Quelle: www.quarks.de

Enantiomerentrennung und CE

Praktikum „Arzneimittelanalytik, Drug Monitoring, Toxikologie und umweltrelevante Untersuchungen“ - Pharmazie, 8. Semester Wahlmodul „Medizinische Chemie“ - M.Sc. Chemie/Lebensmittelchemie/Wirtschaftschemie -

Enantiomerentrennung von Arzneistoffen Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.1. Geschichte der Stereochemie 1.2. Nomenklatur von Isomeren 1.3. Eigenschaften von Enantiomeren 1.4. “enantiomeric excess” 1.5. Beispiele von chiralen Arzneistoffen Trennung von Enantiomeren 2.1. Enantiomerenanalytik 2.2. Indirekte Enantiomerentrennung 2.3. Direkte Enantiomerentrennung Direkte Trennung mit der Kapillarelektrophorese (CE) 3.1. Wiederholung: Grundlagen der CE 3.2. Chirale Selektoren in der CE 3.3. Praktikumsaufgabe: Ofloxacin

Enantiomerentrennung und CE

Bilderquellen:

WS 2010/2011

http://www.wikipedia.de http://www.kapillarelektrophorese.de/

2

Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.1. Geschichte der Stereochemie 1815



1848



1874



1938



1966







J.B. Biot Rotation von linear polarisiertem Licht in α-Quarz

L. Pasteur Trennung von Weinsäureenantiomeren Van`t Hoff / Le Bel

J.B. Biot

L. Pasteur

Asymmetrisches C-Atom, Tetraedermodell

E. Fischer Konfiguration der (+)-Glucose

van‘t Hoff

R.S. Cahn, C. Ingold,V. Prelog R/S Nomenklatur

Le Bel

Gil-Aviv Gaschromatographische Trennung E. Fischer Bilderquelle: www.wikipedia.de

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.2. Nomenklatur von Isomeren (Struktur-)Isomere Stereoisomere

Enantiomere (optisch aktiv) Atropisomere

Konstitutionsisomere (optisch inaktiv)

Diastereomere

meso-Verbindungen (optisch inaktiv) Epimere (optisch aktiv) Anomere (optisch aktiv)

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.3. Eigenschaften von Isomeren ‣ Identische chemische und physikalische Eigenschaften gegenüber achiralen Medien

- Schmelzpunkt

- spektroskopische Eigenschaften

(UV, IR, Fluoreszenz, NMR)

- pKa/pKb-Werte, Redoxpotential, Nucleophilie... ‣ Unterschiedliche Eigenschaften gegenüber chiralen Medien

- linear polarisiertes Licht

(Drehwertbestimmung im Polarimeter)

- chemische Umsetzungen mit chiralen Reagenzien

- Wichtig für Arzneistoffe: Wechselwirkungen mit



Proteinen

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.4. Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess) ( E1 – E2 ) ee (%) = ----------------- x 100 ( E1 + E2 ) E1 = Konzentration des Enantiomers 1 E2 = Konzentration des Enantiomers 2

Was sagt mir eine „ee“ – Angabe? ee = 0% bedeutet: Es liegt ein Racemat (50:50) vor! ee = 100% bedeutet: Die Substanz ist enantiomerenrein! ee = 90% bedeutet: Es liegt ein 95:5 – Gemisch zweier Enantiomere vor!

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.5.1. Chirale Arzneistoffe in Organismus z.B. Rezeptor

‣ Pharmakodynamische Unterschiede (Wechselwirkungen mit Enzymen, Rezeptoren, Ionenkanälen...) ‣ Pharmakokinetische Unterschiede (Proteinbindung, Metabolisierung und Verteilung) Eutomer

‣ ca. 80 % der synthetischen chiralen Arzneistoffe sind als Racemat im Handel ‣ 98% der semisynthetischen oder natürlich vorkommenden AS sind enantiomerenrein im Handel

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z.B. Rezeptor

Distomer

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen

ahe e 100 n the

phenyl group of S-warfarin and Phe 476 is shown, as is the van der Waals contact between the bicyclic template of S-warfarin and residues Ala 103, Phe 114 and Pro 367. An arrow indicates the site of the 7-hydroxylation of S-warfarin catalysed by CYP2C9.

te of such 9 is

redox state of the iron is unknown; the starting material used for crystallization was oxidized protein, but we cannot discount partial reduction of the haem iron by X-rays during data collection21. It is also possible that some ligands that bind in the warfarin-binding pocket are unable to move closer to the haem and could behave as competitive inhibitors by occupying this binding site. With S-warfarin bound in this position, there is space for a second drug molecule to bind at the haem—molecular modelling indicates that either another molecule of S-warfarin (Fig. 4a) or a different molecule, such as fluconazole (Fig. 4b), could simultaneously bind. The discovery of this new warfarin-binding site may have implications for understanding the complex mechanisms used by the human CYP450 proteins during their function. There are many reports that the human CYP450 proteins catalyse reactions exhibit-

ctive 7 . To d the arin dues 114, More side . 2). t to ome e of dues wed ms a The with ogen oms and the iron ed in spin ded,

ding lytic been site onal y for ctive arin ccur, tion such y an 2C9, the The

1.5.1. Chirale Arzneistoffe in Organismus Pharmakokinetische Unterschiede bei der Metabolisierung von Warfarin ‣ das (S)-Eutomer unterliegt einer schnelleren Biotransformation ‣ Fluconazol bindet am selben CYP-Enzym als Inhibitor letters to nature

Warfarin

Fluconazol Quelle: Nature, Vol. 424, 24.July 2003 Figure 4 surface View of of thetheregion theofactive site The of CYP2C9 remains to Figure 3 The activeofsite CYP2C9. haem isthat shown at theavailable bottom, and the S-warfarin molecule aboveligand(s) and to the left.S-warfarin. The active The site of CYP2C9 is large molecule and couldis accommodate additional after bound S-warfarin potentially compounds than S-warfarin multiple into ligands of shown accommodate as in Fig. 3. a, either A second moleculelarger of S-warfarin has beenormodelled the active comparable size to S-warfarin without substantial conformational movement. With Enantiomerentrennung undgroup CEremains available to metabolize S-warfarin bound in this location the haem additional substrate molecules. ing atypical kinetics such as activation, auto-activation and sub-

with the site of hydroxylation closest to the haem iron. b, A known haem binder fluconazole has been modelled into the cavity in a similar conformation to that observed in the complex of CYP51 with fluconazole (Protein Data Bank code 1EA1).

WS 2010/2011 when incubating the protein with the fluorescent probe 7-methoxy-4-

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.5.2. Eigenschaften von chiralen Arzneistoffen Wirkstoff

(R)-Enantiomer

(S)-Enantiomer

Asparagin

süß

bitter

Adrenalin

30x aktiver als (S)

Chloramphenicol

(R,R) antibakteriell

(S,S) inaktiv

Thalidomid

nicht (?) teratogen

teratogen

Ethambutol

(R,R) Erblindung

(S,S) tuberkulostatisch

Dopa

passive Diffusion

aktive Diffusion

Ibuprofen Tranylcypromin

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(R) inaktiv, aber Inversion zu (S) (+) MAO-Hemmer, (-) NA-Reuptakehemmer (antidepressiv)

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen

Exkurs :

Chirale Zentren (außer vierbindiges C)

G. Subramanian (ed.): A Practical Approach to Chiral Separations by Liquid Chromatography, VCH Weinheim (1994) p2

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.5.3. Arzneistoffe mit einem chiralen Zentrum Als Racemat werden eingesetzt: Bisoprolol Cetirizin Chloroquin Cyclophosphamid

Ibuprofen Ifosfamid

Methadon

Metoprolol

Ofloxacin Omeprazol

Oxazepam

Phenprocoumon

Promethazin

Propranolol

Pyrantel



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Als reines Enantiomer werden eingesetzt: Acetylcystein (R) Adrenalin (R) Cetirizin (R) Folsäure (S) Ibuprofen (S) Levodopa (S) Levofloxacin (S) Levomethadon (R) Methotrexat (S) Omeprazol (S) Pramipexol (S)

(chiraler Phosphor) (chiraler Phosphor)



(chiraler Schwefel) Rosiglitazon Salbutamol Thiopental Verapamil Warfarin

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.5.4. Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (I) Ascorbinsäure (5R,1‘S)

Diltiazem (2S,3S)

Chloramphenicol (1R,2R)

Captopril (2S,2‘S)

Pilocarpin (3S,4R)

‣

Nomenklatur nach CIP Bestimmung der absoluten Konfiguration an vier-und sechsfach koordinierten Stereozentren

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.5.4. Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (II) Ephedrin (1R,2S)

1R,2S L-(-)-Ephedrin

1S,2R D-(+)-Ephedrin

1R,2R L-(-)-Pseudoephedrin

1S,2S D-(+)-Pseudoephedrin

threo-Reihe

erythro-Reihe

‣

Fischer-Rosanoff Konvention Arbeitskonvention, nach der (+)-Glyceraldehyd [(R)-2,3-Dihydroxypropanal] als D-Glyceraldehyd bezeichnet wird

‣

erythro, threo relativer Stereodeskriptor für Diastereomere mit chiraler, acyclischer Partialstruktur mit zwei benachbarten Stereozentren mit gleichem oder ähnlichen Substituenten

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.5.4. Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (III)

Tramadol (1S,2S + 1R,2R)

Retinol

‣

‣

cis, trans relative Beziehung zwischen zwei Liganden an separaten Atomen, die durch eine Doppelbindung oder in einem Ring benachbart sind E, Z Stereodeskriptor für stereoisomere Alkene, Cumulene und verwandte Systeme

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Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen 1.5.4. Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (IV)

N-Butylscopolaminiumbromid

stereochemische Nomenklatur in bicyclischen Systemen Deskriptoren für die relative Orientierung von Gruppen an nicht-Brückenkopfatomen ‣

‣

endo, exo Exo-ständig sind diejenigen Substituenten, die zur kürzesten Brücke stehen; endo-Substituenten sind der kürzesten Brücke abgewandt. syn, anti Gruppen, die an der kürzesten Brücke substituiert sind, stehen syn, wenn sie zur ersten Brücke stehen. Falls nicht, ist die Gruppe anti-ständig.

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Trennung von Enantiomeren 2.1.1. Anforderungen an die Enantiomerenanalytik ‣ hohe Empfindlichkeit (Nachweisgrenze 6 α-D-Glucose-Einheiten β - Cyclodextrin => 7 α-D-Glucose-Einheiten γ - Cyclodextrin => 8 α-D-Glucose-Einheiten

b a

c

CD

Durch die chirale Information in der Struktur der Zucker wird im Cyclodextrin eine chirale Umgebung erzeugt!

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α β γ

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Dimension a b c 5.7 13.7 7.8 7.8 15.3 7.8 9.5 16.9 7.8

Kavitäts volumen 174 262 427

3

Å

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Direkte Trennung mit der Kapillarelektrophorese 3.3.1. Ofloxacin Formel:

Chemische Eigenschaften:

- Zwitterion (saure Carboxylfunktion, basischer Stickstoff

am Piperazinring); IEP = 7,4

- ein Chiralitätszentrum

(Das S-(-)-Enantiomer ist je nach Keimart 8-128 mal stärker

wirksam als das R-(+)-Enantiomer) Handelsnamen:

- Tarivid®:

R,S-(±)-Ofloxacin (1984)

- Tavanic®:

S-(-)-Ofloxacin (Levofloxacin, 1998)

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Direkte Trennung mit der Kapillarelektrophorese 3.3.2. Praktikumsaufgabe Qualitative Bestimmung von Ofloxacin-Enantiomeren in Humanurin mit Hilfe der Kapillarelektrophorese Elektrophoretische Bedingungen: Laufpuffer

:

100mM H3PO4 mit Triethylamin auf pH 2,0 eingestellt Chiraler Selektor

:

45mM Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (D.S. = 0,8) Kapillare

:

fused silica; 20/27 cm





50 µm I.D. x 375 µm O.D. Spannung

:

20kV Injektion

:

hydrodynamisch; 5 sec (Urinproben) bzw.





10 sec (wässrige Standardlösung) bei 0,5 psi Detektion

:

UV-Detektion, 280 nm λmax= 280 nm

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Quellenverzeichnis Literaturhinweise Stereochemie:

- B. Testa: Grundlagen der Organischen Stereochemie

- IUPAC: http://goldbook.iupac.org/src_PAC1996682193.html Kapillarelektrophorese:

- H. Engelhardt: Kapillarelektrophorese

- F. Tagliaro, G. Manetto, F. Crivellente, F.P. Smith: „A brief introduction

to capillary electrophoresis“, Forensic Science International, 92 (1998),

75-88

- H. Wätzig: „Grundlagen der Kapillarelektrophorese“, PZ Prisma, 3 (1996),

126-136 Chirale Trennungen:

- S. Fanali, Z. Aturki, C. Desiderio: „New strategies for chiral analysis of

drugs by capillary electrophoresis“, Forensic Science International,

92 (1998), 137-155

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