UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM PROCEDIMENTO DE PREPARO DE AMOSTRA - LIVRE DE SOLVENTE ORGÂNICO - PARA DETERMINAÇÃO DE GLIFOSATO E AMPA EM GRÃOS DE SOJA

Gysellen Ferreira Vieira Lima

Mestrado em Química, Área de Concentração: Química Analítica e Ambiental.

CUIABÁ MATO GROSSO - BRASIL 2017

GYSELLEN FERREIRA VIEIRA LIMA

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM PROCEDIMENTO DE PREPARO DE AMOSTRA - LIVRE DE SOLVENTE ORGÂNICO - PARA DETERMINAÇÃO DE GLIFOSATO E AMPA EM GRÃOS DE SOJA

Dissertação

apresentada

à

Universidade

Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, para obtenção do título de Mestre em Química, Área de Concentração de Química Analítica e Ambiental.

CUIABÁ MATO GROSSO - BRASIL 2017

III GYSELLEN FERREIRA VIEIRA LIMA

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM PROCEDIMENTO DE PREPARO DE AMOSTRA - LIVRE DE SOLVENTE ORGÂNICO - PARA DETERMINAÇÃO DE GLIFOSATO E AMPA EM GRÃOS DE SOJA

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, para obtenção do título de Mestre em Química, Área de Concentração: Química Analítica e Ambiental.

APROVADA: 25 de setembro de 2017

Prof. Dr. Adley Bergson G. de Abreu

Prof.ª Drª Marilza Castilho

Prof. Dr. Ricardo Dalla Villa (Orientador)

IV

V DEDICATÓRIA

Á uma senhora forte, trabalhadora, mãe de dez filhos e que sempre se importou imensamente com os netos e não me falta elogios para descrevê-la, minha avó querida, Alaide Maria Dias Ferreira Mendes. DEDICO.

VI AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pois ele esteve comigo por todos os dias, me fazendo manter a fé e a perseverança, perante todas as adversidades. Agradeço aos meus pais, Lúcia e Loênio, por me ajudarem, acreditarem na minha capacidade, e pelo cuidado, carinho e amor incondicional que tem por mim. Deus não poderia ter me dado pais melhores. Agradeço ao Prof. Dr. Ricardo Dalla Villa, por ter aceitado a me orientar mesmo eu não tendo experiência anterior com a área. Muito obrigada professor, pela orientação e pelos inúmeros ensinamentos. Agradeço também as professoras Dra Michelle Fernanda Brugnera e Dra Eliana Freire Gaspar de Carvalho Dores, pelo apoio e incentivo para a realização deste trabalho. Agradeço aos professores, Dra Marilza Castilho, Dra Adriana Paiva de Oliveira e Dr. Adley Bergson Gonçalves de Abreu membros da banca examinadora. Sem dúvida suas contribuições foram muito importantes para a continuidade e conclusão deste trabalho. Agradeço em especial a professora Dra Oscarlina Lúcia dos Santos Weber, por nos ajudar a concluir as análises deste trabalho. Agradeço a todos os colegas queridos que conheci no mestrado, em especial, Bárbara, Danielle, Francisca, Keyla, Camila, Natalí, Carol, Letícia, Amanda, Lucas, Douglas, Patrick, André, que contribuíram e acompanharam todo o processo árduo que parecia não ter fim. Agradeço em especial a Barbi (Bárbara), por ter me ensinado um pouco da técnica e mais ainda pelo apoio nos momentos difíceis. Desde o dia que foi proposto eu trocar de projeto em 2016, senti que daríamos certo e foi assim, um dia uma ficava desesperada e a outra dava o incentivo e vice-versa, obrigada por tudo baixinha. Agradeço muito ao meu noivo, Alexandre, por ter me apoiado a concluir este trabalho. Neste período, aguentou minhas crises de ansiedade e desespero e, além disso, exerceu diferentes papéis, como por exemplo, psicólogo e em alguns dias como auxiliar de laboratório (mais precisamente lavando minhas vidrarias), obrigada por tudo meu amor, amo você e que continuemos nesta parceria por toda a vida. Enfim, agradeço a todos aqueles que aqui não foram citados, mas que contribuíram de forma direta ou indireta para conclusão deste trabalho. Obrigada e que Deus abençoe a todos!

VII RESUMO LIMA, Gysellen Ferreira Vieira, Universidade Federal de Mato Grosso, setembro de 2017. Desenvolvimento e validação de um procedimento de preparo de amostra – livre de solvente orgânico - para determinação de glifosato e AMPA em grãos de soja. Orientador: Ricardo Dalla Villa. No presente trabalho foi desenvolvido e validado um procedimento de preparo de amostras para determinação de glifosato e AMPA em grãos de soja utilizando-se água ultrapura como solvente e óxido de alumínio neutro (Al2O3) na etapa de pré-concentração. Inicialmente, as amostras foram trituradas e os analitos extraídos com água ultrapura sob agitação em vortex. Na pré-concentração dos analitos, os extratos foram eluidos em cartuchos recheados com Al2O3 que posteriormente foi lavado com sucessivas porções de água ultrapura para eliminação de coextratos. A remoção dos analitos do Al2O3 foi feita com solução aquosa 0,10 mol L-1 de hidróxido de sódio (NaOH) e o ajuste de pH dos extratos com hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3). Na avaliação do efeito de variáveis como massa de amostra e tempo de agitação foi feito um planejamento fatorial completo. As variáveis avaliadas exerceram efeito significativo (p ≤ 0,05, t de Student) sobre a recuperação do glifosato. A faixa linear de trabalho foi de 2,50 a 22,5 mg kg-1, por cromatografia de troca iônica com detector de condutividade (CTI-DC) e de 15 a 27 mg kg-1 por cromatografia liquida de alta eficiência com detector de UV/visível (HPLC-UV/Vis). A exatidão, expressa em termos de porcentagem de recuperação, foi superior a 85% com coeficientes de variação (CV) inferiores a 17% para ambas as técnicas analíticas. Os limites de detecção e quantificação do método para o glifosato foram de 1,20 e 5,00 mg kg-1 por CTI-DC e por HPLC-UV/Vis foram de 6,00 e 16,5 mg kg-1 para o glifosato e de 2,60 e 16,5 mg kg-1 para o AMPA. Estes limites são inferiores ao valor de referência estabelecido pela Codex Alimentarius que corresponde a 20 mg kg-1. Depois de validado, o método foi aplicado em duas amostras de soja em grão (orgânica e transgênica) e não foram detectados resíduos de glifosato nas mesmas. A utilização de água ultrapura e de Al2O3 no procedimento proposto proporciona exatidão e precisão semelhante aos clássicos de preparo de amostra para determinação de glifosato em grãos de soja, com a vantagem de não utilizar solventes orgânicos tóxicos, o que atende os preceitos da química verde e diminui os custos de análises.

Palavras-chave: herbicida, glycine max (L) Merr., cromatografia, Al2O3.

VIII ABSTRACT LIMA, Gysellen Ferreira Vieira, Universidade Federal de Mato Grosso, agosto de 2017. Development and validation of a sample preparation procedure - free of organic solvent - for the determination of glyphosate and AMPA in soybean grains. Orientador: Ricardo Dalla Villa. In the present work, a sample preparation procedure for the determination of glyphosate and AMPA in soybean grains was performed and validated using ultrapure water as solvent and neutral aluminum oxide (Al2O3) in the preconcentration stage. Initially, the samples were crushed and the analytes extracted with ultrapure water under vortexing. In the preconcentration of the analytes, the extracts were eluted in cartridges filled with Al2O3 that were later washed with successive portions of ultrapure water to eliminate coextracts. The Al2O3 analytes were removed with 0.10 mol L-1 aqueous solution of sodium hydroxide (NaOH) and the pH adjustment of the extracts was performed with sodium hydrogencarbonate (NaHCO3). In the evaluation of the effect of variables such as sample mass and agitation time, a full factorial design was done. The variables evaluated had a significant effect (p ≤ 0,05, Student's t) on glyphosate recovery. The linear working range was 2,50 to 22,5 mg kg-1, by ion-exchange chromatography with conductivity detector (CTI-DC) and from 15 to 27 mg kg-1 by high performance liquid chromatography with UV/ Visible detector (HPLC-UV/Vis). The accuracy, expressed in terms of percent recovery, was greater than 85% with coefficients of variation (CV) less than 17% for both analytical techniques. The limits of detection and quantification for glyphosate were 1,20 and 5,00 mg kg-1 by CTI-DC and by HPLC-UV/Vis were 6,00 and 16,5 mg kg-1 for glyphosate and 2,60 and 16,5 mg kg-1 for AMPA. These limits are lower than the reference value established by the Codex Alimentarius, which corresponds to 20 mg kg -1. After validation, the method was applied to two soybean samples (organic and transgenic) and no glyphosate residues were detected in them. The use of ultrapure water and Al 2O3 in the proposed procedure provides accuracy and precision similar to the classic sample preparation for the determination of glyphosate in soybean grains, with the advantage of not using toxic organic solvents, which complies with the precepts of green chemistry and reduces analysis costs.

Keywords: herbicide, glycine max (L) Merr., Chromatography, Al2O3.

IX LISTA DE FIGURAS Figura 1. Equilíbrios e constantes de dissociação do glifosato.......................................... 17 Figura 2. Equilíbrios e constantes de dissociação do AMPA. ............................................ 18 Figura 3. Representação da superfície do Al2O3 em pH ácido, neutro e básico ................ 23 Figura 4. Extração com água ultrapura. ............................................................................ 30 Figura 5. Eluição dos extratos aquosos de soja em cartuchos recheados com Al 2O3. ...... 31 Figura 6. Cromatogramas de um padrão aquoso 1,00 mg L -1 de glifosato obtido por CTIDC (A) e de glifosato e AMPA por HPLC-UV/Vis (B)......................................................... 35 Figura 7. Curvas analíticas para avaliação da linearidade instrumental obtidas por CTI–DC (A) e HPLC-UV/Vis (B) ...................................................................................................... 35 Figura 8. Cromatogramas de um extrato ajustado pH com NaHCO 3 (A) e de um extrato ajustado pH com NaHCO3 e com diluição de cinco vezes (B) ........................................... 39 Figura 9. Efeito da massa de amostra e tempo de agitação na etapa de extração do glifosato da amostra de soja. ............................................................................................. 40 Figura 10. Efeito da concentração de glifosato, volume de extrato de soja e vazão de eluição do extrato na etapa de clean-up ............................................................................ 41 Figura 11. Efeito da concentração de NaOH e do tempo de agitação na etapa de dessorção. ......................................................................................................................... 41 Figura 12. Cromatograma do branco analítico do método (A), do extrato de uma amostra de soja fortificada a 15,00 mg kg-1 com glifosato (B) e de um padrão a 0,86 mg L -1 de glifosato preparado em água (C) ....................................................................................... 42 Figura 13. Curva analítica obtida pelo método da superposição de matriz para glifosato no intervalo de concentração de 2,5 a 22,5 mg kg-1 por CTI-DC............................................ 42 Figura 14. Porcentagem de recuperação de glifosato obtido em ensaios de adição e recuperação para diferentes níveis de concentração (n=9)............................................... 43 Figura 15. Cromatograma do branco analítico do método (A), do extrato de uma amostra fortificada a 15,00 mg kg-1 com glifosato (B) e de um padrão a 0,86 mg L -1 de glifosato preparado em água (C) ..................................................................................................... 44 Figura 16. Curva analítica obtida pelo método da superposição de matriz para glifosato e AMPA no intervalo de 15 a 27 mg kg-1 por HPLC-UV/Vis ................................................. 44 Figura 17. Recuperação dos analitos em ensaios de adição e recuperação para diferentes níveis de concentração (n=6) ............................................................................................ 45

X LISTA DE TABELAS Tabela 1. Métodos de preparo de amostra e técnicas instrumentais para determinação de glifosato e AMPA em soja.................................................................................................. 22 Tabela 2. Informação nutricional rotulada na embalagem da matriz ................................. 30 Tabela 3. Recuperação média (Rec%) e %CV obtidas com as diferentes condições experimentais provenientes do planejamento fatorial completo do tipo 2 k (n=3). .............. 40 Tabela 4. Recuperação média (Rec%), %CV, LDM e LQM obtidos pelo método de preparo de amostra proposto com quantificação por CTI-DC e HPLC-UV/Vis (n = 6) ...... 46

XI LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. AOAC - Associação Oficial dos Químicos Analíticos, do inglês Association of Official Analytical Chemists CTI-DC - Cromatografia de Troca Iônica com Detector de Condutividade CV - Coeficiente de Variação FMOC-Cl – Cloroformiato de 9-fluorenilmetila GC-MS - Cromatografia a gás acoplada ao detector de espectrômetro de massas, do inglês Gas Chromatography - Mass Spectrometry HPLC-DF - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao detector de fluorescência, do inglês High Performance Liquid Cromatography IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia e Tecnologia LC-MS/MS - Cromatografia Líquida acoplada à espectrometria de massas, do inglês Liquid Chromatography - Mass Spectrometry LDI – Limite de Detecção Instrumental LQI - Limite de Quantificação Instrumental LDM - Limite de Detecção do Método LQM - Limite de Quantificação do Método LMR - Limites Máximos de Resíduos n – Número de medidas PTFE - Politetrafluoretileno r – Coeficiente de correlação Rec% - Porcentagem de recuperação Rs - Resolução S/N – Razão sinal ruído, do inglês Signal to Noise ratio SGM – Soja geneticamente modificada SPE - Extração em fase sólida, do inglês Solid Phase Extraction

XII SUMÁRIO 1.

INTRODUÇÃO...................................................................................................... 14

2.

OBJETIVOS ......................................................................................................... 16

2.1.

Objetivo Geral ..................................................................................................... 16

2.2.

Objetivos Específicos ......................................................................................... 16

3.

REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 17

3.1.

Considerações gerais sobre o glifosato ........................................................... 17

3.2.

Modo de ação do glifosato em culturas de soja convencional e de

geneticamente modificada.............................................................................................. 18 3.3.

Ocorrência de glifosato em soja e em seus derivados ................................... 19

3.4.

Métodos analíticos para a determinação de glifosato em grãos de soja ....... 20

3.5.

Óxido de alumínio (Al2O3) .................................................................................. 22

3.6.

Validação de métodos ........................................................................................ 23 3.6.1.

Seletividade ............................................................................................. 24

3.6.2.

Linearidade.............................................................................................. 25

3.6.3.

Precisão .................................................................................................. 25

3.6.4.

Exatidão .................................................................................................. 25

3.6.5.

Limite de detecção e quantificação ......................................................... 26

4.

MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 28

4.1.

Instrumentação ................................................................................................... 28

4.2.

Reagentes e soluções ........................................................................................ 29

4.3.

Amostras de soja ................................................................................................ 30

4.4.

Desenvolvimento de procedimento de preparo de amostras ......................... 30

4.5.

Validação do método .......................................................................................... 32 4.5.1.

Quantificação por CTI-DC ....................................................................... 32

4.5.2.

Quantificação por HPLC-UV/Vis .............................................................. 33

4.5.3.

Avaliação do desempenho do método proposto ..................................... 34

5.

RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 35

5.1.

Avaliação dos parâmetros instrumentais ......................................................... 35

5.2.

Desenvolvimento e otimização do método ...................................................... 36

5.3.

5.2.1.

Extração do glifosato dos grãos de soja .................................................. 36

5.2.2.

Clean-up .................................................................................................. 36

5.2.3.

Ajuste do pH do extrato alcalino .............................................................. 38

5.2.4.

Planejamento fatorial ............................................................................... 39

Validação do método proposto ......................................................................... 41 5.3.1.

Quantificação por CTI-DC ....................................................................... 41

XIII 5.3.2.

Quantificação por HPLC-UV/Vis .............................................................. 44

5.3.3.

Comparação dos métodos de quantificação por CTI-DC e HPLC-UV/Vis 45

5.4.

Aplicação do método.......................................................................................... 46

5.5.

Destino dos resíduos gerados no desenvolvimento do Trabalho. ................. 46

6.

CONCLUSÕES..................................................................................................... 48

7.

SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................... 49

REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 50

14 1. INTRODUÇÃO

O glifosato [N-(fosfonometil) glicina] é um herbicida sistêmico e de amplo espectro, que entrou no mercado no início da década de 1970. Deste então tem sido utilizado no controle de plantas daninhas e na dessecação de diversas culturas tais como soja, milho e algodão. Devido a sua eficiência e baixo custo, tornou-se um dos herbicidas mais utilizados no Brasil e no mundo (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002; BENBROOCK, 2016). O cultivo de soja geneticamente modificada (SGM), em meados dos anos 1990, teve uma grande contribuição para o aumento do consumo de glifosato, já que a mesma foi desenvolvida para ser resistente a este composto (ZHANG, 2013). O uso global de glifosato em culturas de SGM aumentou de 25 milhões de kg em 2000 para 233 milhões de kg em 2014 (BENBROOCK, 2016). O fato da soja transgênica SGM não metabolizar o glifosato, pode contribuir para a contaminação dos grãos desta leguminosa (ARREGUI et al., 2004; BØNH et al., 2014). A presença de resíduos de glifosato em soja é particularmente preocupante tendo em vista a variedade de produtos alimentícios derivada da mesma. O controle de qualidade destes grãos, em termos da contaminação por glifosato, depende fundamentalmente de métodos analíticos exatos, precisos, economicamente acessíveis e, com o advento da química verde, que dispense a utilização de solventes tóxicos. Nos métodos disponíveis para esta finalidade, o glifosato geralmente é extraído com água ultrapura e os extratos submetidos a uma etapa de purificação (clean-up), que envolve a extração de compostos apolares com diclorometano e dos polares e iônicos com resinas trocadoras de íons como, Amberlite-IRA (Cl-) e Amberlite IRA-420 (H+) (ABREU et al., 2008; ARREGUI et al., 2004; BOTERO-COY et al., 2013; ZHANG et al., 2013; CHAMKASEM; HARMON, 2016). Estes métodos têm como principal desvantagem a geração de resíduos e os custos relativamente altos. A escolha do adsorvente na etapa de clean-up é de suma importância, pois dela dependerá, a sensibilidade e a seletividade do método. Embora a utilização do adsorvente Al2O3 nesta etapa ainda não tenha sido relatada, algumas características deste composto sugerem que o mesmo seja um promissor adsorvente para o glifosato. Em pH entre 6,0 e 7,0 há um predomínio de cargas positivas na superfície do Al 2O3 (KASPRZYKHORDERN, 2004). Neste mesmo valor de pH o glifosato encontra-se predominantemente na forma aniônica o que favorece sua adsorção. Em pH superior a 9 a superfície da alumina encontra-se negativamente carregada e favorece a dessorção do glifosato. Esta hipótese é coerente com o comportamento do glifosato em solo, onde em pH entre 4,5 e 7,0 o mesmo está fortemente adsorvido a compostos como o Al2O3 e o Fe2O3

15 (TONI; SANTANA; ZAIA, 2006). Porém, é facilmente dessorvido quando o pH é elevado. Considerando-se que lipídios, proteínas entre outros compostos presentes na soja, apresentam propriedades bastante distintas do glifosato, principalmente no que se refere às características ácido/base, é possível que este composto possa ser adsorvido seletivamente na superfície do Al2O3 e favorecer o clean-up. Dentre as técnicas instrumentais para a quantificação de glifosato em soja destacase a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência (HPLC-DF) e a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS). Estas técnicas embora proporcionem resultados exatos e precisos possuem custos operacionais relativamente altos, e em alguns casos requerem prévia derivatização do analito (BOTERO-COY et al., 2013; ZHANG et al., 2013; SHARMA et al.,2015). A cromatografia de troca iônica com detecção por condutividade (CTI-DC) tem sido pouco explorada para a determinação de agrotóxicos com caráter iônico (GANGAL; BONDRE; RAMANATHAN, 2000), apesar de dispensar a utilização de solventes tóxicos e não requer a derivatização do analito. Dimitrakopoulos e colaboradores (2010) relatam a determinação de glifosato em água e em suco de laranja por cromatografia iônica, e segundo estes autores o método desenvolvido é direto, rápido, sensível e barato. Ante ao exposto, o presente trabalho propõe o desenvolvimento de um método de preparo de amostra para determinação de glifosato em grãos de soja por CTI-DC e a avaliação da utilização do Al2O3 no clean-up de extratos aquosos de soja.

16 2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral Desenvolver e validar um procedimento de preparo de amostra livre de solvente orgânico para determinação de glifosato e AMPA em grãos de soja, utilizando o Al2O3 para o clean-up dos extratos e pré-concentração do analito.

2.2. Objetivos Específicos  Avaliar a extração de glifosato e AMPA dos grãos de soja utilizando-se apenas água ultrapura como solvente;  Avaliar o uso do Al2O3 para o clean-up do extrato e pré-concentração dos analitos;  Avaliar o efeito das variáveis envolvidas nas diferentes etapas do preparo de amostra tais como: massa de amostra e tempo de agitação;  Validar (“in house”) o método proposto em termos de seletividade, linearidade, exatidão, precisão e limites de detecção e quantificação;  Avaliar a quantificação de glifosato por CTI-DC e de glifosato e AMPA por HPLCUV/Vis;  Aplicar o método validado em grãos de soja orgânica e transgênica;

17 3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1. Considerações gerais sobre o glifosato O glifosato (C3H8NO5P), cujo nome químico é N-(fosfonometil) glicina, é um herbicida sistêmico e de amplo espectro de ação, que entrou no mercado no início da década de 1970. Deste então tem sido utilizado na dessecação de plantas daninhas em diversas culturas, como soja, milho e algodão. Devido a sua eficiência e baixo custo tornou-se um dos herbicidas mais utilizados no Brasil e no mundo (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002; BENBROOCK, 2016). No ano de 2014 o glifosato ocupou a primeira posição, esteve entre os dez agrotóxicos mais comercializados no Brasil, com um consumo aproximado de 195 mil toneladas (IBAMA, 2017). No mesmo período, o uso mundial do herbicida foi de aproximadamente 826 mil de toneladas (BENBROOCK, 2016). Em condições ambientais, o glifosato é um sólido cristalino, muito solúvel em água (12 g L-1 a 25 °C) e pouco solúvel em solventes orgânicos comuns, como a acetona e o etanol. Este composto também possui comportamento zwiteriônico, assim como os aminoácidos. Os valores das constantes de dissociação (pKa) do glifosato são: pK1 = 0,8; pK2 = 2,2; pK3 =5,4; pK4 = 10,2, (Figura 1) (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002). OH

H

O

N

P

H

OH

H

O

N

P

OH

H

O

N

P

H

OH

H

O

N

P

H

OH

H

O

N

P

H

O O

N

P

O H O H Figura 1. Equilíbrios e constantes de dissociação do glifosato. Fonte: AMARANTE JÚNIOR et al., 2002 e COUTINHO; MAZO, 2005.

O

OH

O OH

O

O

OH

H

O

N

P

H H

OH O

N

P

O

O

pKa=5,4

pKa=10,2

O

+ H

O

+ H

O

+ H

O O

O

+ H

O O

O O

pKa=2,16

O

O O

O H

pKa=0,8

Em valores de pka abaixo de 0,8, o glifosato encontra-se com uma protonação no grupamento amino. Em valores de pka entre 0,8 a 2,16, tem-se predominância de uma

18 protonação no grupamento amino (-NH2+) e uma dissociação no grupamento fosfato (PO2H-). Em valores de pH entre 2,16 e 5,4, tem-se predominância de duas dissociações, uma no grupamento fosfato ( PO2H-) e outra no grupamento carboxila (-COO-), e a protonação no grupamento amino permanece. A partir de valores de pka 5,4 até 10,2, têm-se predominância de três dissociações, e acima de pka 10,2 o glifosato está na sua forma aniônica totalmente dissociado (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002). O glifosato em contato com o solo pode ser rapidamente degradado por uma grande variedade de microrganismos, por meio de duas rotas catabólicas, produzindo o ácido aminometilfosfônico (AMPA), seu principal metabólito, e sarcosina como metabólito intermediário (GALLI; MONTEZUMA, 2005). O AMPA possui propriedades semelhantes ao do glifosato e os valores de constantes de dissociação para este metabólito são: pK 1 = 0,90; pK2 = 5,6 e pK3 = 10,2 (DELMONICO et al., 2014). Os equilíbrios de dissociações do metabólito em função do pH podem ser observados na Figura 2. O

H3N

H3N

H3N

P

O OH

pKa= 0,9

H3N

P

OH

OH

O

O

P

O pKa= 5,6

H3N

P

OH

O

O

O

P

O

pKa= 10,2

H2N

O

P

O

+ H

O

+ H

O

+ H

O

Figura 2. Equilíbrios e constantes de dissociação do AMPA. Fonte: SILVA, 2011.

3.2. Modo de ação do glifosato em culturas de soja convencional e de geneticamente modificada A absorção do glifosato nas plantas acontece basicamente pela região clorofilada das folhas e tecidos verdes e translocado, preferencialmente pelo floema, para os tecidos meristemáticos (GALLI; MONTEZUMA, 2005). A elevada eficiência no controle das ervas daninhas ocorre devido ao modo de ação do herbicida que age sobre a enzima enolpiruvil

19 shikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) inibindo a via de síntese dos aminoácidos aromáticos essenciais, fenilalanina, triptofano e tirosina, os quais são precursores de outros produtos, como liguinia alcalóides, flavonóides e ácidos benzóicos. Os sintomas das plantas sob efeito deste produto incluem amarelamento dos meristemas, necrose e morte das mesmas em dias ou semanas (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002). Em lavouras de soja convencional o glifosato é utilizado como agente dessecante, e sua aplicação proporciona a eliminação total das plantas daninhas. Apesar da elevada eficiência deste herbicida para o controle das plantas daninhas, esta prática é bastante limitada, pois também ocasiona a eliminação da cultura de interesse. Neste cenário, novas tecnologias foram desenvolvidas para aumentar a eficiência no manejo das plantas daninhas nessas culturas. Com isso, por meio da tecnologia genética de DNA recombinante, foi desenvolvida a soja geneticamente modificada (SGM) com resistência ao glifosato (soja Roundup Ready). Onde a soja convencional recebeu um gene de uma bactéria do solo, conhecida por Agrobacterium, conferindo a cultura resistência à aplicação do herbicida (ABREU et al., 2008). Com o advento da SGM, tornou-se mais fácil para os agricultores o controle de plantas daninhas. Uma vez que a SGM não metaboliza o glifosato, o mesmo não irá inibir a produção de aminoácidos essenciais para o desenvolvimento da planta, que contribui para um controle eficiente das plantas daninhas sem prejudicar a cultura de interesse. Contudo, com a introdução da SGM, ocorreu um aumento no uso do glifosato na cultura, e com isso, resíduos deste composto pode vir a se acumular no vegetal e em seus grãos, como já foi relatado em alguns trabalhos (BØNH et al., 2014; SHARMA et al., 2015). Este contexto tem despertado a preocupação pública quanto à presença de resíduos de glifosato em alimentos (BAI; OGBOURNE, 2016).

3.3. Ocorrência de glifosato em soja e em seus derivados A soja em grãos e seus derivados são um dos principais alimentos utilizados como fonte de proteína vegetal, tanto para alimentação humana quanto na produção de ração para animais. Os consumidores desta leguminosa ou dos seus derivados podem estar em risco de exposição aos resíduos de glifosato, portanto torna-se imprescindível o monitoramento de glifosato em grãos de soja (ABREU et al., 2008; SHARMA et al., 2015). Dentre os trabalhos relatados na literatura para a determinação de glifosato em soja, tem se o trabalho feito por Arregui e colaboradores (2004), onde os autores determinaram resíduos de glifosato e AMPA nas folhas e grãos de soja. O monitoramento foi feito em cinco regiões da Argentina no período de 1997 a 1999, e foram determinados resíduos de glifosato entre 1,9 a 4,4 mg kg-1 nas plantas, e 0,1 a 1,8 mg kg-1 nos grãos.

20 Os autores também reportaram resíduos de AMPA, indicando que ocorreu a metabolização do glifosato na soja (ARRREGUI et al., 2004; ABREU et al., 2008). Bønh e colaboradores (2014) analisaram 31 lotes de soja, que incluíram SGM, orgânica e convencional, obtidas da Iowa, Estados Unidos. Nas amostras de grãos de SGM foram determinados concentrações médias de 3,3 mg kg-1 para glifosato e 5,7 mg kg-1 para AMPA. Nas amostras de soja orgânica e convencional, não foram detectados resíduos de glifosato e AMPA. Sharma e colaboradores (2015) desenvolveram um método para determinação de glifosato em grãos de soja e aplicaram o método desenvolvido em amostras de soja obtidas da Tailândia e Nepal. Neste estudo foram analisadas 53 amostras de dois lotes diferentes de soja e foram detectados resíduos de glifosato de 0,23 a 5,06 mg kg-1. Resíduos de glifosato e AMPA também foram determinados em produtos derivados de soja. Ehling e Reddy (2015) desenvolveram um método para determinação de glifosato e AMPA em vários ingredientes nutricionais derivados de soja, milho e beterraba açucarada e também em leite de vaca e leite materno. Na aplicação do método foram determinados resíduos de glifosato e AMPA de 0,10 e 0,21 mg kg-1 em proteína isolada de soja e de 0,85 e 2,7 mg kg-1 em proteína concentrada de soja, ambos derivados de SGM, respectivamente. Os resíduos não foram detectados em leite de soja, óleo de soja, óleo de milho, maltodextrina, sacarose, leite de vaca, leite em pó ou leite materno. Chamkasem e Harmon (2016) desenvolveram um método para determinação de glifosato, AMPA e glufosinato em soja e milho e aplicaram o método desenvolvido em uma amostra de soja e milho. Na aplicação foram determinados 11 mg kg-1 de glifosato e 4,9 mg kg-1 de AMPA na amostra de soja, e 6,5 mg kg-1 de glifosato e 0,065 mg kg-1 de AMPA na amostra de milho, e não foram detectados resíduos de glufosinato em concentrações acima de 0,03 mg kg-1 nas amostras avaliadas.

3.4. Métodos analíticos para a determinação de glifosato em grãos de soja O desenvolvimento de métodos analíticos para determinação de glifosato em grãos de soja ainda é pouco explorado. Uma das justificativas é a alta complexidade da matriz, que contém elevada concentração de lipídios, aminoácidos e carboidratos, fornecendo extratos inapropriados para a determinação instrumental. Além disso, as propriedades do glifosato, como elevada polaridade e solubilidade em água, baixa volatilidade e ausência de grupos cromóforos que absorvam na região ultravioleta e visível, dificultam a determinação do analito nesta matriz. A determinação de glifosato em grãos de soja envolve duas etapas cruciais, uma de purificação (clean-up) dos extratos de soja e outra de quantificação do analito. O clean-

21 up dos extratos de soja geralmente é feito por extração líquido-líquido com um solvente orgânico e/ou extração em fase sólida (SPE) com adsorventes ou resinas de troca iônica (TADEO et al., 2000; RAINA-FULTON, 2014; ADAMS et al., 2017). Nos métodos disponíveis para esta finalidade o glifosato frequentemente é extraído com água ultrapura dos grãos de soja, previamente triturados, e os extratos submetidos à etapa de clean-up, que envolve a extração de compostos apolares com diclorometano (DCM) e dos polares e iônicos com resinas trocadoras de íons, como resina trocadora de ânions Amberlite-IRA (Cl-) e de cátions 732 (H+) (ABREU et al., 2008; MARTINS-JUNIOR et al., 2009; BOTERO-COY et al., 2013; ZHANG et al., 2013; SHARMA et al., 2015; CHAMKASEM; HARMON, 2016). Após o preparo da amostra, a etapa seguinte consiste na quantificação do glifosato, e dentre os métodos instrumentais mais utilizados destacase os métodos cromatográficos, que usualmente requerem a prévia derivatização do analito. A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) pode ser empregada para determinação de glifosato em soja (ABREU et al., 2008), porém seu uso requer uma extensa derivatização do analito, para aumentar a sua volatilidade e permitir sua detecção. Além disso, as propriedades do glifosato limitam a utilização dos reagentes de derivatização frequentemente utilizadas na análise por CG-MS. Nestes processos, comumente são utilizados anidrido trifluoroacético (TFAA) e trifluoroetanol (TADEO et al., 2000). A cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência (HPLC-DF) é uma técnica recomendada pela EPA (Environmental Protection Agency) para a determinação de glifosato e AMPA em amostras de alimentos. Esta técnica também requer a prévia derivatização dos analitos, que geralmente é feita com cloroformiato de 9fluorenilmetila (FMOC-Cl) e cloreto de p-toluenosulfonila, para aumentar a sensibilidade e seletividade do método (ZHANG et al., 2013; SHARMA et al., 2015). A cromatografia liquida com detector de espectrometria de massas tandem massas (LC-MS/MS) tem sido relatada para determinação de glifosato em soja sem etapa de derivatização. Devido à evolução das colunas cromatográficas, que tem possibilitado o aumento de afinidade do analito com as novas fases estacionárias (BOTERO-COY et al.,; RAINA-FULTON, 2014; CHAMKASEM; HARMON, 2016). Em geral, os métodos cromatográficos com detecção de massas proporcionam bons resultados e elevada sensibilidade, no entanto, possuem um custo relativamente alto e requerem o uso de solventes. Na Tabela 1 são listados exemplos de métodos de preparo de amostra e técnicas instrumentais relatados na literatura para a determinação de glifosato e AMPA em grãos de soja.

22

Tabela 1. Métodos de preparo de amostra e técnicas instrumentais para determinação de glifosato e AMPA em soja. Preparo de amostra de soja Referência Técnica Purificação dos Extração do analito Derivatização extratos 20 mL de água + 5,0 mL de MartinsPor meio de uma DCM a 2,0 g de soja + LC-ESI Junior et al., extração liquido/liquido SD agitação mecânica por 60 /MS/MS (2009) com metanol min Por meio de uma extração em fase sólida 20 mL de água + 5,0 mL de Botero (SPE) com adsorvente DCM a 2,0 g de soja + Coy et al., Oasis HLB e posterior SD LC-MS/MS agitação em ultrassom por (2013) precipitação das 30 min proteínas presentes no eluato com ACN 50 mL de água + 4,0 mL de Por meio de uma Zhang et DCM a 5,0 g de soja + extração em colunas DPCS-Cl HPLC-DF al., (2013) agitação por 5 min + 10 min empacotadas com resina em ultrassom catiônica Por meio de uma Sharma et 4 mL de água + 1,0 mL de extração liquido/liquido FMOC-Cl + H3PO4 HPLC-DF al., (2015) metanol a 1,0 g de soja com metanol ACN: Acetonitrila **Adsorvente Oasis HLB composto de copolímero de N-vinilpirrolidona e divinilbenzeno SD: Sem derivatização DPCS-Cl: Cloreto de 3,6-dimetoxi-9-fenil-9H-carbazole-1-sulfonilo

A CTI-DC baseada em supressão de íons tem sido pouco explorada para a determinação de glifosato, apesar de ter sido reportada na literatura para determinação de glifosato em água, com limites de detecção de glifosato inferiores a 0,54 mg kg-1 (DIMITRAKOPOULOS et al., 2010; ZHU et al., 1999). A CTI-DC é uma técnica atraente e mais limpa, uma vez que comumente utiliza como fase móvel soluções aquosas de sais inorgânicos, como carbonato de sódio (Na2CO3), e tem sensibilidade e precisão satisfatória em relação à LC-MS/MS. Além disso, o custo de manutenção de um CTI-DC é menor quando comparado ao de outras técnicas analíticas como, por exemplo, LC-MS/MS (GANGAL; BONDRE; RAMANATHAN, 2000). De uma maneira geral, métodos para determinação de glifosato em soja são ainda escassos o que motiva a procura por alternativas que possam contribuir para o controle de qualidade desta importante matriz alimentícia, no que diz respeito à determinação de agrotóxicos.

3.5. Óxido de alumínio (Al2O3) O Al2O3, comumente conhecido como alumina, tem sido relatado na literatura como adsorvente para a recuperação de fosfatos de águas residuais e também no clean-up de amostras contendo lipídios (GILBERT-LÓPEZ; GARCÍA-REYES; MOLINA-DÍAZ, 2009; XIE et al., 2015). Além disso, apresenta grande aplicação como, catalisador, na produção

23 de cerâmica e na composição de fase estacionária em cromatografia (DIAS-FILHO; CARMO, 2006). O Al2O3, devido à sua elevada área de superfície, resistência mecânica e estabilidade térmica possui várias aplicações como adsorvente e catalisador. As características ácido/base da superfície do Al2O3 permitem um controle na capacidade de adsorção de compostos orgânicos como ácidos carboxílicos. As propriedades da superfície do Al2O3 dependem fortemente do pH e do ponto de carga zero, que pode variar de 7 a 10 dependendo do tipo do Al2O3. Em meio ácido, abaixo do ponto de carga zero, a superfície do Al2O3 é carregada positivamente sendo que em meio básico a superfície é carregada negativamente (Figura 3) (KASPRZYK-HORDERN, 2004).

Figura 3. Representação da superfície do Al2O3 em pH ácido, neutro e básico Fonte: KASPRZYK-HORDERN, 2004.

O fato do Al2O3 poder ser preparado com características ácida, neutra ou alcalina, é bastante útil para separação de substâncias que apresentam variações dessas características (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). Como o Al2O3 é um adsorvente polar, a retenção de substâncias polares é favorecida observando-se a seguinte ordem de adsorção: - CO2H > - OH > - NH2 > - SH > - CHO > C=O > - CO2R > - OCH3 > - CH=CH-. As moléculas orgânicas com grupos funcionais tais como grupos carboxílicos, fenólicos ou amino, podem ser fortemente adsorvidas a superfície do Al2O3, com energias de adsorção muito superiores a de outros compostos orgânicos, o que torna o Al 2O3 uma alternativa para a remoção desses compostos da água. Tendo em vista que a maioria dos ácidos carboxílicos é fraco a adsorção na superfície de Al2O3 é dependente pelo pH do meio (KASPRZYK-HORDERN, 2004). Assim, a capacidade de adsorção do Al2O3 pode ser modificada por ajustes de pH do meio, que pode propiciar uma adsorção seletiva de determinados compostos. Além disso, alguns trabalhos têm relatado a utilização de Al2O3 para adsorção de grupamentos fosfatos e carboxílicos (DIAS-FILHO; CARMO, 2006; XIE et al., 2015), o que sugere que o mesmo possa ser um promissor adsorvente para o glifosato, que possui ambos os grupamentos mencionados.

3.6. Validação de métodos

24 A validação de um método analítico visa demonstrar que o mesmo é apropriado para uma determinada finalidade analítica, e fornece resultados analíticos com confiabilidade, precisão e exatidão adequadas. A validação do método é um requisito dos órgãos de credenciamento do Brasil e de outros países, e para isso a maioria destes órgãos estabelece documentos oficiais que são diretrizes a serem adotadas no processo de validação (ANVISA, 2003a; RIBANI et al., 2004). No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e o Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO) são os órgãos que regulamentam a validação dos métodos analíticos. Estes órgãos disponibilizam documentos oficiais e orientações para validação de métodos analíticos. No caso da ANVISA tem-se a Resolução no 899 de 29/05/2003, enquanto o INMETRO disponibiliza o documento DOQ-CGGRE-008 de fevereiro de 2010. A validação de métodos pode ser classificada em dois tipos: validação no laboratório (“in house validation”) e validação completa (“full validation”). A validação no laboratório consiste na avaliação dos parâmetros de validação do método em um único laboratório sem repetir os experimentos em outros laboratórios (sem verificar a reprodutibilidade). Já na validação completa são avaliados todos os parâmetros de desempenho de validação do método incluindo a reprodutibilidade, desta forma a validação in house é uma etapa preliminar da validação completa (RIBANI et al., 2004). Os parâmetros comumente empregados na validação de métodos analíticos são seletividade, linearidade e faixa de aplicação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estes parâmetros são utilizados para demonstrar o desempenho dos métodos analíticos e, com base nestes, será classificado como adequado,

ou

não,

a

uma

determinada

aplicação

(TAVERINIERS;

LOOSE;

BOCKSTAELE, 2004). Cabe destacar, que de acordo com o tipo de ensaio, não será necessário a avaliação de todos estes parâmetros (INMETRO, 2010).

3.6.1. Seletividade A seletividade é definida como a capacidade do método em medir o analito alvo na presença de outros analitos, matrizes ou outros materiais potencialmente interferentes. Na cromatografia, pode-se avaliar a seletividade observando a presença de picos próximos ao tempo de retenção do analito de interesse. Uma das formas mais simples para se avaliar a seletividade do método pode ser feito por meio da comparação dos cromatogramas da matriz da amostra isenta do analito e o da matriz fortificada com padrão do analito (AOAC, 2002).

25 3.6.2. Linearidade A linearidade de um método consiste em fornecer resultados proporcionais à concentração do analito, dentro de um determinado intervalo (TAVERINIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004). A avaliação da linearidade pode ser feita pelo método visual e/ou pela avaliação do coeficiente de correlação. Um coeficiente de correlação linear elevado (r > 0,99) é frequentemente recomendado como evidência da linearidade. Entretanto, não é recomendado o uso deste coeficiente como teste para definir a linearidade, sendo o exame visual usualmente é suficiente para este fim (AOAC, 2002).

3.6.3. Precisão A precisão pode ser definida como o grau de concordância entre os resultados experimentais obtidos de uma mesma amostra em determinadas condições, quanto mais próximos os resultados estiverem entre si menor a amplitude das medidas. O termo precisão fornece a dispersão dos valores medidos em torno de um valor médio, e seu valor numérico é estimado pelo desvio-padrão amostral (s) e desvio padrão relativo (RSD) ou coeficiente de variação (CV). Esses valores podem ser obtidos pelas Equações 1 e 2: s=

n i =1

xi − x 2

(1)

n−1

RSD % ou CV % =

S x

× 100

(2)

Onde: x é média aritmética do número de medições, xi é o valor individual de uma medição e n número de medições. A precisão também pode ser expressa em três formas: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade. A repetitividade (precisão intra-corrida ou intra-ensaios) expressa à precisão nas mesmas condições de operação, ou seja, equipamento, dia, analista, reagente e número de repetições, num curto intervalo de tempo. A precisão intermediária (precisão inter-corridas) expressa a precisão em diferentes condições de operação,

diferente

dias,

analistas,

equipamentos,

no

mesmo

laboratório.

A

reprodutibilidade (precisão interlaboratorial) expressa a precisão entre laboratórios, utilizando o mesmo método e amostra, entretanto diferentes laboratórios, analistas e equipamentos (BRITO et al., 2003; TAVERINIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004).

3.6.4. Exatidão A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro.

26 Os processos mais utilizados para a avaliação da exatidão são: uso de material de referência certificado, ensaios de recuperação e a comparação do método proposto com um método de referência (RIBANI et al., 2004). Nos ensaios de recuperação dos analitos (Rec%) as amostras em branco (sem o analito) são fortificadas em pelo menos em três diferentes níveis de concentração do analito dentro da faixa de uso do método. O cálculo de recuperação é usualmente é feito por meio da Equação 3: Rec% =

C1 C2

x 100

(3)

Onde: C1 é concentração do analito determinada na amostra fortificada, C2 é concentração teórica do analito. Os valores devem ser comparados com as taxas de recuperação aceitáveis, conforme estabelecidos por agências credenciadas. Os protocolos de validação recomendam no mínimo três níveis de concentração, e para cada nível sejam feitas de 3 a 10 repetições (TAVERINIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004).

3.6.5. Limite de detecção e quantificação O limite de detecção (LD) é a menor concentração do analito que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, enquanto que o limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração do analito que pode ser quantificada com exatidão e precisão aceitáveis. Os métodos mais empregados para a determinação do LD são: método visual, método relação sinal-ruído, método com base em parâmetros da curva analítica. Para a determinação do limite de detecção do método (LDM) e Limite de quantificação do método (LQM), pode ser utilizado o método proposto por Thier e Zeumer (1987). De acordo com estes autores o LDM pode ser estimado por meio de regressão linear. Neste método, as médias das concentrações medidas (recuperações) são colocadas em função dos respectivos níveis de fortificação e o coeficiente angular (S) da reta ajustada, é utilizado no cálculo do LDM, como pode ser observado na Equação 4: LDM =

2𝑡 (𝑔𝑙 ;95 ) ×s comb 𝑆

(4)

Onde: scomb é o desvio padrão combinado, S o coeficiente angular da equação de reta ajustada e “t” de student com gl graus de liberdade e para nível de confiança de 95%. O desvio padrão combinado é determinado pela Equação 5: scomb =

m−1 s A 2 +(z−1)s B 2 m+z−2

(5)

27 Onde: scomb o desvio padrão combinado, SA o desvio padrão das concentrações medidas no menor nível de fortificação utilizado no experimento; m é o número de determinações efetuadas no menor nível de fortificação, S B é o desvio padrão das respostas das determinações no branco analítico e z igual ao número de determinações efetuadas no branco analítico. De acordo Thier e Zeumer (1987) o LQM pode ser igual ou maior que o LDM, e corresponde ao menor nível de fortificação dos ensaios de adição e recuperação, desde que o percentual de recuperação situe-se entre 70 a 120%, e o CV não seja superior a 20%.

28 4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Instrumentação Todas as medidas de massa foram feitas em balança analítica modelo 210 (Bel Mark, Monza, Itália), com precisão de ± 0,0001g. Para as medidas de volumes foram utilizados balões volumétricos (Pyrex) e micropipetas (Pipetman, modelo P200, Middleton, EUA e Kasvi, modelo K1-100B e K1-10000B, Paraná, Brasil) com volumes ajustáveis no intervalo de 20-200 µL, 100-1000 µL e 1000-10000 µL, respectivamente. Para o preparo dos padrões, soluções e amostras foi utilizado água ultrapura (18,2 MΩ cm-1) obtida com um sistema de purificação de água Milli-Q modelo Synergy (Millipore, Molsheim, França). Para o preparo de amostra foi utilizado um liquidificador modelo R17625 (Philips Walita, São Paulo, Brasil), peneira granulométrica com malha de 0,850 mm de abertura (Bertel, São Paulo, Brasil), agitador tipo vortex modelo VX-200 (Labnet, São Paulo, Brasil), centrífuga modelo 320R (Heittech, Fohrenstr, Alemanha), manifold para extração à vácuo (J.T. Backer, Darmstadt, Alemanha), com compressor de ar acoplado modelo Cal Dia-pump (Fanem, São Paulo, Brasil), banho ultrassônico modelo B3510 (Branson, São Paulo, Brasil) e pHmetro modelo Sension + pH31 (Hach, Barcelona, Espanha). Na quantificação do analito foi utilizado um cromatógrafo de íons (Metrohm, Herisau, Switzerland) modelo 940 profissional IC Plus, com detector de condutividade (IC Conductivity Metrohm), equipado com amostrador automático modelo 919 IC Autosampler plus, coluna Metrosep A Sup 7-250/4.0 (polímero de álcool polivinílico) 5 μm, 250 mm x 4,0 mm d.i, com pré-coluna Metrosep A Supp 16 guard/4.0 de mesma fase da coluna e uma coluna de guarda Metrosep RP 2 Guard/3,6. A eluição foi feita em modo isocrático com solução 10,8 mmol L-1 de carbonato de sódio à vazão de 0,8 mL min-1 a 45 ºC. Como regenerante foi utilizada uma solução 500 mmol L-1 de ácido sulfúrico. A aquisição e processamento dos dados foram feitos com software MagIC Net 3.1. Na quantificação dos analitos por HPLC-UV/Vis, foi utilizado um cromatógrafo (Varian, Califórnia, USA) modelo ProStar 240, com injetor automático modelo ProStar 410 AutoSampler, bomba quaternária modelo 240, coluna Phenomenex Gemini (C18) 5 μm, de 250 mm x 4,6 mm d.i, com coluna de guarda de mesma fase da coluna e detector de absorbância UV com arranjo de diodos modelo 330, com monitoramento a 240 nm. As condições cromatográficas utilizadas foram conforme descrito por Delmonico et al., (2014), onde a eluição foi feita em modo isocrático com solução tampão de fosfato de sódio 0,20 mol L-1 (pH = 3,0) e acetonitrila (92:08) a 1,0 mL min-1 a uma temperatura de 25,0 °C. Para a derivatização dos analitos foi utilizado um banho termostático modelo B480 (Buch, Oregon, EUA).

29 4.2. Reagentes e soluções Todas as soluções padrão de glifosato e AMPA foram preparadas a partir de padrões primários (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) com pureza de 99,0%. Hidróxido de sódio (Cromoline, São Paulo, Brasil), hidrogenocarbonato de sódio (Merck, Darmstadt, Alemanha) e óxido de alumínio neutro (J.T. Baker, Center Valley, Estados Unidos), todos com pureza de 98,0% foram utilizados no desenvolvimento do método. Ácido sulfúrico e carbonato de sódio (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) ambos com pureza

superior

a

98,0%

foram

utilizados

como

regenerante

e

fase

móvel,

respectivamente, nas determinações por CTI. Acetonitrila grau HPLC (J.T. Baker, Center Valley, Estados Unidos), fosfato de sódio monobásico e fosfato de sódio bibásico (Synth, São Paulo, Brasil) ambos com pureza superior a 98,0% foram utilizados no preparo da fase móvel nas determinações por HPLC. Ácido fosfórico (Cromoline, São Paulo, Brasil) com pureza de 98,0% foi utilizado para o ajuste de pH da solução tampão e cloreto de p-toluenossulfonilo (SigmaAldrich, Darmstadt, Alemanha) com pureza de 98,0% foi utilizado na derivatização dos analitos. As soluções padrão estoque, a 100 mg L-1, foram preparadas pela dissolução em água ultrapura dos padrões primários de glifosato e AMPA. Posteriormente estas soluções, foram utilizadas no preparo das soluções intermediárias a 10,0 mg L-1 dos analitos, que foi utilizada no preparo das soluções padrão de trabalho com concentração no intervalo de 0,0900 a 1,50 mg L-1 para determinações por CTI-DC e de 1,00 a 3,00 mg L-1 por HPLC-UV/Vis. Soluções 0,100 mg L-1 de hidróxido de sódio (NaOH) e 1,00 mg L-1 de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) foram utilizadas no preparo de amostra e solução a 10,0 mg L-1 de cloreto de p-toluenossulfonilo em acetonitrila e tampão de fosfato de sódio (pH = 11) foram utilizados para derivatização dos analitos para a determinação por HPLC-UV/Vis. Todas as vidrarias utilizadas foram primeiramente enxaguadas em água corrente, e imersas em solução aquosa a 2% (v/v) de detergente Extran Alcalino (Merck, Rio de Janeiro, Brasil) onde permaneceram por 12 horas. Posteriormente, foram enxaguadas com água corrente, e submersas em solução aquosa a 2% (m/v) de NaOH (Indaiá, São Paulo, Brasil) por cerca de 12 horas. Após esse período, foram enxaguadas com água deionizada e pequenas porções de água ultrapura (18,2 MΩ cm-1). E secas à temperatura ambiente (25 ± 3 °C).

30 4.3. Amostras de soja No desenvolvimento do método foi utilizada soja em grãos não transgênica coletada em supermercado local na cidade Cuiabá/MT. Na aplicação do método foi utilizada uma amostra de soja de cultura orgânica e outra transgênica, ambas coletadas na referida cidade. As informações nutricionais, obtidas do rótulo das embalagens das amostras são apresentadas na Tabela 2. Tabela 2. Informação nutricional rotulada na embalagem da matriz Soja NT Soja TG Soja OG Informações nutricionais -1 gg Carboidratos 22 24 53 Proteínas 32 28 8,4 Gorduras totais 16 16 3,4 Gorduras saturadas 0 2,0 0 Gorduras trans 0 0 0 Gorduras monoinsaturadas 3,7 Gorduras poli-insaturadas 9,6 Colesterol 0 Fibra alimentar 22 8,0 4,2 Sódio 0 0,3 0 NT: não transgênica; TG: transgênica e OG: orgânica

4.4. Desenvolvimento de procedimento de preparo de amostras Na extração dos analitos, 2,00 g da matriz, previamente trituradas até que passassem em peneira de malha 0,850 mm, foram fortificadas a 10,0 mg kg-1 do analito, e colocadas em tubos de ensaio do tipo Falcon (3,20 x 11,6 cm), sendo mantidas em repouso por 24 horas. Após a fortificação, 10,0 mL de água ultrapura (25 ± 3 °C) foram adicionados aos tubos de ensaio contendo a matriz, e o conteúdo dos tubos foi agitado em vortex por 10 minutos e centrifugado a 5000 rpm, por igual período, para a coleta do extrato. O procedimento de extração foi repetido por mais uma vez e os extratos misturados e destinados à etapa de pré-concentração e clean-up (Figura 4).

Figura 4. Extração com água ultrapura.

31 Para a pré-concentração do analito, 5,00 mL do extrato (pH = 6,3), foram eluidos à 1 mL min-1, em cartuchos (7 cm; ø=1,5 cm) recheados com 1,00 g de Al2O3 neutro, e previamente condicionados com 150 mL de água ultrapura. Na sequência, o clean-up do extrato foi feito pela eluição dos cartuchos com 50,0 mL de água ultrapura (pH = 5,6) para 2− remoção de íons como PO3− e co-extratos orgânicos, abundantes na amostra 4 e SO4

(Figura 5).

Figura 5. Eluição dos extratos aquosos de soja em cartuchos recheados com Al2O3.

Após o clean-up, o conteúdo do cartucho foi transferido para um tubo Falcon, juntamente com 5,00 mL de solução de hidróxido de sódio 0,10 mol L-1, para dessorção do analito em banho ultrassônico (40 kHz) por 10 minutos. Em seguida, foi feita a centrifugação, a 5000 rpm por 10 minutos, para a coleta do extrato final, que teve o pH ajustado na faixa de 10-11, com 500 µL de solução de bicarbonato de sódio 1,00 mol L-1. Por fim, o extrato foi filtrado em membrana 0,22 m de politetrafluoretileno (PTFE), diluído cinco vezes em água ultrapura e destinado para as determinações por CTI-DC. Devido ao elevado número de variáveis em cada etapa do método proposto, optouse por uma triagem prévia das mesmas. Na triagem, avaliou-se o modo de agitação (vortex e ultrassom) na etapa de extração, a massa de óxido de alumínio (0,500 e 1,00 g) na pré-concentração e clean-up, e o modo de agitação (vortex e ultrassom) na dessorção do analito do Al2O3. A avaliação do efeito das variáveis foi feita por comparação de média (teste t de Student, com 95% de confiança) do sinal analítico (área do pico) em cada conjunto de dados. Posteriormente, foi feita a avaliação dos efeitos das variáveis remanescentes, por meio de um planejamento fatorial completo do tipo 2k, onde k é o número de variáveis avaliadas (BARROS NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2010). Neste planejamento as variáveis operaram em dois níveis denominados nível inferior (-) e superior (+). Na etapa de extração do glifosato da amostra de soja foi avaliado o efeito da (o): i) razão entre a massa de amostra e volume de solução extratora, onde (-) foi de 2,00 g: 20 mL e (+) 4,00 g: 20 mL e ii) tempo de agitação onde (-) foi de 5 minutos e (+) 10 minutos. Na etapa de

32 pré-concentração do analito e clean-up dos extratos foi avaliado o efeito da (o): i) concentração do analito na matriz, onde (-) foi de 5,50 mg kg-1 e (+) 17,5 mg kg-1 ; ii) volume do extrato, onde (-) foi de 5,00 mL e (+) 10,0 mL e iii) taxa de eluição do extrato onde (-) foi de 1 mL min-1 e (+) 3 mL min-1. Na etapa de dessorção do analito foi avaliado o efeito da (o): i) concentração da solução extratora onde (-) foi de 0,0500 mol L-1 e (+) 0,100 mol L-1 e ii) tempo de agitação onde (-) foi de 5 minutos e (+) 10 minutos. Estes ensaios foram feitos em ordem aleatória, e como resposta foi utilizada a porcentagem de recuperação do analito. Os dados obtidos foram analisados com auxílio do software Statistica (versão 8, StatSoft Corp., Tulsa, EUA). Todos os ensaios foram feitos com amostras de soja previamente trituradas, peneiradas em malha de 0,850 mm, em triplicatas acompanhados de branco analítico. Para os ensaios de triagem e planejamento fatorial (etapas de extração e dessorção) as amostras foram fortificadas a 10,0 mg kg-1 do analito.

4.5. Validação do método 4.5.1. Quantificação por CTI-DC A validação dos parâmetros instrumentais foi feita com base em orientações da AOAC (2002) e Taverniers et al., (2004). A linearidade instrumental foi avaliada por meio do coeficiente de correção linear (r) entre a concentração do analito e o sinal analítico, e por exame visual das curvas analíticas preparadas no intervalo de 0,090 a 1,50 mg L-1. A precisão instrumental, expressa em termos de coeficiente de variação, foi avaliada por meio de nove injeções sucessivas de padrões do analito em três níveis de concentração (0,500; 0,820 e 1,16 mg L-1). Os limites de detecção (LDI) e de quantificação instrumentais (LQI) foram avaliados com base na razão entre o desvio padrão da resposta instrumental e o coeficiente angular de uma curva analítica no intervalo de 0,010 a 1,50 mg L-1. Devido à baixa sensibilidade instrumental não foi possível validar o método para o AMPA por CTI-DC. A validação do método foi feita com base em orientações de Thier e Zeumer (1987), AOAC (2002), e SANCO (2015). A seletividade foi avaliada por meio da comparação dos cromatogramas de extratos do branco analítico da amostra, do extrato de uma amostra fortificada a 15,00 mg kg-1 e de um padrão a 0,86 mg L-1 do analito. A linearidade foi avaliada por meio do coeficiente de correlação linear (r), entre a concentração do analito e o sinal analítico, e pelo exame visual de curvas analíticas, preparadas em triplicatas pelo método da superposição de matriz no intervalo de 2,50 a 22,5 mg kg-1. Para a construção destas curvas, diferentes volumes de uma solução padrão estoque 100 mg L-1 de glifosato foram adicionados a 2,00 g da matriz, previamente

33 triturada e peneirada em malha de 0,850 mm, afim de se obter extratos com concentrações no intervalo de 0,0910 a 0,820 mg L-1. A exatidão e a precisão foram avaliadas por meio de testes de adição e recuperação, em quatro níveis de fortificação (5,00; 10,0; 15,0 e 20,0 mg kg-1) com nove repetições para cada nível, acompanhado de um branco analítico para cada ensaio. Nestes ensaios, as amostras de soja (previamente triturada e peneirada em malha 0,850 mm) foram fortificadas pela adição de diferentes volumes de solução padrão aquosa 100 mg L-1 e deixadas em repouso por 24 horas a temperatura de 25 ± 3 °C para posterior aplicação do método de preparo de amostras. A exatidão e precisão foram expressas em termos de porcentagem de recuperação e coeficiente de variação das recuperações, respectivamente. Os limites de detecção (LDM) e quantificação (LQM) do método foram determinados por meio de ensaios de adição e recuperação de acordo com requisitos recomendados por Thier e Zeumer (1987). Para a determinação do LDM, foram relacionadas às massas adicionadas e recuperadas nos ensaios de adição e recuperação, nos níveis de 5,00; 10,0; 15,0 e 20,0 mg kg-1. O LQM corresponde ao menor nível de fortificação estudado e a porcentagem de recuperação pode variar entre 70 e 120%, com coeficiente de variação de até 20%.

4.5.2. Quantificação por HPLC-UV/Vis A validação dos parâmetros instrumentais e do método foi feita de maneira análoga ás descritas para determinações por CTI-DC. Na avaliação da linearidade instrumental foram preparados padrões com concentração no intervalo de 1,00 a 3,00 mg L-1 de AMPA e glifosato. Na avaliação da precisão instrumental, foram avaliados três níveis de concentração de 1,50; 2,00 e 2,50 mg L-1 dos analitos. O LDI e LQI dos analitos foram determinados do mesmo modo que na determinação por CTI-DC. Na avaliação da linearidade do método, foram preparados padrões com concentração no intervalo de 15,0 a 27,0 mg kg-1 de AMPA e glifosato. A exatidão e a precisão do método foram avaliadas em três níveis de concentração (17,5; 19,5 e 22,5 mg kg-1 ) com seis repetições para cada nível, acompanhadas de um branco analítico. O LDM e LQM foram determinados com base nos resultados dos testes de adição e recuperação. Na quantificação por HPLC-UV/Vis, após o ajuste do pH dos extratos com NaHCO3, o analito foi derivatizado de acordo com orientações de Delmonico et al., (2014). Posteriormente os extratos foram filtrados em membrana 0,22 µm de PTFE e destinados às análises por HPLC-UV/Vis.

34 4.5.3. Avaliação do desempenho do método proposto Depois de validado, o método foi aplicado a amostras de grãos de soja, orgânica e transgênica, obtidas em comércio da cidade de Cuiabá-MT e Londrina-PR. Nestes ensaios, também foram feitos controles analíticos com as amostras previamente fortificadas a 15 mg kg-1 dos analitos. Estes ensaios foram feitos em triplicata (n = 3) acompanhada de um branco analítico.

35 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Avaliação dos parâmetros instrumentais As condições cromatográficas utilizadas na quantificação por CTI-DC e HPLCUV/Vis possibilitaram a eluição dos analitos em até 30 minutos, com resolução (Rs) superior a 1,30, sendo o mínimo aceitável igual a 1,00 (AOAC, 2002) (Figura 6). Como mencionado anteriormente, não foi possível a quantificação do AMPA por CTI-DC, devido ao elevado limite de detecção para este analito (> 10 mg L-1).

-1

Figura 6. Cromatogramas de um padrão aquoso 1,00 mg L glifosato e AMPA por HPLC-UV/Vis (B)

de glifosato obtido por CTI-DC (A) e de

O exame visual das curvas analíticas (Figura 7) e os valores de r superiores a 0,99 indicam uma elevada correlação linear entre a concentração dos analitos e a resposta

0,5

Glifosato, S= 0,3284x - 0,0069, r² = 0,9998

1,5

Sinal analítico (nA)

Sinal analítico (mS/cm)

instrumental para as diferentes técnicas avaliadas (AOAC, 2002).

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0

0,3 0,6 0,9 1,2 -1 Concentração (mg L )

(A) 1,5

AMPA, S = 544089x - 158598 r² = 0,9960 Glifosato, S = 326592x - 62200 r² = 0,9971

1,2 0,9 0,6 0,3 1,0

(B) 1,5 2,0 2,5 3,0 -1 Concentração (mg L )

Figura 7. Curvas analíticas para avaliação da linearidade instrumental obtidas por CTI–DC (A) e HPLCUV/Vis (B)

36 Os valores de LDI e LQI por CTI-DC para o glifosato foram de 0,020 e 0,068 mg L1

, respectivamente, enquanto que por HPLC-UV/Vis foram de 0,23 e 0,86 mg L-1 para o

glifosato e 0,19 e 0,63 mg L-1 para o AMPA, respectivamente. A literatura relata limites de detecção para o glifosato em determinações por HPLC-UV/Vis da ordem de 0,009 mg L-1 e de até 0,00054 mg L-1 por CTI-DC (DIMITRAKOPOULOS et al., 2010; DELMONICO et al., 2014). Em concordância com estes trabalhos pode ser observado que o valor de LDI obtido por HPLC-UV/Vis foi mais de dez vezes maior que o obtido por CTI-DC. O CV do sinal analítico ficou abaixo de 8% para os analitos quantificados por CTIDC e HPLC-UV/Vis, em todos os níveis de concentração avaliados, o que indica uma boa precisão instrumental para ambas as técnicas (TAVENIERS, LOOSE; BOCKSTAELLE, 2004).

5.2. Desenvolvimento e otimização do método 5.2.1. Extração do glifosato dos grãos de soja Nestes ensaios foi observada uma elevada recuperação do glifosato presente em grãos de soja utilizando-se apenas água ultrapura como solvente extrator e agitação em vortex. Em uma única extração, foram obtidas recuperações de até 60%. Com duas extrações consecutivas foram obtidas recuperações superiores a 95% com CV inferior a 6%. Resultados semelhantes foram relatados por Granby e colaboradores (2003) que também utilizaram água como solvente extrator e obtiveram recuperações superiores a 85% com duas extrações consecutivas. Estes resultados podem ser justificados pela elevada polaridade e solubilidade do glifosato em água superior a 12,0 g L-1 a 25 ºC (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002; GRANBY et al., 2003). Também foi observado que o modo de agitação teve grande influência na recuperação do analito das amostras de soja. Quando a agitação em vortex foi substituída pela em ultrassom (40 kHz) a recuperação média diminuiu em 20%. Durante os ensaios com ultrassom foi observado visualmente que a agitação da amostra não foi intensa devido ao tamanho dos fragmentos da amostra (>0,500 mm), o que pode justificar as diferenças observadas.

5.2.2. Clean-up Devido à complexidade nutricional dos grãos de soja, que possui elevados teores de proteínas, lipídios e carboidratos em sua composição, os métodos para determinação de glifosato nesta matriz usualmente requerem uma etapa de clean-up para eliminar coextratos e permitir a determinação cromatográfica do mesmo (TADEO et al., 2000). Nesta etapa é muito comum a utilização de resinas trocadoras de íons, que tem como função a

37 adsorção do analito e eliminação dos interferentes da matriz (ARREGUI et al;. 2004; ABREU et al., 2008; ZHANG et al., 2013). Neste contexto, o Al2O3 pode ser uma excelente alternativa a estas resinas. Quando foi feita a eluição dos extratos aquosos de soja em cartuchos empacotados com Al2O3 (50-200 μm) foi observada uma elevada retenção do glifosato e a eliminação de grande parte da matéria orgânica solubilizada no extrato original. Em ensaios subsequentes, os cartuchos foram eluidos sucessivamente com porções de água ultrapura (pH = 5,6) para retirar componentes da matriz adsorvidos ao Al2O3. Nestes ensaios não foi observado a eluição do analito, o que contribuiu para a eficácia do clean-up. No extrato aquoso de soja (pH = 6,0 ± 0,5), assim como na água utilizada no clean-up (pH = 5,6 ± 0,5), o glifosato encontra-se predominantemente na forma aniônica (C3H6NO5P-3) (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002) e a superfície do Al2O3 positivamente carregada (AlOH2+), visto que o pH de carga zero da mesma está entre 7,0 a 9,0 (KASPRZYK-HORDERN, 2004), o que justifica a elevada interação entre ambos. Após o clean-up, os cartuchos foram eluidos com 5,0 mL de uma solução aquosa 0,10 mol L-1 de NaOH (pH12) para extração dos analitos. Destaca-se que, com o aumento do pH ocorre uma inversão da carga do Al2O3, e consequentemente a dessorção do analito, que em meio básico permanece negativamente carregado (KASPRZYKHORDERN, 2004). Apesar destas características do analito/adsorvente, nos ensaios iniciais a recuperação do analito foi inferior a 10%. Para aumentar as recuperações o Al2O3 foi removido dos cartuchos e submetido a uma extração com solução aquosa 0,10 mol L-1 de NaOH, porém assistida por agitação em ultrassom (40 kHz). Nessas condições foram obtidas recuperações superiores a 99% com CV inferior a 6%. Posteriormente, foi avaliada a agitação em vortex e ultrassom na etapa de dessorção do analito do Al2O3 e na etapa de extração do analito da soja. Na etapa de dessorção, ambas as técnicas resultaram em recuperações superiores a 98%, porém quando foi utilizada agitação por ultrassom foram obtidos CV inferior a 6%, enquanto que por vortex superior a 15%. Na etapa de extração do analito da soja, quando foi utilizada agitação em vortex a recuperação do analito foi superior a 75%, enquanto que por ultrassom a recuperação não ultrapassou a 58%. A extração assistida por agitação em ultrassom é mais eficiente quando aplicada a matriz sólida finamente pulverizada (BENDICHO, et al. 2012), como o Al2O3 (50-200 µm). O que pode justificar a diminuição na eficiência da extração quando aplicado em partículas maiores, como as de soja (0,500 mm). A utilização de 0,500 e 1,00 g de Al2O3 não teve influência na recuperação do analito, ambas resultaram em recuperações entre 88 e 90% Este resultado pode ser justificado pela elevada capacidade de adsorção do Al2O3 (KASPRZYK-HORDERN,

38 2004), que em ambos os casos possuem sítios ativos suficientes para adsorção do glifosato. No entanto, foi observado que os valores de CV aumentaram de 6 para 20% com a diminuição da massa do adsorvente de 1,0 para 0,5 g. Assim, optou-se por manter a utilização de 1,00 g de Al2O3. 5.2.3. Ajuste do pH do extrato alcalino A utilização de solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 0,10 mol L-1 resultou em extratos com pH superior a 13, o que impossibilita a injeção direta dos mesmos no sistema cromatográfico, que opera entre pH de 3 a 12. Inicialmente, optou-se pelo ajuste do pH com ácidos fortes como HCl, H2SO4 e HNO3, no entanto, foi observado que esta prática introduz grandes quantidades de ânions como Cl-, SO4-2 e NO3-, que pode sobrecarregar o sistema supressor de íons e até mesmo saturar a coluna cromatográfica, causando distorções nos cromatogramas. Este problema foi contornado pelo ajuste do pH dos extratos entre 10-11 com uma solução 1,00 mol L-1 de bicarbonato de sódio (NaHCO3). O NaHCO3 reage com NaOH para formar carbonato de sódio (Na2CO3), o que resulta num tampão básico formado por Na2CO3/NaHCO3, cujo pH é de aproximadamente 10 (MAHAN; MYERS, 1969). A adição do NaHCO3 minimizou as distorções nos cromatogramas, já que os íons bicarbonato (HCO3-) e carbonato (CO32-) são componentes da própria fase móvel. No entanto, este procedimento o ajuste de pH com NaHCO3 causou um desdobramento do pico do Glifosato (Figura 8A) que pode ter sido causado pela elevada concentração de Na2CO3/NaHCO3 (>20 mmol L-1) nos extratos, o que aumenta momentaneamente a força de eluição da fase móvel e contribui para o desdobramento do pico do analito e, a consequente alteração do perfil cromatográfico.

39

Figura 8. Cromatogramas de um extrato ajustado pH com NaHCO 3 (A) e de um extrato ajustado pH com NaHCO3 e com diluição de cinco vezes (B).

Este problema foi contornado com a diluição de cinco vezes dos extratos em água ultrapura (Figura 8B). Assim em todos os experimentos subsequentes, o pH dos extratos foram ajustados com NaHCO3 seguido da diluição de cinco vezes em água ultrapura. Além disso, após cada injeção do extrato, foi injetada uma água ultrapura para limpar possíveis ânions da matriz retidos na coluna.

5.2.4. Planejamento fatorial O método de preparo de amostra proposto pode ser dividido em três etapas: (i) extração do glifosato dos grãos de soja, (ii) clean-up dos extratos aquosos de soja e (iii) extração do glifosato adsorvido no Al2O3. Para cada uma destas etapas foi feito um planejamento fatorial completo do tipo 2k com intuito de avaliar o possível efeito das principais variáveis sobre a exatidão método (Tabela 3).

40 Tabela 3. Recuperação média (Rec%) e %CV obtidas com as diferentes condições experimentais k provenientes do planejamento fatorial completo do tipo 2 (n=3). Etapa Variáveis Condições avaliadas Rec ± CV (%) 1- (-) 2 (-) 5 84 ± 5,6 (i) Extração do Massa (g) de amostra e 2- (+) 4 (-) 5 94 ± 7,7 glifosato dos grãos tempo (min) de agitação em 3- (-) 2 (+) 10* 100 ± 11 de soja vortex 4- (+) 4 (+) 10 63 ± 9,4 1- (-) 5 (-) 5 (-) 1 96 ± 5,4 2- (+) 17 (-) 5 (-) 1 105 ± 6,0 3- (-) 5 (+) 10 (-) 1 92 ± 5,3 Concentração do analito 4- (+) 17 (+) 10 (-) 1 90 ± 6,5 (ii) Clean-up dos -1 (mg kg ), volume de extrato extratos de soja 5- (-) 5 (-) 5 (+) 3 117 ± 4,4 -1 (mL) e vazão (mL min ) 6- (+) 17 (-) 5 (+) 3 103 ± 11,5 7- (-) 5 (+) 10 (+) 3 102 ± 6,0 8- (+) 17 (+) 10 (+) 3* 99 ± 3,3 1- (-) 0,05 (-) 5 83 ± 5,7 -1 Concentração (mol L ) de 2- (+) 0,10 (-) 5 94 ± 13,8 (iii) Extração do NaOH e tempo (min) de glifosato do Al2O3 3- (-) 0,05 (+) 10 89 ± 5,3 agitação em ultrassom 4- (+) 0,10 (+)10* 104 ± 5,0 * Condição selecionada para o preparo de amostra

Na etapa (i) foi observado que a massa de amostra teve efeito significativo negativo na recuperação do analito, enquanto que o tempo de agitação não influenciou os resultados. Observa-se também que houve um efeito significativo negativo de interação entre a massa e o tempo de agitação em vortex (Figura 9). 30

Massa

Tempo

MassaxTempo

20

Erro

10 0

-10 -20

-7,4 -13,4 -23,5

-30 Efeito

Figura 9. Efeito da massa de amostra e tempo de agitação na etapa de extração do glifosato da amostra de soja.

Uma hipótese para esta combinação de efeitos é que o aumento de massa da amostra associado ao maior tempo de contato com o analito favoreceu a recombinação entre ambos e dificultou sua extração. Com isso, nos ensaios de validação foi utilizada a condição 3, que propiciou resultados mais exatos. Das variáveis avaliadas na etapa (ii), verificou-se que o volume de extrato aquoso de soja teve um efeito negativo e a taxa de eluição deste extrato um efeito positivo na recuperação do glifosato (Figura 10). Destaca-se que embora significativo o módulo destes efeitos foram pequenos e estão próximos do erro experimental. Todas as condições avaliadas proporcionam recuperações entre 90 e 117%, comumente aceitas pela maioria dos protocolos de validação para estes níveis de concentração. Desta forma,

41 nos ensaios de validação optou-se por utilizar a condição 8, tendo em vista, a maior exatidão dos resultados.

Erro

30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30

Concentração do analito ConcetraçãoxVolume

Volume de extrato ConcentraçãoxTaxa

0,02

9,7

-2,8

Taxa de eluição VolumexTaxa

-0,17 -6,0

-9,7

Efeito

Figura 10. Efeito da concentração de glifosato, volume de extrato de soja e vazão de eluição do extrato na etapa de clean-up

Na etapa (iii), foi observado que apenas a concentração de hidróxido de sódio teve efeito significativo na extração do glifosato (Figura 11). Embora a magnitude do efeito esteja muito próxima do erro experimental, estes resultados são consistentes com a hipótese de que o aumento do pH torna a superfície da alumina mais negativa e favorece o processo de dessorção do analito. Assim, para a validação do método optou-se pela utilização da Condição 8. 20

Concentração de NaOH

Tempo de agitação

ConcentraçãoxTempo

Erro

10 0

12,7

8,3

2,0

-10 -20 Efeito

Figura 11. Efeito da concentração de NaOH e do tempo de agitação na etapa de dessorção.

5.3. Validação do método proposto 5.3.1. Quantificação por CTI-DC A comparação entre o cromatograma do branco analítico (Figura 12A), do extrato de uma amostra fortificada a 15 mg kg-1 com glifosato (Figura 12B) e do padrão de glifosato a 0,86 mg L-1 (Figura 12C) evidencia a ausência de interferentes no tempo de retenção do analito e a seletividade do método.

42

Figura 12. Cromatograma do branco analítico do método (A), do extrato de uma amostra de soja fortificada -1 -1 a 15,00 mg kg com glifosato (B) e de um padrão a 0,86 mg L de glifosato preparado em água (C).

A semelhança entre o perfil cromatográfico apresentado nas Figuras 12B e 12C também indica que o método de preparo de amostra não influência as separações cromatográficas. Nos cromatogramas A e B podem ser observados picos com grande intensidade no intervalo de 2 a 11 minutos, atribuídos ao íon carbonato, resultante do ajuste de pH do extrato com NaHCO3 e outros íons não identificados possivelmente oriundos do Al2O3, NaOH, NaHCO3, e da própria matriz. O método da superposição de matriz proporcionou valor de r superior a 0,99 (Figura 13), no intervalo de concentração de 2,5 a 22,5 mg kg-1, o que indica uma elevada correlação linear entre a concentração do analito no extrato final e o sinal instrumental (AOAC, 2002; SANCO, 2015). Este método de calibração é recomendado para compensar possíveis efeitos de matriz (SANCO, 2015).

Sinal analítico (mS/cm)

0,075

Glifosato, S=0,003x + 0,0022 r² = 0,9930

0,060 0,045 0,030 0,015 0,000

0

5

10 15 20 -1 Concentração (mg kg )

25

Figura 13. Curva analítica obtida pelo método da superposição de matriz para glifosato no intervalo de -1 concentração de 2,5 a 22,5 mg kg por CTI-DC.

43 Nos ensaios de adição e recuperação foram obtidas recuperações entre 98,5 a 110% do analito com valores de CV inferiores a 11% (Figura 14). Para os níveis de fortificação avaliados recomendam-se recuperações entre 70 e 120% com valores de CV inferiores a 20% (SANCO, 2015). O analito não foi detectado em nenhum dos brancos analíticos. 140

%Recuperação máxima e mínima aceitável (SANCO, 2015)

% Recuperação

120 100 80 60 40 20 0

5

10 15 Nível de fortificação (mg kg-1)

20

Figura 14. Porcentagem de recuperação de glifosato obtido em ensaios de adição e recuperação para diferentes níveis de concentração (n=9)

Os valores de LDM e LQM para o glifosato foram inferiores a 5,00 mg kg-1 (Tabela 4). Estes limites são compatíveis com os limites máximos de resíduos (LMR) para glifosato em grãos de soja, estabelecido por agências ambientais de diferentes partes do mundo. O LQM é duas e quatro vezes menores que o valor de referência recomendado pela ANVISA (2003) e Codex Alimentarius (2006), que corresponde a 10 e 20 mg kg-1, respectivamente. Sharma e colaboradores (2015) reportaram valores de LDM inferiores a 0,20 mg -1

kg para a determinação de glifosato em grãos de soja por HPLC-DF. Neste trabalho, após a extração do glifosato com água ultrapura foi feito a clean-up com metanol para precipitação de proteínas e a derivatização do analito com FMOC-Cl para sua detecção por fluorescência. Botero-Coy e colaboradores (2013), reportaram LDM de 0,12 mg kg-1 para determinações de glifosato em grãos de soja por LC-MS/MS. Neste estudo, o analito também foi extraído com água ultrapura, porém na etapa de clean-up foi utilizado diclorometano e SPE (Oasis HLB) para partição de co-extratos lipídicos. Por fim, foi feita a precipitação de proteínas pela adição de acetonitrila. Observa-se que os trabalhos supracitados relataram valores de LDM inferiores ao obtido pelo método proposto o que pode ser justificado pelo sistema de detecção cromatográfico utilizado. Embora menos sensível, o método proposto também proporciona limites inferiores aos LMR de glifosato para soja, com a vantagem de dispensar a utilização de solventes orgânicos.

44 5.3.2. Quantificação por HPLC-UV/Vis A comparação entre o cromatograma do branco analítico (Figura 15A), do extrato de uma amostra fortificada a 16,5 mg kg-1 com glifosato e AMPA (Figura 15B) e do padrão a 1,75 mg L-1 dos analitos (Figura 15C), evidencia a ausência de interferentes no tempo de retenção dos analitos e a seletividade do método. A semelhança entre o perfil cromatográfico apresentado nas Figuras B e C também sugere que o método de preparo de amostra não influenciou as separações cromatográficas.

Figura 15. Cromatograma do branco analítico do método (A), do extrato de uma amostra fortificada a 15,00 -1 -1 mg kg com glifosato (B) e de um padrão a 0,86 mg L de glifosato preparado em água (C)

A calibração pelo método da superposição de matriz, no intervalo de concentração de 15 a 27 mg kg-1, proporcionou valores de r de 0,99 para o AMPA, e de 0,97 para o glifosato (Figura 16). A AOAC recomenda valor de r superior a 0,99, porém outros órgãos reguladores, como o INMETRO, consideram aceitáveis valores de r superiores a 0,90.

Sinal analítico (nA)

0,8

Glifosato, S = 8601,3x + 163359, r² = 0,9735 AMPA, S = 25484x + 10038, r² = 0,9972

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2

16

18 20 22 24 -1 Concentração (mg kg )

26

Figura 16. Curva analítica obtida pelo método da superposição de matriz para glifosato e AMPA no intervalo -1 de 15 a 27 mg kg por HPLC-UV/Vis

45 Nos testes de adição e recuperação, foram obtidas recuperações entre 85 a 111% e com valores de CV inferiores a 17% para ambos analitos avaliados (Figura 17). Estes resultados evidenciam a exatidão e precisão do método proposto (AOAC, 2002; SANCO, 2015). 140

%Recuperação máxima e mínima aceitável (SANCO, 2015)

% Recuperação

120

Glifosato AMPA

100 80 60 40 20 0 15,0

16,5

18,0

19,5

21,0

22,5

24,0

-1

Nível de fortificação (mg kg )

Figura 17. Recuperação dos analitos em ensaios de adição e recuperação para diferentes níveis de concentração (n=6).

O LDM para AMPA foi de 2,6 mg kg-1 e para o glifosato foi de 6,0 mg kg-1 e o LQM de 16,5 mg kg-1 para ambos os analitos. Destaca-se que o LQM obtido é inferior ao LMR para glifosato em grãos de soja estabelecido pela Codex Alimentarius (20 mg kg-1), porém não atende ao valor de referência estabelecido pela ANVISA (10 mg kg-1). Não há valores de referência para resíduos de AMPA em alimentos. A determinação de glifosato e AMPA por HPLC-UV/Vis em matrizes ambientais tem sido reportada por muitos autores, apesar disso, há poucos relatos para a determinação destes analitos em alimentos. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que o método de preparo de amostra proposto pode ser uma alternativa para a determinação de glifosato e AMPA em grãos de soja por HPLC-UV/Vis, que é uma das técnicas analíticas mais acessíveis para esta finalidade.

5.3.3. Comparação dos métodos de quantificação por CTI-DC e HPLC-UV/Vis Pode ser observado na Tabela 4 que para ambas as técnicas analíticas avaliadas as recuperações variaram entre 80-120% com CV inferiores a 20%. Observa-se também que os valores de LQM são suficientes para a quantificação de glifosato em grãos de soja em concentrações inferiores a 20 mg kg-1, que corresponde ao LMR estabelecido pela Codex Alimentarius (2006). Observa-se também que com exceção para o nível 22,5 mg kg-1, não houve diferenças significativas (p ≥ 0,05, t de Student) entre os resultados obtidos por CTI-DC e por HPLC-UV.

46 Tabela 4. Recuperação média (Rec%), %CV, LDM e LQM obtidos pelo método de preparo de amostra proposto com quantificação por CTI-DC e HPLC-UV/Vis (n = 6) LDM LQM -1 a Técnica Instrumental Analito NF (mg kg ) Rec (%) CV (%) -1 mg kg b 16,5 105 ±8,0 b CTI-DC Glifosato 19,5 103 ±5,0 1,20 5,0 b 22,5 108 ±5,0 b 16,5 103 ±9,0 b Glifosato 19,5 88 ±12 6,00 16,5 b 22,5 89 ±5,0 HPLC-UV/Vis b 16,5 85 ±12 b AMPA 19,5 91 ±18 2,60 16,5 b 22,5 111 ±6,0 a

b

Nível de fortificação; Um ou dois valores anômalos descartados do cálculo da média.

Embora a CTI-DC proporcione limites inferiores para o glifosato não foi possível à quantificação do AMPA por esta técnica. No entanto, fica evidente que o método de preparo de amostra é eficiente para extração do AMPA, que possui comportamento ácido/básico semelhante ao do glifosato. Destaca-se também que o extrato final obtido pelo método proposto está em meio aquoso, que é compatível com a maioria das técnicas analíticas instrumentais, inclusive o LC-MS/MS. Na literatura há relatos de LQM inferiores a 0,4 mg kg-1 para determinação de glifosato em grãos de soja por LC-MS/MS (BOTERO-COY, et al., 2013; CHAMKASEN; HARMON, 2016). Apesar de extremamente sensível esta técnica é mais onerosa que a CTI-DC e requer no preparo de amostra a utilização de solventes de elevada toxicidade como diclorometano, metanol e acetonitrila para precipitação de proteínas e compostos apolares.

5.4. Aplicação do método Depois de validado, o método foi aplicado a amostras de soja orgânica e transgênica obtidas em comércio da cidade de Cuiabá-MT e Londrina-PR. Nestas amostras não foram detectados nenhum dos analitos avaliados. Para garantir a confiabilidade das determinações, foram utilizados amostras fortificadas como controle a 15 mg kg-1 e para essas amostras foram obtidas recuperações no intervalo de 80-120% e com CV inferiores a 20%, por ambas as técnicas CTI-DC e HPLC-UV/Vis.

5.5. Destino dos resíduos gerados no desenvolvimento do Trabalho. Após os experimentos, os excedentes dos extratos aquosos de soja foram descartados na pia do laboratório em água corrente. Os resíduos alcalinos e ácidos foram devidamente neutralizados e tiveram o mesmo destino dos excedentes dos extratos. A

47 alumina utilizada no método foi armazenada para avaliação da reutilização da mesma nos procedimentos de extração. Os resíduos gerados por HPLC-UV/Vis foram segregados em frascos âmbar de 4L, devidamente rotulados e encaminhados para o tratamento de resíduos.

48 6. CONCLUSÕES A utilização de água ultrapura na extração de glifosato dos grãos de soja minimiza a geração de resíduos e evita a exposição do analista a reagentes tóxicos. A utilização de Al2O3 para o clean-up dos extratos aquosos de soja e adsorção de glifosato pode ser uma alternativa as resinas convencionais utilizadas para estes fins. No procedimento de preparo de amostra proposto variáveis como massa de amostra, volume de extrato utilizado na etapa de clean up e concentração de NaOH nas etapas de extração tiveram efeitos significativos, porém pequenos quando comparados ao erro experimental. De uma maneira geral, as recuperações do glifosato para a maioria das condições avaliadas proporcionam resultados aceitáveis em termos de exatidão e precisão. A CTI-DC pode ser uma alternativa à LC-MS/MS com a vantagem de não utilizar solventes tóxicos na composição da fase móvel e apresentar menor custo. O procedimento de preparo de amostra proposto com quantificação por CTI-DC foi seletivo para o glifosato e por HPLC-UV/Vis para glifosato e AMPA, e os valores de LDM e LQM do método atendem aos LMR estabelecidos pela ANVISA e Codex Alimentarius. Os testes de adição e recuperação, bem como as demais figuras de mérito avaliadas, indicam que o método proposto possui precisão e exatidão suficientes para determinação de glifosato e AMPA em soja e pode ser uma ferramenta útil no controle de qualidade deste alimento. Nos ensaios de aplicação do método não foi detectado concentração de glifosato nas amostras de soja avaliadas. Este resultado pode ser atribuído a boas práticas agrícolas na aplicação do glifosato ou ao prolongando tempo de armazenamento dos grãos, que pode contribuir para os processos de degradação deste herbicida. Apesar deste agrotóxico não ter sido detectado nas amostras avaliadas, destaca-se que seu monitoramento é de suma importância, tendo em vista a utilidade da soja na sociedade moderna.

49 7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS  Validar o método de preparo de amostra proposto para outros alimentos derivados de soja;  Aplicar o método para o monitoramento de resíduos de glifosato em grãos de soja em diferentes lotes de produção;  Fazer a validação interlaboratorial do método proposto.

50 REFERÊNCIAS

ABREU, A. B. G.; MATTA, M. H. R.; MONTAGNER, E. Desenvolvimento e validação de método de análise de glifosato em grãos de soja. Química Nova, v.31, n.1, p.5-9, 2008. ADAMS, S.; GUEST, J.; DICKINSON, M.; FUSSEL, R. J.; BECK, J.; SHOUTSEN, F. Development and validation of ion chromatography tandem mass spectrometry based method for the multi- residue determination of polar ionic pesticides in food. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.65, p. 7294-7304, 2017. AMARANTE JÚNIOR, O. P.; SANTOS, T. C. R.; BRITO, N. M; RIBEIRO, M. L. Glyphosate: properties, toxicity, use and legislation. Química Nova, v. 25, n. 4, p. 589593, 2002. ANVISA, A. N. D. V. S. Guia para Validação de Métodos Analíticos e bioanalíticos. Resolução - RE nº 899 de 29 de maio de 2003. ARREGUI, M.; LENARDO, A.; SANCHEZ, D.; MAILTRE, M.; SCOTTA, R.; ENRIQUE, S. Monitoring glyphosate residues in transgenic glyphosate-resistant soybean. Pest Management Science, v.60, p.163-166, 2004. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS (AOAC), 2002. Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary. 2002. Disponível em:http://www.aoac.org/imis15_prod/AOAC_Docs/StandardsDevelopment /SLV_Guidelines_Dietary_Supplements.pdf. Acesso em: 17 junh. 2017. BAI, S. H.; OGBOURNE, S. M. Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environmental Science and Pollution Research, v.23, p. 18988–19001, 2016. BARROS NETO, B.; SCARMINIO, I. S.; BRUNS, R. E. Como fazer experimentos. 4 ed. Editora Unicamp, p. 99-144, 2010. BENBROOK, C. M. Trends in glyphosate herbicide use in the United States and globally. Environmental Sciences Europe, v.28, p.1-15, 2016. BØHN, T.; CUHRA, M.; TRAAVIK, T., SANDEN, M.; FAGAN, J.; PRIMICERIO, R. Compositional differences in soybeans on the market: Glyphosate accumulates in Roundup Ready GM soybeans. Food Chemistry, v.153, p.207–215, 2014. BOTERO-COY, A. M.; IBANEZ, M.; SANCHO, J.V.; HERNANDEZ, F. Direct liquid chromatography–tandem mass spectrometry determination of underivatized glyphosate in rice, maize and soybean. Journal of Chromatography A, v.1313, p.157-165, 2013. BRITO, N. M. A. J.; O. P.; POLESE, L.; RIBEIRO, M. L. Validação de Métodos Analíticos: Estratégia de Discussão. Pesticidas: Revista de Ecotoxicologia e Meio Ambiente, v. 13, 2003 CALADO, V.; MONTGMORY, D. Planejamento de experimentos usando o Statistica. 1 ed. Rio de Janeiro: e-papers, 2003.

51 COLLINS, C.H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Fundamentos de cromatografia. Campinas, SP: Editora: Unicamp, 2006. CHAMKASEM, N.; HARMON, T. Direct determination of glyphosate, glufosinate, and AMPA in soybean and corn by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v.408, p.4995-5004, 2016. CODEX ALIMENTARIUS – FAO AND WHO FOOD STANDARDS. Pesticide Residues in Food and Feed, 2006. Pesticides database search.Disponível em: http://www.fao.org/faowho-codexalimentarius/standards/pestres/pesticide-detail/en/?p_id=158 Acesso em: 23 Junh. 2017. COUTINHO, C. F. B.; MAZO, L. H.; Complexos metálicos com o herbicida glifosato: revisão. Química Nova, v.28, n.6, p.1038-1045, 2005. DELMONICO, E. L.; BERTOZZI, J.; SOUZA, N. E.; OLIVEIRA, C. C. Determination of glyphosate and aminomethylphosphonic acid for assessing the quality tap water using SPE and HPLC. Acta Scientiarum, v.36, n.3, p. 513-519, 2014. DIAS - FILHO, N. L.; CARMO, D. R. Adsorption at Silica, Alumina, and Related Surfaces. Encyclopedia of Surface and Colloid Science. 2006. Disponível em: https://www.researchgate.net/publication/242304032_Adsorption_at_Silica _Alumina_and_Related_Surfaces Acesso em: 20 de julh. 2017. DIMITRAKOPOULOS, I. K.; THOMAIDIS, N. S.; KOUPPARIS, M. A. Effect of suppressor current intensity on the determination of glyphosate and aminomethylphosphonic acid by suppressed conductivity ion chromatography. Journal of Chromatography A, v.1217, p.3619–3627, 2010. EHLING, S.; REDDY, T. M.; Analysis of Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid in Nutritional Ingredients and Milk by Derivatization with Fluorenylmethyloxycarbonyl Chloride and Liquid Chromatography−Mass Spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.63, p. 10562−10568, 2015. GALLI, A. J. B.; MONTEZUMA, M. C. Glifosato: Alguns aspectos da utilização do herbicida na agricultura. 1ed. São Paulo: ACADCOM, 2005. GANGAL, N. D.; BONDRE, D. D.; RAMANATHAN, P.S. Determination of some pesticides and intermediates by ion chromatography. Journal of Chromatography A, v.884, p.243249, 2000. GILBERT-LÓPEZ, B.; GARCÍA-REYES, J. F.; MOLINA-DÍAZ, A. Sample treatment and determination of pesticide residues in fatty vegetable matrices: a review. Talanta, v.79, p.109-128, 2009. GRANBY, K.; JOHANNESEN, S.; VAHL, M. Analysis of glyphosate residues in cereals using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS). Food Additives and Contaminants, v.20, n.8, p.692–698, 2003. IBAMA - Agrotóxicos. Relatórios de comercialização de agrotóxicos. Boletim 2014. Disponível em:http://www.ibama.gov.br/agrotoxicos/relatorios-de-comercializacao-deagrotoxicos#sobreosrelatorios Acesso em: 28 de Jun. de 2017.

52 KASPRZYK-HORDERN, B. Chemistry of alumina, reactions in aqueous solution and its application in water treatment. Advances in Colloid and Interface Science, v.110, p.1948, 2004. MAHAN, B. M.; MYERS, R. J. Química: Um Curso Universitário. 1 ed. Blucher, 1969. MARTINS-JÚNIOR, H.; LEBRE, D. T.; WANG, A. Y.; PIRES, M. A. F.; BUSTILLOS, O. V. An alternative and fast method for determination of glyphosate and aminomethylphosphonic acid (AMPA) residues in soybean using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Rapid Communications In Mass Spectrometry, v.23, p.1029-1034, 2009. RAINA-FULTON, R. A Review of Methods for the Analysis of Orphan and Difficult Pesticides: Glyphosate, Glufosinate, Quaternary Ammonium and Phenoxy Acid Herbicides, and Dithiocarbamate and Phthalimide Fungicides. Journal of AOAC International, v. 97, p. 965-977, 2014. RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C.Validation for chromatographic and electrophoretic methods. Quimica Nova, v. 27, n. 5, p. 771-780, 2004. SHARMA, P. O.; PHOLPHANA, N.; RANGKADILOK, N.; PARKPIAN, PREEDA.; SATAYAVIVAD, J. Development of simple and sensitive HPLC method for determination of glyphosate residues in soybean. Nepal Journal of Environmental Science, v.3, p.2126, 2015. SANCO/11945/2015. European Commission Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed.Implemented. Disponível em: http://www.crlpesticides.eu/docs/public/tmplt_article.asp?CntID=727&LabID=100&Lang=E N Acesso em: 14 de julh. 2017. SILVA, E. R. Desenvolvimento de metodologia de baixo custo para determinação de glifosato usando microdispositivos eletroforéticos fabricados em poliéster-toner. 2011 (Mestrado-dissertação). Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos. TADEO, J. L.; SANCHEZ-BRUNETEA, C.; PEREZB, R. A.; FERNANDEZ, M. D. Analysis of herbicide residues in cereals, fruits and vegetables. Journal of Chromatography A, v.882, p.175-191, 2000. TAVERNIERS, I.; LOOSE, M.D.; BOCKSTAELE, E.V. Trends in quality in the analytical laboratory. II. Analytical method validation and quality assurance. Trends in Analytical Chemistry, v. 23, n. 8, p. 535-552, 2004. TONI, L. R. M.; SANTANA, H.; ZAIA, D. A. M.; Adsorção de glifosato sobre solos e minerais. Química nova, vol. 29, n. 4, 829-833, 2006. THIER, H. P.; ZEUMER, H. Manual of pesticide residue analysis. New York: VCH, v. 1, p. 218, 1987.

53 XIE, J.; LIN, Y.; LI, C.; WU, D.; KONG, H. Removal and recovery of phosphate from water by activated aluminum oxide and lanthanum oxide. Powder Technology, v.269, p.351357, 2015. ZHANG, Y.; ZHANG, Y.; QU, Q.; WANG, G.; WANG, C. Determination of glyphosate and aminomethylphosphonic

acid

in

soybean

samples

by

high

performance

liquid

chromatography using a novel fluorescent labeling reagent. Analytical Methods, v.5, p. 6465–6472, 2013. ZHU, Y.; ZHANG, F.; TONG, C.; LIU, W. Determination of glyphosate by ion chromatography. Journal of Chromatography A, v.850, p.297–301, 1999.