Zusammenfassung: Biotechnologie I; 1. Vorlesung 1. In der Biotechnologie werden durch enge Verflechtung von Naturund Ingenieurwissenschaften biologische Organismen, Systeme oder Prozesse für die Gewinnung von Produkten (Zellmasse, Stoffwechselprodukte ) bzw. für "Dienst"leistungen genutzt. 2. In der Biotechnologie wirken verschiedene Teilgebiete der Chemie, Technik, Biologie und Biochemie sowie der Ökonomie eng zusammen. 3. Die Biotechnologie geht auf seit Jahrtausenden genutzte empirische Prozesse zurück und setzt heute in zunehmendem Maße Erkenntnisse der modernen Biologie (wie Molekularbiologie, Zellbiologie etc.) sowie anderer Wissenschaftsgebiete ein.
Die "Produzenten" in der Biotechnologie Prokaryonten - Bakterien - Aktinomyzeten - Archaebakterien Eukaryonten - Hefen - Schimmelpilze - tierische und pflanzliche Zellkulturen - Algen - gentechnisch veränderte Pflanzen und Tiere "Teile" von Organismen - Enzyme
Tab. 2-4. In der Biotechnologie benutzte Organismen und Zellkulturen und ihre Produkte (Auswahl) Prokaryonten Archaebakterien Methanosarcina barkeri Eubakterien gram-positive Bakterien Bacillus thuringiensis Clostridium acetobutylicum Corynebacterium glutamicum Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Propionibacterium shermanii Streptomyces griseus gram-negative Bakterien Gluconobacter suboxydans Methylophilus methylotrophus Xanthomonas campestris Zymomonas mobilis
Methan Insektizid Butanol und Aceton L-Lysin L(+)-Milchsäure Dextran Vitamin B12 Streptomycin Essig (-säure) Einzellerprotein Xanthan Ethanol
aus: H.Diekmann und H.Metz, Grundlagen und Praxis der Biotechnologie, Gustav Fischer Verlag 1991
Tab.2-4. In der Biotechnologie benutzte Organismen und Zellkulturen und ihre Produkte (Fortsetzung) Eukaryonten Pilze Hefen Saccharomyces cerevisiae Candida utilis myzelbildende Pilze Agaricus bisporus Aspergillus niger Cephalosporium acremonium Claviceps purpurea Curvularia lunata Penicillium chrysogenum Rhizopus sp. Trichoderma reesii Pflanzen- Zellkulturen Lithospermum erythrorhizon Catharanthus roseus Digitalis lanata Coleus blumei Tier-Zellkulturen Hybridoma-Zellen Fibroblastzellen
Ethanol, Bier, Wein Futterhefe Kultur-Champignon Citronensäure Cephalosporin Ergotamin Steroidhydroxylierungen Penicillin Glucamylase Cellulase Shikonin Indolalkaloide Digoxin Rosmarinsäure monoklonale Antikörper β-Interferon
aus: H.Diekmann und H.Metz, Grundlagen und Praxis der Biotechnologie, Gustav Fischer Verlag 1991
Useful products from yeast and filamentous fungi. These products provide targets for genetic manipulation. GM strains are most advanced for the production of antibiotics and enzymes
Product Biomass
Uses Foods
Yeast Saccharomyces cerevisiae
Ethanol
Beer; wine
Saccharomyces cerevisiae
CO2
Bread, wine
Saccharomyces cerevisiae
Sulphite
Preservative (beer)
Saccharomyces cerevisiae
Flavours (e.g. lactones, peptides, terpenoids)
Foods, beverages
Saccharomyces cerevisiae Pichia guilliermondii Sporobolomyces odorus
Trichoderma viride Gibberella fujikuroi Mucor circinelloides Phycomyces blakesleeanus
Polyunsaturated fatty acids
Foods
Cryptococcus curvatus
Mortierella alpina Mucor circinelloides
Yarrowia lipolytica
Aspergillus niger Aspergillus terreus
Organic acids (e.g; citric, Preservatives, food gluconic, itaconic) ingredients, chemical synthesis
Filamentous fungus Agaricus bisporus Fusarium venenatum
Antibiotics (e.g. penicillin, cephalosporin, polyketides)
Health
Penicillium chrysogenum Acremonium chrysogenum Penicillium griseofulvum Aspergillus tamarii
Homologous enzymes (e.g. amylases, cellulases, proteases)
Food processing, paper production, detergents
Kluyveromyces lactis
Aspergillus spp. Rhizopus spp. Trichoderma spp.
Heterologous proteins
Foods, therapeutics
Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces lactis Pichia pastoris Pichia angusta Yarrowia lipolytica
Aspergillus niger Aspergillus oryzae Aspergillus nidulans Trichoderma reesei
aus: C.Ratledge & B.Kristiansen, Basic Biotechnology, Cambridge University Press 2001
YEASTS 1 Saccharomyces cerevisiae 2 Candida utilis 3 Aureobasidium pullulans 4 Trichosporon cutaneum 5 Saccharomycopsis capsularis 6 Saccharomycopsis lipolytica 7 Hanseniaspora guillermondii 8 Hansenuela capsulata 9 Saccharomyces carlsbergensis 10 Saccharonmyces rouxii 11 Rhodotorula rubra 12 Phaffia rhodozyma 13 Cryptococcus laurentii 14 Metschnikowia pulcherrima 15 Rhodotorula pallida aus: Sci Am September 1981
Verschiedene Penicillium, Aspergillus spp. (und einige andere) Schimmelpilze in Reinkulur. Quelle: http://de.wikipedia.org/wiki/Aspergillus
Tab. 6.2 Wichtige Unterschiede zwischen Prokaryoten und Eukaryoten
Merkmal Endomembranen (ER, GolgiApparat, Vesikel)
Prokaryot fehlend
Eukaryot vorhanden
Kernhülle mit Porenkomplexen
fehlend
vorhanden
Cytoskelett (Actinfilamente, Mikrotubuli)
wird durch analoge Proteine ersetzt
vorhanden
Exo- und Endocytose
fehlend
vorhanden
Genom/Chromosomen
1 zirkuläres DNA-Molekül
mehrere lineare Chromosomen
Histone, Nucleosomen
fehlend
vorhanden
Ribosomen
70S-Ribosomen
80S-Ribosomen
RNA-Polymerasen
1
3 (I-III)
aus: M.Wink, Molekulare Biotechnologie, Wiley-VCH 2004
Durchschnittliche Verdopplungszeiten: Bakterien: 0,25 - 1 h Hefen: 1 – 2 h Schimmelpilze: 2 – 6,5 h Tierische Zellen: 15 – 48 h Pflanzenzellen: 20 – 70 h
Abb.2-46. Vermehrung von Mikroorganismen-Zellen. A: Querteilung bei Bakterien. B: Substrat- und Luftmycel bei Streptomyceten. C: Sprossung (z. B. Saccharomyces) und Querteilung (z. B. Schizosaccharomyces) bei Hefen. D: Längenwachstum und Verzweigungen bei septierten und nicht-septierten mycelbildenden Pilzen aus: H.Diekmann und H.Metz, Grundlagen und Praxis der Biotechnologie, Gustav Fischer Verlag 1991
Abb.2-9. Replikation (DNA-Neusynthese) und Trennung der Tochter-DNA bei der Zellteilung eines Prokaryonten (A) bzw. beim Zellteilungszyklus eines Eukaryonten (B). G1 = Interphase, keine DNA-Synthese, S = DNASynthesephase, G2 = prämitotische Phase, M = Mitose (Zellkernteilung), läuft in 4 Phasen ab: Prophase, Metaphase, Anaphase, Telophase. Es entstehen Tochterzellen mit identischen Chromosomen. aus: H.Diekmann und H.Metz, Grundlagen und Praxis der Biotechnologie, Gustav Fischer Verlag 1991
Fortpflanzung und Austausch genetischen Materials bei Mikroorganismen
aus: P.Präve et al. Handbuch der Biotech-nologie, 4.Aufl., Oldenbourg
FIGURE 3.49 The presence of pili on an Escherichia coli cell is revealed by the use of viruses that specifically adhere to the pilus. The cell is about 0.8 µm in diameter. aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
aus: P.Präve et al. Handbuch der Biotechnologie, 4.Aufl., Oldenbourg Verl. 1994
Workhorse of fermentation is the yeast Saccharomyces cerevisiae, cells of which appear in the Scanning electron micrograph made by Alastair T. Pringle of the University of California at Los Angeles. Each cell is about 10µm in diameter: Strains of the yeast serve to raise bread and to make alcoholic beverages. As the cells ferment sugars they evolve carbon dioxide and also make alcohol; in dough the carbon dioxide forms the holes of the bread. Several of the cells are budding (beginning to reproduce) and several budding scars are visible.
aus: Scientific American September 1981
REPRODUCTION OF YEAST is normally asexual, proceeding by the formation of buds on the cell surface, but sexual reproduction can be induced under special conditions. In the sexual cycle a normal diploid cell (a cell with two sets of chromosomes and therefore two sets of genes) gives rise to asci, or spore cells, that contain four haploid ascospores (cells with one set of chromosomes and one set of genes). The ascospores are of two mating types: a and α. Each type can develop by budding into other haploid cells. The mating of an a haploid cell and an α haploid cell yields anormal a/α diploid cell. Haploid cells of the same sex can also unite occasionally to form abnormal diploid cells (a/a or α/α) that can reproduce only asexually, by budding in the usual way. Industrial yeasts reproduce mainly by budding. aus: Scientific American September 1981
aus: Scientific American, April 1997
aus: Scientific American, April 1997
Temperaturbedingungen für Produzenten psychrophil mesophil thermophil extremophil
Wachstumsoptimum bei 5 - 20°C Wachstumsoptimum bei 20 - 40°C Wachstumsoptimum bei 40 - 55°C Wachstumsoptimum über 55°C
Säugerzellen, Insektenzellen (Optimum bei 27-29°C) und die meisten Mikroorganismen sind mesophil Lactobacillus (Milchsäureproduktion) ist thermophil, Vorteil: bei 50°C kaum Fremdinfektionen möglich Extremophile sind i.A. schwer kultivierbar einfacher, das Gen für ein bestimmtes Produkt in einen „normalen“ Produzenten zu klonieren bei den meisten Kultivierungen: Heizen erforderlich (Brutschrank) bei exothermen (wärmeproduzierenden) Vorgängen (Komposthaufen, feuchtes Heu) Kühlung erforderlich
Archaea - "Archaebakterien" Gruppe phylogenetisch verwandter Prokaryonten - keine nähere Verwandtschaft zu den Bakterien - die meisten Archaea sind anaerob, - viele leben unter ungewöhnlichen, extremen Bedingungen, bei denen "normale" Lebewesen sterben würden (heißen Quellen mit Temperaturen über dem Siedepunkt; extrem konzentriertem Salzwasser; stark saurem oder alkalischem Milieu, Boden oder Wasser), daher die Bezeichnung Extremophile - Archaea zeigen deshalb ungewöhnliche biochemische Eigenschaften (z.B. Methanogene)
Archaea markieren wahrscheinlich die Grenzen der biologischen Toleranz gegenüber physikochemischen Extremwerten. Möglicherweise kennzeichnen diese Eigenschaften die Archaea als ursprünglichste Lebensformen, da z.Z. der Entstehung des Lebens (älteste mikrobielle Fossilien sind ~ 3,5 Milliarden Jahre alt) vergleichbare Extrembedingungen auf der Erde herrschten (kein O2, hohe Temperatur mit 100°C oder mehr). oder Eventuell sind die Archaea lediglich Organismen, die sich an extreme Lebensbedingungen angepaßt haben, weil sie im harten Konkurrenzkampf mit vielen Bewerbern unter den heutigen "normalen" Lebensbedingungen keine Chance hatten.
U.U. sind hyperthermophile Archaea den ersten Lebewesen wirklich am ähnlichsten!
AGE OF MICROORGANISMS, which lasted some three billion years, dominates the time span of biological evolution. Microfossils of prokaryotic cells have been found in deposits 3.5 billion years old, and those cells must have been preceded by simpler ones. The earliest eukaryotic fossils are only about 1.3 billion years old. Almost nothing is known about evolution during the age of microorganisms. The macroscopic fossil record goes back only about 600 million years to the time of the earliest metazoans, -or multicellular organisms.
aus: Scientific American, June 1981
Ribosomal RNAs are ancient molecules found in all cellular organisms and serve as excellent evolutionary chronometers. Comparisons of sequences of ribosomal RNA can be used to determine the relationships between organisms. Phylogenetic trees based on ribosomal RNA have now been prepared for all of the major prokaryotic and eukaryotic groups.
FIGURE 18.7 Primary and secondary structure of 16S ribosomal RNA (rRNA). This is the 16S rRNA from Escherichia coli (Bacteria). 16S rRNA from Archaea has general similarities in secondary structure (folding) but numerous differences in primary structure (sequence). The counterpart to 16S rRNA in eukaryotes is 18S rRNA present in cytoplasmic ribosomes.
aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
Although the three domains of living organisms were originally defined by ribosomal RNA sequencing, subsequent studies have shown that they differ in many other ways. Particularly, the Bacteria and Archaea differ extensively in cell wall and lipid chemistry, and in features of transcription and protein synthesis.
Archaea-Membranen keine typischen Fettsäuren (haben verzweigte Lipide), verzweigte aliphatische Reste sind an Glycerol über eine Ätherbindung gekoppelt - die Ätherbindung ist der Biomarker für fossile Archaea (Esterbindung bei Bakterien und Eukaryonten)
FIGURE 20.1 Major lipids of Archaea. (a) Glycerol diethers. (b) Diglycerol tetraethers. (c) Tetrapentacyclic diglycerol tetraethers. Note that in all cases, the hydrocarbon is attached to the glycerol by ether linkages. Hydrocarbon in (a) phytanyl; (b) and (c) dibiphytanyl. Note also how the introduction of pentacyclic rings in (c) shortens the length of the hydrocarbon chain. (d) Comparison of the ester linkage of Bacteria and Eukarya with the ether linkage of Archaea. aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
Archaea haben sehr unterschiedlich zusammengesetzte Zellwände: entweder: - aus NAcetylglucosamin, NAcetyl-talosaminuronsäure und L Aminosäuren Pseudo-Peptidoglykan, - ausschließlich aus Polysacchariden - teilweise ähnlich dem Chondroitin (Hauptkomponente des Bindegewebes von tierischen Geweben) bzw. in einigen Fällen aus Polysacchariden mit Sulfationen, - aus Glycoprotein, - ausschließlich aus Protein (verschiedene bzw. nur ein Protein), oder - aus Protein und Glycoprotein.
FIGURE 20.4 Structure of pseudopeptidoglycan, the cell wall polymer of Methanobacterium species.
aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
FIGURE 3.28 Structure of one of the repeating units of the peptidoglycan cell-wall structure, the glycan tetrapeptide. The structure given is that found in Escherichia coli and most other Gramnegative Bacteria. In some Bacteria, other amino acids are found. aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
FIGURE 20.5 Cell wall structure of Halococcus, an extremely halophilic archaeon. The wall basically consists of a repeating threepart pattern. Note the abundance of sulfate groups. Abbreviations: UA, uronic acid; Glu, glucose; Gal, galactose; GluNAc, N-acetylglucosamine; GaINAc, N-acetylgalactosamine; Gly, glycine; GuINUA, N-acetylgulosaminuronic acid; Man, mannose. aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
Genetik derArchaeen - Chromosom - ein kovalent geschlossenes, ringförmiges DNAMolekül - 1500 bis 2900 kb (kleiner als E.coli - 4700 kb - aber im Bereich der "normalen" Bakterien) haben Plasmide u.U. reich an Insertions-Sequenzen Restriktions-Modifikations-Systeme (wie auch andere Prokaryonten, bekannt ist die Methylierung) einige Archaea können durch Plasmide und genomische DNA transformiert werden, Klonierungsvektoren wurden entwickelt
Operons vorhanden, polycistronische mRNA, wie bei Bakterien (nicht bei Eukaryonten) haben eine einzige RNA-Polymerase wie Bakterien, aber Struktur ähnelt der RNAPolymerase II der Eukaryonten und unterscheidet sich von bakterieller RNAPolymerase Promotersequenz ähnlich der TATA-Box eukaryontischer Promoter
Tab. 6.1 Einige Unterschiede zwischen Bakterien und Archaeen _________________________________________________________________________
Merkmal
Bacteria
Archaea
__________________________________________________________________ Peptidoglykan (Murein) in der Zellwand
vorhanden
fehlend
RNA- Polymerase
eubakteriell
archaebakteriell
Formylmethionyl-tRNA
vorhanden
fehlend
Methanogenese
fehlend
vorhanden
Isoprenylether-Lipide
fehlend
vorhanden
Acylester-Lipide
vorhanden
fehlend
Mosaikgene
fehlend
vorhanden
ATP-Synthase-Typ
F
A
Katabolischer Embden-Meyerhof-Weg
vorhanden
fehlend
__________________________________________________________________ aus: M.Wink, Molekulare Biotechnologie, Wiley-VCH 2004
Systematik Extreme Halophile Methanogene Hyperthermophile Thermoplasma - Zellwand-freier Mikroorganismus (ähnlich den Mykoplasmen unter den Bakterien), - Optimum bei pH 2 und 55°C, - isoliert aus selbstentzündlichen Kohleabfallhaufen, - hat einzigartige Membran aus Tetraäther-Lipiden mit Mannoseund Glukoseeinheiten (Lipoglykan)
FIGURE 20.27 A typical self-heating coal refuse pile, habitat of Thermoplasma. (c) Spontaneous heat production can ignite nearby vegetation (d) Photo of a large hot refuse pile aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
FIGURE 20.26 Themoplasma acidophilum, an acidophilic, thermophilic, mycoplasma-like archean. Electron micrograph of thin section. The diameter of cells is highly variable from 0.2 to 5 µm. The cell shown is about 1 µm in diameter. aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
FIGURE 20.28 Structure of the tetraether lipoglycan of Thermoplasma acidophilum. Glu = glucose, Man = mannose. Note the ether linkages (shown in color).
aus: Brock et al.: Biology of Microorganisms, 7th ed. 1994
Zusammenfassung: Biotechnologie I; 2. Vorlesung 1. Biotechnologische Produkte (Zellmasse, Enzyme, Pharmazeutische Produkte, Spezielle Chemikalien und Nahrungsmittelzusätze, Massenprodukte, wie z.B. Alkohol) stellen einen beträchtlichen Anteil am Weltmarktvolumen dar. 2. Die wichtigsten in der Biotechnologie genutzten "Produzenten" sind Mikroorganismen (Hefen, Schimmelpilze, Bakterien und Aktinomyzeten). 3 . Weiterhin spielen Säugerzellkulturen und gereinigte Enzyme eine wichtige Rolle. 4. Archaea unterscheiden sich durch eine Reihe spezifischer Merkmale (z.B. ribosomale RNA, Membranaufbau) von Bakterien und Eukaryonten und werden als dritte Domäne der Lebewesen angesehen. 5. Archaea leben unter ungewöhnlichen Umweltbedingungen und werden deshalb auch als Extremophile bezeichnet (Extremophile ist keine Definition der Systematik, sondern charakterisiert extreme Lebensbedingungen).
