copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Farmaceutyczny www.fpn.info.pl

Cena 24,50 zł

Przegląd Naukowy

Miesięcznik

PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH

IC Value - Current 3.66 MNiSW 4

ROK VI (X) Nr 10/2009 (57)

Scientific Review in Pharmacy

Ekspresja genów związanych z regulacją cyklu komórkowegow komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę Biologiczna aktywność likopenu Modelowe postacie wybranych środków znieczulenia miejscowego. Cz. II. Ocena biofarmaceutyczna Aktywność przeciwnowotworowa wybranych dipirydotiazyn i dichinotiazyn zbadana w National Cancer Institute w Bethesdzie, USA Antyoksydacyjne właściwości czarnej porzeczki Wchłanianie wapnia w jelitach

ISSN 1425-5073

Zastosowanie magnetycznych nanocząsteczek tlenku żelaza w diagnostyce onkologicznej

1

Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk

Farmaceutyczny

Adres redakcji / Editorial Adress:

Przegląd Naukowy

Miesięcznik

PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH

ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / Poland Tel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345 Fax. + 48 32 364 11 58 E-mail: [email protected]

Index Copernicus 3,66 MNiSW 4

Scientific Review in Pharmacy

Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board Przewodniczący / Head: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec Członkowie / Members: Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria

Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia

Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary: Dr n. med. Robert D. Wojtyczka E-mail: [email protected]

Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board: Dr n. farm. Paweł Olczyk Dr n. biol. Małgorzata Kępa Mgr Anna Szeremeta Mgr Agnieszka Jura – Półtorak Dr n. hum. Anna Kierczak

Wydawca / Publisher:

Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego

Adres Wydawcy / Publisher Adress: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Poland tel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31

Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.) Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Agnieszka Romańska Robert Cyganik E-mail: [email protected] Nakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies

Skład / Technical Editor: Jerzy Partyka

Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education. Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja nie odpowiada.

All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for advertisements and reader letters.

Zdj. Zygmunt Wieczorek

Szanowni Państwo, Koleżanki i Koledzy, Drodzy Czytelnicy Z przyjemnością przedkładamy Państwu kolejny numer Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego. Anonsujemy w nim grudniowe, międzynarodowe Sympozjum na temat jakości kształcenia w europejskim szkolnictwie wyższym, roli uniwersytetów w kształtowaniu edukacyjnych standardów, pozyskiwania źródeł finansowania uczelni czy też – na temat roli szeroko rozumianego przemysłu w kooperacji ze szkołami wyższymi i wspierania ich rozwoju. Sympozjum to, pod nazwą Universities Challenged: Shaping the Future of Higher Education Standards in Europe, odbędzie się w Brukseli, 9 grudnia, w dziesiątą rocznicę ogłoszenia Deklaracji Bolońskiej. Dążeniem edukacyjnych sympozjów, takich jak obecnie anonsowane, czy konferencji, takich jak przedstawiane Państwu wcześniej, coroczne Konferencje Europejskiego Stowarzyszenia Wydziałów Farmaceutycznych (European Association of Faculties of Pharmacy), jest wskazanie znaczenia uniwersyteckiej edukacji jako kluczowej drogi do kreowania społeczeństwa opartego na wiedzy. Uczestnicy Sympozjum dyskutować będą nad realizacją kolejnych etapów, prowadzących do utworzenia Europejskiego Obszaru Szkolnictwa Wyższego. Celem spotkania będzie zachęcenie reprezentantów akademickich uczelni do rozwinięcia międzyuczelnianej współpracy, fundamentalnej dla podniesienia jakości kształcenia jak i utrzymywania najwyższych standardów edukacyjnych we wszystkich europejskich uniwersytetach. Jakość kształcenia w naszych Uczelniach weryfikowana jest nieustannie, zarówno przez zewnętrzne Komisje Akredytacyjne jak i w ramach uczelnianych Przedsięwzięć, takich jak studenckie kongresy, konferencje i konkursy. Ostatnim w tym roku ze studenckich naukowych przedsięwzięć był III Ogólnopolski Kongres Naukowy Młodej Farmacji – Bydgoszcz 2009, zaś ostatnim z Konkursów, gdzie absolwenci wszystkich kierunków nauczania prowadzonych na Wydziałach Farmaceutycznych prezentowali swoje prace magisterskie, był Finał Ogólnopolskiego Konkursu Prac

Magisterskich, który odbył się siedzibie Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego, w Warszawie. Miałam zaszczyt przewodniczyć temu Przedsięwzięciu. Niełatwe zadanie przypadło w udziale wysokiemu jury. Poziom wszystkich prac był niezwykle wysoki, podobnie jak sposób prezentacji dyplomowych osiągnięć czy dyskusja wyników. Gratulujemy zwycięzcom, a raczej zwyciężczyniom, które wyłoniliśmy po konkursowych zmaganiach. Pierwsze miejsce przypadło absolwentce Wydziału Farmaceutycznego w Warszawie, drugie – absolwentce Wydziału Farmaceutycznego w Sosnowcu, zaś trzecie – absolwentce Wydziału Farmaceutycznego Poznaniu. Gratulujemy Uczelniom, nauczycielom akademickim i studentom. Bogactwem naszego bieżącego numeru są jednak przede wszystkim opublikowane w nim prace. Dotyczą one wielu dziedzin nauk farmaceutycznych i medycznych. Pochodzą z różnych ośrodków naukowych w Polsce. Jestem ogromnie szczęśliwa, iż Farmaceutyczny Przegląd Naukowy, który stale ulepszamy pod względem formalnym, rozkwita pod względem merytorycznym właśnie dzięki Państwu. Serdecznie za to dziękuję. To nasze wspólne dzieło i nasza radość, i aż boję się tego powiedzieć – i sukces. Szanowni Państwo. Niniejszy numer jest dziesiątym w bieżącym roku. Tak więc, życzenia świąteczne powinnam składać nie teraz, lecz w numerze 12. Jednak nie zdążymy wydać dwóch kolejnych numerów, choć są one już składane. Proszę zatem przyjąć najserdeczniejsze życzenia wspaniałych, rodzinnych i pogodnych Świąt Bożego Narodzenia. Proszę przyjąć także najlepsze życzenia wszelkiej pomyślności w Nowym Roku, pogody ducha, sukcesów i poczucia szczęścia. I proszę pamiętać, że mamy wspólny cel. Piąć się w górę po tak trudnych do pokonania, kolejnych szczeblach rankingowej ministerialnej „drabiny”. Uda nam się to razem na pewno. Ze świątecznymi myślami, Redaktor Naczelny Prof. dr hab. Krystyna Olczyk

Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Miesięcznik

PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH

Index Copernicus 3,66 MNiSW 4

Scientific Review in Pharmacy

Nr 10 / 2009

Spis treści Ekspresja genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę0 Expression of genes associated with cell cycle regulation in promyelotic leukemia cells HL-60 exposed to cisplatin Biologiczna aktywność likopenu Biological activity of lycopene Modelowe postacie wybranych środków znieczulenia miejscowego. Cz. II. Ocena biofarmaceutyczna0 Model drug formulations of selected of local anaesthetics. Part II. Biopharmaceutical assessment Anticancer activity of the selected dipyridothiazines and diquinothiazines determined in National Cancer Institute in Bethesda USA0 Aktywność przeciwnowotworowa wybranych dipirydotiazyn i dichinotiazyn zbadana w National Cancer Institute w Bethesdzie, USA

0 11

17

20

26

Antyoksydacyjne właściwości czarnej porzeczki0 Antyoxidative properties of black currant

30

Wchłanianie wapnia w jelitach Intestinal absorption of calcium

35

Zastosowanie magnetycznych nanocząsteczek tlenku żelaza w diagnostyce onkologicznej Application of magnetic iron oxide nanoparticles i0 n oncological diagnostics

39

Universities Challenged: Shaping the Future of Higher Education Standards in Europe � ��������������������������������������������������������������������������� ����������������������������������������������������������������� ����������������������������������������������������������������������� ���������������������������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������� ������������������������������������� �

����������������������������������������������������������������� ����������������������������������������������������������������� �������������������������������������������������������

Radisson Blu EU Hotel Brussels

�

��������������������������������������������������������������������������� �������������������������������������������������������� ��������������������������������������

9th December 2009

�

����������������������������������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������� �������������������������������������������������������������������������� ��������������������������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������� ����������������������������������������������������������

Organised by

���������������������������������

“An International Symposium for gathering knowledge, discussing the latest challenges and sharing best practices in higher education quality and standards in Europe”

14 Great College Street, Westminster, London, SW1P 3RX T: +44 (0) 845 606 1535 F: +44 (0) 845 606 1539 W: publicpolicyexchange.co.uk

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

“Quality assurance is vital for making European higher education attractive and trustworthy, in line with the objectives of the EU modernisation agenda for higher education and the Bologna Process. Globalisation, economic integration and increased academic and professional mobility are making mutual recognition and cross-border quality assurance increasingly important. As a consequence, higher education is becoming more transparent and credible for citizens, employers and students within and outside Europe.” - Ján Figel, EU Commissioner, September 2009

“In the decade up to 2020 European higher education has a vital contribution to make in realising a Europe of knowledge that is highly creative and innovative.” “The objectives set out by the Bologna Declaration and the policies developed in the subsequent years are still valid today. Since not all the objectives have been completely achieved, the full and proper implementation of these objectives at European, national and institutional level will require increased momentum and commitment beyond 2010.” “We ask the higher education institutions to pay particular attention to improving the teaching quality of their study programmes at all levels. This should be a priority in the further implementation of the European Standards & Guidelines for quality assurance.” - Communiqué of the European Ministers Responsible for Higher Education, April 2009

Abstract and Programme Anticipating the fundamental curricular, governance and funding reforms needed to prepare for future challenges in a globalised economy, the EU launched the Bologna Process in 1999 and invited the Higher Education (HE) sector to seize the opportunity to play a central role. This was reinforced by the EU commitment in Lisbon from March 2000 to become “the most competitive and dynamic knowledge-based economy in the world, capable of sustainable economic growth with more and better jobs and greater social cohesion”. To achieve this, the HE reform process presupposes proactive multi-level, cross-border and cross-sector collaboration for the creation of diverse networks, new forms of partnerships and innovative research. Furthermore, the bid to raise the credibility, quality and standard of university education requires all stakeholders to work together in a new era of cooperation and engagement – critical ingredients for the creation of frameworks for action. A decade after the Bologna Declaration, an intense debate is still raging about the actual and comparative value of higher education in Europe. The current financial crises and rising unemployment have put the spotlight firmly on the quality and standards of university education at European and national levels. With its pivotal role as a driving force towards the creation of a knowledge base society, exercising enormous influence on the economic, social and research environment in Europe, the higher education sector continues to face critical structural and coordination challenges. Encompassing the EU knowledge triangle - education, research and innovation - this special International Symposium provides a timely opportunity for Universities and other stakeholders across Europe to assess the progress to date of the HE reform process. The symposium will also consider the steps needed to achieve the vision of creating a European Higher Education Area alongside a robust framework that encourages cooperation and collaboration between universities to improve the comparative quality and standard of higher education across Europe. The Centre for Parliamentary Studies welcomes the participation of all key partners, responsible authorities and stakeholders. The Symposium will support the exchange of ideas and encourage delegates to engage in thought-provoking topical debate.

7

Farm Przegl Nauk, 2009,10

Wednesday 9th December 2009 Radisson Blu EU Hotel, Brussels 09:00

Registration and Morning Refreshments

10:00

Chair’s Welcome and Opening Remarks

Prof. Luc Francois PhD, Director of AUGent (confirmed) 10:10

The European Higher Education Area – Myth or Reality? � Ten years after the Bologna Declaration � Higher education in the EU – comparative estimation of current levels within member states � Quality and standards – positive or negative trends? � Curricular, governance and funding reforms – the next steps � Possible solutions and future action plans

Speaker: Ms. Barbara Nolan, Head of Unite, Higher Education; Erasmus, DG Education and Culture, European Commission (confirmed) 10:40

First Round of Discussions

11:00

Morning Coffee Break

11:20

The Effectiveness of Governance Arrangements of Higher Education in Europe � Improving teaching – Identifying institutional structures and processes for optimal performance � Changing role of the state vis-à-vis higher education � The role of the universities as key actors in national higher education policies � Different ‘waves’ of educational reforms – lessons learned

Speaker: Prof. Luc Francois PhD, Director of AUGent (confirmed) 11:50

Second Round of Discussions

12:10

Networking Lunch

8

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

13:10

Creating Ground-Breaking Innovation in Higher Education � University and industry cooperation – sharing knowledge and harnessing the potential of university based research � Flexibility and relevance in education – new skills for new jobs � Market vs. higher education – differences in culture, values and mission � Dual funding deficit on education and research site – the role of the non-public sources

Speaker: Ms. Belen Bernaldo De Quiros, Head of Unite, Universities Business Partnerships, DG Education and Culture, European Commission (confirmed) 13:40

Third Round of Discussions

14:00

Short Break

14:10

Cooperation within the Higher Education Sector – Challenges Ahead � Inconsistent levels of cooperation between EU countries – structural difficulties and possible solutions � Access to international programmes – pathways towards creating knowledge based society � The emergence of global research networks – future challenges � Main pillars of sustainable cooperation in the field of higher education in Europe – mind mapping for the years to come

Speakers: Mr. Bernd Wächter, General Secretary, Academic Cooperation Association (tbc) Mrs. Anne Corbett PhD, Visiting Fellow, European Institute, London School of Economics (confirmed) 14:40

Fourth Round of Discussions

15:10

Chair’s Summary and Closing Remarks

15:20

Networking Reception and Refreshments

16:20

Symposium Close ** Please note that the programme and speakers are subject to change without notice **

9

Farm Przegl Nauk, 2009,10

10

Farm Przegl Nauk, 2009,10, 11-16

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Ekspresja genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę Expression of genes associated with cell cycle regulation in promyelotic leukemia cells HL-60 exposed to cisplatin Adam Wilczok1, Alicja Zajdel1, Jakub Wilczok2, Agnieszka Kłych1, Monika Paul-Samojedny3 Katedra i Zakład Biofarmacji; Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 2 Apteka „Grand” w Chorzowie 3 Katedra i Zakład Genetyki Medycznej; Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

1

Streszczenie Cisplatyna, lek przeciwnowotworowy stosowany w monoterapii jak i terapii skojarzonej wielu nowotworów, zaliczana jest do cytostatyków o działaniu niezależnym od cyklu podziałowego, niszczącym komórki niezależnie od ich stadium rozwoju. Aktywność przeciwnowotworowa cisplatyny jest związana z procesami regulacji cyklu komórkowego, a największe jej wiązanie do DNA ma miejsce podczas fazy S cyklu komórkowego. Stosując technikę mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) porównywano ekspresję genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę oraz w komórkach kontrolnych. Analizując sygnały fluorescencji 160 sond, wyselekcjonowanych z bazy NetAffx Analysis Center, reprezentujących ekspresję 84 genów bezpośrednio związanych z fazą G1, przejściem G1/S, syntezą DNA i jego replikacją, fazą G2, przejściem G2/M, punktami kontrolnymi, pozytywną regulacją cyklu komórkowego lub jego zatrzymaniem wykazano, że w badanych komórkach cisplatyna najsilniej stymuluje ekspresję genów BAX, GTSE1, DDX11, SKP2, MAD2L1 oraz hamuje ekspresję NBN i BCL2. Poznanie efektów zmienionej ekspresji tych genów jest szczególnie istotne dla określenia mechanizmu działania leku oraz powstawania oporności.

Abstract Cisplatin, an anticancer drug used in monotherapy and combined therapy of various tumors belongs to cytostatics which destroy cells undepending on the phase of their division. Cisplatin antitumour activity is associated with cell cycle regulation processes and its strongest binding to DNA takes place in the S phase of the cell cycle. Using oligonucleotide microarray technique (HG-U133A, Affymetrix) the expression pattern of genes associated with the cell cycle regulation in HL-60 promyelotic leukemia cells exposed to cisplatin and control cells was compared. Analysis of the fluorescence signals of 106 probes selected from NetAffx Analysis Center database, which represent expression of 84 genes directly related to G1 phase, G1/ S transition, DNA synthesis and its replication, G2 phase, G2/M transition, cell cycle checkpoints, and positive regulation of the cell cycle or its arrest, showed that in the tested cells, cisplatin in the greatest extent stimulates expression of BAX, GTSE1, DDX11, SKP2, MAD2L1 and decreases expression of NBN and BCL2 genes. Determination of effects of altered expression of these genes is particularly important for understanding of drug action mechanism, including acquired resistance to cisplatin. Key words: cisplatin, gene expression, cell cycle, promyelocytic leukemia cells, HL-60

Słowa kluczowe: cisplatyna, ekspresja genów, cykl komórkowy, komórki białaczki promielocytarnej, HL-60

Wstęp Cisplatyna jest lekiem przeciwnowotworowym stosowanym zarówno w monoterapii jak i terapii skojarzonej guzów przerzutowych jąder i jajników, szyjki macicy, raka pęcherza moczowego, płasko komórkowego raka głowy i szyi oraz raka płuc często w połączeniu z winblastyną, bleomycyną, etopozydem i doksorubicyną. Cisplatyna, podobnie jak karboplatyna, cyklofosfamid, ifosfamid, melfa-

lan, dakarbazyna, czy antracykliny (doksorubicyna, daunorubicyna, daktynomycyna), zaliczana jest do cytostatyków o działaniu niezależnym od cyklu podziałowego, niszczącym komórki niezależnie od ich stadium rozwoju. Mechanizm działania leku, który jest podobny do działania związków alkilujących polega na hamowaniu replikacji DNA na skutek tworzenia silnych wiązań między- i wewnątrzłańcuchowych w DNA. Tworzenie adduktów Pt – DNA jest przyczyną cytotoksyczności cisplatyny [1-3].

11

Farm Przegl Nauk, 2009,10 Analiza danych dotyczących ekspresji genów w linii ludzkich komórek raka jajnika A2780 poddanych działaniu cisplatyny lub oksaliplatyny wykazała, że leki te wpływają na procesy związane z odpowiedzią komórek na uszkodzenia DNA, cyklem komórkowym, apoptozą i naprawą DNA oraz różnymi ścieżkami przekazywania sygnałów i szlakami metabolicznymi [4]. Działanie cisplatyny nie jest fazowospecyficzne, chociaż największe jej wiązanie do DNA ma miejsce w fazie S cyklu komórkowego [3]. Regulacja cyklu komórkowego odbywa się przez uruchamianie kaskadowych reakcji fosforylacji i defosforylacji białek katalizowanych przez różnorodne kinazy białkowe oraz fosfatazy. Kinazy białkowe układu kontroli cyklu komórkowego, których aktywność zależy od nagromadzenia i rozpadu cyklin, są obecne w komórkach dzielących się podczas całego cyklu. W czasie cyklu komórkowego cykliny A, C, D i E są syntetyzowane w miarę upływu cyklu, zaś cyklina B jest syntetyzowana w fazie G2. Maksymalne stężenie cyklin występuje podczas mitozy, po czym ulega ono obniżeniu na skutek trawienia ich przez proteazy. Aktywacja kinaz zachodzi w dwóch krytycznych przedziałach czasowych tzw. punktach kontrolnych cyklu komórkowego, w fazie G1 prowadzi do przejścia z fazy G1 do S i zapoczątkowania syntezy DNA, natomiast pod koniec fazy G2 prowadzi do przejścia G2 do M i zapoczątkowania mitozy. Przejście z późnej fazy G2 do M następuje w rezultacie aktywacji kinazy MPF, znanej jako czynnik wywołujący dojrzewanie [5, 6]. Jak wynika z badań wykonanych na komórkach hodowanych w warunkach laboratoryjnych, zmiany w ekspresji genów widoczne są w czasie od 2 godzin do nawet 24 godzin ekspozycji na cisplatynę. Zarówno rodzaj jak i liczba genów ulegających nadekspresji lub hamowaniu ekspresji zależy od zastosowanych w eksperymencie linii komórek, a ponadto od czasu narażenia na ten cytostatyk [7, 8]. W przedstawianej pracy, w celu pełniejszego wyjaśnienia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za odpowiedź komórek nowotworowych na działanie cisplatyny, a przy okazji na mechanizmy decydujące o braku wrażliwości na ten lek, poddaliśmy ocenie zmiany w ekspresji genów związanych z regulacją cyklu komórkowego. Czas ekspozycji na cisplatynę został ograniczony do sześciu godzin, aby nie obserwować wtórnych efektów zmian w ekspresji genów związanych, np. z śmiercią komórki, które utrudniłyby interpretację wyników ze względu na ich nakładanie się z efektami pierwotnej odpowiedzi komórek na ten lek. Do badań wykorzystaliśmy hodowane w warunkach laboratoryjnych komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60, które wykazują istotną wrażliwość na cisplatynę [9, 10]. Badania ekspresji genów zostały wykonane z zastosowaniem techniki mikromacierzy oligonukleotydowych firmy Affymetrix.

Materiał i metody Hodowle komórkowe Materiał do badań stanowiły hodowane komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60. Komórki hodowano, zgodnie z zaleceniami ATCC, w standardowych warunkach (37°C, 5% wysycenie atmosfery CO2), w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (Gibco) wzbogaconej

12

10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS; Sigma), 100 µg /ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Sigma), 2 mM glutaminy (Sigma), 1 mM pirogronianu sodu (Sigma) i 4,5 g/l glukozy. Po 48 godzinach inkubacji do hodowli dodawano roztwór cisplatyny (Sigma) rozpuszczonej w DMSO (Sigma) tak aby uzyskać stężenie 0,22 µg/ml, odpowiadające wartości ID30 (Inhibitory Dose 30%). Hodowle kontrolne prowadzono w identyczny sposób, dodając po 48 godzinach czystego DMSO, stosowanego ze względu na ograniczoną rozpuszczalność cisplatyny. Po 6 godzinach inkubowania hodowli komórki zbierano i przygotowywano do ekstrakcji RNA. Ekstrakcja całkowitego RNA RNA ekstrahowano z użyciem odczynnika TRIZOL (Invitrogen Life Technologies), zgodnie z protokołem producenta. Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wykorzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen). Ekstrakty RNA oceniano jakościowo techniką elektroforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny oraz ilościowo przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech). Analiza aktywności transkrypcyjnej genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) Całkowite RNA (8µg) zostało wykorzystane do syntezy dwuniciowego cDNA (Gibco BRL SuperScript Choice system), które stanowiło matrycę do syntezy biotynylowanego cRNA (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego cRNA przeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3, a następnie po pozytywnej weryfikacji z mikromacierzą HG-U133A (Affymetrix). Znakowanie produktów hybrydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo kompleksem streptawidyna – fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna – fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGEWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG–U133A w przewodniku Gene Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). W następnym etapie płytki mikromacierzy odczytywano używając skanera Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies). Otrzymane wyniki intensywności fluorescencji zapisano i zarchiwizowano w programie Microarray Suite oraz specjalnie do tego celu przygotowanej bazie danych. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wyników w programie RMA Express polegającej na przekształceniu logarytmicznym wartości sygnału fluorescencji dla każdego transkryptu (log2) wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.7,0, Gnumeric, oraz Microsoft Excel. Wyodrębnienia grup genów związanych z cyklem komórkowym dokonano korzystając z bazy danych Affymetrix NetAffx™ Analysis Center (http://www. affymetrix.com/ analysis/index.affx) po wpisaniu kwerendy „cell cycle”, komercyjnie dostępnego zestawu przeznaczonego do badania genów cyklu komórkowego firmy SABiosciences oraz danych literaturowych. Z grupy 22283 sond mRNA, obecnych na mikromacierzy HG-U133A, wyfiltrowano za pomocą arkusza programu Gnumeric sygnały fluorescencji charakteryzujące ekspresję wybranych

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Tab. I. Ekspresja genów różnicujących związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na cisplatynę względem prób odniesienia (komórki eksponowane na DMSO), (SLR – ang. signal log ratio – stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych próbach, strzałka á - nadekspresja, strzałka â - spadek ekspresji genu w komórkach HL-60 eksponowanych na cisplatynę, * - geny kandydujące) nazwa sondy

symbol genu

211833_s_at

BAX

204315_s_at

GTSE1

208478_s_at

BAX

210206_s_at

DDX11

203626_s_at

SKP2 *

203362_s_at

MAD2L1 *

202907_s_at

NBN *

203685_at

BCL2 *

nazwa kodowanego białka Białko związane z BCL2 (BCL2-associated X protein) Białko 1 ulegające ekspresji w fazach G2 i S (G2 and S-phase expressed 1) Białko związane z BCL2 (BCL2-associated X protein) Zależna od ATP RNA helikaza DDX11 (ATP-dependent RNA helicase DDX11) Białko 2 związane z kinazą fazy S (p45) (S-phase kinase-associated protein 2 (p45)) MAD2 element punktu kontrolnego wrzeciona mitotycznego (MAD2 mitotic arrest deficient-like 1) Nibryna, kompleks naprawy uszkodzeń DsDNA (NBN, Nibrin) Białka rodziny BCL2 (BCL2)

transkryptów związanych z regulacją cyklu komórkowego. Porównując sygnały fluorescencji tych sond, uzyskane dla komórek kontrolnych oraz eksponowanych na cisplatynę, wyznaczono zbiory genów o ekspresji różniącej się więcej niż ± 2SLR - tzw. genów różnicujących oraz zbiory genów, których ekspresja była większa niż ± 2s, lecz mniejsza niż ± 2SLR – tzw. genów kandydujących.

Wyniki Analiza zawartości bazy danych Affymetrix NetAffx Analysis Center wykazała 6550 genów (stan na dzień 28.10.2009), których funkcja jest chociaż w najmniejszym stopniu powiązana z regulacją cyklu komórkowego. Spośród tych genów, do oznaczenia zmian w ich aktywności wywoływanych przez cisplatynę w komórkach HL-60 wybrano 84, które wydają się być bezpośrednio związane z tym procesem. Analizie poddano ekspresję genów uczestniczących w fazie G1 cyklu komórkowego oraz w przejściu G1/S: ANAPC2, CCND1, CCNE1, CDC34, CDK4, CDK6, CDKN1B, CDKN3, CUL1, CUL2, CUL3, SKP2, genów fazy S i replikacji DNA: ABL1, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, PCNA, RPA3, SUMO1, UBE1, genów fazy G2 oraz uczestniczących w przejściu G2/M: ANAPC2, DIRAS3, BCCIP, BIRC5, CCNB1, CCNG1, CCNH, CCNT1, CCNT2, CDK5R1, CDK5RAP1, CDK7, CDKN3, CKS1B, CKS2, DDX11, DNM2, GTF2H1, GTSE1, HERC5, KPNA2, MNAT1, a także genów od których zależy przebieg fazy M: CCNB2, CCNF, CDC2, CDC16, CDC20, MRE11A, RAD51. Ponadto porównano ekspresję genów regulujących punkty kontrolne i zatrzymanie cyklu komórkowego: ATM, ATR, BRCA1, BRCA2, CCNG2, CDC2, CDC34, CDK2, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2A, CDKN2B, CDKN3, CHEK1, CHEK2, CUL1, CUL2, CUL3, GADD45A, HUS1, KNTC1, MAD2L1, NBN, RAD1, RAD17, RAD9A, RB1, RBBP8,P53. Zbiór analizowanych genów uzupełniono o geny regulują-

wartość SLR 1,66 ↑ 1,39 ↑ 1,31 ↑ 1,17 ↑ 0,968 ↑ 0,887 ↑ -0,758 ↓ -0,799 ↓

ce cykl komórkowy: ABL1, ANAPC2, ANAPC4, DIRAS3, ATM, ATR, BCCIP, BCL2, BRCA2, CCNB1, CCNB2, CCNC, CCND1, CCND2, CCNE1, CCNF, CCNH, CCNT1, CCNT2, CDC16, CDC2, CDC20, CDK2, CDK4, CDK5R1, CDK6, CDK7, CDK8, CDKN1A, CDKN1B, CKS1B, DDX11, E2F4, GADD45A, KNTC1, MKI67, PCNA, RAD9A, RB1, SKP2, TFDP1, TFDP2, w tym również odpowiedzialne za negatywną regulację: ATM, BAX, BRCA1, CDKN2B, RBL1, RBL2, P53. Genom tym przyporządkowano 160 sond na mikromacierzy HG–U133A. Podczas analizy porównywano wartości sygnałów ekspresji genów uzyskane dla komórek hodowanych w obecności cisplatyny rozpuszczonej w DMSO z sygnałami otrzymanymi dla hodowli, do której dodano tylko DMSO stanowiącej układ odniesienia. Zmierzone wartości sygnałów fluorescencji dla genów różnicujących oraz genów o najbardziej zmienionej ekspresji, tzw. genów kandydujących, które, mimo iż znacznie różnią się ekspresją, nie spełniają kryterium genu różnicującego zestawiono w tabeli I. Cisplatyna, dodana do hodowli komórek HL-60, powoduje stymulację ekspresji BAX, GTSE1, DDX11, SKP2, MAD2L1 oraz hamowanie NBN i BCL2. Geny te pełnią bardzo istotne funkcje w procesach regulujących cykl komórkowy.

Dyskusja Analizując wyniki uzyskane w przedstawianej pracy, w pierwszej kolejności należy przypomnieć, jakie funkcje w badanych komórkach pełnią geny, których ekspresja pod wpływem cisplatyny uległa największej stymulacji bądź hamowaniu. Gen BAX, którego ekspresja znacząco wzrosła, jest odpowiedzialny za kodowanie białka powiązanego z Bcl2 (Bax), które jest niezbędne dla inicjacji uwalniania cytochromu c oraz innych czynników proapoptotycznych z zewnętrznej błony mitochondrium i przez to do aktywacji kaspaz podczas apoptozy. Białko supresorowe nowotworów

13

Farm Przegl Nauk, 2009,10 P53 powoduje wzrost ekspresji BAX. U ssaków rodzinę białek Bcl2 dzieli się na 3 podrodziny: podrodzinę Bcl2 (np. B-, Bcl-xl, Bcl-xs, A1), podrodzinę Bax (Bax, Bak, Bok) oraz podrodzinę BH3 (Bad, Bik, Bid). Białka z podrodziny Bcl2 (z wyjątkiem Bcl-xs) są inhibitorami apoptozy, natomiast białka z podrodziny Bax i BH3 są promotorami aktywnej śmierci komórki [11]. Obserwowana w komórkach HL-60 nadekspresja BAX, może warunkować wrażliwość na cisplatynę. Przypuszczenia te znajdują potwierdzenie w badaniach Perego i wsp., w których zaobserwowano, że komórki oporne na lek charakteryzują się niskim poziomem białka BAX [12]. Wysoka ekspresja genu BCL2 z niską ekspresją białka BAX są przyczyną niskiej śmiertelności i oporności komórek na chemioterapię. Obserwowane w wyniku oddziaływania cisplatyny na komórki HL-60 obniżenie ekspresji BCL2 oraz zwiększenie ekspresji BAX, wynika najprawdopodobniej z niewystarczającego poziomu białka BAX, niezbędnego w komórce podlegającej procesowi apoptozy. Gen GTSE1 bierze udział w syntezie G2  i  S enzymatycznego białka 1, ulegającego ekspresji w fazach S oraz G2 cyklu komórkowego, które w odpowiedzi na uszkodzenie DNA gromadzi się w jądrze i wiąże białko P53, powodując jego przemieszczenie z jądra i hamując jego zdolność do indukowania apoptozy. Nagromadzenie się białka GTSE1 powoduje opóźnienie przejścia komórki z fazy G2 do M [13]. Kolejnym z genów, którego ekspresja w komórkach HL-60 uległa zwiększeniu pod wpływem cisplatyny jest DDX11 koduje enzym, zależną od ATP helikazę RNA. Jego funkcja jest najprawdopodobniej związana z utrzymywaniem jakości przekazywania chromosomów i stabilności genomu. W opisywanym eksperymencie zaobserwowano wzrost ekspresji SKP2 – genu kodującego białko 2 związane z kinazą fazy S, które specyficznie rozpoznaje fosforylowany zależny od cyklin inhibitor 1B, znany również jako p27, przede wszystkim w fazie S i oddziałuje z białkiem 1 związanym z kinazą fazy S (SKP1, p19). Co ciekawe gen ten określany jest jako proonkogenny i współuczestniczący w patogenezie białaczek [14], biorąc pod uwagę skuteczność działania cisplatyny, wzrost ekspresji tego genu należy uznać za niepożądany. MAD2L1, którego ekspresja w próbach eksponowanych na cisplatynę, również uległa zwiększeniu, koduje białko będące składnikiem punktu kontrolnego tworzenia wrzeciona mitotycznego, który zapobiega przejściu do anafazy do momentu, gdy chromosomy nie są prawidłowo ułożone na płytce metafazowej i w ten sposób uniemożliwia podział komórki [15]. W badanych komórkach HL-60, poza omówionym już obniżeniem ekspresji BCL2, cisplatyna powoduje obniżenie ekspresji NBN, genu, który koduje białko nubrynę (nibrynę). Białko to bierze udział w naprawie pęknięć w dwuniciowym DNA, które w poważnym stopniu uszkadzają genom [16]. Warto zauważyć, że wzrost ekspresji genu nie zawsze przekłada się bezpośrednio na wzrost stężenia kodowanego przez ten gen białka. Ponieważ ekspresja genu za pomocą mikromacierzy oligonukleotydowych mierzona jest na poziomie transkrypcji, a często zależność pomiędzy transkrypcją i translacją regulowana jest na zasadzie sprzężenia zwrotnego, można założyć, że wysoki poziom ekspresji genu może być także odzwierciedleniem obniżonego stężenia białka, np., gdy jego synteza nie zachodzi lub zachodzi

14

wolniej na skutek błędów podczas translacji w rybosomach, na skutek degradacji białka, a nawet jego nieprawidłowej lokalizacji w komórce. Zależność pomiędzy zatrzymaniem cyklu komórkowego i cytotoksycznością jest bardzo złożona. W szeregu opublikowanych prac jednoznacznie potwierdzono, że przeciwnowotworowa aktywność cisplatyny jest związana z procesami regulacji cyklu komórkowego [17-19]. W komórkach raka jajnika cisplatyna powoduje zwiększenie ekspresji genów kodujących białka niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania punktu kontrolnego G2/M: WEE1, CDC25C oraz CCNB1, a także genu CDC6 [19]. Indukcja apoptozy przez cisplatynę jest uważana za podstawowy mechanizm jej aktywności przeciwnowotworowej. Ekspozycja na cisplatynę prowadzi do aktywacji wielu szlaków molekularnych, włączając kinazy aktywowane mitogenami oraz P53 [20]. Już 1990 roku odkryto, że wywoływane przez cisplatynę zaburzenia kontroli cyklu komórkowego mogą mieć miejsce zanim komórka wchodzi w fazę S lub po replikacji DNA [21]. Przez to zatrzymanie wzrostu komórki może nastąpić zarówno w fazie G1 jak i G2/M. Gdy uszkodzenie DNA następuje w punkcie kontrolnym G1/S, zatrzymanie cyklu komórkowego jest zwykle zależne od P53. Szlak P53 jest od dawna uważany za kluczowy w odpowiedzi na czynniki genotoksyczne, w tym również cisplatynę [19]. Uszkodzenia DNA prowadzą do nagromadzania P53 poprzez hamowanie degradacji zależnej od ubikwityny. Gen P53 może indukować transkrypcję genów istotnych dla punktów kontroli cyklu komórkowego jak również zaangażowanych w śmierć komórki [22]. Ponadto reguluje on szereg innych specyficznych tkankowo genów, co umożliwia odpowiednio dostosowaną odpowiedź komórek. Cisplatyna powoduje znaczny wzrost aktywności białek P53 i P21 oraz zmniejszenie aktywności białka P27 [23]. Jednakże nie wszystkie aspekty odpowiedzi przez punkt kontrolny G1 na stres genotoksyczny mogą być łączone z szlakiem P53, ponieważ hamowanie CDK2 w odpowiedzi na uszkodzenie DNA zachodzi nawet w komórkach nie syntetyzujących P53 lub P21 [24]. Komórki HL-60 zastosowane w przedstawianej pracy charakteryzują się w znacznym stopniu zmutowaną sekwencją i funkcją TP53 [25]. Istotna jest tu rola cyklin. Badania wykazały, że wywołane przez cisplatynę uszkodzenie DNA może indukować zatrzymanie G1 poprzez dwuetapowy proces: szybkie zatrzymanie G1 niezależne od szlaku P53 spowodowane przez proteolizę cykliny D1 i wolniejsze utrzymywanie zatrzymania, wynikające z wzrostu stabilności P53 [26]. Akumulacja komórek w fazie G1 jest rzadko spotykana, ponieważ komórki najczęściej pozostają zablokowane w punkcie G2/M i to ten właśnie punkt kontrolny odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. W fazie G2 komórki są zdolne do zapoczątkowania zatrzymania cyklu komórkowego w obecności jak i nieobecności P53 [27]. Przejście do mitozy jest uniemożliwiane przez utrzymywanie CDK1 (Cdc2) w zahamowanej formie poprzez brak fosforylacji, albo poprzez sekwestrację składników kompleksu CDK1 – cyklina B poza jądrem. Aktywacja punktów kontrolnych przez cisplatynę, może czasowo indukować zatrzymanie fazy S, po czym następuje hamowanie kinaz Cdc2 cyklin A i B powodujące długotrwałe zatrzymanie G2/M. Ponadto, chociaż głównym celem P21 jest udział w fazie

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

G1 cyklu komórkowego, pełni on również funkcję regulacyjną w utrzymaniu zatrzymania w fazie G2 poprzez blokowanie interakcji Cdc25c [28]. Ponieważ hamujący efekt adduktów cisplatyny z DNA na zależne od cyklin kinazy białkowe fazy G1 (CDKs) jest późniejszym wydarzeniem w sekwencji aktywacji tego punktu kontrolnego i jest najprawdopodobniej wspomagany przez p16INK4A - inhibitor CDK4, uważa się, że zatrzymanie cyklu komórkowego, jako konsekwencja uszkodzenia DNA, jest niezbędne dla kompleksu naprawiającego DNA poprzez wycinanie nukleotydów (NER), aby mógł on usunąć addukty i umożliwić przeżycie komórki [29]. Taka naprawa DNA jest jedną z wielu przyczyn powstawania oporności komórek na cisplatynę. Tylko, gdy naprawa DNA nie jest kompletna, co następuje podczas znacznego uszkodzenia DNA po zastosowaniu wyższych stężeń cisplatyny, komórki mogą ulegać apoptozie. Naprawa DNA jest nierozerwalnie związana z aktywacją punktów kontrolnych cyklu komórkowego oraz apoptozą, a wszystkie trzy procesy są w zależny od siebie sposób związane z białkiem supresorowym nowotworu P53. Przedstawione w niniejszej pracy wyniki badań, sugerują, że cisplatyna w znaczący sposób modyfikuje ekspresję genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach HL-60. Dokładne poznanie efektów zmienionej aktywności genów jest niezmiernie istotne dla określenia mechanizmu działania leku oraz sposobu powstawania i przeciwdziałania oporności.

Wnioski 1. Dodanie cisplatyny do hodowli komórek HL-60 znacznie wpływa na ekspresję genów związanych z regulacją cyklu komórkowego. 2. Wpływ cisplatyny na ekspresję poszczególnych genów związanych z regulacją cyklu komórkowego w komórkach HL-60 nie jest jednakowy - geny BAX, GTSE1 oraz DDX11 wykazują najbardziej stymulowaną ekspresję, natomiast ekspresja genów NBN i BCL2 jest najbardziej hamowana w porównaniu do komórek hodowli kontrolnych. 3. Poznanie efektów zmienionej aktywności genów jest niezmiernie istotne dla określenia mechanizmu działania leku i prognozowania skuteczności terapii. Piśmiennictwo 1. Einhorn LH. Curing metastatic testicular cancer. Proc Natl Acad Sci 2002; 99: 4592–95. 2. Wang G, Reed E, Li QQ. Molecular basis of cellular response to cisplatin chemotherapy in non-small cell lung cancer (Review). Oncol Rep 2004; 12: 955-65. 3. Lippert B. Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of a Leading Anticancer Drug. Wiley-VCH, Weinheim 1999, 111-35. 4. Varma R i wsp. Platinum drug effects on the expression of genes in the polyamine pathway: time-course and concentration-effect analysis based on Affymetrix gene expression profiling of A2780 ovarian carcinoma cells. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: 711–23.

5. Vermeulen K, Van Bockstaele DR, Berneman ZN. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Prolif 2003; 36: 131-49. 6. Meeran SM, Katiyar SK. Cell cycle control as a basis for cancer chemoprevention through dietary agents. Front Biosci 2008; 13: 2191-202. 7. Previati M i wsp. RNA expression induced by cisplatin in an organ of Corti-derived immortalized cell line. Hear Res 2004; 196: 8-18. 8. Kerley-Hamilton JS i wsp. A p53-dominant transcriptional response to cisplatin in testicular germ cell tumorderived human embryonal carcinoma. Oncogene 2005; 24: 6090–100. 9. Previati M i wsp. Cisplatin-induced apoptosis in human promyelocytic leukemia cells. Int J Mol Med 2006; 18: 511-16. 10. Malinowska K i wsp. Aktywność biologiczna – in vitro nowych związków koordynacyjnych platyny(II) i palladu(II). Pol Merk Lek 2009; 151: 52-6. 11. Ota T i wsp. Complete sequencing and characterization of 21,243 full-length human cDNAs. Nat Genet 2004; 36: 40–5. 12. Perego P i wsp. Association between cisplatin resistance and mutation of p53 gene and reduced bax expression in ovarian carcinoma cell systems. Cancer Res 1996; 56: 556-62. 13. Monte M i wsp. The cell cycle-regulated protein human GTSE-1 controls DNA damage-induced apoptosis by affecting p53 function. J Biol Chem 2003; 278: 30356-64. 14. Méndez J i wsp. Human origin recognition complex large subunit is degraded by ubiquitin-mediated proteolysis after initiation of DNA replication. Mol Cell 2002; 9: 481-91. 15. Privette LM i wsp. Loss of CHFR in human mammary epithelial cells causes genomic instability by disrupting the mitotic spindle assembly checkpoint. Neoplasia 2008; 10: 643-52. 16. Cerosaletti KM, Concannon P. Nibrin forkhead-associated domain and breast cancer C-terminal domain are both required for nuclear focus formation and phosphorylation. J Biol Chem 2003; 278: 21944-51. 17. Mack PC i wsp. Cell cycle-dependent potentiation of cisplatin by UCN-01 in non-small cell lung carcinoma. Cancer Chemother Pharmacol 2003; 51: 337-48. 18. Senderowicz AM. Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators. Oncogene 2003; 22: 6609-20. 19. Clarke PA i wsp. Characterisation of molecular events following cisplatin treatment of two curable ovarian cancer models: contrasting role for p53 induction and apoptosis in vivo. Br J Cancer 2004; 91: 1614-23. 20. Siddik ZH. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene 2003; 22: 7265–79. 21. Sorenson CM, Barry MA, Eastman A. Analysis of events associated with cell cycle arrest at G2 phase and cell death induced by cisplatin. J Natl Cancer Inst 1990; 82: 749-55. 22. Ryan KM, Phillips AC, Vousden KH. Regulation and function of the p53 tumor suppressor protein. Curr Opin Cell Biol 2001; 13: 332–37.

15

Farm Przegl Nauk, 2009,10 23. Qin LF, Ng IOL. Induction of apoptosis by cisplatin and its effect on cell cycle-related proteins and cell cycle changes in hepatoma cells. Cancer Lett 2002; 175: 27-38. 24. Vogelstein B, Lane D, Levine AJ. Surfing the p53 network. Nature 2000; 408: 307-10. 25. Konac E i wsp. Detection of p53 deletions using FISH values in the HL-60, Daudi, Raji and K-562 cell-lines. Exp Oncol 2003; 25: 33–5. 26. Agami R, Bernards R. Distinct initiation and maintenance mechanisms cooperate to induce G1 cell cycle arrest in response to DNA damage. Cell 2000; 102: 55-66. Adres do korespondencji: dr hab. n. farm. Adam Wilczok Katedra i Zakład Biofarmacji SUM ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec tel. 32 364 10 63 e-mail: [email protected]

16

27. Taylor WR, Stark GR. Regulation of the G2/M transition by p53. Oncogene 2001; 20: 1803-15. 28. Ando T i wsp. Involvement of the interaction between p21 and proliferating cell nuclear antigen for the maintenance of G2/M arrest after DNA damage. J Biol Chem 2001; 276: 42971-77. 29. Ferry KV, Hamilton TC, Johnson SW. Increased nucleotide excision repair in cisplatin-resistant ovarian cancer cells: role of ERCC1-XPF. Biochem Pharmacol 2000; 60: 1305–13.

Farm Przegl Nauk, 2009,10, 17-19

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Biological activity of lycopene Biologiczna aktywność likopenu Ewa Kurzeja, Małgorzata Stec, Aneta Kościołek, Maria Wardas, Katarzyna Pawłowska-Góral Katedra i Zakład Żywności i Żywienia, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Abstract: Not only are fruit and vegetables a source of nutrients, but they also contain substances which have preventive properties in forestalling many diseases of civilization, such as tumors or cardiovascular diseases. Among compounds of natural provenience which have beneficial effects on human body, antioxidants, such as vitamin C and E, carotenoids, flavonoids and selenium are the most important. Among these, carotenoids deserve special attention due to their omnidirectional effects, which are widely researched, particularly the antioxidative properties. Lycopene has the most powerful antioxidative properties among carotenoids – it is a red colorant contained in tomatoes and processed products based on them, as well as water melons, red grapefruit, and papaya. As a result of research it has been established that frequent eating of food rich in lycopene, both natural and processed, effectively protects against - among others - prostate and liver cancer. It also reduces the risk of getting arteriosclerosis and forestalls its further development. Key words: lycopene, carotenoids, antioxidants

Progressing chemisation of food – i.e. adding large amounts of non-nutritional ingredients to food, such as preservatives, colourants, artificial flavours, antioxidants and synergents, stabilizers and emulsifiers causes consumer anxiety about the health aspect of food they consume. Consequently, natural substances displaying the aforementioned characteristics are more and more intensely sought in order to add them to food products. It has to be stressed that the fact that a given substance is to be found in nature does not guarantee its safety for health. Only after a number of tests can it be qualified as a food additive – or not. Lycopene – a natural colourant belonging to the group of carotenoids, designated as E160d, has been recognized as an absolutely safe ingredient in foodstuffs. It can be added to: drinks based on fruit and vegetable juices, drinks based on milk, cereals, fats, sauces, soups, bakery products, confectionery products, drinks such as wine and spirits, ice-cream, edible rinds on maturing cheeses and edible coating. Lycopene (Fig.1) is an acyclic isomer of β−carotene with the same empirical formula C40H56. Contrary to β−carotene, which is an aliphatic - alicyclic polyene, lycopene does not have closed chains of β−ionone. It belongs to chain polyunsaturated aliphatic hydrocarbons and does not display features characterizing vitamin A, such as β−carotene In its molecules it contains eleven conjugated double bindings,

Streszczenie Warzywa i owoce są źródłem nie tyko składników odżywczych, ale zawierają również substancje mające profilaktyczne działanie w zapobieganiu wielu chorób cywilizacyjnych, takich jak choroby nowotworowe czy choroby układu sercowo naczyniowego. Wśród związków pochodzenia naturalnego wpływających korzystnie na organizm człowieka największe znaczenie mają antyoksydanty takie jak witamina C i E, karotenoidy, flawonoidy oraz selen. Wśród nich na szczególną uwagę zasługuje bardzo liczna grupa karotenoidów, których wielokierunkowe działanie, szczególnie przeciwutleniające, jest obecnie szeroko badane. Najsilniejsze właściwości antyoksydacyjne w grupie karotenoidów posiada likopen – czerwony barwnik, którego głównym źródłem są pomidory i ich przetwory, a także arbuzy, czerwone grejfruty, papaja. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że częste spożywanie zarówno produktów naturalnych jak i przetworzonych bogatych w likopen skutecznie chroni przed zachorowalnością, m.in. na raka prostaty czy wątroby oraz zmniejsza ryzyko powstawania i rozwoju miażdżycy. Słowa kluczowe: likopen, karotenoidy, antyoksydanty which, playing the role of a chromophore, determine its ruby red hue [1]. Lycopene is usually found in the most thermodynamically stable trans configuration. Exposed to light and temperature it undergoes partial isomerization, from trans form to cis form [2]. It is most abundantly present in tomato skin, but it can also be found in some fruit (Table 1). Processing fresh tomatoes causes change in the amount of active substances they contain and influences their bioavailability. Apart from lycopene, in processed tomato products the following are to be found: 5,6–epoxylycopene, 5,6-dihydroxy5,6-dihydrolycopene, β−carotene, γ- carotene [3]. Lycopene is a relatively stable compound and while tomatoes are being processed its amount does not change significantly, while its bioavailability grows. This is due to the fact that in high temperature cell walls rupture and lycopene is freed from tomato tissues. Furthermore, a beneficial change takes place in the configuration of some lycopene molecules from trans to cis form. Lycopene cis isomers crystallize and aggregate to a lesser extent, they can be more effectively dissolved in lipophilic solvents and are more easily transported by biofilms [4]. While lycopene trans form dominates in tomatoes ingested, in blood serum lycopene is to be found mainly in cis configuration. It is not entirely clear whether this is due to

17

Farm Przegl Nauk, 2009,10 Table I. Lycopene content in tomatoes, tomato products and in fruit [3, 6]. Product fresh tomato cooked tomato yellow tomato tomato sauce tomato puree tomato soup tomato juice ketchup watermelon pink guava pink grapefruit papaya apricot

the fact that cis form is more easily absorbed, or whether after absorption trans form lycopene is isomerized into cis form and then absorbed by tissues [5]. Absorption of lycopene from food increases when fats are present, especially those containing unsaturated fatty acids. Research shows that a single dose of unprocessed tomato juice does not change the saturation of lycopene in blood serum, contrary to juice cooked for one hour in the presence of 1% maize oil, which does change the saturation significantly [6]. It has also been observed that absorption of lycopene is greater if it is ingested with other carotenoids than if it is consumed separately [7]. In human body lycopene is amassed in greatest amounts in adrenal glands, testicles, liver and prostate gland. To some extent it is also accumulated in breast, pancreas, lungs, kidneys, ovaries and fat tissue, as well as in the stomach, which suggests, that in these organs the compound plays a natural biological role and influences the course of disease process. Lycopene is also present in body fluids such as blood serum, mother’s milk and semen [6]. Among carotenoids lycopene is characterized by the strongest antioxidative properties. It plays an important role in prevention and therapy of tumours and cardiovascular diseases [8 – 10]. Determined by its polyene structure and compliance with addition reactions, antioxidative properties of polyene result from its direct reactions with hydrogen superoxide, organic radicals generated in the process of lipid peroxidation, nitrogen dioxide and sulfhydryl radicals [11]. It can also quench singlet oxygen. Lycopene (LK) reaction with superoxide radical (LOO•) takes place in a few stages: LOO• + L → LOO-LK• LOO-LK• + LOO• → LOO-LK•-OOL • LOO-LK -OOL + LOO-LK•-OOL → (LOO)2-LK-(OOL)2 Numerous tests confirm protective effects of lycopene on development of tumours, especially of those organs in which it accumulates in the greatest amounts i.e. prostate and liver. There have been many publications indicating the relationship between consuming lycopene and decreasing the risk of developing prostate cancer [12]. It has been proved that a tenfold increase in weekly consumption of lycopene decreases the risk of cancer disease by almost 35%. Protective effects of lycopene bring results also in the cases of advanced prostate tumour [13]. It has also been shown that

18

Lycopene content (mg/100g of the product) 0,88-4,20 3,70 0,50 6,20-14,10 20,94-49,33 7,99 5,0-11,60 9,90-13,44 2,30-7,20 5,40 3,36 2,0-5,30 0,86

Figure 1. Structure of lycopene

daily consumption of tomato paste by men with hyperplasia of prostate cells lowers the saturation of prostate gland antigen (PSA) in blood [14]. As a result of tests carried out on young healthy rats which have been administered lycopene it has been established that the greatest amount of lycopene is accumulated in the left prostate lobe, in which local expression of IGF-I is decreased, as well as the level of transcription of pro-inflammatory cytokines, immunoglobulines and immunoglobuline receptors. It has been also shown that consumption of lycopene gently, but significantly, reduces the expression of genes of enzymes metabolizing androgens and androgen receptors [15]. The mechanism of anticarcinogenous influence of lycopene is probably connected with the improvement of intercellular connectivity by inducing gap junctions as a result of stimulating the body to biosynthesize connexin B, the protein responsible for correct intercellular communication [1]. Lycopene can probably also impede the carcinogenic process by deactivation of insulin growth agent I (IGF I) [16]. In tests carried out on liver cancer cells of SK-Hep 1 line it has been established that lycopene inhibits their growth, limits their number and impedes their adhesion to the base and decreases the activity of metaloproteinases MMP-2 and MMP-9, which they secrete. Furthermore, liver cancer cells subjected to the activity of lycopene exhibited reduced ability to invade and migrate, in comparison with other SK-Hep1 cells [17]. Consumption of products containing lycopene decreases the risk of developing cancer of oral cavity, pharynx and trachea [18], gastro-intestinal tract [16], large bowel [19], bladder [20] and breast [21]. The role of lycopene in prevention of cardiovascular diseases consists mainly in the protection of lipoproteins of LDL fraction from oxidation, happening as a result of antioxidative properties of lycopene. If oxidation of LDL lipo-

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

proteins takes place, they stimulate the walls of a vessel to produce adhesive particles MCP-1, ICAM-1 and VCAM-1, which attracts monocytes to it. It has been shown that lycopene limits the expression of adhesive particles and the adhesion of monocytes to the walls of a vessel. Apart from its antioxidative activity, lycopene decreases the synthesis of cholesterol by blocking 3 –hydroxy -3 methyloglutaric-CoA reductase (an enzyme necessary for its synthesis) and it increases the degradation of LDL lipoprotein [6]. Much attention is given to the protective properties of lycopene against harmful effects of UV radiation on skin. It has been shown that exposition of skin to UV radiation causes lowering in the level of lycopene saturation in skin of about 31-46% in comparison with unexposed skin. Protective effect of lycopene on skin consists in decreasing the thickness of epidermis, stimulating proliferation and differentiation of keranocytes, inhibiting the intercellular activity of type I colagenaze and on maintaining the right density of skin [22]. Due to the proven healthiness of lycopene, it is available in the form of many pharmaceutical preparations, used as diet supplements. However, processed tomatoes are thought to be the best source of lycopene. References 1. Rutkowski M, Grzegorczyk K, Stefańczyk A. Likopen – naturalny karotenoid niezbędny dla zdrowia i urody. Farm Pol 2006; 62: 1039-1044. 2. Boileau TWM, Boileau AC, Erdman JWJr. Bioavailability of all-trans and cis-isomers of lycopene. Exp Biol Med 2002; 227: 914-919. 3. Bobrowska B, Olędzka R. Współczesne poglądy na rolę żywieniową luteiny i likopenu. Bromat Chem Toksykol 2002; 3: 289-296. 4. Khachik F et al. Chemistry, distribution, and metabolism of tomato carotenoids and their impact on human health. Exp Biol Med 2002; 227: 845-851. 5. Moco S et al. Tissue specialization at the metabolite level is perceived during the development of tomato fruit. J Exp Bot 2007; 7: 1-16. 6. Clinton SK. Lycopene: chemistry, biology and implications for human health and disease. Nutr Rev 1998; 56: 35-51. 7. Rao AV, Agarwal S. Role of lycopene as antioxidant carotenoid in the prevention of chronic diseases: a review. Nutr Res 1999; 19: 199-203.

8. Willcox JK, Catignani GL, Lazarus S. Tomatoes and cardiovascular health. Crit Rev Food Sci Nutr 2003; 43: 1-18. 9. Rao AV, Agarwal S. Role of antioxidant lycopene in cancer and heart disease. J Am Coll Nutr 2000; 19: 563-569. 10. Agarwal S, Rao AV. Tomato lycopene and its role in human health and chronic diseases. CMAJ 2000; 163: 739-744. 11. Heber D, Lu Q-Y. Overview of mechanisms of action of lycopene. Exp Biol Med 2002; 227: 920-923. 12. Wu K et al. Plasma and dietary carotenoids and the risk of prostate cancer; a nested case-control study. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev 2004; 13: 260-269. 13. Peters U et al. Serum lycopene, other carotenoids, and prostate cancer risk: a nested case-control study in the prostate, lung, colorectal, and ovarian cancer screening trial. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev 2007; 16: 962-968. 14. Edinger MS, Koff WJ. Effect of the consumption of tomato paste on plasma prostate-specific antigen levels in patients with benign prostate hyperplasia. Braz. J Med Biol Res 2006; 39: 1115-1119. 15. Herzog A et al. Lycopene reduced gene expression of steroid targets and inflammatory markers in rat prostste. FASEB J 2005; 19: 272-274. 16. La Vecchia C. Tomatoes, lycopene intake, and digestive tract and female hormone-related neoplasms. Exp Biol Med 2002; 227: 860-863. 17. Hwang ES, Lee HJ. Inhibitory effect of lycopene on the adhesion, invasion and migration of SK-Hep 1 human hepatoma cells. Exp Biol Med 2006; 231: 322-327. 18. Mayne ST et al. Low plasma lycopene concentration is associated with increased mortality in a cohort of patients with prior oral, pharynx or larynx cancers. J Am Coll Nutr 2004; 23: 34-42. 19. Erhardt JG et al. Lycopene, beta-carotene, and colorectal adenomas. Am J Clin Nutr 2003; 78: 1219-1224. 20. Hung RJ et al. Protective effects of plasma carotenoids on the risk of bladder cancer. J Urol 2006;176: 1192-1197. 21. Wane D, Lengacher CA. Integrative review of lycopene and breast cancer. Oncol. Nurs Forum 2006; 33: 127-137. 22. Fazekas Z et al. Protective effects of lycopene against ultraviolet B-induced photodamage. Nutr Cancer 2003; 47: 181-187.

Address for correspondence: dr n. med. Ewa Kurzeja Katedra i Zakład Żywności i Żywienia Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach 41-200 Sosnowiec, ul. Jedności 8; tel. 032/3641172 e-mail: [email protected]

19

Farm Przegl Nauk, 2009,10, 20-25

Modelowe postacie wybranych środków znieczulenia miejscowego. Cz. II. Ocena biofarmaceutyczna Model drug formulations of selected of local anaesthetics. Part II. Biopharmaceutical assessment Monika Balcerkiewicz1, Edmund Grześkowiak1, Pascal Le Corre2, Maja Ratajczak-Enselme2, Anna Wolc3, Krzysztof Stefankiewicz1 Katedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu 2 Laboratoire de Pharmacie Galenique et Biopharmacie Université de Rennes 3 Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu 1

Streszczenie W ostatnim okresie podejmowane są liczne próby dotyczące poszukiwania bezpieczniejszych i skuteczniejszych leków, między innymi przez próby chemicznej syntezy czystych izomerów optycznych wcześniej poznanych substancji leczniczych. Podobny kierunek badań w grupie anestetyków lokalnych doprowadził do syntezy lewobupiwakainy i ropiwakainy. Dzięki mniejszej lipofilności oraz słabszemu powinowactwu do kanałów sodowych i potasowych mięśnia sercowego, substancje te utraciły cechy, które w przypadku związku macierzystego decydowały o jego wysokiej toksyczności. Z myślą o osiągnięciu bezpieczniejszej oraz efektywniejszej analgezji, jak dotąd badano wiele nowoczesnych form leku. Dobre rezultaty w badaniach przedklinicznych przyniosło wykorzystanie mikrosfer polimerowych. Wyniki tych badań sugerują, że uzyskanie efektu przedłużonego uwalniania leków inkorporowanych w mikrosferach pozwala na osiągnięcie przedłużonej analgezji oraz jednoczesne zmniejszenie ryzyka wystąpienia działań niepożądanych. W niniejszej pracy przeprowadzono badania mające na celu ocenę przebiegu procesów kinetycznych jakim podlega substancja lecznicza po zastosowaniu jej w modelowej postaci mikrosfer polimerowych. Doświadczenie z wykorzystaniem zwierząt doświadczalnych przeprowadzono w dwóch etapach. W I etapie badań, grupie zwierząt zakwalifikowanych do grupy kontrolnej podano domięśniowo roztwór chlorowodorku ropiwakainy. W II etapie badań celem określenia farmakokinetyki ropiwakainy uwolnionej z mikrosfer polimerowych, grupie zwierząt podano lek w równoważnej dawce w postaci iniekcji domięśniowej. Badaną substancję oznaczono w osoczu krwi królików zaadaptowaną i zwalidowaną metodą HPLC UV-VIS. Na podstawie przeprowadzonych oznaczeń oszacowano wartości wybranych parametrów farmakokinetycznych.

20

Abstract Over the last years research in anaesthetic pharmacology have been focused on increasing safety of anaesthetics by synthesis of their optical isomers. Similar trend has been noticed with local anaesthetics leading to synthesis of levobupivacaine and ropivacaine. Due to decreased lipid solubility and lower affinity to sodium- potassiumchannels located in heart muscle, these drugs lost those properties, which, in case of the original compound, were responsible for its high toxicity. To achieve safer and more effective analgesia, up to now, many new drug formulations were evaluated. Good results in preclinical studies were obtained with polymer microspheres. Those results suggest that prolonged release of active substance form incorporated microspheres allows to achieve sustained analgesia and lower risk of adverse reactions. In our work we analysed the impact of ropivacaine administration in a form of model polymer microspheres on ropivacaine pharmacokinetic. In our two stage study we used animal model. In the first stage to our control group we administered solution of ropivacaine hydrochloride intramuscularly. In a second stage to establish pharmacokinetic of ropivacaine incorporated in polymer microspheres we administered the drug to a group of animals in an equivalent dose as an intramuscular injection. Concentration of ropivacaine in rabbit plasma was measured by validated and adapted HPLC with UV VIS detection and primary pharmacokinetic parameters were calculated.

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Uzyskane wyniki pozwoliły na stwierdzenie, że domięśniowe podanie ropiwakainy w postaci mikrosfer polimerowych wpływa na modyfikację procesów farmakokinetycznych badanej substancji leczniczej. Podanie leku w postaci mikrosfer polimerowych zmniejsza absorpcję do krążenia ogólnego oraz wydłuża proces eliminacji leku. Słowa kluczowe: mikrosfery, ropiwakaina, znieczulenie miejscowe, PLGA

Wstęp Spośród środków znieczulenia miejscowego, najbardziej przydatna w niemal wszystkich rodzajach znieczulenia jest bupiwakaina (BP). Jej szczególne cechy farmakokinetyczno-farmakodynamiczne decydują o zastosowaniu BP w uśmierzaniu bólu porodowego, około- i pooperacyjnego oraz nowotworowego. Powszechną praktyką kliniczną jest stosowanie tego leku w postaci ciągłego znieczulenia zewnątrzoponowego. Wykonywane jest ono techniką powtarzalnych dawek frakcjonowanych lub ciągłego wlewu przez cewnik umieszczony w przestrzeni zewnątrzoponowej. Zarówno w pierwszym jak i drugim przypadku może jednak dojść do zagrażającego życiu podpajęczynówkowego lub donaczyniowego wstrzyknięcia zewnątrzoponowej dawki środka znieczulenia miejscowego [1]. Celem zmniejszenia ryzyka powikłań blokad centralnych z zastosowaniem BP, spośród których wymienia się również zwiększone zagrożenie infekcją bakteryjną oraz rzadziej występujące komplikacje neurologiczne, wciąż poszukuje się nowych, bezpieczniejszych metod znieczulenia [2, 3]. Dla ciągłej analgezji zewnątrzoponowej mogłoby to być podanie jednorazowej dawki środka znieczulenia miejscowego w postaci, która ograniczyłaby wchłanianie substancji leczniczej do krwiobiegu, zmniejszając w ten sposób ryzyko wystąpienia objawów działania kardio- i neurotoksycznego oraz wydłużając czas działania farmakologicznego leku [4, 5]. Realne zagrożenie pojawienia się objawów działania toksycznego w przebiegu znieczulenia BP, wynika z faktu znacznej toksyczności tego leku w porównaniu z innymi środkami znieczulenia miejscowego. Wzrost stężenie BP w osoczu powoduje charakterystyczny zespół objawów, związanych z zaburzeniami pracy serca oraz funkcji ośrodkowego układu nerwowego. Objawy neurotoksyczności pojawiają się zazwyczaj wcześniej i przy niższych stężeniach niż zaburzenia ze strony układu krążenia. Zdarza się jednak, że po podaniu BP objawy kardiotoksyczne mogą wystąpić bez uprzednich objawów ośrodkowych. Bupiwakaina pokonując z łatwością barierę krew – płyn mózgowo-rdzeniowy, po osiągnięciu stężenia toksycznego wywołuje w pierwszej fazie pobudzenie, a przy dalszym wzroście stężeń depresję ośrodkowego układu nerwowego (OUN) ze śpiączką oraz zatrzymaniem oddechu [4, 5]. Potencjalna toksyczność obecnie stosowanych środków leczniczych sprawiła, że ostatnie lata w farmakologii tych związków charakteryzują się poszukiwaniem nowych, bezpieczniejszych leków między innymi przez próby chemicznej syntezy izomerów optycznych wcześniej poznanych sub-

Obtained data allowed to conclude that intramuscular injection of ropivacaine in a form of polymer microspheres has a significant impact on pharmacokinetic of the drug. Administration of ropivacaine in a form of polymer microspheres decreases systemic absorption and prolongs drug elimination. Key words: ropivacaine, polymer microspheres, local anaesthesia, PLGA

stancji leczniczych. Podobny kierunek badań w grupie anestetyków lokalnych doprowadził do syntezy lewobupiwakainy i ropiwakainy. Kliniczne zastosowanie ropiwakainy (RP) stało się możliwe dzięki doniesieniom o znacznym ograniczeniu ryzyka wystąpienia działań niepożądanych S(-)-enancjomeru N-propylowego homologu BP. Dzięki niższej rozpuszczalności w lipidach oraz mniejszym powinowactwie do kanałów sodowych i potasowych w mięśniu sercowym, RP utraciła cechy, które w przypadku związku macierzystego decydowały o jego wysokiej kardio- i neurotoksyczności [6, 7]. Znacznie wcześniej, przed wprowadzeniem do farmakoterapii leków chiralnych, bezpieczeństwo oraz skuteczność stosowania środków farmaceutycznych osiągane były dzięki udoskonaleniom metod ich otrzymywania. Między innymi w wyniku zastosowania w technologii postaci leku polimerów, możliwe stało się opracowanie takich form leków, które zapewniłyby jednocześnie wysoką skuteczność jak i bezpieczeństwo ich stosowania [8]. Szczególne, biofarmaceutyczne cechy układu wielozbiornikowego spowodowały intensyfikację badań, co zaowocowało licznymi publikacjami i doniesieniami z badań, w przebiegu których testowano anestetyki lokalne, do formulacji których wykorzystano: liposomy [9], kompleksy inkluzyjne z cyklodekstrynami [10, 11], nośniki lipidowe [12], mikrosfery polimerowe [13, 14] czy liposfery [15]. Wyniki cytowanych badań sugerują, że podanie środka znieczulenia regionalnego w nowoczesnej postaci, w tym mikrosfer polimerowych, pozwala na modyfikację biodostępności substancji leczniczej, a przez to zwiększenie skuteczności oraz bezpieczeństwa prowadzonej farmakoterapii. Celem pracy było określenie przy pomocy doświadczalnego modelu zwierzęcego wpływu zastosowania RP w modelowej postaci mikrosfer polimerowych na biodostępność uwolnionej z nich substancji czynnej. Kolejne etapy badań miały umożliwić realizację założonego celu poprzez określenie wpływu zastosowania RP w postaci mikrosfer polimerowych na farmakokinetykę substancji leczniczej, ze szczególnym uwzględnieniem zmniejszonej absorpcji leku do krążenia ogólnego i spowolnienia eliminacji substancji leczniczej oraz weryfikacja, czy niezamierzone wprowadzenie do krążenia ogólnego leku w badanej postaci wiąże się z mniejszym ryzykiem wystąpienia objawów działania toksycznego.

Materiał i metody Badania zostały zaakceptowane przez Lokalną Komisję Etyczną ds. Badań na Zwierzętach i zrealizowane w Katedrze i Zakładzie Farmacji Klinicznej i Biofarmacji Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Badane mikrosfery PLGA z RP

21

Farm Przegl Nauk, 2009,10 Tab. I. Charakterystyka badanych królików Królik nr

Ropiwakaina iniekcja i.m.

1 2 3 4 5 6 7 8

3,2 3,1 3,0 3,2 2,8 4,1 3,0 3,3

Mikrosfery polimerowe z ropiwakainą iniekcja i.m. 3,9 4,4 3,7 4,3 4,0 4,3 -

S ± SD

3,2 ± 0,4

4,1 ± 0,3

Dawka podanego leku

5 mg

5 mg

Pobraną krew przenoszono do probówek heparynizowanych, a uzyskane przez odwirowanie osocze przechowywano w temperaturze -30 °C do czasu wykonania analizy. Ropiwakainę w pobranym materiale biologicznym oznaczono zaadaptowaną i zwalidowaną metodą HPLC opisaną przez Lorec i wsp. [17] i Tanaka [18]. Badaną substancję poddano ekstrakcji z fazy wodnej do organicznej, a następnie po odparowaniu w strumieniu azotu, suchą pozostałość rozpuszczono w fazie ruchomej. Na kolumnę chromatografu wyposażonego w detektor UV-VIS nastrzykiwano próbki o objętości 50 µl używając jako wzorca wewnętrznego roztworu chlorowodorku BP o stężeniu 10 µg/ml. Wszystkie pomiary, obliczenia oraz automatyczne integracje powierzchni sygnałów opracowano przy użyciu programu komputerowego Empower Pro.

uwolniona ropiwakaina (%)

– MSRP (RP/RG503H, (proporcje ropiwakaina/ polimer – 40/60)) otrzymano w Laboratoire de 80 Pharmacie Galenique et Biopharmacie Univer70 sité de Rennes [16]. Badania in vivo wykonane w ramach niniejszej pracy przeprowadzono 60 z wykorzystaniem modelu zwierzęcego, kró50 lików rasy Nowozelandzki Biały, obojga płci, o znanej masie ciała. Przed doświadczeniami 40 zwierzęta były karmione pełnowartościową pa30 szą, natomiast 24 h przed rozpoczęciem badań zwierzętom pozostawiano jedynie nieograni20 czony dostęp do wody. Badania prowadzono 10 etapowo. Doświadczenia z wykorzystaniem zwierząt doświadczalnych, poprzedzone zostały 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 adaptacją i walidacją chromatograficznej metocz as (h) dy oznaczania substancji leczniczej w osoczu krwi badanych królików. Celem porównania Ryc. 1. Profile (n=6) skumulowanego uwalniania ropiwakainy z mikrosfarmakokinetyki RP uwolnionej z mikrosfer po- fer z polimeru RG503H o stosunku substancji czynnej do polimeru 40/60 limerowych badanie przeprowadzono w dwóch (28) grupach królików. Pierwszą grupę zwierząt zakwalifikowanych do grupy kontrolnej stanowiło 8 królików o masie ciała 3,2±0,4 kg, którym podano domięśniowo 1% roztwór chlorowodorku RP w dawce 5 mg. Drugą grupę stanowiło 6 królików o masie ciała 4,1±0,3 kg, którym podano RP w postaci iniekcji domięśniowej dyspersji wodnej mikrosfer polimerowych w równoważnej dawce 5 mg. Charakterystyka badanych królików została zamieszczona w tabeli I. Wykorzystaną do badań matrycą biologiczną było osocze krwi pochodzącej od badanych królików. Próbki krwi (1,5 ml) pobierano z naczynia krwionośnego ucha zwierzęcia, Ryc. 2. Przykładowe chromatogramy (metoda HPLC) osocza obciążoużywając w tym celu kaniuli naczyniowej. nego badaną substancją i wzorcem; (czasy retencji: badana substancja W obu grupach królików próbki krwi po- – 7,945 min, wzorzec wewnętrzny – 12,089 min) bierano bezpośrednio przed podaniem leku (próbka zerowa), oraz po 0,02; 0,05; 0,08; 0,17; 0,25; 0,33; 0,50; 0,75; 1,00; 2,00; 3,00; 4,00 i 5,00; Wyniki 6,00; 7,00; 8,00 h od momentu podania leku. Ponieważ W oparciu o wartości oznaczonych stężeń (tabela II) badania in vitro kinetyki uwalniania substancji czynnej z badanych mikrosfer (rysunek 1) potwierdziły wydłu- przeprowadzono analizę farmakokinetyczną indywidualnych żenie drugiej, tzw. wolnej fazy uwalniania, w II grupie krzywych zależności stężenia od czasu. Średnie wartości zwierząt dokonano dodatkowych pobrań krwi po 10,00; stężenia RP uzyskane w kolejnych etapach doświadczenia przedstawiono dodatkowo w postaci wykresu (rysunek 3). 24,00 oraz 30,00 h [16].

22

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Tab. II. Porównanie średnich wartości stężeń substancji leczniczej uzyskanych po domięśniowym podaniu ropiwakainy w postaci roztworu chlorowodorku - RP oraz modelowej postaci mikrosfer polimerowych - MSRP RP

MSRP

Czas [h] 0,02 0,05 0,08 0,17 0,25 0,33 0,50 0,75 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

S

SD

S

SD

360,56 601,14 522,03 465,65 369,73 273,46 202,84 159,68 130,26 93,09 57,99 38,19 27,36 12,12 7,01 6,40

303,26 260,74 169,49 214,26 177,74 117,94 63,49 69,09 66,62 55,16 39,68 27,06 20,94 6,46 1,45 0,12

66,35 51,41 33,96 56,43 42,62 31,11 32,40 37,70 44,95 50,64 41,75 29,34 27,43 20,12 24,43 20,85

45,17 51,00 27,83 41,24 23,90 17,00 21,25 19,53 33,34 10,50 8,41 5,35 5,90 2,53 9,89 8,68

Analiza statystyczna Test t – Studenta NS IS IS IS IS IS IS IS IS NS NS NS NS IS IS IS

rzystano statystyczny program komputerowy SAS (SAS, 20022003). W obrębie porównywanych grup zweryfikowano normalność rozkładu przy pomocy testu Shapiro-Wilka. Ponieważ dla większości analizowanych zmiennych rozkład nie odbiegał istotnie od normalnego dlatego szczegółowe porównania danych w obrębie grup wykonano w oparciu o test t-Studenta dla par danych (poziom istotności α = 0,05). Istotność różnic między badanymi postaciami leku szacowano wykorzystując test t-Studenta dla par danych (poziom istotności α = 0,05). Wyniki oceny statystycznej dla uzyskanych danych zamieszczono w tabelach II i III.

Dyskusja

Stężenie ropiwakainy [ng/ml

Jednym ze sposobów obniżenia wysokiej toksyczności optycznie czynnej BP jest stosowanie jej czystego 600 S(-)-enancjomeru. Przy jednoczesnym zacho500 waniu podobnego profilu farmakokinetycznego 400 i farmakodynamicznego, lewobupiwakaina (LBP) 300 jest mniej toksyczna od R(+)-enancjomeru (dekstrobupiwakainy) oraz mieszaniny racemicznej 200 [19]. Zastosowanie czystego S(-)-enancjomeru 100 N-propylowego homologu BP również zwią0 zane jest z ograniczeniem ryzyka wystąpienia 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 działań niepożądanych, za które w znacznej mieCzas [h] rze odpowiedzialny jest R(+)-enancjomer RP. Inkorporowanie tej substancji leczniczej w matrycy Ropiwakaina HCl MS Ropiwakaina mikrosfer polimerowych pozwoliło na ujawnienie Ryc. 3. Średnie stężenia ropiwakainy w osoczu krwi królików po domię- pozostałych, korzystnych właściwości charakteśniowym podaniu leku w postaci chlorowodorku – RP (n=8) oraz dysper- ryzujących badany nośnik leku. Zmniejszoną absorpcję do krążenia ogólnego sji wodnej mikrosfer polimerowych – MSRP (n=6) osiągnięto dzięki znacznemu obniżeniu wartości średniego stężenia maksymalnego oraz obniżeniu wartoW celu oszacowania wartości parametrów farmakokine- ści średniego pola powierzchni pod krzywą zmian stężenia tycznych wykorzystano różne metody matematyczne (model w czasie od 0 do 8 h (tabela III). Obniżenie wartości średhybrydowy). Dzięki nim możliwe było wyznaczenie para- niej stałej szybkości eliminacji, zmniejszenie wartości średmetrów opisujących farmakokinetykę RP tj. AUC, AUMC, niego klirensu i wydłużenie średniego czasu biologicznego MRT, kel, t0,5, Vd i Cl. Wartości parametrów Cmax i tmax odczy- półtrwania wskazuje natomiast na znaczne spowolnienie tano bezpośrednio z indywidualnych krzywych C=f(t). Pole eliminacji leku podanego w postaci iniekcji domięśniowej powierzchni pod krzywą opisującą zmiany stężenia leku we mikrosfer polimerowych. Charakterystyka procesów farmakokinetycznych opisukrwi w czasie wyznaczono metodą trapezów. Wyznaczenie parametrów farmakokinetycznych wymaganych do oceny jących substancję leczniczą zastosowaną w postaci iniekcji biodostępności umożliwiło określenie względnej dostępno- domięśniowej wodnej dyspersji mikrosfer polimerowych ści biologicznej badanej substancji leczniczej zastosowanej (MSRP), w znacznym stopniu potwierdza wyniki badań w postaci mikrosfer polimerowych Fr (AUC0-8h bad / AUC0-8h skumulowanego uwalniania in vitro (rysunek 2). Zastosowanie polimeru RG503H wpłynęło w warunkach in vivo na = 0,59). stand Wartości parametrów farmakokinetycznych RP uzyska- wydłużenie zarówno szybkiej jak i wolnej fazy uwalniania RP z mikrosfer MSRP i sprawiło, że po około 8 godzinach ne w kolejnych etapach badania zamieszczono w tabeli III. W ocenie statystycznej stężeń badanych substancji lecz- prowadzenia doświadczenia dostępność biologiczna badaniczych oraz ich parametrów farmakokinetycznych wyko- nej substancji leczniczej uległa ograniczeniu do 59%. 700

23

Farm Przegl Nauk, 2009,10 lenia regionalnego jakim jest RP, potwierdzony również został, pożądany w przebiegu znieczulenia regionalnego efekt ograniczonej Analiza RP MSRP Parametry biodostępności. Przeprowadzone statystyczna S SD S SD Test t - Studenta doświadczenia dowiodły, że poC max [ng/ml] wolna absorpcja i niskie stężenia 636,56 156,95 91,70 36,73 IS t max [h] obserwowane dla badanej sub0,14 0,07 0,71 1,00 IS kel [1/h] stancji leczniczej inkorporowanej 0,4616 0,0912 0,0320 0,0093 IS AUC0-8h [ng·h/ml] w postaci mikrosfer polimero525,80 217,06 308,83 76,95 IS AUCtot [ng·h/ml] wych mogą sprzyjać obniżeniu 556,95 218,95 861,98 327,39 NS AUMCtot [ng·h2/ml] wysokiej toksyczności leku [2]. 1088,83 570,92 23049,59 17641,99 IS MRT [h] Zmniejszenie ryzyka wystąpie1,90 0,41 24,33 8,58 IS t0,5 [h] nia objawów działania niepożą1,32 0,28 16,86 5,95 IS Vd [l] danego środków znieczulenia 18,87 6,07 143,32 29,36 IS Vd [l/kg] regionalnego zastosowanych 5,90 2,04 35,15 8,00 IS Cl [l/h] w badanej postaci leku, w sytu9,81 4,06 3,76 1,14 IS Cl [l/h*kg] acji niezamierzonego wprowa3,20 1,26 0,92 0,25 IS dzenia do krążenia ogólnego, jest możliwe dzięki zdecydowanie wyższej dawce odpowiedzialnej Ropiwakaina (RP) podobnie jak BP jest lekiem sil- za wystąpienie objawów toksyczności. Analiza uzyskanych nie wiążącym się z białkami krwi [6]. Oprócz problemów w badaniach wyników wykazała także spowolnienie elimiz oznaczeniem w analizowanych próbkach wolnej, osiągają- nacji leku zastosowanego w postaci mikrosfer polimerocej miejsca receptorowe frakcji leku, charakterystyczne dla wych, sugerując tym samym przedłużenie działania zniegrupy amidowych środków znieczulenia regionalnego jest czulającego pod warunkiem zastosowania odpowiednich przewyższająca objętość kompartmentów fizjologicznych dawek leku. Fakt ten sprawia, że badana postać z inkorporowartość pozornej objętości dystrybucji. Podanie środków waną substancją leczniczą wydaje się być perspektywicznie z tej grupy, w postaci leków o zmodyfikowanym uwalnianiu przydatna klinicznie, zarówno w znieczuleniach zabiegów powoduje, że parametr ten osiąga jeszcze większe wartości. chirurgicznych jak i analgezji pooperacyjnej. Zastosowanie RP w postaci mikrosfer polimerowych spowodowało spodziewane zwiększenie wartości średniej ob- Wnioski jętości dystrybucji. Według danych zawartych w piśmiennictwie, większość Zastosowanie RP w modelowej postaci mikrosfer poliobjawów działania niepożądanego środków znieczulenia re- merowych pozwala uzyskać przedłużoną eliminację po jedgionalnego generowana jest poprzez gwałtowny wzrost ich norazowym podaniu leku, przy jego ograniczonej absorpcji stężenia w krążeniu ogólnym [20]. Obecnie dąży się zatem do krążenia ogólnego. do spowolnienia procesu absorpcji tych leków do krążenia Jednoznaczne potwierdzenie ograniczonego ryzyka wyogólnego. Poza wyżej opisanymi, służącymi temu celowi stąpienia objawów działania toksycznego będącego wynimetodami, na szczególną uwagę zasługuje stosowanie BP kiem niezamierzonego, donaczyniowego podania środków z dodatkiem leku obkurczającego naczynia. Jednoczesne za- znieczulenia regionalnego w postaci mikrosfer polimerowych stosowanie epinefryny zmniejsza szybkość procesu absorp- w tym RP, wymaga przeprowadzenia dalszych badań poszecji substancji czynnej, prowadząc do zmniejszenia ryzyka rzonych o ocenę stopnia blokady czuciowej i motorycznej. wystąpienia objawów działania neuro- i kardiotoksycznego BP [6]. Ponadto, zastosowanie tej metody pozwala na ogra- Piśmiennictwo niczenie działania farmakologicznego substancji leczniczej do działania miejscowego, nie wpływa jednak na czas jego 1. Jurczyk W, Drobnik L i wsp. Podstawy anestezjologii i intrwania [2]. W wielu ośrodkach prowadzone są badania tensywnej terapii, Podręcznik dla studentów pod redakzmierzające do osiągnięcia podobnego efektu, poprzez zacją Zdzisława Kruszyńskiego. Akademia Medyczna im. stosowanie preparatu złożonego RP [21, 22]. Według autoKarola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań 1999. rów cytowanych prac dodatek epinefryny zmniejsza układo- 2. Przeklasa-Muszyńska A, Dobrogowski J. Powikłania wą absorpcję RP oraz obniża wartość osiąganego średniego znieczulenia miejscowego. Andres J(red.): Neurologia, stężenia maksymalnego. Wyniki tych badań potwierdzają znieczulenie regionalne i terapia bólu. Ośrodek Regiomożliwość zwiększenia indeksu terapeutycznego dzięki nalny FEEA w Krakowie, Kraków 2005; 129-148. zastosowaniu RP z dodatkiem epinefryny. Niemożliwe do 3. Wordliczek J. Analgezja pooperacyjna. Andres J. (red.) osiągnięcia tą metodą jest jednak, potwierdzone dla badanej Neurologia, znieczulenie regionalne i terapia bólu. przez nas modelowej postaci leku, przedłużenie efektu dziaOśrodek Regionalny FEEA w Krakowie, Kraków 2005; łania farmakologicznego. 217-241. W niniejszych badaniach, oceniających farmakokinety- 4. Garstka J. Znieczulenie przewodowe. PZWL, Warszawa kę modelowej postaci jednego z nowszych leków znieczu1992. Tab. III. Porównanie średnich wartości parametrów farmakokinetycznych uzyskanych po domięśniowym podaniu ropiwakainy w postaci roztworu chlorowodorku – RP oraz modelowej postaci mikrosfer polimerowych - MSRP

24

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

5. Kamiński B, Kübler A. Anestezjologia i intensywna terapia. Podręcznik dla studentów medycyny. PZWL, Warszawa 2002. 6. Sweetman SC. Martindale. The complete drug reference. Pharmaceutical Press, Chicago 2005. 7. Stewart J, Kellet N, Castro D. The central nervous system and cardiovascular effects of levobupivacaine and ropivacaine on healthy volunteers, Anesth Analg. 2003; 25: 153-163. 8. Janicki S, Fiebig A, Sznitowska M. Farmacja stosowana, Podręcznik dla studentów farmacji; PZWL, Warszawa 2006. 9. Yu HY, Shyh-Dar L, Sun P. Kinetic and dynamic studies of liposomal bupivacaine and bupivacaine solution after subcutaneous injection in rats, J Pharm Pharmacol. 2002; 54: 1221-1227. 10. Karashima K i wsp. Prolongation of intrathecal and sciatic nerve blocks using a complex of levobupivacaine with maltosyl-beta-cyclodextrin in rats, Anesth Analg. 2007; 104: 1121-1128. 11. de Araujo DR i wsp. Development and pharmacological evaluation of ropivacaine-2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin inclusion complex, Eur J Pharm Sci. 2008; 33: 60-71. 12. Dollo G i wsp. Bupivacaine containing dry emulsion can prolong epidural anesthetic effects in rabbits, Eur J Pharm Sci. 2004; 22: 63-70. 13. Le Corre P i wsp. Spray-dryed bupivacaine-loaded microspheres: in vitro evaluation and biopharmaceutics of bupivacaine following brachial plexus administration in sheep, Int J Pharm. 2002; 238: 191-203. 14. Zhang H i wsp. Bupivacaine-loaded biodegradable poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres I. Optimization of the drug incorporation into the polymer matrix and modelling of drug release, Int J Pharm. 2008; 351: 244-249.

15. Siriporn T i wsp. Formulation and characterization of bupivacaine lipospheres, Int J Pharm. 2004; 280: 57-65. 16. Ratajczak M. Technologia otrzymywania mikrosfer z kopolimerów kwasu mlekowego i glikolowego oraz bupiwakainy. Praca magisterska. Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego, Poznaniu/Rennes 2002. 17. Lorec AM i wsp. Rapid simultaneous determination of lidocaine, bupivacaine and their two main metabolites using capillary gas-liquid chromatography with nitrogen phosphorus detector, Ther Drug Monit. 1994; 16: 592-595. 18. Tanaka E i wsp. Simultaneous determination of three local anesthetic drugs from the pipecoloxylidide group in human serum by high-performance liquid chromatography, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2006; 834: 213-216. 19. Gristwood RW. Cardiac and CNS toxicity of levobupivacaine: strengths of evidence for advantage over bupivacaine, Drug Saf. 2002; 25: 153-163. 20. White PF. Text book of Intravenosus Anesthesia. Williams & Wilkins, Baltimore 1997. 21. Karmakar MK i wsp. Arterial and venous pharmacokinetics of ropivacaine with and without epinephrine after thoracic paravertebral block, Anesthesiology 2005; 103: 704-711. 22. Ratajczak - Enselme M i wsp. Effect of epinephrine on epidural, intrathecal, and plasma pharmacokinetics of ropivacaine and bupivacaine in sheep, Br J Anaesth. 2007; 99: 881-890.

Adres do korespondencji: dr n. farm. Monika Balcerkiewicz Katedra i Zakład Farmacji Klinicznej i Biofarmacji UM w Poznaniu ul. Św. Marii Magdaleny 14, 61-861 Poznań, tel. 61 668 78 53 e-mail: [email protected]

25

Farm Przegl Nauk, 2009,10, 26-29

Anticancer activity of the selected dipyridothiazines and diquinothiazines determined in National Cancer Institute in Bethesda USA Aktywność przeciwnowotworowa wybranych dipirydotiazyn i dichinotiazyn zbadana w National Cancer Institute w Bethesdzie, USA Krystian Pluta, Małgorzata Jeleń, Beata Morak-Młodawska The Medical University of Silesia, Department of Organic Chemistry, Sosnowiec, Poland

Abstract Seventeen selected newly synthesized azaphenothiazines, being tricyclic 10-substituted dipyridothiazines A1-A8 and pentacyclic 6-substituted diquinothiazines B1-B9 were investigated in vitro against the cell lines of 9 types of human cancer: leukemia, melanoma, non-small cell lung cancer, colon cancer, CNS cancer, ovarian cancer, renal cancer, prostate cancer and breast cancer in National Cancer Institute, Bethesda, USA. This study showed that the cell lines of all 9 cancer types were sensitive to our compounds. Two dipyridothoazines A and all diquinothiazines B were active against at least one cancer cell line. Pentacyclic quinothiazines B were much more active than tricyclic dipyridothiazines A. To our knowledge this study is a first demonstration of significant anticancer activities of azaphenothiazines. Key words: phenothiazines, azaphenothiazines, dipyridothiazines, diquinothiazines, anticancer activity

Introduction Phenothiazines are significant class of heterocyclic compounds for their interesting chemical properties and widely recognized pharmacological activity (neuroleptic, antihistaminic, antitussive and antiemetic [1]). Recent reports demonstrated promising anticancer [2, 3], antiplasmid [4] and antibacterial activities [5], reversal of multidrug resistance (MDR) [6, 7] and potential treatment in Alzheimer’s [8], Creutzfeldt-Jakob [9] and AIDS diseases [10] of typical and newly synthesized phenothiazines. Significant anticancer activity was found not only for typical neuroleptic phenothiazines but also for new phenothiazine derivatives [11-13] which were obtained by introduction of new pharmacophoric groups at the thiazine nitrogen atom

26

Streszczenie Siedemnaście wybranych ostatnio otrzymanych azafenotiazyn, będących tricyklicznymi 10-podstawionymi dipirydotiazynami A1-A8 i pentacyklicznymi 6-podstawionymi dichinotiazynami B1-B9 zostało przebadanych in vitro na liniach komórkowych 9 typów ludzkiego nowotworu: białaczki, czerniaka, nowotworów płuc, okrężnicy, centralnego układu nerwowego, jajnika, nerki, prostaty i piersi w National Cancer Institute w Bethesdzie, USA. Badania wykazały, że linie komórkowe wszystkich 9 typów nowotworów były wrażliwe na nasze związki. Dwie dipirydotiazyny A i wszystkie dichinotiazyny B były aktywne w stosunku do co najmniej jednej linii komórek nowotworowych. Pentacykliczne dichinotiazyny B były bardziej aktywne niż tricykliczne dipirydotiazyny A. Według naszej wiedzy przedstawione badania są pierwszym przykładem znaczących aktywności przeciwnowotworowych azafenotiazyn. Słowa kluczowe: fenotiazyny, azafenotiazyny, dipirydotiazyny, dichinotiazyny, aktywność przeciwnowotworowa

and by substitution of the benzene ring with the naphthalene ring to form benzophenothiazines and dibenzothiazines. We modified the phenothiazine structure with the pyridine and quinoline rings to form new azaphenotiazines being 10-substituted dipyridothiazines (10-substituted 2,7diazaphenothiazines) and 6-substituted diquinothiazines (6-substituted dibenzo-1,9-diazaphenothiazines). Some of these compounds exhibit very significant anticancer activity determined in National Cancer Institute in Bethesda, USA. The most active turned out to be 6-chloroethylureidoethyldiquinothiazine with growth inhibition GI50 = 0.04 µg/ml (40 ng/ml) against melanoma line SK-MEL-5 [14]. In this paper, we demonstrate the anticancer activity of less active dipyridothiazines A1-A8 and diquinothiazines B1-B9

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

determined against cancer cell lines in order to discuss the structure-activity relationship and to search for effective anticancer drugs.

Materials and methods Chemicals 10-Substituted tricyclic dipyrido[3,4-b;3’,4’-e][1,4]thiazines A1-A8 and 6-substituted pentacyclic diquino[3,2b;2’,3’-e][1,4]thiazines B1-B9, depicted in Fig. 1, were synthesized according to the recently described procedures [15-18]. These compounds possess the alkyl, aryl, heteroaryl, N,N-dialkylaminoalkyl, N-acylaminoalkyl and N-sulfonylaminoalkyl groups at the thiazine nitrogen atom. Assay for anticancer activity The anticancer activity parameter such as the percentage of growth (PG in %) of azaphenothiazines A1-A8 and B1-B9 was determined by the dose-response curve using the cell lines of 9 types of human cancers (leukemia, non-small cell lung cancer, colon cancer, central nervous system cancer, melanoma, ovarian cancer, renal cancer, prostate cancer and breast cancer cell lines) at concentration of 10-5 M/l in National Cancer Institute (Bethesda) in Vitro Anticancer Drug Discovery Screen Program [19]. Azaphenothiazines which give lower PG value are considered as more potent anticancer compounds.

Results and discussion The anticancer activities of dipyridothiazines A1-A8 and diquinothiazines B1-B9, as the PG values, were shown in Tables 1 and 2, respectively. To short this review, the discussion was limited to those compounds which exhibit the PG values below or around 60% and to 28 cancer cell lines. As one can see from Tables diquinothiazines B1-B9 turned out to be more active than dipyridothiazines A1-A8. Below, R N N

A2.

H3C H3C A4..

N

Anti-leukemia activity Diquinothiazine B3, B4 and B8 exhibit activity against SR line. Anti-renal cancer activity It is worth noting that all diquinothiazines (B1-B9) and 2 dipyridothiazine (A1 and A2) exhibit potent activity against UO-31 line. The most active was compound B6 with the PG value of 19%. Anti-melanoma activity 6 Diquinothiazines (B1, B2, B4-B6 and B8) showed activity against SK-MEL2 line and diquinothiazine B8 against UACC-62 line. Anti-colon cancer activity Diquinothiazines B1 and B8 exhibited activity against KM12 and HCT-116 lines, respectively. N

N

N Cl

R N

N

R

NSC No 743522/1

B1. -CH2CH2CH2CH3

NSC No 744651/1

743518/1

B2.

744654/1

743523/1

N

N

Anti-breast cancer activity 4 Diquinothiazines (B1,B3, B6 and B8) were found active against MCF7 line and 3 diquinothiazines (B1, B8 and B9) against T-47D line, 2 diquinothiazines (B5 and B7) against MDA-MB231/ATCC line and diquinothiazines B7 against HS578T line. Dipyridothiazine B1 showed activity against HS578T line. Compound B1 showed the most potent activity with the remarkable PG values of 7 % and 14%.

S

NO2 O2N

Anti-non-small cell lung cancer activity Whereas only dipyridothiazine A1 and diquinothiazines B5 were active against EKVX line, 6 diquinothiazines (B1, B4, B5, B7-B9) were found active against HOP-92 line. Some other compounds were only a little less active.

S

R A1. -CH3

A3.

there is short review of antiproliferative activities against the cell lines of 9 types human cancers.

CH2

B3

Cl

744652/1

B4..

NO2

744653/1

743524/1 B5. O

A5. -CH2CH2CH2 N

743521/1

O A6. -CH2CH2N(C2H5)2 743519/1 A7. -CH2CH(CH3)CH2N(CH3)2 743525/1 A8. -CH2CH2CH2NHCOCH3 743520/1

N

B6. -CH2CH2NHCOCH3 B7. -CH2CH2CH2NHCOCH3 B8. -CH2CH2CH2NHCOOC2H5 B9. -CH2CH2CH2NHSO2C6H4CH3

744655/1 744657/1 744661/1 744663/1 744662/1

Fig. 1. Structures of dipyridothiazines A1-A8 and diquinothiazines B1-B9 with National Cancer Institute code numbers

27

Farm Przegl Nauk, 2009,10 Tab. I. Anticancer activity (PG in % at concentration of 10-5 M) of dipyridothiazines A1-A8 Non-small cell Compd’s lung cancer number HOP-92 NCI-H522

EKVX

HS578T

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8

49 89 79 >90 >90 >90 >90 >90

64 >90 >90 >90 >90 >90 >90 >90

85 80 77 90 >90 89 87 90

>90 88 73 >90 >90 90 90 78

Renal cancer Compd’s number RXF-393 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8

>90 84 >90 >90 >90 >90 >90 >90

Melanoma Compd’s number UACC-62 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8

>90 >90 81 >90 >90 >90 87 >90

Breast cancer

Leukemia

MDA-MB231-ATCC 90 77 85 >90 >90 >90 >90 85

K-562

RPMI-822

>90 87 83 >90 89 >90 >90 >90

>90 >90 86 >90 >90 >90 88 >90

Ovarian cancer

CNS Cancer

UO-31

ACHN

OVCAR-8

SNB-75

SF-295

40 56 >90 -

>90 >90 75 >90 >90 >90 >90 >90

>90 87 83 90 >90 >90 >90 >90

85 >90 >90 90 87 89 >90 83

>90 >90 87 >90 >90 88 >90 >90

Prostate cancer

Colon cancer

U251

PC-3

COLO 205

>90 >90 88 >90 >90 >90 >90 >90

>90 88 >90 >90 >90 >90 >90 >90

>90 >90 90 >90 >90 >90 >90 >90

Anti-ovarian cancer activity Diquinothiazine B7 showed activity against SK-OV-3 line. Anti-CNS cancer activity Diquinothiazine B7 was found to be active against U251 and SNB-75 lines. Anti-prostate cancer activity Diquinothiazine B8 showed activity against PC-3 line. This short commentary demonstrates anticancer potential and selectivity of our new azaphenothiazines. Some compounds exhibited significant antiproliferative activity, for example compounds B1, B6, B5, B8 and B7 against the selected cell lines (Table 2). It worth noting that less active dipyridothoazines A showed antiproliferative activity against to the selected cancer lines with the PG values of 40-90% (Table 1). Taking into account the phenothiazine structures A and B, it seems that the multicyclic ring system is much more biological potent than the nature of the pharmacophoric substituents.

Tab. II. Anticancer activity (PG in % at concentration of 10-5 M) of diquinothiazines B1-B9 Compd’s number B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 Compd’s number B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9

28

Non-small cell lung cancer HOP-92

HOP-62

28 >90 73 84 90 62 80 39 >90 75 89 47 69 49 76 69 >90 R e n a l Melanoma cancer

Breast cancer EKVX

MCF7

HS578T

85 >90 >90 >90 69 86 86 74 72

7 61 37 >90 74 53 60 45 70

>90 89 88 85 83 >90 63 82 >90

Leukemia MDA-MB231/ ATCC 76 >90 >90 84 68 80 66 77 83

T-47D

SR

14 >90 77 89 83 80 83 39 64

77 81 65 54 78 87 80 44 83

Colon cancer

Ovarian cancer

CNS cancer

Prostate cancer

UO-31

SK-MEL2

UACC-62

KM12

HCT-116

SK-OV-3

SNB-75

U251

PC-3

22 39 43 37 27 19 29 24 32

62 67 78 64 39 63 76 62 71

>90 85 85 77 78 >90 78 59 76

68 >90 >90 >90 >90 >90 82 -

>90 >90 85 90 >90 >90 87 68 >90

>90 >90 >90 >90 >90 >90 65 88 >90

>90 >90 >90 >90 >90 >90 60 >90 >90

>90 >90 >90 >90 86 >90 57 >90 >90

79 >90 81 73 86 75 67 82

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Conclusions This study showed that the cell lines of all 9 cancer types were sensitive to our compounds. Two dipyridothoazines A and all diquinothiazines B were active against at least one cancer cell line. Pentacyclic quinothiazines B were much more active than tricyclic dipyridothiazines A. To our knowledge this study is a first demonstration of significant anticancer activities of azaphenothiazines. References 1. Gupta RR and Kumar M. Synthesis, properties and reactions of phenothiazines. In: Gupta, RR (ed) Phenothiazines and 1,4-Benzothiazines. Chemical and Biological Aspects. Elsevier, 1988, 1-161. 2. Motohashi N et al: Antitumor potential and possible targets of phenothiazine-related compounds. Curr Drug Targets 2000; 1: 237-245. 3. Motohashi N et al: Cytotoxic potential of phenothiazines. Curr Drug Targets 2006; 7: 1055-1066. 4. Molnár A, Amaral L, Molnár J. Antiplasmid effect of promethazine in mixed bacterial cultures. Int J Antimicrob Agents 2003; 22: 217-222. 5. Motohashi N et al: Synthesis and biological activity of N-acylphenothiazines. Int J Antimicrob Agents 2000; 14: 203-207. 6. Amaral L, Martins M, Viveiros M. Enhanced killing of intracellular multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis by compounds that affect the activity of efflux pumps. J Antimicrob Chemother 2007; 59: 1237-1246. 7. Mayur YC, Jagadeesh S, Thimmaiah KN. Targeting calmodulin in reversing multi drug resistance in cancer cells. Mini-Rev Med Chem 2006; 6: 1383-1389.

8. Mosnaim AD et al: Phenothiazine molecule provides the basic chemical structure for various classes of pharmacotherapeutic agents. Am J Therapeutics 2006; 13: 261-273. 9. Amaral L, Kristiansen JE: Phenothiazines: potential management of Creutzfeldt-Jacob disease and its variants. Int J Antimicrob Agents 2001; 18,: 411-417. 10. Viveiros M et al: The in vitro activity of phenothiazines against Mycobacterium avium: potential of thioridazine for therapy of the co-infected AIDS patients. In Vivo 2005; 19: 733-736. 11. Barbieri F et al: Quinolizidinyl derivatives of iminodibezyl and phenothiazine as multidrug resistance modulators in ovarian cancer cells. Invest New Drug 2003; 21: 413-420. 12. Sakagami H et al: Induction of DNA fragmentation in human Myelogenous Leukaemic cell lines by phenothiazine-related compounds. Anticancer Res 1995; 15: 2533-2540. 13. Wuonola MA et al: The primary in vitro anticancer activity of “half-mustard type” phenothiazines in NCI’s revised anticancer screening paradigm. Anticancer Res 1998; 18: 337-348. 14. Pluta K et al: Anticancer Activity of newly Synthesized Azaphenothiazines in NCI’s Anticancer Screening. Pharmacol. Reports 2010; (in press). 15. Morak-Młodawska B, Pluta K: Synthesis of novel dipyrido-1,4-thiazines. Heterocycles, 2007; 71: 1347-1361. 16. Nowak M et al: Synthesis of new pentacyclic diquinothiazines. J Heterocycl Chem 2007; 44: 543-550. 17. Morak-Młodawska B, Pluta K. Acyl and sulfony derivatives of 10-aminoalkyl-2,7-dia-zaphenothiazines. Heterocycles, 2009;7 8: 1289-1298. 18. Jeleń M, Pluta K. Synthesis of 6-aminoalkyldiquino-1,4-thiazines and their acyl and sulfonyl derivatives. Heterocycles, 2008; 75: 859-870. 19. Shoemaker RH. The NCI human tumor cell line anticancer drug screen. Nature Rev, 2006; 6: 813-823.

Address for correspondence: dr hab. Krystian Pluta The Medical University of Silesia Department of Organic Chemistry Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec, Poland e-mail: [email protected].

29

Farm Przegl Nauk, 2009,10, 30-34

Antyoksydacyjne właściwości czarnej porzeczki Antyoxidative properties of black currant Ewa Ambrożewicz, Elżbieta Skrzydlewska Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku Streszczenie Owoce czarnej porzeczki są bogatym źródłem takich związków chemicznych jak flawonoidy (antocyjany, proantocyjanidyny i flawonole), kwasy fenolowe oraz witamina C. Działanie biologiczne owoców czarnej porzeczki związane jest z właściwościami antyoksydacyjnymi wyżej wymienionych związków. Główną grupą antyoksydantów czarnej porzeczki są antocyjany stanowiące 9295% wszystkich polifenoli zawartych w owocach, a ich zawartość wacha się w granicach 199 – 304,87mg/100g. Działanie antyoksydacyjne czarnej porzeczki potwierdzono badaniami in vitro i in vivo. Stwierdzono, że antocyjany posiadają zdolność do hamowania wytwarzania RFT, do nasilania właściwości antyoksydacyjnych oraz do chelatowania jonów metali przejściowych. Konsekwencją takiego działania jest zdolność do przeciwdziałania oksydacyjnym modyfikacjom istotnych biologicznie składników komórki jak DNA, lipidy i białka. Antocyjany wykazują również działanie przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe, wpływają korzystnie na procesy widzenia, a dzięki działaniu alkalizujacemu mogą hamować tworzenie się i wzrost kamieni moczowych dzięki czemu wspomagają leczenie kamicy nerkowej.

Abstract The black currant fruits are rich source of flavonoids (anthocyanins, proanthocyanidins and flavonols), phenolic acids, and vitamin C. The biological effect of black currant fruits depends on antioxidant properties of those compounds. The main antioxidants in black currants are anthocyanins (92 – 95%), in the fresh fruits content of these components ranges from 199 mg/100g to 304,87 mg/100g depending on cultivation. Antioxidant properties of black currant have been proven both in vitro and in vivo studies. Anthocyanins inhibit generation of reactive oxygen species (ROS), intensify antioxidant properties and chelate transition metal ions. As a concequence, black currants possess ability to prevent against oxidative stress, DNA damage and lipid and protein oxidation. Moreover, anthocyanins have also shown antiviral and anticarcinogenic effect and beneficial effects on visual processes. Additionally, black currant juice can inhibit the formation and growth of urinary stone and support the nephrolithiasis treatment because of its alkalizing effect. Key words: black currant, antioxidants

Słowa kluczowe: czarna porzeczka, antyoksydanty

Skład chemiczny czarnej porzeczki Czarna porzeczka (Ribes nigrum L.) jest krzewem owocowym należącym do rodziny agrestowatych (Grossulariaceae). Prawie wszystkie części rośliny są źródłem związków chemicznych, aktywnych biologicznie. W związku z tym w praktyce wykorzystywane są zarówno jej liście (Folium Ribis nigri), owoce (Fructus Ribis nigri) jak i olej tłoczony z nasion (Oleum Ribis nigri), przy czym zawartość związków biologicznie ważnych jest różna w poszczególnych częściach krzewu. Liście czarnej porzeczki zawierają składniki bioaktywne takie jak flawonoidy, w tym głównie rutynę (2097-2875 µg/g), izokwercetynę (747-1327 µg/g), astrogalin (752-366 µg/g), mircetynę (82-41 µg/g), kwercetynę (53-28 µg/g), oraz kemferol (10-5 µg/g) [1], a także garbniki i niewielkie ilości olejków eterycznych (α-pinen, geraniom, limonen) [2, 3]. Ponadto liście są źródłem witaminy C i soli mineralnych, m.in. związków boru i magnezu [2, 3]. Najczęściej wykorzystywane owoce czarnej porzeczki

30

są bogatym źródłem cukrów (8,5 – 17,9%), kwasów organicznych (3,6 – 7,3%), błonnika ( 4,17% składu owoców, z czego 2,14% to celuloza a 1,76% ligniny), pektyn (2,04%) oraz polifenoli (0,53%) i witaminy C (tabela I) [4, 5, 6, 8, 9]. Ze względu na właściwości biologiczne szczególnie ważnymi składnikami owoców są polifenole, do których należą flawonoidy (antocyjany, proantocyjanidyny i flawonole), kwasy fenolowe, a także witamina C, która występuje w owocach w stosunkowo dużych ilościach. Zwartość związków fenolowych w owocach zależy od wielu czynników, przede wszystkim od uprawianej odmiany, od warunków uprawy (tj. temperatury, w której dojrzewają owoce, dostępu do wody, rodzaju gleby), a także od stopnia dojrzałości owoców [4, 7]. Owoce czarnej porzeczki są spożywane na świeżo, jak również wykorzystywane w przemyśle spożywczym i gospodarstwie domowym, jako doskonały surowiec do sporządzania soków, dżemów, win i nalewek. Szczególnie często spożywany jest sok produkowany z owoców czarnej porzeczki, który charakteryzuje się bardzo dużą zawarto-

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

ścią polifenoli (głównie antocyjanin), witaminy C, kwasów organicznych oraz składników mineralnych (tabela II) [10, 11]. Zawartość związków biologicznie czynnych w soku jest niższa niż w owocach. Związane jest to z procesem przetwarzania, jakim podlegają owoce w czasie produkcji soku, sposób przeprowadzania oczyszczania, klarowania, maceracji czy pasteryzowania istotnie wpływają na jego skład [10]. Ponadto antocyjany wykazują bardzo małą stabilność w podwyższonych temperaturach, dlatego pasteryzacja i wszelka obróbka termiczna powoduje obniżenie zawartości tych związków w sokach. Natomiast stosowanie preparatów enzymatycznych do maceracji miazgi owocowej znacząco zwiększa ilość uwalnianych polifenoli (tabela III) [10]. Również nasiona czarnej porzeczki zawierają związki aktywne biologicznie. Są one szczególnie bogatym źródłem kwasów tłuszczowych (tabela IV). Zawierają duże ilości kwasów: γ-linolenowego (GLA, 18:3(n–6)), linolowego (LA, 18:2(n–6)),), α-linolenowego (ALA, 18:3(n–6)), a także − rzadko występującego naturalnie kwasu stearydynowego (SDA, 18:4(n–3)) [12]. Ponadto nasiona charakteryzują się podobną jak owoce czarnej porzeczki zawartością polifenoli. Podstawowymi polifenolami nasion są antocyjany głównie występujące, jako glikozydy cyjanidyny i delfinidyny oraz rutynozydy cyjanidyny i delfinidyny, a także glikozydy mircetyny i kwercetyny.

Właściwości biologiczne czarnej porzeczki Działanie biologiczne owoców czarnej porzeczki związane jest z występowaniem w niej związków o działaniu antyoksydacyjnym, w tym głównie witaminy C oraz polifenoli, a zwłaszcza flawonoidów, wśród których szczególnie ważne są antocyjany (antocyjaniny) stanowiące 92-95% wszystkich polifenoli zawartych w czarnej porzeczce [13]. Owoce te są jednocześnie jednym z najbogatszych źródeł antocyjanin. Zawartość antocyjanin w czarnej porzeczce waha się w granicach 199 – 304,87mg/100g i zależy przede wszystkim od gatunku krzewu [4, 5]. W owocach czarnej porzeczki zidentyfikowano 14 antocyjanin, z których w największej ilości występują glikozydy cyjanidyny i delfinidyny [6]. Wzory strukturalne czterech głównych antocyjanin przedstawiono w tabeli V. W owocach czarnej porzeczki obok antocyjanin występują również ich bezbarwne prekursory – proantocyjanidyny, polikatechiny wykazujące również właściwości antyoksydacyjne [14]. Występują one jako dimery, oligomery i polimery, a całkowita zawartość tych związków waha się w granicach 120,6 do 165,8 mg/100g owoców [6]. Inną grupą polifenoli występujących w owocach czarnej porzeczki są flawonole [9, 15]. Zlokalizowane są one głównie w skórce owoców w postaci glikozydów, głównie jako mono- di- tri- i tetrasacharydy (glukozy, galaktozy ramnozy, arabinozy, ksylozy i kwasu glukoronowego). Większość flawonoli czarnej porzeczki to pochodne mircetyny (61%) i kwercetyny (36%) [8]. Oznaczono jednak również niewielkie ilości pochodnych kemferolu. W sumie w czarnej porzeczce zidentyfikowano 13 różnych flawonoli zarówno w formie glikozydów jak i aglikonów [8]. Kolejną grupą polifenoli, które występują w owocach czarnej porzeczki są kwasy fenolowe. Zawartość

kwasów fenolowych w owocach jagodowych jest bardzo duża w porównaniu z innymi roślinami. W czarnej porzeczce zidentyfikowano 18 różńych kwasów fenolowych [7]. Należą one głównie do pochodnych kwasu hydroksycynamonowego, hydroksybenzoesowego oraz kwasu p-hydroksyfenolooctowego i p-hydroksyfenolomlekowego. Ponadto w czarnej porzeczce występuje kwas sinapowy, którego niezidentyfikowano w żadnych innych owocach jagodowych. Całkowita zawartość kwasów fenolowych w czarnej porzeczce to 3484,1 mg/kg owoców, z czego wolne kwasy fenolowe stanowią 1,7%. Większość kwasów występuje w formie związanej, w postaci estrów (65,4%) i glikozydów (32,9%) [7]. Wolne kwasy polifenolowe w czarnej porzeczce to głównie m-kumarynowy, ferulynowy, p-hydroksyfenolooctowy [7]. Główne polifenole występujące w czarnej porzeczce - antocyjany wykazują aktywność biologiczną przede wszystkim antyoksydacyjną zarówno w roślinach, w których występują, jak i po spożyciu w organizmach zwierzęcych. Aktywność biologiczna w stosunku do organizmów zwierzęcych zależy w dużym stopniu od możliwości ich przenikania do tkanek i komórek. Uważa się, że w owocach czarnej porzeczki występują związki, które powodują wzrost absorpcji antocyjanin. Stwierdzono, że absorpcja antocyjanin z soku jest wyższa niż z wyizolowanych związków [16]. Badania na hodowlach komórek nabłonka ludzkiego wykazują, że istotą mechanizmu absorpcji i przyswajalności biologicznej antocyjanin może być metabolizm zachodzący w komórkach oraz sposób transportu tych związków przez błonę komórkową [17]. Antocyjany wprowadzone do układu pokarmowego są wchłaniane do krwioobiegu głównie w jelicie cienkim i żołądku [18, 19]. Maksymalne stężenie we krwi osiągane jest po około 120 minutach od spożycia [19]. Badania wykazały, że 3-glukozyd delfinidyny i 3-rutynozyd cyjanidyny po spożyciu są bezpośrednio absorbowane do krwi w niezmienionej formie i wydalane z moczem w postaci glikozydów [19]. Jednak ilość wydalonych antocyjanin czarnej porzeczki jest śladowa w porównaniu z przyjętą dawką. Badania pokazują, że po 8 godzinach od spożycia soku zawartość antocyjanin w moczu wynosi zaledwie 0,02 – 0,11% przyjętej dawki [19, 20]. Tak niewielkie stężenie antocyjanin w moczu jest spowodowane częściową ich eliminacją z kałem oraz z metabolizmem jakiemu ulegają [20, 21]. Badania pokazały, że antocyjany metabolizowane są w organizmie ludzkim do kwasów fenolowych. Głównymi metabolitami glikozydów cyjanidyny i delfinidyny są kwasy izofenolowy, prokatechinowy, 3,4-dihydroksyfenylopropinowy oraz 3,4-dihydroksyfenylooctowy [21]. Działanie antyoksydacyjne czarnej porzeczki potwierdziły wyniki badań wykonanych zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Stwierdzono, że antocyjany wyizolowane z czarnej porzeczki powodują zahamowanie wytwarzania RFT, takich jak nadtlenek wodoru w komórkach HL-60 oraz SH-SY5Y [22]. Składniki czarnej porzeczki wpływają na podwyższenie poziomu NO i przypuszcza się, że dzięki temu wykazują działanie wazorelaksujące [23]. Wykazano również, że spożycie soku jak i wyizolowanych antocyjanin wpływa na zdolności antyoksydacyjne powodując wzrost aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i peroksydazy glutationowej w erytrocytach szczurów [16, 24]. Konsekwen-

31

Farm Przegl Nauk, 2009,10 Tab. I. Skład chemiczny owoców czarnej porzeczki Związki Witamina C Polifenole:

Zawartość 9049 [mg/kg] 534,985 [mg/100g]

antocyjany

199-304,876 [mg/100g]

kwasy fenolowe

3484,17 [mg/kg]

flawonole

101-1588 [mg/kg]

proantocyjany Cukry:

120,6-165,86 [mg/100g] 85,09 – 179,924 [mg/g]

fruktoza

43,43 – 85,374 [mg/g]

glukoza

36,86 – 82,784 [mg/g]

sacharoza Kwasy organiczne:

3,38 – 36,884 [mg/g] 36,56 – 73,354 [mg/g]

cytrynowy

28,84 – 59,794 [mg/g]

jabłkowy

0,70 – 6,904 [mg/g]

winowy

0,46 – 1,124 [mg/g]

szczawiowy

0,23 – 0,474 [mg/g]

Tab. II. Chemiczny skład soku z czarnej porzeczki Sok z czarnej porzeczki Polifenole Witamina C Kwas szczawiowy Kwas cytrynowy K+

Zawartość 103310 mg/l 17711 g/100g 20411 mmol/l 2,8811 mmol/l 55,311 mmol/l

Ca2+

7,211 mmol/l

Mg2+ Na+

5,311 mmol/l 5,011 mmol/l

cją działania antyoksydacyjnego składników czarnej porzeczki jest ich zdolność do przeciwdziałania oksydacyjnym modyfikacjom istotnych biologicznie składników komórki jak DNA, lipidy i białka [22, 16, 24]. Stwierdzono, że polifenole zawarte w czarnej porzeczce, jak i wyizolowane z niej antocyjany chronią DNA przed działaniem nadtlenku wodoru, przy czym wykazano, że polifenole wyizolowane zawarte w soku działają skuteczniej niż wyizolowane z niego antocyjany [22]. Ochronne działanie antocyjanin wyizolowanych z czarnej porzeczki w stosunku do lipidów w warunkach in vitro stwierdzono oceniając stężenie heksanalu oraz koniugowanych dienów [13]. Badania in vitro pokazały, że antocyjany są efektownymi antyoksydantami w stosunku do emulsji typu o/w oraz w stosunku do LDL. Wykazano także ochronne działanie składników soku z czarnej porzeczki na peroksydację lipidów in vivo stwierdzając obniżenie poziomu MDA w surowicy krwi i wątrobie szczurów [24] i w surowicy krwi ludzi po spożyciu soku [25].

Uważa się, że zdolność soku z czarnej porzeczki do hamowania peroksydacji lipidów może przyczyniać się do ochronnego działania soku a zwłaszcza antocyjanin na układ sercowo – naczyniowy [15]. Jednak badania prowadzone na królikach jak i na ludziach wykazały, że sok z czarnej porzeczki nie chroni przed miażdżycą naczyń krwionośnych [16]. Natomiast badania prowadzone na królikach wykazały, że antocyjany wyizolowane z soku z czarnej porzeczki powodują wzrost poziomu cholesterolu, LDL, oraz triglicerydów we krwi, a picie soku z czarnej porzeczki nie wywiera żadnego wpływu na poziom całkowitego cholesterolu we krwi, powodując jednak obniżenie poziomu VLDL [16]. Oceniając poziom tryptofanu i grup karbonylowych w białkach wykazano również, że sok z czarnej porzeczki hamuje zachodzenie oksydacyjnych modyfikacji białek w warunkach in vitro [13]. Potwierdzono to w warunkach in vivo mierząc poziom semialdehydu 2-aminoadypinowego w wątrobie szczurów [24]. Istnieją również doniesienia, że sok z czarnej porzeczki wykazuje prooksydacyjne działanie w stosunku do białek osocza, przy antyoksydacyjnym działaniu w stosunku do lipidów [15, 26]. Niezależnie od protekcyjnego działania antocyjanin czarnej porzeczki w stosunku do różnych białek regenerują one barwnik siatkówki oka – rodopsynę, która jest niezbędna do absorpcji fotonów światła. Antocyjany nasilając regenerację rodopsyny, polepszają adaptację oka do widzenia w ciemności oraz poprawiają ostrość widzenia [27]. Ponadto antocyjany wpływają korzystnie na procesy widzenia chroniąc oko przed uszkodzeniami powodowanymi przez promieniowanie [28]. Wykazano, że 3-glukozyd cyjanidyny i 3-rutynozyd cyjanidyny przyśpieszają regenerację rodopsyny, natomiast 3-rutynozyd delfinidyny i 3-glikozyd delfinidyny nie wpływają na regenerację tego białka [28]. Wynika to z różnic w polarności tych związków. Ponadto antocyjany poprzez poprawę ukrwienia siatkówki oka powodują poprawę komfortu widzenia pacjentów krótkowzrocznych [28]. Niezależnie od właściwości antyoksydacyjnych sok z czarnej porzeczki wykazuje również działanie przeciwwirusowe. Stwierdzono, że hamuje on rozwój wirusa opryszczki (herpes simplex wirus) [29] oraz wirusa grypy typu A i B [30]. Wykazano, że do zahamowania o 50% rozwoju wirusa A i B potrzebny jest ekstrakt z czarnej porzeczki o stężeniu 3,2µg/ml, a do zahamowania o 99% ekstrakt o stężeniu 10µg/ml [30]. Istnieją również badania sugerujące, że sok z czarnej porzeczki dzięki działaniu alkalizujacemu może zapobiegać tworzeniu się i wzrostowi kamieni moczowych oraz wspomagać leczenie kamicy nerkowej [11]. Wykazano ponadto, że spożywanie soku powoduje wzrost wydalania kwasu cytrynowego i szczawiowego [11]. Badania przedkliniczne dowodzą, że antyoksydanty zawarte w czarnej porzeczce obniżają ryzyko rozwoju nowo-

Tab. III. Wpływ obróbki termicznej na skład soku [10] Sok z czarnej porzeczki Bez maceracji Po maceracji

32

Sok niepasteryzowany

Sok pasteryzowany

Polifenole

Antocyjany

Polifenole

Antocyjany

[mg/l] 2624 8127

[mg/l] 1327 2935

[mg/l] 3011 10639

[mg/l] 882 2246

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Tab. IV. Zawartość kwasów tłuszczowych w nasionach czarnej porzeczki [12] Kwas tłuszczowy Omega-6:

Zawartość [%]

linolowy (LA)

47,5

α-linolenowy (ALA)

14,5

γ-linolenowy (GLA) Omega-3:

12,6

stearydynowy (SDA)

2,7

Tab. V. Zawartość antocyjanin w owocach czarnej porzeczki [6] Wzór strukturalny

Pełna nazwa

Skrót

Zawartość [mg/100g]

3- glukozyd cyjanidyny

Cys-3-glu

28,56

3-rutynozyd cyjanidyny

Cys-3-rut

134,94

3-glukozyd delfinidyny

Del-3-glu

112,54

3-rutynozyd delfinidyny

Del-3-rut

275,17

OH OH HO

O

+

O - glukoza OH OH OH HO

O

+

O - rutynoza OH OH OH HO

O

+

OH O - glukoza

OH OH OH HO

O

+

OH O - rutynoza

OH

tworów. W badaniach prowadzonych na hodowlach komórek raka okrężnicy HT29 i raka piersi MCF-7 udowodniono, że ekstrakt z owoców czarnej porzeczki hamuje namnażanie się tych komórek, a efektywność tego procesu zależy od stężenia soku [31, 32]. Badania prowadzone na komórkach H29 sugerują, że inhibicja komórek nowotworowych związana jest z ekspresją białka p21(WAF1) [32]. Piśmiennictwo 1. Tabart J i wsp. Antioxidant capacity of black currant varies with organ season and cultivar. J Agric Food Chem 2006; 54: 6271-6276. 2. Strzelecka H, Kowalski J. Encyklopedia zielarstwa i ziołolecznictwa. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2000. 3. Lamer-Zarawska E i wsp. Fitoterapia i leki roślinne. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2007. 4. Bordonaba JG, Terry LA. Biochemical profiling and chemometric analysis of seventeen UK-grown black currant cultivars. J Agric Food Chem 2008; 56: 7422-7430.

5. Borowska EJ, Szajdek A. Składniki dietetyczne i substancje bioaktywne w owocach aronii, borówki i porzeczki czarnej. Bromat Chem Toksykol 2005; 2: 181-184. 6. Wu X i wsp. Characterization of anthocyanins and proanthocyanidins in some cultivars of Ribes nigrum, and Sambucus and their antioxidant capacity. J Agri Food Chem 2004; 52: 7846-7856. 7. Zaderowski R, Naczk M, Nesterowicz J. Phenolic acid profiles In some small berries. J Agric Food Chem 2005; 53: 2118-2124. 8. Koponen JM i wsp. Characterization and fate of black currant and bilberry flavonols in enzyme-aided processing. J Agric Food Chem 2008; 56: 3136-3144. 9. Häkkinen SH i wsp. Content of the flavonols quecetin, muricetin and kaempferol in 25 edible berries. J Agri Food Chem 1999; 47: 2274-2279. 10. Szajdek A, Dąbrowska E, Borowska EJ. Wpływ obróbki enzymatycznej miazgi owoców jagodowych na zawartość polifenoli i aktywność soku. Żywność 2006; 4: 59-67. 11. Keβler T, Jansen B, Hesse A. Effect of blackcurrant-, cranberry-, and plum juice consumption on risk factors associated with kidney stone formation. Euro J Clin Nutr 2002;56: 1020-1023. 12. Tahvonen RL i wsp. Black currant seed oil and fish oil supplements differ in their effects on fatty acid profiles of plasma lipids, and concentrations of serum total and lipoprotein lipids, plasma glucose and insulin. J Nutri Biochem 2005; 16: 353-359. 13. Viljanen K i wsp. Inhibition of protein and lipid oxidation in liposomes by berry phenolics. J Agri Food Chem 2004; 52: 7419-7424. 14. Krenn L i wsp. Anthocyanin- and proanthocyanidin-rich extracts of berries in food supplements – analysis with problems. Die Pharm 2007; 62: 803-813. 15. Young J.F i wsp. Effezt of fruit intake on urinary quercetin extraction and biomarkers of antioxidative atatus. Am J Clin Nutr 1999; 69: 87-94. 16. Nielsen ILF i wsp. Anthocyanins increase low-density lipoprotein and plasma cholesterol and do not reduce atherosclerosis in Watanabe Heritable Hyperlipidemic rabbits. Mol Nutr Food Res 2005; 49: 301 – 308. 17. Steinert RE i wsp. Absorption of black currant anthocyanins by monolayers of human intestinal epithelial caco-2 cells mounted in using type chambers. J Agric Food Chem 2008; 56: 4995-5001. 18. Passamonti S i wsp. The stomach as a site for anthocyanins absorption from food. FEBS Letters 2003; 544: 210-213. 19. Mosumato H i wsp. Orally administered delphinidin 3-rutinoside and cyanidin 3-rutinoside are directly absorber in rats and humans and appear in the blood as the intact forms. J Agri Food Chem 2001; 49: 1546-1551. 20. Netzel M i wsp. Bioactive anthocyanins detected in human urine after ingestion of balckcurranr juice. J of Env Path Tox and Oncol 2001; 20(2): 89-95. 21. Nurmi T i wsp. Metabolism of berry anthocyanins to phenolic acids in humans. J Agri Food Chem 2009; 57: 2274-2281.

33

Farm Przegl Nauk, 2009,10 22. Gosh D i wsp. Effect of anthocyanins and other phenolics of boysenberry and blackcurrant as inhibitors of oxidative stress and damage to cellular DNA in SH-SY5Y and HL-60 cells. J Sci Food Agric 2006; 86: 678-686. 23. Nakamura Y, Matsumoto H, Todoki K. Endotheliumdependent vasorelaxation induced by black currant concentrate in rat thoracic aorta. Jpn J Pharmacol 2002; 89: 29 – 35. 24. Farombi EO i wsp. Commonly consumed and occurring dietary substances affect biomarkesr of oxidative stress and DNA damage in healthy rats. Food Chem Toxol 2004; 21: 1315-1322. 25. Netzel M i wsp. In vivo antioxidative capacity of a composite berry juice. Food Res Inter 2002; 35: 213-216. 26. Breinholt VM i wsp. Effects of commonly consumed fruit juices and carbohydrates on redox status and anticancer biomarkers in female rats. Nutr Cancer 2003; 45: 46-52. Adres do korespondencji: Ewa Ambrożewicz Uniwersytet Medyczny w Białymstoku 15-222 Białystok, ul. Mickiewicza 2a tel. + 48 85 748-57-08 e-mail: [email protected]

34

27. Nakaishi N i wsp. Effects of black currant anthocyanidine intake on dark adaptation and VDT work-induced transient refractive alteration in healthy humans. Altern Med Rev 2000; 5: 553-562. 28. Mosumato H i wsp. Stymulatory effect of cyanidin 3-glucoside on the regeneration of rhodopsin. J Agric Food Chem 2003; 51: 3560-3563. 29. Suzutani T i wsp. Anti-herpesvirus activity of an extract of Ribes nigrum L. Phytother Res 2003; 17: 609-613. 30. Knox MY i wsp. Activity of anthocyanins from fruit extract of Ribes nigrum L. against influenza A and B viruses. Act virol 2001; 45: 209-215. 31. Olsson ME i wsp. Inhibition of cancer cell proliferation in vitro by fruit and berry extracts and correlations with antioxidant levels. J Agri Food Chem 2004; 52: 7264-7271. 32. Wu QK i wsp. Berry phenolic modulate the expression of p21WAE1 and Bax but not Bcl-2 in HT-29 colon cancer cells. J Agric Food Chem 2007; 55: 1156-1163.

Farm Przegl Nauk, 2009,10, 35-38

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Wchłanianie wapnia w jelitach Intestinal absorption of calcium Barbara Dolińska1, Dominika Wożniak2, Florian Ryszka1 1 2

Farmaceutyczny Zakład Naukowo-Produkcyjny „Biochefa”, Sosnowiec „Apteka 2000” ul. Legionów Polskich 72, 41-300 Dąbrowa Górnicza

Streszczenie Wapń jest składnikiem mineralnym, niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania całego organizmu. Zapewnienie organizmowi odpowiedniej ilości wapnia jest potrzebne dla prawidłowej pracy układu nerwowego, kostnego i mięśnia sercowego. Przewód pokarmowy wraz z wątrobą i trzustką bierze istotny udział w utrzymaniu homeostazy wapnia w ustroju. Witamina D jest niezbędna do jelitowego wchłaniania wapnia, mineralizacji kości oraz spełnia ważną rolę przy funkcjach nerwowo - mięśniowych. Uważa się, że kalbindyna - białko wiążące wapń zależne od witaminy D, odgrywa ważną rolę w wewnątrzkomórkowym transporcie wapnia. Czynnikami stymulującymi wchłanianie wapnia są: laktoza, kwasy żółciowe i tłuszcze zawierające MCT (średniołańcuchowe kwasy tłuszczowe), a hamującymi – kwasy uronowe, kwas szczawiowy, nadmiar fosforanów w diecie oraz alkohol. Słowa kluczowe: wapń, witamina D, kalbindyna, wchłanianie

Wstęp Wapń stanowi ważny składnik tkanek podporowych oraz pełni funkcję regulatora stanu wrażliwości komórek nerwowych i aktywności enzymów śródkomórkowych. Bierze także udział w mechanizmie skurczu mięśni szkieletowych i gładkich, w utrzymywaniu stabilności cytoszkieletu komórkowego, w zjawiskach wzrostu i różnicowania komórek, jak również w procesach odporności komórkowozależnej, krzepnięcia i fibrynolizy [1]. Pomimo ważnych funkcji wewnątrzkomórkowych, aż 99 % całkowitych zasobów ustrojowych wapnia jest zlokalizowane w kościach. Około 40% wapnia znajdującego się w surowicy krwi jest związane z białkami, głównie z albuminami. Pozostałe 60% wapnia zawartego w surowicy jest w postaci zjonizowanej oraz kompleksów fosforanowych i cytrynianowych [2]. Dostarczenie organizmowi odpowiedniej ilości wapnia z pokarmem jest zatem niezbędne. Głównym źródłem wapnia

Abstract Calcium is a mineral, necessary for the proper functioning of the whole organism. Providing adequate quantities of body calcium is necessary for the proper working of the nervous system, skeletal and cardiac muscle. The gastrointestinal tract along with the liver and pancreas play an important role in maintaining calcium homeostasis in organism. Vitamin D is essential for intestinal calcium absorption, bone mineralisation and plays an important role in neuromuscular functions. Calbindin, the vitamin Ddependent calcium-binding protein, is believed to play an important role in intracellular calcium transport. There are several factors, which can stimulate calcium absorption: lactose, bile acids, MCT (medium chain triglycerides). Calcium absorption can be inhibited by uronic acid, oxalic acid, excess of phosphorus in the diet and alcohol. Key words: calcium, vitamin D, calbindin, absorption

w diecie są produkty spożywcze, a zwłaszcza mleko i jego przetwory. Wapń zawarty w produktach mlecznych jest lepiej przyswajalny i oprócz wpływu na tkankę kostną, obniża także zawartość tkanki tłuszczowej oraz korzystnie modyfikuje skład masy ciała. Jeżeli dieta nie pokrywa zapotrzebowania na wapń - niezbędne jest uzupełnienie go odpowiednimi preparatami. Ustalono, że zapotrzebowanie na wapń zmienia się z czasem, w związku z czym zalecane codzienne jego dawki (recommended dietary allowances – RDA) zależą od wieku człowieka. Zgodnie z obowiązującymi w Polsce normami, zalecane dzienne zapotrzebowanie na wapń wynosi 800 mg dla dzieci, a największe zapotrzebowanie 1 200 mg/dobę występuje u młodzieży. Dla kobiet do 25 roku życia oraz kobiet karmiących i w okresie pomenopauzalnym wynosi 1 100 mg/dobę [3-5]. Jednym z elementów składowych bilansu wapniowego organizmu jest absorpcja jelitowa. Ilość wapnia wchłoniętego zależy od wielu czynników, do których zalicza się: skład

Praca naukowa finansowana ze środków na realizację projektu współfinansowanego z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w Ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka Nr UDA-POIG.01.03.1-00-133/08-00 „Innowacyjne technologie produkcji biopreparatów na bazie nowej generacji jaj” w latach: 2009-2011.

35

Farm Przegl Nauk, 2009,10 racji pokarmowej, wiek, płeć, stan fizjologiczny, ewentualne choroby oraz stan odżywienia organizmu. Stopień wchłaniania tego pierwiastka zależy głównie od aktualnych potrzeb organizmu. Z przeciętnej racji pokarmowej wchłania się około 30-40% spożytego wapnia [6]. Metabolizm wapnia jest regulowany poprzez poziom parathormonu (PTH), kalcytoniny oraz witaminy D. Parathormon jest wydzielany przez gruczoły przytarczycowe, a jego główną rolą jest ochrona organizmu przed hipokalcemią, natomiast witamina D jest „kluczem do spiżarni z wapniem”. Przy jej braku spożywanie nawet znacznych ilości wapnia jest bezcelowe [2]. Złożony metabolizm wewnątrzustrojowy witaminy D prowadzi do powstania aktywnego hormonu - kalcytriolu (1,25(OH)2D3), który jest odpowiedzialny za regulację jelitowego wchłaniania wapnia. W komórkach narządów docelowych kalcytriol wiąże się ze swoistym receptorem jądrowym VDR (vitamin D receptor) występującym w kompleksie z receptorem X kwasu retinolowego i przez modulację odpowiednich genów wywołuje biologiczny efekt. Kalcytriol działa na enterocyt w sposób bezpośredni i pośredni, doprowadzając w efekcie do wzrostu wchłaniania wapnia z przewodu pokarmowego. Mechanizm bezpośredniego oddziaływania kalcytriolu polega na modyfikacji struktury fosfolipidów błony luminalnej, co może powodować lokalny wzrost przepuszczalności błony luminalnej dla jonów. Ten etap działania witaminy D jest niezależny od syntezy białek de novo. Drugiemu pośredniemu mechanizmowi działania kalcytriolu na poziomie komórki towarzyszy aktywacja genomu i synteza de novo białka wiążącego wapń – CaBP (calcium-binding protein). Im więcej kalcytriolu lokalizuje się w jelicie, tym większa jest synteza białka wiążącego wapń, oraz absorpcja wapnia z przewodu pokarmowego. Wykazano jeszcze jeden bardzo ważny aspekt działania witaminy D jako systemu endokrynnego - wpływ zawartości wapnia w diecie na stężenie jelitowe białka wiążącego wapń, a tym samym na wchłanianie wapnia z przewodu pokarmowego. Okazało się, że jelito odznacza się dużymi zdolnościami adaptacyjnymi w tym zakresie. Przy stosowaniu diety o niskiej zawartości wapnia jelito wytwarza znacznie więcej białka wiążącego wapń niż przy podawaniu diet o dużej zawartości wapnia, gdy synteza tego białka jest kilka razy mniejsza. Przy zastosowaniu diety o niskiej zawartości wapnia dochodzi do hipokalcemii, która jest bodźcem do wydzielania parathormonu (PTH) przez przytarczyce. Parathormon jest silnym stymulatorem działania 1α-hydroksylazy nerkowej, doprowadzającym do wzrostu syntezy kalcytriolu. Z chwilą normalizacji stężenia wapnia w surowicy zmniejsza się synteza PTH i dzięki temu zmniejsza się aktywność 1α-hydroksylazy nerkowej, doprowadzając do zmniejszonej syntezy kalcytriolu i spadku syntezy białka wiążącego wapń w jelicie. W konsekwencji prowadzi to do spadku absorpcji wapnia w przewodzie pokarmowym [7, 8]. Wapń wchłania się drogą transportu czynnego (przezkomórkowego) i drogą transportu biernego (paracelularną) [9-12]. W przebiegu aktywnego wchłaniania wapnia widoczne są 3 etapy [13]. Pierwszym z nich jest transport wapnia przez rąbek szczoteczkowy enterocytu, przebiegający zgodnie z gradientem stężeń. Stężenie wapnia w cytozolu jest bardzo niskie i pewną rolę ułatwiającą może odgrywać zmiana

36

płynności rąbka szczoteczkowego pod wpływem kalcytriolu, co wykazały badania Brasitusa i wsp. [14]. Inni autorzy stwierdzili obecność nośnika białkowego – kalmoduliny, integralnie związanej z rąbkiem szczoteczkowym [15]. Białko to odgrywa pewną rolę ochronną, zapobiegającą niekontrolowanemu wnikaniu wapnia do wnętrza komórki. Zgodnie z teorią Moosekera i wsp. [16] kalmodulina występuje w kompleksie z aktyną i miozyną. Wapń, przekraczając rąbek szczoteczkowy, łączy się z tym kompleksem białkowym i zamyka „kanał wapniowy” w błonie komórkowej, a ponowne jego otwarcie następuje po przekazaniu wapnia na nośnik wewnątrzkomórkowy, np. kalbindynę. Na podstawie badań izotopowych w stanach niedoboru witaminy D wykazano obecność wapnia jedynie w bezpośrednim sąsiedztwie rąbka szczoteczkowego, a przy tym nie stwierdzono przenikania Ca do dalszych części enterocyta. Drugim etapem aktywnego wchłaniania wapnia jest transport wewnątrzkomórkowy tego pierwiastka. W tym procesie bardzo ważną rolę odgrywa kalbindyna – białko wiążące wapń zależne od witaminy D, które pełni rolę bufora chroniącego komórkę przed niekorzystnym działaniem wapnia wewnątrz komórki i przenośnika jonów wapnia. Podczas badań na zwierzętach wykryto 2 formy tego białka. Pierwsza z nich, kalbindyna D28K, która występuje u ptaków, ma zdolność wiązania 4 atomów wapnia przez 1 cząsteczkę białka. Druga, występująca u ssaków – kalbindyna D9K, wiąże 2 atomy wapnia. Kalbindyna D9K zawiera 78 aminokwasów (wszystkie gatunki), jej masa cząsteczkowa wynosi od 8,787 kDa do 8,907 kDa w zależności od gatunku. Białko to transportuje Ca od rąbka szczoteczkowego do błony podstawno-bocznej enterocyta. Syntezę tego białka stymuluje kalcytriol, a hamuje ją kortyzol. Kalcytriol zwiększa ekspresję w enterocytach kanału wapniowego TRPV6 (transient receptor potential cation channel V6) i kalbindyny 9K (CaBP, calcium-binding protein), co zwiększa jelitową absorpcję wapnia spożytego z pokarmem z 10-15% do 30-40% [7, 13, 17-21]. W wewnątrzkomórkowym przemieszczaniu się kalbindyny pomocnicze znaczenie mają mikrotubule. Kalbindyna wykazuje różne powinowactwo do kationów, które można uszeregować następująco: Ca>Cd>Sr>Mn>Zn>Ba>Co>Mg [13]. Z badań Nemere i Normana [22] wynika, że pewną rolę odgrywa transport pęcherzykowy. W mechanizmie tym wapń wiąże się z białkowymi strukturami pęcherzyków. Niewielka część wapnia wędruje przez komórkę jako wapń wolny. Trzecim etapem aktywnego wchłaniania wapnia jest usuwanie tego pierwiastka z komórki na błonie podstawnobocznej. Proces ten wymaga energii, ponieważ przebiega przeciw gradientowi stężeń. Istotnym mechanizmem jest usuwanie wapnia w wyniku zastosowania pompy wapniowej [13]. Stymulujący wpływ na syntezę białek wchodzących w skład pompy wykazuje kalcytriol, działając na poziomie transkrypcji. Aktywność tej pompy zwiększają takie białka, jak kalbindyna i kalmodulina, chociaż mechanizm tej aktywacji nie jest poznany. Być może, pewną rolę odgrywa interakcja między białkami, a – być może – zdolność transformująca Ca2+. Inną drogą wydalania wapnia z komórki jest wymiana sodowo-wapniowa, polegajaca na wymianie 1 jonu wapniowego na 3 sodowe z płynu międzykomórkowego. Następnie jony sodowe zastępowane są przez pota-

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

sowe wskutek działania pompy sodowo-potasowej. Pęcherzyki transportujące wapń usuwane są z enterocyta drogą egzocytozy. Inne badania wskazują na bezpośredni wpływ estrogenów na wchłanianie wapnia [23, 24]. Wchłanianie wapnia drogą paracelularną (transport bierny) zachodzi przy dostatecznie wysokim stężeniu wapnia w świetle jelita, pozwalającym na pokonanie bariery potencjału elektrochemicznego pomiędzy światłem a lamina propria (5-8 mV). Stężenie wapnia w świetle wynosi wówczas około 6 mM. Wapń przenika przez złącza ścisłe (tight junction) pomiędzy enterocytami do płynu międzykomórkowego. Pewną rolę przypisuje się białkowej kinazie C, zwiększającej przepuszczalność międzykomórkową dla Ca [25]. Chociaż najszybsze wchłanianie wapnia odbywa się w dwunastnicy, a następnie w kolejności w jelicie czczym, jelicie krętym i okrężnicy, to największe ilości wapnia wchłaniane są w jelicie krętym (63%), następnie w jelicie czczym (23%) i dwunastnicy (15%). Jedynie nieznaczna ilość wapnia absorbowana jest w żołądku i okrężnicy. Zależność między czynnym i biernym wchłanianiem wapnia ma związek z jego podażą. Przy niskiej dominuje czynne wchłanianie przezkomórkowe, a przy wysokiej – bierne, drogą paracelularną. W górnych odcinkach przewodu pokarmowego (dwunastnicy, jelicie czczym) większą rolę wydaje się odgrywać wchłanianie czynne, natomiast w jelicie krętym – bierne [13]. Biodostępność wapnia jest bardzo zróżnicowana. Istnieje wiele czynników, które stymulują lub hamują wchłanianie wapnia. Takie czynniki, jak błonnik, kwas szczawiowy, kwasy uronowe, fityniany, nadmiar białka czy fosforu upośledzają wchłanianie wapnia, podczas gdy laktoza, aminokwasy, witamina D sprzyjają wykorzystaniu tego składnika z pożywienia. Laktoza obecna w mleku po strawieniu ułatwia transport wapnia. Dlatego osoby z brakiem enzymu rozkładającego laktozę są bardziej narażone na niedobór wapnia. Magnez obecny w żywności także ułatwia wchłanianie tego makroelementu. U osób stosujących dietę bogatotłuszczową obserwuje się zwiększone wydalanie wapnia z organizmu. Wchłanianie wapnia obniża się wraz ze starzeniem się organizmu. Związane jest to m.in. z niedoborem estrogenów. Hormony te zwiększają absorpcję jonów Ca2+ pośrednio – przez wzrost produkcji witaminy D w nerkach. Zapewniają również prawidłową odpowiedź jelit na witaminę D. Dieta bogata w sód znacznie zwiększa wydalanie wapnia. Istotnym warunkiem prawidłowej gospodarki wapniowej w ustroju jest odpowiedni stosunek wapnia do fosforu w pożywieniu. Przyjmuje się, że powinien on wynosić 1:1 u osób dorosłych, zapewnia to bowiem optymalne wchłanianie wapnia z przewodu pokarmowego i wbudowywanie go do kości. Oligosacharydy o właściwościach prebiotycznych poprawiają jelitowe wchłanianie wapnia nie tylko u niemowląt i małych dzieci, ale także u nastolatków. Kwasy żółciowe nasilają wchłanianie wapnia poprzez zwiększenie rozpuszczalności soli wapniowych, a pośrednio poprzez ułatwienie wchłaniania witaminy D. Innym czynnikiem stymulującym wchłanianie wapnia jest obecność lipidów zawierających średniołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Badania na zwierzętach wykazały, że dieta wzbogacona o foswitynę, główną fosfoglikoproteinę żółtka jaja, zwiększa wbudowywanie wapnia do kości [13, 26-33].

Podsumowanie Jony wapnia ogrywają ważną rolę w wielu procesach fizjologicznych dotyczących układu krążenia, nerwowego, mięśniowego oraz kostno-szkieletowego. Zatem dostarczenie organizmowi odpowiedniej ilości wapnia ma istotne znaczenie w prawidłowym rozwoju oraz w profilaktyce szeregu chorób cywilizacyjnych, takich jak osteoporoza, otyłość, cukrzyca typu 2, nadciśnienie tętnicze, niektóre nowotwory. Najlepszym sposobem zapewnienia właściwej podaży tego makroelementu jest odpowiednio wysokie spożycie mleka i jego przetworów. Jak wskazują badania jest to najlepsze i najefektywniejsze źródło wapnia. Wchłanianie wapnia, jest uzależnione od poprawnego stanu śluzówki przewodu pokarmowego oraz od obecności związków niezbędnych do transportu wapnia przez ściankę jelit do krwioobiegu. Na stężenie wapnia w surowicy ma wpływ jego ilość w spożywanym pokarmie, stopień wchłaniania z przewodu pokarmowego oraz wydalania z moczem. Do utrzymania prawidłowej homeostazy wapnia w ustroju niezbędna jest witamina D. Przez aktywny metabolit 1,25 dihydroksycholecalciferol (1,25(OH)2D3) jest ona czynnikiem, który decyduje o wchłanianiu wapnia z przewodu pokarmowego. Kalbindyna będąca zależnym od witaminy D białkiem wiążącym wapń, odgrywa ważną rolę w wewnątrzkomórkowym transporcie wapnia. Istnieją związki zaburzające metabolizm wchłaniania wapnia oraz takie, które stymulują jego wchłanianie. Piśmiennictwo 1. Kokot F, Franek E. Postępy w badaniach nad gospodarką wapniowo-fosforanową – część I. Postępy Nauk Medycznych 2007; 5:168-174. 2. Knypl K. Znaczenie magnezu oraz wapnia w schorzeniach układu krążenia. Przew Lek 2004; 11:44-48. 3. Lorenc RS, Głuszko P, Karczmarewicz E i wsp. Zalecenia postępowania diagnostycznego i leczniczego w osteoporozie. Obniżenie częstości złamań poprzez efektywną profilaktykę i leczenie. Terapia 2007; 9:11-39. 4. Ziemlański Ś, Bułhak-Jahymczyk B, Budzyńska-Topolowska J i wsp. Normy żywienia dla ludności w Polsce. Nowa Medycyna 1998; 4: 1-27. 5. Machelle M. The role of nutricion and nutritional supplements in women’s health. Fertil Steril 1999; 72:579-91. 6. Brzozowska A. Składniki mineralne. (w:) Żywienie człowieka. Podstawy nauki o żywieniu, red. Gawęcki J., Hryniewiecki L. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 1998, 198-240. 7. Sikorski T, Marcinowska-Suchowierska E. Osteoporoza wtórna w chorobach przewodu pokarmowego z perspektywy minionych 5 lat. Postępy Nauk Medycznych 2008; 6:366-380. 8. Walicka M, Jasik A, Paczyńska M i wsp. Niedobór witaminy D – problem społeczny. Postępy Nauk Medycznych 2008; 1:14-22. 9. Bronner F. Recent developments in intestinal calcium absorption. Nutr Rev. 2009; 67: 109-13. 10. Khanal RC, Nemere I: Regulation of intestinal calcium transport. Annu Rev Nutr. 2008; 28:179-96.

37

Farm Przegl Nauk, 2009,10 11. Bronner F. Mechanisms of intestinal calcium absorption. J Cell Biochem. 2003; 88:387-93. 12. Bronner F. Mechanisms and functional aspects of intestinal calcium absorption. J Exp Zoolog A Comp Exp Biol. 2003; 300:47-52. 13. Ryżko J. Gospodarka wapniowo-fosforanowa w stanach fizjologii i patologii układu pokarmowego. Pediatria Współczesna. Gastroenterologia, Hepatologia i Żywienie Dziecka 2001; 3:111-117. 14. Brasitus TA, Dudeja PK, Eby B i wsp. Correction by 1.25-dihydroxycholecalciferol of the abnormal fluidity and lipid composition of enterocyte brush border membranes in vitamin D – deprived rats. J. Biol. Chem. 1986; 261: 16404-16409. 15. Bikle DD, Munson S. 1.25-dihydroxyvitamin D increases calmodulin binding to specific protein in the chick duodenal brush border membrane. J. Clin. Invest. 1985; 76:2313-2316. 16. Mooseker MS, Wolenski JS, Coleman TR i wsp. Structural and functional dissection of membrane – bound mechanoenzyme: brush border myosin I. Curr. Top. Membr. 1991; 33:31-55. 17. Zhang C, Sun Y, Wang W i wsp. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of human Ca 2+loaded calbindin-D28k. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2008; 64:133-6. 18. Choi KC, Jeung EB. Molecular mechanism of regulation of the calcium-binding protein calbindin-D9k, and its physiological role(s) in mammals: a review of current research. J Cell Mol Med. 2008; 12:409-20. 19. Christakos S, Dhawan P, Benn B i wsp. Vitamin D: molecular mechanism of action. Ann N Y Acad Sci. 2007; 1116:340-8. 20. Bolt MJ, Cao LP, Kong J i wsp. Vitamin D receptor is required for dietary calcium-induced repression of calbindin-D9k expression in mice. J Nutr Biochem. 2005; 16:286-90. 21. Venyaminov SY, Klimtchuk ES, Bajzer Z i wsp. Changes in structure and stability of calbindin-D(28K) upon calcium binding. Anal Biochem. 2004; 334:97-105. Adres do korespondencji: dr hab. n. farm. Barbara Dolińska F. Z. N. P. Biochefa 41-205 Sosnowiec, ul. Kasztanowa 3 tel.: 32 291-69-68 e-mail: [email protected]

38

22. Nemere I, Norman AW. Transcaltachia, vesicular calcium transport, and microtubule – associated calbindin – D28K. Emerging views of 1.25-dihydroxyvitamin D3 – mediated intestinal calcium absorption. Miner. Electrolyte Metab.1990; 16:109-114. 23. O’Loughlin PD, Moris HA. Oestrogen deficiency impairs intestinal calcium absorption in the rat. J. Physiol. (Lond.)1998; 511:313-322. 24. Collin EM, Van den Bemd GJ, Van Aken M i wsp. Evidence for involvement of 17 beta-estradiol in intestinal calcium absorption independent of 1.25-dihydroxyvitamin D3 level in the rat. J. Bone Miner. Res.1999; 14:57-64. 25. Obeidl LM, Okazaki T, Karolak LA i wsp. Transcriptional regulation of protein kinase C by 1.25-dihydroxyvitamin D3 in HL-60 cells. J. Biol. Chem. 1990; 265: 2370-2374. 26. Marcinowska- Suchowiejska E. Miejsce wapnia i witaminy D w profilaktyce i leczeniu osteoporozy. Przew Lek 2001; 4:34-41. 27. Sobczuk A, Jabłoński E. Rola diety i wapnia w profilaktyce osteoporozy pomenopauzalnej. Prz Menopauz 2005; 2:48–52. 28. Ohta A. Prevention of osteoporosis by foods and dietary supplements. The effect of fructooligosaccharides (FOS) on the calcium absorption and bone. Clin Calcium. 2006; 16:1639-45. 29. Cashman K. Prebiotics and calcium bioavailability. Curr Issues Intest Microbiol. 2003; 4:21-32. 30. Cashman KD. A prebiotic substance persistently enhances intestinal calcium absorption and increases bone mineralization in young adolescents. Nutr Rev. 2006; 64:189-96. 31. Choi I, Jung Ch, Choi H i wsp. Effectiveness of phosvitin peptides on enhancing bioavailability of calcium and its accumulation in bones. Food Chemistry 2005; 93:577-583. 32. Dolińska B, Mikulska A, Ryszka F. Skuteczność preparatów wapnia w profilaktyce jego niedoborów. Farm Przegl Nauk 2008; 7-8:5-8. 33. Dolińska B, Mikulska A, Ryszka F. Promotory wchłaniania wapnia. Ann Acad Med Siles 2009; 63,1:76-83.

Farm Przegl Nauk, 2009,10, 39-48

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

Zastosowanie magnetycznych nanocząsteczek tlenku żelaza w diagnostyce onkologicznej Application of magnetic iron oxide nanoparticles in oncological diagnostics Mariusz Panczyk Zakład Dydaktyki i Efektów Kształcenia, Wydział Nauki o Zdrowiu, Warszawski Uniwersytet Medyczny Streszczenie Nanotechnologia jest stosunkowo nową interdyscyplinarną dziedziną nauki zajmującą się zarówno projektowaniem jak i inżynierią w skali nano (< 500 nanometrów [nm]). W najbliższym czasie technologia ta może przyczynić się do kolejnego przełomu w nowoczesnej terapii celowanej oraz diagnostyce molekularnej. Superparamagetyczny tlenek żelaza jest obecnie jednym z najważniejszego nanomateriałów do biomedycznych zastosowań. Nanocząsteczki mają relatywnie dużą powierzchnię co umożliwia ich skonjugowanie z różnymi ligandami (przeciwciała monoklonalne, peptydy) nacelowanymi na komórki nowotworowe. Ponadto nanocząsteczki tlenku żelaza mają unikalne właściwości paramagnetyczne, co czyni je doskonałym środkiem cieniującym do zastosowań w diagnostyce onkologicznej z wykorzystaniem technik magnetycznego rezonansu jądrowego. Zrozumienie podstaw tej ciągle rozwijającej się technologii oraz potencjalnych aplikacji klinicznych powinno być potrzebą wszystkich zajmujących się badaniem, diagnostyką oraz leczeniem onkologicznym.

Summary Nanotechnology is relatively new interdisciplinary science dealing with designing and engineering in a nanoscale (< 500 nanoscopic meters [nm]). This technology, in near future, may contribute to the next breakthrough in modern targeted therapy and molecular diagnostics. Superparamagnetic iron oxide is currently one of the most important nanomaterials for biomedical applications. Nanoparticles have relatively large surface which allow their conjugation with numerous ligands (monoclonal antibodies, peptides) aimed at cancer cells. Moreover, the iron oxide nanoparticles have unique paramagnetic characteristics making them a perfect contrast agent for oncological diagnostics applications using nuclear magnetic resonance. Understanding the basis of this constantly developing technology and its potential clinical application should be a need of all people involved in research, diagnostics and treatment of cancer. Key words: nanotechnology, nanoparticles, imagining, nanocontrasts, iron oxide

Słowa kluczowe: nanotechnologia, nanocząsteczki, obrazowanie, nanokontrasty, tlenek żelaza

Wstęp Ostatnie kilka lat intensywnych badań prowadzonych w ramach nanotechnologii doprowadziło do opracowania nanomateriałów, które pozwoliły na zastosowanie w praktyce eksperymentalnej i klinicznej nanonarzędzi przeznaczonych do obrazowania subkomórkowego oraz molekularnej diagnostyki nowotworów [1-4]. Nanocząsteczki w onkologii są wykorzystywane zarówno w bardzo czułych metodach obrazowania charakteryzujących się wysoką specyficznością, ale także mogą być użyteczne jako nośniki dla cytostatyków dostarczających leki wybiórczo nacelowane na zmieniono nowotworowo komórki guza. Niestety, aktualna wiedza na temat odpowiednich bioznaczników charakterystycznych dla fenotypowo zmienionej tkanki nowotworo-

wej pozwalających na specyficzne jej obrazowanie na tle tkanek zdrowych jest ograniczona. Taka sytuacja zmusza chemików, biologów, nanotechnologów oraz klinicystów do poszukiwania odpowiednich rozwiązań technicznych, umożliwiających tworzenie specjalnie zaprojektowanych bioaktywnych sond molekularnych, które pozwolą uzyskać wiarygodne dane z obrazowania użyteczne w diagnostyce onkologicznej. Jest co najmniej kilka przeszkód stojących na drodze do opracowania dobrych nanonarzędzi do diagnostyki nowotworów: (1) odpowiedni system dostarczenia nanosondy w okolice tkanki nowotworowej; (2) niska toksyczność i optymalna biodostępność; (3) stabilność nanokonstruktu w środowisku płynów ustrojowych; (4) dostatecznie duża efektywność wzbudzania sygnału niezbędnego do obrazowaniu w warunkach in vivo oraz (5)

39

Farm Przegl Nauk, 2009,10 Tab. I. Dostępne kontrasty IO do zastosowań w MRI [na podstawie Magnetic Resonance - Technology Information Portal: http://www.mr-tip.com] Rodzaj ION USPIO

Nazwa handlowa (producent) Sinerem® (Guerbet); Combidex (AMAG Pharmaceuticals) ®

ClariscanTM (GE Healthcare)

SPIO

SupravistTM (Bayer Schering Pharma AG) EndoremTM (Guerbet); Feridex (AMAG Pharmaceuticals) ®

Resovist® (Bayer Schering Pharma AG) Lumirem® (Guerbet); GastroMARK® (AMAG Pharmaceuticals) MPIO

Abdoscan® (GE Healthcare)

Inne nazwy (producent)

Charakterystyka

Piśmiennictwo

Ferumoxtran; AMI-227 (AMAG Pharmaceuticals)

wielkość krystalitu: 4,3-4,9 nm; całkowita wielkość: około 50 nm

[46]

czynnik wewnątrznaczyniowy

[82]

nanokontrast przeznaczony do MRA, obecnie w III fazie badań klinicznych

[83]

Ferumoxide; AMI-25 (AMAG Pharmaceuticals)

wielkość krystalitu: 4.3–4.8 nm; całkowita wielkość: około 200 nm

[46]

Ferrixan; Ferucarbotran; SHU-555A (Bayer Schering Pharma AG)

zawiesina nanocząsteczek opłaszczonych karboksydekstranem; rdzeń zawiera kilka krystalitów, każdy o średnicy około 4,2 nm; całkowita wielkość: około 62 nm

[84, 85]

Ferumoxsil; AMI-121 (AMAG Pharmaceuticals)

zawiesina nanocząsteczek SPIO opłaszczonych silikonem

[86]

Ferristene; OMP (GE Healthcare)

krystality IO opłaszczone hydrofobowym polimerem; wielkość całkowita około 3 μm

[87]

Feruglose; PEG-FERRON (GE Healthcare) SHU-555C (Bayer Schering Pharma AG)

MRA - magnetic resonance angiography; OMP – oral magnetic particles kompatybilność z istniejącymi technologiami stosowanymi w obrazowaniu. Technika magnetycznego rezonansu (MRI, magnetic resonance imaging) dostarcza obrazów wysokiego kontrastu, umożliwia określenie morfologii tkanek oraz szczegółów anatomicznych całego ciała. Technika ta jest najważniejszym narzędziem do diagnozowania onkologicznego, a przy wysokiej czułości możliwe jest jej dostosowanie do potrzeb obrazowania na poziomie komórkowym i molekularnym [5, 6]. W celu uzyskania bardziej szczegółowego obrazu, w metodzie MRI, stosuje się specjalne kontrasty o właściwościach magnetycznych. Przyjętym standardem klinicznym w MRI jest użycie Gd-DTPA (gadolinium diethylenetriaminopentaacetic acid), który jest kontrastem dający silny efekt T1. Z drugiej strony Gd-DTPA ma niską efektywność kontrastową, krótki czas retencji w warunkach in vivo oraz brak jednoznacznie określonej toksyczności i biokompatybilności z wewnątrzkomórkowym środowiskiem. Nadal poszukuje się innych, alternatywnych rozwiązań, które polepszyłyby jakość uzyskanych obrazów MRI [7-9]. Takim nowym czynnikiem kontrastowym może być nanocząsteczkowy magnetyczny tlenek żelaza (ION, iron oxide nanoparticles), który stanowi nową generację nośników przeznaczonych do nowotworowo-specyficznego obrazowania metodą MRI. Magnetyczny ION jest dużo bardziej efektywny niż Gd-DTPA, ponieważ możliwa jest modyfikacja jego właściwości magnetycznych poprzez zmianę wielkości krystalitowego rdzenia i zastosowanie specjalnych powłok okrywających ION [10]. Ponadto magnetyczny ION charakteryzuje

40

się długim czasem retencji we krwi, jest biodegradowalny oraz ma niską toksyczność [5, 11-14]. Niniejsza praca jest przeglądem badań z ostatnich kilku lat, przedstawiającym rozwój metod obrazowania nowotworów z użyciem kontrastów opartych o magnetyczne ION.

Superparamagnetyczne czynniki kontrastowe do zastosowań w MRI Kontrasty oparte o superaparamagnetyczne czynniki takie jak IO, mają postać układów koloidalnych zbudowanych z cząstek o wymiarach w granicach 5 – 200 nm. Każda cząstka składa się natomiast z bardzo małych krystalitów zawierających po kilka tysięcy jonów. Superparamagnetyzm to zjawisko pojawiające się w niektórych materiałach magnetycznych, które składają się z krystalitów (1 – 10 nm) zwanych nanocząstkami. Pojedynczy krystalit nie ma w sobie podziału na odrębne domeny magnetyczne. W temperaturze poniżej temperatury Curie lub temperatury Néela energia termiczna nie jest wystarczająca do zerwania oddziaływań pomiędzy sąsiadującymi atomami, jednakże może być wystarczająca do zmiany orientacji namagnesowania całego krystalitu. Jeżeli energia termiczna będzie większa niż energia anizotropii magnetycznej, spowoduje to, że moment magnetyczny cząstki będzie mógł się przeorientować. Takie ciągłe fluktuacje sprawiają, że materiał zacznie zachowywać się podobnie jak paramagnetyk. Główną różnica polega jednak na tym, że w paramagnetyku przyłożone pole magnetyczne wpływa na momenty magnetyczne pojedynczych

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

atomów, zaś w superparamagnetyku pole oddziałuje na momenty magnetyczne pochodzące od całych krystalitów. Ponadto moment magnetyczny dla takich superparamagnetycznych nanocząsteczek IO jest znacznie większy, niż dla chelatowanych cząsteczek zawierających jon gadolinu [15, 16]. Każda z cząstek zbudowana jest z rdzenia składającego się z kilku krystalitów i otoczony płaszczem ochronnym (patrz niżej). Wymiary krystalitów wpływają na właściwości takie jak relaksacja, a całkowita średnica cząstki odpowiada za cechy farmakokinetyczne kontrastu. Ze względu na wielkość cząstek można ION kontrasty podzielić na trzy rodzaje: (1) USPIO (ultrasmall superparamagnetic iron oxide) o wymiarach poniżej 50 nm; (2) SPIO (superparamagnetic iron oxide) o wymiarach w granicach 50 nm – 1 μm oraz (3) MPIO (micron-sized particles of iron oxide) duże cząsteczki dochodzące do kilku mikrometrów. Wielkości cząstek USPIO i SPIO pozwalają na ich dożylne zastosowanie, natomiast wymiary MPIO ograniczają ich podane jedynie drogą doustną w celu wykonania obrazowania układu pokarmowego. Ponadto nanocząsteczki SPIO są używane jako negatywne kontrasty do obrazowania wątroby, ponieważ wykazują się one dużym powinowactwem do siateczki endoplazmatycznej (RES, reticuloendothelial system) komórek wątroby (Kupffer cells) i śledziony. Natomiast nanocząsteczki o wymiarach poniżej 300 nm charakteryzują się długim okresem półtrwania we krwi, co umożliwia ich zastosowanie w angiografii. Nadal poszukuje się również nowych zastosowań dla takich formulacji ION, jak MION (monocrystalline iron oxide particles) czy CLIO (crosslinked iron oxides) [17]. Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) opiera się na zjawisku jądrowego rezonansu magnetycznego, który jest z powodzeniem stosowany w spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) w laboratoriach fizycznych i chemicznych. W istocie MRI jest tomografią z zastosowaniem NMR dla jąder atomów wodoru zawartych w cząsteczkach wody. Woda znajduje się we wszystkich miękkich tkankach ludzkich, jednak w różnych proporcjach w stosunku do innych związków chemicznych. Przy użyciu specjalnej cewki, fale radiowe (RF, radio frequency) są wysyłane w kierunku badanego obiektu. Protony atomów wodoru pochłaniają energię fali RF i wpadają w rezonans. Zależnie od natężenia sygnału oraz czasu jego trwania protony atomów wodoru przechodzą na wyższy poziom energetyczny. Po wyłączeniu „zakłócenia”, protony wracają do stanu początkowego, wypromieniowując energię, którą wcześniej pozyskały, w postaci sygnału swobodnej relaksacji. Powoduje to dające się zarejestrować zmiany sygnału emisji rezonansowej pochodzących z atomów wodoru obecnych w cząsteczkach wody, zawartych w tkankach. Relaksacja to zanikanie sygnału jakie następuje po wyłączeniu oddziaływania energii fali RF i jest wynikiem powrotu protonów do stanu równowagi (tzw. relaksacja podłużna, stała czasowa T1) lub też wynika ze wzajemnego oddziaływania momentów magnetycznych sąsiednich protonów (tzw. relaksacja poprzeczna, stała czasowa T2). Relaksacja indukowana przez środki kontrastowe oparta o cząsteczki superparamegnetyczne [16] jest opisana przez teorię relaksacji sformułowaną przez Curie (classical outer-sphere relaxation theory) [18]. Teoria ta wyjaśnia jakie jest tempo relaksacji protonów

wodoru znajdujących się w otoczeniu niesparowanych elektronów namagentyzowanych cząstek kontrastu [19]. Takie środki cieniujące charakteryzują się bardzo silnym wzmocnieniem T1, przy równoczesnej zmianie podatność okolic sąsiadujących z kontrastem na oddziaływanie pola magnetycznego, co ma wpływ na T2. W zależności od promienia cząstek, nankontrasty USPIO silniej wpływają na T1 (T1zależne środki, kontrasty pozytywne) w przeciwieństwie do SPIO, które są T2-zależne (kontrasty negatywne) [20-23].

Modyfikacje funkcjonalne ION Jest wiele różnych metod chemicznych, które mogą służyć do syntezy magnetycznych ION. Najczęściej stosowane to: metoda oparta o wytrącanie lub współwytrącanie oraz metoda syntezy odwróconej miceli [24, 25]. ION pozbawione odpowiedniego zewnętrznego płaszcza są niestabilne w środowisku wodnym i mają tendencję do agregacji i tworzenia osadu. Po padaniu in vivo, cząsteczki te często tworzą agregaty we krwi, które następnie ulegają sekwestracji przez makrofagi [26]. Dlatego też powierzchnia ION powinna być pokryta różnego typu polimerami, które eliminują lub znacznie zmniejszają efekt agregacji w warunkach fizjologicznych in vivo. W praktyce można zastosować opłaszczenie in situ w trakcie lub bezpośrednio po syntezie ION [27-29]. Ponadto możliwe jest kapsułkowanie magnetycznych ION w liposomach lub też utworzenie magnetoliposomów [30]. Polimerowe amfifilowe surfaktanty takie jak poloksamery, polokasaminy i glikol polietylenowy (PEG, poly(ethylene glycol)) są zwykle używane do utworzenia otoczek powierzchniowych ION w celu zmniejszenia lub całkowitego wyeliminowania opsonizacji ION. Wśród wymienionych polimerów amfifilowych najczęściej stosowanym do tworzenia otoczek powierzchniowych jest PEG, który nadaje ION takich pożądanych cech jak: wysoką rozpuszczalność i stabilność w wodnym środowisku, biokompatybilność oraz długi czas retencji we krwi. Bardzo istotną cechą PEG jest możliwość modyfikacji jego grup funkcyjnych pozwalająca na skonjugowanie z ION różnego rodzaju ligandów lub cząsteczek czynnych farmakologicznie [25, 31-36]. Oczywiście takie opłaszczone ION mają ograniczoną liczbę miejsc wiązania dla ligandów, ponieważ jest ona limitowana liczbą wolnych grup funkcyjnych zlokalizowanych w warstwie powierzchniowej ION [33]. Laconte i współpracownicy oraz Yang i współpracownicy wykazali, że masa molekularna PEG znacząco wpływa na stopień biodystrybucji opłaszczonych ION w warunkach in vivo [37, 38]. Dlatego też ważne jest dobranie odpowiedniej grubości warstwy płaszcza PEG podczas projektowania ION przeznaczonych do konstrukcji sond używanych do nowotworospecyficznego obrazowania in vivo. Poza PEG również inne materiały mogą być używane do tworzenia otoczek ION, należą do nich: poly(TMSMA-rPEGMA) (TMSMA, 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, PEGMA, poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) [26], warstwy kwasu hialuronowego (HA, hyaluronic acid) [39], modyfikowane dendrymery 3 generacji (3G) klasy poli(amido-aminowe) (PAMAM, poly(amido amine)) [40]. Ostatnio utworzono również nową klasę superparamegnetycznych cząsteczek, które mają jednolitą wielkość

41

Farm Przegl Nauk, 2009,10 sięgającą 5 – 30 nm. Takie nanocząsteczki mogą zostać opłaszczone trójblokowymi amfifilowymi polimerami, które dostarczają grup funkcyjnych do skonjugowania z odpowiednimi ligandami, takimi jak przeciwciała lub krótkie peptydy, które mają duże powinowactwo do biomolekuł specyficznych dla tkanki nowotworowej [41]. Pomimo intensywnych badań nad rozwojem zastosowań ION do kontrastowania metodą MRI, kilka przeszkód nadal nie zostało pokonanych. Głównym wyzwaniem jest opracowanie materiałów powierzchniowych do tworzenia otoczek, które będą nie tylko stabilizować nanocząsteczki w warunkach in vivo, ale przede wszystkim będą dostarczać odpowiednich grup funkcyjnych do kontrolowanej biokonjugacji ligandów tworzących sondę. Zbyt słabe związanie materiału tworzącego płaszcz nanocząsteczki, może przyczyniać się do oderwania powłoki i utworzenia agregatów podczas przechowywania kontrastu lub w warunkach użycia in vivo. Ponadto tak uszkodzony kontrast przestaje być użyteczny w specyficznym obrazowaniu opartym o reakcję ligand ↔ target. Innym istotnym problemem są właściwości magnetyczne ION, które wpływają na efektywność obrazów uzyskanych w MRI. Właściwości te zależą w znacznym stopniu od morfologii, struktury krystalitu, wielkości oraz jednolitości mieszaniny ION. Aktualnie, najwięcej badań związanych z użyciem ION do celów molekularnego obrazowania, poświęconych jest metodą kontroli wielkości i morfologii nanocząsteczek. Cechy te są krytyczne dla właściwości magnetycznych kontrastów co bezpośrednio wpływa na jakość uzyskanych obrazów MRI, a w konsekwencji na użyteczność kliniczną tej metody. Dla potrzeb takich zastosowań najlepsze są ION o wymiarach w granicach od 5 do 150 nm, wysokiej masie magnetycznej oraz możliwości utworzenia stabilnych konstruktów skoniungowanych z wysoce specyficznymi ligandami dla biomolekuł nowotworowych [17, 42].

Zarejestrowane nanokontrasty IO stosowane w obrazowaniu in vivo Wśród różnych rodzajów używanych kontrastów in vivo można wyróżnić dwie podstawowe grupy: niespecyficzne oraz organo-specyficzne środki cieniujące. Pierwsze spośród nich to takie, które nie mają jakiegoś szczególnego powinowactwa do określonych struktur komórkowych lub tkanek, charakteryzują się niską masą cząsteczkową, szybkim klirensem nerkowym, szybko osiągają jednakowe stężenie w kompartmencie śródnaczyniowym i pozanaczyniowym. Środki takie są stosowane w obrazowaniu przestrzeni pozakomórkowych (ECF, extracellular fluid agents). Do pierwszej grupy kontrastów zalicza się również czynniki o większej masie cząsteczkowej, które osiągają duże stężenie śródnaczyniowe, wolno ulegają wydalaniu przez nerki i/lub wątrobę, mają one zastosowanie w technikach obrazowania naczyń (MRA, magnetic resonance angiography). Organo-specyficzne kontrasty wykazują się dużym powinowactwem do określonych typów komórek, przy czym zdolność do specyficznej dystrybucji tkankowej może mieć charakter bierny lub czynny (kontrasty celowane). Organo-specyficzne bierne środki cieniujące mają zastosowanie w obrazowaniu wątroby, śledziony, węzłów chłonnych,

42

szpiku kostnego oraz mózgu. Natomiast kontrasty celowane, ulegające czynnej biodystrybucji, są tak skonstruowane, aby specyficznie rozpoznawać pewne stany patologiczne, takie jak procesy zapalne i miażdżycowe czy apoptozę, ale także fenotypowo zmienione komórki np. powstające w wyniku transformacji nowotworowej. W wielu przypadkach molekularne cele, na które skierowane są takie kontrasty zlokalizowane są wewnątrzkomórkowo. Nanocząsteczki SPIO używane są w obrazowaniu in vivo jako kontrasty charakteryzujące się w zależności od stężenia, silnym wzmocnieniem T1 lub T2 [43]. Ze względu na znaczne rozmiary cząsteczek kontrastu, bardzo wolno przenika on przez barierę naczyniową, długi czas pozostając w znacznym stężeniu w kompartmencie śródnaczyniowym. Ponadto w przeciwieństwie do środków opartych o chelatowany Gd3+, kontrasty ION są wychwytywane poprzez system RES wątroby, śledziony i węzłów chłonnych i włączone w ogólnoustrojowy obieg żelaza (ferrytyna, hemosyderyna, hemoglobina), co sprawia że eliminacja z organizmu nie jest prostym procesem opartym o filtrację nerkową. Nanokontrasty SPIO po podaniu dożylnym nie akumulują się w hepatocytach ani komórkach metastazowych, ale ulegają sekwestracji przez fagocytujące komórki Kupffera wątroby i śledziony, które stanowią jedynie 2-3% całej populacji komórek tych narządów. Ponieważ nanocząsteczki SPIO wykazują się bardzo silnym efektem T2, więc nawet niewielka ich koncentracja pozwala na obrazowanie wątroby z użyciem takich kontrastów. Obecnie jest dostępnych kilka zarejestrowanych kontrastów SPIO stosowanych w obrazowaniu wątroby i śledziony: AMI-25 (Feridex®, AMAG Pharmaceuticals lub EndoremTM, Guerbet) oraz Resovist® (Bayer Schering Pharma AG) (Tabela I) [44]. Komórki zmienione nowotworowo są pozbawione RES lub mają obniżoną aktywność tego systemu, co skutkuje zróżnicowaną koncentracją kontrastu. Resovist® nie akumuluje się w komórkach metastazowych, ale może się gromadzić w komórkach rakowych HCC (hepatocellular carcinoma) i FNH (focal nodular hyperplasia). Feridex® nie ulega sekwestracji przez większość typów komórek nowotworowych. Ponieważ większość tkanek, takich jak przerzuty, guzy pierwotne, cysty czy gruczolaki charakteryzuje się słabszym powinowactwem do kontrastów SPIO, to możliwe jest ich zobrazowanie, dzięki dużej intensywności świecenia na tle zdrowej tkanki, widocznej jako ciemny obszar [45] Nanocząsteczki o mniejszych średnicach jak USPIO, ferumoxtran-10 (Sinerem®, Guerbet; Combidex®, ferumoxtran, Advanced Magnetics), SHU-555C (SupravistTM, Bayer Schering Pharma AG) i VSOP-C184 (Ferropharm GmbH), wykazują się mniejszym efektem relaksacji niż SPIO, ale za to mają korzystniejszy stosunek wartości T1/ T2 co czyni je doskonałymi środkami cieniującymi dla technik MRA (Tabela I) [46-48]. USPIO nie akumulują się tak szybko w układzie RES, jak duże cząsteczki innych kontrastów, co skutkuje ich długim okresem biologicznego półtrwania [49]. Niewielkie wymiary cząsteczek USPIO (mniej niż 10 nm) pozwalają na ich swobodne gromadzenie się w układzie limfatycznym, a przede wszystkim w węzłach chłonnych. Szczególnie dużym powinowactwem do USPIO wykazuje się układ fagocytów jednojądrowych (MPS, mononuclear phagocyte system) układu limfatycznego. Prawi-

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

dłowe utkanie tkankowe węzłów chłonnych, widoczne jest w obrazowania z użyciem kontrastu USPIO jako ciemny obszar, podczas gdy obecność przerzutów (mają mniejsze powinowactwo do kontrastu) można stwierdzić po jasnych plamach. Jeden z komercyjnie dostępnych nanokontrastów opartych o technologię USPIO stosowanym w obrazowaniu węzłów chłonnych jest Sinerem® (Guerbet) [50]. Wśród innych możliwych zastosowań takich kontrastów można wymienić: (1) określanie statusu angiogenezy w sąsiedztwie guzów nowotworowych, (2) lokalizacja i stan płytek miażdżycowych oraz (3) obrazowanie zmian w szpiku kostnym. Cząsteczki IO o wymiarach przekraczających 1 μm (MPIO) jak na przykład Abdoscan® (GE Healthcare) zbudowany z opłaszczonych krystalitów IO o całkowitej wielkości 3 μm oraz Lumirem® (Guerbet) znany również, jako GastroMARK® (AMAG Pharmaceuticals) zawiesina SPIO opłaszonych silikonem, są stosowane jako doustne środki cieniujące w obrazowaniu przewodu pokarmowego (Tabela I) [51]. Kontrasty te wypełniając żołądek i jelito cienkie powodują zaciemnienie tych obszarów umożliwiając obrazowanie struktur przyległych w tym trzustki, jelita grubego i przewodów żółciowych (cholangiografia MR).

Tworzenie kontrastów celowanych ION przeznaczonych do MRI Pomimo że liczne wyniki badań wskazują na możliwość zastosowanie ION w diagnostyce i terapii nowotworów [17, 52], to główną przeszkodą ograniczającą szerokie zastosowanie tych nanoobiektów w praktyce klinicznej jest brak satysfakcjonującej specyficzności kontrastów, tak aby stopień koncentracji osiągany w okolicach rozrostu nowotworowego, pozwalał na uzyskanie silnego sygnału niezbędnego w czułych metodach obrazowania. Jednym z możliwych rozwiązań powyższego problemu jest skonstruowanie specjalnych nacelowanych sond zbudowanych z ION i sprzęgniętych z nim ligandów dla których target zlokalizowany jest na komórkach nowotworowych [53]. Rozwój nowotworu jest procesem wieloetapowym u podłoża, którego leżą różnego rodzaju zmiany strukturalne i funkcjonalne genomu komórek ulegających transformacji. Podczas trwania procesu kancerogenezy zachodzą zmiany, które z czasem doprowadzają do uzyskania przez komórki stransformowane cech, które odróżniają je od tych jakie posiadają komórki tkanek zdrowych. Obecność specyficznych dla komórek nowotworowych guza receptorów powierzchniowych może zostać wykorzystane jako potencjalne cele dla sond z wbudowanym ligandem sprzęgniętym z ION. Przy projektowaniu i budowaniu nacelowanych sond kontrastowych zawierających ION wykorzystuje się różnego rodzaju ligandy, takie jak przeciwciała, peptydy czy małe cząsteczki. Dla takich ligandów celem są biomolekuły zlokalizowane na komórkach zmienionych nowotworowo. W ostatnich kilku latach intensywnie badano w eksperymentach prowadzonych w warunkach in vitro i in vivo różnego rodzaju konstrukty z ION, używając do tego celu hodowli nowotworowych linii komórkowych, zwierzęcych modeli różnych postaci nowotworów oraz zwierząt z wszczepiennym guzem (Tabela II). Najintensywniej badanym modelem kontrastu ION jest

sonda oparta o ligand jakim jest przeciwciało monoklonalne, który charakteryzuje się wysoką specyficznością w stosunku do targetu jakim jest pojedynczy epitop danego antygenu [12, 54-63]. Jednym z takich testowanych eksperymentalnie kontrastów były MEIO (magnetism-engineered iron oxide) skoniungowane z herceptyną (również komercyjnie dostępne humanizowane przeciwciało monoklonalne, Trastuzumab). Jest to dobrze scharakteryzowane przeciwciało skierowane przeciwko receptorom Her-2/neu, których nadekspresję obserwuj się na komórkach raka piersi. Receptory te stały się również targetem dla celowanej terapii tego nowotworu. Ponieważ reakcja antygen-przeciwciało jest bardzo specyficzna, to również dla wysoko czułego obrazowania MRI stała się ona doskonałym rozwiązaniem. Jak pokazał Lee i współpracownicy możliwe jest wykonanie takiej detekcji z użyciem sprzęgniętych sond w warunkach in vivo, małego guza o wielkości 50 mg [62]. Jednakże mimo tak obiecujących wyników, nierozwiązanym problemem pozostaje wielkość użytych przeciwciał, które nie pozwalają na uzyskanie satysfakcjonującego stopnia skunjugowania z powierzchnią ION. Ponadto rozmiary takich sond uniemożliwiają skuteczną ich penetrację przez barierę włośniczkową, a tym samy utrudnione jest uzyskanie wysokiego stopnia koncentracji w okolicach guza nowotworowego. Jedną z możliwych strategii przełamania powyższych ograniczeń jest użycie pojedynczych łańcuchów przeciwciał lub peptydów o niskiej masie cząsteczkowej. Kilka takich rozwiązań zostało przetestowanych w badaniach eksperymentalnych (Tabela II) [23, 64-71]. Peptydy dla których targetem są receptory powierzchniowe komórek nowotworowych mogą zostać wchłonięte (internalizacja) do przestrzeni wewnątrzkomórkowej poprzez endocytozę. Uzyskane w ten sposób wysokie stężenie skonjugowanych ION dostarcza silnego sygnału do detekcji MRI, dlatego też takie peptydy są idealnym ligandem dla nanocząsteczkowych sond używanych jako kontrasty w obrazowaniu. Chlorotoksyna jest 36 aminokwasowym peptydem, który ma specyficzne powinowactwo do MMP-2 (matrix metalloproteinase) zlokalizowanego na powierzchni komórek. Proteinaza MMP-2 ulega wysokiej nadekspresji w glejaku i innych podobnych rozrostach nowotworowych, przyczynia się do degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej prowadząc do wzrostu inwazyjności [72]. Sun i współpracownicy pokazali w eksperymencie z użyciem ION opłaszczonych bifunkcjonalnym PEG i sprzęgniętych kowalencyjnie z chlorotoksyną, że po dwugodzinnej inkubacji, internalizowane sondy osiągają 10-krotnie większe stężenie wewnątrz komórek glejaka w porównaniu z ION niesprzęgniętymi z żadnym ligandem. W badaniach in vivo prowadzonych na mysim modelu, stwierdzono ponadto większy kontrast w obrazowaniu techniką MRI w przypadkach z użyciem nacelowanych ION, niż dla „gołych” kontrastów [73]. Dużym wyzwaniem diagnostyki onkologicznej jest wczesne wykrywanie nowotworów. Antygen uMUC-1 (underglycosylated mucin-1 antigen) jest markerem wczesnych zmian nowotworowych, jest on prezentowany na powierzchni komórek niemal wszystkich nabłonkowych gruczolakoraków (adenocarcinoma). uMUC-1 ma kilka istotnych cech, które czynią go doskonałym targetem dla

43

Farm Przegl Nauk, 2009,10 Tab. II. Testowane in vivo i in vitro ION z przeznaczeniem do celowanej diagnostyki onkologicznej [na podstawie Molecular Imaging and Contrast Agent Database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=micad] Nanocząsteczki SPIO

Cel biologiczny CEA antygen powierzchniowy receptor dla trasferyny

Ligand przeciwciało anty-CEA przeciwciało monoklonalne L6 transferyna

CLIO

antygen uMUC-1

peptyd EPPT1

Ferumoxides (SPIO)

antygen komórek raka okrężnicy

przeciwciało monoklonalne A7

rak okrężnicy (mysz)

[59]

nanokrystality tlenku żelaza (Fe3O4)

receptor Her-2/neu

herceptyna

NIH3T6.7 (model mysi wszczepienny)

[58]

CLIO

receptor dla bombezyny

peptydy bombezyny (bombesin peptides)

PDAC (mysz)

[66]

SPIO kapsułkowany z czynnikiem fotodynamicznym

powierzchniowe antygeny naczyń guza

peptyd F3

glejak (szczur)

[67]

SPIO

receptor LHRH

LHRH

linie komórkowe oraz wszczepienny guz piersi (mysz)

[76]

USPIO

antygen powierzchniowy CD20

przeciwciało monoklonalne antyCD20

chłoniak Burkitta (mysz)

[61]

MION USPIO

Nowotwór rak okrężnicy (mysz) guz wewnątrzczaszkowy LX-1 (szczur) rak piersi (szczur) linie komórkowe raka piersi, jelita grubego, trzustki i płuc oraz model mysi różnych nowotworów

Piśmiennictwo [56] [55] [88] [64, 65]

peptyd CREKA

wszczepienny guz piersi (mysz)

[68]

USPIO

surowicze białka krzepnięcia integryna αvβ3

peptyd RGD

[69]

MEIO

receptor Her-2/neu

herceptyna

rak naskórkowy (mysz) NIH3T6.7 (model mysi wszczepienny)

siRNA (siSurvivin)

gruczolakorak jelita grubego (mysz)

[89]

kwas foliowy

linia komórkowa ludzkiego nabłonkowego nowotworu wargi

[63]

mysi model z nadekspresją receptora Her-2/neu

[90]

SPIO

CLIO PEG-SPIO

gen Birc5 kodujący surwiwinę receptor dla kwasu foliowego

Dekstran-IO

receptor Her-2/neu

PEG-IO CLIO

MMP-2 hepsyna (hepsin) integryna plektyna-1 (plectin-1)

CLIO SPIO

receptor EGFR

Trastuzumab (humanizowane przeciwciało monoklonalne) chlorotoksyna peptyd IPLVVPL

glejak (szczur) rak prostaty (mysz)

[35]

[34, 73] [23]

peptyd PTP

PDAC (mysz)

[70]

fragment przeciwciała anty-EGFR

wszczepienne guzy trzustki i nerek (mysz)

[71]

SPIO – superparamagnetic iron oxide; MION – monocrystalline iron oxide nanoparticles; USPIO – ultrasmall superparamagnetic iron oxide; CLIO – cross-linked iron oxide; MEIO - magnetism-engineered iron oxide; PEG-IO – poly(ethylene glycol)-magnetic iron oxide; PEG-SPIO – poly(ethylene glycol)-superparamagnetic iron oxide; CEA – canceroembrionic antigen; uMUC-1 – underglycosylated mucin-1; PDAC – pancreatic ductal adenocarcinoma; LHRH – liberyna uwalniająca hormon luteinizujący; MMP-2 – membrane-bound matrixmetallo proteinase-2; EGFR – epidermal growth factor receptor. wczesnej diagnostyki obrazowej: (1) ulega nadekspresji w ponad 50% przypadków raka, a poziom jego ekspresji utrzymuje się podczas rozrostu guza; (2) w komórkach rakowych jest białkiem niskoglikozylowanym w przeciwieństwie do tkanek zdrowych gdzie ulega wysokiej glikozylacji, umożliwia to rozróżnienie tych dwóch rodzajów fenotypu w obrazowaniu; (3) jest antygenem powierzchniowym co czyni go dostępnym dla nacelowanych sond kontrastowych. Moor i współpracownicy skonstruowali sondę zbudowaną z rdzenia SPIO opłaszczonego dekstranem (CLIO, crosslinked iron oxide) i skonjugowanego z peptydem EPPT1 specyficznie rozpoznającym uMUC-1. Tak przygotowany kontrast został użyty in vivo w obrazowaniu techniką MRI i NIRF (near-infrared fluorescence), dodatkowo do tego

44

celu użyto wyznakowania sondy fluorescencyjnym czynnikiem Cy5.5. Tak przygotowany kontrast daje wysokiej jakości sygnał dostarczający obrazu o szczegółowej lokalizacji i stanie guza oraz tkanek go otaczających co czyni go idealnym do zastosowania we wczesnej diagnostyce onkologicznej [64]. Około 37% pacjentek z rakiem piersi ma przerzuty odległe do kości i zajęte węzły chłonne co przyczynia się do niskiego odsetka (27%) 5-letnich przeżyć w tej grupie chorych [74]. Możliwość wczesnej detekcji przerzutów za pomocą specjalnie nacelowanych ION mogłoby znacznie poprawić przeżywalność pacjentów z zaawansowaną postacią nowotworu. Ponieważ około 52% komórek raka piersi wykazuje ekspresję receptorów dla LH-RH (liberyna uwalniająca hor-

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

mon luteinizujący, luteinizing hormone-releasing hormone) [75] to jest to doskonały target dla kontrastów opartych o ION. Nanocząsteczki SPIO skonjugowane z dekapeptydem rozpoznającym specyficznie receptory LH-RH, które są zlokalizowane zarówno na komórkach guzów pierwotnych oraz metastazowych, ulegają w wyniku internalizacji na drodze endocytozy, wewnątrzkomórkowej akumulacji. W badaniach in vitro, po inkubacji stwierdza się 12-krotnie większe stężenie sprzęgniętych nanocząsteczek SPIO w komórkach docelowych w porównaniu z „gołym” nanocząsteczkami. Natomiast w badaniach in vivo, 7,5-krotnie stężenie w komórkach guza pierwotnego i 11-krotne w guzach przerzutowych do wątroby. Tak obiecujące wyniki badań in vivo pozwalają sądzić, że takie konstrukty SPIO będą dobrym narzędziem do wysoko czułego obrazowania techniką MRI metastazowych stadiów raka piersi [76]. Angiogeneza jest jednym z kluczowych mechanizmów związanych z szerzeniem się rozrostu nowotworowego. Integryna αvβ3 jest markerem angiogenezy, a jej ekspresja koreluje ze stopniem zaawansowania nowotworu. Ponieważ ta biomolekuła zlokalizowana jest w nabłonku naczyń krwionośnych otaczających guz, więc target ten jest bezpośrednio dostępny dla ligandów znajdujących się we krwi, co czyni go idealnym dla celowanej diagnostyki obrazowej. Zhang i współpracownicy użyli ION opłaszczonych APTMS (3-aminopropyltrimethoxysilane), który posiada aminowe grupy funkcyjne. Za pomocą tego polimeru można utworzyć pojedynczą warstwę otaczającą ION, do której wiązaniem kowalencyjnym przyłącza się ligandy peptydowe w rodzaju RGD (Arg-Gly-Asp). RGD sprzęgnięte z nanocząsteczkami USPIO opłaszczonymi APTMS, wykazuje powinowactwo do integryny αvβ3. Badania in vivo na myszach o zróżnicowanym stopniu zaawansowania nowotworu, wykazały pozytywny wynik obrazowania techniką MRI, a intensywność świecenia zależała od poziomu αvβ3 w naczyniach krwionośnych okalających guz [69]. Aby zwiększyć czułość obrazowania w warunkach in vivo konieczne jest nie tylko uzyskanie odpowiedniego stopnia kumulacji kontrastu w komórkach nowotworowych ale przede wszystkim w całej masie guza. Większość obecnie używanych targetów do celowanej diagnostyki takich jak Her-2/neu, integryna αvβ3, czy uMUC-1 ulegają ekspresji jedynie w pewnej subpopulacji komórek rakowych lub konkretnym typie nowotworu. Simberg i współpracownicy syntezowali specjalny peptyd CREKA (Cys-Arg-Glu-LysAla), który skonjugowany z ION, pozwala utworzyć specyficzną dla architektury zrębu danego guza siatkę, która jest widoczna w obrazowaniu. Ponadto nanokontrasty CREKASPIO akumulują się w naczyniach krwionośnych okalających guz, inicjując przy tym procesy zakrzepowe. Powyższe cechy przyczyniają się do uznania tych nanokontrastów za bardzo obiecujące, ponieważ charakteryzuje je: (1) wysoka specyficzność dla różnych typów guzów litych; (2) wzmocnienie sygnału, co zwiększa czułość MRI; (3) embolizacja w wyniku fizycznego zablokowanie naczyń doprowadzających do guza poprzez utworzenie zatorów zakrzepowych [68]. Niskocząsteczkowy kwas foliowy (FA) dla którego receptory ulegają często nadekspresji w wielu typach nowotworów, również był badany jako potencjalny ligand do celowanego obrazowania. Zalety jakie wiążą się z użycie FA

w obrazowaniu to: (1) duża stała wiązania ligand-receptor; (2) niski koszt i stosunkowo prosty proces skonjugowania FA z ION; (3) dobra rozpuszczalność zarówno w wodnym jak i organicznym środowisku; (4) brak immunogenności [77]. Sun i współpracownicy zsyntezowali ION otoczony heterobifunkcjonalnym polimerem PEG 600 do którego następnie wiązaniami amidowymi przyłączyli cząsteczki FA. W badaniach in vitro z użyciem takich nanokontrastów przeprowadzonych na liniach komórkowych HeLa (komórki ludzkiego nowotworu karku) wykazano 12-krotnie większy poziom akumulacji sprzęgniętych ION w komórkach, w porównaniu z grupą kontrolną [78]. Ponadto w badaniach in vitro i in vivo wykazano, że takie nanokonstrukty SPIOPEG-FA mogą być użyteczne w celowanym obrazowaniu naskórkowego raka nosogardzieli (nasopharyngeal epidermoid carcinoma) [63, 79]. Pinkernelle i współpracownicy wykazali w badaniach in vitro z użycie ION prowadzonych na hodowli linii komórkowej ludzkiego raka okrężnicy, że niezbędnym minimalnym stężeniem żelaza potrzebnym do detekcji nanokontrastu metodą MRI było 4–5 µg/106 komórek [80]. Przy zastosowaniu celowanych ION próg wykrywalności zależy bezpośrednio od stopnia koncentracji targetu w komórkach docelowych. Na przykład ekspresja receptorów dla kwasu foliowego notowana w komórkach glejaka wynosi tylko 104, dla porównania ekspresja EGFR (epidermal growth factor receptors) obserwowana w linii komórkowej A431 ludzkiego raka płaskonabłonkowego to 3 x 106 [81]. Ponadto takie czynniki jak: stężenie zewnątrzkomórkowe ION, wielkość nanocząsteczki, rodzaj zewnętrznego płaszcza ION oraz czas inkubacji wpływają na dokładność detekcji MRI. W przypadku detekcji w warunkach in vivo pojawiają się kolejne ograniczenia wymagające nowych rozwiązań technicznych. Poniżej zostaną przedstawione najważniejsze problemy wymagające podjęcia badań eksperymentalnych nad kontrastami opartymi o technologię ION. (1) Konieczne jest każdorazowe opracowanie optymalnej liczby ligandów jakie muszą przypadać na pojedynczą nanocząsteczkę. Idealny stosunek liczby ligandów/jedną nanocząsteczkę zależy od: (a) gęstości targetów prezentowanych na komórkach docelowych; (b) siły wiązania ligand-target; (c) masy cząsteczkowej i wielkości liganda. (2) Należy przeprowadzić szczegółowe badania wewnątrzkomórkowej dystrybucji ION sprzęgniętych z ligandem: (a) jakie są losy nanokontrastu internalizowanego na drodze endocytozy; (b) czy endosom ulega degradacji pod wpływem lizosomów; (c) czy nanokontrast jest uwalniany do cytoplazmy komórki lub lokuje się w okolicach jądra komórkowego. (3) Ponieważ rozpiętość używanych dawek w eksperymentach z udziałem modeli zwierzęcych jest bardzo szeroka, od 1 do 250 mg Fe/ kg, utrudnia to właściwe porównanie wyników obrazowania uzyskanych przez różne zespoły badawcze. (4) Nadal nie udało się określić w badaniach ilościowych in vivo niezbędnych dawek nanokontrastów potrzebnych do uzyskania pożądanej jakości obrazów. Ponieważ możliwe jest łączenie techniki MRI z innymi metodami wykorzystującymi technologie znakowania takie jak radio- czy NIR-znaczniki, to uzyskany w ten sposób multimodalny obraz umożliwi śledzenie biodystrybucji oraz ilościową ocenę rozkładu znakowanych ION w organizmie żywym.

45

Farm Przegl Nauk, 2009,10

Podsumowanie Mimo że intensywne badania ostatnich lat dostarczyły przekonujących dowodów na możliwość stosowania różnego typu ION w celowanej diagnostyce onkologicznej, to nadal konieczne jest przeprowadzenie wielu prób przedklinicznych i klinicznych z zastosowaniem nanokontrasowych sond. Aplikacje do praktyki klinicznej wymagają nowych rozwiązań, które pozwolą pokonać istniejące ograniczenia w stosowaniu celowanych ION. Różnego typu bariery biologiczne uniemożliwiają uzyskanie dostatecznego stężenia kontrastu w sąsiedztwie rozrostu nowotworowego, zmienna ekspresja biomolekuł stanowiących targety dla nacelowanych ION utrudniają uniwersalne zastosowanie nanokontrastowych sond molekularnych, brak dostatecznej dystrybucji kontrastu w całej masie guza oraz trudności w uzyskaniu obrazowania przerzutów odległych zlokalizowanych w różnych miejscach organizmu. Badania eksperymentalne nad nanokontrastami opartymi o technologię ION wskazują, że obecnie zarejestrowane preparaty są tylko niewielką częścią wciąż niewykorzystanego potencjału jaki tkwi w możliwości klinicznego zastosowania nanonarzędzi w diagnostyce onkologicznej. Najbliższe lata powinny przynieść odpowiedź na pytanie, na ile obrazowanie technikami MRI z wykorzystaniem nanokontrastów ION może zwiększyć skuteczność wczesnego wykrywania zmian nowotworowych oraz pomóc w zwiększeniu efektywności terapii celowanej będącej domeną współczesnej onkologii klinicznej. Piśmiennictwo 1. Jain KK. Role of nanobiotechnology in developing personalized medicine for cancer. Technol Cancer Res Treat 2005; 4: 645-50. 2. Nie S et al. Nanotechnology applications in cancer. Annu Rev Biomed Eng 2007; 9: 257-88. 3. Sengupta S, Sasisekharan R. Exploiting nanotechnology to target cancer. Br J Cancer 2007; 96: 1315-9. 4. Wang MD et al. Nanotechnology for targeted cancer therapy. Expert Rev Anticancer Ther 2007; 7: 833-7. 5. Bradbury M, Hricak H. Molecular MR imaging in oncology. Magn Reson Imaging Clin N Am 2005; 13: 225-40. 6. Ito H. Oncology imaging: current status and new approaches. Int J Clin Oncol 2006; 11: 256-7. 7. Bird CR et al. Gd-DTPA-enhanced MR imaging in pediatric patients after brain tumor resection. Radiology 1988; 169: 123-6. 8. Bulte JW, Kraitchman DL. Iron oxide MR contrast agents for molecular and cellular imaging. NMR Biomed 2004; 17: 484-99. 9. Kim D, Hong KS, Song J. The present status of cell tracking methods in animal models using magnetic resonance imaging technology. Mol Cells 2007; 23: 132-7. 10. Rogers WJ, Basu P. Factors regulating macrophage endocytosis of nanoparticles: implications for targeted magnetic resonance plaque imaging. Atherosclerosis 2005; 178: 67-73. 11. Harisinghani MG et al. Noninvasive detection of clinically occult lymph-node metastases in prostate cancer. N Engl J Med 2003; 348: 2491-9.

46

12. Funovics MA et al. MR imaging of the her2/neu and 9.2.27 tumor antigens using immunospecific contrast agents. Magn Reson Imaging 2004; 22: 843-50. 13. Jain TK et al. Iron oxide nanoparticles for sustained delivery of anticancer agents. Mol Pharm 2005; 2: 194205.Montet X et al. Nanoparticle imaging of integrins on tumor cells. Neoplasia 2006; 8:214-22. 14. Muller RN et al. Relaxation by metal-containing nanosystems. Adv Inorg Chem 2005; 57: 239-92. 15. Laurent S et al. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis, stabilization, vectorization, physico-chemical characterizations and biological applications. Chem Rev 2008; 108: 2064-110. 16. Thorek DL et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticle probes for molecular imaging. Ann Biomed Eng 2006; 34: 23-38. 17. Gueron M. Nuclear relaxation in macromolecules by paramagnetic ions: a novel mechanism. J Magn Reson 1975; 19: 58-66. 18. Gillis P, Koenig SH. Transverse relaxation of solvent protons induced by magnetized spheres: application to ferritin, erythrocytes and magnetite. Magn Reson Med 1987; 5: 323-45. 19. Koenig SH, Kellar KE. Theory of 1/T1 and 1/T2 NMRD profiles of solutions of magnetic nanoparticles. Magn Reson Med 1995; 34: 227-33. 20. Roch A, Muller RN, Gillis P. Theory of proton relaxation induced by superparamagnetic particles. J Chem Phys 1999; 110: 5403-11. 21. Vogl TJ et al. Superparamagnetic iron oxide enhanced versus gadolinium-enhanced MR imaging for differential diagnosis of focal liver lesions. Radiology 1996; 198: 881-7. 22. Kelly KA et al. Detection of early prostate cancer using a hepsin-targeted imaging agent. Cancer Res 2008; 68: 2286–91. 23. Shen T et al. Monocrystalline iron oxide nanocompounds (MION): physicochemical properties. Magn Reson Med 1993; 29: 599-604. 24. Nitin N et al. Functionalization and peptide based delivery of magnetic nanoparticles as an intracellular MRI contrast agent. J Biol Inorg Chem 2004; 9: 706-12. 25. Lee H et al. Antibiofouling polymer-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential magnetic resonance contrast agents for in vivo cancer imaging. J Am Chem Soc 2006; 128: 7383-9. 26. Berry CC et al. Cell response to dextran-derivatised iron oxide nanoparticles post internalisation. Biomaterials 2004; 25: 5405-13. 27. Jodin L et al. Influence of the catalyst type on the growth of carbon nanotubes via methane chemical vapor deposition. J Phys Chem B 2006; 110: 7328-33. 28. Horak D et al. D-mannose-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem 2007; 18: 635-44. 29. De Cuyper M, Joniau M. Magnetoliposomes. Formation and structural characterization. Eur Biophys J 1988; 15: 311-9. 30. Kohler N, Fryxell GE, Zhang M. A bifunctional poly(ethylene glycol) silane immobilized on metallic oxidebased nanoparticles for conjugation with cell targeting agents. J Am Chem Soc 2004; 126: 7206-11.

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

31. Mikhaylova M et al. Superparamagnetism of magnetite nanoparticles: dependence on surface modification. Langmuir 2004; 20:2472-7. 32. Gupta AK, Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials 2005; 26: 3995-4021. 33. Veiseh O. et al. Optical and MRI multifunctional nanoprobe for targeting gliomas. Nano Lett 2005; 5: 1003-8. 34. Lee H et al. Thermally cross-linked superparamagnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and application as a dual imaging probe for cancer in vivo. J Am Chem Soc 2007; 129: 12739-45. 35. Kumagai M et al. Iron hydroxide nanoparticles coated with poly(ethylene glycol)-poly(aspartic acid) block copolymer as novel magnetic resonance contrast agents for in vivo cancer imaging. Colloids Surf B Biointerfaces 2007; 56: 174-81. 36. LaConte LE et al. Coating thickness of magnetic iron oxide nanoparticles affects R2 relaxivity. J Magn Reson Imaging 2007; 26: 1634-41. 37. Yang L et al. Receptor-targeted nanoparticles for in vivo imaging of breast cancer. Clin Cancer Res 2009; 15: 4722-32. 38. Kumar A et al. Development of hyaluronic acid-Fe2O3 hybrid magnetic nanoparticles for targeted delivery of peptides. Nanomedicine 2007; 3: 132-7. 39. Shi X et al. Synthesis, characterization, and intracellular uptake of carboxyl-terminated poly(amidoamine) dendrimer-stabilized iron oxide nanoparticles. Phys Chem Chem Phys 2007; 9: 5712-20. 40. Gao X et al. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nat Biotechnol 2004; 22: 969-76. 41. Wang YX, Hussain SM, Krestin GP. Superparamagnetic iron oxide contrast agents: physicochemical characteristics and applications in MR imaging. Eur Radiol 2001; 11: 2319-31. 42. Weissleder R et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: characterization of a new class of contrast agents for MR imaging. Radiology 1990; 175: 489-93. 43. Reimer P et al. Clinical results with Resovist: a phase 2 clinical trial. Radiology 1995; 195: 489-96. 44. Hamm B et al. Focal liver lesions: characterization with nonenhanced and dynamic contrast material-enhanced MR imaging. Radiology 1994; 190: 417-23. 45. Jung CW, Jacobs P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn Reson Imag 1995; 13: 661-74. 46. Weinmann HJ et al. Comparative studies on the efficacy of MRI contrast agents in MRA. Acad Radiol 2002; Suppl. 1: S135–6. 47. Taupitz M et al. New generation of monomer-stabilized very small superparamagnetic iron oxide particles (VSOP) as contrast medium for mr angiography: preclinical results in rats and rabbits. J Magn Reson Imag 2000; 12: 905-11. 48. Mornet S et al. Magnetic nanoparticle design for medical diagnosis and therapy. J Mater Chem 2004; 14: 2164-75.

49. Mack MG et al. Superparamagnetic iron oxide-enhanced MR imaging of head and neck lymph nodes. Radiology 2002; 222: 239-44. 50. Lonnemark M et al. Superparamagnetic particles as an MRI contrast agent for the gastrointestinal tract. Acta Radiol 1988; 29: 599-602. 51. Corot C et al. Recent advances in iron oxide nanocrystal technology for medical imaging. Adv Drug Deliv Rev 2006; 58: 1471-504. 52. Rhyner MN et al. Quantum dots and multifunctional nanoparticles: new contrast agents for tumor imaging. Nanomed 2006; 1: 209-17. 53. Cerdan S et al. Monoclonal antibody coated magnetite particles as contrast agents in magnetic resonance imaging of tumors. Magn Reson Med 1989; 12: 151-63. 54. Remsen LG et al. MR of carcinoma-specific monoclonal antibody conjugated to monocrystalline iron oxide nanoparticles: the potential for noninvasive diagnosis. AJNR Am J Neuroradiol 1996; 17: 411-8. 55. Tiefenauer LX et al. In vivo evaluation of magnetite nanoparticles for use as a tumor contrast agent in MRI. Magn Reson Imaging 1996; 14: 391-402. 56. Artemov D et al. MR molecular imaging of the Her-2/ neu receptor in breast cancer cells using targeted iron oxide nanoparticles. Magn Reson Med 2003; 49: 403-8. 57. Huh YM et al. In vivo magnetic resonance detection of cancer by using multifunctional magnetic nanocrystals. J Am Chem Soc 2005; 127: 12387-91. 58. TomaAet al. Monoclonal antibodyA7-superparamagnetic iron oxide as contrast agent of MR imaging of rectal carcinoma. Br J Cancer 2005; 93: 131-6. 59. Serda RE et al. Targeting and cellular trafficking of magnetic nanoparticles for prostate cancer imaging. Mol Imaging 2007; 6: 277-88. 60. Baio G et al. Magnetic resonance imaging at 1.5 T with immunospecific contrast agent in vitro and in vivo in a xenotransplant model. Magma 2006; 19: 313-20. 61. Lee JH et al. Artificially engineered magnetic nanoparticles for ultra-sensitive molecular imaging. Nat Med 2007; 13: 95-9. 62. Chen TJ et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. J Biomed Mater Res A 2008; 87: 165-75. 63. Moore A et al. In vivo targeting of underglycosylated MUC-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res 2004; 4: 1821-7. 64. Medarova Z et al. In vivo imaging of tumor response to therapy using a dual-modality imaging strategy. Int J Cancer 2006; 118: 2796-802. 65. Montet X, Weissleder R, Josephson L. Imaging pancreatic cancer with a Peptide-nanoparticle conjugate targeted to normal pancreas. Bioconjug Chem 2006; 17: 905-11. 66. Reddy GR et al. Vascular targeted nanoparticles for imaging and treatment of brain tumors. Clin Cancer Res 2006; 12: 6677-86. 67. Simberg D et al. Biomimetic amplification of nanoparticle homing to tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104: 932-6.

47

Farm Przegl Nauk, 2009,10 68. Zhang C et al. Specific targeting of tumor angiogenesis by RGD-conjugated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles using a clinical 1.5-T magnetic resonance scanner. Cancer Res 2007; 67: 1555-62. 69. Kelly KA et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLoS Med 2008; 5: e85. 70. Yang L et al. Single Chain Epidermal Growth Factor Receptor Antibody Conjugated Nanoparticles for in vivo Tumor Targeting and Imaging. Small 2008; 5: 235-43. 71. Veiseh M et al. Tumor paint: a chlorotoxin: Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res 2007; 67: 6882-8. 72. Sun C et al. In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes. Small 2008; 4: 372-9. 73. Jemal A et al. Cancer statistics, 2008. CA Cancer J Clin 2008; 58: 71-96. 74. Chatzistamou L et al. Effective treatment of metastatic MDA-MB-435 human estrogen-independent breast carcinomas with a targeted cytotoxic analogue of luteinizing hormone-releasing hormone AN-207. Clin Cancer Res 2000; 6: 4158-65. Adres do korespondencji: dr n. farm. Mariusz Panczyk Zakład Dydaktyki i Efektów Kształcenia Wydział Nauki o Zdrowiu Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Żwirki i Wigury 61 02-091 Warszawa tel. 22 57 20 490, fax. 22 57 20 491 e-mail: [email protected]

48

75. Leuschner C et al. LHRH-conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for detection of breast cancer metastases. Breast Cancer Res Treat 2006; 99: 163-76. 76. Low PS, Henne, WA, Doorneweerd DD. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Acc Chem Res 2008; 41: 120-9. 77. Sun C, Sze R, Zhang M. Folic acid-PEG conjugated superparamagnetic nanoparticles for targeted cellular uptake and detection by MRI. J Biomed Mater Res A 2006; 78: 550-7. 78. Chen H et al. Characterization of pH- and temperature sensitive hydrogel nanoparticles for controlled drug release. PDA J Pharm Sci Technol 2007; 61: 303-13. 79. Pinkernelle J et al. Imaging of single human carcinoma cells in vitro using a clinical whole-body magnetic resonance scanner at 3.0 T. Magn Reson Med 2005; 53: 1187-92.

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073

INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OF MANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY 1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewed transdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicine and related sciences. The journal publishes conference reports and materials, conference announcements, as well as letters to the Editor. 2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printed and an electronic form. Electronic versions of articles are to be sent to [email protected] or supplied on CD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagrams and figures) should be addressed to:



3.

4.

5. 6. 7.

8.

Scientific Review in Pharmacy 41-200 Sosnowiec ul. Jedności 8 Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345 Fax: +48 32 364 11 58 Disk label should contain the first name(s) and surname(s) of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphics should be included in separate files. Do not paste pictures and graphics to text files. The Editor advises to use Star Office, Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *. TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi. All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief. The Authors are encouraged to suggest their reviewers, however the final selection of a reviewer is up to the Editorial Board. The Editor-in-Chief reserves the right to correct or abbreviate the text (after the Author’s approval). Authors are requested to resubmit the revised manuscript within four weeks. Papers that are not resubmitted within four weeks will be treated as a new submission. The manuscript that has been rejected by the Scientific Review in Pharmacy should not be resubmitted. A cover letter should be included with the manuscript, containing a declaration that the manuscript has not been previously published in print or electronic format and is not under consideration by another journal or electronic medium, signed by all the Authors. It should also include written approval from the head of the institution in which the study was conducted. All human and animal research will have obtained ethical consent from the local Bioethical or Ethical Committee. The material sent in and the review will remain among the documentation of the Board of Editors. Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the whole of the copyrights for the published papers (including the right to publishing in print, on electronic media, such as CD-ROM disks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries is allowed without any written permission of the Editor. Instructions for authors: 8.1. Manuscript Page Setup • Paper: white, A4 format. • Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom) • Font: Times New Roman, no smaller than 12 points. • Text: Double-spaced, one side of the page only. • Numbering: Insert page numbers at bottom right of each page. • Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extra line space between paragraphs. • Subheads: All subheads should be flush with the left margin, with one line above. Indent first line after a subhead. Use an extra line space between the subhead and the text. • Title or Heading of the article: boldface, on separate line. • Second-level subhead: boldface, on separate line. • Third-level subhead: italic, on separate line. 8.2. Organization of Manuscript • Title page should include: submission date and Author(s) full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’ full current affiliations (for papers with multiply authors, please enumerate the authors and their affiliations in the following way: Author1, Author2, etc; 1Affiliation, 2Affiliation, etc.). Affiliations should contain the full name of the institution. One corresponding author must be designated for papers with coauthors. At the bottom of the page the full

name, academic degrees/titles, and address of the corresponding author should be given, including the telephone number, fax number and/or e-mail address. If research has been funded, please indicate the source of funding (including grant index/symbol, grant agencies, corporations, or sponsors). • The second page should include an abstract (150-250 words). The abstract must be self-contained, and must not require reference to the paper to be understood. The abstract should present objectives and scope of the study or reasons for writing the paper. The methods and techniques or approaches should be described only to the extent necessary for comprehension. The findings and conclusions should be concise and informative. The abstract should be followed by the key words consistent with the Medical Subject Headings Index Medicus, and should not contain unfamiliar terms that are not defined, undefined acronyms and reference citations. Neither displayed equations or lists should appear in the abstract. • Body text should be organized as follows: original paper - introduction, material and methods descriptions, research results, discussion; review papers – free structure; case studies – introduction (motivation for the study), case descriptions, discussion of the characteristic symptoms, treatment results etc. • Figures (diagrams, drawings, color or black-and-white photographs) should be put into a separate envelope. On each figure there should be its number (Arabic numerals), the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking. Figure captions should be placed on separate pages and numbered consecutively using Arabic numerals. Previously published visual materials should be supplied together with the written consent of the Publisher for reprint. • Tables, each on a separate page, should be numbered using Roman numerals and preceded by their captions. Table captions should be placed on separate pages, numbered using Roman numerals. • The papers should not exceed the following limitations: original and review work – 10 pages and others – 5 pages. 8.3. References to the works cited should be presented at the end of the paper and arranged according to the sequence of citations in the body text. The acronyms for journal titles should be used according to Index Medicus. Each entry, starting with a new line, should be given a number and must be presented as follows: • journal citation: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67. If there are more than three authors, the name of the first one should be given, followed by an ,,et al” annotation. Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associated changes in the serum lysosomal glycosidases activity and glycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331: 97-102. • the specific chapter: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. Biochemia Harpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1994, 59-69. • monograph: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw 2004. References to the works cited within the text should be numbered using Arabic numerals and placed between brackets, e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations: original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliography entries.

49

Farm Przegl Nauk, 2009,10

REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM 1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowane prace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe, z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych. Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na temat konferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji. 2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać w formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@ kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CDROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego (z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:

Farmaceutyczny Przegląd Naukowy 41-200 Sosnowiec ul. Jedności 8 Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345 Fax: +48 32 364 11 58



Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów) i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory. Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych. Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word, Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor: CMYK, rozdzielczość 300 dpi. Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych każdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca się autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja zastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta, jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu z autorem). Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu, zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającym czterech tygodni. W przeciwnym razie praca będzie traktowana jako nowa publikacja. Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta nie może być ponownie przedkładany Redakcji Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie była uprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcji innego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawierać również podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodę Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie publikacji w czasopiśmie. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, które są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji Redakcji. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskich do wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, na nośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy. Instrukcje dla autorów 8.1. Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu: • Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, na białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego odstępu między kolejnymi wierszami. • Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny). • Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt. • Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy od strony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnym rogu. • Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowych odstępów pomiędzy kolejnymi akapitami. • Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównane do lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstem należy wprowadzić jeden odstęp. • Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką. • Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubioną czcionką. • Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochyloną czcionką, 8.2 Układ manuskryptu • Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowych przy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afilia-

3.



4.

5. 6. 7.

8.

50

cję każdego z nich, w następujący sposób Autor1, Autor2, …; 1Afiliacja, 2Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim, nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca. U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres, telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję, dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanych prosimy o wskazanie źródła finansowania (w tym numery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lub sponsorów). • Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie (150-250 słów w języku polskim i angielskim), będące autonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczać odnośników literaturowych. Streszczenie powinno zawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawowe procedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Pod streszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w języku polskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject Headings Index Medicus. • Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały, według następującego schematu: prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań, dyskusja oraz wnioski; prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziały i podrozdziały; prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby, charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp. • Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe) powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane, opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy, z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać na oddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy na ponowną publikację. • Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami umieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać na oddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframi rzymskimi. • Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinna wynosić 10, a pozostałych – 5 stron. 8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowania w tekście pracy. Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z Index Medicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza, powinna być opatrzona numerem oraz zredagowana zgodnie z niżej podanym przykładem: • czasopismo naukowe: np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67. Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”. np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associated changes in the serum lysosomal glycosidases activity and the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331: 97-102. • wydawnictwo zbiorowe: np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1994, 59-69. • monografia: np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław 2004. Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1]. Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach oryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do 10 pozycji.