DNA-KLONIERUNG

DNA-KLONIERUNG http://openpcr.org/use-it/ DNAKLONIERUNG: Vervielvältigung eines DNA-Moleküls In vitro - PCR In vivo – in unterschiedlichen Wirtsz...
Author: Gitta Becke
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DNA-KLONIERUNG http://openpcr.org/use-it/

DNAKLONIERUNG: Vervielvältigung eines DNA-Moleküls In vitro - PCR In vivo – in unterschiedlichen Wirtszellen

POLYMERASEKETTENREAKTION (Polymerase Chain Reaction, PCR)

PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) „Polymerase-Kettenreaktion“ zur Vervielfältigung (Amplifizierung) von Nukleinsäuren

Erfinder: Kary Mullis (1985) PCR eröffnet in fast allen Bereichen der Naturwissenschaft zahlreiche neue Möglichkeiten Nobelpreis für Mullis in 1993

Polymerase-Kettenreaktion 





Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Möglichkeit ein Stück DNA (bis auf 40 kb) zu vervielfältigen. Mit dieser Methode lassen sich, mit Hilfe einer hitzestabilen Variante des Enzyms DNA-Polymerase, kurze DNA-Abschnitte vervielfältigen, wobei nur sehr wenig Ausgangsmaterial benötigt wird. Es werden nur die Moleküle verwendet die auch bei der Replikation teilnehmen.

Taq-POLYMERASE Thermus aquaticus DNA-Polymerase

Taq Taq-Polymerase wird

bei 95 °C nicht zerstört! Taq-Polymerase funktioniert bei 72 °C am besten

 Die Taq-Polymerase ist eine DNA-Polymerase

 Durch diese thermostabile Polymerase wurde die Technik im Alltag verwendbar  Heute sind auch eine Reihe von rekombinanten Enzymen erhältlich

Taq-POLYMERASE  Die Taq-Polymerase wurde aus dem in heiβen Quellen lebenden thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnen.

Die grundlegenden Komponente NUKLEOSID-TRIPHOSPHATE (dNTP-s: dATP, dGTP, dTTP, dCTP): die Bausteine für den neuen DNA Strang TEMPLATE: zu amplifizierende DNA, die originale DNA, die man vervielfältigen möchte PRIMER: einzelsträngige DNAs mit einer Länge von 20-30 Nukleotiden (Oligonukleotide). Thermostabile DNA-POLYMERASE katalysiert die Synthese vom neuen DNA-Strang

Enzym-Cofaktor: Mg2+ (MgCl2) Puffer: Erhaltung des pH-Wertes, Salzkonzentration

TEMPLATE 

Eine kleine Menge der DNA-Probe genügt.



Rein theoretisch gesehen genügt auch nur ein DNAMolekül.



Die untersuchte Sequenz muss nicht bekannt sein, nur zwei kurze Abschnitte an beiden Enden.



Als Template kommen zB. die folgenden „Stoffe” in Frage:  

 

Geronnenes Blut / frisches Blut Haare mit einer Haarwurzel Nagelsplitter Zellen, die an einer Zahnbürste haften

PRIMER Primer sind solche kurze Sequenzen die mit beiden Enden der zu vervielfachenden DNA komplementär sind; Ihre 3’ Enden sind sich gegenüber.

Forward Primer

Reverse Primer Primer müssen bei gleicher Temperatur schmelzen (Schmelztemperatur hängt vom GC-Inhalt ab)

Primer müssen im grossen Überfluss vorhanden sein

PCR findet in

PCR-Gerät

einem Gerät, das THERMO CYCLER genannt Schutzhaube Heizblöcke

wird, statt. Diese Maschine

erhitzt und kühlt die Reaktions-

röhrchen in kürzester Zeit auf die Steuerungseinheit

angegebene Temperatur.

Die drei Hauptschritte des PCR-Zyklus DENATURATION - Schmelzen bei ca. 94°C : Zuerst wird die doppelsträngige DNA auf 94-95 ˚C erhitzt, um die Stränge voneinander zu trennen (die Wasserstoffbrücken zwischen den Basen brechen auf) und um alle enzymatische Reaktionen stillzulegen (z. B. die bei dem letzten Schritt vom vorherigen Zyklus aktiven Enzyme). ANNEALING - Anlagerung - Primerhybridisierung bei ca. 50-60°C : Nach der Trennung der Stränge wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer, die den Start- und Endpunkt des zu vervielfältigenden DNAAbschnitts bestimmen, sich an die einzelnen DNA-Stränge anlagern können. Diese Primer sind zu den Enden des DNA-Abschnitts komplementär und werden künstlich hergestellt. EXTENSION – Elongation - Verlängerung bei ca. 72°C : Schliesslich ergänzt die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden (dNTPs). Sie beginnt am 3‘-Ende des Primers und folgt den DNA-Strang. Diesen PCR-Zyklus lässt man 25- bis 50-mal ablaufen.

ZYKLUS 1.

zu vermehrender DNA-Abschnitt

5’ 3’

3’ 5’

Denaturierung (T>90°C) 3’

5’ 3’

5’ Annealing (55 – 65 °C) 3’

5’ 3’

5’

5’

3’ 5’

3’ DNA-Synthese (72 °C)

3’ 5’ 3’

5’ 5’

3’ 5’ 3’

N = N0 * 2n

N = Zahl der amplifizierten Moleküle

N

EXPONENTIELLER ANSTIEG DER GEWÜNSCHTEN DNA

N0 = Zahl der Startmoleküle n

= Zahl der Zyklen

N0

n

Mathematische Beschreibung der PCR praktisch:

theoretisch:

N

20 Zyklen: 1,048,576

30 Zyklen: 1,073,741,824

N0

n

Plateau-Phase Limitierung von Reaktionskomponenten Thermische Inaktivierung der DNA-Polymerase Reassoziation der PCR-Produkte konkurriert mit Primeranlagerung

Vor der Entdeckung der Taq-Polymerase… Man musste die nicht hitzestabile Polymerase in allen Zyklen wieder zugeben.

und heutzutage…

BESTÄTIGUNG VON PCR-PRODUKTEN MIT GELELEKTROPHORESE

AGAROSE GELELEKTROPHORESE - Agarose Gelelektrophorese ist die Methode für Separation von DNAFragmenten anhand der Länge der Molekülen - DNA-Fragmente sind negativ geladen, dafür wandern Sie in einem elektrischen Feld von der Katode in die Richtung der Anode - Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von mehreren Faktoren: - die Konzentration des Gels, die den Porendurchmesser determiniert - die Größe der DNA-Molekülen - die Konformation der DNAMolekülen - die Zusammensetzung der Elektrolytlösung - die elektrische Feldstärke

AGAROSE GELELEKTROPHORESE - die DNA-Fragmente werden nach Ethidiumbromid-Färbung im UV-Licht sichtbar gemacht (EtBr-gefärbte DNA Banden fluoreszieren im UV-Licht) - die Größe von beliebigen Fragmenten kann durch Kalibration mit DNAs von bekannten Größe (sogenannte Marker-DNAs) bestimmt werden - Getrennte DNAs können aus dem Gel für Sequenzierung oder Klonierung isoliert werden.

OPTIMIERUNG DES PCR-PROTOCOLS

Kritische PCR-Parameter:  Konzentration der DNA-Template  Länge, Konzentration und Schmelzpunkt der Primer  Konzentration freier Nukleotiden  Konzentration divalenter Kationen (meistens Mg2+)  Art und Konzentration der Polymerase  Reaktionsbedingungen (PCR-Programm)

PRIMERPLANUNG PRIMERLÄNGE SCHMELZPUNKT (TM)

SPEZIFIZITÄT KOMPLEMENTÄRE PRIMERSEQUENZEN

G/C-INHALT SEQUENZ AM 3’-ENDE : Richtung der DNA-Synthese

5’ 3’ 3’

5’

3’

5’

3’ 5’

PRIMERPLANUNG SCHMELZPUNKT, (TM) DEN SCHMELZPUNKT DER PRIMER KÖNNEN WIR EINFACH BESTIMMEN:

Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C #: DIE ANZAHL DER ENTSPRECHENDEN BASE IN DEM PRIMER

ANNEALING MUSS ZIRKA 5°C NIEDRIGER ALS TM sein BEIDE PRIMER MÜSSEN ÄHNLICHE TM-WERTE HABEN

Medizinische Nutzung von PCR: 

Untersuchung auf erbbare Mutationen



Diagnose von viralen Infektionen, z. B. Erkennung von HIV, HPV, EBV, CMV, Herpesvirus, Rotavirus, Calicivirus







Diagnose von bakteriellen Infektionen ohne eine Zellkultur zu benötigen, z.B. Erkennung von TBC (Mycobacterium tuberculosis ), Syphilis (Treponema pallidum), Lepra (Mycobacterium leprae ), Chlamydia (Chlamydia trachomatis ) Diagnose von Erbkrankheiten (Detektion von Genmutationen durch Amplifikation, Sequenzierung), z.B. zystische Fibrose, Brustkrebs, Retinoblastom Pränatale Diagnostik:  Proben aus der amniotischen Flüssigkeit  Geschlechtsbestimmung  Diagnose von vererbbaren Krankheiten durch die Detektion der verursachenden Mutationen

ANWENDUGEN DER PCR

GERICHTSMEDIZIN

GERICHTSMEDIZIN - DNA-Fingerabdruck-Analyse - STR (Short Tandem Repeats):

- Die 7-40-fache Wiederholung von 2-7 Basen - VNTR (Variable Number of Tandem Repeats): - Die Anzahl der Wiederholungen ist von Mensch zu Mensch unterschiedlich, was eine sichere Identifizierung ermöglicht

- Das FBI verwendet 13 polymorphische Loci. Anhand dieser Loci kann jeder Mensch durch seine DNA identifiziert werden.

FBI’s STR LOCI

VNTR Analyse: Die STR-s werden mit PCR vervielfacht und auf einem Gel sichtbar gemacht

DNA-Fingerabdruck Analyse in der Gerichtsmedizin

- drei untersuchte VNTRLoci - DNA von drei Verdächtigen + DNAProbe des Täters vom Tatort - multiplex PCR mit 6 Primern

- 6 Fragmente von allen Proben - die Muster der drei Verdächtigen sind unterschiedlich - das Muster der Probe B ist mit dem Muster der Probe F identisch

Schwächen der PCR 





Fehler der Taq-Polymerase:  Es besitzt die Fähigkeit des „proof reading” nicht.  Es macht alle 2 x 104 Basenpaare einen Fehler.  Die neuen rekombinanten Polymerasen sind besser. Kontamination (mit anderer DNA) Wenn der Primer sich am Anfang an eine schlechte Stelle bindet, kann es vorkommen, dass nicht das gewünschte Fragment vervielfacht wird.

REKOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE

DNA Fragmente aus verschiedenen Quellen können kovalent gekoppelt werden

REKOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE

DNA Fragmente aus verschiedenen Quellen können kovalent gekoppelt werden

RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN

Enzyme, die DNA schneiden können

DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN - Manche Bakterienstämme sind gegen Infektion mit Bakteriophagen immun, sie produzieren Enzyme, die die Phagen-DNA abbaut, noch bevor sie sich replizieren kann (Abwehrmechanismus). - Die Entdeckung von Restriktions-Modifikations Systeme in Bakterien führte zur Entwicklung von gezielten, kontrollierten und reproduzierbaren in vitro DNA-Spaltung und Ligation. - Das ist die Grundstrategie der DNA-Klonierung. - Das Restriktions-Modifikations-System beruht sich auf zwei Enzyme: - 1. Restriktionsendonuklease - 2. DNA-Methylase

DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 1. Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen, Restriktasen, REs): erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden die doppelsträngige DNA innerhalb oder in der Nähe der Erkennungssequenz. - „Restriktion” deutet die Fähigkeit von Bakterien zur Degradierung fremder DNA nach Infektion von Bakteriophagen an. (Die Wirtszelle erzeugt restriktive Umständen für die Bakteriophagen) 2. DNA-Methylase modifiziert die Bakterien-DNA mit Methylgruppen innerhalb der Erkennungssequenz von eigenen Restriktasen.

DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN - Restriktionsendonukleasen erkennen DNA-Sequenzen von vier bis acht Basenpaaren (Restriktionsstelle). - die Erkennungssequenzen sind sogenannte Palindrome: DNASequenzen, die gleich sind, wenn der eine Strang von links nach rechts und der andere von rechts nach links gelesen wird - Viele Restriktionsenzyme bilden überhängende komplementäre einzelsträngige DNAs an den Enden der Restriktionsfragmenten. Die werden auch als klebrige Enden bezeichnet. Ligase kann mit hoher Effizienz DNAs mit homologen klebrigen Enden binden.

5´GAATTC 3´ 3´CTTAAG 5´

DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN

- Eine zweite Gruppe von Restriktasen produziert gerade (oder glatte) Enden. Diese Enden ohne komplementäre überstehende Enden können nur schwer von Ligase gekoppelt werden. Die haben aber den Vorteil, dass sie alle anderen DNAs mit glatten Enden binden können.

DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN

EcoRI spaltet die doppelsträngige DNA innerhalb der Erkennungssequenz

DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN Ein Enzym mit einer Erkennungssequenz von 4 Basenpaaren schneidet durchschnittlich alle 44 = 256 Basenpaare

Ein Enzym mit einer Erkennungssequenz von 6 Basenpaaren schneidet durchschnittlich alle 46 = 4096 Basenpaare Ein Enzym mit einer Erkennungssequenz von 8 Basenpaaren schneidet durchschnittlich alle 48 = 65536 Basenpaare

DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN Enzym

Quelle

Erkennungsstelle

Durchschnittliche Fragmentgrösse

DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN

Unterschied bei der Verdauung zirkulärer und linearer DNA

AGAROSE GELELEKTROPHORESE Marker DNA

Trennung von DNA-Molekülen anhand Molekulargewicht

RESTRIKTIONSKARTIERUNG Unabhängige und Parallelverdauung mit zwei oder mehreren Restriktionsendonukleasen wird gemacht um die Position der Schnittstellen zu bestimmen, eine Restriktionskarte zusammenzustellen

RE1

RE2 RE1+RE2

RFLP

Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus 





Unterschiede in den DNASequenzen zwischen Individien können als genetische Marker in menschlicher DNA genutzt werden Erste Markergeneration (1986): basieren auf Unterschieden in Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

RFLP

Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus Die Länge eines Restriktionsfragments wird durch Mutation beeinflusst, bei der eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym entsteht oder verloren geht.

Verwendung: Identifizierung eines Individuums Identifizierung rezessiv vererbter Krankheiten, pränatale Diagnose von Erbkrankheiten.

RFLP

Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus Identifizierung rezessiv vererbter Krankheiten, pränatale Diagnose von Erbkrankheiten.

Sichelzellanämie

DNA-KLONIERUNG -

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DNA-Klonierung: eine Methode, bei der man eine beliebige DNASequenz, z. B. ein Gen, in einen Vektor z. B. ein Plasmid integriert und dann es in lebendigen Zellen amplifiziert Amplifikation von einzelnen DNA Molekülen in vitro mit PCR Amplifikation von einzelnen DNA Molekülen in vivo (in Zellen) Notwendige Komponente der DNA-Klonierung:  DNA-Fragment  mit kompatibelen Restriktasen linealisierte VektorDNA  DNA-Ligase  Kompetente Wirtszellen

DNA-KLONIERUNG: WIRTSZELLE - eine Wirtszelle wird mit dem Konstrukt aus dem

Vektor und der integrierten, zu untersuchenden DNA transformiert und kann dann untersucht werden - die typischen Wirte in molekularbiologischen Laboratorien sind Stämme des Bakteriums

Escherichia coli

- für molekulare Klonierung werden nicht pathogene Stämme von E. coli benutzt - in solchen Stämmen kann fremde DNA in enormen Mengen amplifiziert werden, die fremde DNA bleibt stabil - die Stämme sind Mutanten für bestimmte Gene, die für Rekombination und das RestriktionsModifikationssystem verantwortlich sind - E. coli hat die Vorteilen, dass es schnell und einfach kultiviert werden kann (eine Zellteilung dauert 20 Minuten) und genetisch gut charakterisiert ist - neben E. coli, viele andere prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen sind verwendet

DNA-KLONIERUNG: VEKTOREN - In vitro hergestellte DNA kann in die Wirtszellen mithilfe von Vektoren eingebracht und vermehrt werden - Vektor-DNAs stammen von prokaryotischen oder eukaryotischen Plasmiden, Viren und Transposonen - als ein Vektor in die Wirtszelle gelangen ist (durch Transformation oder Transfektion) - integriert es sich ins Genom, oder - verhält es sich als individuelles Replikon in der Zelle (Replikationsstartstelle) - Vektor DNAs sind am meisten in vitro modifiziert und enthalten die folgenden Komponenten: - Selektionsmarkergen (z.B. Gen für Antibiotika-Resistenz) - Unikale Restriktionsstelle(n) - viele Vektoren wurden für speziellen Zwecken entwickelt: z.B. Expressionsvektoren ermöglichen die Produktion von Proteinen anhand der klonierten DNA

NATÜRLICHE PLASMIDE - Natürliche Plasmide sind kleine ringförmge DNA-Moleküle - sie können in hoher Kopienzahl in einem Bakterium vorkommen - sie werden unabhängig von dem bakteriellen Chromosom repliziert (Replikationsursprung, ori) - sie tragen oft Gene für Antibiotikaresistenz

PLASMIDVEKTOREN

- künstliche Plasmide werden als Plasmidvektoren benutzt - sie tragen Gene für Antibiotikaresistenz - Selektion - ori: Replikationsursprung, das Plasmid kann in E. coli vermehrt werden - MKS: multiple Klonierungsstelle mit einer Reihe unikalen Erkennungssequenzen von Restriktionsendonukleasen

Klonierung von Fremd-DNA in einen Plasmidvektor - Die Vektor-DNA wird mit einem Restriktionsenzym linearisiert - die Ziel-DNA, die als Insert in den Vektor (Plasmid) integriert werden soll, wird mit dem gleichen Enzym geschnitten - komplementäre Enden entstehen an Vektor- und Ziel-DNA (überstehende Einzelstränge) - so ist es nun möglich, den Vektor und das ZielDNA-Stück miteinander zu verbinden (Ligase)

DNA-KLONIERUNG: LIGATION - DNA Ligase: ein Enzym, das DNAMoleküle zwischen einem 5’-PhosphatEnde und einem 3’-OH-Ende miteinander verbinden kann - DNAs mit komplementären einzelsträngigen Enden können diese Basenpaarung eingehen - die Enden werden als kohäsiv oder klebrig bezeichnet, über die können DNAs durch die DNA-Ligase fest verbunden werden - die DNA-Ligase katalysiert die Bildung neuer Phosphodiesterbrücken - die Ligation wird bei 10 bis 15ºC durchgeführt. Bei dieser relativ tiefen Temperatur ist gewährleistet, dass die beiden komplementären Enden Basenpaare ausbilden und das Enzym (Ligase) noch arbeitet.

DNA-KLONIERUNG: TRANSFORMATION - Transformation im Zusammenhang mit rekombinanter DNA: das Einbringen von DNA in eine Zelle - das Vektor-Insert-Konstrukt wird in E. coli eingeführt - die meisten Bakterien (auch E. coli) nehmen DNA unter normalen Bedingungen nur in begrenztem Umfang auf - um diese Bakterien wirksam zu transformieren, muss man die Zellen physisch und/oder chemisch behandeln - so wird ihre Fähigkeit verstärkt, DNA aufzunehmen - Zellen, die eine solche Behandlung durchlaufen haben, bezeichnet man als kompetente Zellen - nach der Transformation erfolgt die Selektion von Bakterien, die den Plasmid mit dem Insert enthalten - dafür kann man bei Plasmidvektoren deren Antibiotikaresistenzgene ausnutzen, oder - Vektoren benutzen, die das lacZ-Gen enthalten (Genprodukt des lacZ-Gens ist das Enzym ßGalactosidase, es katalysiert die Hydrolyse des Substrates X-gal wodurch Blaufärbung entsteht)

DNA-KLONIERUNG: SELEKTION Selektion der Bakterienzellen mit dem rekombinanten Vektor: • Plasmide mit zwei Antibiotikaresistenzgene • Plasmide mit dem lacZ Gen

DNA-KLONIERUNG: SELEKTION Gen von Interesse

Rekombinantes Plasmid

Verdauung mit Restriktase

Transformation

Ligation

R2

R1 Plasmid

Verteilung der Bakterien an der Oberfläche von festem Medium, das Antibiotikum 1 enthält

Meisterplatte

Replika-Platierung auf Platte mit Antibiotikum 2

Isolierung der Antibiotikum 2 sensitiven Kolonien von Meister Platte

Nachtsüber Wachsen

Replikaplatte

Plasmide mit zwei Antibiotika-Resistenz Genen

Isolierung der Plasmid-DNA

DNA-KLONIERUNG: SELEKTION Gen von Interesse

Rekombinantes Plasmid

Ligation

Verdauung

Transformation

lacZ

R1

Verteilung der Bakterien an der Oberfläche von festem Medium, das Antibiotikum 1 und X-Gal enthält Isolierung der weißen Kolonien

Nachtsüber Wachsen

Weiße Kolonien: keine X-gal Abbau, rekombinantes Plasmid

Plasmide mit dem lacZ Gen

Isolierung der Plasmid DNA

EXPRESSIONSVEKTOREN

HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE

Mithilfe von Bakterien können rekombinante Proteine in grossen Mengen hergestellt werden. Das proteinkodierende Gen muss in einen Expressionsvektor mit induzierbarem bakteriellen Promoter eingebaut werden.

HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE

Rekombinante Proteine werden in grossen Mengen von Bakterien isoliert, z.B. mit Affinitätschromatographie.

HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE

Viele eukaryotische Proteine können in Bakterien nicht produziert werden, weil posttranslationale Modifikationen (welche essentiell für die Proteinfunktion sind) nur in Eukaryoten ablaufen. In solchen Fällen benutzt man eukaryotische Expressionssysteme.

MEDICAL APPLICATIONS

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