Biomaterialien

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1

Knochenersatzmaterialien Scaffolds, (poröse Schäume, Gewebe, Non-woventextiles) Knochenzemente (CPC, PMMA)

Wachstumsfaktoren

Granulate (HAP, CPP, Bioglass®, Komposite etc.) Monolithe, geformt (HAP, CPP, Komposite) Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

2

Knochenersatzmaterialien Scaffold mit Zellen oder vaskularisiertes künstliches Gewebe (Tissue Engineering)

Wachstumsfaktoren

Zellen

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3

Knochen-Tissue Engineering Scaffold mit Zellen oder vaskularisiertes künstliches Gewebe (Tissue Engineering)

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4

Knochen-Tissue Engineering Tissue Engineering • Arbeit mit häufig bioresorbierbaren, mit lebenden Zellen besiedelten, gewebsartigen Implantaten • Die diskrete Grenzfläche (Interface) zwischen Implantat und Wirtsgewebe verschwindet • das fremde Material (Biomaterial) wird aufgelöst und durch körpereigenes ersetzt (Remodellierung) • Das Biomaterial soll biokompatibel, biodegradabel ohne toxische Abbauprodukte und industriell verarbeitbar sein • Das Biomaterial sollte in der Lage sein, mechanische Kräfte auf die kultivierten Zellen zu übertragen • Das Biomaterial soll (idealerweise) spezifische chemische und strukturelle Informationen enthalten, die den Gewebsaufbau steuern können, in etwa analog zur Zell-Zell-Wechselwirkung

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5

Tissue Engineering Zellen Zellen Biomat. Oberfläche

Faktoren

Scaffold Faktoren

Biomaterialien

Scaffold „Dreieck“

Biomat. Mechanik

„Rhombus“ „ Diamond“ Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

6

Scaffolds Was muss ein Material „können“? Zelladhäsion, -spreitung

Zellmigration

Zell-Zell-WW Gewebsaufbau

Zell -proliferation, -differenzierung Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

7

Scaffolds natürlich Embryonalentwicklung Gesichtsschädel (IntramembranOssifizierung)

Analogien

artifiziell Osteoblasten auf PHB-Scaffold

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Quelle Differenzierung Phänotyp Zustand

Mechanische Stimuli

Tissue Engineering Zellen

Scaffolds

Architektur Mech. Eigenschaften Biologische Signale Abbaugeschwindigkeit Chemie

Zell-Scaffold-Konstrukt

In vitro-Reifung (Bioreakator) Nährstoffe Zellproliferation und –differenzierung Aufbau extrazellulärer Matrix (EZM) Differenzierungshilfsmittel Wachstumsfaktoren (Vaskularisierung) Weitere Cytokine

Vorgefertigtes Gewebe

In vivo-Remodellierung Anpassung des Phänotyps der Zellen Umorganisation der EZM Anpassung und Wachstum des Gewebes Degradation/Resorption des Scaffolds Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Regenerative Therapie In vivo-(in situ)-Tissue Engineering (Scaffold ohne Zellen) Tissue Engineering (Scaffold mit Zellen) Zelltherapie (Zellen ohne Scaffold)

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In vivo-(in situ)-Tissue Engineering (Scaffold ohne Zellen)

Biomaterialkonzept, Gewebeinduktion (tissue induction) • Ein geeignetes „intelligentes“ Biomaterial soll in vivo Mediatoren, die für Zelladhäsion, -proliferation, -differenzierung und die notwendige biosynthetische Aktivität der Zellen wichtig (Wachtstumsfaktoren, Chemokine etc.) sind, binden (fangen) und den Zellen präsentieren (aktivieren)  Fänger- und Aktivatorstruktur, sowie die Leitstruktur für den Gewebsaufbau darstellen • Die Zellen sollen in das voluminöse Biomaterial, den Scaffold, in vivo einwachsen, reifen und nachfolgend Gewebe bilden • Gegenwärtig nur für sehr kleine Durchmesser der Scaffolds denkbar

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Scaffolds In vivo-Besiedlung und -Vaskularisierung

Immobilisierung von Chemokinen, z.B. SDF-1, die die notwendigen Zellen anlocken

In vivo-Tissue Engineering in situ-Tissue Engineering (Scaffold ohne Zellen) Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Zelltherapie (Zellen ohne Scaffold)

Zelltherapie • Isolierte Zellen haben prinzipiell die Fähigkeit, ihr HerkunftsGewebe nachzuformen (z.B. Kapillarendothelzellen – HDMEC formen Röhren, Herzmuskelzellen formen „schlagendes“ Gewebe) aber • es gibt keine interne Organisation des Gewebes • die Zellen werden durch das Fehlen einer „Schablone“ (Template), einer Leitstruktur, beim Aufbau ihres entsprechenden Gewebes behindert • Eine Vielzahl von Anwendungsfällen wird es geben, die Scaffolds als Leitstruktur erfordern, besonders im lasttragenden Bereich • obwohl die die Zelltherapie sich gegenwärtig in einer rasanten Entwicklung befindet

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Scaffold

Tissue Engineering (Scaffold mit Zellen) Zellen: Besiedlung mit den gewünschten Zellen bzw. deren Vorläufern

Nährstoffe Mechanische Stimuli Differenzierungshilfsmittel Wachstumsfaktoren Weitere Cytokine

Zell-Scaffold-Konstrukt

In-vitro-Reifung (Bioreakator) Zellproliferation und –differenzierung Aufbau extrazellulärer Matrix (EZM) (Vaskularisierung) Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Scaffolds In vitro-Besiedlung, in vivo-Vaskularisierung

Tissue Engineering (Scaffold mit Zellen)

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Scaffolds In vitro-(Prä)-Vaskularisierung

Tissue Engineering (Scaffold mit Zellen) plus Vaskularisierung durch Kokultur von z.B. hMSC und Endothelzellen, z.B. HDMEC plus Wachstumsfaktoren Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Vaskularisierung

Richard A.D. Carano and Ellen H. Filvaroff Angiogenesis and bone repair: DDT 8 (2003)

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in-vitro-(prä)-Vaskularisierung + bFGF (basic fibroblast growth factor) + VEGF (vascular endothelial growth factor

Tube-Bildung aus HDMEC-(humanen dermalen mikrohämovaskulären Endothelzellen)-Zellen im Kollagen-HAP-Scaffold (Fluoreszenzbild) Peters, Gelinsky, Hanke

Blau: Kerne/Rot: Actin-Mikrofilamente/Grün: CD31-Protein Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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in-vitro-(Prä)-Vaskularisierung

Tube-Bildung aus HDMEC-(humanen dermalen mikrohämovaskulären Endothelzellen)-Zellen im Kollagen-HAP-Scaffold (cLSM 3D Rekonstruktion) Peters, Gelinsky, Hanke

Blau: Kerne/Rot: Actin-Mikrofilamente/Grün: CD31-Protein Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Scaffolds Art und Materialien Poröse/offenporige Scaffolds (Gele, Schwämme, feste

Schäume)

Material: Keramiken (z.B. HAP), Kollagen, Kollagen/HAP, Chitosan, Chitosan/Kollagen, PHB*, PLGA**, resorbierbare Metalle (z.B. Magnesium, Eisen)

Textile Scaffolds (non-woven textiles, Gesticke, Gewebe, Gewirke, Fadengelege, Flock-Scaffolds)

Material: Fasern, Filamentgarne aus synthetischen und natürlichen Stoffen Synthetisch: Polyamid, Polycaprolactan, Polylactid, **Polylactid/glycolid (PLGA), *Polyhydroxybutyrat (PHB) Natürlich/modifiziert: Chitin, Dibutyrylchitin, Chitosan Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Poröse Scaffolds Offenporiger Scaffold (PLGA)

Offenporiger Scaffold (Kollagen/HAP), besiedelt

Gelinsky et al. MBZ

salt leached

gefriergetrocknet

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Flock-Scaffolds

Polyamidfasern (Flockscaffold) mit hMSC besiedelt Walther A, Hoyer B, Springer A, Mrozik B, Hanke T, Cherif C, Pompe W, Gelinsky M: Novel textile scaffolds generated by flock technology for tissue engineering of bone and cartilage. Materials 5 (2012) 540-557

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Textile Scaffolds Non-woven textile

microfabricated textile (PLGA)

Courtesy of Mooney, D.J., Mikos. A. G. Scien. American. Keith Kasnot 2000

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Scaffolds

Zwei- und Dreiphasenverbundwerkstoffe

Mineralisierte Gelatine als Knochenersatzmaterial

Silikat, Kollagen +/- Calciumphosphatphase

Gelatine oder CMLGelatine, HAP

Offenporiger Scaffold

Offenporiger Scaffold

Chitosanfadenscaffolds

Derivatisiertes Chitosan

Textiles Konstrukt (Gewebe, Gestick)

Chitosan

Nonwoven Netshape (NSN)

Matrices für die Remodellierung

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Leitstrukturen Thermally Induced Phase Separation

Solvent Casting and Particle Leaching

Solid Freeform Fabrication

Rezwan et al.: Biomaterials 27 (2006) 3413–3431

Microsphere Sintering

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Leitstrukturen J R Jones: Acta Biomaterialia 9 (2013) 4457–4486

Spongiosa = trabekulärer Knochen Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Leitstrukturen

Rezwan et al.: Biomaterials 27 (2006) 3413–3431 Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Was soll erreicht werden?

Roschger et al.: Bone 42 (2008) 456– 466

Kriterium: Bone Mineral Density Distribution

qBEI – quantitative Backscattered Electron Imaging Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Was soll erreicht werden?

Kriterium: Bone Mineral Density Distribution

A: Zoeliakie; B,C: versch. Formen von Osteoporose; D,F Osteoporose nach versch. medikamentösen Therapien; E: Osteogenesis Imperfecta

Roschger et al.: Bone 42 (2008) 456– 466 Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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Was soll erreicht werden?

Kriterium: Bone Mineral Density Distribution qBEI – quantitative Backscattered Electron Imaging, Ca-conc. by qBEI, E-mod by nano-Indenting

Roschger et al.: Bone 42 (2008) 456– 466 Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

30

Zellen: Kultur und Analytik

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Wirkmöglichkeiten der KEM auf Zellen und Gewebe

Freisetzung von Materialkomponenten

Wirkstofffreisetzung Mögliches Target

Morphologie, Gefüge und Struktur des Materials

Festigkeiten Fähigkeit zur Mechanotransduktion

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Biomaterial - Was wird analysiert? •einphasige Materialien

in vitro-Zellkultur

(Mono- oder Cokulturen)

•Natur (Biologie) •Bioinspiriert •Chemie •Polymere •Keramik •Metallurgie

•Komposite

Material Zellen

Material EZM Zellen

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33

Biomaterial - Was wird analysiert? in vivo Biomaterial in der Defektzone

nach Implantation

Bildung der EZM

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34

Biomaterial - Was wird analysiert? •einphasige Materialien • mechanische Eigenschaften, Festigkeiten, • Quellverhalten, Maßhaltigkeit • Porosität • Gefüge (Lichtmikroskopie, REM, TEM, AFM) • Azelluläres Degradationsverhalten in speziellen Lösungen (Phosphate Buffer Solution,

Simulated Body Fluid u.a.)

•Azelluläre Mineralisation (sog. Bioaktivität) • Oberflächeneigenschaften (Rauhigkeiten, •Komposite

Morphologie, spezielle Muster)

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Biomaterial-Zell-WW - Was wird analysiert? in vitro-Zellkultur

(Mono- oder Cokulturen) • Auf- bzw. Einwachsverhalten der Zellen (Zell-Morphologie und Migration)

• Degradation und Mineralisation in Gegenwart von Zellen • Wirkstofffreisetzung • Materialbedingte Veränderungen des Mediums (z.B. Ansäuerung)

• Mechanische Eigenschaften unter Zellkulturbedingungen •„Biomechanik“ •Fähigkeit zur Mechanotransduktion

• Biokompatibilität bzw. Cytotoxizität des Materials (Proliferation,

Differenzierung, Nekrose, Apoptose, Immunreaktion)

• Zell-Zell-Wechselwirkungen auf dem Material (Gap-Junctions, Signalproteine)

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Biomaterial-Zell-WW - Was wird analysiert?

A. Friedmann et al. / Acta Biomaterialia 7 (2011) 2499–2507

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37

Biomaterial-Zell-WW - Was wird analysiert?

A. Friedmann et al. / Acta Biomaterialia 7 (2011) 2499–2507

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Biomaterial-Zell-WW - Was wird analysiert? in vivo Biomaterial in der Defektzone Osteoblasten

Resorption des Biomaterials

Grafik: Hanke

Osteoklasten

BMU: basic multicellular unit Knochenneubildung Kikuchi et al. Composites Sci. Technol. 64 (2004) 819–825

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Biomaterial-Zell-WW - Was wird analysiert? Vaskularisiertes Gewebe

Biomaterial

Neuer trabekulärer Knochen

Interaktion Biomaterial und neuer Knochen Q. Fu et al, Tissue Engineering Part A 17 (2011) 3077-3084

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Biomaterial - Was wird analysiert?

Assessment of angiogenesis in osseointegration of a silica–collagen biomaterial using 3D-nano-CT V Alt, …, S Heinemann, T Hanke, R Schnettler, AC Langheinrich: Acta Biomaterialia 7 (2011) 3773–3779

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„Aus der Sicht der Zelle“ - Was wird analysiert? Zellebene Proliferation Differenzierung Morphologie Migration (Mikroskopie)

z.B. ALP = Alkalische Phosphatase

Protein-Ebene Proteomik – Untersuchung der globalen Proteinexpression

DNA/RNA-Ebene Genomik – Untersuchung der globalen Genexpression (DNA-Arrays) Gezielte Analyse bestimmter transscribierter Genabschnitte (PCR - Polymerasechain reaction)

Gezielte Bestimmung spezifischer Proteine, wie Signalproteine, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Enzyme (ELIZA, Enzymaktivitätsbestimmungen) Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

42

„Aus der Sicht der Zelle“ - Was wird analysiert? Zellebene Proliferation Differenzierung Morphologie Migration (Mikroskopie)

z.B. LDH = Lactatdehydrogenase

Protein-Ebene Proteomik – Untersuchung der globalen Proteinexpression

DNA/RNA-Ebene Genomik – Untersuchung der globalen Genexpression (DNA-Arrays) Gezielte Analyse bestimmter transscribierter Genabschnitte (PCR - Polymerasechain reaction)

Gezielte Bestimmung spezifischer Proteine, wie Signalproteine, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Enzyme (ELIZA, Enzymaktivitätsbestimmungen) Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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„Aus der Sicht der Zelle“ - Was wird analysiert? in vitro-Zellkultur

Rückschluss auf

in vivo-Verhältnisse

?

Co-Kultur

(simples) Modell der

von Ob/OC

BMU: Basic Multicellular Unit

cross talk

Ein kleiner Schritt hin zu den Verhältnissen im lebenden Organismus Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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„Aus der Sicht der Zelle“ - Was wird analysiert? Humane Osteoklasten/Osteoblasten-Cokultur

Tag 0

Tag 12

Tag 312

Tag 13/Tag 0

Tag 14/Tag 1 Tag 41/Tag 28

Aussiedlung der hMSC 1,25x106

Ohne osteogene Zusätze

Mit osteogenen Zusätzen*

Aussiedlung der humanen Monozyten 4x105

Ohne osteogene oder osteoklastogene Zusätze**

* 10nM dexamethasone, 50 µM ascorbate, 10 µM ß-glycerophosphate, 10 nM Vitamin D3 ** keine Zugabe von MCSF und RANK-L

Heinemann C, Heinemann S, Worch H, Hanke T: European Cells and Materials 21 (2011) 80-93

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„Aus der Sicht der Zelle“ - Was wird analysiert? Humane Osteoklasten/Osteoblasten-Cokultur Triphasisch: Silikat(65)Kollagen(30)-HAP(5)

Triphasisch: Silikat(50)Kollagen(30)-HAP(20)

[Ca2+]e = 7,1 mg/dl

[Ca2+]e = 2,5 mg/dl

[Ca2+]e ~0 mg/dl

actin nuclei CD68

Biphasisch: Silikat(70)Kollagen(30)

Enzym: DNA, LDH, ALP, TRAP 5b; ELIZA: Bone-TRAP® PCR: ALP, BSP II, RANKL, IL-6, VTNR(αν), VTNR(β3), CTSK, TRAP, OSCAR, CALCR; GADPH Vorlesung Biomaterialien Folie Nr.

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