Menschliche Metaphasechromosomen; Anfärbung spezifischer Regionen des Chromosomenpaars 22
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Nukleinsäureblotting Kapillarblot
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Nukleinsäureblotting Zoo‐Blot
(Fotografie von Dr. Marion Jurk)
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Nukleinsäureblotting Aufbau einer Slot‐ und Dot‐Blotapparatur
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
DNA‐Microarrays • Prinzip der Hybridisierung liegt zugrunde Prinzip der Hybridisierung liegt zugrunde • gleichzeitige Untersuchung der Expression vieler Gene in einer Probe
Modul 2303-021
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Isolieren der mRNA
Modul 2303-021 A B
ATTTACAGGAA ATTTACAGGAA ATTTACAGGAA
ATCTACCCAGGAA A
ATCTACCCAGGAA A ATCTACCCAGGA AA
AT TCTACGCCAGGAA AT TCTACGCCAGGAA AT TCTACGCCAGGAA
AACGCCAG GGAA AACGCCAG GGAA TAACGCCAG GGAA
ATTAACAGGAA ATTTACAGGAA A ATTAACCGGAA ATCTACAGGA AA ATTAACCGGAA ATCTACAGGA AA ATTAACCGGAA ATCTACAGGAA A AT TCTACAGGAA ATCTACAGGAA A
ATTAACAGGAA A ATT TAACAGGAA
ATTAACAG GGAT
ATTAACAGGAT ATTAACAGGA AT
Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
DNA‐Microarrays Aufbau eines Microarrays
1
2
3
C
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
DNA‐Microarrays
Durchführung eines DNA‐Microarray‐Experiments
cDNA‐ Synthese
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Synthese von cDNA • cDNA = copy DNA • mRNA‐Sequenz in Form von DNA • keine Introns
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
DNA‐Microarrays Durchführung eines DNA‐Microarray‐Experiments
Microarray
Isolieren der mRNA
Modul 2303-021
cDNA‐ Synthese
Markierung der cDNA mit Fluoreszenz‐ farbstoffen
Fluoreszierende cDNA mit dem Microarray hybridisieren
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
DNA‐Microarrays Durchführung eines DNA‐Microarray‐Experiments
100000
Legend Unflagged Norm & Unflagged Good Norm & Good Bad Norm & Bad Absent Norm & Absent Not Found Norm & Not Found Selected Norm & Selected
F635 Median
10000
Scannen
Datenanalyse
1000
100
100
1000
10000
100000
F532 Median
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
DNA‐Microarrays Verschiedene Arten von Microarrays
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Mutagenese
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Mutagenese ortsgerichtete Mutagenese • die zu mutagenisierende die zu mutagenisierende Sequenz muss bereits bekannt sein Sequenz muss bereits bekannt sein • man sollte wissen, welche Mutation man einführen will • es funktioniert am besten, Punktmutationen einzuführen, da man mit Primern arbeitet: Primer-Templat-Duplex 5'-cgatcccattggcgccaagcgctcctc-3' ||||||||||||| ||||||||||||| gaggctagggtaaccgaggttcgcgaggaggta
Serin
Æ
Alanin
• man untersucht also die Auswirkungen von einzelnen oder wenigen AS‐Austauschen
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Mutagenese ortsgerichtete Mutagenese
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Mutagenese Zufällige Mutagenese mittels mutagener Substanzen • wird häufig verwendet, wenn man Gene finden will, die an einem bestimmten Prozess beteiligt sind • Problem: Mutationen sind zufällig und deshalb müssen viele mutagenisierte Individuen untersucht werden • Vorbereitung der Versuche teilweise aufwendig • Substanzen, die für die Mutagenese eingesetzt werden, sind stark gesundheits‐ schädlich hädli h
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Ethylmethansulfonat (EMS): Punktmutationen von G nach A oder C nach T nach A oder C nach T
x
+/+ +/+* +/+*
+/+ x
+/+*
Screening
+*/+*
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in Zellen: Einbringen von DNA in Zellen: Transformation und Transfektion
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in Bakterien: Transformation Transformation chemisch kompetenter Zellen
Plasmid‐DNA zu kompetenten Zellen geben
10 min auf Eis
1 min 42 °C Hitzeschock
Zugabe von Medium
1 h 37 °C
37 °C über Nacht Ausplattieren
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in Bakterien: Transformation Transformation durch Elektroporation Stromquelle Deckel Küvette Elektroden elektrische Kontakte Zellsuspension
http://en.wikipedia.org/wiki/Electroporation
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion chemische Reagenzien: DEAE‐Dextran • DEAE‐Dextran: kationisches Polymer • assoziiert mit negativ geladener DNA • die positiven Ladungen erlauben der negativ geladenen Zellmembran zu kommen • Aufnahme wahrscheinlich durch Aufnahme wahrscheinlich durch Endocytose
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion chemische Reagenzien: Calciumphosphat
Plasmid‐DNA Calciumchlorid
Phosphat‐ Puffer
20 min
Modul 2303-021
• Calciumphosphat bildet mit DNA ein Präzipitat • das Präzipitat wird von den Zellen über Endozytose oder Phagocytose aufgenommen • Calciumphosphat hemmt möglicher‐ weise Nukleasen 2 – 12 Std.
Untersuchung
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion chemische Reagenzien: Liposomenmethode Endozytose
Plasmidvektor-DNA
Endosom
freigesetzte DNA
DNA-LipidKomplex LipofectionReagenz Zellmembran
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion physikalische Methoden: • Elektroporation • biolistische Methode mittels Genegun • direkte Mikroinjektion
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion Transiente und stabile Transfektion transiente Transfektion: Vektor wird nicht in das Wirtsgenom integriert, Transgen wird nur transient exprimiert stabile Transfektion: Transgen integriert ins Wirtsgenom; das ist selten und wird durch Cotransfektion mit einem Resistenzgen erreicht
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in eukaryotische Zellen: Transfektion Mit einem GFP‐Vektor transfizierte S2‐Zellen
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in Organismen: Einbringen von DNA in Organismen: Herstellung transgener Tiere
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in Organismen Herstellung transgener Tiere am Beispiel von Drosophila Transposase
5‘ Repeat
Helferplasmid 3‘ Repeat
+ P‐Element‐Vektor
Duplikation der Insertionsstelle
Transposition Transgen
Modul 2303-021
Marker
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in Organismen Herstellung transgener Tiere am Beispiel von Drosophila
Syncytium PolzellenKnospung
Helferplasmid und P-Element-Vektor mit white+-Markergen
Zellularisierung x
http://dev.biologists.org
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in Organismen Herstellung transgener Tiere am Beispiel von Drosophila
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
Einbringen von DNA in Organismen Herstellung transgener Tiere am Beispiel der Maus
PCR‐Analyse oder Southern Blot der DNA
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
k k knock‐out‐ und knock‐down‐Techniken dk k d h ik
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
knock‐out und knock‐down Techniken knock‐out durch homologe Rekombination
neo: vermittelt Neomycin‐Resistenz tk (Thymidinkinase): vermittelt Sensitivität gegenüber Ganciclovir
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
knock‐out und knock‐down Techniken knock‐out durch homologe Rekombination
Modul 2303-021
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Analytische Methoden der Biologie SS09 7 Klonierung und Gentechnik
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
knock‐out und knock‐down Techniken RNAi (RNA interference)
Institut für Physiologie Fachgebiet Biosensorik
knock‐out und knock‐down Techniken RNAi (RNA interference)
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.ht l
