E P

ENDOKRYNOLOGIA POLSKA POLISH JOURNAL OF E NDOCRINOLOGY

PRACE ORYGINALNE ORIGINAL PAPERS

PRACE

ORYGINALNE /

O RIGINAL

PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/2004 ISSN 0423-104X

Analysis of pendrin expresion in human thyroid tissues with use of antipendrin antibodies Joanna Skubis-Zegadło1, Anna Nikodemska1, Anna Łyczkowska1, Ewa Przytuła2, Jolanta Czerwińska2, Krzysztof Bardadin2, Ireneusz Kozicki3, Janusz Pachucki4, Barbara Czarnocka1 1 2 3 4

Departament Departament Departament Departament

of of of of

Biochemistry, Medical Centre for Postgraduate Education Warsaw Pathology, Medical Centre for Postgraduate Education Warsaw Surgery, Medical Centre for Postgraduate Education Warsaw Internal Medicine and Endocrinology, Medical University of Warsaw

Summary The first step of hormones production in the thyroid gland is iodide uptake into follicular cells and translocation to the follicular lumen where biosynthesis takes place. It has been postulated that pendrin might be one of the transporting proteins involved in the transportation of iodide from the cells to the lumen. Pendrin belongs to solute carrier family SLC26A and consists of 780 amino acids with 12 transmembrane domains. To investigate pendrin protein expression and localization we generated antipendrin antibodies. The polyclonal antibodies were purified by affinity chromatography with bed coupled with synthetic peptide. Obtained antibodies were characterized by high specifity and affinity to the pendrin protein. These antibodies were used for immunological methods e.g. immunohistochemistry and Western blotting. In Western-blot antibodies detected the single polypeptide band about 115 kDa. In immunohistochemistry antibodies recognized the protein localized in apical membrane of the thyrocyte in normal

690

thyroid, in thyroid glands from patients with Graves’ disease or nodular goiter. Expression of pendrin was also confirmed on the mRNA level by Northern-blotting method where single band – 5 kb corresponding to PDS transcript was detected. Examining the pattern of pendrin expression and localization in thyroid diseases could be a step forward to understand the mechanisms of transport and distribution of the iodide in thyroid. (Pol J Endocrinol 2004; 6(55): 690-696) Key words: antipendrin antibodies, pendrin, thyroid, PDS




Joanna Skubis-Zegadło Departament of Biochemistry Medical Centre for Postgraduate Education. 99 Marymoncka St. Warsaw

PRACE

ORYGINALNE /

ORIGINAL

PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/2004 ISSN 0423-104X

Analiza ekspresji pendryny w tkankach tarczycy ludzkiej z użyciem przeciwciał antypendrynowych Joanna Skubis-Zegadło1, Anna Nikodemska1, Anna Łyczkowska1, Ewa Przytuła2, Jolanta Czerwińska2, Krzysztof Bardadin2, Ireneusz Kozicki3, Janusz Pachucki4, Barbara Czarnocka1 1 2 3 4

Zakład Biochemii Klinicznej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa Zakład Patomorfologii, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa Klinika Chirurgii Ogólnej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego, Warszawa Klinika Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii Akademii Medycznej w Warszawie

Streszczenie Pierwszym etapem biosyntezy hormonów tarczycy T3 i T4 jest transport jodu z krwioobiegu do wnętrza tyreocyta, a następnie do światła koloidu. Postuluje się, że jednym z białek transportujących jod do światła koloidu jest pendryna. Jest ona białkiem błonowym, zbudowanym z 780 aminokwasów, posiadającym 12 transmembranowych domen. Wykorzystanie otrzymanych antypendrynowych przeciwciał prezentowanych w tej pracy pozwoliło na scharakteryzowanie lokalizacji oraz poziomu ekspresji pendryny w tkankach tarczycy. Przeciwciała, po oczyszczeniu z wykorzystaniem kolumnowej chromatografii powinowactwa z odpowiednim antygenem związanym ze złożem, charakteryzowały się wysokim stopniem wiązania do antygenu. Wysoko specyficzne przeciwciała zostały użyte w metodach immunologicznych: immunohistochemii i Westernblottingu. W metodzie Western-blotting przeciwciała wiązały się z białkiem o ciężarze ok. 115 kDa. Przeciwciała reagowały immunohistochemicznie z białkiem zlokalizowanym na szczytowej części błony tyreocyta w tkankach

Wstęp Jod jest pierwiastkiem niezbędnym w biosyntezie hormonów tarczycy. Jego transport zarówno z krwi do komórek pęcherzykowych otaczających koloid, jak i z ich wnętrza do światła pęcherzyka jest ściśle regulowany. Pierwszy etap transportu jonów jodu do wnętrza tyreocyta katalizuje zlokalizowany w błonie podstawnej symporter sodowo-jodowy NIS [13, 14, 15, 16]. Etap drugi, translokacja wewnątrzkomórkowego jodu przez błonę szczytową do koloidu, gdzie odbywa się proces jego organifikacji i wbudowania w cząsteczki hormonów tarczycy, możliwy jest dzięki pendrynie, jednemu z opisanych szczytowych transporterów [7, 8, 9, 10]. Gen PDS, którego uszkodzenie odpowiedzialne jest za obserwowany w zespole Pendreda wrodzony brak słuchu i wole został niedawno zidentyfikowany [6, 13, 19]. Pendryna, produkt tego genu, jest białkiem błonowym należącym do rodziny trans-

prawidłowych tarczycy, w tkankach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa i z wolem wieloguzkowym. Analiza Northern-blotting pozwoliła na zidentyfikowanie pojedynczego prążka – 5 kb odpowiadającego transkryptowi genu PDS. Zbadanie występowania i lokalizacji pendryny w tarczycy może być kolejnym krokiem dla zrozumienia mechanizmów transportu i dystrybucji jodu w gruczole tarczowym. (Endokrynol Pol 2004; 6(55): 690-696) Słowa kluczowe: przeciwciała antypendrynowe, pendryna, tarczyca, PDS




Joanna Skubis-Zegadło Zakład Biochemii Klinicznej, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego ul. Marymoncka 99, Warszawa

Grant: CMKP 501-2-1-01-60/64/02

porterów anionowych (SLC26A). Poza tarczycą występuje również w nerce, uchu wewnętrznym, endometrium oraz łożysku. W tych tkankach funkcjonuje jako transporter lub wymiennik jonowy [2, 5, 6, 3]. W tarczycy pendryna zlokalizowana jest w błonie szczytowej tyreocyta, gdzie transportuje jod poprzez błonę komórkową do światła koloidu natomiast chlor do wnętrza komórek tarczycy [1, 7, 8, 9]. Badanie ekspresji i lokalizacji białka w komórkach i tkankach tarczycy stało się możliwe, między innymi, dzięki zastosowaniu swoistych przeciwciał. W niniejszym artykule przedstawiono otrzymywanie 10 poliklonalnych przeciwciał antypendrynowych. Przeciwciała te, po oczyszczeniu na kolumnie powinowactwa charakteryzowały się wysoką specyficznością w stosunku do pendryny, stając się bardzo cennym narzędziem w metodach immunologicznych takich jak: immunohistochemia oraz Western-blotting. 691

Analiza ekspresji pendryny w tkankach tarczycy

PRACE ORYGINALNE

Materiały i metody Tkanki tarczycy Tkanki tarczycy otrzymano z kliniki chirurgii ogólnej Szpitala Klinicznego nr 1 im. W. Orłowskiego, Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego w Warszawie. W metodzie Western-blotting analizowano następujące tkanki: 15 tarczyc prawidłowych (TP), 8 tkanek od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (GB) i 5 tkanek od pacjentów z wolem guzkowym nadczynnym. Do analizy Northern-blotting użyto następujących tarczyc: 2 przypadki tkanek prawidłowych, 3 tkanki od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa, 3 wola guzkowate nadczynne. Otrzymane pooperacyjnie tkanki przechowywano w temperaturze -80˚C. Badania immunohistochemiczne przeprowadzono z zaparafinowanych tkanek, które obejmowały następujące przypadki: 47 tkanek prawidłowych (TP), 10 tkanek od pacjentów z chorobą GravesaBasedowa (GB), 28 wól wieloguzkowych (W). Otrzymywanie króliczych poliklonalnych przeciwciał antypendrynowych Otrzymywanie peptydów Peptydy odpowiadające określonej sekwencji łańcucha aminokwasowego pendryny [20] zsyntetyzowano konwencjonalną metodą w fazie stałej (Mimotopes a MitoKor Company, Australia). Obejmowały one następujące sekwencje białkowe: 1 peptyd odpowiadający fragmentowi Nkońcowemu pendryny: aminokwasy 1-15 (MAAPGGRSEPPQLPE),. 2 peptyd: aminokwasy 171-185 (LNTTMIDTAARDTAR); 3 peptyd: aminokwasy 327-338 (IVKSIPRGVLPP); 4 peptyd: aminokwasy 408-421 (SRTAVQESTGGKTQ); 5 peptyd: aminokwasy 768-780 (LDVQDEAMRTLA) odpowiadający C-końcowemu fragmentowi pendryny; 6 peptyd: aminokwasy 157-171 (PDEHFLVSSSNGTVL); 7 peptyd: aminokwasy 234-245 (SQLQIVLNVSTK); 8 peptyd: aminokwasy 244-255 (TKNYNGVLSIIY); 9 peptyd: aminokwasy 317-328 (ANLEKNYNAGIV); 10 peptyd: aminokwasy 337-349 (PPELPPVSLFSEM). Do każdego peptydu została dołączona cząsteczka cysteiny, poprzez którą sprzęgano peptydy z białkiem nośnikowym. Produkcja przeciwciał antypendrynowych Syntetyczne peptydy sprzęgano z hemocyjaniną szkarłatki (KLH – keyhole limpet hemocyanin, Pierce) przy użyciu Sulfo-SMCC (Pierce) jako czynnika wiążącego. Powstałe koniugaty (peptyd + KLH) w ilości 500 µg z dodatkiem kompletnego adjuwantu Freuda używano do immunizacji króli zgodnie ze standardowym protokołem. Przed 692

Skubis-Zegadło J.

szczepieniem pobierano surowicę kontrolną (preimmun). Króle doszczepiano koniugatami po dwóch i po czterech tygodniach oraz dwukrotnie w czterotygodniowych odstępach. W trakcie doszczepiania kontrolowano poziom wytwarzanych przeciwciał antypeptydowych. W 2 tygodnie po ostatnim szczepieniu króle skrwawiono. Surowice testowano na obecność przeciwciał antypendrynowych metodą ELISA. Oczyszczanie przeciwciał antypendrynowych Swoiste przeciwciała antypendrynowe otrzymywano oczyszczając surowice króli metodą chromatografii powinowactwa na kolumnach ze złożem (SulfoLink Coupling Gel Kit®, Pierce) związanym z odpowiednim peptydem. Kolumnę inkubowano z surowicą rozcieńczoną PBS 1:1 przez godzinę w temperaturze pokojowej (RT), następnie płukano PBS (0,15M NaCl w 0,1M buforze fosforanowym o pH 7,4). Związane do peptydów IgG eluowano 0,1 M roztworem glicyny o pH 2,4 i natychmiast neutralizowano poprzez dodanie 50 µl TRIS, pH 9. Stężenie białka w oczyszczonych frakcjach mierzono spektrofotometrycznie (UV-2101PC, Shimadzu), przy długości fali 280 nm. Przeciwciała przechowywano w 4˚C w 1,5% roztworze wołowej albuminy (BSA), z dodatkiem 2,9 mM azydku sodu (NaN3). ELISA Metodą ELISA badano obecność przeciwciał antypendrynowych w surowicach otrzymanych po skrwawieniu króli oraz powinowactwo oczyszczonych przeciwciał do antygenu. Płytki polistyrenowe (Nunc - Immuno Plate, Maxisorb) opłaszczano roztworem odpowiedniego peptydu w stężeniu 0,2 µg/100 µl w buforze węglanowym o pH 9,6. Po nocnej inkubacji w 4ºC płytki płukano wodą dwukrotnie destylowaną. Pozostałe aktywne miejsca wysycano 1% roztworem BSA przez dwie godziny w 37˚C. Badane przeciwciało nakładano w rozcieńczeniach od 1:10 - 1:1 000 000, inkubowano 2 h w 37˚C, a następnie trzykrotnie płukano w PBST (PBS + 0,1% Tween® 20 (SERVA). Ilość związanych z antygenem przeciwciał wykrywano przy pomocy drugiego przeciwciała przeciwko króliczej globulinie sprzężonego z HRP (affinity purified, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc), w rozcieńczeniu 1:10 000. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, płytki płukano trzykrotnie PBST. Reakcję wywoływano TMB i mierzono absorbancję przy długości fali 450 nm. Swoistość przeciwciał badano metodą immunoprecypitacji. Przeciwciała antypendrynowe w stałym stężeniu, odpowiadającym 50% maksymalnego wiązania do peptydu, preinkubowano dwie godziny w łaźni lodowej ze wzrastającym stężeniem peptydu. Mieszaninę nakładano na płytkę opłaszczoną tym samym peptydem i postępowano zgodnie z procedurą opisaną powyżej.

Metoda Western Blotting

Izolacja RNA Northern Blotting

Tkanki tarczycy homogenizowano w buforze (0,25 M sacharoza, 0,02 M Tris, 0,001 M EDTA o pH 7,4) zawierającym inhibitory proteaz (PMSF - 50µM, aprotynina – 1 µg/ml, leupeptyna – 1 µg/ml, pepstatyna – 1 µg/ml). Homogenaty wirowano 15 min, 1000 x g. Osad odrzucono a supernatanty wirowano przez godzinę przy 100 000 x g, 4˚C. Otrzymaną surową frakcję błon rozdzielano na 8% żelu poliakrylamidowym w warunkach redukujących (SDS-PAGE). Białko, w ilości 50 µg na studzienkę, redukowano merkaptoetanolem przez 30 min w 37°C. Elektroforezę prowadzono 50 min przy napięciu prądu 150 V. Rozdzielone na żelu białka elektrotransferowano na membranę Immobilon P (PVDF, Bio-Rad), 90 min, 100 V. Membrany, po uprzednim wysyceniu 5% roztworem odtłuszczonego mleka w PBSN3- (noc w 4˚C), inkubowano dwie godziny w temperaturze pokojowej z roztworem przeciwciał w stężeniu 5 µg/ml. Następnie błony płukano 3 x PBST i inkubowano godzinę z II przeciwciałem, antykróliczymi globulinami znakowanymi HRP, w rozcieńczeniu 1:1000. Błonę ponownie płukano 3 x PBST. Powstałe kompleksy przeciwciało - pendryna uwidaczniano kolorymetrycznie, używając jako chromogenu wzmocnionego DAB (Roche Diagnostics GmbH), lub chemiluminescencyjnie z użyciem SuperSignal West Pico (Pierce). Wizualizację prążków przeprowadzono naświetlając filmy BioMax MS (Sigma - Aldrich, Corp.). Kontrolę negatywną stanowiły surowice króli pobrane przed immunizacją, precypitacja przeciwciała odpowiednim peptydem oraz kontrola reakcji drugiego przeciwciała.

Całkowite RNA izolowano ze 100 mg tkanek tarczycy z użyciem odczynnika TRIzol (Invitrogen) zgodnie z metodą Chomczyński i Sacchi [12]. Ilość otrzymanego RNA mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 260 nm. Czystość otrzymanego RNA oznaczano na podstawie stosunku wartości pomiarów wykonanych przy długościach fal: 260 nm / 280 nm oraz rozdzielenia elektroforetycznego na 0,8% agarozowym żelu podjednostek 28S i 18S rRNA. Obecność RNA oraz wydajność transferu do membrany sprawdzano wybarwiając żel bromkiem etydyny. Wyizolowane RNA przechowywano w -80˚C. Transfer RNA oraz hybrydyzację Northern przeprowadzono zgodnie z metodą opisaną wcześniej [21]. RNA (10 µg) rozdzielone elektroforetycznie na 0,8% żelu agarozowym transferowano osmotycznie na membranę GeneScreen w 10x SSPE (3 M NaCl, 0.25 M NaH2PO4 x H2O, 0.02 M EDTA pH 7,7). Następnie membranę inkubowano z sondą. W badaniach zastosowano sondę będącą fragmentem genu PDS (nukleotydy 3789 – 4137 cDNA pendryny, GeneBank No. GI:4505696) zawierającą radioaktywnie wyznakowany [P32α] dCTP (3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc.). Hybrydyzację membrany z sondą prowadzono w następujących buforach: 50% formamid, 5x SSPE, 1x odczynnik Denhardta i 50 µg/ml DNA spermy łososia. Następnie membranę płukano 3 razy w SSPE. Do ostatniego płukania, które przeprowadzono w 42ºC, dodano 0,1% SDS. Ilość otrzymanego mRNA sprawdzano z użyciem ImageQuant v. 5.0 program (Molecular Dynamics), następnie eksponowano na filmie Kodak BioMax (Sigma - Aldrich, Corp.) przez 1 – 20 dni.

Oznaczanie stężenia białka Stężenie białka mierzono metodą BCA (Pierce) według standardowego protokołu. Immunohistochemiczne barwienie tkanek (IHC) Skrawki tkanek tarczycy (3 µm) inkubowano przez noc w 60˚C na silanizowanych szkiełkach. Materiał odparafinowywano w ksylenie i uwadniano w gradiencie etanolu i wody. Antygen odsłaniano inkubując szkiełka w łaźni wodnej (96°C) przez 20 min w 10mM buforze cytrynianowym (pH 6,0). Po przepłukaniu preparatów w PBS nakładano przeciwciała antypendrynowe w stężeniu 0,25 µg/ml. Preparaty inkubowano przez noc w 4˚C. Następnie płukano je PBS i inkubowano z LSAB 2 Kit (DAKO). Reakcję wizualizowano przy pomocy chromogenu DAB (DAKO). Preparaty podbarwiono hematoksyliną Mayera. Reakcję immunohistochemiczną oceniano używając następujących kryteriów: 0 - brak reakcji, ++ reakcja średnio pozytywna, +++ reakcja silnie pozytywna. Dwóch niezależnych patologów oceniało losowo wybrane preparaty.

Wyniki Charakterystyka przeciwciał antypendrynowych Wysoko oczyszczone przeciwciała otrzymane w wyniku immunizacji króli syntetycznymi peptydami wiązały się z antygenem (ryc. 1). Widoczny przebieg krzywych wiązania przeciwciał sugeruje ich różne powinowactwo do pendryny. Stwierdzono, że pełne wysycenie antygenu przeciwciałami osiągano przy rozcieńczeniu 1:100 000 dla przeciwciał #6 i #10, 1:10 000 dla #1, #2, #3, #4, #5, podczas gdy dla #7 i #8 przy rozcieńczeniu 1:1000. Tylko jedno przeciwciało przeciwko peptydowi 8, charakteryzowało się brakiem wyraźnej różnicy między wiązaniem się do antygenu surowicy kontrolnej a oczyszczonymi przeciwciałami. Zostało zatem pominięte w następnych testach. Swoistość oczyszczonych przeciwciał badano metodą immunoprecypitacji. Dodanie odpowiedniego peptydu do roztworu przeciwciał powodowało hamowanie ich wiązania. Tabela I przedstawia

693

PRACE ORYGINALNE

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2004; 6 (55)

Analiza ekspresji pendryny w tkankach tarczycy

Skubis-Zegadło J.

IgG 1 preimmun 1 IgG 2 preimmun 2 IgG 3 peimmun 3 IgG 4 preimmun 4 IgG 5 preimmun 5

4,0 3,5 3,0

OD 450 nm

100 x 90 % 58% 62,5% 92,77% 83% 55% 88,23% 41,6%

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,01 0,1 1 Stê¿enie peptydu (ug/ml)

10

70 60 50 40 30 20 10 100

80 60 40 stê¿enie peptydu (ug/ml)

20

0 IgG 6 IgG 7 IgG 9 IgG 10

90 80 70 60 50 40 30 20 100

IgG 6 preimmun 6 IgG 7 preimmun 7 IgG 8 preimmun 8 IgG 9 preimmun 9 IgG 10 preimmun 10

4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 1E-3

0,01 0,1 1 Stê¿enie peptydu (ug/ml)

10

Ryc. 1. Wiązanie przeciwciał do syntetycznych peptydów.

Krzywe rozcieńczeń poliklonalnych przeciwciał antypendrynowych i surowic kontrolnych (preimmun). Ryc. 1. The binding of antibodies to the synthetic peptides. The dilution curves of policlonal antibodies and control sera (preimmun).

wyrażone w procentach hamowanie wiązania przeciwciał. Stwierdzono, że inkubacja przeciwciał ze 100 - krotnym nadmiarem peptydu powoduje obniżenie wiązania w około 41 – 62% dla przeciwciał #10, #6, #3, #2, natomiast w 83 – 93% dla przeciwciał #9, #5, #1, #4 (tabela I). Krzywe hamowania wiązania przeciwciał do antygenu przedstawia rycina 2. Wyznaczone na podstawie tych krzywych przybliżone powinowactwo miało wartości rzędu 10-7M - 10-8M. Wartości te wskazują, że większość 694

80

10 1E-3

-0,5

90

Hamowanie wi¹zania (%)

Nr Ilość peptydu (µg/ml) przeciwciała 6,25 x 12,5 x 25 x 50 x 1 15,7% 21,1% 31,6% 43% 2 15,7% 21,1% 31,6% 43% 3 17,5% 25% 43,75% 50% 4 44,4% 55,6% 77,8% 88,9% 5 42,72% 54,55% 69,1% 72,73% 6 11,1% 16,7% 22,3% 44,5% 9 47% 57,06% 69,42% 82,36% 10 6,36% 4,44% 18,18% 22,72%

OD 450 nm

PRACE ORYGINALNE

Table I. Inhibition of antibodies binding to antigen (%).

IgG 1 IgG 2 IgG 3 IgG 4 IgG 5

100

Hamowanie wi¹zania (%)

Tabela I. Hamowanie wiązania przeciwciał do antygenu (%).

80 60 40 20 stê¿enie peptydu (ug/ml)

0

Ryc. 2. Wpływ syntetycznych peptydów na wiązanie się

przeciwciał do antygenu. Ryc. 2. Effect of synthetic peptides on binding antibodies to the antigene.

otrzymanych przeciwciał charakteryzuje wysokie powinowactwo do pendryny. Jakkolwiek wszystkie wysoko oczyszczone przeciwciała antypendrynowe reagowały z antygenem, do dalszych badań użyto przeciwciał: #1 i #5. Peptydy, przeciwko którym je wyprodukowano odpowiadają N-końcowi (peptyd 1) i C-końcowi (peptyd 5) białka pendryny. Metoda Western-blottingu Przeciwciała antypendrynowe reagowały z białkiem pendryny obecnym w surowej frakcji błon tarczycy zgodnie z liniową zależnością. Wzrastającemu stężeniu białka odpowiada wzrastająca intensywność immunoreakcji (ryc. 3A). Liniową zależność reakcji przeciwciał z pendryną obserwowano w zakresie od 15 do 100 µg białka surowej frakcji błon. W warunkach redukujących przeciwciała rozpoznawały prążek, którego wyznaczony ciężar cząsteczkowy wynosił około 115-117 kDa (ryc. 3 B). Kontrolę negatywną w doświadczeniu stanowiły: reakcja surowicy pobranej od króli przed immunizacją, preinkubacja przeciwciała #1 lub #5 z nadmiarem peptydu oraz kontrola niespecyficznej reakcji drugiego przeciwciała.

Metoda barwienia immunohistochemicznego Przeciwciała antypendrynowe #1 i #5 immunoznakowały pendrynę. Zarówno w tkance prawidłowej, wolu wieloguzkowym, jak i w tkankach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa oba przeciwciała reagowały z białkiem zlokalizowanym w części szczytowej tyreocyta (ryc. 5 ABCD). W prawidłowej tarczycy reakcja, zarówno w pęcherzykach jak i w komórkach, była heterogenna, co sugeruje ich różną aktywność funkcjonalną. W tkankach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa i wolach wieloguzkowych obserwowano silniejszą reakcję ograniczoną do błony szczytowej pęcherzyków. Szczególnie intensywną immunoreakcję zauważono w małych pęcherzykach o dużej aktywności proliferacyjnej. Metoda Northern-blottingu Ekspresję genu PDS w analizowanych tkankach tarczycy badano metodą Northern-blotting. We wszystkich analizowanych tkankach transkrypt genu PDS został rozpoznany w przewidzianej dla niego wielkości – 5kb (ryc. 4). W prawidłowych tkankach tarczycy poziom transkryptu genu PDS charakteryzował się zmiennością w zależności od ocenianych tkanek. Poziom ekspresji genu PDS zarówno w tkankach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa, jak i wolu nadczynnym był, w porównaniu do prawidłowej tarczycy, wyższy i podobnie jak wykazano dla tkanek prawidłowych charakteryzowała go zmienność.

Ryc. 3. Charakterystyka ludzkiej pendryny metodą Western-blottingu. A. Pół-ilościowa analiza pendryny. B. Ekspresja pendryny w tkankach tarczycy: prawidłowej (TP), Gravesa-Basedowa (GB), wolu nadczynnym (W), wzorzec molekularny (M). Ryc. 3. Characteristic of human pendrin by Westenblotting. A. Semiquantitative detection of pendrin. B. Expression of pendrin in thyroid tissues: normal thyroid (TP), Graves’ disease (GB), nodular goiter (W), molecular marker (M).

Ryc. 4. Poziom genu PDS w badanych tkankach tarczycy:

tkanka prawidłowa (TP), od pacjenta z chorobą GravesaBasedowa, wole nadczynne (W). Ryc. 4. PDS mRNA levels in thyroid tissues examined: normal thyroid (TP), Graves’ disease (GB), nodular goiter (W).

Dyskusja Biosynteza hormonów tarczycy T3 i T4 oraz metabolizm jodu jest regulowany przez wysoko wyspecjalizowane białka. Postuluje się, że pendryna jest jednym z białek katalizujących transport jodu z wnętrza tyreocyta do światła koloidu [7, 8, 9, 10]. W niniejszej pracy przedstawiono otrzymywanie poliklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko różnym fragmentom ludzkiej pendryny. Przeanalizowano ich stopień powinowactwa do pendryny oraz swoistość reakcji. Stwierdzono, że otrzymane przeciwciała antypendrynowe charakteryzowały się wysokim powinowactwem do antygenu, przez co stały się cennym narzędziem do prowadzenia dalszych badań nad lokalizacją i ekspresją pendryny z użyciem metod immunologicznych (immunohistochemia, Westernblotting). Stosując te przeciwciała potwierdzono, że pendryna zlokalizowana jest w błonie szczytowej tyreocyta, tak jak inne białka kluczowe dla procesu biosyntezy hormonów tarczycy: peroksydaza tarczycowa, NADPH-oksydaza produkująca H2O2 i tyreoglobulina [21]. Ekspresja pendryny w tkankach tarczycy, jak sugerują otrzymane wyniki, związana jest z poziomem funkcjonalnym zarówno komórek tarczycy, jak i pęcherzyków. Heterogenna lokalizacja pendryny w tarczycy opisana przez innych badaczy [9,17] została potwierdzona również przez nas. Wysoki poziom białka pendryny i transkryptu genu PDS obserwowany w tarczycach od pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa wskazuje również, że ekspresja pendryny związana jest z aktywnością metaboliczną tarczycy. Jednakże w tarczycach patologicznych nie obserwowano, typowej dla prawidłowej tarczycy, heterogennej ekspresji białka. 695

PRACE ORYGINALNE

Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology 2004; 6 (55)

PRACE ORYGINALNE

Analiza ekspresji pendryny w tkankach tarczycy

Skubis-Zegadło J.

Ryc. 5. Ekspresja i lokalizacja białka pendryny w tkankach tarczycy: A - prawidłowej; B - od pacjenta z chorobą Gravesa-Basedowa; C - wolu wieloguzkowym; D - kontrola negatywna. Ryc. 5. Expression and localization of pendrin protein in thyroid tissues: A - normal thyroid; B - from a patient with Graves’ disease; C - nodular goiter; D- negative control.

Otrzymane swoiste przeciwciała antypendrynowe o wysokim powinowactwie do antygenu pozwoliły na wstępną charakterystykę pendryny w prawidłowych i patologicznych tkankach tarczycy. Stanowi to ważny etap w badaniach ekspresji białka i genu pendryny w złośliwych patologiach tarczycy.

11.

12.

Piśmiennictwo

13.

1.

14.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Porra V, Bernuer-Valentin F, Trouuttet-Masson S et al. Characterization and Semiquantitative Analyses of Pendrin Expressed in Normal and Tumoral Human Thyroid Tissues. Clin Endo & Met 2002; 87(4): 1700-1707 Soleimani M, Greeley T, Petrovic S et al. Pendrin: an apical Cl-/OH-/HCO3- exchanger in the kidney cortex. Am J Physiol Renal Physiol 2001; 280: F356-F364 Royaux I, Wall S, Karniski L et al. Pendrin, encoded by the Pendred syndrome gene, resides in the apical region of renal intercalated cells and mediates bicarbonate secretion. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98(7): 4221-4226 Rillema J and Hill M. Prolactin regulation of the pendriniodide transporter in the mammary gland. Am J Physiol Endocrinol Metab 2003; 284: E25-E28 Suzuki K, Royaux I, Everett L et al. Expression of PDS/pds, the Pendred Syndrome Gene, in Endometrium. The J Clin Endo & Met 2002; 87(2): 938-941 Everett L, Morsli H, Wu D et al. Expression pattern of the mouse ortholog of the Pendred’s syndrome gene (Pds) suggests a key role for pendrin in the inner ear. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 96: 9727-9732 Arturi F, Russo D, Bidart J et al. Expression pattern of the pendrin and sodium/iodide symporter genes in human thyroid carcinoma cell lines and human thyroid tumors. Europ J Endocrinol 2001;145: 129-135. Rodriguez A-M, Perron B, Lacroix L et al. Identification and Characterization of a Putative Human Iodide Transporter Located at the Apical Membrane of Thyrocytes. J Clinic Endocrinol & Metab 2002; 87(7): 3500-3503 Kondo T, Nakamura N, Suzuki K et al. Expression of Human Pendrin in Diseased Thyroids. J Histochem Cytochem 2003; 51: 167-173 Royaux I, Suzuki K, Mori A et al. Pendrin, the Protein Encoded by the Pendred Syndrome Gene (PDS), Is an

696

15. 16.

17.

18.

19.

20.

Apical Porter of Iodide in the Thyroid and Is Regulated by Thyroglobulin in FRTL-5 Cells. Endocrinology 2000; 141(2): 839-845 Yoshida A, Taniguchi S, Hisatome I et al. Pendrin Is an Iodide-Specific Apical Porter Responsible for Iodide Efflux from Thyroid Cells. J Clinic Endocrinol & Metab 2002; 87(7): 3356-3361 Royaux IE, Belyantseva IA, Wu T, Kachar B et al. Localization and functional studies of pendrin in the mouse inner ear provide insight about the etiology of deafness in pendred syndrome. J Assoc Res Otolaryngol 2003; 4(3): 394-404. Carrasco N. Iiodide transport in the thyroid gland. Biochemical et Biophysical Acta 1993; 1154: 65-82 Spitzweg Ch, Morris J. The sodium iodide symporter: its pathophysiological and therapeutic implications. Clin Endocrinology 2002; 57: 559-574 Dai G, Levy O, Carrasco N Cloning and characterization of the thyroid iodide transporter. Nature 1996; 379: 458-460 Smanik PA, Liu Q, Furminger L et al. Cloning of the human sodium iodide symporter. Biochem Biophys Res Commun 1996; 226: 339-345 Bidart JM, Mian C, Lazar V et al. Expression of pendrin and the Pendred syndrome (pds) gene in human thyroid Tissues. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 2028-2033 Taylor J P, Roussel A, Metcalfe A et al. Mutations of the pds gene, encoding pendrin, are associated with protein mislocalization and loss of iodide efflux: Implications for thyroid dysfunction in Pendred syndrome. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: 1778-1784 Everett LA, Glaser B, Beck JC, et al. Pendred syndrome is caused by mutations in a putative sulphate transporter gene (PDS). 1997; Nat Ggenet 17:411-422. Taurog A Hormone synthesis: thyroid iodide metablolism Braverman LE, Utiger RD, et al. Werner and Ingbar’s The Thyroid: a fundamental and clinical text. 8th Ed. Philadelphia: Lippincott, Wiliams & Wilkins: 2000:61-85

PRACE

ORYGINALNE /

ORIGINAL

PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/2004 ISSN 0423-104X

Iodine supplementation and thyroid autoimmunity markers in children with non – toxic diffuse goiter Paweł Matusik1, Ewa Małecka-Tendera1, Aleksandra Januszek-Trzciąkowska1, Joanna Janowska2, Mieczysław Szalecki3 1 2 3

Department of Pediatric Endocrinology and Diabetes, Silesian University School of Medicine, Katowice Department of Pathophysiology Silesian University School of Medicine, Katowice City Hospital, Kielce

Summary Background: There is a body of evidence that introduction of iodine prophylaxis in iodine deficient region may increase the occurrence of autoimmune thyroid disorders. The aim of the study was to evaluate the influence of iodine supplementation on concentration of thyroid autoimmunity markers in children with nontoxic diffuse goiter. Material and Methods: 24 children (22 girls, 2 boys) with a mean age of 12,9 ± 2,2 years with non-toxic diffuse goiter were treated for 12 months with 100 µg daily of iodine (Iodid, Merck). None of them suffered from autoimmune disorder and they all had negative family history of autoimmune disease. Before and after 3, 6, and 12 months of therapy antibodies to thyroglobulin (TgAb) and to thyroid peroxidase (TPOAb) as well as interleukin – 6 (IL-6), tumor necrosis factor α (TNFα), soluble intercellular adhesion molecule - 1 (sICAM-1) and soluble vascular cell adhesion molecule – 1 (sVCAM-1) levels were measured. After 3 months of therapy TgAb

level increased significantly and remained elevated at 6th and 12th month of treatment. After 6 months a significant increase of sICAM–1 level was noted. TNFα increased significantly after 12 months compared to the baseline value. There were no significant differences in TPOAb, IL – 6 and sVCAM-1 levels during therapy. In all children TSH and fT4 levels were not significantly different between all study points and remained in normal range during the study. Conclusion: Significant increase of TgAb, TNFα and sICAM-1 levels during iodine therapy in children with non-toxic diffuse goiter may indicate that this treatment modality can increase the risk of thyroid autoimmunity in iodine sufficient regions. (Pol J Endocrinol 2004; 6(55): 697-702) Key words: non-toxic diffuse goiter, inorganic iodine, autoimmunity, antithyroid antibodies, cytokines

697

PRACE

ORYGINALNE /

O RIGINAL

PAPERS Endokrynologia Polska / Polish Journal of Endocrinology Tom/Volume 55; Numer/Number 6/2004 ISSN 0423-104X

Wpływ suplementacji jodem nieorganicznym na wskaźniki procesu autoimmunologicznego tarczycy u dzieci z wolem rozlanym nietoksycznym Paweł Matusik1, Ewa Małecka-Tendera1, Aleksandra Januszek-Trzciąkowska1, Joanna Janowska2, Mieczysław Szalecki3 1 2 3

Katedra i Klinika Pediatrii, Endokrynologii i Diabetologii Dziecięcej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach Katedra i Zakład Patofizjologii Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach Wojewódzki Szpital Dziecięcy w Kielcach

Streszczenie Wstęp: W populacjach które zostały poddane powszechnej profilaktyce jodowej pojawiły się doniesienia o wzroście występowania schorzeń tarczycy o podłożu autoimmunologicznym, co może przemawiać za immunogennym wpływem suplementacji jodem na tkankę gruczołu tarczowego. Celem pracy była ocena wpływu terapii preparatem jodu na poziomy markerów procesu immunologicznego u dzieci z wolem rozlanym nietoksycznym. Materiał i metody: Badaniem objęto grupę 24 dzieci (22 dziewczynki, 2 chłopców) w wieku 12,9±2,2 lat z wolem rozlanym nietoksycznym. Zarówno u pacjentów jak i ich najbliższych krewnych nie występowały choroby o podłożu autoimmunologicznym. Wszystkie dzieci były leczone prze 12 miesięcy preparatem jodu nieorganicznego (Jodid, Merck) w dawce 100 µg/d. Przed leczeniem oraz po 3, 6 i 12 miesiącach terapii oznaczono w surowicy krwi przeciwciała przeciwmikrosomalne (TPO) i przeciwtyreoglobulinowe (TgAb), interleukinę 6 (IL-6), czynnik martwicy nowotworów α (TNFα) oraz formy rozpuszczalne molekuł adhezyjnych (sICAM1 i sVCAM-1). Po 3 miesiącach terapii stwierdzono znamienny wzrost stężenia TgAb w stosunku do wartości wyjściowej, który utrzymywał się w kolejnych miesiącach badania. W 6 i 12 miesiącu terapii stwierdzono również istotny statystycznie wzrost stężenia sICAM, a w 12 miesiącu istotny wzrost stężenie TNFα w porównaniu

Wstęp Najczęstszą przyczyną wola rozlanego nietoksycznego jest niedostateczna podaż w diecie jodu nieorganicznego [1]. Pomimo wprowadzenia powszechnej profilaktyki jodowej w naszym kraju, nadmierna objętość gruczołu tarczowego jest nadal częstym powodem kierowania dzieci i młodzieży do poradni endokrynologicznych. Ze względu na brak możliwości rutynowego wykonania badania wydalania jodu z moczem, preparaty jodu są w dalszym ciągu często stosowane przez wielu lekarzy jako lek pierwszego rzutu w przypadku stwierdzenia wola rozlanego nietoksycznego. Suplementacja jodem może jednak u osób predys698

do wartości wyjściowej (p