Warszawa, luty 2014

Enzymologia I Materiały do ćwiczeń dla studentów kierunku Biotechnologia Wydziału Biologii UW oraz dla wszystkich zainteresowanych studentów kierunków przyrodniczych

opracował zespół Zakładu Regulacji Metabolizmu Instytutu Biochemii Wydziału Biologii

Ćwiczenie 1 Oznaczenia enzymatyczne w diagnostyce medycznej Oznaczanie aktywności aminotransferaz w surowicy krwi królika Aminotransferaza alaninowa (AlaT; transaminaza glutaminian:pirogronian = GPT; EC 2.6.1.2) oraz aminotransferaza asparaginianowa (AspT; transaminaza glutaminian:szczawiooctan = GOT; EC 2.6.1.1) są enzymami uczestniczącymi w metabolizmie aminokwasów. Szczególnie duŜą aktywnością tych enzymów charakteryzują się: wątroba, serce, mózg i mięśnie szkieletowe. U zdrowego człowieka aktywność aminotransferaz w osoczu jest znikoma, a jej wzrost niemal zawsze wskazuje na uszkodzenie któregoś z wymienionych narządów. Wysoką aktywność aminotransferaz stwierdza się m.in. u chorych z zawałem serca (głównie AspT), wirusowym zapaleniem wątroby (głównie AlaT), marskością lub nowotworem wątroby oraz dystrofią mięśniową. Pomiar aktywności aminotransferaz w osoczu jest zatem rutynowo wykorzystywany w diagnostyce medycznej. W warunkach normy aktywność aminotransferaz powinna zawierać się w granicach 8–38 jednostek l–1 surowicy krwi. Zasada pomiaru aktywności aminotransferaz Aminotransferaza alaninowa (AlaT) katalizuje reakcję: L-Alanina + 2-Oksoglutaran ↔ Pirogronian + L-Glutaminian

(1)

Aktywność enzymu jest określana szybkością przyrostu stęŜenia produktu reakcji – pirogronianu. Zawartość tego związku moŜna oznaczyć spektrofotometrycznie przy długości fali 340 nm na podstawie spadku stęŜenia NADH, który jest zuŜywany podczas katalizowanego przez dehydrogenazę mleczanową przekształcenia pirogronianu w mleczan: + Pirogronian + NADH ↔ Mleczan + NAD (2) Obie reakcje są prowadzone równolegle w tej samej kuwecie, co pozwala na bieŜąco śledzić szybkość reakcji katalizowanej przez aminotransferazę alaninową. Aktywność aminotransferazy asparaginianowej (AspT) jest oznaczana w analogiczny sposób. Enzym ten katalizuje reakcję: L-Asparaginian + 2-Oksoglutaran ↔ Szczawiooctan + L-Glutaminian (1) StęŜenie produktu tej reakcji – szczawiooctanu moŜna mierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali 340 nm na podstawie spadku stęŜenia NADH w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę jabłczanową: +

Szczawiooctan + NADH ↔ Jabłczan + NAD

(2)

Celem ćwiczenia jest oznaczenie aktywności aminotransferaz w surowicy krwi królika.

1

Wykonanie Materiały i odczynniki 1. 2. 3. 4. 5. 6.

do oznaczania aminotransferazy alaninowej, AlaT 0,4 M bufor fosforanowy pH 7,4 (10 ml) 1 M roztwór L-alaniny (2,5 ml) Mieszanina podstawowa (przygotować w dniu oznaczeń): 0,2 M bufor fosforanowy, 0,2 M L-alanina (10 ml) 0,2 M 2-oksoglutaran sodowy (250 µl) NawaŜka NADH słuŜąca do sporządzenia roztworu o stęŜeniu 10 mg ml–1 (100 µl) Dehydrogenaza mleczanowa

10. 11. 12.

do oznaczania aminotransferazy asparaginianowej, AspT 0,4 M bufor fosforanowy pH 7,6 (10 ml) 2 M roztwór L-asparaginianu (5 ml) Mieszanina podstawowa (przygotować w dniu oznaczeń): 0,2 M bufor fosforanowy, 0,5 M Lasparaginian (10 ml) 0,2 M 2-oksoglutaran sodowy (250 µl) NawaŜka NADH słuŜąca do sporządzenia roztworu o stęŜeniu 10 mg ml–1 (100 µl) Dehydrogenaza jabłczanowa

A.

Przygotowanie surowicy do oznaczeń

7. 8. 9.

ŚwieŜo pobraną krew umieścić na ok. 2 godziny w cieplarce nastawionej na 37°C, celem wytworzenia skrzepu. śółtawą ciecz znad skrzepu odwirować i tak otrzymany preparat wykorzystywać do oznaczeń. Studenci otrzymują gotowy preparat surowicy

B.

Pomiar aktywności aminotransferaz

Pomiary oznaczyć następująco: oznaczanie aktywności AlaT – próby Nr 1, 2, 3; oznaczanie aktywności AspT – próby 4, 5, 6. Korzystając ze stęŜonych roztworów (odpowiednio: odczynniki nr 1 i nr 2 lub odczynniki nr 7 i nr 8), przygotować 10 ml mieszaniny podstawowej potrzebnej do pomiaru aktywności wybranej aminotransferazy (odczynnik nr 3 lub nr 9). Na 15 min przed pomiarem włączyć spekol. Ustawić długość fali 340 nm. Pomiar prowadzić w temperaturze pokojowej. Do kuwety odmierzyć: 500 µl odpowiedniej mieszaniny podstawowej, 15 µl NADH, odpowiednią dehydrogenazę (5 µl enzymu rozcieńczonego według wskazówek prowadzących) oraz 25 µl surowicy. Zawartość kuwety uzupełnić wodą do takiej objętości, aby w chwili rozpoczęcia reakcji, czyli po dodaniu 30 µl 2-oksoglutaranu, całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 1 ml. Następnie wymieszać i preinkubować przez 5 min. Następnie zmierzyć absorbancję wobec wody jako próby odniesienia. Rozpocząć reakcję dodaniem 30 µl 2-oksoglutaranu. W momencie dodania 2-oksoglutaranu uruchomić pomiar czasu i odczytywać zmiany absorbancji co 15 sekund przez ok. 5 min. Objętość próby badanej (surowicy) jest dobrana prawidłowo, jeśli zmiany absorbancji w ciągu 15 s wynoszą około 0,020–0,030 jednostek absorbancji. Jeśli otrzymane wyniki odbiegają od tej wartości, powtórzyć pomiar, odpowiednio zmiejszając lub zwiększając rozcieńczenie surowicy. Jeśli otrzymany wynik jest zgodny z oczekiwaniami, wykonać jeszcze dwa powtórzenia, stosując tę samą objętość surowicy.

C.

Opracowanie wyników

Zanotowane dane pomiarowe naleŜy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania. Zmiany wartości absorbancji przy 340 nm w czasie naleŜy odłoŜyć na wykresach (dobierając odpowiednio skalę na osi rzędnych) i wyliczyć szybkość początkową reakcji V0 = ∆ absorbancji min–1. Otrzymane wyniki przeliczyć na aktywność całkowitą w kuwecie i wyrazić w µmolach min–1, wiedząc, Ŝe milimolowy współczynnik absorbancji dla NADH przy 340 nm wynosi ε = 6,22 mM–1 cm–1. Podać aktywność transaminaz w 1 ml surowicy krwi królika. Wyniki zestawić w tabeli, na koniec obliczając średnią aktywność transaminaz w 1l surowicy. 2

Ćwiczenie 2 Wpływ rozpuszczalników organicznych na stabilność enzymów na przykładzie dehydrogenazy alkoholowej Zamiana środowiska działania enzymów ze środowiska wodnego na środowisko organiczne ma szczególne zastosowanie w biotechnologii, np. wtedy gdy substrat(y) łatwiej rozpuszcza(ją) się w roztworach o niŜszej polarności niŜ woda. W środowisku organicznym moŜna teŜ przeprowadzić reakcje syntez przy uŜyciu hydrolaz, co praktycznie jest niemoŜliwe w środowisku wodnym. Przykładem takich syntez jest produkcja paliwa „biodiesel” z zastosowaniem lipaz katalizujących reakcję transestryfikacji kwasów tłuszczowych pochodzących z olejów roślinnych w obecności metanolu lub etanolu. Reakcja ta w środowisku wodnym nie zachodzi z uwagi na rozpuszczalność substratu oraz na powstający produkt reakcji – wodę, która będąc jednocześnie rozpuszczalnikiem, przesuwa równowagę reakcji w kierunku hydrolizy. Do kolejnych zalet środowiska organicznego moŜna zaliczyć często zwiększoną termostabilność enzymów oraz mniejsze niŜ w roztworach wodnych ryzyko zakaŜenia mikroorganizmami. Co więcej, reakcje wymagające udziału substratów higroskopijnych, takich jak np. bezwodniki kwasowe zachodzą z większą wydajnością w środowisku organicznym. Ponadto modyfikacje polarności rozpuszczalnika wykorzystuje się czasem w celu kontroli stereospecyficzności enzymów. Szereg enzymów wykazuje zwiększoną termostabilność w roztworach organicznych. Na przykład lipaza trzustkowa lub lizozym zachowują stabilność w temperaturze 100°C przez wiele godzin, podczas gdy tak znaczna trwałość enzymów nie jest moŜliwa w środowisku wodnym nawet po ich róŜnego rodzaju modyfikacjach (np. immobilizacji). Zwiększona termostabilność wynika między innymi z tego, Ŝe większość procesów prowadzących do nieodwracalnej inaktywacji białek, jak np. deamidacja, hydroliza wiązań peptydowych czy rozszczepianie reszt cystyny wymaga udziału wody. Interesujące jest, Ŝe optymalna temperatura działania mitochondrialnej ATPazy w kierunku hydrolizy ATP jest taka sama (około 58°C) zarówno w wodzie, jak teŜ roztworze o jej małej zawartości. Natomiast stabilność tego enzymu jest znacznie większa w środowisku mniej polarnym. Celem ćwiczenia jest zbadanie aktywności dehydrogenazy alkoholowej (EC 1.1.1.1) inkubowanej przez dwie godziny w środowisku wodnym lub organicznym w zakresie temperatur od 25 do 75°C. Dehydrogenaza alkoholowa katalizuje reakcje utlenienia alkoholu do aldehydu z jednoczesną redukcją NAD+ do NADH. +

etanol + NAD ↔ aldehyd octowy + NADH Zmiany stęŜenia NADH w czasie trwania reakcji moŜna oznaczyć, wykorzystując jego zdolność absorbancji promieniowania elektromagnetycznego o długości fali 340 nm.

Wykonanie Materiały i odczynniki 1. 2. 3. 4. 5. 6.

50 mM bufor fosforanowy o pH 7,8 (30 ml) Toluen (200 µl) Dodekan (moŜna zamiast dodekanu uŜyć oktanu) (200 µl) Dehydrogenaza alkoholowa (liofilizowana) + 100 mM wodny roztwór NAD (350 µl) 1 M wodny roztwór etanolu (200 µl)

Materiały pomocnicze i aparatura Liofilizator, zamraŜarka –80°C, spektrofotometr, pipety automatyczne, kuwety, szpatułki, mikromieszadło Studenci rozpoczynają ćwiczenie od etapu C

3

A.

Przygotowanie liofilizatu dehydrogenazy alkoholowej

Odpowiednią ilość dehydrogenazy alkoholowej rozpuścić w buforze fosforanowym tak, aby jej stęŜenie wynosiło 0,1 mg białka na ml. Odmierzyć po 100 µl roztworu enzymu do dobrej jakości probówek Eppendorfa. Zliofilizować. Liofilizat zamrozić w –80°C. Próbę z tak przygotowanym enzymem oznaczyć jako 0.

B.

Wpływ rozpuszczalników organicznych na termostabilność dehydrogenazy alkoholowej

Do trzech probówek zawierających zliofilizowany enzym (próby nr 1, 2, 3) odpipetować po 100 µl buforu fosforanowego, do trzech kolejnych (próby nr 4, 5, 6) po100 µl toluenu a do 3 następnych (próby nr 7, 8, 9) po 100 µl dodecanu. Zawiesić starannie enzym w rozpuszczalniku i następnie inkubować przez dwie godziny: próby 1, 4, 7 w temperaturze 25°C, próby 2, 5, 8 w 50°C a próby 3, 6, 9 w temperaturze 75°C. Po zakończonej inkubacji wszystkie próby zliofilizować i przechowywać w temperaturze –80°C.

C.

Oznaczanie aktywności dehydrogenazy alkoholowej

Oznaczenie polega na pomiarze w czasie zmian wartości absorbancji przy długości fali 340 nm, + spowodowanych redukcją NAD w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę alkoholową. Pomiary przeprowadzić dla wszystkich prób zawierających enzym poddany inkubacji (etap B – próby 1–9) oraz dla jednej porcji wyjściowego preparatu enzymu (etap A – próba 0). Bezpośrednio przed pomiarem rozpuścić otrzymane liofilizaty enzymu w 100 µl buforu fosforanowego. Po dokładnym wymieszaniu roztwory enzymu naleŜy dalej rozcieńczyć wg wskazań asystenta, tak aby obserwowane zmiany absorbancji na minutę zawierały się w granicach od 0,012 do 0,100. Próby z enzymem po rozcieńczeniu starannie wymieszać. Do kuwety o pojemności 2 ml i przekroju 1 cm odmierzyć 1,42 ml buforu fosforanowego, 35 µl + roztworu NAD , oraz 30 µl rozcieńczonego enzymu. Zawartość kuwety dokładnie wymieszać i zmierzyć absorbcję wobec próby odniesienia zawierającej wodę destylowaną. Obserwować zmiany absorbcji przez ok. 1 min, a następnie rozpocząć reakcję dodaniem 15 ml roztworu etanolu. Zawartość kuwety starannie wymieszać. W momencie dodania etanolu uruchomić pomiar czasu i odczytywać zmiany absorbancji co 15 sekund przez ok. 3 min.

D.

Opracowanie wyników

Zanotowane dane pomiarowe naleŜy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania. Zmiany wartości absorbancji przy 340 nm w czasie naleŜy odłoŜyć na wykresach i wyliczyć szybkość początkową reakcji V0 = ∆ absorbancji min–1. Otrzymane wyniki przeliczyć na aktywność całkowitą w kuwecie w µmolach min–1 wiedząc, Ŝe milimolowy współczynnik absorbancji dla NADH przy długości fali 340 nm wynosi ε = 6,22 mM–1 cm–1. Znając całkowitą zawartość białka w kuwecie pomiarowej, obliczyć aktywność właściwą dehydrogenazy alkoholowej (µmol min–1 mg–1 białka) w próbach inkubowanych w róŜnych rozpuszczalnikach i w róŜnych temperaturach. Wyliczyć % aktywności w stosunku do wyjściowej próby dehydrogenazy alkoholowej. Wyniki zestawić w tabeli. Na podstawie uzyskanych wyników wyciągnąć wnioski na temat wpływu rozpuszczalnika na stabilność dehydrogenazy alkoholowej.

4

Ćwiczenie 3 Zastosowanie fluorymetrii w badaniach biochemicznych i biomedycznych Fluorymetria jest metodą badania materii wykorzystującą emisje promieniowania elektromagnetycznego przez cząsteczki po jego uprzednim zaabsorbowaniu. Po zaabsorbowaniu energii cząsteczki dąŜą do jej oddania i powrotu do stanu podstawowego. Nadmiar energii rotacyjnej i oscylacyjnej jest łatwo oddawany w sposób bezpromienisty, natomiast dominującym sposobem oddawania energii wzbudzenia elektronowego jest mechanizm promienisty, tzn. cząsteczka po pewnym czasie Ŝycia na wzbudzonym poziomie elektronowym emituje światło. PoniewaŜ część energii wzbudzenia jest tracona w wyniku wewnątrzcząsteczkowych przejść bezpromienistych, emitowane promieniowanie ma mniejszą energię, czyli charakteryzuje się większą długością fali w stosunku do promieniowania zaabsorbowanego. Widmo emisyjne jest zazwyczaj lustrzanym odbiciem widma absorbcyjnego ale przesuniętym w kierunku fal dłuzszych. O ile w spektroskopii absorbcyjnej mierzymy stosunek światła padającego do przechodzącego przez roztwór badany, o tyle we fluorymetrii mierzymy emitowane światło, co skutkuje wyŜszą czułością omawianej metody. Metody fluorymetryczne wykorzystywane są m.in. do bezpośredniego lub pośredniego pomiaru niewielkich ilości cząsteczek biologicznych.

Rys. 3.1 Schemat budowy spektrofluorymetru

5

Celem ćwiczenia jest fluorymetryczne oznaczanie stęŜenia glukozy. Glukozę moŜna oznaczyć na podstawie przyrostu ilości NADPH (maksimum absorbancji 340 nm, maksimum emisji przy 465 nm) w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę (1) Glukoza + ATP ↔ Glukozo-6-fosforan + ADP

(1)

a następnie dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową (2) Glukozo-6-fosforan + NADP ↔ 6-fosfoglukonian + NADPH + H+

(2)

Wykonanie Materiały i odczynniki 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

0,1 M buforu Tris-HCl o pH = 8,1 0,1 M roztwór MgCl2 10 mM roztwór ATP roztwór NADP o stęŜeniu 10 mg ml–1 roztwór wzorca glukozy roztwór heksokinazy roztwór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej

Materiały pomocnicze i aparatura Spektrofluorymetr, pipety automatyczne, kuwety, szpatułki, mikromieszadło

A.

Oznaczanie zawartości glukozy w próbie badanej

Do kuwety fluorymetrycznej odmierzyć: - 100 µl 10 mM ATP - 200 µl 0,1 M MgCl2 - 40 µl NADP o stęŜeniu 10 mg/ml - 1630 µl 0,1 M buforu Tris-HCl o pH = 8,1 - 10 µl próby badanej - 10 µl dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej Rozpocząć pomiar. Po ustabilizowaniu się odczytu dodać 10 µl heksokinazy i obserwować przebieg reakcji. Po jej zakończniu dodać 10 µl roztworu wzorca glukozy i znów obserwować przebieg reacji. Po zakończeniu reakcji odczytać zmiany fluorescencji osobno dla wzorca i osobno dla próby badanej. Wiedząc o ile jednostek zmieniła się fluorescencja w kuwecie po dodaniu wzorca, obliczyć ile glukozy zawierała próba badana. Następnie wykorzystując milimolowy współczynnik absorbacji dla NADPH (ε = 6,22 mM–1 cm–1 przy długości fali 340 nm) wyliczyć zmianę absorbacji jaką moŜna by było zaobserwować śledząc oznaczenie takiej samej próby badanej, w tych samych warunkach, przy uŜyciu spektrofotometru absorbcyjnego. Zanotowane dane pomiarowe naleŜy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania.

6

Ćwiczenie 4 Zastosowanie enzymu do produkcji leku. Wykorzystanie tyrozynazy izolowanej z pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus) do wytwarzania L-DOPA L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenyloalanina) jest naturalnym prekursorem dopaminy, jednego z najwaŜniejszych neuroprzekaźników wykorzystywanych przez neurony ssaków, a takŜe adrenaliny i noradrenaliny, syntetyzowanych zarówno w ośrodkowym układzie nerwowym, jak i w tkankach obwodowych. W komórkach tkanki nerwowej L-DOPA jest wytwarzana z tyrozyny w reakcji katalizowanej przez hydroksylazę tyrozynową (HT, EC 1.14.16.2), a następnie przekształcana w dopaminę przez dekarboksylazę DOPA (AADC) (Rys. 4.1). Dopamina moŜe być następnie wykorzystana do syntezy noradrenaliny i adrenaliny w reakcjach katalizowanych przez hydroksylazę dopaminową (DBH) oraz Nmetylotransferazę fenyloetanoloaminową (PNMT). O HO

O

TH

CH2 CH C

HO

CH2 CH C

OH

NH2

HO

tyrozyna

NH2

OH

L-DOPA AADC

HO

CH2 CH2 NH2

HO

Dopamina

DBH

PNMT HO HO

CH OH

HO

CH2 NH CH3

HO

adrenalina

CH CH2 OH NH2 noradrenalina

HT – hydroksylaza tyrozynowa AADC – dekarboksylaza DOPA

DBH – hydroksylaza dopaminowa PNMT – N-metylotransferaza fenyloetanoloaminowa

Rys. 4.1 Schemat biosyntezy amin katecholowych w organizmie człowieka L-DOPA jest podstawowym i najbardziej skutecznym środkiem stosowanym w terapii choroby Parkinsona – schorzenia zwyrodnieniowego układu nerwowego, na które cierpi około 1,5% osób w wieku powyŜej 65 lat. Przyczyny choroby Parkinsona nie zostały dotychczas w pełni wyjaśnione, aczkolwiek wiadomo, Ŝe obserwowane objawy: drŜenie rąk, ramion, nóg, Ŝuchwy i twarzy oraz sztywność kończyn i tułowia, spowolnienie ruchów, upośledzenie koordynacji ruchowej i równowagi są wynikiem obumierania neuronów istoty czarnej mózgu (tzw. neuronów dopaminergicznych), odpowiedzialnych za wytwarzanie dopaminy. Podstawową metodą otrzymywania L-DOPA w przemyśle farmaceutycznym jest synteza chemiczna. W latach 90-tych minionego wieku prowadzono intensywne badania nad wykorzystaniem mikroorganizmów lub preparatów enzymatycznych do produkcji tego leku. Jednak biosynteza L-DOPA z uŜyciem bakterii lub grzybów okazała się dość kosztowna, głównie ze względu na konieczność usuwania duŜych ilości 7

zanieczyszczeń powstających w procesie produkcyjnym, a przez to niekonkurencyjna z syntezą chemiczną. Z drugiej strony, prace nad wykorzystaniem enzymu – tyrozynazy, jako biokatalizatora reakcji przekształcania aminokwasu tyrozyny w L-DOPA, wykazały wyraźną opłacalność ekonomiczną takiego podejścia, szczególnie w związku z duŜą trwałości enzymu i łatwością jego oddzielenia od mieszaniny reakcyjnej. Tyrozynaza (EC 1.14.18.1) jest szeroko rozpowszechniona w organizmach Ŝywych. Obecność tego enzymu stwierdza się zarówno w mikroorganizmach, jak i w komórkach roślin. Natomiast w organizmach ssaków największą aktywność tyrozynazy wykrywa się w melanocytach, gdzie jest ona kluczowym enzymem szlaku syntezy melaniny, barwnika nadającego skórze charakterystyczne zabarwienie. Tyrozynaza moŜe katalizować dwie róŜne reakcje chemiczne: a) hydroksylację monofenoli do o-difenoli: HO

R1

+

HO

O2

R1

+

H2O

HO

monofenol

o-difenol

b) utlenianie o-difenoli do o-chinonów: 2

HO

R1

+

2 O

O2

R1

+

2 H2O

O

HO

o-chinon

o-difenol

Spośród róŜnorodnych związków chemicznych o charakterze monofenoli, tyrozyna wydaje się być najwaŜniejszym substratem tyrozynazy. Enzym ten wydajnie hydroksyluje tyrozynę do L-DOPA (o-difenol, por. powyŜej), a następnie umoŜliwia przekształcenie cząsteczek L-DOPA do dopachinonów (o-chinon). Proces powstawania dopachinonów moŜna zablokować przez dostarczenie do środowiska reakcji związków chemicznych o właściwościach silnie redukujących, np. askorbinianu lub NADH, co sprawia, Ŝe jedynym produktem reakcji katalizowanej przez tyrozynazę jest L-DOPA. MoŜliwość tę wykorzystuje się w procesie enzymatycznej produkcji L-DOPA, a pomiar ilości powstającej L-DOPA w czasie pozwala określić aktywność uŜytej tyrozynazy. Powszechnie stosowaną, czułą i prostą metodą detekcji oraz ilościowego oznaczania L-DOPA w próbach nie zawierających innych o-difenoli (np. adrenaliny, 2,3-dihydroksybenzoesanu etc.) jest chemiczne przekształcenie tego aminokwasu do dinitrochinonu. PoniewaŜ powstały związek charakteryzuje się intensywnym, czerwonopomarańczowym zabarwieniem, moŜliwe jest oznaczenie jego zawartości metodami kolorymetrycznymi (l = 460 lub 390 nm). Proces derywatyzacji L-DOPA do dinitrochinonu przebiega w dwóch kolejnych reakcjach chemicznych: R1

R1

HNO2

O2N O2N

OH

OH

OH

OH

L-DOPA

dinitropochodna L-DOPA

(o-difenol)

(Ŝółte zabarwienie)

a) nitrowania L-DOPA do dinitropochodnej o charakterystycznym Ŝółtym zabarwieniu: b) utlenienia dinitropochodnej L-DOPA do dinitrochinonu w obecności jonów wodorotlenowych: Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z enzymatyczną metodą produkcji L-DOPA z wykorzystaniem tyrozynazy uzyskanej z pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus). 8

Tyrozynaza została oczyszczona zgodnie z procedurą opisaną przez Sharama i współpracowników (2003). 200 g rozdrobnionych pieczarek zamroŜono w temp. –20°C na okres 12 godzin. Następnie przeprowadzono ekstrakcję białek z mroŜonych pieczarek, uŜywając najpierw czystego acetonu schłodzonego do temp. –20°C, a następnie roztworu 30% acetonu w wodzie destylowanej. Tak wyekstrahowane białka zostały następnie wytrącone z roztworu wodnego schłodzonym acetonem, odwirowane i zawieszone w 0,1 M sodowym buforze fosforanowym o pH 7,0. W kolejnym etapie wykonano frakcjonowanie białek siarczanem amonowym. Do preparatu dodano siarczan amonu w ilości potrzebnej do otrzymania roztworu o stęŜeniu końcowym równym 10% roztworu nasyconego, preparat odwirowano, a osad odrzucono. Do otrzymanego supernatantu dodano kolejną porcję soli do uzyskania stęŜenia równego 60% nasycenia. Preparat ponownie odwirowano, a osad zawieszono w 0,1 M sodowym buforze fosforanowym (pH 7,0) i roztwór poddano dializie względem tego samego buforu. Dializę prowadzono przez 12 godzin w temp. 2–4°C przy ciągłym mieszaniu buforu, uzyskując „preparat tyrozynazy”.

Wykonanie Materiały i odczynniki 1. 2. 3. 4. 5. 6.

7.

Preparat tyrozynazy otrzymany z pieczarek Mieszanina reakcyjna do oznaczania aktywności tyrozynazy zawierającej 0,1 M sodowy bufor fosforanowy pH 7,0, 10 mM askorbinian sodu, 7,5 mM tyrozynę (40 ml) 2 M roztwór NaOH (35 ml) 2 M roztwór HCl (30 ml) 20 ml 15% (wag./obj.) roztworu molibdenianu sodu zmieszanego z 20 ml 15% (wag./obj.) azotynu sodu (NaNO2) (40 ml) 10 mM roztwór wzorcowy L-DOPA. OdwaŜyć bardzo dokładnie nawaŜkę L-DOPA (na 5 ml). TuŜ przed uŜyciem rozpuścić w ogrzanej do temp. około 60°C mieszaninie reakcyjnej do oznaczania aktywności tyrozynazy Odczynnik Bradford. 100 mg Coomassie Blue G-250 rozpuścić w 50 ml 96% etanolu. Do tego roztworu dodać 100 ml 85% (wag./obj.) kwasu ortofosforowego. Otrzymany roztwór rozcieńczyć wodą destylowaną do objętości końcowej 1 l. Przechowywać w ciemnej butelce w lodówce.

Materiały pomocnicze i aparatura Szklana zlewka o objętości 25 ml, mieszadło magnetyczne, cylinder miarowy o objętości 25 ml, pipeta automatyczna (1 ml), spektrofotometr lub kolorymetr z filtrem dla 390 nm, kuwety spektrofotometryczne

A.

Produkcja L-DOPA w obecności tyrozynazy, oznaczanie aktywności tyrozynazy

Zlewkę o poj. 25 ml (podpisaną jako I) napełnić 10 ml mieszaniny reakcyjnej do oznaczania aktywności tyrozynazy. W zlewce umieścić mieszadełko magnetyczne. Przygotować zestaw probówek (7 sztuk) wg poniŜszego schematu i odmierzyć do kaŜdej probówki po 500 µl 2 M HCl. Zestaw probówek dla prób pobieranych ze zlewki I I0

I20

I40

I60

I80

I120

R1

R1 O2 N

OH

O2N O2N

I100

O2 N

OH

dinitropochodna L-DOPA (Ŝółte zabarwienie)

O O

OH

dinitrochinon (czerwonopomarańczowe zabarwienie)

9

Reakcję rozpoczyna się dodaniem 1,0 ml otrzymanego preparatu tyrozynazy do zlewki nr I zawierającej mieszaninę reakcyjną. W czasie trwania pomiaru naleŜy mieszać mieszaninę reakcyjną na mieszadle magnetycznym. W celu oznaczenia produkcji L-DOPA pobierać co 20 minut po 500 µl próby ze zlewki i przenosić kolejno do uprzednio przygotowanych probówek zawierających 2 M HCl. Po zakończeniu reakcji dodać po 1000 µl mieszaniny 15% molibdenianu amonu z 15% azotynem sodu. Zawartość probówek zamieszać na mikrowytrząsarce, a następnie do kaŜdej dodać po 1000 µl 2 M NaOH i ponownie zamieszać. Po 5 minutach zmierzyć wartości absorbancji przy λ = 460 nm (spektrofotometr) lub λ = 390 nm (kolorymetr) względem odpowiedniej próby pobranej w czasie „0”.

B.

Wyznaczanie krzywej wzorcowej do oznaczania L-DOPA

Do 7 jednorazowych, plastikowych i ponumerowanych probówek odmierzyć następujące ilości roztworów, jak przedstawiono w tabeli: Roztwory

Nr probówki 0

1

2

3

4

5

6

µl roztworu 10 mM L-DOPA

0

20

40

60

80

100

120

Mieszanina reakcyjna

500

480

460

440

420

400

380

Przy uŜyciu pipety automatycznej dodać do kaŜdej probówki po: 500 µl 2 M HCl oraz 1000 µl mieszaniny 15% molibdenianu sodu z 15% azotynem sodu. Następnie zawartość probówek zamieszać na mikrowytrząsarce, dodać po 1000 µl 2 M NaOH i ponownie zamieszać. Po 5 minutach zmierzyć wartości absorbancji przy 8 = 460 nm względem próby odniesienia (probówka „0”). Na podstawie uzyskanych wyników wykreślić krzywą wzorcową, odkładając na osi odciętych (0X) zawartość L-DOPA w poszczególnych próbach (w µmolach), a na osi rzędnych (0Y) wartości absorbancji (A).

C.

Oznaczanie zawartości białka metodą Bradford - przykład krzywa wzorcowa i oznaczenie zawartości białka w preparacie tyrozynazy zostało wykonane przez prowadzących

Zawartość białka w preparacie tyrozynazy oznaczyć metodą Bradford, polegającą na pomiarze wzrostu absorbancji przy długości fali 595 nm, wywołanej powstaniem kompleksu barwnika Coomassie Blue G-250 z białkiem. Preparat tyrozynazy (10–100 µl) odmierzyć za pomocą pipety automatycznej do suchej probówki na 10 ml. Objętość doprowadzić do 200 µl, dodać 3 ml odczynnika Bradford, zamieszać i po 5 minutach zmierzyć absorpcję przy 595 nm wobec próby nie zawierającej białka (tzw. materiałowej lub odniesienia). Próba materiałowa jest przygotowywana poprzez wymieszanie 200 µl wody z 3 ml roztworu Bradford. JeŜeli ilość białka wzięta do oznaczania była odpowiednia, tzn. absorpcja wynosiła 0,1– 0,5, co odpowiada 5 do 25 µg białka, oznaczenie powtórzyć. Jeśli otrzymane wyniki odbiegają od tych wartości, oznaczenie powtórzyć, odpowiednio zmieniając rozcieńczenie białka. Z krzywej wzorcowej przygotowanej przez prowadzących ćwiczenia odczytać ilość białka w kuwecie i na tej podstawie obliczyć jego zawartość w preparacie tyrozynazy.

10

D.

Opracowanie wyników

Zanotowane dane pomiarowe naleŜy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania. Na podstawie pomiarów absorbancji dla wzorcowych roztworów L-DOPA wykreślić krzywą wzorcową. Z krzywej wzorcowej wyznaczyć zawartość L-DOPA (µmole) w poszczególnych próbkach pobranych w czasie trwania reakcji. Na podstawie wykonanych pomiarów wykreślić krzywą produkcji LDOPA w czasie. Na podstawie zmian zawartości L-DOPA w czasie wyznaczyć aktywność preparatu tyrozynazy (µmol –1 min ). Znając, podane przez prowadzących, a wyznaczone na podstawie pomiaru metodą Bradford, stęŜenie białka w uŜytym preparacie enzymatycznym, wyliczyć aktywność właściwą preparatu tyrozynazy (µmol min–1 mg–1 białka). Wyniki zestawić w tabeli.

11

Ćwiczenie 5a Badanie kinetyki reakcji enzymatycznych przy uŜyciu programu komputerowego Gepasi Gepasi to program słuŜący do symulacji kinetyki przemian chemicznych i biochemicznych. Program ma być pomocny w nauce praw rządzących złoŜonymi szlakami metabolicznymi oraz w badaniach naukowych, umoŜliwiając sprawdzanie postawionych hipotez dotyczących regulacji przemian w drodze ich modelowania. UmoŜliwia symulację stanów stacjonarnych, jak i progresji przemian (time course). UŜytkownik programu musi wprowadzić do niego informacje o stechiometrii modelowanych przemian, charakterystyce kinetycznej poszczególnych reakcji, liczbie i objętości przedziałów, w których reakcje zachodzą oraz określić początkowe stęŜenia metabolitów. Na podstawie dostarczonych informacji program tworzy równania róŜniczkowe określające zachowanie układu, po czym je rozwiązuje. Program Gepasi dokonuje charakterystyki znalezionych stanów stacjonarnych, wykorzystując Analizę Kontroli Metabolicznej (Metabolic Control Analysis) i analizę stabilności kinetyki linearnej (Linear Kinetic Stability Analysis) [Cornish-Bowden A., Fundamentals of Enzyme Kinetics. Buttrrworths, London 1995]. Program Gepasi został napisany przez Pedro Mendesa z Uniwersytetu Walijskiego [http://www.gepasi.org/]. Celem ćwiczenia jest poznanie podstaw programu, moŜliwości modelowania reakcji chemicznych lub szlaków metabolicznych, przybliŜenie zasad kinetki enzymatycznej oraz zachęcenie do dalszej samodzielnej pracy z programem. PoniŜej przedstawiono przykład posługiwania się tym programem.

A.

Reakcje odwracalne i nieodwracalne

Przebieg reakcji chemicznej między dwoma lub więcej cząsteczkami wymaga, aby doszło między nimi do zderzenia, w którym uwolniona zostanie wystarczająca ilość energii oraz spełnione będą wymogi wzajemnej orientacji w przestrzeni. Dlatego teŜ szybkość reakcji, uwarunkowana liczbą zderzeń między substratami, jest proporcjonalna do ich stęŜeń. Dla reakcji: A + B → C jej szybkość jest określona jako: v = k [A][B] lub ogólniej v= k Π Si (iloczyn stęŜeń wszystkich substratów i stałej szybkości reakcji). W przypadku reakcji odwracalnej szybkość reakcji przekształcenia substratów w produkty będzie pomniejszona o szybkość reakcji przekształcenia produktów w substraty i ogólna postać wzoru przyjmie postać: v = k+ Π Si - k- Π Pj

Model reakcji nieodwracalnej Wprowadzenie danych do programu Uruchomić program. Pojawia się główne okno programu – zakładka Model Definition (Rys. 5.1). Najpierw naleŜy wpisać równania stechiometryczne przemian. W tym celu nacisnąć przycisk Reactions. Pojawia się okno (Rys. 5.2), w które wpisać równanie reakcji: S -> P. W przypadku reakcji odwracalnej substraty od produktów oddzielamy znakiem =, w przypadku reakcji nieodwracalnej -> (myślnik ze znakiem symbolu „większy od”). Po wpisaniu kaŜdej reakcji (obecnie tylko jednej S -> P) nacisnąć przycisk Add. JeŜeli zapomnimy o naciśnięciu Add, to wpisana reakcja zostanie zignorowana. Po wpisaniu wszystkich reakcji naleŜy wcisnąć przycisk OK. Po zdefiniowaniu stechiometrii reakcji, trzeba określić ich kinetykę. W tym celu nacisnąć przycisk Kinetics (por. Rys. 5.1), co spowoduje wywołanie okna, w którym moŜna określić typ kinetyki, według której kaŜda z reakcji zachodzi (Rys. 5.3). W lewym polu okna określamy reakcję, której kinetykę chcemy zdefiniować, a w prawym wybieramy typ kinetyki. W tym oknie naleŜy teŜ określić wielkości stałych kinetycznych dla danej reakcji. Dla wcześniej wpisanej reakcji wybieramy typ kinetyki Mass action, a wielkość stałej szybkości określamy na 1. Wybieramy OK. Aby dokończyć definiowanie zadanego modelu, trzeba podać początkowe stęŜenia związków uczestniczących w reakcji. Nacisnąć przycisk Metabolites (por. Rys. 5.1) i zadać początkowe stęŜenie S = 10 i początkowe stęŜenie P = 0 (Rys. 5.4). 12

Rys. 5.1

Rys. 5.2

Rys. 5.3

13

Po zdefiniowaniu modelu naleŜy określić parametry pracy programu, które obejmują: 1) wielkości, jakie program ma rejestrować, 2) czas trwania symulacji itd. Wejść na zakładkę Tasks (Rys. 5.5) i pozostawić zaznaczone pole wyboru Time course, czyli progresja reakcji, jednocześnie pilnując, by pole Steady state pozostawić niezaznaczone. Po naciśnięciu przycisku Edit moŜna wybrać wielkości, które program będzie w trakcie symulacji rejestrować (Rys. 5.5). Pojawi się okno (Rys. 5.6) w którym dokonujemy wyboru poprzez podświetlenie poŜądanej pozycji w rozwijanym menu i przyciśnięcie przycisku Add. Po lewej stronie okna przedstawione są schematycznie katalogi grupujące poszczególne wielkości; moŜna je rozwijać, klikając na znak plus. Po zaznaczeniu określonego katalogu w oknie środkowym pojawią się zawarte w nim wielkości, które moŜemy wybiórczo podświetlać i poprzez kliknięcie na Add dodawać do listy wielkości, których zmiany program będzie śledził w trakcie symulacji. Wybrane wielkości będą wyświetlone w prawej części okna. NaleŜy wybrać czas oraz przejściowe stęŜenia (transient concentrations pod metabolites) substratu i produktu: time, [S]t, [P]t (Rys. 5.6). Wybrane wielkości pojawią się w prawym polu okna Tasks jak na Rys. 5.5. NaleŜy jeszcze podać czas zakończenia reakcji End Time – 5 oraz ilość punktów, dla których program dokona obliczeń Points – 50 (Rys. 5.5) Wszystkie wprowadzane wielkości są wielokrotnością jednostek zdefiniowanych pod Units, które moŜemy odczytać w głównym oknie programu – zakładka Model Definition (Rys. 5.1) i których w trakcie ćwiczenia nie naleŜy zmieniać. Po zdefiniowaniu modelu oraz wybraniu parametrów pracy programu moŜna przeprowadzić symulację. Program rozpoczyna symulację po naciśnięciu przycisku Run (por. Rys. 5.5). Zapytani o nazwę pliku, w jakim program ma zachować wynik symulacji, wpisujemy swoje nazwisko. Aby obejrzeć wynik symulacji, klikamy myszą na zakładkę Plot, otwierającą okno (Rys. 5.7), w którym zadajemy sposób prezentacji wyników w postaci wykresu. Jako rodzaj wykresu – Type zaznaczamy opcję 2D, w polu osi 0X (X-axis) zaznaczamy czas (time), a w polu osi 0Y (Y-axis) zaznaczamy stęŜenie substratu i produktu czyli [S]t, [P]t. Na zakładce Plot zaznaczyć pole wyboru key. Pozostałe opcje wybieramy jak na Rys. 8. Po naciśnięciu przycisku Plot!, pojawi się wykres obrazujący zmiany stęŜenia substratu i produktu w czasie. Po otrzymaniu wykresu naleŜy wypełnić odpowiednie pola arkusza sprawozdania i odpowiedzieć na zadane pytania.

Model reakcji odwracalnej Nacisnąć File i wybrać New. W czasie definiowania modelu i określania parametrów pracy programu postępować analogicznie jak przy modelu reakcji nieodwracalnej, w razie potrzeby korzystając z powyŜej zamieszczonego opisu. Wpisać reakcję: S = P (zakładka Model Definition i przycisk Reactions), początkowe stęŜenia S = 10 i P = 0 (przycisk Metabolites), zdefiniować kinetykę przemiany S = P jako Mass action (reversible) i określić wartości stałych szybkości reakcji k (przycisk Kinetics). Odpowiednio, zaleŜnie od wariantu: wariant a) k1 = 1 i k2 = 1; wariant b) k1 = 1 i k2 = 2; wariant c) k1 = 2 i k2 = 1. Na zakładce Tasks wypełnić wszystko tak samo jak poprzednio, pamiętając o tym, by pole Steady state pozostawić niezaznaczone. Nacisnąć przycisk Run; zapytani o nazwę pliku w jakim program ma zachować wynik symulacji, wpisać swoje nazwisko i numer symulacji, np. 2, a po zakończeniu symulacji otrzymać wykres zmian stęŜeń S i P w czasie (zakładka Plot). Po otrzymaniu wykresu naleŜy wypełnić odpowiednie pola arkusza sprawozdania i odpowiedzieć na zadane pytania.

Reakcja, w której na jedną cząsteczkę powstającego produktu są wykorzystywane dwie cząsteczki substratu Wybrać File i New. Następnie zdefiniować reakcję: S + S -> P, stęŜenia początkowe S = 10 i P = 0, określić kinetykę przemiany jako Mass action (irreversible) i wpisać wartość stałej szybkości reakcji k = 0.1. Na zakładce Tasks po naciśnięciu Edit kazać programowi rejestrować czas oraz stęŜenia przejściowe S i P. End Time niech będzie równe 5, a Points – 50. NaleŜy pamiętać, by pole wyboru Stady state pozostało nie zaznaczone. Po przeprowadzeniu symulacji otrzymać wykres zmian stęŜeń substratu i produktu w czasie. Po otrzymaniu wykresu naleŜy wypełnić odpowiednie pola arkusza sprawozdania i odpowiedzieć na zadane pytania. 14

Rys. 5.4

Rys. 5.5

Rys. 5.6 15

B.

Model kinetyczny nieodwracalnej reakcji enzymatycznej wg Michaelisa–Menten

ZałoŜenia modelu: Powstanie kompleksu Enzym–Substrat (ES) jest koniecznym etapem katalizowanej enzymatycznie przemiany substratu S w produkt P. Reakcję charakteryzuje stała szybkości k1. Istnieją dwie drogi rozpadu kompleksu ES: 1) z odtworzeniem E i S, zachodząca ze stałą szybkości k2 oraz 2) z rozpadem kompleksu ES do E i P, zachodząca ze stałą szybkości kkat i ta przemiana jest wedle załoŜeń nieodwracalna. W rzeczywistości ten ostatni warunek jest spełniony przy niskim stęŜeniu P. k1 kkat E + S ↔ ES → E + P k2 Wybrać File i New. Aby zbudować model spełniający powyŜsze załoŜenia, po naciśnięciu przycisku Reactions wpisać równania kolejnych reakcji: E + S = ES i ES -> E + P, po wpisaniu kaŜdej z reakcji nie naleŜy zapomnieć o wciśnięciu przycisku Add. Dla obu reakcji w naszym modelu wybieramy typ kinetyki Mass action a wielkość wszystkich stałych kinetycznych określamy dla kolejnych wariantów a) na 1, b) na 2, c) na 2. Początkowe stęŜenia substratów i produktów określamy następująco: wariant a) S = 10, E = 1, ES = 0, P = 0; wariant b) S = 20, E = 1, ES = 0, P = 0; wariant c) S = 30, E = 1, ES = 0, P = 0. W zakładce Tasks zadajemy śledzenie zmian stęŜeń [S]t [E]t [ES]t [P]t (znajdujemy je w grupie metabolites katalogu transient concentrations) oraz początkowe stęŜenie substratu [S]i (znajdujemy je w grupie metabolites w katalogu initial concentrations) oraz czasu (Rys. 5.6). Czas zakończenia symulacji End Time – 25 oraz ilość punktów, dla których program dokona obliczeń, Points – 100. NaleŜy pamiętać o pozostawieniu pola wyboru Steady state niezaznaczonego. Po zdefiniowaniu modelu oraz wybraniu parametrów pracy programu moŜemy przeprowadzić symulację. Zapytani o nazwę pliku, w jakim program ma zachować wynik symulacji, wpisujemy swoje nazwisko i kolejny numer symulacji. Aby obejrzeć wynik symulacji klikamy myszą na zakładkę Plot, otwierającą okno, w którym zadajemy sposób prezentacji wyników w postaci wykresu, zaznaczamy czas na osi X i stęŜenia wszystkich reagentów, czyli [E]t [S]t [ES]t i [P]t na osi Y. Zaznaczyć pole wyboru Key. Otrzymany wykres naleŜy przerysować w odpowiednie pole arkusza sprawozdania. Na poniŜszym przykładzie zobaczymy, jak róŜnią się krzywe progresji (krzywe obrazujące zaleŜność ilości produktu od czasu), wykreślone dla róŜnych początkowych stęŜeń substratu. Otworzyć zakładkę Tasks i kazać programowi rejestrować szybkości drugiej reakcji: – J(R2), określającej szybkość powstawania produktu J(R2) (po wciśnięciu Edit wybrać w rozwijalnym menu steps a następnie fluxes). Program Gepasi umoŜliwia automatyczne zmienianie wielkości jednego z parametrów. Aby tak uczynić, naleŜy otworzyć zakładkę Scan, nacisnąć przycisk Enable (napis zmieni się na Disable) (Rys. 5.8). W lewym górnym oknie wyboru zaznaczyć initial concentrations, w prawym górnym [s]i i nacisnąć przycisk Add. Zadajemy wartości najniŜszą i najwyŜszą (Min = 1 i Max = 100) oraz Density (liczbę początkowych stęŜeń [s]i, jaką program wykorzysta do symulacji = 20). Naciskamy przycisk Run i po otwarciu zakładki Plot! Ŝądamy wykresu obrazującego zaleŜność [p]t od czasu oraz J(R2) od czasu oraz zaznaczamy opcję Multiplot. Wypełnić zadania określone w sprawozdaniu.

C.

Model hamowania współzawodniczego

Kinetykę hamowania współzawodniczego moŜna modelować za pomocą następujących reakcji: S + E = ES, ES -> E + P oraz E + I = EI. W tym modelu inhibitor oddziałuje tylko z wolną postacią enzymu, a związanie substratu do enzymu związanego z inhibitorem jest niemoŜliwe. Nacisnąć File oraz New. Zdefiniować następujące reakcje: S + E = ES, ES -> E + P oraz E + I = EI. Określić kinetykę wszystkich reakcji jako Mass action, wszystkie stałe określić jako równe jedności. Określić stęŜenie początkowe [S] na 50, [P] na 0 i [I] na 0, [EI] na 0, [ES] na 0, [E] na 1. Otworzyć zakładkę Tasks, nacisnąć Edit (por. rys. 5.6) i kazać programowi rejestrować czas: time, stęŜenia przejściowe: S, P, E, I, EI, ES (znajdujemy je w grupie Metabolites w katalogu transient concentrations) oraz stęŜenie początkowe [S]i (znajdujemy je w grupie Metabolites w katalogu initial concentrations). 16

NaleŜy pamiętać, by zaznaczone było okno wyboru Time course, a okno wyboru Steady state nie było zaznaczone. Wybrać czas zakończenia reakcji 70 i Points – 100. Przeprowadzić symulację i obejrzeć jej wynik w postaci wykresu: wybrać opcję Multiplot, wykreślić zaleŜności stęŜeń [S]t [P]t [I]t [EI]t [ES]t i [E]t od czasu. Nie zamykać okna z wykresami. Następnie wejść na zakładkę Model Definition i po wciśnięciu Metabolites zmienić stęŜenie początkowe I na 50. Ponownie przeprowadzić symulację i otrzymać odpowiednie wykresy. Wykonać polecenia określone w sprawozdaniu. Następnie zbadać, jak zmienia się szybkość reakcji w zaleŜności od stęŜenia substratu przy stałej ilości inhibitora. NaleŜy pozostawić stęŜenie początkowe [I] = 50, wejść na zakładkę Scan, wcisnąć Enable, wybrać [S]i (w grupie initial concentrations), nacisnąć Add, określić wartość minimalną na 50 a maksymalną na 500, Density = 20. Przeprowadzić symulację oraz otrzymać takie same jak poprzednio wykresy zmian stęŜenia produktu w zaleŜności od czasu. NaleŜy wypełnić odpowiednią część sprawozdania. Zbadać, jak zmiana szybkości tworzenia kompleksu enzym–inhibitor wpływa na wydajność hamowania. Zmienić stałą szybkości reakcji tworzenia kompleksu EI na równą 50, pozostawiając stałą szybkości jego rozpadu bez zmian ( zakładka Model Definition, okno Kinetics, stała k1). Przeprowadzić symulację, otrzymać takie same jak poprzednio wykresy. NaleŜy wypełnić odpowiednią część sprawozdania.

D.

Model hamowania niewspółzawodniczego

Inhibitor niewspółzawodniczy wiąŜe się z enzymem w innym miejscu niŜ substrat i zmienia jego aktywność katalityczną, nie wpływając na powinowactwo enzymu do substratu. Substrat moŜe się wiązać zarówno do wolnego enzymu, jak i do kompleksu enzym inhibitor, podobnie inhibitor moŜe się przyłączać do kompleksu enzym substrat zanim ten ulegnie rozpadowi uwalniając produkt i enzym. JeŜeli kompleks enzym–substrat–inhibitor nie moŜe ulec rozpadowi z wytworzeniem produktu to mamy czyste hamowanie niewspółzawodnicze. JeŜeli kompleks enzym–substrat–inhibitor moŜe rozpadać się do kompleksu enzym– inhibitor + produkt to mówimy o hamowaniu częściowo niewspółzawodniczym. Zaproponować schemat reakcji obrazujący model hamowania niewspółzawodniczego. Po zweryfikowaniu go u osoby, prowadzącej zajęcia korzystając z umiejętności zdobytych w poprzedniej części ćwiczenia, utworzyć w programie Gepasi model hamowania niewspółzawodniczego czystego i zbadać, jak wzrost początkowego stęŜenia substratu wpływa na wydajność hamowania niewspółzawodniczego przy stałym stęŜeniu inhibitora. Wypełnić zadania określone w sprawozdaniu.

17

Rys. 5.7

Rys. 5.8 18

E.

Wykreślenie krzywej progresji reakcji enzymatycznej oraz krzywej Linevera – Burka

Aby wykreślić odpowiednie krzywe, naleŜy dokonać pomiarów określających zaleŜności prędkości początkowej n0 od początkowego stęŜenia substratu [S]0. W oknie Reactions naleŜy podać S -> P. Odczytać jednostki jakich program uŜyje na zakładce Model Definition w polu Units. W oknie Kinetics określić typ kinetyki reakcji jako Henri – Michaeli – Menten. Zadać Km= 1.5 i Vmax = 0.00167. Jak w poprzedzających zadaniach na zakładce Tasks pozostawić niezaznaczone pole Steady state i zaznaczone pole Time course. End Time określić na 5, Points na 100. Zadać programowi śledzenie czasu, stęŜęnia początkowego substratu, stęŜenia substratu, stęŜenia produktu oraz szybkości reakcji – J(R1). Szybkość reakcji znajduje się w rozwijalnym menu wyboru pod steps i dalej fluxes. Na zakładce ‘Scan’, naleŜy wybrać zmienianie stęŜenia początkowego substratu, wartość Min określić na 0.5, Max na 10, Density na 5. Wartości stęŜeń początkowych substratu oraz odpowiadające początkowe prędkości reakcji będą odczytywane na zakładce ‘Time course’ (Rys. 5.9), na której moŜna śledzić, jak w czasie zmienia się prędkość reakcji i jak zmieniają się zadawane początkowe stęŜenia substratu [S]i (program Gepasi określa stęŜenie początkowe [S]0 jako [S]i). Po wciśnięciu przycisku Select Data polecić programowi wykreślanie [S]i i J(R1). Teraz kliknięcie na ‘Run’ na tej samej zakładce, Gepasi przeprowadzi kolejne symulacje przebiegu reakcji dla pięciu początkowych stęŜeń substratu. PoniewaŜ symulacja zachodzi szybko, naleŜy wykorzystać obecny na zakładce po prawej stronie suwak, w celu jej zwolnienia, co umoŜliwi notowanie danych, oraz przycisk ‘Pause’ umoŜliwiający czasowe przerwanie symulacji. Do określenia rodzaju kinetyki oraz stałych kinetycznych reakcji, student potrzebuje wartości początkowe stęŜenia substratu oraz odpowiadające im szybkości początkowe. NaleŜy pamiętać, Ŝe waŜna jest prędkość początkowa reakcji i to właśnie ją naleŜy odczytać z programu, po zatrzymaniu na chwilę reakcji przyciskiem ‘Pause’ – to z jaką prędkością reakcja zachodziła na początku najlepiej odczytać jako górną skalę na osi „y” małego, obecnego na zakładce wykresu. Na zakładce ‘Time course’ szybkość oznaczona jest jako ‘J(R1)’. Po zakończeniu pracy z Gepasi student powinien dysponować danymi szybkość początkowa/ stęŜenie początkowe dla kolejnych stęŜeń inhibitora. Otrzymane wartości naleŜy wprowadzić do arkusza sprawozdania, pamiętając o uŜytych jednostkach, czasami dość nietypowych, np. szybkość mamy wyraŜoną w mmol/s. NaleŜy przeliczyć na jednostki uŜyte w arkuszu. Następnie naleŜy wypełnić drugą część sprawozdania. PoniewaŜ do graficznego wyznaczenia stałych kinetycznych potrzebujemy wartości 1/[S]0 oraz 1/ n0 naleŜy dokonać odpowiednich przekształceń a następnie narysować, na jednym wykresie krzywą progresji vo=funkcja[S]0 a na drugim krzywą LineveraBurka: 1/ n0= funkcja(1/[S]0).

19

stęŜenie początkowe odpowiadająca szybkość początkowa

Rys. 5.9

20

Ćwiczenie 5b Przeszukiwanie enzymatycznych baz danych Sprawdzanie nazewnictwa i właściwości enzymów moŜna zacząć od bazy IUBMB Enzyme Nomenclature

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ Następnie na podanej stronie naleŜy wybrać polecenie Search lub klasę enzymów umieszczoną w tabelach List of Recommended Names for Enzymes lub Enzyme Subclasses znajdujących się w dalszej części strony macierzystej IUBMB Enzyme Nomenclature Po wybraniu poszukiwanego enzymu otwiera się strona opisująca podstawowe własności enzymu: nr EC katalizowaną reakcję chemiczną nazwy zwyczajowe i systematyczne Ze strony podstawowej enzymu w bazie IUBMB moŜna przejść do innych baz danych omawiających właściwości tego enzymu. W tym celu naleŜy kliknąć na odpowiedni skrót na stronie, co spowoduje przekierowanie do strony omawiającej wybrany enzym w nowej bazie enzymatycznej. Baza Brenda http://www.brenda-enzymes.org/ Na stronie tej bazy danych moŜna uzyskać szczegółowe informacje o właściwościach enzymu, m.in. o specyficzności substratowej i katalitycznej enzymu, stałych kinetycznych, kofaktorach, inhibitorach, występowaniu enzymu w organizmach i specyficzności tkankowej. W bazie tej podane są takŜe odnośniki do innych baz danych i jest cytowana literatura opisująca dany enzym. Baza ExPASy Proteomics Server Enzyme nomenclature database http://www.expasy.org Baza ExPASy umoŜliwia przejście do innych stron bazy ExPASy oraz innych baz danych. Jedną z moŜliwości jest przejście do strony omawiającej połoŜenie enzymu w szlakach metabolicznych (Biochemical Pathways; map number). TakŜe na stronie podstawowej enzymu w bazie ExPASy Enzyme dla określonego enzymu podane są kody dla białka enzymatycznego otrzymanego z określonego taksonu; kliknięcie na odpowiedni kod przekierowuje do bazy UniProtKB/Swiss-Prot. Na jej stronach umieszczone są informacje o budowie białkowej enzymu oraz moŜliwość przekierowania m.in. do baz dotyczących sekwencji cDNA lub genu kodującego enzym (Sequence databases) a takŜe struktury przestrzennej białka enzymatycznego (3D structure databases). Obejrzenie struktury 3D dla danego enzymu, o ile została opracowana, jest moŜliwe po przejściu do szeregu baz, np. RCSB PDB (RCSB Protein Data Bank) lub EC-PDB. Model enzymu moŜe być dostępny np. w postaci skryptu Java, a takŜe istnieje moŜliwość zaimportowania plików w róŜnych formatach kodujących obraz przestrzenny białka, np. w formacie PDB. Zaimportowany plik moŜna odtworzyć np. w programach Accelrys DS Visualizer (http://accelrys.com) lub DeepView (http://spdbv.vital-it.ch).

21

Ćwiczenie 6 Oczyszczanie dehydrogenazy mleczanowej z zastosowaniem chromatografii powinowactwa biologicznego na złoŜu Cibacron-Blue Sepaharose. Sporządzenie bilansu oczyszczania białka enzymatycznego Chromatografia powinowactwa. Chromatografia powinowactwa jest rodzajem chromatografii adsorpcyjnej, w której oczyszczana cząsteczka jest specyficznie i odwracalnie adsorbowana przez komplementarne łączenie się ze składnikiem (ligandem) immobilizowanym na nierozpuszczalnym złoŜu chromatograficznym (matrycy). Wysoka selektywność rozdziału wynikająca z naturalnej specyficzności reagujących cząsteczek umoŜliwia nie tylko uzyskanie w jednym etapie znacznego (nawet 1000-krotnego) stopnia oczyszczenia danego związku, ale takŜe pozwala na stosowanie w procesie oczyszczania duŜych objętości roztworów wyjściowych. Z tych względów chromatografia powinowactwa jest stosowana do oczyszczania związków w złoŜonych mieszaninach, pozwalając na oddzielenie małych ilości określonego materiału biologicznego (np. enzymu) od duŜej ilości substancji towarzyszących. Zasadę metody chromatografii powinowactwa przedstawia Rys. 6.1. Biospecyficzny ligand (L) jest związany kowalencyjnie ze matrycą (złoŜem) chromatograficzną (M) umieszczoną w kolumnie. PoniewaŜ immobilizowany ligand wykazuje powinowactwo wiązania do substancji oczyszczanej (S), moŜe w określonych warunkach utworzyć specyficzny kompleks L–S. Pozostałe, niespecyficzne substancje znajdujące się w materiale wyjściowym moŜna usunąć z kolumny chromatograficznej, nie naruszając trwałości kompleksu L–S. Po ich usunięciu, zmieniając warunki elucji, moŜna specyficznie oddysocjować substancję S.

Rys. 6.1 Zasada chromatografii powinowactwa biologicznego Matryca uformowana jest z ziaren Ŝelu zbudowanego z polisacharydów. Najczęściej stosuje się Ŝel o nazwie Sepharose otrzymywany z agaru, będącego kompleksem agarozy (Rys. 6.2) i agaropektyny. Grupy hydroksylowe reszt cukrowych w agarozie mogą być łatwo wykorzystane do kowalencyjnego dołączania ligandu. Porowata struktura Ŝelu umoŜliwia dołączenie ligandu we wnętrzu matrycy i związanie nawet duŜych cząsteczek ligandu. Sepharose wykazuje bardzo małą niespecyficzną adsorpcję, co jest waŜne, poniewaŜ istota chromatografii powinowactwa polega na specyficznej interakcji między ligandem i substancją oczyszczaną. Ponadto taka matryca jest stabilna i mało wraŜliwa na warunki środowiska, takie jak 22

niskie i wysokie pH lub detergenty. Ziarnista forma Ŝelu zapewnia szybki przepływ eluatu, co ułatwia zbieranie poszczególnych frakcji z kolumny. W zaleŜności od zastosowanej procedury oczyszczania stosuje się matryce o róŜnej wielkości ziaren Ŝelu i stopniu usieciowania polisacharydów; w niniejszym ćwiczeniu uŜyto Ŝel Sepharose 4B. Rys. 6.2 Agaroza

HO CH2 HO H

O

O

H

H

HO

H

O

H O H

O

H

H OH

O H

Ligand. Wybór ligandu do chromatografii powinowactwa jest uwarunkowany dwoma czynnikami. Po pierwsze, ligand powinien wykazywać specyficzność i odwracalne powinowactwo wiązania do substancji oczyszczanej. Po drugie, powinien mieć dające się chemicznie modyfikować grupy, co pozwoliłoby przyłączać go do matrycy bez naruszania jego aktywności wiązania substancji oczyszczanej. Jako ligandy mogą być zastosowane barwniki zawierające grupy chlorotriazynylowe, które łatwo reagują w alkalicznym środowisku z matrycami polisacharydowymi, tworząc trwałe barwne produkty. Adsorpcja białek do immobilizowanych barwników triazynowych moŜe dotyczyć nie tylko specyficznych oddziaływań w miejscu aktywnym (tzw. adsorpcja biospecyficzna), ale takŜe oddziaływań jonowych i hydrofobowych (adsorpcja niespecyficzna). Zastosowany w ćwiczeniu Cibacron-Blue 3GA wykazuje + specyficzność w stosunku do dehydrogenaz współdziałających z NAD (dh. mleczanowa, dh. jabłczanowa, dh. alkoholowa). Stosując ten barwnik lub barwniki pokrewne, moŜna specyficznie oczyszczać takŜe + dehydrogenazy współdziałające z NADP (np. dh. glukozo-6-fosforanowa, dh. glutaminianowa) oraz kinazy (np. kin. adenylanowa, kin. pirogronianowa). Enzymy mogą być wymyte z kolumny albo niskim stęŜeniem koenzymu, albo (bardziej ekonomicznie) przez wzrastającą siłę jonową buforu elucyjnego. Do oczyszczania + tego typu enzymów moŜna takŜe stosować matrycę związaną z koenzymami np. AMP-Sepharose, NAD Sepharose. O

NH2 SO3Na

SO3Na H N N

O

HN

N H SO3Na

N N

O

śel agarozowy

Rys. 6.3 Cibacron-Blue sprzęgnięty z Ŝelem agarozowym

23

Celem ćwiczenia jest otrzymanie oczyszczonej frakcji dehydrogenazy mleczanowej (L-lactate dehydrogenase – LDH, EC 1.1.1.27) z preparatu cytosolowego wątroby lub nerki królika. W tym celu wykorzystuje się matrycę przygotowaną przez sprzęgnięcie Cibacron-Blue 3GA z Sepharose 4B. Enzym oczyszcza się na kolumnie wypełnionej tak przygotowanym złoŜem Cibacron-Blue Sepharose, wymywając kolejne frakcje wzrastającą siłą jonową buforu elucyjnego. W otrzymanych frakcjach oznacza się aktywność enzymu oraz stęŜenie białka. Oznaczenia te umoŜliwiają obliczenie stopnia oczyszczania enzymu i wydajność procedury. Zastosowanie chromatografii na Ŝelu Cibacron-Blue Sepharose pozwala w jednym etapie na 35-krotne oczyszczenie enzymu z wydajnością około 75%. Oznaczenia aktywności LDH we frakcji cytosolowej i eluatach. Zasady wyznaczenia szybkości początkowej reakcji enzymatycznej. Reakcję enzymatyczną zachodzącą w stanie oddalonym od stanu równowagi moŜna opisać następującym wzorem: E + S ↔ ES → E + P gdzie E – enzym S – substrat ES – kompleks enzym–substrat P – produkt W czasie trwania tak zdefiniowanej reakcji enzymatycznej moŜna wyróŜnić trzy fazy. Pierwsza z nich, faza prestacjonarna (I) trwa kilka milisekund i rozpoczyna się z chwilą dodania enzymu do mieszaniny inkubacyjnej. Następuje wtedy szybkie tworzenie kompleksu enzym–substrat ES i spadek stęŜenia wolnego enzymu E. Druga faza, stacjonarna (II) trwa wystarczająco długo, aby moŜliwy był pomiar szybkości reakcji metodami powszechnie stosowanymi w laboratoriach biochemicznych. Charakterystyczne cechy fazy stacjonarnej to stała szybkość reakcji, stałe stęŜenie kompleksu ES i enzymu E. Gdy stęŜenie substratu obniŜy się na tyle, Ŝe zacznie obniŜać się stęŜenie kompleksu ES i spada szybkość reakcji, zaczyna się trzecia, poststacjonarna (III) faza reakcji (Rys. 6.4). 0,8

I

St enie [jed. umowne]

0,6

III

II Substrat

0,4

Stan stacjonarny

Produkt

0,2

Kompleks ES E 0 0

10

20

30

40

50

60

70

Czas trwania reakcji, t [jed. umowne]

Rys. 6.4 Zmiany stęŜenia substratu [S], produktu [P], wolnego enzymu [E] i kompleksu enzym– substrat [ES] w czasie trwania jednosubstratowej reakcji enzymatycznej Fazy reakcji enzymatycznej: I – prestacjonarna, II – stacjonarna, III – poststacjonarna. Według teorii sformułowanej przez Michaelisa i Menten w czasie fazy stacjonarnej szybkość reakcji V jest stała i moŜna ją odnieść do początkowego stęŜenia substratu [S0]. Szybkość tę, określaną mianem szybkości początkowej reakcji enzymatycznej V0, naleŜy wyznaczyć z początkowego, prostoliniowego odcinka zmian stęŜeń substratu (S) lub produktu (P). Zmiany stęŜeń reagentów w czasie moŜna mierzyć jako zmiany w 24

czasie absorbancji charakterystycznej dla jednego z reagentów (Rys. 6.5). Przy badaniu aktywności enzymu w określonym preparacie naleŜy wyznaczyć szybkość początkową w warunkach pełnego wysycenia enzymu substratu, tzn. przy stęŜeniu substratu znacznie przekraczającym wartość stałej Michaelisa dla danego enzymu; wyznaczona V0 powinna być wtedy zbliŜona wartością do Vmax. Oczyszczana w ćwiczeniu dehydrogenaza mleczanowa (LDH) katalizuje reakcję: +

pirogronian + NADH ↔ mleczan + NAD

Przy wyznaczaniu aktywności LDH w cytosolu i eluatach substraty reakcji, NADH i pirogronian, są dodawane w stęŜeniach wysycających, co pozwala wyznaczyć szybkość maksymalną dla danej ilości enzymu. Oznaczenie polega na pomiarze w czasie spadku absorbancji przy długości fali 340 nm, odpowiadającej maksimum absorbancji NADH. Wartość V0 (Rys. 6.5) wyliczona z prostoliniowego odcinka wykresu w jednostkach absorbancji na minutę musi zostać wyraŜona jako zmiana ilości substratu w jednostce czasu, tzn. w µmolach NADH min–1 (U). W tym celu naleŜy skorzystać ze wzoru Lamberta–Beera wiąŜącego absorbancję ze stęŜeniem substancji absorbującej. Milimolowy współczynnik absorpcji dla NADH przy długości fali 340 nm wynosi , ε= 6,22 mM–1 cm–1. 0

V0

Absorbancji przy 340 nm

-0,06

-0,12

-0,18

-0,24

-0,30 0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

Czas [min]

Rys. 6.5 Wyznaczanie wartości V0 w jednostkach absorbancji min–1 z prostoliniowego odcinka krzywej spadku absorbancji przy 340 nm w czasie trwania reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową (przykład) Oznaczanie białka z zastosowaniem Erytrozyny B. Zawartość białka we frakcjach cytosolowej i wyeulowanych z kolumny oznaczyć metodą kolorymetryczną z zastosowaniem erytrozyny, która w połączeniu z białkami w środowisku kwaśnym tworzy róŜowo zabarwiony kompleks o maksymalnej wartości absorbancji przy 545 nm. O C OH I

O

HO

I

I

Rys. 6.6 Erytrozyna B (2', 4', 5', 7'- tetrajodofluoresceina) 25

Wykonanie Materiały i odczynniki 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

9. 10. 11. 12. 13. 14.

do przygotowania kolumny chromatograficznej i oczyszczenia LDH Cibacron-Blue 3GA (20 mg/ml, roztwór wodny) Sepharose 4B 0,5 M roztwór Na2CO3 (2 ml) 0,02% roztwór NaN3 (2 ml) 1 M roztwór NaCl (10 ml) 0,9% roztwór NaCl (50 ml) 0,1 M bufor Tris-HCl pH 7,5 (bufor do równowaŜenia kolumny) (25 ml) 0,1 M bufor Tris-HCl pH 7,5 zawierający 1 M KCl (bufor do wymywania frakcji zawierających enzym) (25 ml) do oznaczania aktywności LDH Mieszanina reakcyjna do oznaczania aktywności LDH zawierająca 40 mM bufor Tris-HCl pH 7,5, 25 mM KCl, 6 mM EGTA (przygotować 10 ml roztworu) Roztwór NADH o stęŜeniu 10 mg ml–1 (180 µl) 0,1 M roztwór pirogronianu sodu (350 µl) do oznaczania białka Standardowy odczynnik erytrozyny B, 30 mg/ml (odczynnik trwały przez 6 miesięcy – 0,5 ml roztworu) 25 mM bufor cytrynianowy pH = 3,0. Rozcieńczyć przygotowany 0,1 M bufor cytrynianowy pH 3,0 (25 ml) Roztwór erytrozyny B – przyrządzić bezpośrednio przed uŜyciem. 0,025 ml standardowego odczynnika erytrozyny B odmierzyć do kolby miarowej na 25 ml i uzupełnić do kreski 25 mM buforem cytrynianowym pH 3,0. Roztwór jest trwały przez 3 godziny (przygotować 25 ml roztworu)

Materiały pomocnicze i aparatura Kolumna chromatograficzna, zamraŜarka –80°C, pipety automatyczne, spektrofotometr, kuwety, szpatułki, mikromieszadło

A. Sprzęganie Cibacron-Blue 3GA z Sepharose 4B oraz przygotowanie kolumny wypełnionej Cibacron-Blue Sepharose Małą ilość (około 2,5 g) Sepharose 4B przemyć na lejku Schotta G3 wodą destylowaną i Ŝel przenieść do plastikowej probówki zamykanej korkiem. Dodać 0,6 ml 0,5 M roztworu Na2CO3 i 0,6 ml wodnego roztworu zawierającego 20 mg/ml Cibacron-Blue 3GA. Zawartość probówki starannie wymieszać i pozostawić na 2 dni w 45°C w termostacie, kilkakrotnie mieszając w czasie inkubacji. Następnie uzupełnić probówkę do objętości 10 ml wodą destylowaną i usunąć niezwiązany barwnik, odwirowując Ŝel w wirówce laboratoryjnej przez 10 min przy 2000 obr/min i odrzucając supernatant. Przemywać Ŝel wodą destylowaną aŜ do zaniku niebieskiej barwy supernatantu. Kolumnę napełnić 2–4 ml Ŝelu Cibacron-Blue Sepharose. Przemyć kilkoma objętościami wody destylowanej. Przemyty Ŝel przechowywać w 4°C w obecności 0,02% NaN3. Przy dłuŜszym przechowywaniu moŜe nastąpić częściowe uwolnienie barwnika i wtedy matrycę przemywa się roztworem 1 M NaCl (2–3 ml). W celu zrównowaŜenia kolumny przepłukać ją trzykrotną objętością 0,1 M buforu TrisHCl pH 7,5. Studenci otrzymują przygotowaną i zrównowaŜoną kolumnę

B.

Otrzymywanie frakcji cytosolowej z wątroby królika

Uwaga: Studenci otrzymują zamroŜoną frakcję cytosolową Wątrobę królika zhomogenizować w łaźni lodowej w homogenizatorze Pottera w roztworze 0,9% NaCl (1 g tkanki na 5 ml roztworu). Homogenat wirować przez 20 minut przy 14 000 g w temp. 4oC, 26

otrzymany supernatant (frakcja cytosolowa) przechowywać w 1–2 ml porcjach zamroŜonych w –80°C. Cytosol po rozmroŜeniu i dokładnym wymieszaniu, zwirować w temp. 4oC w mikrowirówce MPW 211 przy 13 000 obr/min przez 10 min., a otrzymany supernatant uŜywać do naniesienia na kolumnę z Cibacron-Blue Sepharose. Oznaczyć we frakcji cytosolowej aktywność właściwą dehydrogenazy mleczanowej (patrz D) i zawartość białka (patrz E).

C.

Adsorpcja i elucja dehydrogenazy mleczanowej (LDH) z frakcji cytosolowej

UŜywane roztwory i kolumna powinny mieć temperaturę pokojową. Roztwór białka frakcji cytosolowej (0,5–1 ml) nakłada się na złoŜe pipetą automatyczną. Gdy roztwór wniknie w Ŝel, naleŜy dodać kilka kropel buforu do równowaŜenia w celu uniemoŜliwienia zapowietrzenia kolumny, a następnie kolumnę zamknąć i pozwolić na zrównowaŜenie frakcji cytosolowej z immobilizowanym ligandem przez ok. 15 minut. Następnie kolumnę przemyć 4,5 ml 0,1 M buforu Tris-HCl pH 7,5, zbierając do ponumerowanych probówek 3 frakcje po 1,5 ml eluatu. W dalszej kolejności kolumnę przemyć 10,5 ml 0,1 M buforu Tris-HCl pH 7,5 zawierającego 1 M KCl, zbierając do ponumerowanych probówek 7 frakcji po 1,5 ml eluatu. W trakcie zbierania eluatu probówki naleŜy umieścić w łaźni lodowej. We wszystkich próbach oznaczyć aktywność enzymu (patrz D) i stęŜenie białka (patrz E). Jeśli oznaczenia nie wykonuje się tego samego dnia, próbki zamrozić w –80°C. Na koniec przemyć kolumnę (bez zbierania frakcji) 4 ml 0,1 M buforu Tris-HCl pH 7,5 zawierającego 1 M KCl, a następnie 8 ml buforu Tris-HCl pH 7,5.

D.

Oznaczenia aktywności LDH we frakcji cytosolowej i eluatach

Do kuwet o poj. 1 ml odmierzyć po 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej, 10 µl NADH oraz frakcję cytosolową (5 µl frakcji cytosolowej nerki lub 5 µl 5–10-krotnie rozcieńczonej 0,9% NaCl frakcji cytosolowej wątroby) i wodę w takiej objętości, by w chwili rozpoczęcia reakcji po dodaniu 20 µl pirogronianu całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 1 ml. Zawartość kuwety wymieszać plastikową bagietką i zmierzyć wartość absorbancji NADH przy 340 nm, która powinna wynosić od 0,600 do 0,800. Po 2 minutach inkubacji dodać 20 µl pirogronianu i natychmiast wymieszać roztwór. W momencie dodania pirogronianu uruchomić pomiar czasu i notować zmiany absorbancji NADH co 15 sekund przez 2–3 minuty. W analogiczny sposób oznaczać aktywność enzymu w kolejnych frakcjach eluatu z kolumny, odmierzając 25–100 µl eluatu otrzymanego po przepuszczeniu przez kolumnę frakcji cytosolowej. Aktywność całkowitą enzymu (µmol min–1) w kaŜdej z badanych prób naleŜy wyznaczyć z prostoliniowego odcinka krzywej progresji.

E.

Oznaczanie białka z zastosowaniem Erytrozyny B

Przygotować próbę materiałową "0" dodając do probówki 75 µl wody i 1,4 ml roztworu erytrozyny B. Do probówki oznaczonej "C" odmierzyć 30 µl 10-krotnie rozcieńczonego cytosolu, natomiast do probówek oznaczonych numerami od 1 do 10 odmierzyć po 30 µl nierozcieńczonych eluatów. Następnie do probówek C i 1-10 odmierzyć po 1,4 ml roztworu erytrozyny B (przygotowanego według punktu 14). Następnie do tych próbówek dodać po 45 µl wody. Próby zamieszać, a następnie probówki umieścić na 10 minut w bloku grzejnym (temperatura 90–95°C). Próby schłodzić do temperatury pokojowej i oznaczyć wartości absorbancji przy długości fali 545 nm względem próby materiałowej "0". Zawartość białka w próbach odczytać z przygotowanej przez prowadzących ćwiczenia krzywej wzorcowej.

F.

Opracowanie wyników

Zanotowane dane pomiarowe naleŜy przeliczyć, posługując się arkuszem sprawozdania. Zmiany wartości absorbancji przy 340 nm w czasie naleŜy odłoŜyć na wykresach i wyliczyć szybkość początkową V0 = ) absorbancji min–1. Otrzymane wyniki przeliczyć na aktywność całkowitą naniesionego na kolumnę cytosolu lub całkowitą aktywność danej frakcji w µmol min–1. Na podstawie wartości absorbancji przy 545 nm wyliczyć całkowitą zawartość białka w cytosolu naniesionym na kolumnę i poszczególnych frakcjach elucyjnych. Wykreślić wykres zaleŜności zawartości białka (mg we frakcji) i aktywności enzymatycznej (U całkowita frakcji) od numeru eluowanej próby (patrz rys. 6.7). NaleŜy obliczyć aktywność właściwą (µmol min–1 mg–1 białka) w cytosolu i we wszystkich frakcjach eluatu. Podać aktywność całkowitą eluatu (suma 27

0,80

0,60

0,60

0,40

0,40

0,20

0,20

Aktywno ca kowita frakcji [U]

-1

0,80

Ca kowita zawarto bia ka we frakcji [mg ml ]

aktywności wszystkich wyeluowanych próbek) oraz wydajność oczyszczania (całkowita aktywność eluatu dzielona przez całkowitą aktywność cytosolu) oraz stopień oczyszczenia we frakcji najaktywniejszej (aktywność właściwa próbki/aktywność właściwa cytosolu). Wyniki zestawić w tabeli.

0

0 1

2

3

4

6

5

Nr frakcji

7

8

9

10

Rys. 6.7 Aktywność enzymatyczna oraz zawartość białka w eluowanych frakcjach (przykład)

28

Zalecana literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6 7. 8.

Stryer L., Biochemia, PWN, Warszawa 2005 Murray R.K., Granner D.K., Rodwell V.W., Ilustrowana Biochemia Harpera, PZWL, Warszawa 2008 Zgirski A., Gondko R., Obliczenia biochemiczne, PWN, Warszawa 1998 Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.), Ćwiczenia z biochemii, PWN, Warszawa 2003 Witwicki J., Ardelt W. (red), Elementy enzymologii, PWN, Warszawa 1984 Cornish-Bowden A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. Buttrrworths, London 2004 strona WWW Cornish-Bowdena: http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mcainfo.htm Gupta M.N., Roy I., Enzymes in organic media, European Journal of Biochemistry 271 (2004) 25752583 Cao L., Van Langen L., Sheldon R.A., Immobilised enzymes: carrier-bound or carrier-free, Current Opinion in Biotechnology 14 (2003) 387-394

Strona główna NC-IUBMB, nomenklatura enzymów: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ Baza enzymatyczna Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/ Baza enzymatyczna Expasy: http://www.expasy.ch Strona główna programu Gepasi: http://www.gepasi.org/ Strona główna programu Copasi: http://www.copasi.org/tiki-index.php

Regulamin pracy w laboratorium 1. 2. 3. 4. 5.

6.

7. 8.

9. 10.

Podczas pracy w laboratorium konieczny jest fartuch i odpowiednie obuwie. W pracowni nie wolno jeść ani palić oraz uŜywać kosmetyków. Zabrania się uŜywania naczyń laboratoryjnych do celów spoŜywczych. Ubranie wierzchnie naleŜy pozostawić w szatni, natomiast torby, teczki itp. składać w pracowni w miejscu do tego przeznaczonym. KaŜdy student jest odpowiedzialny za utrzymanie porządku w pracowni. Nie utrudniajmy pracy sobie, kolegom i prowadzącym ćwiczenia. NaleŜy specjalnie dbać o aparaturę. Przed przystąpieniem do pracy naleŜy zapoznać się z instrukcją obsługi. Zachować szczególną ostroŜność w czasie pracy z urządzeniami elektrycznymi. Po zakończeniu ćwiczeń naleŜy pozostawić aparat w takim stanie, aby mógł być bez przeszkód i bezpiecznie uŜyty przez następną osobę. Z rozpuszczalnikami organicznymi niskowrzącymi moŜna pracować wyłącznie w pomieszczeniach przystosowanych do tego celu. Pozostałości odczynników organicznych naleŜy zbierać w specjalnie oznakowane naczynia. Alkohol uŜywany w laboratoriach skaŜony jest w dawkach niebezpiecznych dla zdrowia. Roztwory kwasów, zasad i innych substancji Ŝrących uŜywać w wyznaczonych miejscach. Stosować okulary i rękawice ochronne. Rozlane Ŝrące płyny naleŜy natychmiast wytrzeć. Skórę oparzoną kwasem lub zasadą naleŜy spłukać dokładnie bieŜącą wodą, następnie przemyć 5% roztworem NaHCO3 (kwas) lub 2% CH3COOH (zasada). Mając do czynienia z silnie trującymi związkami, naleŜy zachować szczególną czystość rąk (rękawice ochronne) i miejsca pracy. Do pipetowania trucizn uŜywać specjalnych gruszek lub nasadek na pipety. Ostatnia osoba opuszczająca pracownię powinna sprawdzić, czy wszystkie urządzenia, gaz i woda są wyłączone. Studenci nie mogą pracować bez opieki pracownika dydaktycznego.

O kaŜdym, nawet drobnym wypadku naleŜy natychmiast powiadomić prowadzącego ćwiczenia.

29

Spis treści

1.

Oznaczenia enzymatyczne w diagnostyce medycznej. Oznaczanie aktywności aminotransferaz w surowicy krwi królika

1

2.

Wpływ rozpuszczalników organicznych na stabilność enzymów na przykładzie dehydrogenazy alkoholowej

3

3.

Zastosowanie fluorymetrii w badaniach biochemicznych i biomedycznych

5

4.

Zastosowanie enzymu do produkcji leku. Wykorzystanie tyrozynazy izolowanej z pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus) do wytwarzania L-DOPA

7

5.

Badanie kinetyki reakcji enzymatycznych przy uŜyciu programu komputerowego Gepasi Przeszukiwanie enzymatycznych baz danych

11

6.

Oczyszczanie dehydrogenazy mleczanowej z zastosowaniem chromatografii powinowactwa biologicznego na złoŜu Cibacron-Blue Sepaharose. Sporządzenie bilansu oczyszczania białka enzymatycznego

19

Skrypt przygotowali pracownicy Zakładu Regulacji Metabolizmu: Jadwiga Bryła, Jakub DroŜak, Maciej Garstka, Adam Jagielski, Robert Jarzyna, Anna Kiersztan, Zbigniew Kaniuga, Katarzyna Winiarska

30