Medizinische Genomik

Molekularbiologie

Revolution Blütezeit Paradigma-Wechsel

Die Zeit der Gesundheit

Wettstreit der genomischen Techniken Real-time (ware Zeit) PCR

Sequenzierung

Chiptechnologien

Trende in der medizinischen Genomik Verstehen des Funktionsmechanismus’ des Genoms Kennenlernen der Struktur des Genoms

1990-2003 Human Genom Projekt

2003-2010

2010-2020

Nach 2020

Fortschritte in der Medizin

Verstehen der Biologie der Krankheiten

Verbesserung der Effektivität der Heilkunde

Evidenz basierende Heilung

BEGRIFFE

Ziel davon ist die Anwendung der aus wissenschaftlichen Forschungen stammenden Ergebnisse, Tatsachen (Evidenzen) bei Treffen von Entscheidungen im Klinikum.

Translations Medizin Hauptaufgabe dieser ist die Translation der aus den Grundforschungen der vergangenen Jahren stammenden Kenntnissen (molekulare Genetik und Genomik) in die medizinische Praxis. Viele sind der Meinung, dass die TM die Evidenz basierende Medizin des XXI. Jahrhunderts ist.

Medizinische Genomik (genomische Medizin) Verwendet genomische Informationen und Techniken zur Diagnostik und Prognose von genetischen Krankheiten und Neigungen.

Individualisierte Heilkunde Anwendung von molekulargenetischen und genomischen Kenntnissen bei Diagnostik, Prognosen und Therapien.

Individualisierte Heilkunde Anwendung von molekular-genetischen und genomischen Kenntnissen in der Diagnostik, Prognose und Therapie. Im Gegensatz zum früher (und auch gegenwärtig) typischen aus „Aspekt der Menge/Mehrheit” gültigen Heilungs-Paradigmas behandelt die Personen-spezifische individualisierte Heilkunde die Patienten mit Verwendung des individuellen genetischen Profils.

1. Individuelles Testen der klassischen Medikamente 2. Neue spezifische Medikamente: DNA, RNA, Proteine, Antikörper, Stammzellen

Sequenz-spezifische Medikamente: Person-spezifisch

Prediktive Medizin Die prediktive Medizin ist (in engerem Sinn) nicht für Kranke, sondern für gesunde Menschen gedacht. Ziel derer ist herauszufeinden, ob der/die Untersuchte/r eine Anfälligkeit bestimmten Erkrankungen gegenüber besitzt.

Ziel der prediktiven Medizin ist das Vorhersagen von zukünftigen Krankheiten damit der/die Betroffene eine proaktive Lebensweise führen kann und wenn notwendig häufiger an Untersuchungen teilnimmt. Bemerkung: die Medizin von Heute ist reaktív (reagierend); das heißt die anwesende Krankheit wird behandelt.

Schranken: wir kennen Umgebung/Lebensweise.

die

Rolle

der

einzelnen

Gene

und

Genetische Tests Amniozentese

Chordozentese

GENETISCHE TESTS

1. Untersuchung der Neugeborenen(z.B.. PKU) 2. Diagnose nach der Empfängnis (= prenatal Test )

3. Preimplantations Test a. b.

preimplantationsgenetische Diagnose preimplantationsgenetische Untersuchung

4. Untersuchung der Träger

Transabdominale CVS

Transcervikale CVS

5. Test nach der Empfängnis

Amniozentese: aus Amnionflüssigkeit Chordozentese: aus Blut aus dem Bauchnabel Chorionzottenbiopsie (aus der Plazenta) - CVS: chorionic villus sampling;

Tests vor der Empfängnis - Die „echte” prediktive Medizin

Diagnose und Prognose

Genetisches Profil

Prediktiv und preventiv

Genomik Molekulare Biologie:

Erforschung der Struktur und Funktion der DNA, RNA und der Proteine auf molekularer

Ebene

Molekulare Genetik: Erforschung der Struktur und Funktion der DNA, RNA auf molekularer Ebene Genomik: Erforschung der Struktur und Funktion der DNA, RNA und der Proteine mit molekularen Methoden, auf gesamt-Genom Ebene, in einer Zelle, im Gewebe oder einem Organismus.

GENOMIK 1. Strukturelle Genomik 2. Funktionelle Genomik a. b.

Transkriptomik Proteomik

3. Integrative Genomik, z.B. a. b.

c.

d. e.

Komparatíve Genomik Metabolomik In silico Genomik (Bioinformatik) Farmakogenomik Nutrigenomik

4. Epigenomik

Untersucht die Struktur der DNA: Feststellen der Basenreihenfolge; Erkundung der SNP-s und anderen Marker , Erkundung von Krankheitserregenden Faktoren

Untersucht die Expression von RNA-s (a) oder Proteine (b) in einer Zelle, Gewebeart oder einem Exemplar. Sucht die Zusammenhänge zwischen den Makromolekülen:z.B. (a) unterschiedliche Arten Durch vergleichen von DNA Sequenzen; (b) Erkundung des Netzes der Stoffwechselprodukte; (c) Mit bionformatischen Mitteln; (d) Beschäftigt sich mit den Zusammenhängen einer genetischen Varianz Und der Wirkung einer Droge ; oder (e) Zusammenhang zwischen der physiologischen Wirkung der Ernährung und dem genetischen Profil.

Untersucht die Variabilität der DNA Methylation und der HistonModifikationen auf gesamt-Genom Ebene

Pharmakogenomik Untersucht, wie das genetische Profil die Reaktionen des Organismus’ auf Medikamente beeinflusst. Vorhersehbarer Nutzen Wirksamere Medikamente Bessere und sicherere Medikamente Genauere Methoden zum Feststellen der notwendigen Dosis Entwickeltere Untersuchung auf Erkrankungen Besserer Impfstoff Verbesserung in der Fortentwicklung der Medikamente und dem Genehmigungsprotokoll Senkung der durchschnittlichen Kosten der Heilkunde

Viele stellen die Pharmakogenomik mit der individualisierten Medizin gleich

Ernährungswissenschaft Geoffrey Rose

Soziale Theorie:

Medizinwissenschaft der ‘70-er, ‘80-er Jahre: Ursache der häufigsten Krankheiten wird oft durch Ungesunde Ernährung verursacht; eine gesunde Lebensweise kann Probleme lösen. Mediterraneum: Früchte, Gemüse, Fisch, Olivenöl, Wein Nordeuropa: Speck

Nutrigenomik

Metabolisches Syndrom

Fenotypische Biomarker Zur frühen Erkennung der Krankheiten

(in willkürlichen Einheiten)

Metabolischer Stress

Krankheitszustand

Die Nutrigenomik untersucht die Wirkung der Ernährung auf Genomebene

Komplexe Krankheit

Gesundheit, Homeostase

Zeit (Monate, Jahre)

Peroxisom Proliferator Aktivator Rezeptor- oder - : → bindet Fettsäuren: „Fat Burning”

Epigenomik Die Epigenomik ist ein neues Wissenschaftsgebiet aus der Fusion der Epigenetik und der Genomik, dessen Ziel es ist die genetische Regelung auf Genomebene kenenzulernen. Bemerkung: die Epigenetik untersucht die Chromatin-modifikationen auf der Ebene der einzelnen Gene

1. DNA Methylierung (5-Methyl-Cytosin)

2. Histonmodifikationen: -Methylierung, Acetylierung, Phosphorilierung, SUMOilierung P Ac

Met

Epigenetischer Kode 1. Histon-Kode: Muster der Bindung eines Histons an ein DNA-Abschnitt oder an das ganze Genom, welches für eine Zellenart typisch ist.

2. DNA Methylierungkode: Methylierungsmuster der DNA, die für eine Zellenart typisch ist. Der epigenetische Kode ist dynamisch, ändert sich anhand äusserer und innerer Faktoren. Die Embryogenese und die Gewebe-Differenzierung werden durch „strenge” epigenetische Programme gesteuert, das epigenetische Muster des Gehirns ist jedoch „flexibel”.

Der DNA Methylierungskode kann von Eltern an Kinder übertragen werden (genetisches Imprinting) Es sind viel mehr Gene betroffen, wie gedacht Auch das Imprinting kann sich in den Zellen des Nachwuchses ändern Kann nicht nur Repression verursachen, sondern auch zu differenzieller Genexpression führen (Promotor-Methylierung)

Epigenetisches Programm Genetischer und epigenetischer Kode und Programm sind nicht unabhängig Die in der DNA festgehaltene Information wird im Laufe epigenetischer Programme ausgedrückt. Hauptfunktion von bestimmten Genen kann die Koordinierung des Musters des Epigenoms sein. Man kann davon ausgehen, dass diese Gene Hauptzielpunkte der Evolution sind, denn ihre Wirkung ist auf Ebene des ganzen Genoms spürbar. Die Verwirklichung des epigenetischen Programms kann auch von Faktoren der Umwelt beeinflusst werden, ebenfalls wegen ihrer Wirkung auf das Epigenom. Die epigenomischen Muster sind das fehlende Glied in der Kette, was das Verstehen der Zusammenhänge zwischen Genom und Umgebung und die dadurch entstehende Krankheitserregende Mechanismen betrifft.

Epigenomik Untersuchungsmethoden der DNA Methylation: (1)Verdauung der DNA durch methylationsempfindlichen- und unempfindlichen Restriktionsendonukleasen (2)chemische Modifikation der DNA durch Na-Sulfit, C->U Transition der nichtmethylierten Stellen; Sequenzänderung, C-G ->A-T (3)Trennung der methylierten und nichtmethylierten Fraktionen des Genoms durch 5-Methylcytosin Immunpräzipitation Zur Zeit werden alle drei Methoden bei „High throughput” Techniken verwendet

Untersuchung der Histonmethylation - ChIP Kreuzbindung von DNA-Bindenden Proteine (TF-e, Histone) zum DNA z.B. mit Formaldehyd

Isolierung des Chromatins, Zerlegung der DNA in kleine Fragmente

Antikörperbindung an die DNA-Bindende Proteine (Immunopräzipitation), später Aufhebung der Kreuzbindungen und Verdauung der Proteine

PCR und DNA-Sequenzierung

ChIP-on-chip Matrix

Genomiale DNA

Antikörper IP Kreuzbindung und DNA-Bruch Hibridisation

Oligonukleotide auf dem Chip

Reinigung, Amplfikation und fluoreszente Markierung

fluoreszentes Glied

POI: protein of interest – das gesuchte Protein(z.B. Histon) IP: Immunpräzipitation

Human Epigenom Projekt Menschliche Stammzellen+ Fibroblast Zellen

MVP Joseph Ecker, Ryan Lister, Mattia Pelizzola – Oktober 2009

Methylations-Variable Positionen(methylation variable positions; MVPs) können als epigenetische Markern verwendet werden

Systemsbiologie -Beschäftigt sich mit den komplexen Interaktionen in den biologischen Systemen Die Systemsbiologie verwendet statt den - in der Wissenschaft üblichen reduktionistischen Annäherungen holistische Methoden Reduktionistische Methode: Untersucht die Bildungselemente eines Systems, mit der Meinung, dass das ganze System durch die Klärung der Zusammenhänge zwischen den Gliedern vollständig erklärt werden kann – technisch leichter zu schaffen Holistische Methode: das System verfügt über solche neue (emergente) Eigenschaften, welche nicht aus den aus den Ereignissen zwischen den Gliedern folgen, mit anderen Worten, das Ganze kann durch die Regeln der Zusammenwirkungen der Gliedern vollständig nicht erklärt werden Genomik wird oft als ein Wissenschaftsgebiet der Sytemsbiologie bezeichnet. Eine rein holistische Methode in der Genomik wird z.B. durch ein solches Tumor-Chip representiert, bei welches ein Tumor durch die verschiedene Expressionsmuster verschiedener Gene tipisiert wird; und zwei DNA-Chips dasselbe Ergebniss zeigen können, auch wenn die Expression einiger Gene nicht übereinstimmen, da das Muster entscheidend ist.

HAPMAP - 2010 Internationales HapMap Projekt Ziel des Internationalen HapMap Projekts ist die Kartierung des Haplotyps (HapMap; haplotype map)des menschlichen Genoms, wodurch die Häufigen Mustern der genetischen Variationen des Menschen katalogisiert werden können. HapMap wird als ein sehr wichtiges Inventar betrachtet,welches diese genetische Variationen (SNP-s) enthält,welche für das Entstehen der Krankheiten zuständig sind oder als Faktore für die Anfälligkeit gegenüber verschiedene Krankheiten stehen Das HapMap Projekt erschaffte eine Datenbank der genetischen Variationen des Menschen auf genomiale Ebene, welche Datenbank für die Assoziationsuntersuchungen (GWAS; siehe nächste Folie) der häufigen Krankheiten verwendet wird.

SNP GWAS

Assoziationsuntersuchungen auf genomialer Ebene GWAS, genome-wide association studies 350 Publikationen; 1640 SNP → >80 Krankheit oder Eigenschaft

SNP-s: 45% in Introne; 43% zwischen Gene; 12% in Gene

18 Regionen wurden mit mehreren Krankheiten in Zussammenhang gebracht → gemeinsame etiologische Prozesse: z.B.: MHC wird mit 10 verschiedenen Krankheiten in Zusammenhang gebracht: von der Autoimmunkrankheit bis zum Lungenkrebs

Assoziationen im Genom – Dezember 2010

Farbkode

Kartierung mendelscher Eigenschaften Das Kennen der Basenzusammensetzung des menschlichen Genoms reicht allein nicht um die genetischen Hintergründe einer fenotypischen Eigenschaft oder einer Krankheit zu definieren genetische Kartierung ist nötig

kleiner Abstand

Crossing over

Kromatid

grosser Abstand

(genetische Rekombination) Die Rekombinationshäufigkeit Hängt von den genetischen Abstand ab

Phenotypische Marker: der Platz des fenotypkodierenden Elements (Gen) am Chromosom ist bekannt Genetische Marker: genetisch bestimmbare Sequenzen, z.B. Mikrosatellite, SNP-s

Genetische Kartierung: die Häufigkeit der gemeinsamen, bzw. getrennten Vererbung der untersuchten Eigenschaft/Krankheit mit einem Marker dessen Position bekannt ist (Nachkömmlinge: Rekombinant vs. NichtRekombinant) Abstand zwischen genetischen Elemente der Eigenschaft und des Markers wird durch die Rekombinationshäufigkeit zwischen Marker und Eigenschaft bestimmt.

Genetische Karte - Bezugswert: cMorgan - wegen den Rekombinations „hot spots” nicht gleichmässig Physische Karte - Bezugswert: Basenpaar

Genetische Rekombination vs. Genkonversion

Crossing over

Genkonversion

Rekombination vs. Neokombination

Rekombinante Fraktion F Exemplar A1 A2

A3 A3 Allele

B1 B2

B3 B3 Allele

A Gen B Gen

A und B Gene auf unterschiedlichen Chromosomen

A Gen B Gen

F

L Exemplar

L

F Exemplar : Allele von Gen A und B segregieren in 50%: Neokombination Partner von F(L) trägt unterschiedliche Allele (A3 und B3 – als Vereinfachung Homozigoten)

grossväterlich

grossmütterlich

C und D Gene auf demselben Chromosom

C Gen D Gen

G

K

Allele der C und D Gene in Exemplar G segregieren nicht unabhängig -> LD (linkage disequillibrium – Verkopplung ungleich

Gewinn der genetischen Rekombination

1.

Die erhöhte genetische Variabilität der Nachkömmlinge und der Population

2.

Die durch die verschiedenen Exemplare „erfundenen” Neuheiten (vorteilhafte Mutationen) können in einem Genom zusammengebracht werden (bei asexuellen Populationen ist das nicht möglich)

Kopplungsanalyse

1. RFLP – Marker: Restriktionsfragmentlänge 2. Mikrosatelliten- Marker – Mikrochips, DNA Sequenzierung, PCR

3. SNP Marker – Mikrochips, DNA Sequenzierung, PCR 4. Neugeneration DNA Sequenzierung – die Detektierung der Marker ist nicht nötig

Kartierung des „P”-Gens mithilfe von Fingerabdruck

Kopplung: I und C

Kopplung von MikrosatellitenMarker an Allel „P”

Kopplung mit M’’

Mikrosatellitanalyse - 64 Kohlmeisen auf 3 verschiedene Mikrosatellit Loci

Ein Exemplar kann höchstens 6 fluoreszierende Punkte produzieren: 3 x 2 Allele (wenn alle 3 Heterozygoten sind)

Rekombinante Spermien Ausgewählter Mann Heterozygot für mehrere SNP-s

Separation der Mustern

PCR Untersuchung der Region

Genetische Kartierung der Neigungsfaktoren für komplexe Krankheiten Für die Kartierung komplexer Krankheiten kann die herkömmliche genetische Analyse nicht verwendet werden, da die verschidenen Parameter der Neigungsfaktoren (z.B Art der Vererbung, Genhäufigkeiten, Penetranz, usw.) unmöglich zu bestimmen sind (anders gesagt gibt es kein entsprechendes genetisches Modell)

1. Parametrische Methoden 2. Nicht-parametrische Methoden

Krankheiten mit mendelscher Vererbung Komplexe Krankheiten

2a. Nicht-parametrische Verkopplungsuntersuchungen (Untersuchung von Verwandten) 2b. Assoziationsuntersuchungen (Untersuchung von Populationen)

2a. Untersuchung von kranken Familien: Bestimmung solcher kromosomalen Segmenten, welche öfter als nur zufällig in den betroffenen Familienmitgliedern vorkommen (enthalten dieselben Markern) 2b. Untersuchung von Populationen: Suche und Bestimmung gemeinsamer (mit identischem Haplotyp) Kromosomsegmenten bei nicht verwandten Personen

Urhaplotypen

Öftere Krankheit/Öftere Variante Hypothese

Haplotypen

SNP-s Indiv Indiv Indiv Indiv

1 2 3 4

Haplotyp Haplotyp 1 Haplotyp 2 Haplotyp 3 Haplotyp 4

Tag SNP-s

a, SNP-s. 3 SNP-s an einem kurzen DNA-Abstand eines Kromosoms bei 4 Personen. Die meissten Basen der DNA sind in den 4 Personen identisch, aber es gibt 3 variable Stellen. Jede SNP bildet 2 mögliche Allele; 1. C oder T, 2 G oder A und 3. wieder G und A. b, Haplotypen. Ein Haplotyp wird durch die verschiedene Kombination von ca. 20, am untersuchten Locus (6000 Bp langer DNA Abschnitt) platzierte SNP-s gebildet. Achtung, auf Abb. b. sind die einander folgenden SNP-s – darunter auch die von Abb. A. siehe Pfeilchen - dargestellt, die nicht-variierenden Basen werden nicht gezeigt. Aufgrund dieses 6kBp langen DNA-Abschnittes können die meissten Exemplare der Population in 4 Haplotypen geordnet werden. c, Tag SNP-s. Um die 4 Haplotypen unterscheiden zu können reicht die blosse Identifizierung von 3 sogenannten Tag-SNP-s aus dem 20: ATC Tag-SNP Muster ist für Haplotyp 1 karakteristisch, ACG für Ht. 2, GTC für 3 und ACC für Ht. 4. Die Isolierung der Tag-SNP-s vereinfacht die Untersuchung.

Urhaplotyp Urhaplotyp

Ggw. Haplotyp 1 Ggw. Haplotyp 2 Ggw. Haplotyp 3 Ggw. Haplotyp 4

Haplotyp Kartierung: In dem DNA-Abschnitt der den urzeitlichen TAT Haplotyp enthält entsteht eine Mutation (X) zwischen SNP-s 3. und 4. (dadurch wird eine Krankheit verursacht, oder das Risiko einer Krankheit wird erhöht; vor der Kartierung wissen wir nicht dass es zwischen 3. und 4. ist ). In vielen Generationen wird der Ur-Haplotyp-Profil wegen der Rekombination erodiert (Änderungen in rot gezeigt), z.B. in Gegenwart-Haplotyp 1 wird durch Rekombination T auf C getauscht. Allerdings enthält der kürzeste konservierte Haplotyp-Profil bei jedem Patienten die Mutation: TXC. Durch diese Technik kann die Krankheit auf ein 10.000 Bp langen Abschnitt lokalisiert werden (kürzer als ein Gen)

Öftere Variante Hypothese Die häufig vorkommenden multifaktorialen Krankheiten des Menschen werden durch einige Varianten einiger Gene verursacht, wessen Ursache ist, dass in der Zeit der Entstehung der menschlichen Art die Populationsgrösse sehr klein war und durch die plötzliche Expansion die seltenen genetische Varianten häufiger wurden.

SNP-s: Markern an der DNS durch welche die Krankheiten, bzw. Neigungen für Krankheiten detektiert werden können ist ein Mittel in der Person-spezifischen Medizin. Riesige Summen werden durch Pharmazeutischen Industriein diese Forschungen investiert. verkoppelte SNP INTERGENISCHE REGION ausserhalb des Gens

GESUND

Keine Wirkung auf das Protein

Ursachen-SNP innerhalb des Gens REGELUNGSREGION

Regelungs-SNP Menge des Proteins

Kodierungs-SNP Funktion des Proteins

gén KODIERENDE REGION

KRANK

David Goldstein

Seltene Variante Hypothese

Die öfter vorkommenden menschliche Krankheiten werden nicht durch vor langer Zeit geerbten, sondern von relativ neue Mutationen ausgelöst (sporadische Mutation).

Die auf gemeinsame Markern (SNP) basierende Strategie ist nicht gut, da es solche Markern nicht gibt. .

Erst die neue Generation der Sequenatoren kann dieses Problem lösen.

Flaschenhals-Effekt Und menschliche Evolution

Originale Population Flaschenhals-Ereigniss überlebende spätere Population Exemplare

Flaschenhals-Effekt kann ausgelöst werden durch: - reproduktionelle Isolation, Seuchen (u.a. z.B. die Retrovirus Infektion) Bei dem Menschen mehrere unabhängige Kolonisationen (mehr Invasion – z.B ist es nicht sicher, dass HIV Teil des menschlichen Genoms wird) Bei Koalas läuft gerade ein Kolonisationsprozess (~Endogenisation): KoRV (Koala Retrovirus)

Penetranz Kontinuum Faktore die Krankheiten mit Mendelscher Vererbung verursachen

Faktore die Neigungen für weniger ernstere Krankheiten verursachen

Penetranz Die Wirkung der Faktoren mit mendelscher-Vererbung und der Faktoren die nur eine Neigung auslösen werden nicht durch eine Grenzlinie voneinander getrennt, sondern sind eher entlang eines Kontinuums platziert.

Wirkung der Anfälligkeit steigern den genetischen Faktore hängt von: 1. den Allelvariationen weiterer, in der Krankheitsbildung eine Rolle spielende Gene in der Person 2. der Umgebunga 3. den Lebensgewohnheiten ab.

Penetranz Kontinuum hoch

Mendelsche Krankheit Auslösende Varianten

Penetranz

Varianten mit mittelhoher Panetranz, Sind durch SequenZierung zu identifizieren Die meissten Varianten Werden durch GWA Untersuchungen identifiziert

niedrig 0,001

0,01

Allelhäufigkeit

0,1