BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 5: ENZIMAS DE RESTRICCION

1. INTRODUCION Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).

2. OBJETIVOS • • • 3.

Identificar la función y clases de enzimas de restricción existentes Adquirir destreza en la realización de hidrólisis de ADN por enzimas de restricción Adquirir la habilidad para realizar e interpretar mapas de restricción

MARCO TEORICO

Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia entre 4-8 pb en ADNs. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la enzima rompe un enlace fosfodiéster en la hebra de arriba y otro enlace fosfodiéster en la hebra complementaria. Estas enzimas se encuentran en muchas especies de bacterias, donde funcionan in vivo como parte de un sistema de restricción y modificación (sistema R/M). Este sistema es análogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su propio ADN y el ADN exógeno, siendo este último degradado por la enzima de restricción. El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas). Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. Las enzimas de restricción no

pueden cortar ADN metilado, de este modo solo afectan el ADN extranjero y no el ADN bacteriano. Existen tres tipos de enzimas de restricción. Las enzimas de restricción de tipo II cortan en una posición específica del ADN dentro de su secuencia de reconocimiento, denominada sitio de restricción.

Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej: Eco RI

E Co R I

= género Escherichia = especie coli = cepa RV 13 = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes: 1. Cohesivos o pegajosos: Cortes escalonados, dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco RI

GAATTC CTTAAG EcoRI

GGATCC CCTAGG

AAGCTT AACGAA

BamHI

HindIII

2. Abruptos: Cortes simétricos, dejando productos con extremos ciegos Ej: Alu I AATATT TTATAA SspI

CCCGGG GGGCCC SmaI

Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos ciegos y con extremos escalonados), en ingeniería genética se prefieren aquellos con extremos complementarios, puesto que permiten la unión espontánea del gen a clonar con el vector. Si las moléculas a utilizar presentan extremos ciegos, hay que conferirles extremos cohesivos, por ejemplo utilizando la enzima transferasa terminal. Importante: Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita para cortar 1µg de ADN en 1 hora. El buffer siempre debe añadirse como un 10% de la reacción total de digestión.

Mapa de restricción Un patrón de ADN generado mediante electroforesis que se produce después de cortar con una enzima de restricción. La representación de una molécula de ADN, ya sea circular o lineal, donde se indiquen los sitios de restricción que poseen, se denomina mapa de restricción.

Mapa de restricción del plásmido YIP5 de 5.541 pb. Los números indicados después de cada enzima de restricción indican las posiciones de los sitios de corte.

Tamaño de los fragmentos de restricción: Si los sitios de restricción fueran distribuidos al azar en la longitud de una molécula de ADN, una enzima que reconociera una secuencia de 4 nucleótidos, cortaría 1/256 nucleótidos, mientras que una enzima que reconociera 6 nucleótidos cortaría en promedio 1/4.096 nucleótidos. La digestión por EcoRI (secuencia de reconocimiento de 6 nucleótidos) de una molécula de ADN bacteriano de 4 millones de pares de bases producirá aproximadamente 103 fragmentos diferentes, mientras que la digestión total de ADN de un mamífero va a producir alrededor de 106 fragmentos. Es por esto que la frecuencia de aparición de un sitio depende de su secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, la enzima NotI que reconoce un sitio de 8 nucleótidos 5'GCØGGCCGC-3' no corta en más de 3 el ADN de mamíferos y produce fragmentos de talla media de 1 a 1,5 millones de pares de bases. Esta enzima se utiliza en los trabajos de cartografía física del ADN

4. PRELABORATORIO 1. Enumere los factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden afectar la actividad de las mismas. 2. Describa las características de las endonucleasas tipo I y III y de ejemplos. 3. ¿Cuantas endonucleasas tipo II se han encontrado hasta el momento? Nombre por lo menos 10. 4. Defina Isoschizómeros y de ejemplos. 5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS • Enzima de restricción (según disponibilidad) • Buffer respectivo para la enzima de restricción señalada • Tubos Eppendorf de 1.5mL estériles • Baño serológico a 37°C • Micro pipetas • Cubeta de hielo • Micro centrífuga (centrífuga para Eppendorf) 6. PROCEDIMIENTO - Partir de un muestras de ADN bicatenario con concentración de 0,1 µg/µL y longitud de 10.000 pb.

- Colocar 10 µl de ADN en los tubos de Micro centrífuga, 7 µl de agua, 1 µl de enzima de restricción a utilizar (de 5 Unidades /ul )y 2 µl de la solución tampón 10X para la enzima de restricción. - Mezclar y centrifugar. - Colocar a incubar en baño serológico (37°C) por 1 hora - Correr los productos en gel de azarosa teñido con bromuro de etidio y visualizar en transiluminador UV

EJEMPLIFICACION DEL PROCEDIMIENTO UTILIZANDO LA ENZIMA DE RESTRICCION EcoRI

Visualización de los productos de hidrólisis: Servir los hidrolizados en un pozo del gel de electroforesis. En uno de los pozos adyacentes, depositar una muestra de ADN no hidrolizado y en otros dos, una mezcla de moléculas de ADN de tamaño conocido (marcadores), que servirán para calcular las tallas de los fragmentos obtenidos.

Gracias a un transiluminador UV, las moléculas de ADN pueden visualizarse. El marcador de peso molecular permite analizar que la Eco RI ha cortado la molécula original de 10.000 pb en dos fragmentos, de 7.500 y 2.500 pb respectivamente.

7. POST-LABORATORIO 1. Mencione 3 diferencias en actividad de las endonucleasas en procariontes y eucariontes. 2. Las enzimas de restricción de tipo II reconocen secuencias de ADN específicas y cortan fuera de esas secuencias. Cierto o Falso (justifique). 3. Estas enzimas se pueden acoplar a cebadores o primers para obtener secuencias de corte dentro de amplicones obtenidos por PCR? ¿Qué utilidad tienen? 4. Mencione un ejemplo de una enzima que genere terminales cohesivos y una que genere terminales abruptos. 8. BIBLIOGRAFÍA -Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad, Biologend, Bioline, Roche, etc. -Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, -David, L.G. Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basic methods in molecular biology. Elsiever Science publishing Co. Ind. NY. 1986. -Catálogos de PROMEGA casa comercial PROMEGA. 9. AUTOEVALUACION

NUMERO DE LA PRACTICA

LOGRO (Objetivos cumplidos) SI NO

FORTALEZAS

DEBILIDADES

SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD