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Untersuchung der Seneszenz in Normalgewebszelllinien im Vergleich zur Apoptoseinduktion

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Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau

zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent.

vorgelegt von Alexander Friedrich Kühlwein aus Lauf an der Pegnitz

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Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler

Gutachter:

PD Dr. Luitpold Distel

Gutachter:

Prof. Dr. Rainer Fietkau

Tag der mündlichen Prüfung:

02.September 2014

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gewidmet meiner Mutter

IV Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung ................................................................................................. 1 1.1 Hintergrund und Ziele........................................................................................ 1 1.2 Methoden .......................................................................................................... 1 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen ....................................................................... 1 1.4 Praktische Schlussfolgerungen......................................................................... 2 2. Abstract .................................................................................................................. 3 2.1 Background and Aims ....................................................................................... 3 2.2 Methods ............................................................................................................ 3 2.3 Results and observations.................................................................................. 3 2.4 Conclusion ........................................................................................................ 4 3. Einleitung................................................................................................................ 5 3.1 Zellalterung ....................................................................................................... 5 3.2 H2Ax ................................................................................................................. 5 3.3 β-Galactosidase Aktivität................................................................................... 6 4. Material und Methoden ........................................................................................... 7 4.1 Gewinnen und Pflege der Zellkultur .................................................................. 7 4.2 Immunostaining................................................................................................. 8 4.2.1 Prinzip ........................................................................................................ 8 4.2.2 Versuchsvorbereitung................................................................................. 8 4.2.3 Bestrahlung ................................................................................................ 9 4.2.4 Fixierung und Permeabilisierung ................................................................ 9 4.2.5 Fluoreszenzfärbung.................................................................................. 10 4.2.6 Bildanalyse ............................................................................................... 11 4.3 Farbstoffe für die flusszytometrische Messung ............................................... 12 4.3.1 Messung von DNA und RNA Gehalt......................................................... 12 4.3.2 Apoptose und Nekrose Detektion durch Annexin V und 7 AAD ............... 13 4.3.3 Detektion der β-Galactosidase-Aktivität durch Färbung mit C12 FDG ..... 15 4.3.4 CD 44 ....................................................................................................... 15 4.4 Flusszytometrie ............................................................................................... 16 4.4.1 Prinzip ...................................................................................................... 16 4.4.2 Versuchsvorbereitung............................................................................... 17 4.4.3 Bestrahlung .............................................................................................. 17 4.5 Färbungen für die flusszytometrische Messung.............................................. 18 4.5.1 Vorbereitung zur Färbung......................................................................... 18 4.5.2 Färbeprotokolle für die flusszytometrische Messung................................ 18 4.5.2.1 Apoptose/Nekrose Detektion ............................................................. 18 4.5.2.2 Quantitative Bestimmung des RNA-Gehalts ...................................... 19 4.5.2.3 Detektion der β-Galactosidase Aktivität ............................................. 19 4.6 Flusszytometrische Analyse............................................................................ 19 4.6.1 Erhebung der Daten ................................................................................. 19 4.6.2 Datenauswertung ..................................................................................... 20 5. Ergebnisse............................................................................................................ 21 5.1 Immunostaining............................................................................................... 21 5.1.1 H2Ax......................................................................................................... 24 5.1.2 BP53 p1778.............................................................................................. 29 5.2 Flusszytometrische Analyse............................................................................ 34

V 5.2.1 Darstellung der Überlebensraten der Zellen............................................. 35 5.2.2 Veränderung der RNA-Menge .................................................................. 36 5.2.3 Verschiebung des Zellzyklus durch Bestrahlung ...................................... 37 5.2.4 Zunahme an apoptotischen und nekrotischen Zellen ............................... 39 5.2.5 Nachweis von CD 44 ................................................................................ 40 5.2.6 Autofluoreszenz........................................................................................ 41 5.2.7 Seneszenz assoziierte β-Galactosidase Aktivität ..................................... 42 6. Diskussion ............................................................................................................ 44 7. Literaturverzeichnis............................................................................................... 46 8. Abkürzungsverzeichnis......................................................................................... 48 9. Anhang ................................................................................................................. 49 10. Danksagung ....................................................................................................... 51 11. Lebenslauf ...................................................... Fehler! Textmarke nicht definiert.

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1. Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele Das Auftreten von Nebenwirkungen ausgelöst durch ionisierende Strahlung ist eine zentrale Thematik in der heutigen Tumortherapie. Hierbei wurden bereits des Öfteren DNA Doppelstrangbrüchen beschrieben, die durch den Einfluss der Strahlentherapie entstanden oder auf den Alterungsprozess und die damit einhergehende Abnahme der Fähigkeit der Zellen diese zu reparieren zurückzuführen waren. Das Ziel dieser Arbeit war es durch ionisierende Strahlung ausgelöste prämature Seneszenz bei humanen Fibroblasten nachzuweisen. Diese sollte des Weiteren mit anderen Zelltodesarten wie Apoptose und Nekrose hinsichtlich ihrer Induktion und Kinetik untersucht werden um Aufschlüsse über deren Bedeutung beim Auftreten von Nebenwirkungen in der Radiotherapie herauszustellen.

1.2 Methoden Es wurde die humane Fibroblastenzelllinie P60 untersucht. Die strahleninduzierten DNADoppelstrangbrüche wurden mit anti-ɣH2AX und anti- bBP53p1778 Immunostaining dargestellt, wobei die gefärbten Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop photographiert und ausgewertet wurden. Stressbedingte Alterung, Apoptose- und Nekroseinduktion wurden mithilfe eines Flusszytometers untersucht. Hierbei wurden die Zellen nach der jeweiligen Reparaturzeit mit speziellen Fluoreszenzfarbstoffen behandelt, um DNA- und RNA- Gehalt, β-GalaktosidaseAktivität, sowie Apoptose- und Nekrosemarker darzustellen. Die Reparaturzeiten betrugen jeweils 48 Stunden, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen und 4 Wochen. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Die untersuchte Fibroblastenzelllinie P60 zeigte eine steigende Anzahl an ɣ-H2Ax-Foci, je höher die Bestrahlungsintensität gewählt wurde. In Bezug auf die unterschiedlichen Reparaturzeiten war der Peak bei 48 Stunden, die Anzahl sank danach stetig ab. Nach 4 Wochen war ein erneuter Peak zu verzeichnen, der auf die Entstehung großer Zellen mit überdurchschnittlicher Proteinaktivität deuten ließ. Durch die flusszytometrische Analyse konnte bei höherer Bestrahlungsintensität und längerer Reparaturzeit ein nahezu linearer Anstieg der β-Galactosidase-Aktivität, und damit der Anteil seneszenter Zellen nachgewiesen werden. Der Anstieg apoptotischer oder nekrotischer Zellen war deutlich geringer ausgeprägt.

2 1.4 Praktische Schlussfolgerungen Die praktische Frage dieser Arbeit war es, welcher Zusammenhang zwischen den durch ionisierende Strahlung ausgelösten Failsafe Programmen und dem Auftreten von Nebenwirkungen im gesunden Gewebe bei der Radiotherapie besteht. Hier muss erkannt werden, dass der Fakt des vermehrten Auftretens von Seneszenz im Gegensatz zu Apoptose und Nekrose bei Strahlendosen einen länger anhaltenden Negativeffekt im umliegenden Bindegewebe darstellt. Während apoptotische oder nekrotische Zellen zeitnah vom Körper eliminiert werden, verbleiben seneszente Zellen im Körper und können eine Gewebsregeneration negativ beeinträchtigen.

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2. Abstract

2.1 Background and Aims The occurrence of side effects caused by ionizing radiation is a key issue in today´s cancer therapy. In this case it has regularly been reported of DNA double-strand breaks caused by the influence of radiation therapy or due to the aging process and the concomitant decrease in the ability of these cells to repair. The aim of this work was to prove premature senescence induced by ionizing radiation in human fibroblasts. This should be further investigated with other types of cell death such as apoptosis and necrosis in their induction and kinetics highlighting conclusions about their significance in the occurrence of side effects in radiotherapy.

2.2 Methods The human fibroblast cell line P60 was studied. The radiation-induced DNA double-strand breaks have been visualized with anti-ɣH2Ax and anti bBP53p1778 immunostaining, the stained cells were photographed and analysed under a fluorescence microscope. Stressrelated aging, necrosis and apoptosis were analysed using the flow cytometer. In this case the cells were stained according to the respective repair time with special fluorescent dyes to show DNA and RNA content, β-galactosidase activity, and apoptosis and necrosis. The repair times were, respectively, 48 hours, 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks.

2.3 Results and observations The studied fibroblast cell line P60 showed an increasing number of ɣ-H2Ax-Foci, the higher the intensity of irradiation was chosen. With respect to the different times for repair, the peak was after 48 hours and the foci number decreased steadily thereafter. After 4 weeks, a renewed peak was observed, which could indicate the emergence of large cells with above average protein activity. By flow cytometric analysis, it was at a higher radiation dose and a longer time to repair an almost linear increase in β-galactosidase activity, and thus the percentage of senescent cells detected. The increase of apoptotic or necrotic cells was significantly less pronounced.

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2.4 Conclusion The practical question of this study was the link between the ionizing radiation-induced failsafe programs and the occurrence of side effects in healthy tissues in radiotherapy. Here it must be recognized that the fact of the increased occurrence of senescence in contrast to apoptosis and necrosis is a longer lasting negative effect in the surrounding connective tissue. While apoptotic or necrotic cells are quickly eliminated from the body, senescent cells remain in place and may have a long lasting negative impact on tissue regeneration.

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3. Einleitung

3.1 Zellalterung Strahlungsinduzierte Schäden können bei Fibroblasten verschiedene Formen haben. Bei der als heteronomes Absterben bezeichneten Nekrose verliert die Zellmembran ihre Integrität und die Zelle zerplatzt aufgrund von Flüssigkeitseinstrom ermöglicht durch die Umkehr des osmotischen Drucks. Die Zellreste werden, begleitet von einer Entzündungsreaktion, von Makrophagen phagozytiert. Im Gegensatz dazu wird die Apoptose, auch programmierter Zelltod genannt, von der Zelle selbst eingeleitet, es erfolgt keine Entzündungsreaktion. Daneben beschrieben Hayflick und Moorhead eine durch Stress ausgelöste vorzeitige Zellalterung, die sogenannte prämature Seneszenz (Hayflick et al. 1961). Zelluläre Seneszenz kann durch verschiedene Stimuli wie endogene oder exogene Oxidationen, Aktivierung von Onkogenen oder DNA-Schädigung ausgelöst werden (Yang 2008). Eine Zelle in praematurer Seneszenz zeichnet sich durch veränderte Genexpression, Abflachung des

Zellreliefs,

ansteigende

Resistenz

gegenüber

Apoptose,

erhöhtes

Level

an

Tumorsuppressorproteinen, verkürzte Telomere und eine erhöhte β-Galactosidase Aktivität aus (Fournier et al. 2007). Anhand des Nachweises der β-Galactosidase Aktivität gilt es zu untersuchen ob und in welchem Ausmaß prämature Seneszenz bei P60 Fibroblasten durch Bestrahlung induziert werden kann.

3.2 H2Ax Ionisierende Strahlung kann auch innerhalb der DNA Schäden in unterschiedlicher Form verursachen: Basenmodifikationen, Basenverluste, Einzelstrangbrüche, Quervernetzungen innerhalb der DNA oder mit Proteinen und Doppelstrangbrüche. Doppelstrangbrüche stellen den schwerstmöglichen Schaden für die Zelle dar (Jeggo et al. 2007). Die durch ionisierende Strahlung entstandenen DNA-Doppelstrangbrüche führen bereits nach kurzer Zeit zu einer Phosphorylierung des Histons H2Ax. Weil diese Phosphorylierung am Serin 139 zu gammaH2Ax sehr reichlich und schnell geschieht, und gut mit jedem DSB korreliert, ist sie der sensibelste Marker um entstandene DNA-Schäden und deren nachfolgende Reparatur zu untersuchen. Gamma H2Ax kann durch Immunostaining unter einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden (Sharma et al. 2012).

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3.3 β-Galactosidase Aktivität Wie bereits erwähnt reagieren Zellen auf strahleninduzierte Schäden wie z.B. DNADoppelstrangbrüche mit verschiedenen sogenannten „Failsafe“- Programmen wie Apoptose, Nekrose oder Seneszenz. Neben den oben beschriebenen phänotypischen Veränderungen weist eine seneszente Zelle eine erhöhte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-Gal) auf (Linskens et al. 1995). SA-β-Gal ist ein sensibler Biomarker, der mithilfe von Fluoreszenzfärbung der zu untersuchenden Zellen und dem Substrat C12 FDG markiert, durch flusszytometrische Analyse ausgewertet werden kann.

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4. Material und Methoden

4.1 Gewinnen und Pflege der Zellkultur Die in den Versuchen verwendeten Zellen entstammen allesamt der Zelllinie P60. Dies sind primäre Hautfibroblasten eines gesunden Probanden, die aus bereits vorhandenen Laborbeständen zur Verfügung gestellt wurden. Nach dem Auftauen erfolgt das Anzüchten und Kultivieren in Zellkulturflaschen. In diesen findet das Kultivieren in speziellem Fibroblastenmedium (Anlage 1) in einem Brutschrank bei 37 °C und 5% CO 2 statt. Die Zellen werden abhängig von ihrer Wachstumsgeschwindigkeit ein- bis zweimal pro Woche passagiert, dabei werden die Zellen im Verhältnis 1:2 in neue Kulturflaschen von 75 cm2 umgesetzt und mit neuem Medium versorgt. Vor dem Passagieren überprüft man die Zellen unter dem Mikroskop hinsichtlich ihrer Vitalität und Ausbreitungsdichte. Anhand dessen entscheidet man über den richtigen Moment für die nächste Passage. Danach wird das alte Nährmedium aus der Zellkulturflasche abpipettiert, die Zellen verbleiben zunächst am Boden der Flasche haften. Die Reste des Mediums werden mit Phosphat buffered saline Lösung (1xPBS, Anlage 2) ausgewaschen, welches durch seine Pufferkapazität, isotonische sowie isoosmotische Zusammensetzung hervorragend zum Waschen von Zellkulturen geeignet ist. Nach wiederholtem Schwenken wird auch die PBS-Lösung abpipettiert. Ohne diesen Schritt würde das im Medium enthalten fätale Kälberserum (FKS-Superior) die Wirkung des nachfolgend angewendeten Trypsin aufheben. Um die am Boden haftenden Zellen zu lösen, wird eine der Flaschengröße entsprechende Menge Trypsin (45ml 1x PBS, 5ml 10x Trypsin, Anlage 3) hinzupipettiert. Für eine 75 cm2 Kulturflasche sind das 2ml. Es folgt eine einminütige Inkubation im Brutschrank. Um die Zellen nicht zu schädigen sollte diese Zeitspanne nicht überschritten werden. Wenn unter dem Mikroskop festgestellt wird, dass noch nicht alle Zellen gelöst sind, kann man den Vorgang durch vorsichtiges Klopfen auf den Flaschenboden unterstützen. Die enzymatische Wirkung des Trypsins wird nun durch die Zugabe von 8ml Nährmedium und das darin enthaltene FKS gestoppt. Diese Lösung wird in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert und 8 Minuten lang bei 20 Grad Celsius und 173G zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 2ml Nährmedium auf dem Mischgerät gelöst. Diese Zellsuspension wird nun mit der gewünschten Menge Medium verdünnt und zur weiteren Kultivierung auf zwei frische Zellkulturflaschen aufgeteilt

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4.2 Immunostaining

4.2.1 Prinzip Durch Immunostaining ist es möglich, Proteine im Kern der Zelle mit Hilfe fluoreszierender Antikörper zu markieren und so unter dem Mikroskop sichtbar zu machen. Die Antikörper richten sich in diesem Fall gegen bestimmte Reparaturproteine, die strahleninduziert aktiviert, und unter dem Mikroskop als sogenannte Foci erkennbar werden. Hierbei werden nach vorhergehender Strahlenbehandlung Veränderungen bezüglich der Anzahl dieser Foci untersucht. In dieser Arbeit wird die Methodik der indirekten Immunfluoreszenz angewendet, welche aus zwei Schritten besteht. Zunächst wird ein primärer Antikörper verwendet, der gegen das gewünschte Reparaturprotein gerichtet ist. Dieser Primär-Antikörper wird genauso wie der Sekundär-Antikörper aus jeweils zwei verschiedenen Tierarten gewonnen. Der danach zugegebene Sekundär-Antikörper ist gegen Immunglobuline aus der Tierart gerichtet, aus welcher der Primär-Antikörper stammt. Der mit Fluoreszenzfarbstoffen präparierte

Sekundär-Antikörper

markiert

somit

den

bereits

am

Reparaturprotein

gebundenen Primär-Antikörper und macht ihn sichtbar.

4.2.2 Versuchsvorbereitung Wie in Tabelle 1 dargestellt, wurden die Zellen vier verschiedenen Dosen ionisierender Strahlung ausgesetzt, und nach fünf unterschiedlichen Reparaturzeiten untersucht. Die Einheit für ionisierende Strahlung mit einem Joule pro Kilo applizierter Dosis ist ein Gray (Gy). Tabelle1: Versuchsaufbau Immunostaining

Reparaturzeit nach Behandlung/Be strahlung 48 Stunden

Kontrollgruppe (unbehandelt)

Bestrahlung mit 100 mGy

Bestrahlung mit 2 Gy

Bestrahlung mit 5 Gy

X

X

X

X

1 Woche

X

X

X

X

2 Wochen

X

X

X

X

3 Wochen

X

X

X

X

4 Wochen

X

X

X

X

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Zu Beginn des Versuchs werden die Zellkulturflaschen aus dem Brutschrank entnommen und unter dem Mikroskop hinsichtlich der Zelldichte und der Vitalität geprüft. Die weitere Vorbereitung entspricht dem Passagieren wie unter 1. beschrieben. Vor dem Zentrifugieren wird hier allerdings die vorhandene Zellzahl bestimmt. Dies geschieht mit dem Zellzählgerät CASY TT (Schärfe System, Reutlingen, Deutschland). Man pipettiert 100µl der Zellsuspension zu 10ml CASYton™- Lösung in ein Zählröhrchen und vermischt beides durch mehrmaliges Schwenken. CASY TT liefert die Zellzahl pro ml, durch Multiplikation mit dem Volumen der Zellsuspension erhält man die Gesamtzellzahl die für den Versuch zur Verfügung steht. Nun folgt das Zentrifugieren für 8 min bei 173g und 20˚C. Pro Versuchsbedingung wird eine Petrischale mit einem sterilen Deckgläschen der Größe 32mm x 24mm versehen und mit 5ml Medium befüllt. Es ist darauf zu achten dass das Medium unter die Deckgläschen fließt, damit diese am Boden haften bleiben und keine Zellen darunter verloren gehen. Nach dem Zentrifugieren wird das Zellpellet resuspendiert und berechnet, wie viel der Zellsuspension pro Deckgläschen benötigt wird. Da einerseits durch die Bestrahlung Zellen verloren gehen, andererseits die Zellkolonien innerhalb der gegebenen Reparaturzeiten wachsen, werden zwischen 50 000 und 100 000 Zellen pro Deckgläschen angesetzt. Das errechnete Volumen der Zellsuspension wird vorsichtig und möglichst gleichmäßig auf jedes Deckgläschen pipettiert. Damit die Zellen nun anwachsen, werden vor der weiteren Behandlung die Petrischalen für mindestens 24 Stunden in einem Brutschrank inkubiert.

4.2.3 Bestrahlung Nach der Ruhephase werden die Zellen in einer 120 kV Röntgenröhre (ISOVOLT Titan, GE, Ahrensburg, Deutschland) bestrahlt. Neben einer unbestrahlten Kontrollgruppe beträgt die Strahlendosis 100mgy, 2Gy und 5Gy. Durch die ionisierende Strahlung entstehen Doppelstrangbrüche in der DNA, welche beim Immunostaining untersucht werden sollen (Strasser et al. 2007). Nach der Behandlung werden die Petrischalen für die dem Versuch entsprechende Reparaturzeit von 48 Stunden bis 4 Wochen weiter im Inkubator bei 37˚C und 5% CO2 aufbewahrt.

4.2.4 Fixierung und Permeabilisierung Je nach gewünschter Reparaturzeit wird das Medium aus den Petrischalen abgesaugt und die Deckgläschen zunächst einmal kurz mit PBS gewaschen. Die Waschlösung wird dann abgesaugt und eine 4%-Formaldehydlösung (Anlage 4) in die Schalen pipettiert. Durch diese werden die Zellen fixiert, und die Zellmembran permeabel, so dass die Antikörper bei der Färbung in den Zellkern vordringen können.

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Die Fixierlösung wird dekantiert, und die Deckgläschen werden dreimal für jeweils 5 Minuten mit einer 1x Tris buffered saline-Lösung (TBS-Lösung) auf dem Orbitalshaker gewaschen (Anlage 5a/b). Die TBS-Waschlösung wird abgesaugt und die Petrischalen mit jeweils 5ml Blockinglösung (Anlage 6) aufgefüllt. Die Aufbewahrung erfolgt danach für 24 Stunden oder länger im Kühlschrank. Die Blockinglösung dient dazu die unspezifischen Proteinstellen abzupuffern, damit die spätere Färbung durch die Antikörper nur an den gewünschten Proteinen geschieht.

4.2.5 Fluoreszenzfärbung Nachdem die Blockinglösung abgesaugt wurde müssen die Deckgläschen erneut dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBS-Lösung gewaschen werden. Nun entnimmt man sie vorsichtig mit einer Pinzette aus der Petrischale und legt sie zum Trocknen auf ein Papiertuch. Damit man die Deckgläschen in der Folge nicht vertauscht, sollte das Tuch mit der jeweiligen Versuchsbedingung beschriftet werden. Mit einem Fettstift werden die Deckgläser in zwei gleich große Felder geteilt, auf welche die jeweils unterschiedlichen Antikörperkombinationen aufgetragen werden können. Zusätzlich wird das Feld für den ɣH2Ax-Antikörper mit einem Punkt markiert. Zur Verdünnung der Antikörpersera wird 1% Bovine Serum Albumine (BSA) in 1x TBS (0,05g BSA auf 5ml 1x TBS) gelöst. Die Primär-Antikörper (Tabelle2) werden entsprechend ihrer Konzentration frisch mit 1% BSA in TBS-Lösung angesetzt. Tabelle 2: Primär-Antikörper für das Immunostaining

Antikörper

Hersteller

Konzentration

anti-H2Ax pSer 139 (mouse) Upstate, New York, USA

1: 1500

anti-BP53 p1778 (rabbit)

1: 50

Cell Signaling

Nun wird auf jedes Feld 100µl der entsprechenden Antikörperlösung pipettiert, und jedes Feld einzeln mit Parafilm™ abgedeckt. Die Deckgläschen werden zur Inkubation der Primär Antikörper in eine feuchte Kammer überführt und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Anschließend wird der Parafilm™ entfernt, und die Deckgläser vorsichtig zurück in die Petrischalen gelegt um sie erneut dreimal für 5 Minuten mit 1x TBS-Lösung zu waschen. Mit einer Pinzette werden die Deckgläser zum Trocknen auf ein beschriftetes Papiertuch gelegt. Die Sekundär-Antikörper werden analog zu den Primär Antikörpern in 1% BSA in 1x TBS angesetzt.

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Tabelle 3: Fluoreszierende Sekundär Antikörper für das Immunostaining

Antikörper

Hersteller

Alexa Fluor 488 goat/ anti-

Molecular Probes, Göttingen,

mouse (grün)

Deutschland

Alexa Fluor 594 chicken/

Molecular Probes, Göttingen,

anti-rabbit (rot)

Deutschland

Konzentration 1: 400

1:200

Auch hier werden 100µl Antikörperlösung auf die entsprechenden Felder pipettiert. Goat antimouse färbt den ɣH2Ax-Antikörper und chicken anti-rabbit den BP53 p1778-Antikörper. Jedes Feld wird erneut einzeln mit Parafilm™ abgedeckt, und die Deckgläser zum Inkubieren für 2 Stunden in die feuchte Kammer bei Raumtemperatur überführt. Danach werden die Deckgläser abermals zurück in die Petrischalen gelegt, und dreimal für 5 Minuten mit 1x TBS- Lösung gewaschen. Zur letzten Färbung wird 0,3µl 4´,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Stammlösung in 1ml Standard-Saline-Citrat Tween (SSC Tween) angesetzt. DAPI färbt die gesamte DNA im Zellkern und lässt diesen unter dem Fluoreszenzmikroskop blau erscheinen. Pro Deckglas werden 50µl der Lösung aufgetragen und im Ganzen mit Parafilm™ abgedeckt. Nach der 2 minütigen Inkubationszeit, die im Dunklen erfolgen sollte, wird der Parafilm entfernt, und die Gläschen kurz in Aqua Bidest getaucht. Zum Trocknen eignet sich ein Ständer der mit Aluminiumfolie abgedeckt wird, damit auch hier kein Licht auf die frisch gefärbten Zellen fällt. Als letztes müssen die Deckgläschen sobald sie trocken sind auf Objektträger transferiert werden. Hierzu wird pro Feld ein kleiner Tropfen Vectashield(VectorLabs, Peterborough, UK) Eindeckmedium auf den Objektträger aufgetragen und die Deckgläser mit den Zellen nach unten aufgelegt. Hierbei ist darauf zu achten dass die Deckgläser wie beschriftet mit der ɣH2Ax Seite nach links aufgelegt werden, um später die verschiedenen Antikörperkombinationen nachvollziehen zu können. Wenn nötig können die Deckgläschen anschließend an den Seiten mit Nagellack auf den Objektträgern fixiert werden.

4.2.6 Bildanalyse Die Beurteilung der Zellen erfolgt unter einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axioplan 2 imaging) mit wechselbaren Filtern in 40facher Vergrößerung. Unter dem Mikroskop wird eine Region mit hoher Zelldichte ausgewählt. Exemplarisch wird eine Zelle sowohl unter dem blauen DAPI-Filter als auch unter dem grünen bzw. roten Filter des jeweiligen Sekundär Antikörpers scharf gestellt. Der Autofokus übernimmt diese Einstellung als Mittelwert für die gesamte Aufnahme dieses Objektträgers. Hiervon wird mit einer CCD-Kamera von Metasystems eine Matrix von 8x8 Bildern aufgenommen und automatisch zu einem

12 Gesamtbild zusammengesetzt. Jedes dieser 64 Einzelbilder besteht seinerseits aus je einer Aufnahme mit der DAPI-Färbung und der Grün- bzw. Rotfärbung des Sekundär-Antikörpers, die ebenso automatisch übereinander gelegt werden. Die eigentliche Analyse der Bilder wird mit dem Programm Biomas (MSAB, Erlangen, Deutschland) durchgeführt. Zunächst werden die Bilder nachbearbeitet, da die von der Kamera erfassten Zellen oftmals nicht in einer Ebene liegen. Die Funktion „sort cells“ markiert die aufgenommenen Zellen, wobei unscharfe oder stark deformierte Zellen entfernt werden können. Mit „count foci“ werden nun die Foci markiert, die innerhalb der ausgewählten Helligkeitsstufe liegen. Die Werte werden automatisch in eine Excel-Datei übertragen, anhand derer entsprechende Auswertungen vorgenommen werden können:

-Anzahl der Foci -Fläche der Foci (µm²) -Durchschnittliche Helligkeit der Foci (Luminance in Graustufen) -Maximale Helligkeit (Luminance in Graustufen) -Fläche der Kerne (µm²) -Helligkeit der Kerne (Luminance in Graustufen) -Helligkeit außerhalb der Kerne (Luminance in Graustufen)

4.3 Farbstoffe für die flusszytometrische Messung

4.3.1 Messung von DNA und RNA Gehalt Zur Anfärbung der nukleären DNA wird der Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 genutzt. Hoechst 33342 lagert sich in der kleinen Furche der DNA-Doppelhelix an, und führt zur Fluoreszenz des Chromatins. Da die Fluoreszenz der Zelle proportional zu ihrem DNAGehalt ist, wird ausgesagt wie viel DNA sich innerhalb der Zelle befindet. Durch unterschiedliche DNA-Mengen können Zellen verschiedenen Zellzyklusphasen zugeordnet werden. Dies wird zur Verdeutlichung graphisch in einem Histogramm dargestellt, in dem die DNA-Menge gegen die Zellzahl aufgetragen wird. Durch die Behandlung mit ionisierender Strahlung von unterschiedlicher Intensität und die unterschiedlich langen Reparaturzeiten lässt sich eine Veränderung dieser Werte feststellen.

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Abbildung 1: Die Färbung der DNA-Menge mit Hoechst zeigt die Aufteilung der Zellen auf die einzelnen Zyklusphasen

In einer normalen Zelle ist der Gehalt an chromosomaler DNA definiert durch die Anzahl der vorhandenen Chromosomen. In proliferierenden Zellen verdoppelt sich die chromosomale DNA und die Anzahl der Chromosomen in der sogenannten S-Phase (Synthesephase) des Zellzyklus. Aus diesem Grunde ist der DNA Gehalt zwischen der G2 Phase (Praemitotischeoder Postsynthesephase) und der Mitose doppelt so groß wie in einer ruhenden Zelle oder in einer postmitotischen Zelle (G0/G1). Eines der typischen Merkmale von apoptotischem Zelltod ist die Fragmentierung von chromosomaler DNA in kleine Bruchstücke. Zudem wird während der Apoptose oft auch der Zellkern fragmentiert. Die kleineren und größeren Stücke werden von der Zelle freigesetzt, sodass bei einer DNA Färbung von apoptotischen Zellen ein DNA Gehalt beobachtet wird, der tiefer ist als bei einer normalen Zelle in der G1-Phase. Man spricht von sub-G1 Zellen. Die DNA Färbung kann somit auch gebraucht werden, um Apoptose in einer Zellpopulation zu quantifizieren. Die RNA-Menge hingegen wird durch den Farbstoff Pyronin Y bestimmt.

4.3.2 Apoptose und Nekrose Detektion durch Annexin V und 7 AAD Der Begriff Apoptose bedeutet programmierter Zelltod. Erleidet eine Zelle durch äußere Einflüsse Schäden innerhalb der DNA, so wird dieser Mechanismus ausgelöst, um Mutationen und die Vererbung des fehlerhaften Erbguts abzuwenden. Bei der Apoptose kommt es zu Membranveränderungen, u.a. zur Umlagerung von Phosphatidylserin (PS) von der zum Zytoplasma weisenden Innenseite der Zellmembran hin zur Außenseite der Zellmembran. PS dient nun als Marker für Phagozyten, die die Zelle abbauen. Im Gegensatz dazu kommt es bei der Nekrose durch den Ausfall der zellulären Ionenpumpen zu einer

14 Umkehr des osmotischen Drucks. Durch den Integritätsverlust der Zellmembran kommt es zum Einstrom von Wasser bis hin zum Zerplatzen der Zelle. Diese physiologischen Unterschiede ermöglichen eine Differenzierung durch Methoden der Fluoreszenzfärbung und anschließender durchflusszytometrischer Analyse. Um Zellen in Apoptose darstellen zu können wird der Fluoreszenzfarbstoff Annexin V eingesetzt. Annexin V ist ein Protein mit einer hohen Affinität für Phosphatidylserin, und kann somit als empfindliche Sonde für die Phosphatidylserin-Exposition auf der Membranaußenseite aller apoptotischen Zellen eingesetzt werden (Koopman et al. 1994; Munoz et al. 2007). Um nekrotische Zellen anzufärben wird in dieser Arbeit 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) verwendet (Zimmermann et al. 2011). 7-AAD färbt ausschließlich die DNA von nekrotischen Zellen an, da es nur in Zellen ohne intakte Zellmembran eindringen kann, und sich dort an Nukleinsäuren anlagert. Man bezeichnet 7-AAD daher auch als Avitalfarbstoff (Schutte et al. 1998).

Abbildung 2: Punktwolkendiagramm mit Quadrantenanalyse zur Differenzierung viabler, nekrotischer sowie apoptotischer Zellen.

Allerdings

kann

bei

nekrotischen

Zellen

mit

verletzter

Zellmembran

auch

der

Apoptosefarbstoff Annexin V in das Zellinnere vordringen und Phosphatidylserin dort anfärben. Bei einem Versuch zur Bestimmung des Apoptose- bzw. Nekrosestadiums von Zellpopulationen wird daher eine Doppelfärbung mit dem Protein Annexin V und mit 7-AAD durchgeführt. Gesunde Zellen reagieren auf beide Färbungen negativ, apoptotische Zellen reagieren positiv auf die Annexin V-Färbung, jedoch negativ auf die mit 7-AAD. Nekrotische Zellen reagieren positiv auf beide Farbstoffe.

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4.3.3 Detektion der β-Galactosidase-Aktivität durch Färbung mit C12 FDG Eine erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA- β-gal) Aktivität ist ein sensibler Marker für zelluläre Seneszenz (Linskens 1995). SA- β-gal ist eine lysosomale Hydrolase, deren Aktivität bei einem pH-Wert von pH=6 liegt. Da die Aktivität der β-Galactosidase in nicht seneszenten Zellen bei pH=4 gemessen wird, ermöglicht die Veränderung des pHWertes eine Aussage über die Aktivität der SA- β-gal (Dimri et al. 1995; Matsumura et al. 1979). Zum Nachweis von SA- β-gal Aktivität in seneszenten Zellen wird die Substanz 5Dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) benötigt. C12FDG ist bei Zugabe zu der Zellsuspension für die Tumorzellmembran permeabel. Nach Eintritt in die viable Zelle wird das Substrat von der SA-β-gal hydrolysiert. Die dabei entstehenden Produkte emittieren grüne Fluoreszenz und sind impermeabel für die Membran, sodass der Farbstoff in der seneszenten Zelle verbleibt und anhand der Intensität der Emissionen flusszytometrisch zu erfassen ist. Die Einstellung des benötigten pH-Werts (pH=6) erfolgt durch Inkubation der Zellsuspension vor Zugabe von C12FDG mit Bafilomycin A1 (siehe Punkt 4.5.2.3) (Kurz et al. 2000; Noppe et al. 2009).

4.3.4 CD 44 CD44 ist ein Transmembranprotein der Zelloberfläche, das hauptsächlich durch Zell-Zell oder Zell-Matrix Adhäsion für den Erhalt von Organ- und Gewebestrukturen sorgt. Es hat sich allerdings herausgestellt, dass besonders aktive und progrediente Neoplasien eine erhöhte Expression von CD44 in der Zellmembran aufweisen (Goodison et al. 1999). Vermutlich ist CD44 auch an Tumorprogression und Metastasierung beteiligt (Godar et al. 2008).

16

4.4 Flusszytometrie

4.4.1 Prinzip Die Flusszytometrie ist ein Messverfahren, welches es erlaubt innerhalb kürzester Zeit eine große Menge an Zellen hinsichtlich diverser Eigenschaften zu analysieren. Das Prinzip beruht darauf, dass in Suspension gelöste Einzelzellen im Flusszytometer einen Laserstrahl passieren, und daraufhin Streulicht, beziehungsweise Fluoreszenzsignale emittieren. Im Vorfeld werden die zu untersuchenden Zellkulturen mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Antikörpern, an die Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt werden, markiert. Letztere binden an das Merkmal gegen das sie gerichtet sind, und fluoreszieren beim Durchqueren des Laserstrahls. Das Streulicht hingegen entsteht bei jeder Zelle die den Laserstrahl passiert, und kann in zwei verschiedenen Richtungen gemessen werden. Das Vorwärtsstreulicht (Forward-Scatter FSc) hängt von der Brechung des Lichts ab, das aus der Richtung des Laserstrahls

kommt.

Große

Zellen

erzeugen

hierbei

ein

ebenso

größeres

Vorwärtsstreulichtsignal als kleine Zellen. Das Seitwärtsstreulicht (Side-Scatter SSc) wird ungefähr im 90˚ Winkel zum FSc gemessen und ist ein Maß für Granularität (Körnigkeit) und Vitalität

der

Zelle.

Zellen

mit

hoher

Granularität

erzeugen

hier

ein

großes

Seitwärtsstreusignal. Zur Veranschaulichung werden die Streulicht-Messergebnisse in einem Dot-plot Diagramm dargestellt. Auf der x-Achse wird das Vorwärtsstreulicht aufgetragen, auf der

y-Achse

das

Seitwärtsstreulicht.

Hieraus

entstehen

im

Punktwolkendiagramm

Anhäufungen von Zellen die aufgrund ihrer Morphologie ähnliche Streulichteigenschaften haben. Anhand dieses „Scatterbildes“ können die Zellpopulationen voneinander abgegrenzt werden. Die Einschätzung der Viabilität der Zellen erfolgt durch die Auswirkungen von Apoptose und Nekrose: non-viable Zellen haben aufgrund von Perforationen der Zellmembran ein geringeres Volumen und eine höhere Granularität. Im Scatterbild ist daher der FSc niedrig und der SSc hoch.

17

4.4.2 Versuchsvorbereitung Der Versuchsaufbau ist identisch zu dem unter 4.2.2 : Tabelle 4: Versuchsaufbau Flusszytometrie

Reparaturzeit nach Behandlung/Be strahlung 48 Stunden

Kontrollgruppe (unbehandelt)

Bestrahlung mit 100 mGy

Bestrahlung mit 2 Gy

Bestrahlung mit 5 Gy

X

X

X

X

1 Woche

X

X

X

X

2 Wochen

X

X

X

X

3 Wochen

X

X

X

X

4 Wochen

X

X

X

X

Bei der Vorbereitung wird zunächst analog zu 4.2.2 vorgegangen. Nach dem Auszählen der Zellen mittels CASY TT und dem anschließenden Zentrifugieren für 8 Minuten bei 20˚ C wird das Zellpellet resuspendiert. Für die Flusszytometrie werden am Versuchstag pro Versuchsbedingung Abhängigkeit

von

etwa der

450.000

Zellen

Reparaturzeit

benötigt.

zwischen

Dementsprechend

150.000

und

450.000

werden Zellen

in pro

Versuchsbedingung in 5ml Medium gelöst und in kleine Zellkulturflaschen übertragen. Diese müssen zum Anwachsen an den Flaschenboden erneut für mindestens 24 Stunden in den Brutschrank.

4.4.3 Bestrahlung Die Zellen in den Zellkulturflaschen werden analog zu 4.2.3 mit ionisierender Strahlung entsprechend der Versuchsbedingung behandelt und anschließend für die jeweilige Reparaturzeit im Brutschrank aufbewahrt.

18

4.5 Färbungen für die flusszytometrische Messung

4.5.1 Vorbereitung zur Färbung Nach der entsprechenden Reparaturzeit (48h, 1/2/3/4 Wochen) werden die Zellen aus den Zellkulturflaschen in Fluorescence activated cell sorter-Röhrchen (FACS-Röhrchen) überführt. Analog zum Vorgehen beim Passagieren (siehe 4.1) wird das alte Medium abgesaugt, mit 1 x PBS gewaschen, trypsiniert und die gelösten Zellen nach vorheriger Kontrolle mit frischem Medium resuspendiert. Nun wird für jede Versuchsbedingung (Kontrolle, 100mGy, 2Gy, 5Gy) jeweils ein Zentrifugenröhrchen beschriftet und mit der entsprechenden Suspension aus der Zellkulturflasche befüllt. Um festzustellen wie viele Zellen tatsächlich pro Versuchsbedingung zur Verfügung stehen, werden 100µl aus jedem Zentrifugenröhrchen in CASY- Zählröhrchen pipettiert und erneut die Zellzahl bestimmt. Währenddessen wird bei 20˚C und 173g für 8 Minuten zentrifugiert. Pro Versuchsbedingung werden drei FACS-Röhrchen vorbereitet, da drei verschiedene Färbungen durchgeführt werden. Der Überstand wird aus den Zentrifugenröhrchen verworfen, und das Zellpellet in jeweils 1,2ml Medium gelöst. Jedes FACS-Röhrchen wird abschließend mit 400µl Zellsuspension befüllt.

4.5.2 Färbeprotokolle für die flusszytometrische Messung Die Zellen werden mit drei verschiedenen Kombinationen von Fluoreszenzfarbstoffen behandelt.

4.5.2.1 Apoptose/Nekrose Detektion Zu den 400µl Zellsuspension werden 2µl Hoechst 33342 in die FACS-Röhrchen pipettiert, und beides auf dem Vortexer gründlich vermischt. Die Röhrchen werden in einem Ständer für 90 Minuten bei 37˚C im Brutschrank aufbewahrt. Danach werden die FACS-Röhrchen bei 300g und 20˚C für 10 Minuten zentrifugiert. Der hierbei entstandene Überstand wird verworfen, und das Zellpellet in 200µl steriler Ringerlösung gelöst. Anschließend werden 5µl Annexin und 5µl 7AAD hinzupipettiert und gründlich vermischt. Die somit gefärbte Zellsuspension wird 30 Minuten lang auf Eis (bei 4˚C) gelagert und nach erneutem Vortexen im Flusszytometer gemessen.

19

4.5.2.2 Quantitative Bestimmung des RNA-Gehalts Bei dieser Färbung werden ebenso zunächst 2µl Hoechst 33342 in die FACS-Röhrchen gegeben und gründlich vermischt. Nach Ablauf von 45 Minuten Einwirkzeit bei 37˚C und 5% CO2 im Brutschrank werden 0,4µl Pyronin Y hinzupipettiert. Nach erneut 45 minütiger Inkubation im Brutschrank erfolgt umgehend die Flusszytometermessung.

4.5.2.3 Detektion der β-Galactosidase Aktivität Die 400µl Zellsuspension werden zunächst mit 4µl Bafilomycin A1 (BAF 1) 30 Minuten lang im Brutschrank behandelt, um den pH-Wert sauer einzustellen. Nach der Zugabe von 2µl Hoechst 33342 wird erneut für 30 Minuten im Brutschrank inkubiert. Nun 0,5µl C12 FDG hinzugeben und nach weiteren 60 Minuten Inkubationszeit 10 Minuten lang bei 20˚C und 300G zentrifugieren. Der Überstand wird verworfen, und das Zellpellet mit 200µl 1x PBS resuspendiert. In diese Lösung werden 5µl CD44 pipettiert und nach gründlichem Mischen für 30 Minuten auf Eis (4˚C) gelagert, bevor die Messung im Flusszytometer erfolgen kann.

4.6 Flusszytometrische Analyse

4.6.1 Erhebung der Daten Die Messung erfolgt im Durchflusszytometer Epics XL der Firma Beckman Coulter (Fullerton, CA, USA). Bei diesem Gerät stehen drei Laser zur Verfügung, die mit drei verschiedenen Wellenlängen arbeiten (405nm, 488nm und 638nm). Somit können nicht nur der FSc und der SSc, sondern auch Fluoreszenzsignale, die durch die drei verschiedenen Wellenlängen emittiert werden, gemessen werden. Die Datenerfassung der Streulichtwerte erfolgt linear, die

der

Fluoreszenzsignale

hingegen

logarithmisch.

Die

Messung

eines

jeden

Färbeprotokolls erfolgt durch ein vorher definiertes und erprobtes Messprotokoll. Bei jeder Versuchsbedingung (48h, 1-4w sowie Kontrolle, 100mgy, 2gy und 5gy) muss zur Vergleichbarkeit der Daten stets dasselbe Messprotokoll verwendet werden. Vor der Messung werden die Kapillaren mit dem Waschprogramm durchgespült, um Messfehler durch alte Zellreste auszuschließen. Um einen schnellen Messvorgang zu gewährleisten sollten die FACS-Röhrchen unmittelbar vor dem Einsetzen in das Karussell nochmal gründlich

gevortexed

zusammengefasst.

werden.

Der

Inhalt

der

Messprotokolle

ist

in

Tabelle

5

20

Tabelle 5: Messprotokolle der Flusszytometrie

Fluoreszenzsensor

FL 1

FL 2

FL 4

Fluorochrome

C12FDG

Pyronin Y

7-AAD

Laser

405 nm

488 nm

Emissionsfilter

500-510 nm

575/30 nm

(FL)

FL 6

FL 9

CD44 APC /

Hoechst

Annexin V

33342

488 nm

638 nm

405nm

695/30 nm

660/20 nm

450/40nm

4.6.2 Datenauswertung Die Auswertung der Daten wurde mit der Software Kaluza 1.1 (Beckman Coulter User Software) durchgeführt. Hierbei werden die erfassten Zellen durch sogenannte Gates in Gruppen eingeteilt, welche hinsichtlich der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe untersucht werden. Die gesammelten Daten werden in Microsoft Excel übertragen und statistisch ausgewertet.

21

5. Ergebnisse

5.1 Immunostaining Ionisierende Strahlung kann mehrere Arten von Schäden in der DNA einer Zelle verursachen: Basenmodifikationen, Basenverluste, Einzelstrangbrüche, Quervernetzungen innerhalb

der

DNA

oder

mit

Proteinen

und

Doppelstrangbrüche

(DSB´S).

Doppelstrangbrüche stellen den schwerstmöglichen Schaden für die Zelle dar (Jeggo and Lobrich 2007). Nach Entstehung eines DSB kann die Zelle entweder den kontrollierten Zelltod, die Apoptose, einleiten, oder den Schaden reparieren (Roos et al. 2006). Da ein Verbleib von Zellen mit schadhafter DNA schwerwiegende Folgen wie Mutationen der Erbinformation oder Induktion maligner Neubildungen nach sich ziehen würde, müssen entsprechende Mechanismen zur Erkennung von DNA-Doppelstrangbrüchen, der Einleitung der Reparatur und der Kontrolle des Reparaturerfolges existieren (Rich et al. 2000). Es gibt zwei Hauptmechanismen der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur: das Nicht-homologe End Joining (NHEJ) und die Homologe Rekombination (HR). Zahlreiche Kinasen, unter anderem ATM (ataxia-telangiectasia mutated) aktivieren Proteinfaktoren, um den Schaden zu reparieren (Czornak et al. 2008). In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Faktoren der ATM-aktivierten Regulationskaskade bei primären P60 Fibroblasten untersucht. Die strahlungsinduzierten DNA-Doppelstrangbrüche wurden mithilfe der gefärbten Faktoren H2AX und BP53p1778 markiert, welche unter dem Fluoreszenzmikroskop als Foci sichtbar wurden.

22

Kontrollgruppe ohne Bestrahlung

Bestrahlung mit 100mGy

Bestrahlung mit 2 Gy

Bestrahlung mit 5Gy Abbildung 3: P60 Zellen nach 48 Stunden; Färbung mit DAPI und ɣ-H2Ax- Antikörpern

23

nach 48 Stunden

nach 1 Woche

nach 2 Wochen

nach 3 Wochen

24

nach 4 Wochen Abbildung 4: P60 Zellen nach Bestrahlung mit 5 Gy; Färbung mit DAPI und ɣ-H2Ax- Antikörpern

5.1.1 H2Ax Die DNA eukaryotischer Zellen ist in Form der Chromosomen organisiert, deren kleinste Untereinheit ein Nukleosom ist. Ein Nukleosom besteht wiederum aus acht Histonen, wobei die vier Isoformen H2A, H2B, H3 und H4 jeweils doppelt vorhanden sind. H2Ax ist eine Unterform von H2A, welche speziell bei der DNA-Reparatur eine wichtige Rolle spielt (Mannironi et al. 1989). Auf molekularer Ebene besitzt das H2Ax Histonprotein am Carboxylende ein Serin/Glutamin-Motiv (SQ). Dieses SQ-Motiv dient als Erkennungsstelle für Phosphoinositol-3-Kinasen wie das erwähnte ATM. ATM ist der Hauptmediator der Phosphorylierung von H2Ax am Ser139 Bereich zur aktivierten Form, dem sogenannten ɣH2Ax (Podhorecka 2009). Bereits wenige Minuten nach der Bestrahlung ist in umfassendem Bereich um die DSB-Stelle phosphoryliertes H2Ax nachweisbar (Avondoglio et al. 2009; Kinner et al. 2008). Die unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbaren nukleären Foci stellen die Summe der als Reaktion auf einen DNA-DSB phosphorylierten H2Ax-Histone dar (Rogakou et al. 1999). Die Menge der sichtbaren Foci korreliert mit der Menge der entstandenen DNA-DSB´s. Da schon kurze Zeit nach Auftreten eines DNA-DSB´s ɣH2AxFoci nachweisbar sind, gilt die Verwendung von ɣH2Ax-spezifischen Antikörpern heutzutage als Goldstandard in der DSB-Analyse (Avondoglio 2009; Podhorecka 2009).

25

6 5 48 h

Foci pro Zelle

4 3

1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen

2 1 0 Ko

100 mGy

2 Gy

5 Gy

Strahlendosis Abbildung 5: Focis pro Zelle in Abhängigkeit von der Strahlendosis

Die Anzahl der Foci die in einer Zelle nachgewiesen werden konnte, korreliert mit der Anzahl an Doppelstrangbrüchen in der DNA des Zellkerns. Hierbei zeigt sich, dass je höher die Bestrahlungsintensität war, desto mehr Foci konnten gezählt werden. Auch die Bestrahlung mit der vergleichsweise geringen Intensität von 100mGy führte zu signifikant mehr Doppelstrangbrüchen als bei der unbestrahlten Kontrollgruppe.

6

Ko 100 mGy

Foci pro Zelle

5

2 Gy 5 Gy

4 3 2 1 0 48 h

1 Woche

2 Wochen

Reparaturzeit

Abbildung 6: Focis pro Zelle in Abhängigkeit von der Reparaturzeit

3 Wochen

4 Wochen

26 Nach 48 Stunden war die Anzahl der Foci im Vergleich zu den anderen Reparaturzeiten am höchsten. Bei der Bestrahlung mit 5 Gy waren es 5,7; bei 2 Gy 2,5, somit kann daraus geschlussfolgert werden dass die Bestrahlungsintensität direkt proportional zur Anzahl der Doppelstrangbrüche steht. Nach 1 Woche, 2 Wochen und 3 Wochen sank die Anzahl der Foci stetig ab. Nach 4 Wochen konnte überraschenderweise ein erneuter Anstieg der Focianzahl beobachtet werden.

mittlere Luminance der Foci

250

Ko 100 mGy

200

2 Gy 5 Gy

150 100 50 0 48 h

1 Woche

2 Wochen

3 Wochen

4 Wochen

Reparaturzeit Abbildung 7: mittlere Luminance (in Graustufen) der Foci in Abhängigkeit von der Reparaturzeit

48 h

mittlere Luminance der Foci

250

1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen

200

150

100

50

0 Ko

100 mGy

2 Gy

5 Gy

Strahlendosis Abbildung 8: mittlere Luminance (in Graustufen) der Foci in Abhängigkeit von der Strahlendosis

27 Die mittlere Luminance der Foci spiegelt die Menge der aktiven Reparaturproteine wieder. Je höher diese ausfällt, umso mehr Reparaturproteine sind im Einsatz um Strahlenschäden zu reparieren. Nach 48 Stunden zeigt sich hier durchschnittlich die höchste Aktivität. Nach 4

mittlere Luminance in der Zelle minus außerhalb der Zelle

Wochen steigt diese wiederum an.

10 9 8 7 6 5 4

48 h 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen

3 2 1 0 Ko

100 mGy

2 Gy

5 Gy

Strahlendosis Abbildung 9: mittlere Luminance (in Graustufen) innerhalb der Zelle minus dem Hintergrund außerhalb der Zelle in Abhängigkeit von der Strahlendosis

mittlere Luminance in der Zelle minus außerhalb der Zelle

10 9 8 7 6 5 4

Ko 100 mGy 2 Gy 5 Gy

3 2 1 0 48 h

1 Woche

2 Wochen

3 Wochen

4 Wochen

Reparaturzeit Abbildung 10: mittlere Luminance (in Graustufen) innerhalb der Zelle minus außerhalb der Zelle in Abhängigkeit von der Reparaturzeit

Da bei der Auswertung mit „count foci“ im Programm Biomas© kleine Foci häufig nicht berücksichtigt werden, beschreibt die mittlere Luminance der Zellen die gesamte Aktivität

28 von Reparaturproteinen innerhalb der Zellen. Hier sind auch die Foci berücksichtigt, die in der Auswertung zunächst durch das Raster fielen.

Fläche des Kerns x mittlere Luminance im Kern - außerhalb

35000 Ko

30000

100 mGy 25000

2 Gy 5 Gy

20000 15000 10000 5000 0 48 h

1 Woche

2 Wochen

3 Wochen

4 Wochen

Reparaturzeit

Fläche des Kerns x mittlere Luminance im Kern - außerhalb

Abbildung 11: Die Fläche des Kerns multipliziert mit der oben dargestellten relativen Luminance des Kerns (DAPI) steht in Relation zu dem DNA-Gehalt der Zelle; dargestellt in Abhängigkeit von der Reparaturzeit

35000

48 h 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen

30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 Ko

100 mGy

2 Gy

Strahlendosis Abbildung 12: Der DNA-Gehalt der Zelle in Abhängigkeit von der Strahlendosis

5 Gy

29

70

48h KO 48 h 100mGy 48h 2Gy 48h 5Gy 4W KO 4W 100mGy 4W 2Gy 4W 5Gy

60

Zellzahl

50

40

30

20

10

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

Anzahl der Foci pro Zelle Abbildung 13: Verteilung der Focianzahl pro Zelle

Die Verteilung der Focianzahl pro Zelle zeigt, dass nach Bestrahlung mit höherer Dosis und längerer Reparaturzeit vermehrt Zellen auftraten, die eine größere Anzahl an Foci aufweisen.

5.1.2 BP53 p1778 Die DNA-Proteinkinase ATM (ataxia telangiectasia mutated) aktiviert verschiedene zelluläre Reaktionen auf ionisierende Strahlung, unter anderem den Zellzyklusarrest. Die Histone ɣH2Ax und 53BP1 sind Substrate der ATM vermittelten Phosphorylierung, ihre Rolle in der Signalkaskade nach DNA Doppelstrangbrüchen (DNA-DSB´s) ist allerdings nicht geklärt. Man geht davon aus, dass 53BP1 am Ort des DNA-DSB´s an der Signaltransduktion beteiligt ist, die beschädigte Zellen daran hindert eine Zellteilung einzuleiten (Fernandez-Capetillo et al. 2002). Das 53-Binding Protein bindet an das Tumor Suppressor Protein p53, welches wiederum Zellen an einer malignen Transformation hindert, indem es Zellwachstum und –tod reguliert. Durch Stress aktiviert, sorgt p53 für Wachstumsstop und Apoptose und ist Teil von DNAReparatur und –rekombination (Brazdova et al. 2002). Das p53 Binding Protein 53BP1 spielt somit ebenso eine wichtige Rolle in der zellulären Reaktion auf DNA Doppelstrangbrüche, dem Erhalt der genomischen Stabilität und der Krebsprävention (Abraham 2002) (Wang et al. 2002).

30

Ko

4

100 mGy 2 Gy

Foci pro Zelle

3

5 Gy

2

1

0 48 h

1 Woche

2 Wochen

3 Wochen

4 Wochen

Reparaturzeit Abbildung 14: Foci pro Zelle in Abhängigkeit von der Reparaturzeit

48 h 4

1 Woche 2 Wochen

Foci pro Zelle

3

3 Wochen 4 Wochen

2

1

0 Ko

100 mGy

2 Gy

5 Gy

Strahlendosis Abbildung 15: Foci pro Zelle in Abhängigkeit von der Strahlendosis

Ähnlich zu der Färbung mit anti-ɣ-H2Ax, sind bei der Färbung mit anti-53BP1 48 Stunden nach der Bestrahlung die meisten Foci pro Zelle erkennbar. Die Kurve sinkt von der ersten

31 bis zur dritten Woche kontinuierlich ab und steigt zur vierten Woche hin wieder an. Ebenso korrelieren die Focianzahlen mit der Intensität der Bestrahlung.

mittlere Luminance der Foci

250 Ko 100 mGy 2 Gy 5 Gy

200

150

100

50

0 48 h

1 Woche

2 Wochen

3 Wochen

4 Wochen

Reparaturzeit Abbildung 16: mittlere Luminance (in Graustufen) der Foci in Abhängigkeit von der Reparaturzeit

mittlere Luminance der Foci

250

200

150

48 h 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen

100

50

0 Ko

100 mGy

2 Gy

5 Gy

Strahlendosis Abbildung 17: mittlere Luminance der Foci in Abhängigkeit von der Strahlendosis

Die Proteinaktivität in den Foci fällt nach 48 Stunden ab, steigt nach 4 Wochen allerdings wieder an. Dies gilt ebenso für die gesamte Zelle, wenn man auch die kleinen Foci miteinbezieht, die zunächst vom „count foci“- Programm nicht erkannt wurden.

mittlere Helligkeit in der Zelle minus außerhalb

32

Ko

14

100 mGy

12

2 Gy 5 Gy

10 8 6 4 2 0 48 h

1 Woche

2 Wochen

3 Wochen

4 Wochen

Reparaturzeit Abbildung 18: mittlere Luminance (in Graustufen) innerhalb der Zelle minus außerhalb in Abhängigkeit von der Reparaturzeit

mittlere Helligkeit in der Zelle minus außerhalb

14 48 h 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen

12 10 8 6 4 2 0 Ko

100 mGy

2 Gy

5 Gy

Strahlendosis Abbildung 19: mittlere Luminance (in Graustufen) innerhalb der Zelle minus außerhalb in Abhängigkeit von der Strahlendosis

Fläche des Kerns x mittlere Helligkeit im Kern minus außerhalb

33

30000 25000 20000 15000 Ko

10000

100 mGy 5000

2 Gy 5 Gy

0 48 h

1 Woche

2 Wochen

3 Wochen

4 Wochen

Reparaturzeit

Fläche des Kerns x mittlere Helligkeit im Kern minus außerhalb

Abbildung 20: Die Fläche des Kerns multipliziert mit der oben dargestellten relativen Luminance des Kerns steht in Relation zur DNA-Menge der Zelle; dargestellt in Abhängigkeit von der Reparaturzeit

30000 25000 20000 15000 48 h 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen

10000 5000 0 Ko

100 mGy

2 Gy

Strahlendosis Abbildung 21: Die DNA-Menge der Zelle in Abhängigkeit von der Strahlendosis

5 Gy

34

140

48h KO 48h 100mGy

120

48h 2Gy 48h 5Gy 100

4W KO

Zellzahl

4W 100mGY 4W 2Gy

80

4W 5Gy 60

40

20

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

Foci pro Zelle Abbildung 22: Verteilung der Focianzahl pro Zelle

Bei höherer Strahlenintensität oder längerer Reparaturzeit treten auch hier vermehrt Zellen auf, die bis zu 16 Foci aufweisen.

5.2 Flusszytometrische Analyse Der Versuchsaufbau für die flusszytometrische Analyse war wie in Tabelle 4 dargestellt, analog zu dem für das Immunostaining. Nach der Bestrahlung und entsprechenden Reparaturzeit wurden hier verschiedene Parameter untersucht, um die Zellpopulationen genauer zu charakterisieren. Besonderes Augenmerk liegt auf der Veränderung der βGalactosidase Aktivität, da diese die prämature Seneszenz indiziert. Daneben werden Zellzyklusveränderungen, Überlebensraten, RNA-Menge und der Anteil an apoptotischen sowie nekrotischen Zellen beleuchtet. Die langen Reparaturzeiten von bis zu vier Wochen sollen genauere Rückschlüsse auf die Zeitpunkte erlauben, an denen besondere Veränderungen aufgrund der ionisierenden Bestrahlung auftreten.

35

5.2.1 Darstellung der Überlebensraten der Zellen

100 90

dead alive

80

Live-Dead (%)

70 60 50 40 30 20 10

4 48 8h k h 10 o 0m g 48 y h 2g 48 y h 5g y 1w 1w k 10 o 0m g 1w y 2g 1w y 5g y 2w 2w ko 10 0m g 2w y 2g 2w y 5g y 3w 3w k 10 o 0m g 3w y 2g 3w y 5g y 4w 4w k 10 o 0m g 4w y 2g 4w y 5g y

0

Abbildung 23: Darstellung des prozentualen Verhältnisses zwischen vitalen (grün) und avitalen (rot) Zellen nach Behandlung und Reparaturzeit

Die Veränderung des Verhältnisses von vitalen zu avitalen Zellen gibt Aufschluss über die Strahlensensitivität der untersuchten Zellpopulation. Im Falle der P60 Fibroblasten zeigt sich ein signifikanter Vitalitätsverlust je höher die Bestrahlungsintensität gewählt wurde. Zudem erhöht sich der Anteil der avitalen Zellen, je länger die Reparaturzeit gewählt wird. Wenn man die Zelllinie P60 allerdings mit anderen vergleicht, so ist die Strahlensensitivität mit einem Höchstwert von 15% avitalen Zellen vergleichsweise gering.

36 5.2.2 Veränderung der RNA-Menge

25 0 Gray 0,1 Gray

20

G0 Pyronin

2 Gray 5 Gray 15

10

5

0 2

7

14

21

28

Reparaturzeit (Tage) Abbildung 24: Menge an RNA-Gehalt der Zellen in G0-Phase des Zellzyklus

Die RNA-Menge der Zellen in den einzelnen Zellzyklusphasen wurde mithilfe von Pyronin Y angefärbt. Die Veränderung der Fluoreszenzintensität korreliert mit der Ab- oder Zunahme der RNA-Menge. Trotz gewissen Unregelmäßigkeiten in den Werten lässt sich feststellen, dass die RNA-Menge über die Dauer der Reparaturzeiten, sowie durch eine Erhöhung der Strahlenintensität abnimmt.

37

5.2.3 Verschiebung des Zellzyklus durch Bestrahlung

12 subG1 >G2M

Zellzahl (%)

10 8 6 4 2

4 48 8h k h 10 o 0m g 48 y h 2g 48 y h 5g y 1 1w w k 10 o 0m g 1w y 2g 1w y 5g y 2 2w w k 10 o 0m g 2w y 2g 2w y 5g y 3w 3w k 10 o 0m g 3w y 2g 3w y 5g y 4 4w w k 10 o 0m g 4w y 2g 4w y 5g y

0

Abbildung 25: Verteilung der Zellen über die Zellzyklusphasen. Sub G1 (blau); >G2M (rot)

Wie unter Punkt 4.3.1 beschrieben, ermöglicht die durch das Fluorochrom Hoechst angefärbte DNA-Menge die Zuordnung der Zellen zu einer bestimmten Zyklusphase, in der sie sich nach der jeweiligen Reparaturzeit befinden. Durch die Behandlung mit unterschiedlich Dosen ionisierender Strahlung kann man im Vergleich zur unbestrahlten Kontrollgruppe eine Veränderung hinsichtlich der Zuteilung auf die unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus feststellen. Trotz leichter Unregelmäßigkeiten lässt sich feststellen, dass durch die Bestrahlung der prozentuale Anteil der Zellen, die sich in der subG1 und >G2MPhase

(>1

diploider

DNA-Satz)

befinden,

ansteigt.

Sowohl

die

Erhöhung

der

Bestrahlungsintensität, als auch die Verlängerung der Reparaturzeit führen zu stetigem Anstieg der Zellen in diesen beiden Zyklusphasen. Der Anteil der Zellen in G0/G1-Phase sinkt bei Erhöhung der Bestrahlungsintensität, wo hingegen der Anteil der Zellen in G2Mund S-Phase zunimmt (Abbildungen 25-27).

38

100 90

G0/G1 S-Phase G2M

80

Zellzahl (%)

70 60 50 40 30 20 10

48 48h h 1 0 ko 0m 48 gy h 2 48 gy h 5g y 1 1w w 10 ko 0m g 1w y 2g 1w y 5g y 2 2w w 10 ko 0m g 2w y 2g 2w y 5g y 3 3w w 10 ko 0m g 3w y 2g 3w y 5g y 4 4w w 10 ko 0m g 4w y 2g 4w y 5g y

0

Abbildung 26: Verteilung der Zellen über die Zyklusphasen G0/G1, S und G2M

Abbildung 27: Overlays der Zellzyklusverteilungen innerhalb der Reparaturzeiten. Zunahme der Zellzahl durch Erhöhung der Strahlendosis in subG1, G2M und >G2M, Abnahme des großen Peaks (G0/G1)

39

5.2.4 Zunahme an apoptotischen und nekrotischen Zellen vital Ann 7AAD --

120

Apoptose Ann 7AAD +-

Zellzahl (%)

100

Nekrose Ann 7AAD ++

80 60 40 20

4w 5gy

4w 2gy

4w 100mgy

4w ko

3w 5gy

3w 2gy

3w 100mgy

3w ko

2w 5gy

2w 2gy

2w 100mgy

2w ko

1w 5gy

1w 2gy

1w 100mgy

1w ko

48h 5gy

48h 2gy

48h 100mgy

48h ko

0

Abbildung 28: Anstieg des Anteils apoptotischer und nekrotischer Zellen durch Erhöhung der Strahlendosis

Durch die Kombinationsfärbung mit Annexin V und 7-AAD ist es möglich, viable Zellen und diejenigen die sich in Apoptose oder Nekrose befinden, zu unterscheiden und zu quantifizieren (siehe Punkt 4.3.2). Je höher die Bestrahlungsintensität gewählt wurde, desto mehr Zellen wurden apoptotisch. Nekrotische Zellen traten auch vermehrt bei höheren Strahlendosen und längerer Reparaturzeit auf, waren allerdings kaum nennenswert.

Abbildung 29: jeweils mit 5 Gy bestrahlt; links nach 48 Stunden, rechts nach 4 Wochen

40 5.2.5 Nachweis von CD 44 Die Messergebnisse zeigen, dass eine Erhöhung der Strahlendosis zu einer vermehrten Expression von CD44+ in der Zellmembran der Fibroblasten führt. Beim Vergleich der Kontrollgruppe über die Reparaturzeiten kann man eine Downregulation von CD44+ feststellen (Abbildung 30).

Abbildung 30: Veränderung der Messwerte von CD44+

41 5.2.6 Autofluoreszenz

50

Autofluoreszenz

45

Autofluoreszenz

40 35 30 25 20 15 10 5 4 48 8h h k 10 o 0m 48 gy h 2 48 gy h 5g y 1w 1w k 10 o 0m g 1w y 2g 1w y 5g y 2w 2w ko 10 0m g 2w y 2g 2w y 5g y 3w 3w k 10 o 0m g 3w y 2g 3w y 5g y 4w 4w k 10 o 0m g 4w y 2g 4w y 5g y

0

Abbildung 31: Autofluoreszenz in Abhängigkeit von den Versuchsbedingungen

Fibroblasten in prämaturer Seneszenz unterscheiden sich morphologisch von ihrem gesunden Pendant. Die Zellen sind größer, das Volumen steigt an, das Zellrelief flacht ab, und es finden sich vermehrt granulöse Strukturen (Goldstein 1990) (Toussaint et al. 2000). Diese phänotypischen Veränderungen führen zu einer Veränderung der Intensität der Autofluoreszenz. Die Messwerte der Autofluoreszenz korrelieren mit denen der im nächsten Abschnitt dargestellten β-Galactosidase-Aktivität (siehe Punkt 5.2.7; Abbildung 32). Je höher die Bestrahlungsdosen waren, desto höher waren die Messwerte der Autofluoreszenz.

42 5.2.7 Seneszenz assoziierte β-Galactosidase Aktivität

60 ß-Galactosidase Aktivität

C12 + 50 40 30 20 10

48 48h h 1 0 ko 0m 48 gy h 2 48 gy h 5g y 1 1w w 10 ko 0m 1w gy 2 1w gy 5g y 2 2w w 10 ko 0m 2w gy 2 2w gy 5g y 3 3w w k 10 o 0m 3w gy 2 3w gy 5g y 4w 4w 10 ko 0m 4w gy 2 4w gy 5g y

0

Abbildung 32: SA-ß Gal

Das Hauptaugenmerk der flusszytometrischen Analyse lag bei der Frage ob und wie sich die β-Galactosidase Aktivität unter den verschiedenen Versuchsbedingungen verändert. Um dies herauszuarbeiten wurden die Zellen wie unter 4.3.3 beschrieben mit C12 FDG gefärbt und anschließend im Durchflusszytometer analysiert. Wie in Abbildung 29 dargestellt, konnte sowohl durch die Steigerung der Strahlendosis, als auch durch längere Reparaturzeiten ein deutlicher, nahezu linearer Anstieg der β-Galactosidase Aktivität verzeichnet werden. Nach 4 Wochen stagnierten die Werte durchschnittlich auf Höchstniveau.

43

Abbildung 33: SA-ß-Galactosidase-Aktivität; Über die Dauer der Reparaturzeiten sieht man eine Rechtsverschiebung, die durch Dosissteigerung verstärkt wird.

44

6. Diskussion In dieser Arbeit wurde die humane Fibroblastenzelllinie P60 auf verschiedene Parameter des Alterungsprozesses hin untersucht. Das Ziel war es mithilfe der gewonnenen Daten eine Aussage über die Kinetiken der verschiedenen Marker für die zellulären Failsafe Programme Apoptose, Nekrose und Seneszenz sowie die DNA-Reparatur treffen zu können. Die Zellen wurden mit ionisierender Strahlung in den Dosen 0 Gy (unbehandelte Kontrollgruppe), 0,1 Gy, 2 Gy und 5 Gy behandelt und danach entweder 48 Stunden, eine Woche, zwei Wochen, drei Wochen oder vier Wochen zur Reparatur im Brutschrank belassen. Neben anderen Arten strahlungsinduzierter Schäden stellen Doppelstrangbrüche den schwerstmöglichen Schaden für die Zelle dar (Jeggo and Lobrich 2007). Diese mithilfe des Immunostainings darzustellen war die erste Aufgabe dieser Arbeit. Die Anzahl der ɣH2AxFoci, die den Parameter für Doppelstrangbrüche in der DNA darstellt, steigt wie in der Literatur angegeben zügig nach der Bestrahlung an. Im Verlauf über die verschiedenen Reparaturzeiten hinweg waren nach 48 Stunden zunächst die meisten Foci zählbar, deren Anzahl bis zur dritten Woche stetig abnahm. Ab der vierten Woche nach der Bestrahlung war wiederum ein deutlicher Anstieg an ɣ-H2Ax-Foci zu verzeichnen. Dies erscheint zunächst widersprüchlich. Allerdings konnte festgestellt werden, dass ab diesem Zeitpunkt vermehrt Zellen vorlagen, die mehr als 10 Foci zeigten. Dies deutet auf die Entstehung sogenannter Riesenzellen hin. Des Weiteren konnte ein direkter Zusammenhang der Strahlendosis mit der

Menge der aktiven Reparaturproteinmenge dargestellt

unbestrahlte

Kontrollgruppe

und

die

mit

100mGy

werden. Während die

bestrahlte

Zellgruppe

kaum

reparaturbedürftige DNA-Schäden aufwiesen, konnte ab 2 Gy eine nahezu lineare Relation zwischen Strahlenintensität und DSB-Menge aufgezeigt werden. Die Untersuchung des 53BP p1778 Proteins zeigte eine ähnliche Kinetik zu der des ɣ-H2Ax. Die Anzahl der Foci korrelierte über die Reparaturdauer hinweg mit der der ɣ-H2Ax-Foci, was sinnig erscheint, da beide Proteine, wenn auch in unterschiedlicher Weise, an der DNAReparatur beteiligt sind.

Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der flusszytometrischen Analyse der Zellkulturen hinsichtlich der Parameter der zellulären Failsafe Programme. Bei der Darstellung der Überlebensraten der Zellen nach der jeweiligen Behandlung zeigte sich ein steigender Vitalitätsverlust, je länger die Reparaturzeit und je höher die Strahlendosis gewählt wurden. Um die RNA-Menge der Zellen darzustellen wurde der Farbstoff Pyronin Y gebraucht. Obwohl die Messdaten eine gewisse Variabilität aufwiesen, konnte festgestellt

45

werden, dass die RNA-Menge über die Dauer der Reparaturzeiten und durch die Erhöhung der Strahlenintensität abnimmt. Der zentrale Punkt der flusszytometrischen Analyse war die Frage nach der Ausprägung der prämaturen Seneszenz bei Fibroblasten. Dies wurde mithilfe der durch C12 FDG dargestellten β-Galactosidase-Aktivität untersucht. Hier konnte verdeutlicht werden, dass je intensiver die Zellen bestrahlt wurden, und je länger die Reparaturzeit gewählt wurde, desto mehr Zellen seneszent wurden. Eine ähnliche Entwicklung konnte hinsichtlich apoptotischer Zellen festgestellt werden. Nekrotische Zellen waren nach starker Bestrahlung in der Minderzahl.

60 Apoptose Ann 7AAD +50

Nekrose Ann 7AAD ++

Zellzahl (%)

Seneszenz C12 + 40 30 20 10

48 48h h 1 0 ko 0m 48 gy h 2 48 gy h 5g y 1 1w w 10 ko 0m 1w gy 2g 1w y 5g y 2 2w w 10 ko 0m 2w gy 2g 2w y 5g y 3 3w w 10 ko 0m 3w gy 2 3w gy 5g y 4 4w w 10 ko 0m 4w gy 2g 4w y 5g y

0

Abbildung 34: Apoptose-, Nekrose-, und Seneszenz-Entwicklung im Vergleich

Seneszente Fibroblasten zeigen eine stark verminderte Mitoserate, bis hin zu einem völligen Stillstand des Zellzyklus. Sie bleiben zwar noch viele Monate am Leben und auch metabolisch aktiv, unterscheiden sich allerdings von ihren teilungsfähigen Nachbarn hinsichtlich zahlreicher Parameter, wie der morphologisch verringerten Zelldichte, der vergrößerten Zelloberfläche und -volumen, der Genexpression oder der Telomerlänge. Eine wichtige Frage die man beim aktuellen Wissensstand der Forschung stellen muss ist, ob die in dieser Arbeit dargestellte stressinduzierte prämature Seneszenz in vivo überhaupt existiert, beziehungsweise welche genaue Rolle sie im Alterungsprozess spielt (Toussaint 2000). Einschränkend muss an dieser Stelle erwähnt werden, dass in dieser Arbeit lediglich eine Fibroblastenzelllinie untersucht wurde und die Ergebnisse damit nur bedingt auf Gewebe übertragen werden können.

46

7. Literaturverzeichnis 1. 2. 3.

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48

8. Abkürzungsverzeichnis •

ATM Ataxia telangiectasia mutated

•

BAF Bafilomycin A1

•

BSA Bovine Serum Albumine

•

C12FDG 5-Dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside

•

DAPI 4´,6-Diamidino-2-phenylindol

•

DSB Doppelstrangbruch

•

FACS Flourochrome activated cell sorter

•

FKS Fötales Kälberserum

•

FL Fluoreszenz Sensor

•

FSc Forward Scatter

•

HR Homologe Rekombination

•

NHEJ Nicht homologes End Joining

•

PBS Phosphate buffered saline

•

PS Phosphatidylserin

•

SA- β-gal Senescence-associated beta-galactosidase

•

SSc Side Scatter

•

SSC Tween Standard Saline Citrat Tween

•

7AAD 7-Amino-Actinomycin

•

TBS Trishydroxymethylaminomethan buffered saline

49

9. Anhang Anlage 1: Nährmedium für P60 Fibroblasten Menge Inhaltsstoff 500 ml

Dulbecco´s MEM (Biochrom,Berlin,Deutschland)

55 ml

12% FKS (fötales Kälberserum)

5 ml

L- Glutamin 200Mm (Invitrogen,Neuseeland)

5 ml

1% Pen/Strep (Invitrogen,Neuseeland)

Anlage 2: Herstellung von 1x Phosphate buffered saline Lösung (PBS) Menge

Inhaltsstoff

40 g

NaCl

1g

KCl

7,7 g

Na2HPO4·12 H2O

1g

KH2PO4

Auffüllen auf 5 l Aqua bi dest. (steril) pH-Wert auf 7,4 einstellen, Herstellung in wiederverschließbarer, autoklavierter Glasflasche, Lagerung bei 2-8°C im Kühlschrank

Anlage 3: Herstellung von 1x Trypsin-Lösung Menge Inhaltsstoff 90 ml

1x PBS

In verschließbarer, steriler Glasflasche

10 ml

10x Trypsin

Lagerung bei 2-8 ˚C im Kühlschrank

50

Anlage 4: 4% Formaldehyd-Fixierlösung Menge

Inhaltsstoff

10,8 ml

37% Formaldehyd

89,2 ml

1x PBS

100µl

0,1% Triton X

Anlage 5a: 10x TBS Menge 12,114 g

Inhaltsstoff Trishydroxymethylaminomethan (Tris)

87,66 g

NaCl

Auf 1 l auffüllen

Aqua dest.

Anlage 5b: 1x TBS Menge

Inhaltsstoff

100 ml

10x TBS

900 ml

Aqua dest.

Anlage 6: Blockinglösung für das Immunostaining Menge

Inhaltsstoff

10 ml

10% FKS

1g

1% BSA

90 ml

1x PBS

0,3 ml

Natriumazid 1M

51

10. Danksagung An erster Stelle danke ich Herrn Prof. Dr. med. Rainer Fietkau, der mir die Durchführung dieser Arbeit im Labor für Strahlenbiologie an der Strahlenklinik Erlangen ermöglichte.

Ein besonderes Dankeschön gilt Herrn PD Dr. med. Luitpold Distel, der meine Arbeit von den ersten experimentellen Versuchen im Labor bis zur Auswertung der Ergebnisse und Fertigstellung tatkräftig und mit viel Geduld begleitete. Dass Sie mich trotz mancher Schaffenspause bedingungslos unterstützt haben bedeutet mir viel.

Mein herzlicher Dank gilt ebenso den Medizinisch Technischen Assistentinnen Frau Elisabeth Müller und Frau Doris Mehler für Ihre engagierte und liebevolle Art der Betreuung. Sie haben mir nicht nur die Arbeitsmethodiken im Labor geduldig erklärt und jede erdenkliche Frage beantwortet, sondern hatten auch in schwierigen Zeiten stets ein offenes Ohr für mich.

Ich danke meinem Bruder Max und meinem Vater für den Rückhalt in allen Lebenslagen. Ich bedanke mich bei Anne für die Ermahnungen diese Arbeit fertigzustellen und ihren Beistand, auf den ich mich stets verlassen konnte. Nicht zuletzt danke ich Lara für die Hilfestellung bei Fragen zu gewissen Text- und Datenverarbeitungsprogrammen.