BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 7: REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

1. INTRODUCCIÓN La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica in Vitro que imita la habilidad natural de la célula para duplicar el ADN, generando múltiples copias de una secuencia específica de nucleótidos o amplificando selectiva y exponencialmente el ADN de un organismo. Por lo tanto, es un procedimiento muy sensible que en teoría, permite detectar específicamente una sola molécula del ADN en solución, lo que ha generado el desarrollo de muchos métodos de diagnóstico basados en este principio. Una de las ventajas que plantea esta técnica es la adaptación del método general para determinar la presencia de una secuencia específica en cualquier agente patógeno, incluyendo bacterias, protozoarios, virus y helmintos, ya que, todos los organismos invasores poseen ADN o ARN, como material genético. De esta manera, puede proveer resultados en el mismo día para organismos en los que normalmente se tomarían varias semanas utilizando tecnologías convencionales. El diseño continuo de protocolos que incluyen diferentes secuencias iniciadoras, cebadores o primers, y múltiples variaciones en la concentración de cada uno de los componentes de la PCR según la secuencia de nucleótidos que se desee amplifica, se debe a que el ADN o ARN usado como blanco cambia entre especies, y por ende los sistemas de medición son modificados y adaptados a nuevas tecnologías que mejoren la sensibilidad, especificidad y rapidez en la determinación. Es así como, en la actualidad ya están disponibles kit de diagnóstico de PCR en tiempo real.

2. OBJETIVOS • • • •

Comprender las fases de desnaturalización, hibridización y elongación o extensión que comprende la PCR. Analizar cada uno de los componentes necesarios para la realización de una amplificación de ADN. Realizar la amplificación de un fragmento de ADN. Discutir algunas aplicaciones de la amplificación de los fragmentos de ADN por PCR.

3. MARCO TEORICO FUNDAMENTO La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica de Biología Molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. A través de ciclos; donde en cada uno se duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento y en unas pocas horas. Esta metodología fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en una de las primeras compañías dedicadas a la comercialización de la Ingeniería Genética la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta técnica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado. En 1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este trabajo. Dentro de las principales aplicaciones de la PCR se encuentran: Estudios Arqueológicos, Medicina Forense, Genética, Pruebas de paternidad, Investigaciones Biomédicas, Ambientales, Industriales y Diagnóstico Clínico. En este último, los Laboratoristas Clínicos, pueden tomar una muestra mínima de material genético, copiar la secuencia de interés las veces necesarias y generar suficiente cantidad de muestra para detectar la presencia o ausencia de patógenos y en muchos casos realizar la cuantificación del mismo. PROCESO METODOLOGICO Cada ciclo de PCR consta de tres fases: 1. Desnaturalización: En esta el ADN blanco de doble cadena se somete a una temperatura de 90º a 95 ºC durante 30 segundos; permitiendo la separación de las dos cadenas. 2. Hibridización: En esta la temperatura de la mezcla se disminuye hasta alcanzar la temperatura adecuada para favorecer el apareamiento de los primers con la secuencia blanco, lo cual generalmente ocurre entre 45 a 55 ºC (dependiendo de la temperatura de Fusión o Tm de los primers) durante 20 a 30 segundos 3. Elongación o extensión: En este la temperatura de la mezcla se eleva hasta 72 °C para que la Taq polimerasa (DNA polimerasa) comience el proceso de extensión en dirección 5’ a 3’ agregando los nucleótidos correspondientes, obteniéndose la hebra complementaria de DNA o AMPLICÓN. En cada ciclo de PCR se duplica todo el ADN presente en la reacción, de manera que en unas pocas horas se obtienen millones de copias de un solo fragmento. Estas tres fases tienen lugar en el mismo tubo y constituyen un ciclo completo de PCR, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores suelen

renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN. Consideraciones: •

Al final del primer ciclo de la PCR, hay dos dobles hebras de ADN idénticas a la original, cada nueva hebra producida se denomina AMPLICÓN.

•

Este ciclo de tres pasos (desnaturalización, alineamiento y extensión) puede ahora repetirse muchas veces. Conforme la PCR continúa, se crean primero dos, cuatro, ocho,…….2n copias (n= número de ciclos), obteniéndose después de 30 ciclos 1.073.741.824 copias. Este proceso de la PCR también es llamado AMPLIFICACIÓN debido a que la secuencia objetivo es copiada una y otra vez con el objeto de hacer millones de copias. Ahora ya hay suficiente material genético para detectar la presencia y la cantidad del patógeno.

•

La temperatura de fusión o Tm a la cual se realiza el paso de hibridización, representa la temperatura a la cuál 50% de un oligonucleótido con una secuencia específica se encuentra unido y la otra mitad se encuentra desnaturalizado.

ZONAS DE TRABAJO PARA PCR (Espacio de laboratorio asignado) AREA A

AREA B

TRABAJO PRE – PCR

TRABAJO POST – PCR

Pesada de químicos Preparación del Buffer Extracción del ADN Preparación de stock para PCR.

soluciones

Preparación de reacciones PCR (mezcla). Amplificación (Termociclador).

Electroforesis de productos PCR Procesamiento productos PCR

de

Secuenciación y análisis de restricción de reacciones PCR Cargamento de productos amplificados para segundo periodo de amplificación.

4. PRELABORATORIO La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica para la síntesis in vitro de secuencias específicas de ADN, con la cual se amplifica el ADN problema. La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la ADN polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5' → 3' usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región de doble cadena se usan los denominados iniciadores (primer). Estos son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3' del fragmento de ADN que se desea amplificar. La reacción de PCR se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: -

Desnaturalización del ADN del doble cadena

-

Hibridización de los iniciadores a la zona 3' específica de cada una de las hebras.

-

Extensión del cebador 3' por medio de la ADN polimerasa.

Teniendo en cuenta las tres etapas de las PCR. 1. ¿Cuáles son las características más predominantes de la Taq polimerasa? 2. Nombre algunas de las modificaciones de la PCR y sus aplicaciones. 3. Mencione brevemente la función de los componentes más usuales de una PCR (DNA polimerasa; iniciadores, cebadores o primers; dNTPs o desoxirribonucleótidos trifosforilados; Buffer y Cloruro de magnesio). 4. ¿Cómo se diseña un cebador y cuáles son los parámetros a tener en cuenta? 5. Si la técnica de PCR es exponencial, en cada ciclo se obtiene el doble de producto, calcule cuantos millones de copias obtendría después de 34 ciclos en la PCR. 5. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS Materiales Guantes estériles Pipetas automáticas Puntas estériles Tubos de PCR estériles Gradilla para tubos de PCR. Reactivos Mezcla maestra con: •

dNTPs : Adenina, Guanina, Citosina y Timina

•

Cloruro de Magnesio (MgCl2)

•

DNA polimerasa (Taq polimerasa)

•

Buffer 1X

•

Agua destilada, des ionizada y estéril o milliQ

•

Primers o cebadores DISPONIBLES (para ADNr 16s o específicos del microorganismo a amplificar).

•

ADN extraído listo para amplificar.

•

Cepa de microorganismo en estudio en cultivo sólido (agar LB)

Equipos • • • • • • • •

Centrífuga, micro centrífuga Termociclador Potenciómetro Balanza analítica Transiluminador de U.V. Cámaras de flujo laminar, cámaras de extracción Congeladores Desionizador

PRIMERA SESION •

Se realizara la Fundamentación de la técnica, diseño de primers, cuidados para prevenir contaminación, usos de controles positivos y negativos

•

los cálculos para realizar la mezcla maestra y las soluciones stock d primers montaje en general

•

Descripción de tipos de controles que se deben incluir

•

Manejo de termociclador

SEGUNDA SESION Realizar el protocolo estandarizado en el laboratorio de Biotecnología, que se describe a continuación 6. PROCEDIMIENTO El procedimiento que a continuación se describe es utilizado para la detección del gen de resistencia a amino glucósidos aac(6´)aph(2´) en cepas de Staphylococcus epidermidis y/o se llevara a cabo la confirmación de género y especie mediante amplificación multiplex. De acuerdo al protocolo estandarizado por el laboratorio de Biotecnología, Grupo de Investigación REMA.

NOTA: Si previamente se realizó la extracción del ADN empezar en el numeral 5.2. O a partir de una caja de cultivo de una cepa de S epidermidis o microorganismo en estudio, realizar el procedimiento de extracción en crudo de ADN (Método de ebullición o Boilling) 6.1 Extracción del ADN por el método de Boiling, de acuerdo a protocolo del laboratorio de Biotecnología, Grupo de Investigación REMA. 1. Se toman 50 µl de agua grado 1(milli Q). 2. Se adicionan de 2 a 3 colonias (UFC) y se calienta en el termociclador a 98º C durante 10 minutos. 3. Se centrifuga a 14000rpm por 10 minutos y se toma el sobrenadante el cual se puede utilizar directamente para la PCR o almacenarlo a -2º C hasta su uso 4. De este sobrenadante se toman 2 µl y se adicionan a la mezcla de PCR (master mix). 6.2 Realizar la mezcla maestra de PCR (master mix), como se describe a continuación, encontrar el volumen para que la concentración final quede como se indica, adicionando los Primers específicos y el ADN en estudio. ELEMENTO

CONCENTRACION stock

Agua d o milliQ Buffer dNTPs MgCl2 Primer F Primer R DNA

---

--

5X 10mM 25mM 10uM 10uM 10-25 ng/ µl

1x 200um 3mM 0.6 µM 0.6 µM 25ng

Taq polimerasa VOLUMEN FINAL

VOLUMEN Para 1 Rx

VOLUMEN Con controles positivo y negativo 3 Rx

3 µl si es boilling ó 2 µl si es purificado

5 U/ µl ----

CONCENTRACION FINAL

2.5 U 50 µl

--

6.3. Realizar la PCR de acuerdo a las condiciones descritas en la tabla:

Condiciones de la PCR Realizar 1 ciclo inicial así: 95 grados durante 3 minutos Gen aac(6´)aph(2´) de Resistencia a aminoglucosi dos

Desnaturaliz ación

Hibridación

Extensión

No.de Ciclos

Ciclo final

95º C por 30 55º C por 30 seg. seg

72º C por 30seg.

34

72 º C por 7 min.

6.4 Visualizar el resultado en gel de agarosa de acuerdo al tamaño del producto amplificado en la siguiente clase Tabla 1. Secuencias de primers para la amplificación de genes específicos de una bacteria y de un gen de resistencia. Gen

Secuencia

Producto amplificado

Staphylococcus epidermidis

5´ATCAAAAAGTTGGCGAAACTTTTCA-3´ (normal)

125pb

5´CAAAAGAGCGTGGAGAAAAGTATCA3´( reverso) 16SrRNA

5´GGAGGAAGGTGGGGATGACG-3´

241pb

5´ATGGTGTGACGGGCGGTGTG-3´ aac(6´)aph(2´)

5´TTGGGAAGATGAAGTTTTAGA-3´

174pb

5´CCTTTACTCCAATAATTTGGCT3¨

7. POST-LABORATORIO 1. ¿Qué tipos de ADN polimerasas se pueden emplear para PCR y que utilidad tienen? 2. ¿Qué condiciones deben tener los Primers utilizados para la PCR? 3. El buffer empleado para PCR ¿qué características tiene? 4. ¿El cloruro de magnesio que utilidad tiene? 5. ¿Cómo se sabe la Tm de un primer? 6. Prepare una aplicación de la PCR para exponer en clase 7. En que consiste el método “boiling” para obtención simple de ADN

8. BIBLIOGRAFIA -Revista Nature Protocolos Años 2009-2013 -Articulo Bodas de Plata de la PCR Revista Nova UCMC. 2008. Gladys Pinilla -PCR protocols second edition Jhon M.S. BARLETT DAVID STIRLIN HUMANA PRESS TOOWA NEW YERSEY. VOL 226 2003 -RAPID CICLE REAL TIME PCR METHODS AND APPLICATION MICROBIOLOGY AND FOOD ANALISIS. SPRINGER U. REISTHL C.WITTWER F. TOTKERILL 2002. -Masa Oliva Jaime. Diagnòstico Molecular en Medicina. Manual moderno. 2004 -Arturo Panduro. Biologia Molecular en la Clinica. McGraw-Hill Interamericana 2000 -Lizcano Fundamentos moleculares en medicina 2005-09-09 Jimenez Genetica. Biologia celular y molecular 2005 9. AUTOEVALUACION NUMERO DE LA PRACTICA

LOGRO (Objetivos cumplidos) SI NO

FORTALEZAS

DEBILIDADES

SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD