Roche Diagnostics informa Octubre 2010

LA MEDICINA PERSONALIZADA Una nueva era para el laboratorio clínico Utilidad clínica de los marcadores angiogénicos en la preeclampsia

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Troponina T cardíaca ultrasensible. Un paso adelante en el diagnóstico 45 cardiológico.

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Utilidad clínica de los marcadores angiogénicos en la preeclampsia.

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Nuevas perspectivas en el cribado del cáncer de cuello de útero. Importancia de la prueba de detección del virus del papiloma humano.

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Microparticulas circulantes

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Diseño e implantación del programa de cribado del Síndrome de Down y otras cromosomopatías en la Comunidad Autónoma Vasca

23

Incorporación del equipo Sysmex XT 4000i en la automatización de líquidos biológicos en el laboratorio y modificación del protocolo de trabajo.

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Importancia de la carga viral plasmática de bajo nivel en la infección por virus de la inmunodeficiencia humana tipo-1 (VIh-1).

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Troponina T cardíaca ultrasensible. Un paso adelante en el diagnóstico cardiológico.

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E d i t a : Roche Diagnostics S.L. Av. Generalitat 171-173 08174 Sant Cugat del Vallès Tel. 935834000 Fax 935834340 D i r e c t o r a : Maite Panadero C o m i t e d e r e d ac c i ó n : Luis de Cabo, Maribel Villarino, José Luis Salvador y José Mari Sanz R e a l iz ac i ó n : Miguel Luis Maier e - m a i l : [email protected] D e p ó s i t o l e g a l : B-4684 1980

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LA MEDICINA PERSONALIZADA Una nueva era para el laboratorio clínico

La medicina personalizada es un nuevo concepto en la práctica médica que ha llegado para quedarse. Si bien no es una forma desconocida de hacer medicina – por ejemplo, la medición de la glucosa en sangre o del tiempo de coagulación para adaptar las dosis terapéuticas a los pacientes en función de los datos aportados por el diagnóstico in vitro realizado supone una cierta individualización del tratamiento – el actual uso de este término, su desarrollo conceptual y su aplicación práctica supone un significativo avance en la forma de diagnosticar y definir la medidas terapéuticas para ciertas patologías. Existen claras evidencias desde hace tiempo que demuestran que la eficacia de las terapias es muy irregular y que sus efectos no deseados son, a veces, dramáticos. Por ejemplo, en EE.UU. se producen anualmente más de 100.000 muertes asociadas a efectos secundarios indeseables de medicamentos convencionales. En otros estudios se ha comprobado que solamente entre un 25% y un 75% de los pacientes obtienen una eficacia terapéutica adecuada cuando son tratados con fármacos de uso común, según el tipo de enfermedad. Este hecho es especialmente relevante en oncología, donde la tasa de fracaso llega hasta el 80%, lo que hace necesario un largo y arriesgado proceso de prueba y error por parte del clínico tratante hasta encontrar una respuesta terapéutica positiva. Los profesionales de la medicina, por tanto, están ansiosos por disponer de herramientas que les permitan preveer de antemano el efecto que una cierta terapia pueda tener en un paciente para así poder buscar la más efectiva y minimizar adicionalmente los riesgos asociados al uso de medicamentos. El desarrollo de nuevas tecnologías para el diagnóstico, establecidas sobre el conocimiento de las bases moleculares y genéticas de las enfermedades, tienen el potencial de convertirse en esa deseada herramienta. La abundante investigación biomédica que se está desarrollando alrededor de estos tópicos está aportando incontestable evidencia molecular y clínica sobre la bondad de estos conceptos y hace posible por primera vez el diagnóstico, la elección terapéutica adecuada y la evaluación del pronóstico médico de varias patologías, especialmente cáncer, que poco tiempo atrás presentaban formidables desafíos a los clínicos. La medicina personalizada se puede definir en este contexto como la capacidad de ajustar el tratamiento a subgrupos específicos de pacientes que comparten similitudes, ya sea a nivel genético o en la naturaleza molecular de la enfermedad. El papel del laboratorio es crucial para poder desarrollar las potencialidades medicas y asistenciales de este nuevo enfoque. El laboratorio debe dar un salto cualitativo y pasar a ser un elemento imprescindible en la medicina, proveyendo al clínico no sólo de datos valiosos sino, sobre todo, de información fundamental para poder diseñar juntos el mejor tratamiento posible para los pacientes y convertirse así en actor destacado en la práctica médica moderna.

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UTILIDAD CLíNICA DE LoS MARCADoRES ANGIoGéNICoS EN LA PREECLAMPSIA Ignacio Herraiz García1, Ana Elena López Jiménez2 , Paula Isabel Gómez Arriaga1, Alberto Galindo Izquierdo1 1 Servicio de Obstetricia y Ginecología. Hospital Universitario “12 de Octubre”. Madrid. 2 Servicio de Bioquímica Clínica. Hospital Universitario “12 de Octubre”. Madrid

Introducción

La preeclampsia (PE) forma parte de la triada de complicaciones más temibles del embarazo, conjuntamente con la hemorragia puerperal y las infecciones. La PE está involucrada en el 15% de las muertes maternas relacionadas con el embarazo. Estas cifras no se han visto reducidas a pesar de los importantes avances acontecidos en la última década en la medicina perinatal, e incluso aumentan en países como el nuestro a consecuencia del incremento en la edad media materna, la inmigración, la obesidad y los embarazos múltiples derivados de las técnicas de reproducción asistida (1). La PE es un trastorno hipertensivo del embarazo que se asocia a un daño vascular sistémico materno con particular afectación de los endotelios fenestrados presentes en el riñón, el hígado y el cerebro. Puesto que la PE produce una afectación generalizada del sistema circulatorio, la hipertensión es una de sus manifestaciones más frecuentes, pero no es la única. Actualmente la PE se define por consenso como la nueva aparición de hipertensión y proteinuria significativa a partir de la semana 20 de gestación, aunque se debe sospechar ante la presencia de hipertensión asociada a la alteración de cualquiera de sus órganos diana durante la segunda mitad del embarazo (2). La PE afecta a aproximadamente el 3% de las gestaciones, elevándose este porcentaje hasta el 5-10% en presencia de factores de riesgo como la nuliparidad, edad materna superior a 40 años, raza negra, embarazo múltiple, fecundación in vitro o enfermedad trombofílica. En mujeres con factores de muy alto riesgo como la hipertensión crónica, diabetes mellitus, obesidad, nefropatía o antecedente de PE en un embarazo previo, la probabilidad de padecer una PE se eleva al 10-30% (3). El espectro clínico de la PE es muy amplio. El 80-90% de los casos son de presentación tardía (más allá de la semana 34 de gestación) y cursan habitualmente como formas leves sin repercusión en el pronóstico materno y/o fetal. El 10-20% restante aparecen de forma precoz (antes de la semana 34) y se asocian con más frecuencia a complicaciones maternas (4) como la insuficiencia renal, fallo hepático, trastornos de la coagulación, hemorragia hepática, edema de pulmón, convulsiones (eclampsia) e ictus, así como con complicaciones fetales: retraso del crecimiento intrauterino y

abruptio placentae. A pesar de la evidente asociación entre la precocidad en la aparición de la PE y su severidad, el curso de este síndrome resulta difícilmente predecible de forma individual (5). Aún no se dispone en la práctica clínica habitual de métodos suficientemente efectivos para su predicción, prevención ni diagnóstico precoz. Tampoco existe un tratamiento curativo, exceptuando la finalización de la gestación. Los principales dilemas en cuanto al manejo clínico se plantean en los casos precoces, cuando la terminación del embarazo actúa en detrimento del pronóstico fetal y su continuación puede poner en riesgo la salud materna. A pesar de estas limitaciones, se ha demostrado que la optimización del manejo clínico de la PE disminuye sustancialmente sus complicaciones, siendo éste su único factor pronóstico modificable (6) (tabla I). Tabla I. Principales determinantes del pronóstico materno y fetal en la preeclampsia

Factores que condicionan el pronóstico Edad gestacional en el momento del diagnóstico Presencia o ausencia de criterios de severidad Presencia o ausencia de enfermedades predisponentes Calidad de la atención médica

La principal dificultad que hasta el momento se ha interpuesto en la mejora del manejo clínico de la PE es el desconocimiento acerca de aspectos fundamentales relacionados con su fisiopatología. Se cree que si bien la PE se manifiesta clínicamente a partir de la segunda mitad del embarazo, su sustrato patogénico se establece durante la primera mitad y se debe a una placentación anómala. Desde hace tiempo se acepta que la presencia de la placenta es un requisito indispensable para la aparición de la PE. No así el feto, ya que la PE puede aparecer en gestaciones molares. Tampoco el útero, ya que se ha descrito la existencia de PE en gestaciones abdominales. Además, tras la expulsión de la placenta, los signos y síntomas de la PE remiten rápidamente por lo general. Los primeros cambios fisiopatológicos conocidos que conducen a la PE acontecen en la circulación úteroplacentaria y dan lugar a una insuficiencia e isquemia

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placentaria. Sin embargo, el fallo en la placentación no es suficiente para explicar el daño endotelial que origina el síndrome materno, ya que alteraciones placentarias similares se han encontrado también en casos de crecimiento intrauterino fetal restringido e incluso en embarazos de curso normal. Debe existir, por tanto, una relación entre una placentación insuficiente y la inducción de una lesión vascular materna, que podría estar mediada por factores liberados a la circulación general desde una placenta hipóxica. En resumen, la PE se concibe como un trastorno que se establece en dos fases: la primera consiste en el establecimiento de una deficiente circulación placentaria durante la mitad inicial del embarazo que condiciona un estado de hipoxia placentaria, y la segunda en la aparición de una respuesta sistémica materna durante la mitad final de la gestación (7) (figura 1). Genética Ambiente Factores inmunológicos

ALTERACIÓN PLACENTARIA

PREDISPOSICIÓN PLACENTA

MADRE FETO

Implantación superficial

CIR

Hipoxia placentartia

ALTERACIÓN SISTÉMICA

sFlt1 / PIGF OBESIDAD DM DISLIPEMIA TROMBOFILIA ¿INFECCIÓN?

PESO

Estrés oxidativo

LÍPIDOS

Disfunción endotelial PE

NO DM

NO PE

materno (8). El propósito fundamental de esta revisión es plantear cuáles pueden ser las futuras aplicaciones clínicas derivadas del estudio de los marcadores angiogénicos involucrados en la patogenia de la PE. Papel de los marcadores angiogénicos en la fisiopatología de la preeclampsia

Los estudios sobre perfiles de expresión génica, iniciados hace ya más de diez años, permitieron diferenciar algunas sustancias cuya formación se encontraba regulada al alza en tejidos placentarios de embarazos complicados con PE. De este modo, algunos grupos de investigación familiarizados con el estudio de la angiogénesis comenzaron a interrogarse acerca del aumento de la expresión en estos tejidos de la forma soluble de la proteína fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1), que reconocieron como un importante factor implicado en la angiogénesis y la vasculogénesis en enfermedades oncológicas y nefrológicas. Esto dio lugar a la realización de estudios sobre sueros de gestantes que padecieron PE. En ellos se encontraron también concentraciones elevadas de sFlt-1. Esta proteína actúa como un potente factor antiangiogénico endógeno antagonista de dos factores proangiogénicos conocidos como vascular endotelial growth factor (VEGF) y placental growth factor (PlGF). La sFlt-1 se adhiere a los dominios de unión de PlGF y VEGF, variando la configuración de estas proteínas. Esto impide su interacción con los receptores endoteliales de superficie y por tanto induce la disfunción endotelial (9) (Figura 2).

Figura 1. Teoría actualmente aceptada en relación a la patogenia de la preeclampsia. En las gestantes predispuestas se produce una implantación placentaria anómala durante la primera mitad de la gestación que impide el normal intercambio de flujo sanguíneo entre la madre y la placenta, comprometiendo el crecimiento fetal. La placenta en situación de hipoxia libera a la circulación general un exceso de factores antiangiogénicos (sFlt1) y menor cantidad de factores angiogénicos (PlGF). El sistema circulatorio materno se altera de forma directamente proporcional al insulto antiangiogénico e inversamente proporcional a la capacidad de defensa de sus endotelios. Dicha capacidad defensiva se encuentra disminuida en aquellas mujeres con factores condicionantes de daño endotelial. La preeclampsia aparece en el momento en que el desequilibrio angiogénico supera las capacidades compensatorias del endotelio materno. CIR, crecimiento intrauterino restringido; sFlt1, soluble fms-like tyroxin kinase 1; PlGF, placental growth factor; DM, diabetes mellitus; PE, preeclampsia.

El principal avance reciente en la investigación sobre la PE consiste en el descubrimiento de la existencia de un desequilibrio en la producción y liberación a la circulación materna de factores reguladores de la angiogénesis desde las placentas en situación de isquemia. Se postula que éste es el insulto de origen placentario que ocasiona el daño vascular

Figura 2. Esquema representativo del equilibrio normal entre factores angiogénicos circulantes, comparado con la disfunción endotelial inducida en la preeclampsia. Flt1, fms-like tyrosine kinase 1; PlGF, placental growth factor; VEGF, vascular endothelial growth factor; sFlt1, soluble fms-like tyrosine kinase.

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Actualmente se cree que la sFlt-1 es un péptido involucrado de forma clave en el desarrollo de la PE. Se ha demostrado in vitro que las placentas hipóxicas expresan en mucha mayor cantidad la sFlt-1. De forma interesante, se han encontrado valores aumentados de la ratio sFlt-1/PlGF en sueros de madres que desarrollan PE hasta cinco semanas antes de su establecimiento clínico. Dicha ratio también se encuentra aumentada en la PE injertada sobre enfermedades como la hipertensión crónica, el lupus eritematoso sistémico y la glomérulonefritis. Además, la severidad de la PE se ha correlacionado positivamente con los valores de la ratio sFlt1/PlGF circulantes. Por último, también se ha observado que los valores de sFlt-1/PlGF de las mujeres que han padecido una PE se normalizan tras el parto. En modelos animales, la administración exógena de sFlt-1 en ratas gestantes induce hipertensión, proteinuria y endoteliosis glomerular, que son hallazgos similares a los encontrados en la PE humana (10). Determinación analítica de los marcadores angiogénicos sFlt-1 y PlGF

La técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) manual ha sido hasta este momento el único método disponible para la cuantificación de ambos marcadores. En la actualidad, Roche ha desarrollado el primer método automatizado para ser utilizado en las plataformas Elecsys y Cobas y para el análisis de PlGF y sFlt-1. Para ambos marcadores se trata de un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) de 18 minutos que utiliza dos anticuerpos monoclonales: uno biotinilado específico anti-PlGF o anti-sFlt-1 (anticuerpo de captura) y otro marcado con un complejo de rutenio (anticuerpo de detección). Las principales características analíticas de los métodos: linealidad, precisión total y límite de detección, resultan convenientes para los propósitos clínicos. No se ven afectados por biomoléculas clásicas como la hemólisis hasta una concentración de hemoglobina libre de 5 g/L, ictericia hasta una concentración de bilirrubina de 427,5 µmol/L (25 mg/dL) ni lipemia hasta 15,81 mmol/L (1400 mg/dL) de concentración de triglicéridos. Tampoco se han encontrado interferencias con fármacos de uso común. El suero es la muestra recomendada, recogida en tubo seco o con gel separador. Sin embargo, en nuestro laboratorio hemos obtenido valores intercambiables en tubo con presencia de anticoagulante heparina de litio. Aún no hay datos de variabilidad intraindividual que permitan conocer la variación biológica total de ambos marcadores Los valores de referencia han sido obtenidos a partir de un estudio multicéntrico europeo en el que ha participado un hospital español (Hospital Universitario “12 de octubre” de Madrid) y han sido recientemente publicados (tabla II) (20).

Tabla II. Valores de referencia de los factores angiogénicos Placental Growth Factor (PlGF) y soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) obtenidos con la plataforma automatizada Elecsys system (Elecsys PIGF, human PIGF y Elecsys sFlt-1, sFlt-1).

Percentiles del test Elecsys sFIt-1 (pg/mL) Semanas de gestación 10-14 15-19 20-23 24-28 29-33 34-36 37-parto Perc. 5 555 470 649 630 707 978 1671 Perc. 50 1445 1459 1576 1449 1934 2972 4400 Perc. 95 2361 2785 2944 3890 6688 9921 11324 N (visitas) 40 44 82 98 105 78 77 Percentiles del test Elecsys PIGF (pg/mL) Semanas de gestación 10-14 15-19 20-23 24-28 29-33 34-36 37-parto Perc. 5 29,4 65,7 125 130 73,3 62,7 52,3 Perc. 50 62,8 135 265 412 439 232 161 Perc. 95 183 203 541 1108 1108 972 659 N (visitas) 40 44 82 98 105 78 77 Cociente entre los percentiles de los tests Elecsys sFIt-1/Elecsys PIGF Semanas de gestación 10-14 15-19 20-23 24-28 29-33 34-36 37-parto Perc. 5 5,21 4,32 2,19 1,01 0,945 1,38 3,65 Perc. 50 22,7 12,6 6,09 3,80 4,03 13,3 26,2 Perc. 95 57,3 26,9 14,8 16,9 86,4 92,0 138 N (visitas) 40 44 82 98 105 78 77

Marcadores angiogénicos en la predicción de la preeclampsia

En la práctica clínica actual, no existe un método óptimo para seleccionar a aquellas gestantes con un mayor riesgo de desarrollar una PE. Las gestantes con factores conocidos de muy alto riesgo de PE son seguidas de forma más intensiva en consultas especializadas en embarazos de alto riesgo, según se recomienda en los protocolos de la Sociedad Española de Ginecología y obstetricia (11). Sin embargo, la mayoría de los casos de PE suceden en gestantes clasificadas a priori como de bajo riesgo, mientras que entre las seleccionadas como de alto riesgo, más de tres cuartas partes no llegan a padecer nunca una PE. Si se pretende mejorar la sensibilidad del cribado incluyendo a embarazadas con criterios de selección más laxos tales como la nuliparidad, la edad avanzada o la raza negra, el cribado pierde todo su sentido práctico, ya que incluiría a más de la mitad de la población de gestantes para su seguimiento intensivo, lo cual resulta inasumible para cualquier sistema de salud (12). El estudio Doppler ecográfico de las arterias uterinas maternas con el fin de valorar de forma indirecta las resistencias al flujo úteroplacentario se ha propuesto como un método para mejorar la detección de las gestantes con mayor riesgo de desarrollar una PE. Aunque es un método que alcanza una sensibilidad del 60-70% para detectar los casos de PE precoz, su empleo rutinario no se ha extendido ya que presenta un bajo valor predictivo positivo -situado alrededor del 20%- y hacen falta ecografistas

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experimentados para su medición (13). La consecución de un método de cribado para la PE más eficiente podría servir para mejorar nuestra capacidad de discriminación, de manera que se pudiesen concentrar los esfuerzos en aquellas gestantes en las que el cribado resultara positivo y disminuir la ansiedad en el grupo de embarazadas con factores de riesgo en el que resultara negativo. La inexistencia de un tratamiento efectivo disponible es la principal limitación para considerar necesario el cribado de la PE en la actualidad. Sin embargo, la correcta selección puede ser la clave para identificar a aquellas mujeres que más se puedan beneficiar de medidas profilácticas (14). Un reciente metanálisis demuestra que la administración de ácido acetilsalicílico en baja dosis (75-150 mg/día) puede evitar aproximadamente un 10% de los casos de PE siempre que se comience a administrar durante la primera mitad del embarazo y en gestantes de alto riesgo (15). Por tanto, se cree que esta modesta acción preventiva de la aspirina podría potenciarse con la implantación de un cribado de la PE al final del primer trimestre. Aunque en esta etapa no se ha completado aún la implantación placentaria, algunos marcadores de PE ya se encuentran alterados. Uno de los marcadores que mejores resultados predictivos ha demostrado en esta edad gestacional es la PlGF. En combinación con otros marcadores bioquímicos como la proteína placentaria A asociada al embarazo (PAPP-A) y ecográficos como el estudio Doppler de las arterias uterinas ha demostrado alcanzar una sensibilidad y especificidad cercanas al 90% para la detección de la PE precoz (16). Esta estrategia de cribado resulta fácilmente implementable al cribado combinado de cromosomopatías que ya se realiza de forma rutinaria en la mayoría de centros entre las semanas 11-14, sin la necesidad de añadir nuevas pruebas. El sFlt-1 no ha demostrado su eficacia en el primer trimestre, pero sí en la segunda mitad del embarazo. Entre las 20-24 semanas de gestación alcanza una sensibilidad del 37-67% con una especificidad del 89-95% para la predicción de la PE precoz. Para una especificidad del 95%, la sensibilidad se eleva al 83% y 89% con el uso combinado de sFlt-1+PlGF y sFlt-1+PlGF+Doppler de las arterias uterinas, respectivamente (17, 18). Por tanto, la aplicación de los nuevos marcadores angiogénicos en combinación con otros marcadores de PE ya conocidos como el estudio Doppler de las arterias uterinas ha puesto a nuestro alcance la posibilidad inimaginable hace tan solo pocos años de realizar un cribado eficiente de la PE antes de la segunda mitad del embarazo. Marcadores angiogénicos como ayuda al diagnóstico

La utilidad de los marcadores angiogénicos, y en concreto de la ratio sFlt-1/PlGF, para el diagnóstico de la PE se muestra incluso superior a la de la predicción. Dos estudios

publicados a comienzos de este año han demostrado que la ratio sFlt-1/PlGF tiene una sensibilidad y especificidad superior al 95% para el diagnóstico de la PE precoz una vez que ésta ya está establecida mediante criterios clínicos (19, 20). La certeza diagnóstica que aporta la elevación de la ratio sFlt1/PlGF puede resultar de gran utilidad para el manejo de algunas situaciones clínicas. Por ejemplo, el 15-20% de los casos de síndrome de HELLP (hemólisis, elevación de transaminasas y disminución de plaquetas) y el 40% de los casos de eclampsia, cursan sin la presencia inicial de hipertensión y/o proteinuria, mientras que la ratio sFlt-1/ PlGF se muestra muy elevada de forma constante en estas complicaciones graves de la PE. También ayuda a confirmar el difícil diagnóstico de PE injertada en gestantes con hipertensión y/o proteinuria previa, ya que la ratio sFlt-1/ PlGF obtiene una concordancia casi perfecta con el diagnóstico clínico final (19). Por último, la ratio sFlt-1/PlGF también se ha mostrado de gran utilidad para realizar el diagnóstico diferencial entre la PE y la agudización de otras enfermedades que pueden simular el mismo cuadro clínico, tales como el síndrome nefrótico, la crisis lúpica, el síndrome hemolítico urémico o la púrpura trombótica trombocitopénica (21). Realizar el diagnóstico diferencial en estos casos es de vital importancia a la hora de decidir si se continúa o no con la gestación, ya que si se trata de alguno de estos diagnósticos diferenciales se puede intentar un tratamiento curativo que permita prolongar el embarazo. Por el contrario, si se trata de una complicación de la PE obliga a finalizar la gestación independientemente de la edad gestacional, ya que no existen tratamientos curativos y la situación solamente es susceptible de empeorar. Por tanto, la normalidad de la ratio sFlt-1/PlGF en cuadros susceptibles de ser confundidos con una PE nos puede ayudar a evitar prematuridades yatrogénicas innecesarias de los recién nacidos. La reciente automatización de los métodos para determinar la sFlt-1 y la PlGF permite su rápida obtención, lo cual puede resultar de gran interés en situaciones de urgencia que requieran confirmar el diagnóstico de PE. otra posible utilidad de la ratio sFlt-1/PlGF es la predicción de complicaciones. En la actualidad se recomienda el manejo expectante de la PE precoz siempre que no exista una complicación que suponga un riesgo inminente para la salud de la madre y/o el feto (22). Esta actitud permite la prolongación del embarazo y la consiguiente mejora del pronóstico del recién nacido, pero siempre se ve amenazada por la posible instauración de una complicación grave de la PE que en ocasiones se presenta de forma súbita e impredecible. De hecho, en uno de cada tres casos de PE precoz fracasa esta actitud expectante y es necesario finalizar la gestación de forma inmediata. Se ha observado que la ratio sFlt-1/PlGF se eleva especialmente antes de la aparición de las complicaciones más graves de PE (23). Por tanto, la

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monitorización de los valores de sFlt-1/PlGF en las mujeres que sufren casos de PE precoz podría ayudar a decidir cuánto prolongar el manejo expectante en ellas sin someterlas al riesgo de una complicación que pueda ponerlas en grave riesgo. Por último, el descubrimiento de la implicación de los factores angiogénicos en el desencadenamiento de los mecanismos patogénicos de la PE ha dado lugar a la búsqueda de tratamientos dirigidos hacia estos factores. Por el momento estos tratamientos se encuentran en fase experimental con animales, habiéndose obtenido resultados preliminares exitosos con el empleo de factores proangiogénicos recombinantes (24). Si estos tratamientos se aplican en humanos en el futuro, será imprescindible determinar previamente los marcadores angiogénicos para conocer qué gestantes son susceptibles de ser beneficiadas con su empleo (tabla III).

Tabla III. Posible aplicaciones de los marcadores angiogénicos en la práctica clínica.

1. Predicción de la PE en la primera mitad del embarazo: • Primer trimestre (11-14 semanas): selección de gestantes que se pueden beneficiar de medidas profilácticas como el AAS en baja dosis. • Segundo trimestre (20-24 semanas): selección de gestantes que se pueden beneficiar de un seguimiento intensivo. 2. Diagnóstico precoz: el ratio sFlt-1/PlGF permite el diagnóstico de la PE hasta 5 semanas antes de la aparición de los signos y síntomas clínicos. 3. Diagnóstico diferencial: • Casos dudosos. • Casos atípicos. 4. Identificación de los casos favorables para el tratamiento conservador. 5. Selección de candidatas para futuros tratamientos preventivos y curativos. PE, preeclampsia; AAS, ácido acetilsalicílico; sFlt-1, soluble fms-like tyrosine kinase1; PlGF, placental growth factor.

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NUEVAS PERSPECTIVAS EN EL CRIBADo DEL CÁNCER DE CUELLo DE ÚTERo. IMPoRTANCIA DE LA PRUEBA DE DETECCIÓN DEL VIRUS DEL PAPILoMA HUMANo.

edad menos incidencia de infecciones VPH transitorias). Existe una evidencia sólida para recomendar la utilización de la detección del VPH, conjuntamente con la citología, en el cribado del cáncer de cuello de útero por encima de los 30 años. Múltiples estudios exploran la eficacia y eficiencia de aplicar la detección del VPH como prueba única en el cribado primario del cáncer cervical. Existe un interés creciente en el genotipado, especialmente para la toma de decisiones en mujeres con VPH positivo y citología normal. La progresiva implementación de la vacuna frente al VPH acelerará los profundos cambios en los programas de cribado existentes. El cribado basado en la citología repetida se abandonará por ser poco eficiente. La detección del VPH en primera línea será de elección pudiéndose iniciar el cribado más tarde y con intervalos más prolongados.

Aureli Torné Servicio de Ginecología Oncológica. Hospital Clínic. Institut d’Investigadions Biomèdiques Agustí Pi i Sunyer IDIBAPS. Departamento de Ginecología y Obstetricia. Universidad de Barcelona. Barcelona.

Resumen

El principal objetivo del cribado del cáncer de cuello de útero es disminuir la incidencia y mortalidad por dicha neoplasia mediante la identificación y tratamiento de sus lesiones precursoras. El cribado rutinario mediante citología cervical, introducido hace más de 50 años, ha permitido una notable reducción de dicha enfermedad entre la población cribada. Una de sus principales limitaciones es la baja sensibilidad, que se suple, en parte, por la reiteración de la prueba. La dificultad en organizar cribados centralizados aplicables a la mayor parte de la población, se ha traducido en un gran esfuerzo y costes para los países desarrollados, que con frecuencia realizan cribados oportunistas, y en la práctica ausencia de cribado en los países en desarrollo. La implicación etiopatogénica del virus del papiloma humano (VPH) en estas lesiones y la disponibilidad de técnicas para su detección ha posibilitado su introducción en la practica clínica. La prueba de detección del VPH, frente a la citología, aporta una gran sensibilidad, reproducibilidad, fácil monitorización y elevado valor predictivo negativo que permiten aumentar el intervalo de cribado. La discreta perdida de especificidad se ha minimizado indicando su determinación sólo a mujeres mayores de 30 años (a mayor

1. Citología en el cribado del cáncer cervical: ventajas y limitaciones.

El cáncer de cuello de útero, con unos 500.000 casos nuevos anuales, constituye el segundo cáncer más frecuente entre las mujeres en todo el mundo y el primero más frecuente en la mayoría de países en desarrollo. En los países desarrollados, en los que se realiza algún sistema de prevención secundaria, esta neoplasia es la sexta o septima más frecuente pero es la segunda o tercera en importancia entre las mujeres más jóvenes (por debajo de los 45 años). Desde que se estableció el concepto de lesión precursora del cáncer de cuello de útero, la citología cervical (según técnica de Papanicolaou), ha constituido el principal método de cribado capaz de reducir significativamente tanto la incidencia como la mortalidad por dicha neoplasia entre los países en los que se ha aplicado de forma masiva y continuada. Sin embargo, en los últimos años, además de sus ventajas, también se han puesto de manifiesto sus deficiencias, especialmente su falta de sensibilidad, que obliga a reiterar la exploración para reducir el número de falsos negativos. La principales limitaciones de la citología son: 1. Naturaleza subjetiva de la prueba, que comporta errores en la interpretación. 2. Marcada variabilidad, dependiente en gran medida del medio en el que se aplique y del control de calidad que se lleve a cabo en todo el proceso (toma de muestra, procesamiento y lectura). 3. Baja reproducibilidad, que explica el amplio intervalo de sensibilidad y especificidad según el laboratorio en el que se realice. 4. Necesidad de una compleja infraestructura sanitaria para

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llevar a cabo todo el cribado. A pesar del esfuerzo en introducir la prueba de forma generalizada, sólo algunos países en todo el mundo han conseguido hacerlo organizadamente y reducir drásticamente la incidencia y mortalidad por dicha neoplasia En esta misma línea, datos recientes procedentes de diferentes estudios de revisión de la literatura muestran que una citología única puede ser incapaz de detectar hasta el 40-50% de las lesiones de alto grado o invasivas confirmadas histológicamente (1, 2). Un metaanálisis que incluyó 59 series halló para la citología una elevada especificidad (90-95%) a expensas de una muy baja sensibilidad (20-35%). otro metaanálisis sobre 12 estudios metodológicamente impecables, seleccionados de entre 94 publicaciones, halló que la citología convencional presenta un intervalo de sensibilidad entre el 30% y el 87% y una especificidad entre el 86% y el 100% (2). Por último, un estudio aleatorizado ha confirmado que la sensibilidad de la citología para la detección de lesiones de alto grado (CIN 2+) es del 53% y la especificidad del 97% (3). Estas limitaciones de la citología todavía son más notables en el caso del adenocarcinoma de cuello de útero, donde el cribado citológico se ha mostrado inefectivo para reducir las tasas de incidencia y mortalidad por dicha neoplasia (4). La reciente introducción de diversos métodos de lectura automatizada de la citología persiguen un mayor rendimiento y pueden ser una opción para mejorar la eficiencia. Sin embargo, globalmente la lectura automática parece ofrecer pequeñas ventajas comparada con la citología convencional (5). 2. Detección del VPH en la prevención secundaria del cáncer de cérvix

En las dos últimas décadas múltiples investigaciones clínicas, epidemiológicas y virológicas, han demostrado que todos los cánceres de cuello uterino, tanto los derivados del epitelio escamoso como del epitelio glandular, están relacionados causalmente con la infección cervical por tipos oncogénicos de VPH (6). Más concretamente, se ha demostrado que la progresión de las lesiones cervicales siempre está asociada a la infección persistente por tipos de VPH de alto riesgo oncogénico (VPH-AR). El desarrollo experimental y clínico de sistemas de detección del VPH capaces de identificar la presencia de alguno de los tipos oncogénicos ha permitido plantear su potencial beneficio en el diagnóstico de lesiones precursoras del cáncer de cérvix, especialmente CIN-2 y CIN-3. Las limitaciones de la citología como prueba de cribado junto con la evidencia de que los métodos de detección del VPH son fiables, exactos y reproducibles ha permitido evaluar su utilidad en la prevención secundaria del cáncer de cérvix (7).

En la práctica clínica, la prueba para la detección de VPH-AR se ha considerado potencialmente útil en tres situaciones: 1. Cribado en combinación con la citología o como prueba única para la detección de lesiones precancerosas del cérvix. 2. Selección de mujeres con citologías que presentan alteraciones menores (ASC-US) que requieren reevaluación para diagnóstico y eventual tratamiento. 3. Seguimiento en mujeres tratadas por lesiones intraepiteliales de alto grado para predecir curación o posible recidiva. 3. Métodos de detección del VPH en la práctica clínica

En condiciones ideales, una prueba de detección de VPH destinada al cribado del cáncer de cérvix debería tener una elevada sensibilidad, que permita identificar el mayor número de casos de CIN y evitar su progresión, y una elevada especificidad, que permita disminuir el sobretratamiento de lesiones de bajo grado que probablemente regresen espontáneamente. Para la validación clínica de una prueba de detección de VPH es importante tener en cuenta el concepto de sensibilidad analítica (detección de cualquier infección VPH-AR, incluso las infecciones transitorias que son clínicamente irrelevantes) y el concepto de sensibilidad clínica (detección de infecciones VPH-AR asociadas a CIN-2/3+ y por tanto clínicamente relevantes). La detección de VPH-AR en el cribado cervical sólo es útil cuando ésta se asocia a la presencia o desarrollo de CIN 2/3+ (8). Los dos métodos de detección del VPH más utilizados en la práctica clínica son la captura híbrida y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). CAPTURA DE HíBRIDoS II (HC-II):

Método basado en la hibridación del ADN del VPH con sondas de ARN marcadas. Los híbridos ADN-ARN se detectan con un anticuerpo monoclonal específico y un sustrato quimioluminiscente, (medición semicuantitativa de la carga viral). Existen dos sondas, una para 5 tipos de VPH de bajo riesgo (VPH-BR: 6,11,42,43 y 44) y otra para 13 tipos de VPH de alto riesgo (VPH-AR: 16,18,31,33,35,39,45,5 1,52,56,58,59 y 68) (Digene HC2 High-Risk HPV DNA Test de Qiagen). El resultado se expresa en unidades relativas de luz (URL) siendo positivo a partir de 1 URL. En la práctica clínica sólo se utiliza la sonda para VPH-AR. La HC2 se ha validado en numerosos estudios clínicos y se aprobó por la FDA en el año 2000 como técnica de selección de mujeres con citología anormal y posteriormente en el año 2003 para su uso en el cribado conjuntamente con la citología (9). PCR DE CoNSENSo:

Este método detecta varios genotipos de VPH en una sola

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sesión de amplificación. Los cebadores o “primers” empleados van dirigidos al gen L1 (una región del genoma altamente conservada) y varían en el tamaño. Los test de PCR de consenso más frecuentemente utilizadas son GP 5+/6+, PGMY09/11 y SPF10. • Amplicor® (Roche Molecular Diagnostics, Basilea, Suiza) es el primer Kit comercial de PCR disponible. Utiliza varios cebadores que se dirigen a un pequeño fragmento de 170 pb de los genes L1 de los 13 tipos de alto riesgo de VPH incluidos en la HC2. El pequeño tamaño del fragmento amplificado permite una buena sensibilidad analítica. • cobas® 4800 (Roche Molecular Diagnostics, Basilea, Suiza) es un sistema totalmente automatizado que detecta por separado los genotipos de VPH de alto riesgo (VPH –AR) 16 y 18 , además la detección de 12 genotipos de alto riesgo (31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68) • Cervista™ HPV-HR es una prueba de amplificación isotérmica que utiliza la enzima cleavasa, endonucleasa que reconoce y digiere el extremo 5’ de los anillamientos producidos en el ADN. GENoTIPADo:

La identificación selectiva de los tipos de VPH es útil ya que la persitencia viral y el riesgo de progresión es variable incluso entre los VPH-AR. • Genotipado con PCR de consenso: se basa en el marcaje de los productos de PCR con biotina durante el proceso de amplificación y posterior hibridación con sondas específicas. • La última generación de Captura Híbrida permite el genotipado, utilizando primers GP5+/6+ que identifican los tipos 16, 18 y 45, con una técnica muy sensible y de fácil uso e interpretación. • Genotipado con microarrays: consiste en fijar secuencias de oligonucleótidos de diferentes tipos específicos de VPH sobre una membrana de celulosa, incrustada en un cristal. Constituye un método sensible, rápido y sencillo. - Clinical Arrays HPV ® (Genomica, Coslada-Madrid, España), detecta los 35 tipos de VPH de alto y bajo riesgo más relevantes. - Linear Array HPV (Roche Diagnostics , Basilea, Suiza) permite la identificación de 37 genotipos de VPH de alto y bajo riesgo con control de b-globina - Biomedlab (Seul, Corea del Sur) microarrays en el que se fijan sondas de oligonucleótidos específicos y una sonda de control de beta globina se fijan a una diapositiva. - Luminex: el ADN del VPH se amplifica mediante una PCR consenso, PGMY09/11 o GP5+/6+. El genotipado se basa en la hibridación con sondas de oligonucleótidos tipo específico con bolas de poliestireno en suspensión que se tiñen con f luoróforos. - PapilloCheck® (Greiner-Bio-one, Frickenhausen, Alemania) amplifica un fragmento de E1. Los microarrays

genotipan simultáneamente 24 VPH-BR, AR y probable alto riesgo. 4. Detección del VPH en el cribado del cáncer de cérvix: características y aspectos diferenciales con la citología

Las ventajas de la detección del VPH en el cribado fueron evidenciadas en 1995 por Cuzick et al. al observar que el 44% de los casos de CIN2+ no habían sido diagnosticados por la citología pero sí por la prueba VPH (que incluía sólo los tipos 16, 18, 31 y 33) en un estudio sobre 2009 mujeres (10). El mismo grupo publicó en 1999 el valor del cribado conjunto (citología y detección de VPH mediante HC2) en 3000 mujeres mayores de 34 años. La sensibilidad para CIN2+ fue del 95% y el VPP del 27%, concluyendo que el cribado conjunto podría suponer una mayor protección y permitir un mayor intervalo de cribado (11). Posteriormente se han publicado múltiples estudios comparativos entre citología y detección de VPH (frecuentemente realizados mediante captura híbrida). El análisis de 15 series publicadas entre 2000 y 2006 halló una sensibilidad para la detección de lesiones CIN2/3 y cáncer claramente superior para las pruebas de detección de VPH que para la citología (91,1% versus 61,3% respectivamente) (12). También se confirmó la gran dispersión de los resultados de la citología (intervalo de sensibilidad entre 18,6% y 94%) consecuencia de la gran variabilidad entre laboratorios. Por contra, los resultados de los diferentes estudios mostraron una dispersión mínima para la detección de VPH (intervalo: 84,9% - 100%), lo que confirma la elevada reproducibilidad de esta prueba. Respecto a la especificidad, la citología aventajó ligeramente a las pruebas de VPH con valores del 93,5% (intervalo: 77,8 - 99,5%) frente a 89,3% (intervalo: 81,8 - 96,5%) respectivamente. En esta misma línea, un reciente metaanálisis concluyó que, de promedio, la detección de VPH tiene una sensibilidad un 27% mayor y una especificidad un 8,4% menor que la citología (13). otro aspecto deseable para una prueba de cribado es el elevado valor predictivo negativo (VPN), o probabilidad de no tener enfermedad cuando el resultado de la prueba es negativo. Diversos estudios, en diferentes poblaciones y grupos de edad, hallaron un VPN para la detección de VPH por encima del 97% (incluso en muchos estudios el VPN fue del 99%-100%) (11, 13, 14-19). El elevado VPN de la detección de VPH tiene importantes implicaciones en el cribado ya que un resultado negativo se traduce en un riesgo insignificante de desarrollar cáncer de cérvix en los próximos 5-8 años (7). Las mujeres con una citología y una prueba de VPH negativos tienen un riesgo inferior a 1 entre 1000 de tener un CIN 2+ no detectado (20). En la tabla I se resumen los puntos clave sobre la utilidad de la prueba de detección de VPH en el cribado del cáncer cervical.

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Tabla I. Prueba de detección de VPH en el cribado del cáncer cervical: aspectos clave.

Existe una evidencia sólida para recomendar la utilización de la prueba de detección de VPH en el cribado del cáncer de cuello de útero en mujeres mayores de 30 años. Edad e intervalo de cribado La prueba de detección de VPH no es apropiada para el cribado de mujeres de menos de 30 años. La detección de VPH conjuntamente con la citología en mujeres de más de 30 años, no debe realizarse antes de los 3 años (cuando ambas pruebas son negativas) La detección de VPH no debe realizarse nunca en un intervalo inferior a 12 meses. El incremento del intervalo de cribado es una de las mayores ventajas de la prueba de detección de VPH. Sensibilidad – Especificidad Prueba de VPH en la detección precoz de CIN 2/3. Un Test positivo es más predictivo de CIN2 + en el seguimiento posterior que una citología anormal. Prueba de VPH negativa: riesgo extremadamente bajo de tener o desarrollar CIN2+ (elevado VPN) La mayor desventaja de la prueba de detección de VPH es la falta de especificidad (más en mujeres < 30 años). Implicaciones: sobreestudio de mujeres VPH positivas, sobrediagnóstico y sobretratamiento. Se necesitan nuevos protocolos para las mujeres VPH positivas para evitar el exceso de colposcopias y el sobretratamiento de lesiones regresivas

5. Cribado cervical mediante citología y detección de VPH conjuntamente

La International Agency for Research on Cancer (IARC) confirmó en 2005 que existía una evidencia suficiente sobre la utilidad de la prueba de detección de VPH en la reducción de la incidencia y mortalidad por cáncer de cérvix. Por tanto, no existen dudas sobre si dicha prueba debe o no incorporarse a los programas de cribado sino en como debe incorporarse (21). La elevada sensibilidad y VPN de la prueba de VPH en la detección de lesiones precancersosas del cérvix, claramente superior a la citología, junto con su facilidad, fiabilidad y reproducibilidad han permitido, en los últimos años, su progresiva introducción tanto en los programas de cribado organizados (poblacionales) como en los oportunistas. Todos los programas que combinan citología y detección de VPH incluyen un corte de edad, mujeres mayores de 30-35 años, en las que existe una menor prevalencia de VPH-AR y una mayor incidencia de CIN3 y cáncer. Además, la combinación de ambas pruebas ha demostrado ser mejor que la utilización de cualquiera de ellas por separado. Diferentes estudios confirman que la utilización conjunta de citología y detección de VPH ofrece una sensibilidad óptima (media: 95,7%, límites: 76,3-100,0%) con un VPN del 100% sin apenas dispersión entre los estudios. Estos resultados sustentan la posibilidad de que el intervalo entre cribados pueda ser alargado con seguridad (12). Por ejemplo, un estudio halló que la incidencia acumulada de CIN3 o cáncer, cuando ambas pruebas fueron negativas, fue del 0,16% a los

Primera citología 3 años después del primer coito o a los 25 años de edad (con relaciones sexuales

Citología anual cada dos años de edad Repetir cada 3 años

* Ambos normales

> 35 años

Final del cribado 65 años

Citología y ADN-VPH

Ambos negativos

Citología (-) VPH (+)

Citología (+)

Citología y VPH cada 5 años

Citología y VPH al año

Protocolo de citología anormal

* Opción sujeta a disponibilidad del test de VPH.

Figura 1: Algoritmo para el cribado primario del cáncer de cuello uterino. Consenso de la Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia (SEGO), la Sociedad Española de Citología (SEC), la Asociación Española de Patología Cervical y Colposcopia (AEPCC) y la Sociedad Española de Anatomía Patológica (SEAP). Adaptado de PuigTintoré et al. 2006

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45 meses y del 0,33% a los 10 años (22). Por tanto, si ambas pruebas son negativas es posible alargar con confianza y seguridad el intervalo de cribado hasta 5 o más años (23-26). Por último, antes de aplicar la prueba de detección de VPH en el cribado se deberían tener en cuenta consideraciones económicas y estudios de coste-eficacia para cada medio particular. En noviembre de 2006 la Sociedad Española de Ginecología y obstetricia (SEGo), la Sociedad Española de Citología (SEC), la Asociación Española de Patología Cervical y Colposcopia (AEPCC) y la Sociedad Española de Anatomía Patológica (SEAP) publicaron un Documento de Consenso que establece el cribado primario del cáncer de cérvix tal como se expone en la figura 1 (27). 6. Cribado cervical mediante detección VPH (como prueba única) y selección con citología. Genotipado viral.

En la mayoría de los países desarrollados la detección de VPH-AR en mujeres mayores de 30 años es inferior a 10-15%. En este contexto más del 80% de las mujeres cribadas presentan citología y VPH negativos. Basándose en estos datos se ha sugerido el uso, en mujeres mayores de 30 años, de la detección de VPH como prueba única en cribado primario (11). Una objeción teórica a esta pauta radica en la baja especificidad de la prueba de VPH que puede representar un incremento de mujeres referidas para un seguimiento innecesario y potencial sobrediagnóstico y sobretratamiento con los costes asociados. Para incrementar la especificidad sin perder la sensibilidad de esta prueba se han propuesto dos opciones: 1) utilizar la citología como prueba secundaria reservándola únicamente para las mujeres VPH-positivas; 2) realizar alguno de las pruebas de detección de VPH que permita el genotipado viral.

Se sabe que los tipos de VPH 16 y 18 presentan un riesgo significativamente mayor de desarrollar CIN-2+, o adenocarcinoma que el resto de virus oncogénicos. Diferentes estudios han demostrado que el VPH 16 y 18 son los dos tipos más prevalentes en el cáncer escamoso y adenocarcinoma (provocan el 70% y 80% de todos los casos, respectivamente). Concretamente, la infección persistente por el VPH 16 representa un riesgo acumulado de CIN 2+ a los 10 años del 22% y la infección persistente por VPH 18 del 17%. Por el contrario, el riesgo para el resto de tipos de VPH-AR es de 1-2% y para las mujeres VPH negativas tiende a ser de cero (28). Por todo ello, se ha propuesto que las mujeres con test VPH positivo para los tipos 16 y 18 se realicen una colposcopia inmediata o un seguimiento más intensivo (a los 6 y 12 meses) dado el elevado riesgo de CIN3. En contra, las mujeres VPH-AR positivas pero negativas para los tipos 16 y 18 pueden seguirse de manera menos intensiva (a intervalos de 1 ó 2 años) con la consiguiente reducción del número de colposcopias (29). La American Society for Cervical Pathology and Colposcopy (ASCPC) en 2009 ha publicado una modificación en sus guías clínicas que contempla el genotipado en el algoritmo diagnóstico de las mujeres con VPH positivo y citología anormal. El objetivo es seleccionar a las mujeres con infección por VPH 16 y 18 para realizar colposcopia inmediata. Por el contrario, el resto de mujeres positivas para otros VPH-AR deben realizarse un control anual con citología y detección de VPH (figura 2) (30) Recientemente se ha publicado unas recomendaciones para la práctica clínica en la prevención primaria y secundaria de los cánceres de cuello de útero y vulva, en las que también se incluye el genotipado en el algoritmo diagnóstico de las mujeres con resultado de VPH positivo y citología anormal (31).

Test VPH-AR (+) / citología (-)

VPH 16/18 (+)

VPH 16/18 (-) Repetir test VPH-AR y citología (al año)

Colposcopia

Ambos (-)

Citología (-) VPH (+)

Citología (+) VPH (+/-)

Cribado rutinario

Colposcopia

Conducta según guía

Figura 2: Algoritmo para el cribado del cáncer de cuello uterino. Genotipado en la selección de las mujeres con test VPH-AR positivo. American Society for Cervical Pathology and Colposcopy (ASCPC, 2009).

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En la actualidad están en marcha 7 grandes ensayos clínicos randomizados diseñados para demostrar, en los próximos años, la eficacia de la detección det VPH en el cribado primario: Suecia (Swedescreening con 12.500 mujeres), Holanda (PoBASCAM con 44.000 mujeres), Reino Unido (ARTISTIC con 25.000 mujeres), Italia (NTCC con 95.000 mujeres), Finlandia (Finnish RPHT con 200.000 mujeres), Canada (12.000 mujeres) e India (140.000 mujeres). VACUNACIÓN FRENTE AL VPH: IMPACTo EN LAS ESTRATEGIAS DE CRIBADo

La vacunación frente a los VPH 16/18 reducirá –pero no eliminará– el riesgo de cáncer de cuello uterino. Las mujeres correctamente vacunadas tendrán, a corto plazo, una importante reducción de las alteraciones citológicas menores (ASC-US, L-SIL) y a largo plazo una reducción de la prevalencia de H-SIL y de cáncer de cérvix. Esta reducción de la prevalencia de anomalías cervicales condicionará en la citología una pérdida del valor predictivo positivo (VPP). Se estima que el actual VPP (en torno a 5070%) caerá al 10-20% en el caso de cribar mujeres vacunadas (32). Esto significa que aumentará el porcentaje de mujeres con falsos positivos. Por contra, la menor prevalencia de alteraciones entre las vacunadas, puede suponer una disminución del rigor y atención de lectura por parte de los citotécnicos, con la consiguiente perdida de sensibilidad y aumento de falsos negativos. En definitiva, la citología en el contexto de mujeres vacunadas será una exploración todavía mucho menos eficiente. La detección de VPH es más sensible y discretamente menos específica que la citología para la detección de lesiones de alto grado o cáncer. Dado que la prueba de VPH no depende de una interpretación subjetiva, mantendrá su rendimiento en condiciones de baja prevalencia. Por tanto a medida que la vacunación sea capaz de reducir las tasas de prevalencia de las lesiones cervicales, la prueba de VPH será proporcionalmente superior a la citología. Sin embargo, la elevada especificidad de la citología la convierte en la prueba ideal para utilizar en segunda línea y descartar lesiones de alto grado o cáncer entre los casos VPH positivos. En definitiva, la vacuna frente al VPH acelerará los profundos cambios que deben realizarse en los programas de cribado existentes. La modalidad de cribado basada en la citología repetida deberá abandonarse por ser poco eficiente. La detección de VPH, los test que permitan genotipar o los nuevos marcadores moleculares, actualmente en estudio, ofrecerán mejor capacidad para seguir a las mujeres vacunadas. La citología quedará como prueba de selección para los casos VPH positivos. La baja prevalencia de lesiones precursoras del cáncer de cérvix entre las mujeres vacunadas y la elevada sensibilidad y VPN de test VPH permitirá que el cribado se inicie más tarde y con intervalos más prolongados.

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HST-N. Automatización Sysmex Soluciones integradas para el laboratorio de hematimetría • Organización del análisis celular en muestras de sangre total. • Especializado en hematología. • Gestión del tubo de EDTA Sysmex WOrkExPErTELInE.

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MICRoPARTICULAS CIRCULANTES Juan Carlos Reverter Calatayud, M. Dolores Tàssies Penella. Servicio de Hemoterapia y Hemostasia. Hospital Clínic. Institut d’Investigacions Biomèdiques Agustí Pi i Sunyer - IDIBAPS. Barcelona Introducción

Desde la década de los sesenta se identifican en la circulación fragmentos de plaquetas activadas, aunque el conocimiento de la posible existencia de elementos subcelulares en la sangre con actividad procoagulante venia ya de antes. Estos fragmentos son vesículas celulares, que no solo son de origen plaquetario, de pequeño tamaño liberadas a la circulación a las que posteriormente se ha venido a denominar micropartículas circulantes. Aunque inicialmente estas micropartículas se consideraron poco relevantes, estudios posteriores han demostrado que son componentes de la sangre que poseen una gran actividad biológica, tanto en situaciones fisiológicas como patológicas. Actualmente las micropartículas circulantes constituyen un campo de activa investigación tanto en el territorio de la hemostasia, con un papel en apariencia prioritariamente procoagulante, como en otros campos numerosos de la biología, habiéndolas llegado a considerar, incluso, como directores de orquesta en las interacciones celulares. En la presente exposición revisaremos su origen, funciones (en especial las referidas a la hemostasia), y modos de detección actuales.

¿Qué son las micropartículas circulantes?

Las micropartículas circulantes son fragmentos celulares de un tamaño de entre 0,1 y 1 µm de diámetro que se encuentran en el plasma y proceden de las membranas citoplasmáticas tras la activación o la apoptosis de las células de origen. Las vesículas de menor tamaño, de unos 50 a 100 µm, se llaman exosomas y las partículas de mayor tamaño, de más de 1,5 µm, se denominan cuerpos apoptóticos. La definición de consenso de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia (ISTH) las define como vesículas de: a) tamaño entre 0,1 a 1 µm de diámetro. b) sin núcleo ni capacidad de síntesis. c) con citoesqueleto. d) pueden proceder de una amplia variedad de células y

contienen cantidades variables de fosfatidilserina y de antígenos de superficie de las células de las que se originan. Las micropartículas se producen por vesiculación de la membrana citoplasmática debida a mecanismos que son aún en buena parte desconocidos pero que parecen derivar de cambios en el citoesqueleto y en la modificación de la asimetría normal de los fosfolípidos de la misma ocasionados por incremento del calcio intracelular. El aumento de calcio intracelular produce la reorganización de las proteínas del citoesqueleto y origina cambios en la asimetría de los lípidos de membrana, debidos a la activación de la flopasa o la escramblasa y a la inactivación de la flipasa, con exposición en la cara externa de la membrana de fosfolípidos aniónicos, fundamentalmente fosfatidilserina, que usualmente están en la cara citoplasmática de la membrana celular. Las micropartículas circulantes así formadas constituyen una población muy heterogénea de fragmentos celulares de diferentes orígenes que derivan de una amplia variedad de células tanto normales (tales como plaquetas, leucocitos, monocitos, linfocitos, eritrocitos, células endoteliales o células musculares lisas) como patológicas (células neoplásicas). Las micropartículas pueden originarse como respuesta a numerosas noxas como pueden ser los procesos infecciosos, la inflamación aguda o crónica, las situaciones de hipercoagulabilidad o las neoplasias, entre muchas otras. Estas situaciones actúan sobre los elementos celulares y les llevan a generar micropartículas, las cuales tendrán acciones biológicas que pueden causar lesiones, sobretodo vasculares, pudiendo, a su vez, realimentar el proceso (figura 1). Las micropartículas circulantes transportan en sus membranas y en el citoplasma restante numerosas proteínas y elementos celulares que proceden de las células de las que derivan. En las micropartículas circulantes se encuentran tanto receptores funcionales de membrana, como el factor tisular, así como proteínas intracelulares, segundos mensajeros y material genético. Además, las micropartículas circulantes pueden fusionarse con otras micropartículas de distinto origen celular. Estas fusiones de membranas entre micropartículas incrementan la

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LESIÓN ACCIÓN: procoagulante proinflamatoria protrombótica

Micropartículas

Endotelio Plaquetas Leucocitos

Figura 1. Mecanismo de la acción patológica vascular de las micropartículas. Diversas situaciones como procesos inflamatorios, infecciosos u otros pueden actuar sobre células normales del tipo del endotelio, las plaquetas o los leucocitos e inducir a éstas a liberar micropartículas a la circulación sanguínea. Estas micropartículas ejercerán en los vasos sus acciones procoagulante, proinflamatoria y protrombótica causando lesión vascular la cual puede, a su vez, retroalimentar la formación de más micropartículas circulantes.

Inflamación Infección Hipercoagulabilidad Cáncer

complejidad aparente de la población de micropartículas y se ve confirmada por el hallazgo de micropartículas circulantes que expresan simultáneamente proteínas específicas de distintas líneas celulares. ¿Qué funciones tienen las micropartículas circulantes?

Las micropartículas circulantes intervienen en muchos procesos fisiológicos como la hemostasia, la inflamación, el remodelado vascular y la angiogénesis. Se han descrito como posibles mediadores en enfermedades inflamatorias, cardiovasculares, diabetes mellitus y en la progresión tumoral. Asimismo, las micropartículas circulantes que expresan factor tisular y moléculas de adhesión, como la P-selectina y su ligando la P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), pueden tener un importante papel en la formación del trombo sea éste fisiológico o patológico. En situación normal fisiológica el efecto biológico de las micropartículas circulantes depende en buena medida de su composición lipoproteica y de proteínas de membrana, que varia dependiendo del tipo celular que las ha originado y del estímulo que ha causado su formación. Las micropartículas circulantes externalizan fosfolípidos aniónicos, en especial fosfatidilserina, que están involucrados en la fase de inicio y amplificación de la coagulación sanguínea y que también pueden intervenir en otros procesos biológicos, como la inflamación y la activación del complemento.

Las micropartículas circulantes se han descrito aumentadas en numerosas entidades (tabla I). Así, en los pacientes con cáncer se puede encontrar un número aumentado de micropartículas circulantes que se producen por causas aún no completamente aclaradas. En estos enfermos, el origen celular de las micropartículas circulantes pueden ser a partir de las células tumorales o de las células normales, como células endoteliales, monocitos y plaquetas. Se ha podido demostrar relación entre la generación de micropartículas circulantes y la actividad procoagulante asociada al cáncer y se han correlacionado con el riesgo de trombosis en estos enfermos. La micropartículas circulantes también parecen jugar un papel importante en la trombocitopenia inducida por heparina y en los pacientes con infecciones. El aumento de micropartículas circulantes en estos enfermos favorece una generación de trombina aumentada y la formación consecuente de trombos. Las micropartículas circulantes además pueden contribuir a la patogenia del tromboembolismo venoso ofreciendo localmente la superficie fosfolipídica aniónica requerida para la formación del complejo tenasa y del complejo protrombinasa de la coagulación y se supone que también contribuyen la reorganización del trombo tras una trombosis venosa. Asimismo, las micropartículas circulantes pueden tener un papel en la púrpura trombótica trombocitopénica transportando factor von Willebrand capaz de inducir los agregados plaquetarios, en las trombosis que se dan en la hemoglobinuria paroxística nocturna o en las enfermedades autoinmunes y en ciertas complicaciones de la gestación como la pre-eclampsia o el retraso de crecimiento intrauterino. En su acción sobre la hemostasia, las micropartículas circulantes proporcionan una superficie fosfolipídica procoagulante cargada negativamente, preferentemente por expresión de fosfatidilserina, que permite el ensamblaje de las Tabla I. Enfermedades en las que se ha descrito un aumento de micropartículas circulantes.

• Cáncer • Infecciones • Enfermedades cardiovasculares • Trombosis venosa profunda y embolismo pulmonar • Anemia falciforme • Trombocitopenia inducida por heparina • Púrpura trombótica trombocitopénica • Hemoglobinura paroxística nocturna • Enfermedades autoinmunes • Diabetes mellitus • Hipertensión arterial grave • Infección por virus de la inmmunodeficiencia humana • Preeclampsia • Esclerosis múltiple • Insuficiencia renal

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enzimas de las vías de la coagulación, que es indispensable para promover la generación de trombina e incrementa la actividad procoagulante del factor tisular. Además de la acción de sus fosfolípidos, las micropartículas circulantes contribuyen a la activación de la coagulación por la expresión de factor tisular transportado por las mismas. Las micropartículas circulantes expresan diferentes efectores específicos en función de su origen, aunque, como ya se ha indicado, puede haber con cierta frecuencia micropartículas circulantes híbridas fruto de fusiones de las mismas. Así, las micropartículas circulantes de origen plaquetario expresan P-selectina, glicoproteínas de membrana o tromboxano y su interacción con monocitos o con micropartículas circulantes monocitarias, promueve la expresión en su superficie de factor tisular. Por su parte, las micropartículas de origen monocitario pueden expresar, junto al factor tisular, PSGL-1 la cual puede unirse a la P-selectina de las plaquetas activadas que están en la zona del trombo inicial, localizando así la presencia de factor tisular y gran cantidad de fosfolípidos aniónicos de membrana en ese punto. En el sentido contrario, la presencia de trombomodulina y de proteína C en la superficie de las micropartículas circulantes sugiere que éstas también pueden actuar con un papel anticoagulante, por lo que, dependiendo de los estímulos, las micropartículas circulantes pueden ser preferentemente pro- o anticoagulantes, contribuyendo de este modo a la regulación de la coagulación. Las micropartículas circulantes también participan en la angiogénesis a través de su contenido en factores promotores como el VEGF o por la expresión de moléculas de adhesión y por el transporte de diversos factores de crecimiento y metaloproteinasas. Asimismo, las micropartículas circulantes contribuyen a los mecanismos de la inflamación aumentando la expresión de citocinas en los monocitos y las células endoteliales y favoreciendo la agregación de los leucocitos a través de la P-selectina y de la PSGL-1. otra función que se ha descrito de las micropartículas circulantes es la modulación de la respuesta inmune mediante la exposición de FasL (CD95L) en su superficie, lo que puede inducir la apoptosis de los linfocitos T citotóxicos. Adicionalmente a sus potenciales efectos debidos a su acción biológica como micropartículas, las micropartículas, tras unirse a receptores celulares específicos, puede fusionar su membrana con la de la célula diana transfiriendo a estas últimas su contenido citoplasmático de proteínas, de RNA, e incluso de oncogenes causando modificaciones del fenotipo en las células diana. ¿Cómo se cuantifican las micropartículas circulantes?

La determinación, cuantificación y caracterización, de las micropartículas circulantes en el laboratorio es compleja. Para intentar lograrlo se han desarrollado diferentes

metodologías que miran cada una de ellas distintos aspectos de las micropartículas circulantes y de diferentes modos. En esencia podemos clasificar los métodos de laboratorio principales para el estudio de las micropartículas circulantes en cuatro grupos: a) Citometría de flujo. b) Estudio de la capacidad procoagulante de las micropartículas. c) Métodos de ELISA de captura de las micropartículas. d) Microscopía electrónica. a) La citometría de flujo se ha empleado con frecuencia en la evaluación de las micropartículas circulantes y es la metodología más extendida para éste uso en los laboratorios. Sin embargo, la citometría de flujo para la determinación de las micropartículas circulantes tiene numerosos problemas y limitaciones en cuanto a su estandarización. De todos modos, resulta un método rápido y permite la detección simultánea de múltiples marcadores antigénicos y del tamaño de las micropartículas. De esta manera es posible por citometría de flujo identificar distintas subpoblaciones de micropartículas. Desafortunadamente, la citometría de flujo se ve claramente limitada en la evaluación de las micropartículas menores a 0,5 µm, debido a que por su tamaño se aproximan a la longitud de onda de la luz láser utilizada, aunque los instrumentos más modernos digitales parece que pueden llegar a determinar incluso micropartículas de hasta menos de 0,3 µm y ciertamente los nuevos citómetros de impedancia también pueden ser de mayor resolución. En cualquier caso, el efecto del ruido de fondo es siempre problemático para el estudio de las micropartículas circulantes por citometría y depende mucho del instrumento, de su antigüedad y de su mantenimiento. En numerosas ocasiones para medir las micropartículas circulantes se requiere la adición a la muestra de marcadores de tamaño calibrados. Visto de una manera global los estudios de citometría de flujo para evaluar micropartículas circulantes tienen la ventaja de requerir volúmenes muy pequeños, pero como defectos son bastante caros y algo lentos, precisan de operadores especializados y son muy sensibles a la producción de artefactos durante el procesamiento de los especímenes. b) Los ensayos de actividad procoagulante se basan en medir la expresión de fosfolípidos aniónicos en la superficie de las micropartículas en cuanto a su capacidad de contribuir en la generación de trombina. Esta acción sobre la hemostasia es una de las funciones biológicas claves de las micropartículas circulantes. Para este fin se ha empleado un test de cefalina diluida o el tiempo de víbora de Russell bajo determinadas condiciones. Sin embargo, estos aparentemente sencillos métodos se han visto en muchas ocasiones limitados por la dificultad de obtener un plasma realmente libre de micropartículas y pueden verse afectados por la presencia de anticoagulante lúpico o por disminución de los factores de la coagulación. También se ha introducido un método

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Adición de plasma libre de micropartículas Aporta factores de la coagulación

Adición de reactivos de activación 2+ con factor Xa y Ca

Especimen a estudiar Incubación

automatizable basado en la adición de factor X activado y calcio en un ensayo con empleo de plasma libre de micropartículas obtenido por acción de un veneno de serpiente (figura 2). Asimismo, en otros estudios se han realizado modificaciones para estudiar las micropartículas en ensayos de medición de potencial endógeno de trombina para hacerlos sensibles y aproximadamente lineales a la concentración de las mismas. De un modo general, los ensayos de actividad procoagulante de las micropartículas circulantes son baratos, pueden automatizarse en muchos casos y realizan una evaluación global de una función biológica esencial de las mismas. Por otra parte, pueden tener como puntos débiles el no dar información del tamaño y origen de las micropartículas circulantes y centrarse solo en una función de las mismas. c) Los métodos de ELISA de captura de las micropartículas se basan en ensayos con la presencia de sustancias adheridas a la superficie de los pocillos que inmovilizan a las micropartículas en suspensión, las cuales luego pueden ser detectadas y cuantificadas. El método más usual para realizar esta inmovilización es la unión a los pocillos de anexina V que, a su vez, es capaz de unirse a la fosfatidilserina expresada por las micropartículas y de este modo capturarlas. También se han desarrollado ensayos en los que esta fase de inmovilización se realiza con el empleo de anticuerpos capaces de detectar marcadores celulares específicos. Una vez inmovilizadas las micropartículas, su detección puede realizarse por diversos métodos. Las micropartículas pueden revelarse empleando anticuerpos monoclonales marcados en un ensayo tipo sandwich, pero los métodos más interesantes son aquellos que las detectan en ensayos procoagulantes con la adición de calcio, factor X activado y un sustrato cromogénico sensible a la trombina. Estos ensayos de captura de las micropartículas son relativamente baratos y muy versátiles y pueden ser automatizados, al menos en parte. Asimismo, realizan una medición global de las micropartículas de cualquier tamaño y origen. Sin embargo,

Coagulación

Figura 2. Esquema de un ensayo de medición de actividad procoagulante basado en la adición de factor X activado y calcio y el empleo de plasma libre de micropartículas obtenido por acción de un veneno de serpiente. Un tempo de coagulación más corto indica un mayor contenido de micropartículas en el espécimen a estudiar.

hay que destacar el inconveniente de que son muy dependientes de la especificidad del método de captura. d) La microscopía electrónica es otra aproximación que se ha desarrollado para el estudio de las micropartículas circulantes. La microscopía óptica está limitada por sus características para la observación y medición de las micropartículas menores de 1 µm aunque el empleo de la microscopía confocal puede contribuir a una mejor aproximación. Sin embargo, la microscopía electrónica resulta muy útil para evaluar las micropartículas en su tamaño, forma y arquitectura interior. El empleo simultáneo de microscopía electrónica con tinción inmunológica, como puede ser con inmuno-oro, puede localizar de modo preciso en las micropartículas distintas proteínas de interés funcional o marcadores de su origen. Sin embargo, estas metodologías de microscopía electrónica son caras y lentas, precisan de operadores especializados y son muy sensibles a la aparición de artefactos durante la fijación, procesamiento y tinción de los especímenes. A estos métodos principales se están incorporando recientemente nuevas tecnologías capaces de medir las micropartículas circulantes. Así, los estudios con la tecnología de Dinamic Light Scattering (DLS) permiten medir de forma muy ajustada partículas incluso de menor tamaño que las micropartículas circulantes sanguíneas. Esta tecnología permite la medición del tamaño de las micropartículas y analizar los histogramas de distribución del mismo, pero no permite analizar su función o componentes. En este sentido, en la actualidad se está empezando a introducir la medición de fluorescencia en estos sistemas de DSL. También se han evaluado las micropartículas circulantes empleando la microscopía de fuerza atómica. En este método las micropartículas circulantes se inmovilizan en una superficie mediante anticuerpos específicos frente a componentes de su membrana. Estos dos últimos métodos, DLS y microscopía de fuerza

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atómica, capaces de medir micropartículas de muy pequeño tamaño han permitido demostrar que las micropartículas medidas por citometría de flujo solo son una fracción mínima de las que realmente están presentes. Este dato podría ayudar a explicar la mala correlación de las micropartículas circulantes medidas por citometría en numerosas entidades nosológicas y los resultados mucho más ajustados de los métodos funcionales. En cualquier caso, hay que destacar que, en cualquiera de los métodos, la fase preanalítica es de crucial importancia para la cuantificación de las micropartículas circulantes y así ha sido destacado por la ISTH en su Subcomité de Biología Vascular. Se precisa de una muy cuidadosa atención en la extracción de la muestra en referencia al tamaño de la aguja, al uso de torniquete y al tipo de anticoagulante empleado. También hay que ser estricto en la preparación del plasma con vigilancia del tiempo transcurrido desde la extracción, de la centrifugación, y de la congelación y descongelación de los especímenes. Conclusiones

Las micropartículas circulantes son unos efectores vasculares activos y por esa razón están involucradas en muchos procesos biológicos tales como las trombosis, la inflamación o el remodelado vascular. Actualmente todavía hay limitaciones técnicas en la cuantificación y el estudio de la función de las micropartículas circulantes por lo que se precisa un esfuerzo para su mejor identificación, caracterización y estandarización de las técnicas de cuantificación. En una aproximación hipotética, el control farmacológico de las micropartículas circulantes en su número o función podría representar una atractiva vía terapéutica para restaurar la biología vascular fisiológica. Por tanto, el avance en el conocimiento de la biología y funciones de las micropartículas circulantes puede ofrecer mejoras importantes en el diagnóstico y pronóstico, así como ofrecer nuevas dianas terapéuticas en un gran número de enfermedades en las que la generación de micropartículas puede tener un papel relevante.

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DISEño E IMPLANTACIÓN DEL PRoGRAMA DE CRIBADo DEL SíNDRoME DE DoWN Y oTRAS CRoMoSoMoPATíAS EN LA CoMUNIDAD AUTÓNoMA VASCA. Antonio López Urrutia1, Andoni Arcelay Salazar2 , Adolfo Uribarren Zaballa 3, Angeles Aniel Quiroga1, Ernesto Casis Saenz4, Carmen Mar Medina 5, Carmen Duque de las Heras 6, Carmen Zugaza Salazar7, Josep Sabrià Rius8, Isabel Portillo Villares9. 1 Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital de Cruces Vizcaya; 2 Subdirección de Atención Especializada, Organización Central de Osakidetza; 3 . Servicio de Ginecología, Hospital de Cruces, Vizcaya; 4 Laboratorio Unificado, Hospital Donostia, Guipúzcoa; 5 Servicio de Análisis Clínicos, Hospital de Galdakao, Vizcaya; 6 Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital de Basurto, Vizcaya; 7. Servicio de Análisis, Hospital Txagorritxu, Alava; 8 SBP soft 2007; 9. Coordinación programa de Cribado, Organización Central de Osakidetza. Introducción

El Síndrome de Down (SD) es un problema de salud importante ya que representa el trastorno cromosómico más frecuente, el síndrome malformativo más común y la primera causa de retraso mental. Por este motivo, desde hace muchos años se han desarrollado técnicas para su diagnóstico prenatal, principalmente las técnicas citogenéticas sobre líquido amniótico o biopsia corial. El carácter invasivo de estas técnicas, el riesgo de pérdida fetal asociado a ellas así como su elevado coste han propiciado el establecimiento de estrategias de cribado que permitan seleccionar aquellas gestantes con mayor probabilidad de tener un feto con una anomalía de este tipo y solo a éstas realizarles la prueba invasiva. Dado que el riesgo de SD se incrementa con la edad materna, éste fue el primer criterio utilizado para seleccionar a la población de riesgo tributaria de ser sometida a amniocentesis (1). El «punto de corte» de edad materna se consensuó en la década de los 70 en 35 años, teniendo en cuenta la relación entre el riesgo de gestación afectada con SD y el riesgo de pérdida fetal que se estima en un 0,9 -1%. Sin embargo, esta aproximación deja sin diagnosticar un 60% de embarazos con SD que se producen en mujeres de menos de 35 años. Por ello, a partir de los años 90 se comenzaron a desarrollar estrategias basadas en técnicas bioquímicas como el triple test del segundo trimestre del embarazo, que combinaba los valores de tres magnitudes bioquímicas séricas (la alfafetoproteína, la fracción beta de la gonadotropina coriónica humana y el estriol libre no conjugado) con la edad materna, ofreciendo una tasa de detección del orden del 60% en todos los intervalos de edad maternal con una tasa del 5% de falsos positivos (2). En los últimos años se han desarrollado programas de cribado que utilizan marcadores bioquímicos y ecográficos,

permitiendo detecciones del 80 al 96% con una tasa de falsos positivos de menos del 5%. El más extendido es el llamado cribado combinado del primer trimestre que combina la determinación en las semanas 9 – 13, de dos parámetros bioquímicos, la proteína asociada al embarazo (PAPP-A) y la fracción beta libre de la gonadotropina coriónica humana (beta hCG libre) y la medida ecográfica de la translucencia nucal (TN), con la edad de la gestante. La asociación de estos parámetros con algunos modificadores del riesgo proporciona una tasa de detección del 80 al 92% (3-8). En la comunidad autónoma del País Vasco (CAPV) desde 1997, mediante una instrucción de la Dirección General de Servicio Vasco de Salud osakidetza (SVS-osakidetza), se ofrece a las gestantes con edad igual o mayor de 35 años la amniocentesis para diagnóstico del síndrome de Down y otras cromosomopatías, no permitiendo cribados bioquímicos “hasta que se desarrollen tests con mayor sensibilidad”, según se dice en la propia instrucción. En diciembre de 2006, un informe sobre el cribado del SD de la Agencia Vasca de Evaluación de Tecnologías Sanitarias (osteba), recomendó la implantación de estrategias no invasivas de cribado del primer trimestre a toda la población por su eficacia, eficiencia y precocidad (9). En base a dicho informe, en 2007 el SVS-osakidetza encargó a un grupo de expertos, el diseño e implantación de un programa de cribado del SD con cobertura a todas las gestantes de la CAPV. El diseño y pilotaje tuvo lugar entre 2008 y 2009 y el despliegue en todos los centros de seguimiento de embarazos de la CAPV, en febrero de 2010. A pesar de que existen numerosas experiencias de implantación de programas de cribado en diferentes centros a nivel nacional e internacional, consideramos que nuestra experiencia planteada desde una perspectiva integral y en toda la comunidad autónoma vasca puede ser de utilidad.

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Objetivos y especificaciones

Los objetivos marcados por el SVS-osakidetza al grupo de trabajo fueron: • Establecer un Programa de cribado del síndrome de Down y otras cromosomopatías a todas las mujeres embarazadas de la CAPV, que fuera eficaz y seguro • Evaluar, diagnosticar y asesorar, proponiendo alternativas de forma individualizada en función del riesgo detectado y respetando las preferencias y valores de las mujeres. • Estandarizar el proceso de control ecográfico del embarazo en la CAPV A la vista de las diferentes opciones y en base a las recomendaciones de la Sociedad Española de Ginecología y obstetricia (SEGo) de la Sociedad Española de Biopatología Médica (AEBM), de la recomendaciones de osteba y las preferencias dentro del grupo de trabajo, se optó por diseñar un programa basado en el cribado combinado del primer trimestre ya que proporciona una buena tasa de detección (80-92%), es de organización relativamente sencilla, no implica visitas adicionales de la gestante, tiene un coste razonable y permite una mayor precocidad en la toma de decisiones. El grupo de trabajo estableció las siguientes especificaciones: • Los criterios, circuitos y procedimientos a utilizar deberían ser únicos y consensuados para minimizar en lo posible la variabilidad. • El punto de corte para ofrecer prueba invasiva sería 1/270 • En caso de positividad se realizaría, además del cariotipo, una prueba genética rápida con respuesta en menos de 72 horas. • Se daría formación a todos los profesionales implicados. • La aplicación informática de soporte del programa debería ser única, multicéntrica y basada en un gestor de bases de datos estándar, utilizable en entorno web que debería garantizar el cumplimiento de la Ley orgánica de protección de datos (LoPD). El motor de cálculo debería ser de fiabilidad probada. • Los reactivos, equipos y controles internos y externos deberían ser unificados para los laboratorios participantes con el fin de disminuir la variabilidad. • Los circuitos e infraestructuras a utilizar deberían ser en su mayoría los habituales del embarazo, evitando circuitos o infraestructuras especiales para este programa. • Todos los profesionales implicados en el programa tendrían acceso a la información que necesitaran para su trabajo. • Se debería minimizar la entrada manual de información y la trascripción de datos, maximizando la comunicación entre los diferentes sistemas de información corporativos. • La estructura final debería permitir el seguimiento y evaluación de los resultados del programa a fin de introducir modificaciones que se traduzcan en una mejora continua de la eficacia y eficiencia del programa.

• Se ofertaría el cribado del segundo trimestre en el caso que la gestante contactara por primera vez mas tarde de la semana 13. • Terminado el diseño se haría una prueba piloto que permitiera probar todos los elementos del programa. Circuito de cribado

A la vista de las infraestructuras existentes, y el número de embarazos previstos, que era de aproximadamente 20.000 por año, se propuso una incorporación del cribado al circuito asistencial mejorando su gestión. El circuito asistencial propuesto fue: 1. La gestante contacta en primer lugar con la matrona, ésta le informa y le propone participar en el programa. Si acepta, le cita en la semana 9-11 en su centro de extracción, para realizar las determinaciones del cribado y las pruebas analíticas habituales correspondientes al control del primer trimestre de embarazo. También cita a la gestante al centro ecográfico en la semana 11 – 13. 2. La gestante se realiza las pruebas de laboratorio en la semana 9-11 y en la semana 11-13 acude al centro ecográfico donde se le calcula la edad gestacional, se le mide la TN y se le calcula el riesgo. Si el riesgo es positivo se le ofrece la técnica invasiva. 3. Los laboratorios de genética realizan las pruebas rápidas de diagnóstico y el cariotipo en líquido amniótico. 4. El resultado de la prueba invasiva se le informa a la gestante y se le ofrecen las alternativas. 5. El resultado final del embarazo es registrado un mes después de la fecha probable de parto y el cribado se cierra. Estructura organizativa y profesionales implicados

El programa constituye un ejemplo de proceso de colaboración multidisciplinar entre niveles asistenciales en el que intervienen los siguientes profesionales y estructuras: • 120 matronas de atención primaria: suponen el primer contacto de la gestante con el sistema sanitario. Su intervención en el proceso es fundamental, ya que es la persona responsable de captar e informar a la gestante, iniciando el Programa • 6 laboratorios intermedios: reciben las muestras de sus centros de salud, realizan las pruebas de control del embarazo y envían las muestras a los laboratorios de cribado • 5 laboratorios de referencia de cribado: reciben las muestras de sus centros de salud, realizan las pruebas de control del embarazo y las pruebas bioquímicas del cribado de toda su área de influencia • 10 centros ecográficos: Centralizan la medición ecográfica de la TN, la datación ecográfica del embarazo e informan del riesgo calculado a la embarazada. • 10 centros de realización de pruebas invasivas, normalmente

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en los mismos Servicios que realizan las ecografías. • 3 laboratorios de genética: realizan las pruebas genéticas en líquido amniótico. • 1 centro coordinador: responsable de completar y cerrar los episodios así como de coordinar y centralizar la problemática derivada del Programa. • 1 coordinador clínico: ginecólogo ecografista encargado de coordinar los centros ecográficos, obstetras y matronas. • 1 comité de evaluación y seguimiento formado por profesionales de las disciplinas implicadas. Software y sistemas de información implicados.

La previsión del número anual de embarazos, la estructura organizativa diseñada y las especificaciones que se definieron hacían que el sistema de información que soportara este programa fuera clave en el éxito del mismo. Existen numerosos programas de cribado, en su mayoría cedidos por el fabricante de reactivos, condicionado al consumo de éstos. La mayoría de ellos están diseñados para entornos de un solo centro y estructura monousuario o pequeños entornos multiusuario. Sin embargo, la estructura propuesta implica un sistema en el que coexisten múltiples laboratorios y centros ecográficos de gestión descentralizada pero cálculos y evaluación centralizada. Se planteó, por tanto, la necesidad de desarrollar un sistema que cumpliera con las especificaciones y requerimientos definidos, independiente de los proveedores de reactivos. Debido a que todos los laboratorios pertenecientes al SVSosakidetza tienen implantada como aplicación corporativa de gestión de laboratorios el sistema omega2000 de Roche Diagnóstics (RD), y a que RD tiene un acuerdo de distribución del software de cribado SsdwLab5 de SBP Soft 2007 se valoró la posibilidad de utilizar dicho software. Aunque dicho programa, inicialmente no cumplía con los requerimientos planteados por el grupo de trabajo, se plantea la posibilidad de desarrollar una versión que se ajustara a nuestras necesidades. Por tanto se acuerda con Roche Diagnóstics y SBP Soft 2007 el desarrollo e implantación de una versión del software SsdwLab5 preexistente acorde con las especificaciones y requerimientos planteados por el grupo de trabajo, manteniendo el motor de cálculo de la aplicación inicial de fiabilidad contrastada. El sistema desarrollado formará parte los sistemas de información corporativos del SVSosakidetza. Sistema de información de cribado. SsdwLab6 web:

La aplicación desarrollada por SBP Soft 2007 fue SsdwLab6 web sobre un gestor de base de datos SQL Server® (Microsoft) y programada para un entorno web con Flash y Flex® (Adobe).

Permite un número ilimitado de gestantes, usuarios, puestos, centros, laboratorios, centros ecográficos, laboratorios de genética y conexiones con otros sistemas o aplicaciones. Dispone de un estricto control de la seguridad y acceso, permitiendo la creación de perfiles de usuarios; administradores, bioquímicos, ecografistas, genetistas, coordinadores, etc., por cada centro o conjunto de centros, que garantizan a cada profesional el acceso al área específica necesaria para el desarrollo de su trabajo, pudiendo ver, modificar y crear datos relacionados con su área. El aplicativo permite una evaluación y control de calidad a nivel global o a cualquier otro nivel de detalle así como la exportación de datos a cualquier otro entorno. Los administradores pueden llevar a cabo toda la gestión relativa al motor de cálculo de riesgo; medianas, ecuaciones, modificadores, etc.,a nivel, global, permitiendo en caso necesario individualizarlas a nivel de centro o ecografista. Existen pantallas específicas donde figuran los datos relacionados con cada fase del proceso; embarazo, cribado, analítica, ecografía, prueba invasiva, ecografía morfológica y resultado final del embarazo lo cual facilita el trabajo de cada profesional. El acceso de los profesionales implicados al sistema informático SsdwLab6 se lleva a cabo mediante un navegador web a través de la intranet excepto las matronas que lo hacen por medio del sistema de información asistenciales de SVS – osakidetza (osabideAP y PCH). Las relaciones entre los distintos profesionales y sistemas se esquematizan en la figura 2. Inicio del proceso.

Las gestantes acuden normalmente al médico de familia o matrona antes de la semana 8 (calculada en función de la fecha de la última regla, FUR). En el caso de acudir al médico de familia, éste la deriva a la matrona. La matrona del centro de salud informa a la embarazada del programa y le entrega un tríptico diseñado al efecto. En caso de que la gestante no acepte su inclusión, la matrona lo hace constar en el sistema informático asistencial. Introduce al sistema de información asistencial (osabideAP o PCH) la solicitud de pruebas analíticas de control de embarazo y el cribado de primer trimestre para la semana 9-11. El sistema le solicita la introducción de la fecha de la última regla, el peso y los siguientes modificadores del riesgo: Diabetes, tabaquismo, raza y antecedentes de trisomías (1014). En el caso de que por la edad gestacional actual no sea posible el cribado del primer trimestre, se solicita el cribado del segundo trimestre. La matrona solicita asimismo una cita para el centro ecográfico para la semana 11-13.

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Evolución del numero mensual de cribados 2009 - 2010 1800 1600 1400

Extensión

Cribados

1200 1000 800 Piloto

600 400

Prepiloto

200 0 Ene

Febr

Mar

Abr

May

Jun

Jul

Ago

Set

Oct

1er trimestre

Nov

Dic

Ene

Total

Febr

Mar

Abr

2º trimestre

Figura 1: Evolución mensual del número de cribados desde enero de 2009 hasta abril de 2010.

Centro coordinador [web intranet] 10 centros ecográficos [web intranet]

3 laboratorios de genética [web intranet]

SsdwLab6

5 laboratorios de cribado [Omega 2000/ PSM] 6 laboratorios intermedios [Omega 2000/ PSM]

Puesto clínico [PCH, Osabide] Matronas Figura 2: Representación esquemática de la relación entre los distintos profesionales y sistemas implicados en el modelo de programa de cribado propuesto.

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Estudios bioquímicos

factores de corrección tanto propias como globales.

Las pruebas bioquímicas, proteína plasmática asociada al embarazo (PAPP-A) y la fracción libre de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica (bHCG) se realizan en 5 laboratorios de referencia que utilizan los mismos equipos y reactivos, actualmente Immulite 2000 (Siemens). Los controles de calidad internos son suministrados por el mismo fabricante, asegurando un único lote para los 5 laboratorios. Todos ellos están suscritos además al programa de evaluación externa de la calidad UK-NEQAS La gestante acude a su centro de extracción en la fecha en la que ha sido citada, (semanas 9 – 11), para la obtención de muestras. Las muestras se envían al laboratorio de referencia de ese centro de salud. Los datos informáticos se trasmiten desde los sistemas de petición electrónica asistencial (osabideAP y PCH) a los sistemas del laboratorio (omega2000) por la intranet, incluyendo los datos demográficos, las pruebas, los modificadores del riesgo y el Código de Identificación Corporativo (CIC), número identificador único para cada usuario de la CAPV. Las pruebas que no son del cribado se procesan normalmente, se validan y se envían de nuevo al sistema informático asistencial. En el caso de tratarse de un laboratorio intermedio, es decir, que no realiza cribados, éste envía la muestra a su laboratorio de referencia y trasmite informáticamente los datos y los modificadores del riesgo. En el caso de un laboratorio de cribado, al realizar la validación clínica de las pruebas correspondientes al cribado, los datos demográficos, las pruebas, los resultados y los modificadores del riesgo se envían automáticamente por la intranet al sistema SsdwLab6 donde se dará de alta la paciente con sus datos y CIC, el embarazo, el cribado y las pruebas analíticas con sus resultados. En el caso de que la gestante no hubiera aceptado participar en el programa, el laboratorio envía solo los datos de la gestante al programa SsdwLab6 marcando “no acepta el cribado” lo cual permite una mejor evaluación del programa, permitiendo su utilización como base de datos de todos los embarazos. El resto de pruebas se informan normalmente y se envían a los sistemas de información asistencial. Una vez que se han volcado los datos a la base de datos, el profesional del laboratorio accede al programa SsdwLab6 y ejecuta un proceso de validación en el que da su conformidad a los datos recibidos y a los resultados a la vista de los datos y los riesgos provisionales calculados por el programa a partir de la FUR. Este proceso es requerido para que posteriormente el ecografista pueda introducir los datos ecográficos y calcular el riesgo final. El laboratorio puede además mediante SsdwLab6 llevar a cabo una monitorización exhaustiva de las medianas y los

Estudios ecográficos e informe de riesgo

La gestante acude a uno de los 10 Centros ecográficos en la semana 11-13 citada por la matrona. En el centro ecográfico se localiza a la gestante en el programa SsdwLab6, quien habrá sido dada de alta en la aplicación por el laboratorio. El ecografista mide la longitud cráneo caudal (CRL) y la TN, introduce estos datos en el programa SsdwLab6 y completa los datos sobre el tipo de embarazo, el número de fetos, y cualquier modificador que no haya sido introducido previamente por la matrona. Todos los campos son obligatorios y el programa no calculará el riesgo si falta alguno de ellos. Esto dota de una gran calidad a la base de datos resultante. El programa calcula la edad gestacional ecográfica y el riesgo combinado tanto para trisomía 21 (SD) como para trisomía 18 (síndrome de Edwards) y 13 (Síndrome de Patau) (15,16). El ecografista imprime entonces el informe para la gestante. En el caso de que alguno de los riesgos sea superior a 1/270, se le ofrece la prueba invasiva (amniocentesis o biopsia corial). En el momento de imprimir el informe, el SsdwLab6 envía al sistema del laboratorio de cribado los resultados de los riesgos para trisomía 21 y 18-13. De forma automática, éste trasmite al sistema informático asistencial los valores de riesgo para que formen parte de la historia electrónica. El programa también permite al ecografista introducir opcionalmente otros parámetros ecográficos dicotómicos que mejoran la detección. Estos parámetros son: la ausencia de hueso nasal, fémur corto, ectasia piélica, foco ecogénico cardíaco, intestino ecogénico, flujo del ductus anormal, regurgitación tricuspídea o malformación mayor para trísomía 21 y quiste único de los plexos coroideos, la arteria umbilical única u otra malformación mayor para las trisomías 18 y 13 (17-23). En el caso de embarazos gemelares el sistema permite duplicar, en las gestaciones bicoriales los datos ecográficos y los correspondientes riesgos así como las pruebas invasivas y el resultado perinatal para todo tipo de gemelares (24-31). El programa SsdwLab6 dispone además de herramientas de control de calidad que permiten monitorizar la calidad de las medidas de la TN a nivel global, de centro o incluso por cada ecografista (CUSUM) (32). Técnicas invasivas y estudios genéticos

A las gestantes con riesgo mayor de 1/270 se les oferta la realización de una técnica invasiva, normalmente biopsia corial o amniocentesis. Las muestras se envían a los laboratorios de genética donde se realiza en primer lugar una técnica rápida, FISH o QFPCR,

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cuyo resultado se entrega en menos de 72 horas. A todas las muestras se les realiza cariotipo. Los datos de la prueba invasiva, (tipo, lugar, fecha, indicación, etc.) así como los resultados de los estudios genéticos se introducen en el programa SsdwLab6 en los laboratorios de genética de una forma estandarizada de forma que sea posible su explotación Ecografía morfológica

El programa está preparado para registrar los datos de la ecografía morfológica de la semana 20 lo cual nos permite integrar todos los datos del embarazo en la misma base de datos. Resultado perinatal

Gestantes

La recogida de los datos del resultado final del embarazo es fundamental para la evaluación del programa en su conjunto. Por este motivo, el grupo de trabajo recomendó disponer de una infraestructura que permitiera llegar al resultado final de cada uno de los casos. Además, se propuso la conexión informática del programa de cribado con las bases de datos de anomalías congénitas y con otras bases de datos de los servicio obstétricos de cada Centro para facilitar esta labor. El programa permite la introducción de información relativa al final del embarazo (normal, aborto, anomalías y datos complementarios. Esta información se introduce en los propios centros en el caso de que se conozca el dato. Transcurridos 30 días desde la fecha probable de parto, El centro coordinador del Programa será la responsable de cerrar el caso. Para ello, consultará las distintas bases de

datos o contactará con los centros con el fin de conocer e introducir en el programa el resultado final del embarazo. Evaluación y seguimiento

El programa implantado permite la obtención de todo tipo de información sobre el programa de cribado tanto a nivel global como a cualquier nivel de detalle. Para llevar a cabo la evaluación y seguimiento del programa se va a crear un comité de seguimiento con el fin de asesorar la planificación, despliegue y evaluación del programa en la CAPV. Mas específicamente: • Proponer criterios generales para el desarrollo del programa. • Gestión de casos de riesgo, gestión de falsos negativos y falsos positivos. • Calidad del proceso, seguimiento de los casos. • Asesorar los criterios del Sistema de Información • Monitorizar el seguimiento y los indicadores de proceso y resultados. • Canalizar la revisión de casos complejos. • Elaborar Informes para las autoridades sanitarias. • Proponer investigaciones, publicaciones y difusión del programa. Resultados y discusión

La fase prepiloto comenzó en enero de 2009, durante 3 meses se probaron los equipos, los reactivos, el programa informático, las medianas, las conexiones y el circuito en el Hospital de Cruces con un solo centro de salud (Leioa). Tras realizar los pertinentes ajustes y modificaciones y se pasó a la

6000

Bioquímica

5000

Ecografía

4000 3000 2000 1000 0

8

9

10

11

12

Edad gestacional (semanas)

13

14

Figura 3: Distribución de gestantes que acuden a las pruebas bioquímicas y ecográficas por edad gestacional a la que acuden.

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siguiente fase. La fase piloto consistió en ofrecer el programa de cribado a embarazadas de un único centro de salud adscrito a cada uno de los 10 centros ecográficos y de los 5 laboratorios. También se probaron los circuitos en los que las muestras llegaban a través de un laboratorio intermedio. La fase de implantación o extensión tuvo lugar desde octubre de 2009 hasta febrero de 2010. En esta fase se fueron incorporando paulatinamente centros de la red del SVSosakidetza de manera que en mayo de 2010 el número total de cribados iniciados era de más de 12.000 con un número mensual superior a los 1500 de los cuales un 97,2 % son del primer trimestre y un 2,8% del segundo trimestre. En la figura 1 se observan la evolución mensual del número de cribados desde enero de 2009 y se puede observar la incorporación de los distintos centros hasta llegar a la completa extensión. La figura 4 muestra la distribución por edades de las gestantes, la mediana es de 33 años y un 34,5 % de las gestantes tiene 35 años o más lo cual nos indica que con el anterior sistema basado en la edad se harían pruebas invasivas a un 34,5 % de las gestantes. La distribución del momento en que las gestantes acuden a la prueba bioquímica y a la ecográfica se muestra en la figura 3. Las semanas de mayor frecuencia son la 10 (44%) para las pruebas bioquímicas y la 12 (60%) para la TN. Hasta el mes de enero de 2010 se utilizaron unas medianas procedentes de otras poblaciones. La tasa de positivos con dichas medianas fue del 7%. En enero de 2010, una vez obtenido un número suficiente de embarazos, se recalcularon las medianas con datos propios. La tasa de positivos con las actuales medianas es de 3,5 % para el primer trimestre y de

5,4 % para el segundo trimestre. A la fecha de redactar este artículo los embarazos con el procedimiento de cierre completo son 1.373 con una sensibilidad del 100% para el Síndrome de Down y 87,5 % para el conjunto de aneuploidías. Estos resultados deben considerarse como preliminares ya que la evaluación de los resultados finales se hará a partir de los 5.000 cribados, es decir, dentro de tres meses.

Conclusiones

El modelo propuesto tanto a nivel estructural, como logístico, informático y técnico ha permitido la implantación del Programa en toda la CAPV en un tiempo razonable sin recurrir a circuitos especiales. A falta de una evaluación completa de los resultados con suficiente número de casos cerrados, el modelo propuesto ofrece las siguientes ventajas: Disminución de la variabilidad por la utilización común de reactivos, equipos, controles, modificadores, algoritmos, medianas y criterios. Las posibilidades de seguimiento, evaluación y mejora son muy elevadas. La infraestructura creada permite su utilización como base de datos del embarazo con posibilidades de incorporar nueva información de utilidad futura. El modelo de colaboración multidisciplinar que ha contado con una excelente implicación de los profesionales involucrados en este programa, ha resultado positivo y enriquecedor para todos.

1200

Número de altas de cribado

1000

800

600

400

200

0

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Edad de la madre

Figura 4: Distribución por edades de las gestantes.

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Roche Diagnostics informa | Octubre 2010

INCoRPoRACIÓN DEL EQUIPo SYSMEX XT 4000i EN LA AUToMATIZACIÓN DEL ANÁLISIS DE LíQUIDoS BIoLÓGICoS EN EL LABoRAToRIo. Y MoDIFICACIÓN DEL PRoToCoLo DE TRABAJo Amaia García de Vicuña, Arantza Arza Ruesga, Carmen Martínez Campos, Cosme Gorostiza Guerricaecheverria, Antonio López-Urrutia Fernández. Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital de Cruces, Barakaldo, Vizcaya.

Introducción

El estudio bioquímico y microscópico de los líquidos biológicos que se realiza en los laboratorios clínicos representa un área de trabajo muy importante, sobre todo desde un punto de vista cualitativo ya, que constituye muchas veces una prueba vital para el diagnóstico de muchos pacientes (1). Por lo tanto, el correcto procesamiento de dichas muestras, así como la exactitud de los resultados son esenciales para esta tarea. El informe del laboratorio complementa al examen físico realizado por el médico al paciente y a otras pruebas de diagnóstico como son las imágenes radiológicas, pruebas de ultrasonidos o ecocardiográficas. En los laboratorios, la diversidad organizativa a la hora de realizar esta prueba es enorme debido a que el grado de implicación del profesional que lo realiza (facultativo, técnico especialista en laboratorio; diplomado universitario en enfermería); los criterios para realizar el recuento diferencial y la metodología implicada son diferentes en cada centro. Los líquidos biológicos que con más frecuencia se remiten al

laboratorio para su estudio se pueden dividir en tres grandes grupos: el líquido cefalorraquídeo (LCR), el líquido sinovial (LS) y los líquidos serosos: líquido pleural (LP), ascítico (LA) o peritoneal (LPER), y pericárdico (LPERI). El LCR es el líquido que con más frecuencia se remite a los laboratorios clínicos y su análisis resulta clave para el tratamiento inmediato del paciente. Este líquido es una solución compleja formada por una secreción activa de las células de los plexos coroideos y de las células ependimales por difusión del plasma. Se diferencia de los fluidos serosos y sinoviales, en la permeabilidad selectiva de las membranas y tejidos adyacentes (barrera hematoencefálica). El gradiente de presión hidrostática dentro de los capilares coroideos produce la filtración de fluido a través de la barrera de células del endotelio capilar en el tejido conectivo a las células epiteliales delimitantes. El LCR tiene múltiples funciones, protege al cerebro y médula espinal de cambios súbitos de presión, mantiene un ambiente químico estable y retira los productos de desecho del metabolismo cerebral (2). La obtención del LCR es habitualmente por punción lumbar, pero también puede obtenerse a través de una punción cervical lateral o cisternal. Las alteraciones en el sistema nervioso central que producen cambios en la composición química, microscópica y macroscópica del LCR son diversas, entre las que destacan por su mayor relevancia las hemorragias, las infecciones, las neoplasias y las enfermedades desmielinizantes. Los líquidos biológicos serosos: ascítico (LA), pleural (LP), peritoneal (LPER) y pericárdico (LPERI) son los líquidos derivados del plasma y que están contenidos en varias cavidades. Estas cavidades están delimitadas por una membrana serosa visceral y por una parietal. Los líquidos serosos son ultrafiltrados del plasma que derivan de la abundante red capilar de la membrana serosa. El análisis de laboratorio que se realiza en estos líquidos es muy importante para diagnosticar la causa del derrame, clasificado, según su contenido proteico, en trasudado o exudado. Los trasudados son líquidos no inflamatorios que se originan por alteración de factores sistémicos que afectan a la formación o reabsorción del líquido (presión hidrostática o coloidosmótica). Los exudados, por el contrario, son líquidos inflamatorios que contienen gran cantidad de proteínas y se deben a una afectación de la pared capilar producida por una infección bacteriana, micótica o vírica, por una inflamación aséptica o por un tumor maligno. El estudio de los líquidos biológicos serosos proporciona información importante sobre la fisiopatología de los órganos y tejidos donde se generan y es función del laboratorio la selección de magnitudes diagnósticas apropiadamente validadas y con buena capacidad discriminatoria, para que este estudio aporte información decisiva en la práctica clínica (2). El líquido sinovial (LS) es el líquido de las articulaciones

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diartrósicas que son las más móviles (rodilla, tobillo, cadera, codo, muñeca y hombro). Es un ultrafiltrado del plasma al que las células sinoviales le aportan el ácido hialurónico que es el responsable de la viscosidad del fluido. La finalidad del estudio del líquido sinovial, obtenido por artrocentesis o punción articular, es ayudar a diagnosticar las enfermedades reumatológicas e infecciosas que afectan a las articulaciones, ya que su alteración refleja la patología de la membrana sinovial y del cartílago articular subyacente. El examen del laboratorio tanto bioquímico como microscópico nos da la posibilidad de clasificar el LS en cuatro categorías: no inflamatorio, inflamatorio, séptico y hemorrágico (2). Hasta la fecha, el método de referencia para el contaje celular en muchos laboratorios sigue siendo el recuento manual en cámara; pero debido a la demora en el tiempo de respuesta, a la manipulación de muestras potencialmente contagiosas, a la necesidad de tener personal altamente cualificado, a la gran variabilidad entre observadores, así como a problemas inherentes al tipo de muestra como la escasa estabilidad de algunos fluidos, el número reducido de células en muchos casos y la dificultad de detectar células atípicas hace que sea necesario la automatización y estandarización de los fluidos biológicos. El objetivo de este estudio es evaluar y comparar el analizador hematológico XT-4000i (Sysmex Co, Kobe, Japan) con el recuento y diferenciación manual, y a su vez, valorar su eficacia, estudiando si su implantación supondrá una mejora. Una vez estudiada su eficacia y su eficiencia nos proponemos la elaboración de un protocolo de trabajo para los diferentes líquidos biológicos basándonos en la estructura organizativa de nuestro hospital y en su rendimiento clínico. Material y métodos

Se han analizado un total de mil líquidos biológicos (n=1000) recibidos durante 8 meses en el laboratorio de un hospital de referencia de tercer nivel, con todas las especialidades. De éstos, un 71% corresponden a LCR, 9% a LP, 10% a LA, 5% a LPER y un 5% a LS. Se han incluido todas las muestras de las que había volumen suficiente (volumen >500 µL). Los líquidos cefalorraquídeos obtenidos tanto por punción lumbar como por punción y derivación ventricular han sido extraídos en tubo estéril sin gel y sin anticoagulante, mientras que los líquidos serosos y el líquido sinovial lo han sido en tubo estéril con EDTA. El transporte se ha llevado a cabo a temperatura ambiente. A todos los líquidos se les ha realizado de forma inmediata el recuento celular al microscopio en cámara desechable Kova Glasstic (el volumen retenido en cada retículo es de 1 µL.), diluyendo previamente con cloruro sódico al 0,9% en caso necesario. El recuento leucocitario diferencial se ha efectuado en las extensiones del sedimento teñidas con una tinción panóptica de Schiff, siguiendo los criterios habituales del

laboratorio: LCR con más de 5 células/µL o más de 10 en el caso de tratarse de recién nacidos y más de 250 células/µL. para el resto de líquidos biológicos. Se han analizado 714 muestras de LCR enviadas a nuestro laboratorio desde las diferentes unidades clínicas. Primero de manera manual en cámara y a partir de 5 -10 células/µL, en función de su procedencia, se prepara el botón celular mediante centrifugación y tinción para su diferenciación al microscopio. A continuación se han procesado con el analizador Sysmex XT-4000i, seleccionando el modo para fluidos biológicos (BF Mode), según instrucciones del fabricante. El equipo ofrece de forma automatizada en su modo para líquidos biológicos los recuentos de hematíes, leucocitos y células de alta fluorescencia, así como la diferenciación de los leucocitos en mononucleares (MN) y polimorfonucleares (PMN), en porcentaje y en unidades absolutas. Además de la medición por impedancia, la tecnología aplicada se basa en la citometría de flujo y la fluorescencia con colorantes fluorescentes que tiñen los ácidos nucleicos y el material proteico, para la serie blanca y células de alta fluorescencia. Previamente al análisis se ha realizado un chequeo del recuento de fondo (background). Las muestras se han introducido directamente por aspiración manual con un volumen de 85 µL. Los diagramas de dispersión se han evaluado cuidadosamente y todos los datos se han impreso y guardado para su análisis posterior. En cuanto a los líquidos serosos, hemos analizado 232 muestras (85 LP, 101 LA, 44 LPER y 2 LPERI) y respecto a los líquidos sinoviales 54 muestras. Todos estos líquidos han sido procesados de igual manera pero con un punto de corte de 250 células/µL para su diferenciación celular. El estudio estadístico se ha realizado mediante el programa Medcalc de comparación de métodos, haciendo un análisis de regresión con el método de Passisng- Bablok para los recuentos leucocitarios, hemáticos, de PMN y MN de todos los líquidos y usando la gráfica de Bland-Altman para las diferencias entre dos mediciones frente a su media. La concordancia clínica se ha analizado con el estadístico kappa (índice de conformidad entre métodos u observadores) y su correspondiente intervalo de confianza del 95% con el programa estadístico SPSS v 18.0. Para ello las muestras han sido categorizadas según el tipo de líquido en diferentes puntos de corte de significado clínico atendiendo al recuento celular. Los LCR se han dividido, en cinco categorías diagnósticas (clases I-V) para el cálculo de los índices de correlación: 1000 (n=12) células/L. Los LS en cuatro categorías (clases I-IV): 10000 (n=28) células/L. Los líquidos serosos se han dividido en las mismas cuatro categorías: 10000 (n=8) células/L.

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LEUCOCITOS LCR

16000 14000

La reproducibilidad ha sido evaluada mediante el estudio de la precisión. Para la precisión intradiaria se ha analizado un líquido con una celularidad alta 10 veces consecutivas y se ha calculado la media y el coeficiente de variación. Para la precisión interdiaria se ha analizado un control hematológico (e-check XE Sysmex) valorado durante 20 días ya que no se disponía de un control específico para líquidos biológicos (3,4). La linealidad del método se ha obtenido mediante diluciones seriadas por duplicado de un líquido seroso con alta concentración celular. La sensibilidad funcional se calcula como la concentración de leucocitos y hematíes en la que el coeficiente de variación es menor del 20%. Para descartar el ruido de fondo se ha analizado 20 veces de forma consecutiva en dos días diferentes el diluyente (Cellpack) del equipo.

10000 8000 6000

y =2,00+1,5x r =0,97

4000 2000 0 0

5000

10000

15000

Microscopio (XT4000i + 1 -microscopio + 1)/Promedio %

Rendimiento y evaluación

XT-4000i

12000

LEUCOCITOS LCR

200

+1,96 SD 179,5

150 100

Media

50

57,6

0 -1,96 SD -64,3

-50 -100 -150 -200

0

5000

10000

15000

20000

Promedio de XT4000i + 1 y microscopio + 1

Resultados

En el estudio de correlación de los LCR se han obtenido los siguientes valores en la comparación de métodos con la regresión de Passing- Bablok: Recuento de hematíes: r = 0,98, recta de regresión y = 155 + 0,99x, intervalos de confianza 0,98 – 1,00 para la pendiente y 0,00 – 205 para la ordenada en el origen, para todos aquellos líquidos con más de 750 hematíes/L. Recuento celular: r = 0,97, y = 2 + 1,5x, intervalos de confianza 1.40 – 1.58 para la pendiente y 1,24 – 2.16 para la ordenada en el origen (figura 1). Diferenciación de las poblaciones leucocitarias: Para PMN: r = 0,88, recta de regresión y = 6,18 + 0,93x, intervalo de confianza 0,87 – 1,00 para la pendiente y 4.00 – 9,18 para la ordenada en el origen. Para MN: r = 0,88, recta de regresión y = -0,07 + 0,94x, intervalo de confianza 0,87 – 1,00 para la pendiente y -4,00 – 3,30 para la ordenada en el origen (figura 2). Con los resultados obtenidos podemos concluir que, a pesar de la buena correlación, los métodos no son intercambiables. Ante este resultado decidimos estudiar la correlación de los LCR por categorías y observamos que para las categorías IV y V, que se corresponden con los líquidos que contienen mayor

LCR

100 80 PMN% XT-4000i

LíQUIDo CEFALoRRAQUíDEo

Figura 1. Recta de regresión de Passing-Bablok y de Bland-Altman para leucocitos de LCR.

60 40 20

y = 6,18+0,93x r = 0,88

0 0

20

40

60

80

100

PMN% Microscopio

LCR

100 80 MN% XT-4000i

Podemos señalar que los resultados obtenidos en cuanto a reproducibilidad y sensibilidad del aparato XT-4000i en el análisis de líquidos biológicos han sido: una precisión intradiaria e interdiaria (coeficiente de variación, CV) para hematíes de 1,7% y 0,3% y para células de 0,06% y 1,2% respectivamente. La sensibilidad funcional obtenida ha sido de 750 hematíes y 5 células (CV< 20%).

60 40 20

y = -0,07+0,94x r = 0,88

0 0

20

40

60

80

100

MN% Microscopio Figura 2. Recta de regresión de Passing-Bablok para MN% y PMN% de LCR.

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100000 80000

20000 0

y = 0,23 + 0,99 x r = 0,94

0

20000

40000

60000

80000 100000 120000

Microscopio

5 62 27

5 83 6

>1000

100

LS

80

1 11

LíQUIDo SINoVIAL

En el estudio de correlación de los LS se han obtenido los siguientes valores en la comparación de métodos con la regresión de Passing- Bablok: Recuento de hematíes: r = 0,99, recta de regresión y = 2217 + 1,07x, intervalo de confianza 0,94 –1,15 y 1410 – 3973 para la ordenada en el origen. Recuento celular: r = 0,94, recta de regresión y = 0,23 + 0,99x, intervalo de confianza 0,96-1,06) y -319 – 238 para la ordenada en el origen. Diferenciación de las poblaciones leucocitarias (figura 3): Para PMN: r = 0,94, recta de regresión y = 8,05 + 0,91x, intervalo de confianza 0,78 – 1,00 para la pendiente y 1,00 – 19,21) para la ordenada en el origen. Para MN: r = 0,94, recta de regresión y = 0,39 + 0,92x, intervalo de confianza 0,81 – 1,00) para la pendiente y -1,002,18 para la ordenada en el origen. En el estudio de concordancia clínica hemos obtenido un valor de Kappa de 0,81 (Error t = 0,07) y un acuerdo entre clases que osciló entre 75% para la clase I, 57% para la clase II, 93% para la clase III y 96% para la clase IV. LíQUIDoS SERoSoS

En el estudio de correlación de los líquidos serosos se han obtenido los siguientes valores en la comparación de métodos con la regresión de Passing- Bablok: Recuento de hematíes: r = 0,92, recta de regresión y = 86.25 + 1.00x, intervalo de confianza 0,97 – 1,03 para la pendiente y 0,00 – 227 para la ordenada en el origen. Recuento celular: r = 0,99, recta de regresión y = 3,00 + 1,00x,

PMN% XT-4000i

31-100 101-1000

60 40 20 0

y = 8,05 + 0,91 x r = 0,94

0

20

40

60

80

100

PMN% Microscopio

LS

100 80 MN% XT-4000i

XT-4000i

60000 40000

Tabla I. Tabla de contingencia atendiendo al recuento de leucocitos en LCR.

LEUCoCIToS/ µL MICRoSCoPIo 5%) viene ref lejado en el equipo con una alarma anorm esc WBC.

30000

40000

50000

60000

Microscopio

LÍQUIDOS SEROSOS

100

PMN% XT-4000i

80 60 40 20 0

y = 4,00 + 1,00 x r = 0,92

0

20

40

60

80

100

PMN% Microscopio

LÍQUIDOS SEROSOS

100 80 MN% XT-4000i

En los laboratorios clínicos, uno de los procedimientos menos automatizado es el estudio de los líquidos biológicos, particularmente el estudio citológico. Esto provoca una variabilidad tanto en el procedimiento de cada laboratorio como en el personal que lo analiza, lo que se traduce en imprecisión. La estandarización de los métodos en el laboratorio pretende eliminar posibles causas de variación como son el tiempo, el volumen de líquido, la superficie de conteo y la interpretación del personal. Pudiendo implementar también un sistema de control de calidad (5). En nuestro hospital tenemos que analizar diariamente una alta cantidad de líquidos biológicos procedentes de diversas áreas clínicas. Durante 2009 se procesaron un total de 4679 líquidos. El procedimiento automatizado propuesto por Sysmex es rápido y fácil de manejar, no necesita pretratamiento de la muestra, el análisis es más preciso y no requiere personal particularmente especializado. Iniciamos el estudio y analizamos 1000 fluidos biológicos (71% LCR, 9% LP, 10% LA, 5% LPER y un 5% LS). observamos que en general el analizador tiende a realizar recuentos superiores que el análisis microscópico. Hemos visto que la cuantificación de hematíes sólo es útil por encima de 750 células/µL. Este límite de cuantificación es suficiente para estimar el grado de contaminación sanguínea de la muestra. Sin embargo en los LCR con bajos recuentos en los que se requiere además una morfología eritrocitaria no es suficiente.

20000

60 40 y = -4,0 + 1,00 x r = 0,91

20 0

0

20

40

60

80

100

MN% Microscopio

Figura 4. Recta de regresión de Passing-Bablok para leucocitos, MN% y PMN% de líquidos serosos.

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Esta magnitud sugiere la presencia de otro tipo de células como pueden ser las mesoteliales, macrófagos linfocitos B activados o células tumorales que algunos casos pueden sugerir un análisis al microscopio para descartar un proceso inflamatorio o neoplásico. También nos proporciona el valor absoluto y porcentaje de eosinófilos dentro del recuento celular. LíQUIDoS CEFALoRRAQUíDEoS

El punto clave para el uso de los contadores automatizados en el análisis de líquidos biológicos es asegurar que el instrumento realice recuentos fiables a partir del escaso número de células que se encuentran en este tipo de líquido en particular. Aproximadamente el 70% de los líquidos que se reciben en nuestro laboratorio de urgencias son LCR. Algunos de estos se extraen por punción lumbar pero gran parte de ellos son obtenidos de los shunts ventriculares sistémicos y reservorios. Debido a las discrepancias obtenidas en los resultados decidimos estudiar con más detenimiento este tipo de líquidos y los diferenciamos según el tipo de extracción y el recuento celular. Así concluimos que el contador en general tiende a sobreestimar la cantidad de leucocitos en este tipo de muestras, de manera que en LCR con un recuento 5 - 30 células/µL no nos permite discriminar con la suficiente exactitud y precisión si un líquido es normal o patológico. Por encima de este valor los recuentos tanto para hematíes como para células son reproducibles. La correlación también es buena para la diferenciación de

células mononucleares y polimorfonucleares en pacientes con recuentos de leucocitos superiores a 30 células/µL, ya que por debajo de este punto de corte el analizador sobrestima la cantidad de PMN en el recuento diferencial. Para los LCR obtenidos de los shunts ventriculares sistémicos y reservorios el analizador realiza un contaje de células muy superior al obtenido al microscopio. Creemos que posiblemente puede ser debido a la contaminación por restos celulares u otras partículas de origen proteico en este tipo de muestras, pero sería necesario realizar más estudios para poder llegar a una conclusión definitiva. Por el contrario en pacientes en tratamiento intratecal con liposomas de citarabina, que pueden ser confundidos con leucocitos en el momento de su inspección al microscopio, la citometría de flujo/fluorescencia ofrece menor interferencia (10). También para aquellos LCR que por diversos tratamientos contienen alta cantidad de sales y su observación al microscopio es difícil.

Protocolo

Cada laboratorio debe definir los límites inferiores para el Sysmexde células nucleadas y eritrocitos, por debajo del recuento XT4000 cual el uso de los contadores automáticos no es fiable (9). En nuestro hospital después de varios meses de trabajo con el equipo Sysmex y sobre la base de los resultados que hemos obtenido hemos propuesto el protocolo de trabajo expuesto en la figura 5.

Otros líquidos

LCR ¿Shunt o derivación?

Si (71 %)

No

Sysmex XT4000

¿Poca muestra? Vol < 300 µL

Si (3 %)

No (26 %)

Sysmex XT4000

Microscopio (75 %) ¿>5% AF?

Si

¿>5% AF?

Si

Microscopio (14,5 %)

No No (85,5 %)

Si (7 %) ¿5-30 cel? No (19 %)

Informe

Informe

Figura 5: Protocolo de trabajo tras la incorporación del equipo Sysmex XT-4000i.

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Conclusión

La incorporación del analizador Sysmex XT-4000i en el laboratorio supone una mejora en el rendimiento de trabajo. El 85% de los líquidos serosos y sinoviales que se reciben en nuestro área de trabajo pueden ser informados con mayor rapidez y precisión mediante la implantación de este equipo, reduciendo a un 15% aproximadamente, los líquidos a evaluar manualmente para descartar un proceso oncológico o cualquier otra alteración clínica, ya que el equipo nos informa del porcentaje de células de alta fluorescencia. Esto supone una ventaja ya que la revisión al microscopio de algunos de estos líquidos es laboriosa, bien por la cantidad de células que contienen, que obliga a realizar diluciones o debido a la turbidez de la muestra. Diferentes área clínicas de nuestro hospital, como pueden ser los servicios de neurocirugía o reanimación, solicitan controles periódicos de los pacientes mediante el estudio del líquido cefalorraquídeo. Esto hace que en nuestro laboratorio casi el 70% de los líquidos que se reciben anualmente se correspondan con este tipo de muestras. Un alto porcentaje de estos líquidos son extraídos mediante shunts ventriculares o catéteres, aproximadamente un 71%. Para estos es necesaria la observación al microscopio debido a posibles interferencias que hemos encontrado. Un nuevo reto que nos proponemos es ampliar el estudio de estos líquidos para poder llegar a una conclusión definitiva. Aunque el rendimiento del analizador que hemos obtenido es menor para el estudio de los LCR, el equipo es capaz de procesar los líquidos patológicos con buena precisión tanto para el recuento de leucocitos como el de las poblaciones celulares, reservando la inspección manual para los líquidos claros y con un recuento celular bajo (menor de 30 células/µL) que es una operación sencilla.

BIBLIoGRAFíA Francisco V. Álvarez. Líquidos biológicos: actualización del análisis en el laboratorio. Editorial Glosa, S.L 2010 Kjeldesberg C, Knight J. Body Fluids. American Society of Clinical Pathologists, Third Edition 1993. Clinical and Laboratory Standars Institute. Body f luid Analysis for Cellular Composition; Approved Guideline. (26). 2006. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne Pennsylvania 19087-1898 USA, Clinical and Laboratory Srandars Institute. CLSI document H56-A Clinical and Laboratory Standars Institute. Analysis of Body Fluid in Clinical Chemistry; Approved Guideline. 2007. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne Pennsylvania 19087-1898 USA, Clinical and Laboratory Srandars Institute. CLSI document H49-A A. Paris, T. Nhan, E. Cornet, J.P. Perol, M.Malet, X. Troussard. Performance evaluation of the body f luid mode on the platform Sysmex XE-5000 series automated hematology analycer. Int Jnl Lab Hem 2010 De Jonge. R, Brouwer. R, de Graaf M.T, Ronald L, et al. Evaluation of the new body f luid mode on the Sysmex XE-5000 for counting leukocytes and erytrocytes in cerebrospinal f luid and other body f luids. Clin Chem Lab Med 2010;48:665-75 de Jonde R., Brouwer R., Smit M., de Frankrijker- Merkestijn M., Dolhain R.J, Hazes J.M., van Toorenenbergen A.W., Lindmans J. Automated counting of white blood cells in synovial f luid. Rheumatology oxford 43, 170-173. 2004 Boer K, Defuel T, Reinhoefer M. Evaluation of the XE-5000 for the automated análisis of blood cells in cerebrospinal f luid. Clin Biochem. 2009.01.025 Martinez Villanueva M, Sarabia Meseguer A, Noguera Velasco J.A, Martinez Hernandez P. Creación de un área de automatización para el estudio citológico de líquidos biológicos. Propuesta de un f lujo de trabajo. Phuphanich S., Maria B., Braeckman R., Chamberlain M. A pharmacikinetc study of intra-CSF administered encapsulated cytarabine (DepoCyt) for the treatmen of neoplastic meningitis in patients with leukaemia, lymphoma or solid tumors as part of a phase III estudy. J Neurooncol 2007. 81:201-208.

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IMPoRTANCIA DE LA CARGA VIRAL PLASMÁTICA DE BAJo NIVEL EN LA INFECCIÓN PoR VIRUS DE LA INMUNoDEFICIENCIA HUMANA TIPo-1 (VIH-1) RAFAEL DELGADo Servicio de Microbiología. Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid.

La medida de la Carga Viral Plasmática (CVP) de VIH-1 es una herramienta fundamental en el manejo clínico de los pacientes infectados por VIH-1. Su valor patogénico y pronóstico la hacen imprescindible en todas las fases de la infección pero especialmente en los pacientes en tratamiento anti-retroviral (TAR), ya que es el indicador más importante de respuesta terapéutica y es de gran ayuda para predecir la evolución clínica (1). La introducción de anti-retrovirales específicos y la instauración del tratamiento de combinación a mediados de los años 90, han supuesto un cambio espectacular en el manejo de los pacientes infectados por VIH y se considera uno de los logros terapeúticos más importantes de la medicina moderna. Las combinaciones de anti-retrovirales actuales permiten que en la mayor parte de los pacientes que inician TAR se consiga rápidamente el control de la replicación del VIH y la subsiguiente recuperación de los linfocitos T CD4+. El TAR debe sin embargo mantenerse de por vida ya que no es posible, por el momento, la erradicación completa del virus debido fundamentalmente a la existencia de un reservorio celular, en su mayoría linfocitos T CD4+ memoria en reposo o quiescentes, en el que el VIH se encuentra integrado latentemente y con la capacidad de iniciar de nuevo la replicación si se suspendiera el TAR. La estabilidad de este reservorio celular es considerable, lo que en la práctica significa la persistencia de células infectadas a lo largo de toda la vida del paciente. Existe, así mismo, la evidencia de que en la mayoría de los pacientes en tratamiento, es posible detectar con técnicas ultrasensibles cierta actividad replicativa que resulta en una carga viral por debajo del umbral de detección de las técnicas convencionales, habitualmente 50 copias de ARN de VIH/mL de plasma, conocida como viremia residual. Determinar el origen y la naturaleza de esta viremia residual está siendo objeto de intensa investigación y debate. Las hipótesis que se invocan para explicar esta dinámica de bajo nivel son dos principalmente: la existencia de santuarios celulares donde la concentración de anti-retrovirales es insuficiente para el

control completo de la replicación y, en segundo lugar, la posibilidad de que se trate de una simple liberación de partículas por células latentemente infectadas sin que den lugar a posteriores ciclos de reinfección. Estas dos hipótesis, no completamente excluyentes, condicionarían un diferente pronóstico en la evolución a largo plazo de los pacientes en tratamiento. El reservorio celular de VIH:

La investigación sobre las circunstancias que explican que la infección por VIH sea intrínsecamente incurable con antiretrovirales proviene fundamentalmente del trabajo del laboratorio de Robert Siliciano en la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkinks en Baltimore, EE.UU. Aunque existían evidencias iniciales sobre células en las que, por hibridación in situ, era posible detectar ADN de VIH sin producción de ARN (2), no fue hasta 1995 que el grupo de Siliciano demostró de manera incontrovertible la presencia del VIH integrado en linfocitos T CD4+ quiescentes (3). La estimación del número de células latentemente infectadas por VIH no parece muy grande, 1/106 linfocitos T CD4+, unos pocos miles en cualquier caso (4), sin embargo la aparente estabilidad del reservorio compromete la posibilidad de erradicación del virus con anti-retrovirales (5), ya que es posible seguir detectando células infectadas a lo largo de todo el tratamiento (6;7) y el VIH emerge sistemáticamente una vez que la terapia se interrumpe (8). Tras un minucioso trabajo en el que se fueron realizando mediciones seriadas del tamaño del reservorio, y su estabilidad en diferentes pacientes, fue también quedando claro que la vida media del reservorio de células latentemente infectadas era más larga de lo previsto, 44 meses, lo que hacía poco realista el objetivo de erradicación al ser teóricamente necesarios 70 años para eliminar completamente esta población con TAR (9;10). Adicionalmente el reservorio no solo es muy estable, sino que constituye un auténtico archivo de todas las variantes que han estado circulando incluyendo las mutantes de resistentes

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seleccionadas en el contexto del TAR (11), lo que implica que las mutantes resistentes de VIH pueden dejar de circular mayoritariamente si se reduce la presión farmacológica por un cambio de medicación, pero no desaparecen ya que está muy probablemente representada en el reservorio y pueden emerger si se producen las circunstancias precisas.

residual aumentando la potencia del TAR (18), lo que apoyaría la hipótesis de que la viremia residual no proviene de ciclos de replicación sino, muy posiblemente, de la simple liberación de partículas por las células del reservorio latentemente infectado (figura 1).

El umbral de 50 copias/mL

Una vez iniciado el TAR, el objetivo actual de todas las recomendaciones clínicas es lograr la supresión completa de la replicación del virus lo que equivale a una carga viral indetectable, menos de 50 copias de ARN de VIH por mL de plasma según la mayoría de técnicas disponibles, (12;13), lo que se consigue habitualmente en un plazo de 12-24 semanas. Este umbral técnico de 50 copias/mL podría coincidir con un umbral biológico por debajo del cual no se produce auténtica replicación y evolución del virus. Ante la proporción cada vez mayor de pacientes que se encuentra en esta situación surge la pregunta de hasta cuánto tiempo va a ser posible mantener el control virológico teniendo en cuenta la alta capacidad de variabilidad del virus, en otras palabras ¿es posible mantener a los pacientes con tratamiento antiretroviral indefinidamente? o, por el contrario, la generación de mutaciones de resistencias es un fenómeno inexorable que tarde o temprano resultará en fallo terapéutico y progresión de la enfermedad. La optimización de las técnicas de detección y cuantificación de virus basadas en biología molecular ha supuesto un avance muy valioso para el estudio de la infección por VIH y el manejo de los pacientes (14). La sensibilidad de las técnicas diagnósticas estandarizadas para la determinación de la CVP ha sido hasta recientemente de 50 copias/mL de plasma. En el laboratorio de investigación se han realizado modificaciones de estas técnicas para aumentar la sensibilidad y llegar a detectar una sola copia (Single Copy Assay, SCA)(15). El SCA se basa fundamentalmente en utilizar un mayor volumen de plasma seguido de concentración de partículas por ultracentrifgación, extracción de ácidos nucléicos y RT-PCR en tiempo real con sondas fluorecentes en una laboriosa combinación (15). Cuando se han realizado estas técnicas ultrasensibles en pacientes en TAR y con CVP estándar indetectable, se ha podido documentar presencia de viremia de bajo nivel en la mayoría de los casos (7). La hipótesis de que esta viremia residual pudiera tratarse de auténtica replicación viral de bajo nivel por actividad subóptima del tratamiento de combinación ha sido investigada en diversos estudios de intensificación en los que se administran antiretrovirales adicionales, pertenecientes a distintas familas, y se mide mediante SCA el posible impacto de esta intensificación en la reducción de la viremia residual (16-18). Los resultados de estos estudios de intensificación confirman en su mayor parte que no es posible disminuir la viremia

Replicación

Liberación

Figura 1: La interpretación más aceptada de la viremia residual (15-20%), circunstancia que limitaba su significación clínica. Las guías clínicas y bioquímicas Año 1999

La National Academy of Clinical Biochemistry publicó en el año 1999 una recomendación sobre el uso de los biomarcadores de los SCA; esta fue la primera guía que propuso el uso sistemático de las troponinas (Tn) cardíacas en la práctica clínica y de laboratorio (3). La guía propuso el uso de dos límites de decisión clínica para la concentración de Tn en la evaluación de los SCA: un límite superior de referencia que producía resultados diagnósticos equivalentes,

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aproximadamente, a los que hubieran obtenido midiendo CK MB y un límite inferior que permitía identificar a pacientes con SCA, CK MB negativa y Tn por encima de este límite inferior a los que se clasificó como SCA con “lesión miocárdica mínima”. Año 2000

En el año 2000, diferentes sociedades cardiológicas recomendaron conjuntamente el uso de la medida de Tn como el biomarcador de elección para la evaluación de los SCA y el diagnóstico del IAM. La recomendación era que se estableciera el diagnóstico de IAM cuando, en el contexto clínico de sospecha de isquemia coronaria, un paciente presentara un valor de Tn superior al del percentil 99 (p99) de la población de referencia (4). La recomendación se recoge en la tabla I. La guía del año 2000 venía a reconocer la demostrada cardioespecificidad de la medida de Tn, característica sobre la

Tabla I. Criterios bioquímicos para el diagnóstico del infarto de miocardio*.

Un paciente presenta un infarto agudo de miocardio si durante las primeras 24 horas de un episodio clínico de isquemia presenta: • Una concentración máxima de troponina T o troponina I superior al límite de decisión clínica, o sea, al percentil 99 de la población de referencia, en al menos en una ocasión durante el episodio. Se recomienda que el percentil 99 se obtenga con una imprecisión total, medida como coeficiente de variación, inferior al 10%. • Una concentración máxima de creatina cinasa MB, preferiblemente medida como concentración de masa, superior a: 1. El percentil 99 de la población referencia, al menos en 2 ocasiones durante el episodio. Para que los valores de CKMB puedan considerarse diagnósticos deben mostrar un perfil de aumento o descenso. 2. El doble del valor de referencia poblacional (el percentil 99 u otro), al menos en 1 ocasión durante el episodio clínico. Esta última definición se corresponde a la recomendada por la organización Mundial de la Salud en sus guías de 1971 y 1979. *Criterios publicados simultáneamente en J Am Coll Cardiol 2000; 36:959-69 (referencia 4 del trabajo) y Eur Heart J 2000; 18:1502-13.

que se basan la especificidad, sensibilidad y precocidad diagnósticas actuales del IAM. Aunque los primeros métodos para medir Tn se habían desarrollado a principio de los años 90, se tardó una década en asumir que cuando un paciente con SCA presentaba un aumento de concentración de Tn, aunque no existiera aumento de los marcadores “clásicos” como CK MB o mioglobina, no se trataba de un “falso positivo” para la Tn, sino de un “verdadero positivo” para el diagnóstico de IAM y un “falso negativo” para CKMB o mioglobina. La evolución clínica confirmaba que estos pacientes presentaban mayor proporción de muerte cardiovascular o por otras causas y de nuevos IAM y requerían más revascularización. La consecuencia implícita de estas observaciones era que la medida de CK MB o mioglobina aportaba menos valor a la evaluación de los SCA que la de Tn y que medir Tn simultáneamente con CK MB o mioglobina no era útil. Basándose en estos datos, en la guía del año 2000 no se recomendaba el uso de mioglobina como biomarcador para evaluar los SCA y sólo se recomendaba la medida de CK MB, preferentemente su concentración de masa, si no era posible medir Tn. Sin embargo, la recomendación del año 2000 establecía una condición que los métodos para medir Tn no podían cumplir con facilidad. Dada la naturaleza del diagnóstico diferencial a establecer (IAM, otros tipos de SCA o no SCA) y las consecuencias en el manejo clínico del paciente derivadas del mismo, la calidad analítica de la medida de Tn debía ser máxima. Esta máxima calidad analítica se concretaba en la recomendación de que el valor diagnóstico, o sea el del p99 de referencia, se obtuviera con una imprecisión total igual o inferior al 10%. Tanto en el año 2001 como en la actualidad pocos métodos para medir Tn satisfacen este requisito analítico tal como se muestra en la tabla II que ha sido producida por el Committee on Standardization of Cardiac Markers Damage de la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) y que puede consultarse en la dirección que se cita. Los datos que figuran en la misma son los proporcionados por las compañías que comercializan los métodos y evaluaciones independientes han demostrado que suelen representar un valor óptimo, ya que se han obtenido en condiciones de evaluación muy controladas, no siempre representativas de las que se dan en el día a día del laboratorio asistencial. La consecuencia de que muchos métodos no puedan medir el valor del p99 con una imprecisión igual o inferior al 10%, es que en la práctica clínica se utiliza como valor diagnóstico aquel que se mide con el 10% de imprecisión; como este valor es superior al del p99 existe un grupo de pacientes con valores de Tn entre el p99 y el que se mide con el 10% de imprecisión que son clasificados como no afectos de IAM. Aparte de ello, los fabricantes han desarrollado diferentes generaciones de los métodos para mejorar su límite de detección y, en consecuencia, bajo una misma denominación pueden

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Tabla II. Características analíticas de los métodos actuales para medir troponinas (Tn) I y T cardíacas.

Fabricante, instrumento, método (generación)

Límite de detección (µg/L)

Tn en el percentil 99 (µg/L)

0,02

0,04

15

0,16