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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93310277.4 kFecha de presentaci´on : 20.12.93 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 604 143 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 29.06.94

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54 T´ıtulo: Elementos sangu´ıneos formados, provistos de rapamicina para inducir la inmunosupresi´ on.

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73 Titular/es:

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72 Inventor/es: Armstrong, Jay Joseph y

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74 Agente: Curell Su˜ nol, Marcelino

30 Prioridad: 22.12.92 US 998065

American Home Products Corporation Five Giralda Farms Madison, New Jersey 07940-0874, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.06.98

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

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01.06.98

Aviso:

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Sehgal, Surendra Nath

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION La presente invenci´on se refiere a una nueva composici´ on que contiene rapamicina y a una t´ecnica innovadora para administrar rapamicina por v´ıa intravenosa o intraarterial, en la que elementos sangu´ıneos formados (eritrocitos) de mam´ıferos se cargan con rapamicina extracorp´ oreamente incub´ andolos con una soluci´ on de rapamicina y los elementos sangu´ıneos formados cargados con rapamicina se administran a continuaci´on al sistema circulatorio de un mam´ıfero para la supresi´on de respuestas inmunes o para el tratamiento de enfermedades que responden al tratamiento con rapamicina. Se ha demostrado que la rapamicina tiene propiedades inmunosupresoras y antiproliferativas, que son u ´ tiles en la inhibici´ on del rechazo de trasplantes y/o injertos, en el tratamiento de ciertos c´anceres o tumores, en el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como el lupus eritematoso sist´emico y la enfermedad inflamatoria respiratoria y en el tratamiento de la proliferaci´ on de c´elulas de m´ usculos lisos y del engrosamiento ´ıntimo despu´es de una lesi´on vascular [Morris, R.J. Heart Lung Transplant 11 (pto. 2) 197 (1992)]. El tratamiento extracorp´oreo de la sangre implica el tratamiento de sangre entera o de componentes de la misma a fin de eliminar o a˜ nadir un componente o modificar un componente sangu´ıneo y devolver la sangre tratada al mam´ıfero para obtener el efecto deseado. La anemia de c´elulas falciformados puede tratarse mediante un tratamiento extracorp´ oreo de la sangre con ´acido etacr´ınico, cianato o mostaza nitrogenada. Pueden reducirse los niveles de colesterol mediante un tratamiento extracorp´ oreo de la sangre con perlas de heparina-agarosa, a las cuales se unen selectivamente las lipoprote´ınas plasm´aticas de baja densidad. Se han utilizado extracorp´ oreamente perlas de agarosa reticulada que contienen tierra de diatomeas o polvos de ´oxido de zinc en la desintoxicaci´on de la sangre para eliminar el Paraquat o fosfatos inorg´anicos. Se han minimizado los efectos t´oxicos del cisplatino utilizado en el tratamiento del glioma maligno humano infundiendo cisplatino dentro de la arteria car´ otida interna y eliminando extracorp´oreamente la mayor parte del cisplatino a partir del flujo venoso yugular mediante di´ alisis, con lo cual se minimiza la cantidad de cisplatino que entra en el cuerpo a un nivel por debajo del cuello. Entre otros tratamientos sangu´ıneos extracorp´ oreos se incluyen la eliminaci´on de c´elulas T, la fotoforesis en la que la sangre se expone a luz ultravioleta, la eliminaci´ on de anticuerpos y complejos inmunes en el tratamiento de alergias, trastornos inmunol´ ogicos y el lupus eritematoso sist´emico y el tratamiento de la sangre con resinas intercambiadoras de iones para mejorar la uni´ on a prote´ınas s´ericas de f´armacos ´acidos en pacientes que presentan uremia. Se ha demostrado que el macr´ olido inmunosupresor FK-506 es absorbido y retenido por c´elulas mononucleares sangu´ıneas perif´ericas y por eritrocitos y que se une reversiblemente a una prote´ına (FKBP) ligante de FK-506 en los eritrocitos. El FK-506 inhibe la activaci´on de linfocitos T y est´ a 2

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disponible para los linfocitos mediante disociaci´on a partir de la FKBP. La daunomicina, un f´ armaco antileuc´emico, no se unir´ a a c´elulas sangu´ıneas rojas. Si las c´elulas sangu´ıneas rojas se tratan en primer lugar con Anfotericina B, un macr´ olido poli´enico que se une a esteroles y perfora las membranas celulares, entonces las c´elulas sangu´ıneas rojas tratadas se unir´ an a la daunomicina. Ratones portadores de c´elulas leuc´emicas L1210 presentaron un tiempo prolongado de supervivencia cuando se trataron con eritrocitos con daunomicina ocluida. Otros macr´ olidos poli´enicos, tales como vacidina A y compuestos relacionados, se unen a c´elulas sangu´ıneas rojas y hacen que tenga lugar la hem´olisis. El antibi´ otico macr´ olido poli´enico, la faeriefungina, presenta una toxicidad para los eritrocitos similar a la Anfotericina B. Se ha hallado que la rapamicina, un macr´ olido tri´enico, se une reversiblemente a la prote´ına ligante FKBP en elementos sangu´ıneos formados (eritrocitos) pero no ocasiona la hem´ olisis tal como los macr´olidos poli´enicos anteriormente mencionados. Las revistas J. Am. Chem. Soc. vol. 113 (4), p´ ags. 1409-1411, 1991 y Mol. Biol. Cell, vol 3 (9) p´ ags. 981-987, sept. 1992, dan a conocer la uni´ on de rapamicina (y FK506) a linfocitos T a trav´es de la prote´ına ligante (inmunofilina) FKBP e investigan el mecanismo de la interacci´on con FKBP. En la sangre humana, los eritrocitos constituyen aproximadamente del 85 al 90 por ciento de los elementos sangu´ıneos formados (microsc´opicamente visibles). La sangre entera humana est´ a compuesta de aproximadamente el 46 % de elementos sangu´ıneos formados y el 54 % de plasma. El equilibrio de la rapamicina entre los elementos sangu´ıneos formados (FBE) cargados con rapamicina y el plasma, se establece r´ apidamente y se observa que depende de las especies. En una sangre de rata que contiene rapamicina en una concentraci´on de 38 ng/ml, las relaciones de sangre entera y FBE a plasma fueron de 1,3 y 1,7 respectivamente y con una concentraci´ on de 200 ng/ml las relaciones fueron de 0,8 y 0,5, respectivamente. En sangre humana con concentraciones de rapamicina comprendidas entre 76 y 189 ng/ml, la relaci´on de sangre entera y FBE a plasma al cabo de 30 minutos de incubaci´ on a una temperatura de 37◦ C fueron de 12 ± 2 y 23,7 ± 3,9, respectivamente. De manera similar, con concentraciones de 482 ng/ml, las relaciones fueron de 1,1 y 1,3, respectivamente. Las relaciones de concentraciones de sangre entera a plasma en monos que recibieron rapamicina fueron de 10 ± 6 y en seres humanos la relaci´on fue de 12 ± 2 y es una indicaci´on de que existe una diferencia seg´ un las especies entre primates y otros mam´ıferos. La presente invenci´on se refiere, por consiguiente, al tratamiento de enfermedades, s´ındromes y respuestas inmunol´ ogicas desfavorables que responden al tratamiento con rapamicina, en el que la rapamicina se suministra mediante elementos sangu´ıneos formados cargados con rapamicina, siendo dichos FBE cargados con rapamicina preparados extracorp´ oreamente. En un aspecto adicional, la invenci´ on propor-

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ciona una composici´ on farmac´eutica para una administraci´ on intravenosa o intraarterial de rapamicina, que comprende elementos sangu´ıneos normales cargados con rapamicina suspendidos en plasma sangu´ıneo o un sustituto fisiol´ ogico del mismo. Las siguientes patentes de los EE.UU. y art´ıculos de revistas describen las propiedades inmunosupresoras, antiinflamatorias, antitumorales y antif´ ungicas de la rapamicina.: US-A-5.100.899, que da a conocer la inhibici´on del rechazo a trasplantes; US-A-3.993.749 que da a conocer propiedades antif´ ungicas, US-A-4.885.171 que da a conocer una actividad antitumoral contra la leucemia linf´atica, c´anceres de colon y de mama, melanocarcinoma y ependimoblastoma; US-A4.401.653 que da a conocer el uso de rapamicina en combinaci´on con picibanil en el tratamiento de tumores; US-A-5.078.999 que da a conocer un m´etodo para tratar el lupus eritematoso sist´emico; US-A-5.080.899 que da a conocer un m´etodo para tratar la inflamaci´ on pulmonar y es por lo tanto u ´til en el alivio sintom´ atico de enfermedades en las que la inflamaci´on pulmonar es un componente, es decir, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cr´ onica, enfisema, bronquitis o s´ındrome de insuficiencia respiratoria aguda; Dumont et al., en FASEB Journal 3 (4), 5256 (1989) que dan a conocer que la rapamicina potencia la actividad supresora de la Ciclosporina A en la proliferaci´ on de c´elulas T, la producci´ on de IL-2 y la expresi´on de IL-2R en c´elulas T de rat´ on estimuladas con ionomicina + PMA; Martel et al., en Can. J. Physiol. Pharmacol. 55, 48 (1997) que dan a conocer que la rapamicina inhibe la respuesta inmune en ratas en tres modelos experimentales - encefalomiolitis al´ergica experimental, un modelo para la esclerosis m´ ultiple, coadyuvante para la artritis, un modelo para la artritis reumatoide y evita anticuerpos humorales (semejantes a IgE) en respuesta a una exposici´on al´ergica a alb´ umina; He et al., en Transplantation Proceedings 24 (3), 1178 (1992) que dan a conocer el tratamiento de donantes con rapamicina por v´ıa intravenosa para reducir el rechazo de injertos en ratas; y R. Morris, en J. Heart Lung Transplant 11 (pto. 2): 197 (1992) en el que el tratamiento con rapamicina inhibe la restenosis (proliferaci´on de c´elulas de m´ usculos lisos y el engrosamiento interno despu´es de una lesi´on vascular) que puede presentarse despu´es de una angioplastia coronaria. La rapamicina es tambi´en u ´ til en el tratamiento de enfermedades inmunoinflamatorias tales como la psoriasis. Una forma de realizaci´ on de la t´ecnica innovadora de la invenci´ on consiste en extraer sangre de un mam´ıfero que se ha de tratar con rapamicina, separar los FBE del plasma por m´etodos de centrifugaci´on o filtraci´ on, cargar los FBE con rapamicina mediante incubaci´ on y combinar los FBE cargados ion rapamicina con el plasma o un sustituto fisiol´ ogico del mismo, a fin de proporcionar la composici´on de la invenci´ on y devolver la sangre entera reconstituida cargada con rapamicina al mam´ıfero. En una forma de realizaci´ on preferida de la presente t´ecnica, los FBE separados se incuban con una soluci´ on de rapamicina y a continuaci´ on se elimina el disolvente lavando los FBE

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cargados con rapamicina con una soluci´ on salina est´eril tamponada con fosfato o plasma simple. Otra forma de realizaci´ on de la invenci´ on consiste en tratar los FBE de una sangre procedente de un donante con rapamicina, tal como se ha mencionado anteriormente, y administrar la sangre del donante cargada con rapamicina a un mam´ıfero hematol´ogicamente compatible que necesita la misma. Todav´ıa otra forma de realizaci´ on de la invenci´on consiste en tratar la sangre de un mam´ıfero donante de un tejido u o´rgano (p.ej. un mam´ıfero con muerte cerebral) de acuerdo con el m´etodo de la presente invenci´ on y cebar de esta manera el ´organo o tejido que se ha de trasplantar con rapamicina a fin de inhibir el rechazo por el mam´ıfero hu´esped. Se ha demostrado que la administraci´on parenteral de agentes inmunosupresores tales como ciclosporina A, ciclofosfamida, metilprednisona, FK506 o rapamicina a un donante de un tejido u o´rgano antes del trasplante, reduce el rechazo del tejido u o´rgano trasplantado. La invenci´on proporciona tambi´en un procedimiento para preparar la composici´ on farmac´eutica de la invenci´on, que comprende un procedimiento para preparar una composici´on farmac´eutica que comprende incubar los elementos sangu´ıneos formados hematol´ ogicamente compatibles, con rapamicina, y reconstituir los elementos sangu´ıneos formados cargados con rapamicina, con plasma o un sustituto fisiol´ ogico del mismo. En un procedimiento de ensayo farmacol´ ogico est´andar ideado para medir la prevenci´ on al rechazo de injertos con sangre que se ha cargado con rapamicina extracorp´ oreamente, se obtuvo sangre entera procedente de una u ´ nica rata Lewis (5 ml) a trav´es de la aorta abdominal. La sangre se centrifug´ o a 830 x g (2.000 rpm) y se aisl´ o la fracci´ on de eritrocitos (RBC), se lav´o dos veces con una soluci´on salina est´eril tamponada con fosfato (PBS) y se volvi´o a suspender en un volumen de PBS o plasma simple de nueva aportaci´ on equivalente al de la fracci´ on de plasma inicial. La mezcla de eritrocitos/PBS se incub´ o seguidamente con rapamicina (1 mg de rapamicina en 10 µl de etanol absoluto/1 ml de RBC/PBS) a una temperatura de 37◦C durante 5 minutos y se obtuvieron partes al´ıcuotas individuales que conten´ıan 1,8 x 106 eritrocitos. Se introdujeron c´ anulas en ratas Lewis machos (300-350 g) con cat´eteres Wicks permanentes en la aorta abdominal en la parte posterior a las arterias renales. Las c´ anulas se lavaron abundantemente con una soluci´on salina fisiol´ ogica est´eril antes de ser cerradas para asegurarse de que quedaban abiertas para la circulaci´ on. En el d´ıa de la canulaci´on, cada animal recibi´ o una secci´on de coraz´on de rata neonatal Brown Norway (BN) trasplantada en la oreja izquierda y se administraron 1,8 x 106 eritrocitos de Lewis cargados con rapamicina a trav´es de la c´anula permanente. A los animales experimentales se les transfundi´ o a trav´es de la c´anula aproximadamente 1,8 x 106 eritrocitos de Lewis cargados con rapamicina sobre una base diaria durante dos semanas. La contractilidad card´ıaca de las secciones de coraz´on de 3

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BN trasplantadas se mantuvieron durante m´ as de 30 d´ıas mediante este m´etodo, y se observ´o que los niveles tanto de linfocitos CD4 como CD8, importantes en el rechazo de injertos, se redujeron sustancialmente. Este procedimiento de ensayo farmacol´ogico est´andar mostr´ o que 1,8 x 106 eritrocitos cargados con rapamicina son aproximadamente equivalentes a 225 µg de una dosis intravenosa de rapamicina para prevenir el rechazo de un injerto. En el procedimiento de ensayo est´andar anteriormente mencionado, los per´ıodos de tiempo de supervivencia del m´ usculo card´ıaco trasplantado son comparables a los tiempos de supervivencia observados en una administraci´ on intravenosa est´andar de rapamicina en un veh´ıculo no acuoso compuesto de 20 % de dimetilacetaR y 70 % de poli(etilenmida, 10 % de Tween 80 glicol) 400, tal como se describe en la p´agina 22 de la revista Transplantation 51 (1), 22-26 (1991). Por lo tanto, se demuestra que la t´ecnica innovadora de la presente invenci´on proporciona un m´etodo eficaz para administrar rapamicina. Sobre la base de los datos obtenidos anteriormente con ratas Lewis, el margen de dosificaci´on proyectado de FBE cargados con rapamicina es de 0,1 µg a 100 mg/kg/d´ıa. El margen de dosificaci´on preferido es de 0,001 a 25 mg/kg/d´ıa. El margen de dosificaci´ on m´ as preferido es de 0,01 a 5 mg/kg/d´ıa. La dosificaci´ on administrada puede variarse variando la cantidad de sangre cargada con 0rapamicina administrada al mam´ıfero o variando la cantidad de rapamicina cargada en los elementos sangu´ıneos formados. La sangre

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cargada con rapamicina puede administrarse en forma de bolo o durante un periodo de tiempo, seg´ un sea necesario. Preferentemente, la composici´on de la invenci´ on se encuentra en una forma de dosificaci´on unitaria. La administraci´on conjunta de otros agentes inmunosupresores tales como ciclosporina A, FK506, ciclofosfamida, prednisona, metilprednisona o azatioprina, se encuentra dentro del alcance de la presente invenci´on. Se observa que la invenci´ on presenta varias ventajas sobre la terapia intravenosa est´ andar. La invenci´ on proporciona un tratamiento con rapamicina sin el uso de un veh´ıculo no natural. El crem´oforo EL, el veh´ıculo utilizado com´ unmente para una administraci´ on intravenosa de antibi´ oticos macroc´ıclicos, ha ocasionado reacciones anafil´acticas. La rapamicina cargada en los eritrocitos puede ser m´ as biodisponible, estar protegida de una descomposici´on metab´ olica, y a trav´es de la complejaci´on con eritrocitos intactos, puede formar un dep´ osito sustancial de f´ armaco en el que la liberaci´on gradual de rapamicina impide probablemente la actividad de los linfocitos contra el injerto de tejidos. Bas´andose en la similitud estructural de la rapamicina con el FK-506, se espera que los FBE cargados con FK-506 sean tambi´en u ´ tiles en la t´ecnica y en la composici´on de la invenci´ on. La invenci´on proporciona tambi´en elementos sangu´ıneos formados extracorp´ oreos (eritrocitos) cargados con rapamicina, p.ej. sustancialmente en ausencia de plasma.

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REIVINDICACIONES 1. Composici´ on farmac´eutica para una administraci´on intravenosa o intraarterial de rapamicina, que comprende eritrocitos cargados con rapamicina suspendidos en plasma sangu´ıneo o en un sustituto fisiol´ ogico del mismo. 2. Composici´ on seg´ un la reivindicaci´ on 1, en la que los eritrocitos se obtienen a partir de sangre del mam´ıfero que necesita un tratamiento con rapamicina. 3. Composici´ on seg´ un la reivindicaci´ on 1, en la que los eritrocitos se obtienen a partir de la sangre de mam´ıferos donantes. 4. Composici´ on seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en una forma de dosificaci´ on unitaria que contiene una cantidad terap´euticamente eficaz de elementos sangu´ıneos formados cargados con rapamicina. 5. Composici´ on seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los eritrocitos est´an sustancialmente saturados con rapamicina. 6. Procedimiento para preparar una composici´on farmac´eutica seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende incubar los eritrocitos hematol´ ogicamente compatibles con rapamicina y reconstituir los eritrocitos cargados con rapamicina, con plasma o un sustituto fisiol´ogico del mismo. 7. Uso de eritrocitos cargados con rapamicina en la preparaci´ on de un medicamento para inducir la inmunosupresi´ on en un mam´ıfero a trav´es de

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una administraci´ on intravenosa o intraarterial. 8. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 7, en el que los eritrocitos se obtienen a partir de la sangre del mam´ıfero que necesita un tratamiento con rapamicina. 9. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 7, en el que los eritrocitos se obtienen a partir de la sangre de mam´ıferos donantes. 10. Procedimiento para preparar eritrocitos cargados con rapamicina, que comprende tratar extracorp´ oreamente la sangre de un mam´ıfero donante de un tejido u o´rgano incubando los eritrocitos hematol´ ogicamente compatibles, con rapamicina. 11. M´etodo para tratar extracorp´ oreamente la sangre de un mam´ıfero con muerte cerebral donante de un tejido u o´rgano, que comprende incubar los elementos sangu´ıneos hematol´ogicamente compatibles con rapamicina, reconstituir los elementos sangu´ıneos formados cargados con rapamicina con plasma y devolver la sangre entera reconstituida que lleva elementos sangu´ıneos formados cargados con rapamicina, por v´ıa intravenosa o intraarterial, al donante. 12. Eritrocitos extracorp´ oreos cargados con rapamicina. 13. Eritrocitos seg´ un la reivindicaci´ on 12, que est´an sustancialmente saturados con rapamicina. 14. Uso de eritrocitos cargados con rapamicina en la preparaci´ on de un medicamento para inhibir el rechazo a trasplantes y/o el rechazo a injertos.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales.

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Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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