) in the beam – stereotactic irradiation: high dose at tumor only • Image reconstruction from sinograms: tumor localization before treatment
PAT Entwicklung bei ESRF : Tiervesuche (Ratte, F98-Zellline) Therapie Versuche mit Tumorratten, Imaging und PAT-IRT Iopamidol contrast: • Tumor rats were induced with F98 cancer cells (104, 5 µl). • The animals showed tumors of ~ 2-4 mm size after 14 days
tumor
• Imaging (350 µm) at iodine K-edge for localization of tumors (33 keV, Iopamidole 2 ml i.V.) • Subsequent intracranial application of target-liposomes (15 µl, 40 mg/ml)
Synchrotron-tomography sCT of a rat bearing a brain tumor from F98 cells by K-edge contrast imaging with Iopamidole @ 33 keV (iodine-K). The images were obtained with a Ge-detector.
• Irradiation at Lutetium K-edge (15 Gy at tumor, 64 keV, tomographic method) • 3D-alignment of sCT, target injection, and radiation treatment (tomographic)
PAT Entwicklung bei ESRF : erfolgreiche Tierversuche (Ratte) Therapieversuche mit Tumor-Ratten und LanthanidNanopartikeln • • •
PAT Survival curves of tumor rats in animal tests of indirect radiation therapy with Lanthanide targets and Nanoparticles.
•
tumor
The tumor were induced at day 0, the IRT treatment was done at day 14. Additionally the tumors were detected by imaging. Tris2Lu-DTPA, Tris2Gd-DTPA (FerroMed), MRI-analog: Magnevist (Schering)
Tumor rats were induced with F98 cancer cells (104). The animals showed tumors of ~ 4 mm size after 14 days. After intracranical injection of 10µl target-drug an indirect radiation therapy test (10 Gy, at K-edge) was done with 1 h delay by the tomographic technique (rotating) Prolonged survival of animals, which got Gd-DTPA and LuDTPA in liposomes, indicated a successful IRT treatment.
Anwendungen von pharmazeutischen Nanopartikeln : Liposomen – Produkte, parenteral
•AmBisome, Albelcet ; Membran-intercaliertes Amphotericin B SUV, gefriergetrocknet, Lipid: H-SPC (hydriertes Soya-PC), Cholesterin, DSPG
•DaunoXome Encapsuliertes Daunorubicin : Krebstherapie SUV, wässrige Suspension : im Blut stabil Lipid: DSPC, Cholesterol
•Doxil (und Myocet)
F. Martin / www.fda.gov
Encapsuliertes Doxorubicin : Krebstherapie LUV, wässrige Suspension : im Blut 4 Tage stabil Lipid: MPEG-DSPE, H-SPC, Cholesterin Ammonium-Gradient hält den Wirkstoff in den LUV
•Visudyne Membran-intercaliertes Benzoporphyrin SUV, gefriergetrocknet : in Blut instabil, schnelle Freis. Lipid: Ei-PG + DMPC + Antioxidatien
•Junovan Membran-intercaliertes MTP-PE : Krebstherapie MLV , in-situ präpariert : im Blut instabil, Phase-III Lipid: POPC / OOPS : negativ geladen -> Makrophagen
