REVISTA ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA

PUBLICACION DE LA ASOCIACION ARGENTINA DE MICROBIOLOGIA Aparece en Biological Abstracts, Chemical Abstracts, Veterinary Bulletin, Index Veterinario, EMBASE (Excerpta Medica) Medline (Index Medicus), Tropical Diseases Bulletin, Abstracts on Hygiene and Communicable Diseases, Literatura Latinoamericana en Ciencias de la Salud (LILACS), Periódica, LATINDEX, SciELO, Science Citation Index Expanded y Redalyc. DIRECTORA Elsa C. Mercado

Instituto de Patobiología - INTA

SECRETARIO DE REDACCIÓN José A. Di Conza Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA - CONICET Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas - UNL

COMITÉ EDITOR Alicia I. Arechavala

Gerardo A. Leotta

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Inés E. García de Salamone

Claudia I. Menghi

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Hospital de Clínicas - Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA

Héctor R. Morbidoni

Ana M. Jar

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Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA

Silvia Carla Predari

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ASESORES CIENTÍFICOS C. Bantar J. C. Basilíco M. I. Berría H. M. Bianchini N. Binsztein M. M. Bracco   R. Campos G. Carballal A. Cataldi

J. J. Cazzulo S.R. Costamagna C. Coto M. D’ Aquino R. de Torres A. H. Frade A. Gentile A. Giri J. E. González

S. González Ayala N. Leardini H. Lopardo W. P. Mac Cormack D. Masih M. Mollerach R. Negroni F. Nicola T. Orduna

R. Raya V. Ritacco H. R. Rodríguez A. P. de Ruiz Holgado A. Schudel L. Scolaro F. Sesma R. Soloaga H. Terzolo G. Vaamonde

ASESORES EN EL EXTERIOR A. Amoroso (Bélgica) M. Gottschalk (Canadá) A. Restrepo (Colombia) J. Arbiza (Uruguay) R. Guerrero (España) G. San Blas (Venezuela) J. A. Ayala (España) M.J. Mendes Giannini (Brasil) G. Schmunis (EE.UU.) P. Feng (EE.UU.) M. Philipp (EE.UU.) A. Steinbüchel (Alemania) E. García López (España) F. Queiroz Telles (Brasil) M. Tolmasky (EE.UU.) J. Vila Estape (España) Secretaría: Deán Funes 472, C1214AAD Buenos Aires; Tel/FAX: 54-11-4932-8858, 54-11-4932-8948; E-mail: [email protected], http://www.aam.org.ar

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Franqueo Pagado Concesión Nº 4195 Tarifa Reducida Concesión Nº 628

ISSN 0325-7541 1 Revista Argentina de Microbiología (2008) 40: ---

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VOLUMEN 43 Nº 4  OCTUBRE-DICIEMBRE DE 2011

ÍNDICE EDITORIAL Primer simposio de virología veterinaria en 2011: Año veterinario mundial A. M. Jar MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS Importancia del estudio del balance del contenido vaginal (BACOVA) en el control preventivo de las trabajadoras sexuales R. Bologno, Y. M. Díaz, M. C. Giraudo, R. Fernández, V. Menéndez, J. C. Brizuela, A. A. Gallardo, L. A. Álvarez, S. G. Estevao Belchior *Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis de cepas de referencia usadas para el diagnóstico de leptospirosis en Argentina M. E. Paván, B. Brihuega, M. J. Pettinari, F. Cairó Efecto de la temperatura sobre la viabilidad de larvas de Trichinella spiralis V. R. Randazzo, L. F. La Sala, S. R. Costamagna *Detección del virus papiloma humano (HPV) y citología de Papanicolaou en mujeres de bajos recursos de la ciudad de Posadas, Misiones, Argentina I. Badano, R. W. Pedrozo, L. S. Ruíz Díaz, J. A. Galuppo, M. A. Picconi, R. H. Campos, J. D. Liotta Infección diseminada por Penicillium marneffei en un paciente HIV positivo. Primera observación en la República Argentina G. Santiso, V. Chediak, E. Maiolo, M. T. Mujica, J. San Juan, A. Arechavala, R. Negroni *Estudio genómico de cepas argentinas de Herpesvirus equino 1 N. A. Fuentealba, G. H. Sguazza, M. L. Eöry, A. R. Varela, M. R. Pecoraro, C. M. Galosi

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MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL Métodos para la detección de Agrobacterium a partir de muestras de material vegetal, suelo y agua A. M. Alippi, A. C. López, P. A. Balatti 278 *Respuesta de plántulas inoculadas con Enterobacter spp. como un modelo de agricultura alternativa Y. E. Morales-García, D. Juárez-Hernández, C. Aragón-Hernández, M. A. Mascarua-Esparza, M. R. Bustillos-Cristales, L. E. Fuentes-Ramírez, R. D. Martínez-Contreras, J. Muñoz-Rojas 287 ARTÍCULO ESPECIAL Bacillus anthracis: una mirada molecular a un patógeno célebre M. E. Paván, M. J. Pettinari, F. Cairó, E. E. Paván, A. A. Cataldi

294

IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS Micorrizas arbusculares: asociaciones simbióticas e indicadores de calidad ambiental en sistemas de cultivos extensivos C. B. Nardini, L. P. Di Salvo, I. E. García de Salamone 311 CARTAS AL EDITOR *Aerococos: difíciles de hallar y de clasificar M. Rasmussen Respuesta al Dr. Rasmussen A. L. Leite, A. Vinhas-da-Silva, L. Felicio, A. Vilarinho, G. Ferreira

312

Índice general de volumen 43 Índice de temas Índice de autores Agradecimiento a los revisores Nuevas instrucciones para los autores Guía para la preparación de los manuscritos

314 318 322 325 326 331

* En inglés

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2

Revista Argentina de Microbiología (2008) 40: ---

VOLUMEN 43 Nº 4  OCTOBER-DECEMBER 2011

INDEX

EDITORIAL First Veterinary Virology Symposium in 2011: World Veterinary Year A. M. Jar CLINICAL MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASES Importance of studying the balance of vaginal content (BAVACO) in the preventive control of sex workers R. Bologno, Y. M. Díaz, M. C. Giraudo, R. Fernández, V. Menéndez, J. C. Brizuela, A. A. Gallardo, L. A. Álvarez, S. G. Estevao Belchior *Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis of reference strains used for the diagnosis of leptospirosis in Argentina M. E. Paván, B. Brihuega, M. J. Pettinari, F. Cairó Effect of temperature on the viability of Trichinella spiralis larvae V. R. Randazzo, L. F. La Sala, S. R. Costamagna *Human papillomavirus (HPV) detection and Papanicolaou cytology in low-resource women in Posadas city, Misiones, Argentina I. Badano, R. W. Pedrozo, L. S. Ruíz Díaz, J. A. Galuppo, M. A. Picconi, R. H. Campos, J. D. Liotta Disseminated infection due to Penicillium marneffei related to HIV infection. First observation in Argentina G. Santiso, V. Chediak, E. Maiolo, M. T. Mujica, J. San Juan, A. Arechavala, R. Negroni *Genomic study of Argentinean Equid herpesvirus 1 strains N. A. Fuentealba, G. H. Sguazza, M. L. Eöry, A. R. Varela, M. R. Pecoraro, C. M. Galosi

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263 268 273

INDUSTRIAL AND ENVIRONMENTAL MYCROBIOLOGY Methods for the detection of Agrobacterium from plant, soil and water samples A. M. Alippi, A. C. López, P. A. Balatti

278

SPECIAL ARTICLE Bacillus anthracis: a molecular look at a famous pathogen M. E. Paván, M. J. Pettinari, F. Cairó, E. E. Paván, A. A. Cataldi

287

MICROBIOLOGICAL IMAGES Arbuscular mycorrhiza: symbiotic association and environmental quality indicators in extensive crop-systems C. B. Nardini, L. P. Di Salvo, I. E. García de Salamone *Growth response of maize plantlets inoculated with Enterobacter spp. as a model for alternative agriculture Y. E. Morales-García, D. Juárez-Hernández, C. Aragón-Hernández, M. A. Mascarua-Esparza, M. R. Bustillos-Cristales, L. E. Fuentes-Ramírez, R. D. Martínez-Contreras, J. Muñoz-Rojas

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LETTERS TO THE EDITOR *Aerococci: hard to find and classify M. Rasmussen Reply to Dr. Rasmussen A. L. Leite, A. Vinhas-da-Silva, L. Felicio, A. Vilarinho, G. Ferreira

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General index of volume 43 Subject index Index by author Acknowledgement to reviewers New instructions to authors Manuscript preparation checklist

314 318 322 325 326 331

* In English

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Editorial

243 ISSN 0325-7541 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 243-245

EDITORIAL

Primer Simposio de Virología Veterinaria en 2011: Año Veterinario Mundial First Veterinary Virology Symposium in 2011: World Veterinary Year En Buenos Aires, entre el 26 y el 29 de setiembre, tuvo lugar el X Congreso Argentino de Virología (CAV 2011). La presidente, Dra. Elsa Baumeister, invitó a participar del Comité Organizador a representantes del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) y de las Facultades de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires, la Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires y la Universidad Nacional de La Plata. Nos planteamos entonces el desafío de organizar el I Simposio de Virología Veterinaria en el marco del CAV 2011. Este ha sido un año de celebración para quienes trabajamos en Ciencias Veterinarias: La enseñanza de la veterinaria en el mundo nace 250 años atrás, el 4 de agosto de 1761, con la fundación de la antigua Escuela Veterinaria de Lyon, Francia, actualmente devenida en el VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon. Pocos años después, en 1764, se funda la Escuela Veterinaria de Alfort en las puertas de París. Junto con estas escuelas se establece la propia profesión veterinaria. El artífice es Claude Bourgelat, entonces director de la Academia de Equitación de Lyon, quien recibe del rey Luis XV la autorización y los medios para crear “una escuela donde se enseñara públicamente los principios y los métodos de curar las enfermedades del ganado” (6). Desde entonces, el mundo ha crecido y evolucionado y de igual forma lo han hecho los objetivos y alcances de la profesión. El 7 de mayo de 2008, un grupo de trabajo formado por representantes de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), el Ministerio de Alimentación, Agricultura y Pesca de Francia, el Consejo Superior del Colegio de Veterinarios de ese país, la Federación de Sindicatos Veterinarios de Francia, la Academia Veterinaria Francesa y cinco Facultades de Veterinaria francesas, se constituyen en el “Comité Vet2011”. Este grupo logra que 2011 sea declarado “Año Veterinario Mundial (Vet2011)” para celebrar los “250 años de ciencia veterinaria al servicio de la salud de los animales y de los seres humanos” (15). Numerosas instituciones de alcance internacional, como la Asociación Mundial Veterinaria y la Asociación Internacional de Estudiantes de Veterinaria; de alcance regional, como la Asociación Panamericana de las Ciencias Veterinarias (Panvet) y otras instituciones de Europa, Asia y África, así como diversas asociaciones nacionales de veterinaria, se han adherido a la celebración del Año Veterinario Mundial en los cinco continentes. Se han establecido comités nacionales “Vet2011” en 57 países, incluida la Argentina, representada por el Prof. Marcelo Míguez, decano de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UBA. El principal objetivo es recordar que “el veterinario, además de ser el médico de los animales y el defensor de su bienestar, es hoy día una pieza clave de la salud pública por el papel que desempeña en la lucha contra el hambre en el mundo, la lucha contra las zoonosis, la vigilancia de la calidad y la inocuidad de los alimentos, la investigación biomédica y la protección del medio ambiente y de la diversidad biológica” (15). La Asociación Veterinaria Mundial (http://www.worldvet.org/node/9) considera tres temas principales de incumbencia para la profesión: salud animal, bienestar animal y salud pública, que aproximan y unifican la salud animal con la salud humana. Un cuarto tema no menos importante es la educación veterinaria, que debe garantizar el nivel de conocimientos y la actualización permanente que requiere la profesión. Además de la enseñanza formal de grado, de postgrado y de educación continua que ofrecen las universidades y otras instituciones educativas, las sucesivas ediciones del Congreso Argentino de

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 243-245

Virología han constituido siempre un ámbito de discusión y actualización científica, un sitio de intercambio entre virólogos de diferentes especialidades, del área pública y privada, del país y del extranjero. En este marco, durante una jornada se llevó a cabo el I Simposio de Virología Veterinaria, al que concurrieron numerosos investigadores, profesionales independientes, docentes, becarios y alumnos de veterinaria y carreras afines. El evento se vio enriquecido, además, por el convenio firmado recientemente entre la Asociación Argentina de Microbiología y la Sociedad de Medicina Veterinaria, que igualó las condiciones de acceso de los miembros de ambas instituciones. Entre una larga lista de virosis animales que despiertan nuestro interés, se seleccionaron finalmente cinco enfermedades virales de actualidad e impacto sanitario, económico y social, tanto en la esfera nacional como internacional. Se invitó a especialistas de reconocida trayectoria, quienes participaron de cuatro mesas redondas y una conferencia que formaron parte del simposio. En la mesa 1, los Dres. María Barrandeguy, Esteban Durante y Mario López Oliva disertaron sobre arteritis viral equina, e hicieron referencia al brote ocurrido a fines de marzo de 2010 y originado a partir del semen importado de Holanda para inseminar yeguas de salto (2); a su impacto sobre la producción equina (8) y a la intervención del organismo oficial de control (4). En la mesa 2, los Dres. Ana Riviere (FAO), José La Torre y Eduardo Maradei expusieron sobre la situación de la fiebre aftosa en Argentina y Sudamérica; sobre los planes de control y erradicación en la Argentina, basados en la vacunación sistemática (7, 9), y sobre los programas regionales que se están aplicando particularmente en la región andina (13). En la mesa 3, la Dra. Karina Trono y el Dr. Eduardo Esteban propusieron dos abordajes diferentes para controlar la leucosis bovina, estimulando la formación de rodeos infectados con baja carga proviral en sangre a partir de la utilización de una variante viral competitiva (14), o intervenir genéticamente mediante la selección de animales resistentes, identificados por genotipado de BoLA (5). En la mesa 4, los Dres. Ana Bratanich, María Barrandeguy, Ariel Pereda y Carlos Perfumo mostraron los avances en el país en la detección del virus de influenza en perros (3), caballos (1), aves silvestres (12) y cerdos (11), y debatieron sobre las metodologías diagnósticas utilizadas y la necesidad de implementar o sostener los sistemas de vigilancia epidemiológica. Para finalizar el simposio, el Dr. Anselmo Odeón disertó sobre la detección y caracterización molecular de herpesvirus bovino tipo 4 aislado a partir de casos de abortos o problemas reproductivos (10). El rol de los veterinarios, desde el laboratorio hasta las instituciones de fiscalización, desde el trabajo diario con los productores hasta en la planificación de políticas oficiales, es crucial para el control y la erradicación de todas estas enfermedades en la República Argentina. Todos estos temas pueden resumirse en el lema del Vet2011 “Veterinarios para la salud, veterinarios para la alimentación, veterinarios para el planeta”. ANA M. JAR Cátedra de Inmunología Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad de Buenos Aires, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. E-mail: [email protected]

1. Barrandeguy M. Influenza equina en Argentina en los últimos 10 años. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV4-4. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 29. 2. Barrandeguy M. Re-emergencia de arteritis viral equina – Año 2010. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV1-1. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 25-6. 3. Bratanich AC. Influenza canina. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV4-2. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 29. 4. Durante E. Procedimientos sanitarios realizados durante el brote de arteritis viral equina del año 2010. X Congreso

Argentino de Virología, Resumen MRSV1-1. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 26. 5. Esteban EN. La alternativa de control del BLV por medio de la selección genética de los bovinos resistentes. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV3-2. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 28. 6. Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires. Disponible en línea en: http://www.fvet.uba. ar/vet_mundial/historia.php 7. La Torre, JL. Procedimientos integrados para el control y erradicación de la fiebre aftosa en la República Argentina.

Editorial

8. 9.

10. 11.

X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV2-3. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 27. López Oliva M. La estrategia es el control. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV1-2. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 26. Maradei, E. Situación de la fiebre aftosa en Argentina y Sudamérica, el rol del laboratorio en los programas de control y erradicación. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV2-2. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 27. Odeón AC. Herpesvirus bovino tipo 4: una nueva enfermedad? X Congreso Argentino de Virología, Resumen PLSV. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 12. Perfumo CJ. Nuevos avances sobre la influenza porcina en la Argentina. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV4-1. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 28.

245 12. Rimondi A, Craig MI, Uhart M, Pérez AA, Zaccagnini ME, La Sala L, Decarre J, Olivera V, Dibárbora M, Vagnozzi A, Vera F, Rojas F, Song H, Sorrell EM; Pérez DR, Pereda A. Estudios sobre influenza aviar en aves silvestres en Argentina. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV4-3. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 29. 13. Riviere A, Rivera A, Díaz T, Del Barrio L. Enfoque FAO para el control progresivo de la fiebre aftosa (CP-FA) y su aplicación en la región andina. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV2-1. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 26-7. 14. Trono K. Leucosis bovina: alternativas de control. X Congreso Argentino de Virología, Resumen MRSV3-1. Rev Argent Microbiol 2011; 43: Supl 1: 27-8. 15. Vet2011. World Veterinary Year. Disponible en línea en: http://www.worldvet.org/en_ Vet2011_info-oct11.pdf

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43:0325-7541 246-250 ISSN Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 246-250

ARTÍCULO ORIGINAL

Importancia del estudio del balance del contenido vaginal (BACOVA) en el control preventivo de las trabajadoras sexuales ROMINA BOLOGNO1, YANINA M. DÍAZ1, MARÍA C. GIRAUDO2, ROSA FERNÁNDEZ2, VIVIANA MENÉNDEZ2, JUAN C. BRIZUELA2, ADRIANA A. GALLARDO1, LAURA A. ÁLVAREZ1, SILVIA G. ESTEVAO BELCHIOR1* Centro Regional de Investigación y Desarrollo Científico-Tecnológico (CRIDECIT), Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, Ciudad Universitaria, km 4, (9000) Comodoro Rivadavia; 2Subsecretaría de Salud de la Municipalidad de Comodoro Rivadavia, Pellegrini 630, (9000) Comodoro Rivadavia, Chubut, Argentina. *Correspondencia. E-mail: [email protected]

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RESUMEN El objetivo de este trabajo fue estudiar a un grupo de 229 trabajadoras sexuales de Comodoro Rivadavia (Chubut), atendidas en centros públicos de salud de dicha ciudad, mediante la aplicación del método conocido como balance del contenido vaginal (BACOVA). Este método comprende el estudio morfológico de la microbiota vaginal, como así también de la reacción inflamatoria. Incluye el análisis del contenido vaginal en fresco y por tinciones de Gram y de Giemsa, de modo de integrar la exploración de todo el panorama biológico. El 35,37 % de estas mujeres presentó microbiota normal (MN); el 15,72 %, microbiota intermedia (MI); el 23,14 %, vaginosis bacteriana (VB) y el 10,48 %, vaginitis microbiana inespecífica (VMI). Los casos de vaginitis por levaduras y por Trichomonas vaginalis comprendieron el 8,30 % y 6,99 % de las mujeres, respectivamente. Se observó el desplazamiento de la MN hacia una MI, que se correspondió con el predominio de bacterias corineformes. Por otra parte, no se reconoció un marcado desequilibrio del contenido vaginal ante la colonización e infección por levaduras o por T. vaginalis: el 48 % de los casos de estas vaginitis convencionales no presentaron reacción inflamatoria vaginal (RIV). El 24,89 % de los casos de MN presentaron una significativa RIV, y en más del 50 % de las mujeres se diagnosticaron disfunciones vaginales en ausencia de sintomatología. Estos resultados se podrían asociar a un incremento del riesgo gineco-obstétrico, lo que afecta la salud sexual y reproductiva de la población estudiada. Palabras clave: infecciones de transmisión sexual, vaginosis bacteriana, trabajadoras sexuales

ABSTRACT Importance of studying the balance of vaginal content (BAVACO) in the preventive control of sex workers. The aim of this work was to study the vaginal microenvironment in sex workers from Comodoro Rivadavia, Chubut. For that purpose, BAVACO procedures were applied. A total of 229 female sex workers attended public health centers. Vaginal secretions were analyzed by Gram and Giemsa stains. The following results were obtained: normal microbiota 35.37 %, intermediate microbiota 15.72 %, bacterial vaginosis 23.14 %, microbial nonspecific vaginitis, Donders’ “aerobic vaginitis” 10.48 %, yeast vulvovaginitis 8.30 %, and trichomoniasis 6.99 %. The intermediate microbiota was characterized by a decrease in the number of lactobacilli and the presence of diphtheroid bacilli cell types. The population studied shared increased values of vaginal dysfunctions. These results are considered risk factors for obstetric and gynecologic diseases. Key words: sexually transmitted infections, bacterial vaginosis, sex workers

INTRODUCCIÓN La microbiota vaginal normal contribuye en forma significativa a mantener el estado fisiológico del tracto genital femenino, lo cual asegura la función óptima de la actividad sexual y reproductiva. Entre otros aspectos, contribuye a controlar la colonización de este tracto por microorganismos de otros nichos ecológicos humanos y por patógenos externos. La microbiota vaginal muestra un alto grado de complejidad: más de 30 géneros y 70 especies se detectan en mujeres en edad fértil, con predominio de Lactobacillus spp. (hasta 18 especies diferentes). En menor proporción se presenta una gran variedad de es-

pecies correspondientes a géneros muy diversos; se trata en su mayoría de microorgnismos anaerobios (8, 9, 18). El contenido vaginal está sujeto a variaciones endógenas, fundamentalmente relacionadas con el factor hormonal (estrógenos) y la respuesta inmune local de la mucosa vaginal. Es también influenciado por la acción de factores externos. El desbalance de la microbiota vaginal es frecuente en la mujer en edad fértil, y en un 15 a 20 % de los casos ocasiona una disfunción vaginal, que afecta la salud sexual y reproductiva (1, 6). En el marco amplio del síndrome de disfunción vaginal (DV) se incluyen patologías con características propias, como la vaginosis bacteriana (VB), la vaginitis microbiana

Contenido vaginal en trabajadoras sexuales

inespecífica (VMI), la vulvovaginitis por levaduras (VVL) y la vaginits por Trichomonas vaginalis (VTv) (5). Con excepción de la VTv, las otras no son consideradas infecciones de transmisión sexual (ITS), pero sí están vinculadas, en forma aún no definitivamente aclarada, con el aumento de la intensidad de la actividad sexual. En el caso de las trabajadoras sexuales, constituye un factor definitorio (6). La VB cursa de manera asintomática en el 50 % de los casos, por la incapacidad de las bacterias asociadas a esta disfunción de producir factores quimiotácticos para leucocitos y la evasión de la respuesta inmune (10, 14, 18). En su definición típica, la VB muestra un valor numérico de Nugent (VN) de 7 o más y ausencia de reacción inflamatoria vaginal (RIV) (12). Este trastorno aumenta significativamente el riesgo de infección y la capacidad de transmisión del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y de otras ITS. En la mayoría de los casos, el estado de VB revierte sin requerir tratamiento específico. Si se mantiene, genera la posibilidad de que exista colonización vaginal por microorganismos de la microbiota habitual intestinal, bucal, de piel o ambiental, y una alta predisposición a las ITS (1, 2). La alteración intermedia o anormal de la microbiota vaginal, con un VN de 4 a 6, también aumenta el riesgo de colonización de esta mucosa por bacterias de otros nichos. Si esta situación persistiera en el tiempo manteniendo su intensidad, se podría producir una RIV, que genera el síndrome de VMI (1). La VMI responde de manera irregular al tratamiento convencional y, como en el caso de la VB, aumenta significativamente el riesgo de adquirir ITS (1, 5, 6). En principio y teniendo en cuenta tan solo los riesgos asociados a estas dos disfunciones (VB y VMI), se hace necesario el control del balance del contenido vaginal (BACOVA) en forma prioritaria, como medida de prevención para la trabajadora sexual, quien debe conocer y tratar su riesgo actual (1, 11). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la frecuencia de aparición de DV en las trabajadoras sexuales de Comodoro Rivadavia, Chubut, Argentina, mediante el control del BACOVA. Este análisis, basado en el valor numérico de Nugent con la corrección de Lanzafame y la evaluación de la RIV, genera un alto valor predictivo para el diagnóstico de VB y de VMI.

MATERIALES Y MÉTODOS El diseño epidemiológico fue observacional. Se desarrolló un estudio de corte transversal de una población de mujeres que asistieron a centros públicos de salud de la ciudad de Comodoro Rivadavia, con el fin de efectuar el control periódico bimestral para tramitar la libreta sanitaria. Contar con este documento es un requisito obligatorio para desarrollar actividad laboral en locales nocturnos, como boites o cabarets, whisquerías y clubes, donde alternan con público de sexo masculino (15). Se confeccionó una ficha epidemiológica para documentar los siguientes datos de las pacientes: edad, día del ciclo, embarazos,

247 cirugías ginecológicas y abortos; uso de drogas anticonceptivas (AT), de preservativos, de dispositivos intrauterinos (DIU) y de duchas vaginales; también se registró la presencia o ausencia de síntomas. Se siguieron integralmente las pautas del Manual de Procedimientos BACOVA (11) y se obtuvieron muestras para el aislamiento y la identificación de Neisseria gonorrhoeae y de levaduras. La detección de N. gonorrhoeae está indicada específicamente en estas mujeres, por requerimiento clínicoepidemiológico. Utilizando un espéculo estéril se tomaron 2 muestras de secreción del fondo de saco vaginal y una del endocérvix, introduciendo secuencialmente 3 hisopos estériles. El primero se colocó en un tubo que contenía 0,5 ml de solución fisiológica estéril, para el cultivo de levaduras y el examen en fresco; el segundo se colocó en un tubo seco destinado a realizar el extendido para coloración con Gram y Giemsa; y el último hisopo se colocó en medio de transporte Stuart conservado a temperatura ambiente, para el cultivo de N. gonorrhoeae. El criterio de clasificación de los exudados vaginales, basado en la microscopía (11), fue el siguiente: frente a patrones microscópicos con un VN de 0 a 3 se consideró microbiota normal (MN); con VN de 4 a 6 se consideró microbiota intermedia (MI); y con VN de 7 a 10 se consideró vaginosis bacteriana. Los casos en los que se obtuvo un VN superior a 4 acompañado de reacción inflamatoria se interpretaron como vaginitis microbianas inespecíficas. El diagnóstico de la presencia de levaduras en el contenido vaginal se basó en la observación microscópica, el cultivo en agar Sabouraud, la formación de tubo germinativo y clamidosporas y las características de crecimiento en el agar cromogénico (CHROMagar Candida). Para el aislamiento de N. gonorroheae se empleó el medio Thayer Martin; las colonias morfológicamente compatibles se identificaron por los métodos bioquímicos convencionales (16). El análisis estadístico de los datos permitió establecer el grado de asociación entre los distintos factores que podrían predisponer al desplazamiento de la microbiota habitual hacia una MI, VB o VMI. Para ello se calculó el odds ratio (OR) con el 95 % de intervalo de confianza (IC 95 %) y la significación estadística (p), con corrección de Yates. Para el estudio se aplicó el test χ2 y para el análisis bivariado se utilizó el programa estadístico Instat v 2.02.

RESULTADOS Se analizaron 229 muestras de contenido vaginal de diferentes mujeres de entre 21 y 65 años, trabajadoras sexuales, que asistieron a un control sanitario. El 35,37 % de las mujeres (81 casos) presentaron microbiota normal. De éstas, 61 (26,64 % del total de mujeres estudiadas) no mostraron ningún criterio morfológico de anormalidad y las otras 20, si bien mantenían un balance normal de la microbiota vaginal, mostraron una RIV significativa. Este subgrupo de mujeres, como se discutirá más adelante, fueron inmediatamente sometidas a estudios complementarios. En 148 mujeres (64,63 % del total) se detectó un desplazamiento del balance de la proporción relativa de lactobacilos (disminución) y del resto de la microbiota vaginal. En 53 de ellas (23,14 % del total) se determinó VB típica, con ausencia de reacción inflamatoria. En el 15,72 % de las mujeres (36 casos) se detectó MI, con un VN de 4 a 6, sin RIV, subgrupo importante dado que se determinó, además, la presencia significativa de morfotipos extraños a expensas de bacterias corineformes. En estas mujeres

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se observaron cocobacilos gram positivos en empalizada y aislados, acompañados de una mínima o nula cantidad de lactobacilos. No se evidenció un aumento relativo de elementos gram variables (compatibles con Gardnerella) ni los morfotipos característicos de la microbiota anaeróbica, tampoco la presencia de células guía. El 10,48 % de las observaciones (24 casos) se correspondieron con VMI (VN mayor de 4, con RIV). En el 8,30 % del total de mujeres estudiadas (19 casos) se demostró la presencia de levaduras, que en todos los casos fueron identificadas como Candida albicans. En el 52,63 % de las mujeres portadoras de levaduras se detectó RIV; el 47,37 % de ellas presentaron VN anormal. En el 6,99 % de las mujeres (16 casos) se detectaron tricomonas, y se demostró RIV en el 68,75 % de estos casos. En este grupo de portadoras de tricomonas, el 56,25 % presentaron un VN anormal. Las levaduras y las tricomonas se reparten dentro del marco de los casos antes agrupados en función del VN y de la RIV. En ninguno de los casos se identificó N. gonorrhoeae. En la Tabla 1 se muestra la distribución de las mujeres estudiadas en función de la edad, la RIV y el VN asignado tras el análisis de los contenidos vaginales. Para cada grupo etario, entre el 64 % y el 84 % de los casos presentaron alguna alteración en el contenido vaginal. No se registraron diferencias significativas entre

los grupos etarios con respecto al número de casos con desbalance en el contenido vaginal (p > 0,05). Asimismo, entre los casos clasificados como VMI, el 30,9 % correspondió a mujeres mayores de 40 años (pre y posmenopáusicas). Por otra parte, del interrogatorio surgieron casos en los que existían síntomas que, por sus características, no son considerados en la actualidad razón de consulta por las mujeres. En función de ello, se delimitó un grupo de mujeres sintomáticas por la presencia de estos factores en la ficha epidemiológica individual. Un porcentaje significativo de las DV, en las que se incluyeron VB, VMI, VVL y VTv, cursaron de manera asintomática (Tabla 2). El análisis estadístico de la asociación entre las variables AT, DIU y edad menopaúsica y las modificaciones en la microbiota habitual mostró que el desplazamiento observado no se asoció significativamente con ninguno de estos factores. Además, se cotejaron los datos obtenidos en este estudio con los registrados en otras mujeres que no son trabajadoras sexuales, que concurrieron a centros de atención de salud de la ciudad de Comodoro Rivadavia para efectuar controles gineco-obstétricos regulares (3). Esa comparación mostró un grado de asociación significativo entre el trabajo sexual y el desplazamiento de la MN hacia una MI [OR 3,820 (IC95 % 1,422-10,302); p = 0,008].

Tabla 1. Distribución de casos de acuerdo a la edad, la reacción inflamatoria vaginal y el valor numérico asignado Edad n VN RIV (años) 0 - 9 Lpc de 10 a 19 Lpc

de 20 a 30 Lpc

21-25

32 15 22

0 - 3 4 - 6 7 - 10

22 11 13

10 2 4

0 2 5

26-30

22 9 17

0 - 3 4 - 6 7 - 10

14 5 13

5 2 1

3 2 3

31-35

14 8 11

0 - 3 4 - 6 7 - 10

11 6 8

3 2 1

0 0 2

36-40

11 6 11

0 - 3 4 - 6 7 - 10

10 5 9

1 1 1

0 0 1

41-45

13 8 8

0 - 3 4 - 6 7 - 10

7 5 7

5 2 1

1 1 0

46-50

3 6 4

0 - 3 4 - 6 7 - 10

2 4 4

1 1 0

0 1 0

51-65

3 3 3

0 - 3 4 - 6 7 - 10

3 2 1

0 1 2

0 0 0

n: número de casos, VN: valor numérico de Nugent, RIV: reacción inflamatoria vaginal, Lpc: leucocitos por campo.

Contenido vaginal en trabajadoras sexuales

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Tabla 2. Distribución de casos de disfunciones vaginales de acuerdo a la presentación de sintomatología Pacientes Pacientes Contenido vaginal n asintomáticas sintomáticas(1) Microbiota normal Microbiota intermedia Vaginosis bacteriana Vaginitis microbiana inespecífica Vulvovaginitis por levaduras Vaginits por Trichomonas vaginalis

81 36 53 24 19 16

65 28 50 17 10 13

16 8 3 7 9 3

Se consideraron sintomáticas las pacientes que presentaban dos o más de los signos y síntomas de la encuesta; n: número de casos (1)

DISCUSIÓN En el 23,14 % de las trabajadoras sexuales se diagnosticó VB típica. Si bien su origen etiológico aún se desconoce, como se expuso anteriormente es aceptado que el proceso se origina por una disfunción sistémica (1). En esta serie no se pudo relacionar este valor de prevalencia con el trabajo sexual, luego de comparar con otro grupo de mujeres. Sin embargo, este porcentaje muestra un considerable valor de riesgo en el grupo de mujeres objeto de estudio (7, 17). Asimismo, si bien la presencia de VB no mostró asociación con el trabajo sexual, el aumento de la MI sí estuvo estadísticamente asociado con la actividad de la población estudiada (p = 0,008). Este subgrupo de mujeres con MI define un estado intermedio, de gran incertidumbre diagnóstica, con predominio de los llamados morfotipos extraños (4). En los casos analizados se observaron mayoritariamente bacterias corineformes. Si bien se presentan estos morfotipos en la microbiota vaginal con frecuencias muy variables (13, 19), este perfil requerirá una etapa de investigación puntual, que debería incluir la identificación de estas especies y la determinación de su eventual participación en el desbalance vaginal. Asimismo, será necesario desarrollar un perfil de informe que corrija la expresión numérica convencional propuesta en el BACOVA. El estudio del grupo de mujeres de Comodoro Rivadavia, comparado con otras series de mujeres no trabajadoras sexuales (3) en las que no se ha informado la significativa asociación de morfotipos corineformes con la presencia de MI, justifica la profundización de este tema. El estudio de la RIV es el aspecto más importante a la hora de evaluar una patología vaginal para establecer conductas preventivas y/o terapéuticas en trabajadoras sexuales. Este estudio contribuye a la interpretación del estado real de la necesidad de implementar un tratamiento antimicótico ante la presencia de levaduras (detectadas por microscopía y/o cultivo) y en forma puntual, cobra gran importancia en aquellos casos que presentaron MN acompañada de una manifiesta RIV. Este subgrupo de

mujeres alcanzó al 24,89 % de aquellas que presentaron un valor numérico entre 0 y 3. Entre ellas se encuentran las que mostraron presencia de levaduras (en nuestro grupo, C. albicans) y aquellas que no evidenciaron la presencia de levaduras; en ambos casos se debe inexorablemente descartar una infección cervical o del tracto urogenital superior. El BACOVA no incorpora la toma del pH en su informe integral morfológico. La toma del pH, en el caso de un VN normal y una RIV significativa, ayuda en forma concreta a la interpretación. Un pH normal agrega valor predictivo positivo a la vulvovaginitis por levaduras, pero un pH elevado es un indicador de infección alta, con elevada probabilidad de presencia de clamidias. El BACOVA es de gran importancia en la protección inmediata del grupo de trabajadoras sexuales. En este estudio se refleja la necesidad de explorar racionalmente la incidencia de infecciones cervicales y del tracto urogenital superior (la de mayor frecuencia actual es la provocada por clamidias), con la finalidad de ofrecer el tratamiento adecuado y colaborar en la etapa preventiva. En estos casos, la edad es también un factor fundamental en las conductas de control. En mujeres jóvenes se podría orientar a una alta prevalencia relativa de clamidias; sin embargo, en mujeres de más de 45 años podrían estar involucradas causas iatrogénicas, alérgicas, atróficas o seniles. En el grupo de mujeres que superan los 40 años, la presencia de RIV debe ser estudiada con una profunda revisión clínica y alternativas de estudios de laboratorio complementarios, a efectos de determinar el origen de esa respuesta. Debido al hipoestrogenismo, estos últimos casos podrían presentar un desplazamiento de la microbiota habitual acompañada de reacción inflamatoria, que se designa como vaginitis atrófica. Descartado el origen infeccioso, estas situaciones requerirán un tratamiento y una conducta preventiva diferente (17). En el control y la atención primaria de la trabajadora sexual, el estudio de la RIV es un criterio fundamental en la toma de decisión respecto de conductas inmediatas, y en

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estos casos se deberían agotar los medios diagnósticos para establecer su etiología (1, 5). Con esta investigación se demuestra que mediante la aplicación de un estudio morfológico, factible en todo laboratorio habilitado del país, se pueden detectar las mujeres en riesgo gineco-obstétrico. Asimismo, en la población de trabajadoras sexuales esta metodología contribuye a establecer medidas preventivas en los casos de VB y VMI. Además, focaliza en aquellas mujeres que requieren de estudios accesorios inmediatos dirigidos a confirmar o descartar ITS típicas u otras infecciones bacterianas. Este procedimiento, de amplia factibilidad profesional y relación costo-beneficio altamente positiva, agrega el mayor valor predictivo positivo y negativo en el diagnóstico de patologías, a la vez que contribuye a la prevención de los riesgos que enfrentan las trabajadoras sexuales. El BACOVA debe incorporarse al estudio serológico convencional, para iniciar la consolidación de un perfil básico de la guía de procedimientos para control, la que debe ofrecerse a las trabajadoras sexuales para aumentar la capacidad de prevención propia y, de hecho, de la comunidad en la que ejercen su profesión. Agradecimientos: los autores agradecen al Programa de Educación Continua (PROECO) y al Programa de Salud Sexual y Reproductiva (PROSAR) de la Fundación Bioquímica Argentina, el integrar el Proyecto BACOVA, lográndose normalizar la metodología para el diagnóstico de disfunción vaginal en laboratorios de Comodoro Rivadavia, Chubut, Argentina, y la formación profesional (Tesinas de Grado) de alumnos de la carrera Bioquímica de la Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco.

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Recibido: 07/06/2011 – Aceptado: 27/09/2011

MLVA genotyping of Leptospira reference strains

251 ISSN 0325-7541 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 251-255

ARTÍCULO ORIGINAL

Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis of reference strains used for the diagnosis of leptospirosis in Argentina MARÍA E. PAVAN1*, BIBIANA BRIHUEGA2, 5, MARÍA J. PETTINARI3, FABIAN CAIRÓ1, 4 1 Biochemiq S.A., Laboratorio de Biología Molecular, Ciudad Autónoma de Buenos Aires; World Organisation for Animal Health (OIE) Leptospirosis Reference Laboratory, Instituto de Patobiología, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Hurlingham, Buenos Aires; 3Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, and 4Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 5Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Salvador, Pilar, Buenos Aires, Argentina. *Correspondence. E-mail: [email protected] 2

ABSTRACT Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by a spirochete that belongs to the genus Leptospira. In the last years, new methods, such as the PCR-based multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA), have been developed for the genotyping of leptospires. In the present work, the MLVA patterns for all reference strains used in Argentina for bovine, ovine, porcine, equine, caprine and canine leptospirosis diagnosis, as well as in human and wild animal diagnosis, were obtained. MLVA results are presented in such a way that they can be readily used for the identification of these strains by the simple and direct comparison of agarose gels. Making the use and interpretation of the MLVA for leptospires typing easier will help increase the use of this method as a routine procedure for human and animal diagnosis, for epidemiological studies, vaccine control and other applications. Key words: Leptospira interrogans, Leptospira kirschneri, Leptospira borgpetersenii, reference strains, MLVA, VNTR, genotyping

RESUMEN Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis de cepas de referencia usadas para el diagnóstico de leptospirosis en Argentina. La leptospirosis es una zoonosis de distribución global causada por una espiroqueta perteneciente al género Leptospira. En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos para la genotipificación de las leptospiras, entre ellos el denominado multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA). En este trabajo se obtuvieron los patrones de MLVA de todas las cepas de referencia utilizadas en la Argentina para el diagnóstico de leptospirosis en bovinos, ovinos, porcinos, equinos, caprinos y perros, y que también son utilizadas en el diagnóstico de leptospirosis en humanos y en animales salvajes. Los resultados del MLVA se muestran de manera tal que pueden ser fácilmente utilizados para la identificación de estas cepas por simple comparación visual de geles de agarosa. Al facilitar el uso y la interpretación del MLVA para la tipificación de leptospiras, se ayudará a difundir la utilización rutinaria de este método en el diagnóstico humano y animal, en estudios epidemiológicos y para el control de vacunas, entre otras aplicaciones. Palabras clave: Leptospira interrogans, Leptospira kirschneri, Leptospira borgpetersenii, cepas de referencia, MLVA, VNTR, genotipificación

INTRODUCTION Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by a spirochete that belongs to the genus Leptospira. The first classifications of pathogenic leptospires were serological, establishing serogroups and serovars through antigenic relationships between strains. Later, the genus Leptospira was divided into 20 species considering DNA relatednesses (2, 5, 7, 9, 13, 14, 17, 18, 21). Nowadays, serological and molecular classifications coexist, and due to the lack of correspondence between them, new Lepto-

spira strains should be characterized by both molecular and serological approaches (1, 6). In Argentina, ���������������������������������������� the reference method for serological diagnosis of leptospirosis is the microscopic agglutination test (MAT), which requires the maintenance of a collection of reference strains and the corresponding antisera (4). After many years of experience, the Argentine Permanent Scientific Commission for Leptospirosis has recommended a group of antigenic strains including Leptospira interrogans, Leptospira borgpetersenii and Leptospira kirschneri strains to be used for MAT in leptospirosis in

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cows, sheep, pigs, horses, goats and dogs (4). These strains are also used for MAT in human and wild animal leptospirosis, along with others that are used specifically in these cases. In the last years, new advances in the genotyping of leptospires have been made. Majed et al. (8) used an innovative PCR-based typing scheme, the multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA), for the molecular typing of L. interrogans. The authors examined a worldwide reference collection using variable-number tandem repeat (VNTR) loci, and defined 47 unique genotypes (8). Later, Slack et al. (16, 19) developed a different MLVA to examine L. interrogans reference strains, and clinical isolates from Australia. MLVA was successfully used for the identification of strains, even within the same serovar (11, 12, 16, 19). Salaün et al. (15) improved the previously described MLVA (8) to allow the typing not only of L. interrogans strains but also of strains belonging to two other pathogenic species, L. kirschneri and L. borgpetersenii. MLVA involves the analysis of multiple loci of VNTR, repeated DNA sequences of varying copy numbers that are generated by slipped strand mispairing during DNA replication (12, 20). The method consists in amplifying these variable length regions showing polymorphism to differentiate the repeat copy number through the size of the resultant amplicon. This technique is simple and easy to implement in a laboratory without sophisticated equipment. In this way, MLVA is useful for the proper identification of Leptospira strains and is ideal for epidemiological studies. However, the results obtained can be difficult to interpret using published data, because only raw copy numbers are usually reported. Therefore, calculations involving the size of each repeat, the flanking regions and the different possible numbers of repeats must be made in order to correctly interpret the molecular weights of the DNA fragments that result from the amplifications.

T����������������������������������������������� he aim of this work was to present the MLVA genotyping of reference strains used in Argentina for the diagnosis of leptospirosis, in such a way that the MLVA patterns can be readily used for the identification of these strains by the simple and direct comparison of agarose gel electrophoresis results.

MATERIALS AND METHODS The L. interrogans, L. borgpetersenii and L. kirschneri reference strains used in this study, including all strains recommended by the Argentine Permanent Scientific Commission for Leptospirosis, are shown in Table 1. Each strain was grown in EMJH medium (Difco Laboratories) for at least 5 days at 28 °C. Culture samples (100 μl) were incubated at 100 °C for 10 min and used directly as a DNA template in MLVA strain typing procedures. The primers described by Majed et al. (8) flanking the VNTR4, VNTR7, VNTR9, VNTR10, VNTR19, VNTR23 and VNTR31 loci were used for L. interrogans whereas the oligonucleotides described by Salaün et al. (15) were used for L. borgpetersenii and L. kirschneri, including those flanking the new VNTR-Lb4 and VNTR-Lb5 loci, and the previously found VNTR4, VNTR7 and VNTR10 loci [herein named VNTR-4bis, VNTR-7bis and VNTR-10bis in order to differentiate PCRs from those performed with the primers developed by Majed et al. (8)]. Each reaction mixture contained a PCR buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.4; 50 mM KCl), 200 μM of each dNTP, 2 mM MgCl2, 1.25 U of Taq DNA polymerase (Invitrogen), 2 μM each corresponding primer, and 5 μl of DNA template in a final volume of 50 μl. PCRs were carried out in a MiniCycler PTC-150 (MJ Research) as follows: 94 °C for 5 min, followed by 35 cycles of denaturalization at 94 °C for 30 s, annealing at 55 °C for 30 s and extension at 72 °C for 90 s, with a final cycle at 72 °C during 10 min. Each amplified sample (14 μl) was subjected to electrophoresis in a 2.2 % agarose gel in TAE buffer (40 mM Tris-Acetate, 1 mM EDTA) with 0.2 μg/ml ethidium bromide at 100 V for 50 min. Amplified DNA bands were visualized upon UV light exposure (DynaLight, Labnet). Amplicon sizes were estimated using CienMarker (Biodynamics).

RESULTS AND DISCUSSION The reference strains analyzed in the present work belong to L. interrogans, L. borgpetersenii and L. kirschneri,

Table 1. Reference strains used in Argentina for the diagnosis of leptospirosis for domestic animals analysed in this work Species

Serogroup

L. interrogans Canicola Icterohaemorrhagiae Pomona Pyrogenes Sejroe L. borgpetersenii L. kirschneri

Serovar

Strain

Canicola Hond Utrecht IV Copenhageni M20 Pomona Pomona Pyrogenes Salinem Wolffi 3705 Hardjo Hardjoprajitno(3)

Animal species(1)

Strain procedence(2)

Hu, Do, Co, Sh, Pi, Ho, Go, Wi Hu, Do, Co, Sh, Pi, Ho, Go, Wi Hu, Do, Co, Sh, Pi, Ho, Go, Wi Hu, Do, Wi Hu, Co, Sh, Pi, Ho, Go, Wi Hu, Co, Sh, Pi, Ho, Go, Wi

I I I I, II, III I, II, III I, II, III

Ballum Tarassovi

Castellonis Tarassovi

Castellon 3 Perepelicin

Hu, Do, Co, Sh, Pi, Ho, Go, Wi Hu, Co, Sh, Pi, Ho, Go, Wi

I, II, III I, II, III

Grippotyphosa

Grippotyphosa

Moskva V

Hu, Co, Sh, Pi, Ho, Go, Wi

I, II, III, IV

According to the animal species from which the serum to be analyzed is obtained, the Argentine Permanent Scientific Commission for Leptospirosis recommended which Leptospira strains should be used for MAT diagnosis. Abbreviations for each animal species: Hu, humans; Do, dogs; Co, cows; Sh, sheep; Pi, pigs; Ho, horses; Go, goats; Wi, wild animals. (2)Strain source: I, World Organisation for Animal Health (OIE) Leptospirosis Reference Laboratory, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Argentina; II, Institut Pasteur, France; III, Instituto Fiocruz, San Salvador, Brazil; IV, Pan American Health Organization, through the División Laboratorios Veterinarios (DILAVE), Uruguay. (3)Strain only recommended by INTA-OIE Leptospirosis Reference Laboratory. (1)

MLVA genotyping of Leptospira reference strains

therefore, we used two different oligonucleotide sets (8, 15) according to the corresponding species, which allowed the correct genotyping of all reference strains. The MLVA genotypes of L. interrogans reference strains Hond Utrecht IV, M20, Pomona, Salinem, 3705 and Hardjoprajitno, recommended by the Argentine Permanent Scientific Commission for Leptospirosis and INTA-OIE Leptopirosis Reference Laboratory to perform MAT in human, domestic and wild animal leptospirosis, were obtained by using seven of the loci described by Majed et al. (8). The patterns obtained for these strains are shown in Figure 1. The MLVA profiles of the six reference strains are absolutely different, and therefore, they can be readily recognized. Strains Hond Utrecht IV (serovar Canicola), M20 (serovar Copenhageni) and Pomona (serovar Pomona) yielded similar results to those reported by Majed et al. (8). Strain Pomona has an easily identifiable pattern (Figure 1C) that can be differentiated not only from that of other reference strains, but also from all L. interrogans MLVA genotypes described in Argentina and Brazil, corresponding to strains with genotypes A, B, C

253

and D from serovar Pomona (10, 11, 12). The profile obtained for strain M20 (Figure 1B) could be rapidly singled out from that of the other five reference L. interrogans strains. However, when using MLVA for typing unknown isolates, it must be taken into account that the pattern of strain M20 is identical to that of two strains from serovar Icterohaemorrhagiae: Ictero No. 1 and RGA, used for human diagnosis (12). When the MLVA patterns obtained for strains Salinem (serovar Pyrogenes), 3705 (serovar Wolffi) and Hardjoprajitno (serovar Hardjo) were compared with previously published results for these strains (8), discrepancies in some amplification fragment molecular weights were observed. Some of the small discrepancies with previous results could be attributed to inevitable electrophoretic run variations, but differences of nearly a hundred base pairs were observed compared to published data (8) for the VNTR9 Hardjoprajitno amplicon and the large VNTR19 Salinem amplicon, implicating a difference of two repeats (approximately 45 bp each) for the loci considered. In order to verify that the strains tested had not been mislabeled,

Figure 1. MLVA patterns for the following L. interrogans strains: A, Hond Utrecht IV (serovar Canicola); B, M20 (serovar Copenhageni); C, Pomona (serovar Pomona); D, Salinem (serovar Pyrogenes); E, strain 3705 (serovar Wolffi); F, strain Hardjoprajitno (serovar Hardjo). The VNTR loci evaluated were: VNTR4 (lanes 2), VNTR7 (lanes 3), VNTR9 (lanes 4), VNTR10 (lanes 5), VNTR19 (lanes 6), VNTR23 (lanes 7) and VNTR31 (lanes 8). Lanes 1: CienMarker.

Figure 2. MLVA patterns for the following Leptospira strains: A, Castellon 3 from L. borgpetersenii; B, Perepelicin from L. borgpetersenii; C, Moskva V from L. kirschneri. The VNTR loci evaluated were: VNTR-4bis (lanes 2), VNTR-7bis (lanes 3), VNTR-10bis (lanes 4), VNTR-Lb4 (lanes 5), and VNTR-Lb5 (lanes 6). Lanes 1 and 7: CienMarker.

254

samples of the same strains were obtained from two additional culture collections, those from the Institut Pasteur, France, and from Fiocruz, Brazil. Results obtained with the new samples were identical to those observed for the first samples, consequently, the patterns for Salinem, 3705 and Hardjoprajitno strains can be reliably considered to be the ones shown in this work. The scheme proposed for L. interrogans (8) cannot be applied to strains belonging to L. borgpetersenii and L. kirschneri species because some of the loci give faint bands, multiple bands or do not amplify at all (15). For this reason, MLVA patterns for the Argentine reference strains Moskva V from L. kirschneri, and Castellon 3 and Perepelicin from L. borgpetersenii were obtained using the loci proposed by Salaün et al. (15) (Figure 2). The typing of Moskva V strain, serovar Grippotyphosa, was problematic. Several attempts to amplify the VNTR loci of this strain from the INTA and Institut Pasteur culture collections were unsuccessful. The Moskva V strain from Fiocruz could be genotyped, but the MLVA pattern obtained (Figure 2C) differed from the previously published one (15). In an effort to clarify this situation, this strain was also obtained from the Pan American Health Organization. This last strain gave unexpected results, including high molecular weight bands, duplicate bands or no amplicons for different loci. Strain Castellon 3, serovar Castellonis, yielded MLVA patterns comparable to those previously reported (15), but a difference was observed for the band expected for VNTR-4bis according to the source of the strain used, ranging from readily visible (strain from Fiocruz, shown in Figure 2A), tenuous (strain from INTA) or missing (strain from Institut Pasteur). Strain Perepelicin, serovar Tarassovi, from the INTA culture collection gave a similar pattern (Figure 2B) to the previously reported one (15), but differed in the size of the VNTR-10bis amplification band, which was a little larger than expected. However, when this strain obtained from different sources (Fiocruz and Institut Pasteur) was tested, an identical pattern was obtained, showing the same discrepancy with respect to the published pattern. In agreement with Salaün et al.’s findings (15), no amplification band was obtained for locus VNTR-4bis, except for a very weak band that was observed for the Fiocruz strain, as shown in Figure 2B. The absence of an amplicon for the VNTR-7bis locus indicates that Castellon 3 and Perepelicin strains belong to the species L. borgpetersenii (Figure 2A and 2B). The reference strains used for obtaining antibodies for MAT or for vaccine production, as well as those used in vaccine control challenging assays must be periodically characterized in order to avoid important problems due to mismanagement or contamination. Mislabeling during subculturing or strain switching are ever-present risks as it could be demonstrated during a recent monitoring of two Brazilian Leptospira strain collections (3). Reference strains are also needed for epidemiological studies, and each country should maintain and control its own collection

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with the best tools available, due to the current difficulties to acquire pathogenic microorganisms. MLVA is a simple, rapid and economical method, but the interpretation of the results obtained, including the comparison with reference strains, is difficult because it has to be made based on VNTR copy number variations. The aim of this work was to facilitate the use and interpretation of this technique for leptospire typing, presenting the MLVA patterns for reference strains used in Argentina in such a way that they can be differentiated by simple visual comparison of agarose electrophoresis results. This will allow MLVA to be incorporated as a routine procedure in strain collection monitoring, epidemiological studies, typing of leptospires isolated from humans and animals, vaccine control and other uses. The widespread application of MLVA will increase the reliability of leptospire typing complementing the traditional serological techniques.

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Recibido: 15/03/2011 – Aceptado: 12/08/2011

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43:0325-7541 256-262 ISSN Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 256-262

ARTÍCULO ORIGINAL

Efecto de la temperatura sobre la viabilidad de larvas de Trichinella spiralis VIVIANA R. RANDAZZO1, LUCIANO F. LA SALA2, SIXTO R. COSTAMAGNA1* 1 Cátedra de Parasitología Clínica, Universidad Nacional del Sur. San Juan 670, (8000) Bahía Blanca, Argentina; 2Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores (CONICET–UNLP), Calle 2 Nro. 584, (1900) La Plata, Buenos Aires, Argentina. *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de diferentes temperaturas sobre la viabilidad de larvas libres y enquistadas de Trichinella spiralis aisladas en el sudoeste de la provincia de Buenos Aires, Argentina. Se trataron larvas libres y enquistadas a diferentes temperaturas (-30 °C, -20 °C, 4 °C, 20 °C, calentamiento gradual entre 0-100  °C). Se determinó el tiempo necesario para matar el 100 % de las larvas. Durante los primeros días, la mortalidad larvaria en todos los tratamientos con frío aumentó significativamente en función del tiempo. En todos los casos, las larvas libres sobrevivieron menor cantidad de días que las enquistadas. A -30 °C, -20 °C y 20 °C no se observaron diferencias significativas entre las curvas de mortalidad de cada estadio larvario, pero a 4 °C la mortalidad fue menos intensa entre las larvas enquistadas. El calentamiento disminuyó la viabilidad, sin observarse diferencias entre estadios larvarios. La totalidad de las larvas libres y enquistadas había muerto a los 61 y 95 días (-30 °C), a los 160 y 180 días (-20 °C), a los 280 y 330 días (4° C), y a los 460 y 590 días (20 °C), respectivamente. Fue necesaria una cocción durante 15 minutos a 90 °C para matar al 100 % de las larvas libres y a 100 °C para lograr igual mortalidad de las enquistadas. Nuestros resultados indican que la temperatura y los tiempos tradicionalmente utilizados para tratar productos cárnicos con potencial de transmisión de T. spiralis no serían los más efectivos para lograr la inactivación de la totalidad de larvas vivas de este parásito. Palabras clave: viabilidad, Trichinella spiralis, temperatura

ABSTRACT Effect of temperature on the viability of Trichinella spiralis larvae. The aim of this work was to study the effect of temperature on the viability of free and encysted larvae of Trichinella spiralis from southwest Buenos Aires province, Argentina. Larvae were treated at variable temperatures (-30 °C, -20 °C, 4 °C, 20 °C, gradual heating between 0-100 °C). The time necessary to kill 100 % of larvae was calculated. During the first days of freezing, larval mortality significantly increased as a function of time. Regardless of temperature, encysted larvae survived longer than the free ones. At -30 °C, -20 °C, and 20 °C there were no significant differences between the survival curves for each larval stage. At 4 °C, mortality was less severe for encysted larvae. All free and encysted larvae died at 61 days and 95 days (-30 °C), 160 days and 180 days (-20 °C), 280 days and 330 days (4 °C) and 460 days and 590 days (20 °C), respectively. Cooking at 90 °C and 100 °C during 15 minutes killed 100 % of free and encysted larvae, respectively. Our results suggest that temperatures and exposure times traditionally used to treat meat products with a potential to transmit T. spiralis are not entirely efficient. Key words: viability, Trichinella spiralis, temperature

INTRODUCCIÓN La trichinellosis es una zoonosis parasitaria producida por larvas de nematodes del género Trichinella (20). La infección se produce por el consumo de carne de cerdo y de especies silvestres cruda o mal cocida, que contiene larvas viables del parásito (22). En la Argentina, la enfermedad es producida por T. spiralis (14). El género Trichinella resiste condiciones ambientales rigurosas (23), lo que actualmente plantea controversias al momento de sugerir la temperatura y el tiempo necesarios para producir la muerte del estadio larvario de este parásito en los alimentos (12).

A pesar del establecimiento de programas de control, los brotes de trichinellosis humana son constantes en diferentes regiones del mundo (3, 4, 21, 23) y, particularmente, en la Argentina (5, 6, 10, 26). En nuestro país, se informaron más de 5000 casos clínicos de trichinellosis en el período 1990-1999, de los cuales más del 90 % ocurrieron en las provincias de Buenos Aires, Córdoba y Santa Fe (5). Por otro lado, hasta el año 2006 no se habían registrado casos en las provincias de Mendoza, San Juan, Chaco, Tierra del Fuego, Formosa y Salta (9). Cabe destacar que para abril de 2011 fueron notificados casos sospechosos en las provincias de Tierra del Fuego, Buenos Aires, Santa

Efecto de la temperatura en Trichinella spiralis

Fe y Entre Ríos, y hubo casos confirmados en las provincias de Mendoza, Córdoba y Chaco y en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires (17). Estos datos muestran que la distribución geográfica de esta enfermedad se ha expandido a provincias en las que antes se consideraba ausente, con un aumento importante del número total de casos en el período 2009-2011 en provincias donde la enfermedad es endémica (17). En la Argentina existen unos 47 000 criaderos de cerdos; el 94 % de ellos son emprendimientos familiares o de subsistencia, con control sanitario escaso o nulo (9). En estos establecimientos los animales son generalmente alimentados con desperdicios, lo que favorece la presencia de roedores y otros animales silvestres con un papel fundamental en la transmisión de esta zoonosis (23). En estos sistemas de crianza, la faena casera es habitual y los productos son frecuentemente comercializados y consumidos sin control sanitario previo, lo que aumenta significativamente el riesgo de infección (6). Los productos cárnicos que no son analizados por un método aceptable de diagnóstico para T. spiralis requieren, antes de su distribución para el consumo humano, de un tratamiento preventivo para inactivar de forma eficaz aquellas larvas que pudieran estar presentes en el producto (19, 27). Entre los procedimientos propuestos por la Comisión Internacional de Trichinellosis se encuentran la cocción, el congelamiento y la irradiación, de modo que resulta fundamental establecer la temperatura y el tiempo de tratamiento requeridos para la destrucción de las larvas (12, 19). A pesar de dichas recomendaciones, en la Argentina se ha observado en los últimos años un aumento del número de casos de trichinellosis humana y de su distribución geográfica (17). Con estos antecedentes, el objetivo del presente trabajo fue determinar las temperaturas y los tiempos de tratamiento necesarios para lograr la pérdida de viabilidad de larvas libres y enquistadas de T. spiralis, aisladas del sudoeste de la provincia de Buenos Aires en Argentina.

MATERIALES Y MÉTODOS Condiciones experimentales Se utilizó la cepa BBSC 01 de T. spiralis tipificada por PCR en el Centro Internacional de Referencia en Roma, Italia, y en la Cátedra de Parasitología Clínica de la Universidad Nacional del Sur (UNS). Como modelo animal se utilizaron ratones BALBc infectados con el parásito, obtenidos del Bioterio del Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia (UNS) y controlados sanitariamente. Cada ratón (n = 20) fue infectado con 2500 larvas vivas de T. spiralis cuantificadas utilizando un microscopio óptico. En un ensayo previo, los autores determinaron que dicha carga parasitaria produce infecciones con intensidades de 250 ± 50 larvas enquistadas por gramo de tejido muscular, sin provocar la muerte del hospedero. Los ratones fueron sacrificados a los 45 días posinfección. Los animales fueron ambientados y tratados de acuerdo con estándares humanitarios (13). Las larvas libres (L) y enquistadas (E) fueron obtenidas a partir del sacrificio y evisceración de 10 ratones para conformar cada grupo. Las larvas libres fueron recuperadas a partir de la digestión

257 enzimática artificial de los ratones muertos (18). Se prepararon 600 tubos con 500 larvas en 1 ml de H2O destilada por tubo. Cada tubo fue asignado aleatoriamente a uno de los cinco grupos que representaron a las larvas libres (L1, L2, L3, L4 y L5). Las larvas enquistadas fueron obtenidas a partir de 600 muestras de músculo (2 g; 2,5 ± 0,2 cm de espesor) con 500 ± 50 larvas enquistadas cada una, las cuales fueron cuantificadas utilizando un microscopio óptico. Cada muestra fue asignada aleatoriamente a uno de los cinco grupos que representaron a las larvas enquistadas (E1, E2, E3, E4 y E5). Al momento de su estudio, las muestras con larvas enquistadas fueron sometidas a digestión enzimática artificial para el posterior recuento de larvas vivas (18). En el presente trabajo se definió a las diferentes temperaturas como “tratamientos”. Los tratamientos de las larvas fueron realizados como se describe a continuación: (1) L1/E1: -30 °C en freezer, (2) L2/ E2: -20 °C en freezer, (3) L3/E3: 4 °C en heladera, (4) L4/E4: 20 ± 0,5 °C en mesada de laboratorio, (5) L5/E5: calentamiento gradual (incremento de 10 °C cada 15 minutos, entre 0 y 100 °C) en baño termostatizado. Las temperaturas y los tiempos de tratamiento fueron monitoreados diariamente mediante reloj y termómetro de precisión calibrado (Hanna, rango de medición: entre -50 °C y 150 °C). Las larvas de los tratamientos L1/E1 y L2/E2 fueron observadas diariamente durante los primeros 20 días, y luego cada 10 días. Las de los tratamientos L3/E3 y L4/E4 fueron observadas cada 10 días. Todos los recuentos fueron realizados utilizando un microscopio óptico. Las larvas fueron clasificadas como “muertas” cuando se observaron al mismo tiempo las siguientes condiciones: 1) ausencia de movimientos; 2) retracción de las estructuras internas; 3) ruptura de la capa quitinosa del parásito. La ausencia de estas tres características permitió clasificar a las larvas como “vivas”. Finalmente, la viabilidad fue confirmada mediante la técnica de azul de metileno (25). Los recuentos de larvas fueron realizados hasta el día en que se logró el 100 % de mortalidad, momento definido como T100. Los recuentos fueron realizados por triplicado y los resultados fueron promediados. Análisis estadístico Inicialmente se ajustaron modelos aditivos generalizados (MAG) no paramétricos para explorar la forma de la relación entre cada variable independiente y la respuesta (15). Luego se construyeron modelos de regresión lineal polinómica (MLP) para evaluar la bondad de ajuste del mejor modelo e interpretar los resultados. En principio, se analizó la asociación entre la variable independiente “días” (ordinal) y la variable dependiente “mortalidad” (conteo), de forma separada para cada tratamiento térmico. La variable “estado larvario” (libre/enquistada) fue incorporada en cada modelo como variable indicadora (“dummy”). Cada modelo incluyó términos paramétricos (lineales, cuadráticos y cúbicos, cuando fue necesario) y funciones de enlace adecuados para reproducir las relaciones identificadas en los MAG y producir el mejor ajuste. Se partió de un modelo saturado, el cual incluyó todas las variables independientes y las posibles interacciones entre ellas. Cada modelo fue seleccionado y reducido a su estructura más simple utilizando el criterio de información de Akaike (AIC) como medida de contraste entre modelos alternativos (2). Las variables fueron excluidas del modelo, a menos que redujeran el AIC en más de 2 unidades (8). La bondad de ajuste de cada modelo final fue determinada por el valor de R2 ajustado, el cual indica la proporción en la variabilidad de la variable dependiente explicada por el modelo. La falta de mejora de ajuste por parte de la interacción “días × grupo” indicó que la relación entre “días” y “mortalidad” no dependió del estadio larvario. En todos los tratamientos, la mortalidad larvaria tuvo una relación no lineal con los días transcurridos. Por lo tanto, los modelos requirieron de términos polinómicos de segundo o tercer orden para describir adecuadamente las funciones de mortalidad.

258

Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 256-262

datos se describen en la Tabla 3 (calentamiento), Tabla 4 (20 °C), Tabla 5 (4 °C), Tabla 6 (-20 °C) y Tabla 7 (-30 °C). De acuerdo con los modelos, la mortalidad larvaria aumentó significativamente en función del tiempo en todos los tratamientos (Figura 1A a 1E). En el calentamiento gradual, las curvas de mortalidad no mostraron diferencias significativas para los distintos estadios larvarios entre los 0 y los 90 °C. Sin embargo, el T100 fue alcanzado a 90 °C para las larvas libres y a los 100 °C para las larvas enquistadas (Figura 1E). De forma similar, durante el congelamiento a -30 °C no se observaron diferencias significativas entre las curvas de mortalidad para cada tipo de larva (i.e. pendiente similar y ausencia de interacción grupo × días) (Tablas 3 y 7). A -30 °C, la mayor parte de las larvas libres (80 %) y enquistadas (83,6 %) murieron durante los primeros ocho días de tratamiento. La curva de mortalidad de las larvas enquistadas mostró pendientes diferentes (p < 0,001) antes y después del 8.o día (Figura 1A). En el primer período, la mortalidad promedio fue de 71 larvas/día (p < 0,001), mientras que durante el segundo período la mortalidad descendió a 0,7 larvas/día (p < 0,001). A 20 °C y 4 °C se observaron fenómenos de interacción “grupo × días” (i.e. el efecto del tiempo sobre la mortalidad en cada tratamiento estuvo fuertemente influenciado por el estadio larvario) (Tablas 4 y 5). A -20 °C, el efecto de grupo en ausencia de interacción significativa “grupo ×

Para la construcción de los MAG, se utilizó la función “gam” del paquete “mgcv” del programa R (24). Los MLG y MLP fueron construidos con las funciones “glm” y “lm” de los paquetes “mgcv” (28) y “stats” de R, respectivamente. La cantidad de larvas por gramo de alimento necesarias para producir trichinellosis humana varía entre 1 y 150 (6). En nuestro estudio, cada tubo tratado contenía 500 larvas libres/ml o 500 larvas enquistadas/2 g de tejido (250 larvas/g). Ambas concentraciones se encuentran por encima del rango antes mencionado. A partir de cada modelo, se realizaron predicciones de la curva de mortalidad larval para nuevos valores de las variables “días” y “temperatura”, utilizando la función “predict” de R. Así, se estimó para cada tratamiento la cantidad de días necesarios para matar un mínimo de 430 larvas dejando de este modo no más de 70 larvas vivas, lo cual fue definido como T70 y representaría una cifra conservadora con potencial de producir enfermedad. Debido a la presencia de un punto de cambio abrupto en la pendiente de la curva de mortalidad de larvas enquistadas tratadas a -30 °C, además de ajustar el modelo de regresión global correspondiente, se utilizó un modelo de regresión segmentada (11) para estudiar la mortalidad larvaria en cada uno de los segmentos de la curva. La presencia de problemas de colinearidad fue evaluada mediante la matriz de correlación y el factor de inflación de la varianza.

RESULTADOS El T100 y T70 dependieron del tratamiento (Tablas 1 y 2) y las larvas libres sobrevivieron menor cantidad de días que las larvas enquistadas en todos los tratamientos (Figura 1). Los modelos de regresión que mejor ajustaron los

Tabla 1. Tiempo (días) requerido para matar el 100 % de larvas (T100) de T. spiralis (datos obtenidos experimentalmente). Tipo de larva Enquistadas Libres Diferencia

20 °C

4 °C

-20 °C -30 °C

Calentamiento†

590 330 180 95 460 280 160 61 130 50 20 34

100 °C 90 °C NA

NA = no aplicable. † Temperatura necesaria para llegar al T100.

Tabla 2. Tiempo (días) requerido para matar un mínimo de 430 larvas (T 70). Se informa el promedio e intervalo de confianza del 95 % (IC95 %) para la cantidad de larvas vivas (LVIVAS) a T70. Datos estimados a partir de los modelos de regresión ajustados. Grupo

Parámetro

20 °C

4 °C

-20 °C

-30 °C

Calentamiento†

Libres T70 LVIVAS (IC 95%)

279 125 60 19 69 (56-82) 69 (55-84) 69 (57-81) 66 (47-85)

NA

Enquistadas T70 LVIVAS (IC 95 %)

284 262 103 28 69 (59-80) 69 (62-76) 68 (58-78) 67 (48-86)

NA

Libres y enquistadas T70 LVIVAS (IC 95 %)

287 69 (60-77)

200 69 (41-97)

80 25 69 (53-84) 68 (54-81)

NA = no aplicable por no haberse ajustado modelos para cada tipo de larva por separado. † Temperatura necesaria para llegar al T70.

77 °C 69 (27-110)

Efecto de la temperatura en Trichinella spiralis

259

Figura 1. Promedio (––) ± 1 desvío estándar ( ) e intervalo de confianza del 95 % (- - -) para la mortalidad media de larvas (libres y enquistadas) de T. spiralis en función del tiempo y bajo cuatro tratamientos térmicos: -30 °C (A), -20 °C (B), 4 °C (C), 20 °C (D) y calentamiento gradual hasta 100 °C (E). Tabla 3. Modelo de asociación entre las variables estudiadas y la mortalidad de larvas de T. spiralis bajo calentamiento Modelo = Larvas muertas (conteo) ~ Temp. + Temp.2 + Temp.3 + εi n = 19 Error estándar residual = 51,5 R 2 ajustado = 0,943 Variable Intercepto Temp. Temp.2 Temp.3 †

Coeficiente 38,584 -9,293 0,327 -0,002

EE

P

32,401 2,951 0,071 < 0,001

0,24919 0,00554 0,00021 0,00085

Δ AIC†

54,51 56,51 16,68

Aumento en el valor de AIC cuando el término es eliminado del modelo.

Tabla 4. Modelo de asociación entre las variables estudiadas y la mortalidad de larvas de T. spiralis a 20 °C Modelo = Larvas muertas (conteo) ~ Días + Días2 + Grupo + Días × Grupo + εi n = 105 Error estándar residual = 29,64 R 2 ajustado = 0,9633 Variable Intercepto Días Días2 GrupoEnq Días × GrupoEnq

Coeficiente -14,000 2,303 0,003 -19,300 0,114

EE 10,160 0,070 < 0,001 12,230 0,043

Aumento en el valor de AIC cuando el término es eliminado del modelo. GrupoEnq = larvas enquistadas †

P 0,17139 < 0,0001 < 0,0001 0,11754 0,00985

Δ AIC† 343,37 170,87 4,99 5,03

260

Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 256-262 Tabla 5. Modelo de asociación entre las variables estudiadas y la mortalidad de larvas de T. spiralis a 4 °C Modelo = Larvas muertas (conteo) ~ Días + Días2 + Días × Grupo + Días2 × Grupo + εi n = 61 Error estándar residual = 19,6 R 2 ajustado = 0,984 Variable

Coeficiente

Intercepto Días Días2 GrupoEnquist Días × GrupoEnq Días2 × GrupoEnq

-646,1 70,25 -0,234 31,4 -3,258 0,011

P

EE

Δ AIC†

332,3 0,0570 4,964 < 0,0001 244,40 0,016 < 0,0001 119,66 16,17 0,0573 163,65 0,241 < 0,0001 93,46 0,001 < 0,0001 94,38

Aumento en el valor de AIC cuando el término es eliminado del modelo. GrupoEnq = larvas enquistadas †

Tabla 6. Modelo de asociación entre las variables estudiadas y la mortalidad de larvas de T. spiralis a -20 °C Modelo = Larvas muertas (conteo) ~ Días + Días2 + Grupo + εi n = 34 Error estándar residual = 20,97 R 2 ajustado = 0,9441 Variable Intercepto Días Días2 GrupoEnq

Coeficientes

EE

1011 3,716 -0,012 -39,490

150,7 0,303 0,002 7,296

P < < <
0.05), but was significantly higher than those reported for other cities in the Argentinean littoral region like Concordia (Entre Ríos) and Corrientes (Corrientes) (c2p < 0.05); (ii) the prevalence throughout the country is not homogeneous; (iii) the highest values of HPV prevalence are reported in the aboriginal populations of the country, including the Guarani communities of Misiones. The prospect of prophylactic vaccines reinforces the need for more knowledge regarding regional prevalence of high-risk HPV types. In this study, a total of 14 different viral types were identified. Mixed infections were presented in 19.4 % of positive women. HPV-16 was the most frequent viral type among the total population with ten monoinfected patients and six patients with mixed infections; giving a total prevalence of 9.8 % (16/163). Moreover, HPV-16 infection was higher in women with cervical lesions than in the NILM, with 29.2 % (7/24) and

Human papillomavirus in Posadas city, Misiones

265

Table 1. Prevalence of HPV infection in Argentina. Analysis of selected studies. Location/Population

HPV

Source

Concordia/Urban Corrientes/Urban Ushuaia/Urban Rosario/Urban Misiones/Urban La Plata/Urban Formosa/Indigenous Jujuy/Indigenous Misiones/Indigenous Misiones/Urban IARC Reference Data

16.6 % (166/987) 17.6 % (9/53) 26.4 % (23/87) 43.0 % (40/93) 43.0 % (92/214) 46.0 % (70/152) 43.6 % (58/133) 51.8 % (56/108)(1) 64.2 % (133/207)(1) 33.1 % (46/139) 20.1 % (17.7-22.7)

(8) (5) (11) (4) (13 (1) (Deluca G, personal communication) (9) (15) Present Study (16)

(1)

Statistically significant differences compared to the present study (χ2p < 0.05)

Table 2. HPV type distribution stratified by Pap cytology. HPV type

Normal cytology n=139 n %

Cervical Lesions n=24 n=163 n % n %

High-Risk HPV-16 6 4.3 4 16.7 10 6.1 HPV-33 10 7.2 1 4.2 11 6.8 HPV-56 5 3.6 1 4.2 6 3.8 HPV-52 6 4.3 - - 6 3.8 HPV-31 2 1.5 1 4.2 3 1.8 HPV-59 1 0.7 - - 1 0.6 HPV-58 - - 1 4.2 1 0.6 HPV-82 - - 1 4.2 1 0.6 HPV-70 1 0.7 - - 1 0.6 Subtotal High-Risk 31 22.3 9 37.5 40 24.5 Low-Risk HPV-6/11 2 1.5 1 4.2 3 1.8 HPV-40 1 0.7 - - 1 0.6 Subtotal Low-Risk 3 2.2 1 4.2 4 2.4 Mixed Infections HPV-16 + HPV-6/11 1 0.7 1 4.2 2 1.2 HPV-16 + HPV-56 1 0.7 - - 1 0.6 HPV-16 + HPV-33 1 0.7 1 4.2 2 1.2 HPV-16 + HPV-52 - - 1 4.2 1 0.6 HPV-31 + HPV-56 2 1.5 - - 2 1.2 HPV-31 + HPV-45 1 0.7 - - 1 0.6 HPV-59 + HPV-58 1 0.7 - - 1 0.6 HPV-45 + HPV-52 HPV-18 + HPV-59 + HPV-58 Subtotal Mixed Infections Undetermined Negative Total

- - 1 0.7 8 5.7 4 2.9 93 66.9 139 100

1 4.2 - - 4 16.7 2 8.0 8 33.3 24 100

1 0.6 1 0.6 12 7.4 6 3.8 101 61.9 163 100

266

Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 263-267

6.5 % (9/139), respectively (χ2p < 0.05), and the associated risk for infection with HPV-16 and the development of cervical lesions in women ≥ 30y showed an OR of 11.8 (1.8-79.7). These results are in agreement with the Argentinean reference values for HPV-16 prevalence and are consistent with the well established role of HPV-16 on cervical cancer development (9, 15). It is interesting to note that the second most frequent type was HPV-33 with 9.3 % (13/163) between mono and co-infections, which was higher than the reference value for Argentina of 1.4 % (15). HPV type distributions are detailed in Table 2. Given that HPV infection is transmitted mainly by sexual intercourse, certain patterns of sexual behavior may be associated with an increased risk for HPV acquisition. According to our survey, HPV infection was associated with the number of sex partners (three or more) in women ≥ 30 y. Particularly, HPV-16 infection was associated with the history of previous STDs and a smoking habit. Details are shown in Table 3. The Screening Guidelines of the American College of Obstetricians and Gynecologists indicate that if HPV testing is used in combination with Pap smears, women who are negative for both tests should return to

be controled in three years. This strategy is meant to minimize unnecessary follow-up visits and invasive procedures without compromising the detection of disease, making this scheme more appropriate to communities with limited access to public health services like Nueva Esperanza population. The National Cervical Cancer Prevention Program of Argentina is starting a project in Jujuy province, introducing the HPV test as primary screening (Picconi MA, personal communication). Therefore, the availability of new screening tools to detect precancerous lesions provides great opportunities for cervical cancer prevention. Despite all its limitations, this study aims to contribute to public health by providing epidemiological information about this community and implementing Pap screening. These data can also be useful for the implementation of prevention programs, including an appropriate introduction of vaccination and the baseline for virological surveillance in the vaccine era. Conflict of Interest: The authors have no conflicts of interest to declare

Table 3. Evaluation of risk factors for HPV infection and the development of cervical lesions in the population studied.

HPV (+) (-)

OR (CI 95%)

HPV-16 (+) (-)

OR (CI 95%)

Normal Cervical OR cytology lesions (CI 95%)

Age at first intercourse ≥19 8 14 1 2 20 1 21 1 ≤18 54 86 1.1 (0.4-2.8) 15 125 1.2 (0.2-5.6) 117 23 1.0 (0.4-2.9)(2) 0.4 (0.1-2.5)(2) Lifetime no. of Sex Partners 1-2 37 73 1 9 101 1 96 14 ≥3 25 25 2.0 (1.0-3.9) 8 42 2.1 (0.8-5.9) 40 10 4.2 (1.6-10.8)(1,2) 4.0 (0.6-25.4)(2) Parity 1-2 14 25 1 5 34 1 31 8 1 ≥3 48 76 1.1 (0.5-2.4) 12 112 0.7 (0.2-2.2) 108 16 0.9 (0.3-3.1)(2) 0.7 (0.1-6.6)(2) History of STIs No 55 90 1 12 133 1 125 20 1 Yes 7 9 1.3 (0.4-3.6) 5 11 5.0 (1.5-16.9)(1, 2) 12 4 0.9 (0.2-3.9)(2) 7.8 (1.1-54.8)(1, 2) Smoking No 47 78 1 11 114 1 105 20 1 Yes 15 18 1.4 (0.6-3.0) 6 27 2.3 (0.8-6.8) 29 4 1.4 (0.5-3.8)(2) 6.6 (1.0-42.6)(1, 2) Pap Smears Normal 46 93 1 10 129 1 Cervical Lesions 16 8 4.0 (1.6-10.1)(1) 7 17 5.3 (1.8-15.8) 8.4 (2.1-33.3)(1, 2) 11.8 (1.8-79.7)(1, 2) (1)

Statistically significant differences;

(2)

Odds ratios adjusted by age (≥30y).

1 4.1 (0.5-32.2) 3.7 (0.4-30.6)(2) 1 1.7 (0.7-4.2) 2.4 (0.7-8.0)(2)

0.6 (0.2-1.5) 1.0 (0.2-4.8)(2)

2.1 (0.6-7.1) 3.7 (0.8-17.4)(2)

0.7 (0.2-2.3) 1.2 (0.3-4.7)(2)

Human papillomavirus in Posadas city, Misiones Acknowledgements:This research was supported by grants of the Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT Red 311/02) and the Comité Ejecutivo de Desarrollo e Innovación Tecnológica (Misiones). The funding agencies were not involved in the study design, data collection, analysis, paper writing or submission. The authors would like to thank the social workers and healthcare professionals at ¨Nueva Esperanza¨. This work is dedicated to the memory of Sergio Tonon.

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Recibido: 31/05/11 – Aceptado: 11/11/11

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43:0325-7541 268-272 ISSN Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 268-272

INFORME BREVE

Infección diseminada por Penicillium marneffei en un paciente HIV-positivo Primera observación en la República Argentina GABRIELA SANTISO1, VIVIANA CHEDIAK2, ELENA MAIOLO1, MARÍA T. MUJICA3, JORGE SAN JUAN2, ALICIA ARECHAVALA1, RICARDO NEGRONI1*. 1

Unidad Micología, 2Unidad de Cuidados Intensivos, Hospital de Infecciosas “F. J. Muñiz”. Uspallata 2272 (1282) CABA; 3 Centro de Micología del Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, UBA. Paraguay 2155 (1114) CABA, Argentina. *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN Se presenta el primer caso humano de peniciliosis por Penicillium marneffei observado en la República Argentina. El paciente era un joven de 16 años, HIV-positivo, procedente de un área rural del sur de China. El paciente fue internado en el Hospital “F. J. Muñiz” por padecer una neumonía grave con insuficiencia respiratoria aguda. El agente causal fue aislado de un lavado broncoalveolar y se lo observó en un citodiagnóstico de piel. La identificación de P. marneffei fue confirmada por las características fenotípicas del aislamiento y la amplificación del ADNr. El enfermo padecía una infección muy avanzada por HIV que condujo a la aparición simultánea de infecciones por citomegalovirus, Pneumocystis jirovecii y procesos bacterianos nosocomiales. Este complejo cuadro derivó en una evolución fatal. Palabras clave: peniciliosis, Penicillium marneffei, infecciones relacionadas al HIV

ABSTRACT Disseminated infection due to Penicillium marneffei related to HIV infection. First observation in Argentina. The first case observed in Argentina of AIDS-related human penicillosis is herein presented. The patient was a sixteen year-old young man coming from a rural area of southern China. He was admitted at the F. J. Muñiz Hospital of Buenos Aires city with severe pneumonia and adult respiratory distress. Penicillium marneffei was isolated from bronchoalveolar lavage fluid and was microscopically observed in a skin cytodiagnosis. P. marneffei identification was confirmed by rRNA amplification and its phenotypic characteristics. The patient suffered an advanced HIV infection and also presented several AIDS-related diseases due to CMV, nosocomial bacterial infections and Pneumocystis jirovecii which led to a fatal outcome. Key words: penicillosis, Penicillium marneffei, AIDS-related infections

La peniciliosis es una micosis sistémica, endémica, producida por el hongo dimorfo Penicillium marneffei, que infecta a seres humanos y roedores del sudeste asiático. Ha habido un notable incremento de la incidencia de esta micosis desde la aparición de la pandemia del sida en la región. La mayor parte de los casos son pacientes con recuentos de linfocitos CD4+ inferiores a 100/µl y presentan la forma diseminada de esta infección fúngica (6). Las áreas endémicas de esta micosis abarcan el norte de Tailandia, el sur de China (incluyendo Hong Kong), Taiwán, Laos, Vietnam, Malasia, Myanmar (Birmania), Filipinas y el nordeste de India (Manipur) (8, 14). P. marneffei fue aislado del suelo y de infecciones espontáneas de diversas especies de ratas de los géneros Rhizomys y Cannomys, que habitan en los bambusales (1, 2). El agente infeccioso penetra posiblemente por vía inhalatoria, es mucho más frecuente la infección durante la estación lluviosa y hay indicios de que existen infecciones asintomáticas, así como largos períodos de latencia que

preceden a las formas clínicas progresivas (8, 13). El principal mecanismo defensivo frente a esta micosis es la producción de una respuesta de citoquinas con predominio Th1, que conduce a la formación de un granuloma epitelioide compacto, semejante al de la tuberculosis. En las personas con déficit de la inmunidad mediada por células, como los pacientes con sida, esta respuesta es inadecuada, se produce una hiperplasia de macrófagos, con gran cantidad de microorganismos, algunos extracelulares (2, 6). Las manifestaciones clínicas son muy semejantes a las observadas en la histoplasmosis clásica y se pueden parecer a las de la criptococosis. El objeto de este informe es dar a conocer el primer caso de peniciliosis diseminada asociada a la infección por HIV observado en la República Argentina. Se trata de un paciente de 16 años, sexo masculino, nacido en la Argentina. Hijo de padres oriundos de Fujian, China, emigró a un área rural del sur de ese país cuando tenía un año.

Infección diseminada por Penicillium marneffei asociada a VIH

La enfermedad que motivó su internación había comenzado durante su regreso de China a la Argentina, luego de pasar por Hong Kong y San Pablo. Ingresó a nuestro país el 17 de marzo de 2010. Tres días más tarde fue llevado al Hospital de Infecciosas “F. J. Muñiz” por presentar fiebre (38-39 °C), escalofríos, tos no productiva, diarrea, vómitos y disnea. de tres semanas de evolución. El paciente impresionó como gravemente enfermo, adelgazado, febril, taquipneico, asténico, con signos de deshidratación, con palidez de piel y mucosas, aunque consciente y cooperador. La presión arterial era de 108/65 mm Hg; la frecuencia cardíaca de 128 latidos/ min; la respiratoria de 32 por minuto, la temperatura axilar fue de 38,5 °C y la presión venosa central fue de 0 cm de agua. En el examen semiológico mostró palidez de piel y mucosas, signo del pliegue cutáneo (deshidratación), roncus y estertores crepitantes en ambos pulmones, hepatomegalia de 1 cm por debajo del reborde costal; en la piel del cuello y los miembros superiores se observaron pápulas de aspecto moluscoide. La radiografía de tórax mostró infiltrados pulmonares nodulares y difusos bilaterales. La tomografía axial computarizada de tórax reveló la presencia de lesiones micronodulillares y áreas de condensación con broncograma aéreo, rodeadas de infiltrados de aspecto semejante a vidrio esmerilado, diseminadas en ambos pulmones (Figura 1). Los estudios de gases en sangre demostraron hipoxia y acidosis metabólica compensada respiratoriamente (pH 7,4; PaCO2 28,6; PaO2 42 mm de Hg, HCO3 19 mEq/l). Los exámenes de laboratorio informaron los siguientes datos: hematocrito, 30,5 %, hemoglobina, 10 g/dl; leucocitos, 6800/µl; plaquetas, 225 000/µl; glucemia 126 mg/ dl; creatininemia 1,06 mg/dl; suero anictérico, GOT 263 U/l; GPT 158 U/l; tiempo de protrombina 69 %; KPTT 48 segundos; sodio 141 mEq/l y potasio 3,3 mEq/l. Fue admitido en la Unidad de Cuidados Intensivos debido al agravamiento de la insuficiencia respiratoria, que obligó a mantenerlo con asistencia respiratoria mecánica. Presentó dos veces neumotórax espontáneo, en ambos casos hubo que drenar quirúrgicamente. Sufrió una infección urinaria intrahospitalaria, episodios de excitación psicomotriz y sepsis con falla multiorgánica. Se comprobó la existencia de varias infecciones concomitantes, lo que llevó a complicaciones graves. La serología de HIV 1 y 2 fue reactiva, la carga viral fue de 750 000 copias de ARN/ml y el recuento de linfocitos CD4+ fue de 6/µl. Presentó PCR positiva para citomegalovirus en el LCR. El examen de lavado broncoalveolar (LBA) mostró escasos leucocitos y abundantes hematíes y macrófagos; en el examen en fresco y mediante coloraciones de Giemsa y de Grocott se comprobó la presencia de elementos compatibles con Pneumocystis jirovecii. Los cultivos en medios con antibióticos presentaron el desarrollo de numerosas colonias de Penicillium con pigmento rojo difusible al medio de cultivo (Figura 2).

269

Figura 1. Tomografía computarizada de tórax; se observan lesiones intersticiales nodulares e infiltrados difusos en ambos pulmones.

Figura 2. a. Medios BHI-agar y agar-miel de Sabouraud; se observan las formas micelial y levaduriforme de P. marneffei. b. Examen microscópico de la forma micelial, se observa el esporóforo típico. Preparación montada en líquido de Gueguen, 1000X. c. Preparación en líquido de Gueguen; se observan elementos de la forma levaduriforme de P. marneffei, 1000X. d. Citodiagnóstico de Tzanck de las lesiones cutáneas, se observa un macrófago con elementos de la forma parasitaria de P. marneffei. Tinción con Giemsa, 1000X.

Se realizaron extendidos teñidos con Giemsa de material obtenido por escarificación de las lesiones cutáneas, en los que se observaron macrófagos que contenían elementos ovalados de 3 a 5 µm de diámetro, con una pared celular que no tomaba el colorante y un tabique transversal con morfología compatible con P. marneffei. Figura 2.

270

Presentó desarrollo de Acinetobacter baumannii en el urocultivo y de Pseudomonas aeruginosa en los hemocultivos. Para controlar la neumocistosis se le indicó cotrimoxazol y corticosteroides, de acuerdo con las normas de la OMS (9). La infección por CMV fue tratada con foscarnet por vía intravenosa; por su micosis diseminada recibió anfotericina B desoxicolato en dosis creciente, de 0,3 a 0,7 mg/kg/día. Las infecciones bacterianas fueron tratadas con ceftriaxona, claritromicina, vancomicina y colistina, y a la segunda semana de internación se le instituyó tratamiento antirretroviral con lopinavir-ritonavir y 3 Tc. Como efectos colaterales se produjo una acentuación de la anemia, leucopenia de menos de 1000 células/µl (que no respondió a los factores estimulantes de colonias de granulocitos y macrófagos), hiperglucemia de 300 mg/ dl, desequilibrio hidroelectrolítico e hipoproteinemia con hipoalbuminemia y edemas. Finalmente, presentó un absceso corneano con endoftalmitis, el líquido del neumotórax se tornó purulento y el paciente falleció por empeoramiento de su cuadro séptico. Estudio del aislamiento de Penicillium recuperado. Colonia gigante a los 15 días de incubación a 28 °C en agar-glucosado de Sabouraud: presentó una colonia circular de 4 cm de diámetro, plana, con micelio aéreo corto, agamuzado, de color amarillo verdoso y pigmento rojo vinoso, que difundía al medio de cultivo. Microcultivos en medios de Czapek con extracto de levadura y agar-papa-glucosado: se observó un micelio vegetativo hialino, ramificado y tabicado, de paredes lisas, de 3-4 µm de diámetro; los conidióforos tenían 80-100 µm de largo por 3-4 µm de ancho, eran ramificados en forma de pincel, presentaron ramas, con 3 a 5 métulas de 7-10 µm de largo por 2-3 µm de ancho y 8 a 10 esterigmas en forma de fiálides de 5-6 µm de largo por 2-3 µm de ancho. En el vértice de los esterigmas se originaban cadenas de conidios elípticos, lisos, de 2 a 3 µm de diámetro (Figura 2). Después de varios subcultivos en agar infusión cerebro-corazón (BHI) a 37 °C, las colonias se trasformaron en pastosas, pequeñas y de color rosado; microscópicamente se observaron elementos ovales o en forma de salchicha, de 2 a 6 µm de diámetro, con tabiques transversales. Las características morfológicas encontradas corresponden a P. marneffei (5, 7). Con la cepa aislada se preparó una suspensión de esporas de la forma micelial en solución salina isotónica estéril, con opacidad equivalente al N.° 1 de la escala de Mc Farland. Con 0,1 ml de esta suspensión se inocularon dos hámsteres de 100 g de peso, por vía intratesticular. Un mes después los animales fueron sacrificados mediante sangría y se comprobó que presentaban una orquitis granulomatosa, con necrosis caseosa en el centro y adherencias fibrosas hacia los tejidos vecinos. En el examen microscópico de impresiones de los testículos teñidas con Giemsa se observaron elementos ovales, de 3-5 µm de diámetro, con un tabique transversal, compatibles con la

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fase tisular de P. marneffei. Los cultivos de macerados de los testículos presentaron el desarrollo de P. marneffei. Se separaron los sueros de estos animales para estudios serológicos. Se preparó un antígeno metabólico de P. marneffei con la cepa aislada. Se sembró una suspensión densa de esporas de la forma micelial en un medio líquido (glucosa al 2 % y extracto de levadura al 1 % en agua destilada). Los frascos se incubaron a 28 °C en un agitador mecánico rotatorio, a razón de 90 ciclos/minuto, durante 4 semanas. Se le adicionó etilmercurio-tiosalicilato de sodio y borato de sodio a la concentración final de 1/5000, para matar al hongo. Después de 48 h a temperatura ambiente, se separó el micelio por filtración y el líquido remanente fue concentrado 10 veces. La capacidad antigénica de este reactivo se probó frente a los sueros de los hámsteres inoculados. La contrainmunoelectroforesis en agarosa presentó dos bandas de precipitación con ambas muestras de suero. La misma reacción efectuada con el suero del paciente no presentó bandas de precipitado. Estudios moleculares para la identificación del aislamiento fúngico proveniente del LBA. A partir de un cultivo en BHI incubado a 37 °C durante 5 días, se preparó una suspensión del hongo (forma levaduriforme) con opacidad equivalente al N.° 3 de la escala de Mc Farland. Un volumen de 10 µl de esta suspensión se usó como molde en las reacciones de PCR. La reacción de PCR se realizó según el siguiente protocolo: tampón PCR 1 x 5 μl, 200 μM de cada dexosirribonucleósido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0,3 mM de MgCl 2, 0,4 μM de cada iniciador (ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ y ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’) (15), 10 μl de molde, 1,25 U/µl Taq ADN polimerasa (Invitrogen, Argentina) y suficiente agua destilada para que el volumen de reacción fuera de 50 μl. La amplificación de la región ADNr se realizó en un termociclador (MiniCycler TM MJ Research Inc, NY, EE. UU.) con los siguientes ciclos: 3 min a 94 °C, 30 ciclos de 45 seg a 94 °C, 45 seg a 55 °C y 45 seg a 72 °C, seguido de una extensión final de 10 min a 72 °C. En la reacción de PCR se incluyó un control negativo y como control positivo se amplificó un aislamiento en fase levaduriforme de P. marneffei de la colección de cultivos de McGinnis (University of Texas, Galverston, EE. UU.). Detección del producto de PCR. Los fragmentos amplificados se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % en tampón TBE (0,09 M Tris, 0,09 M ácido bórico y 2 mM de EDTA, pH 8,3) durante 90 minutos a 90 voltios, y se visualizaron con bromuro de etidio bajo irradiación con luz UV. El producto de amplificación obtenido se purificó con el equipo QIAquick PCR (Qiagen AG, Basel, Suiza) y se secuenció en ambas direcciones usando el equipo ABI Prism 3100/ 3100-Avant Genetic Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). El producto resultante, de 494 pb, se comparó con las secuencias

Infección diseminada por Penicillium marneffei asociada a VIH

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disponibles en GenBank con el programa BLASTn. La secuencia de nucleótidos para la región ADNr del aislamiento procedente del LBA presentó un 100 % de identidad con P. marneffei números de accesos FJ009566.1, FJ009565.1 y FJ009555.1. Esto nos permitió confirmar la identificación microbiológica del aislamiento del LBA del paciente como P. marneffei. P. marneffei es la única especie de género Penicillium que es dimorfa y patógena primaria para el hombre y otras especies de animales. Sobre la base de sus caracteres fenotípicos, fue ubicada por Segretain entre las especies de la sección Asymetrica Divaricada de la clasificación de Raper y Thom (11). Actualmente, sobre la base de los estudios de su ADN, ha sido incluida dentro del subgénero Biverticillum. Si bien el estado teleomorfo de esta especie es desconocido, los integrantes de este subgénero poseen un estado teleomorfo del género Talaromyces, subdivisión Ascomycotina (5, 7). Más del 70 % de los casos de peniciliosis diseminada se asocian al sida y presentan una evolución subaguda. Las manifestaciones clínicas más frecuentes son fiebre prolongada, adelgazamiento, astenia, anorexia, anemia, diarrea, tos seca, disnea, dolor torácico, lesiones cutáneas papulosas de aspecto moluscoide, adenomegalias y hepatosplenomegalia (2, 6, 8, 14). El paciente de este caso presentó varios de estos síntomas, pero debe señalarse que ellos son compartidos por un gran número de enfermedades infecciosas que se observan en pacientes con sida (13). La evolución espontánea de la peniciliosis asociada al sida es siempre fatal, pero su respuesta a los tratamientos antifúngicos es buena. La anfotericina B-desoxicolato, así como sus formulaciones lipídicas y el itraconazol, han demostrado ser eficaces en el tratamiento de esta infección (3, 12, 13). Los estudios in vitro han demostrado que P. marneffei es sensible a anfotericina B, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, 5-fluorocitosina, voriconazol y posaconazol (10). El ketoconazol ha sido desechado por su mayor toxicidad y el fluconazol presentó mayor frecuencia de fracasos terapéuticos que el itraconazol. En cuanto a los triazoles de segunda generación, la experiencia clínica es aún escasa. Por lo general, en los casos graves de peniciliosis se inicia el tratamiento con anfotericina B-desoxicolato, a razón de 0,3 a 0,7 mg/kg/día, y cuando el paciente mejora se cambia por itraconazol por vía oral, a razón de 400 mg/día, hasta alcanzar la remisión clínica completa (3, 11, 13). Para evitar las recidivas, los pacientes HIV-positivos continúan recibiendo 200 mg/ día de itraconazol hasta que presenten dos recuentos de células CD4+ superiores a 150/ml, como consecuencia del tratamiento antirretroviral (4, 12). En el enfermo que motiva esta comunicación de peniciliosis se comprobó la coexistencia de una infección por HIV muy avanzada y con gran velocidad de progresión, como lo demuestran el recuento de linfocitos CD4+ muy bajo y la elevada carga viral. Esta situación facilitó el de-

sarrollo, en corto tiempo, de otras enfermedades virales, bacterianas y fúngicas que complicaron el reconocimiento de la peniciliosis y su tratamiento, lo que empeoró su pronóstico, hasta ocasionarle la muerte. La presentación de este caso clínico tiene por propósito alertar a los médicos de Sudamérica sobre la necesidad de tener en cuenta a la peniciliosis como una de las infecciones fúngicas graves asociadas a la infección avanzada por el HIV, ya que el incremento de las relaciones comerciales y turísticas con el sudeste asiático, así como las corrientes migratorias, hacen posible la observación de esta enfermedad fuera del área endémica, tal como ya ha sucedido en otras regiones (14). Su diagnóstico no es fácil debido a la similitud de manifestaciones clínicas y hallazgos microscópicos con la histoplasmosis (9, 14).

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 268-272

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Recibido: 30/05/2011 – Aceptado: 29/08/2011

Genomic study of EHV-1 strains

273 ISSN 0325-7541 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 273-277

INFORME BREVE

Genomic study of Argentinean Equid herpesvirus 1 strains NADIA A. FUENTEALBA1, 3, GUILLERMO H. SGUAZZA1, MATÍAS L. EÖRY1, 2, 3, ALEJANDRO R. VALERA1, MARCELO R. PECORARO1, CECILIA M. GALOSI1, 4* Cátedras de 1Virología e 2Histología y Embriología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, calle 60 y 118 s/n (1900), La Plata, Buenos Aires, Argentina; 3Centro Científico Tecnológico CONICET, (1900), La Plata; 4Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CIC-PBA), 1900, La Plata, Buenos Aires, Argentina. *Correspondence. E-mail: [email protected]

ABSTRACT Equid herpesvirus 1 (EHV-1) infection has a significant economic impact on equine production, causing abortion, respiratory disease, neonatal death and neurological disorders. The identification of specific EHV-1 genes related to virulence and pathogenicity has been the aim of several research groups. The purpose of the present study was to analyze different genomic regions of Argentinean EHV-1 strains and to determine their possible relationship with virulence or clinical signs. Twenty-five EHV-1 Argentinean isolates recovered from different clinical cases between 1979 and 2007 and two reference strains were amplified and sequenced. The sequence alignments were carried out using Clustal X version 1.92 and the putative amino acid sequences were deduced using Bio-Edit version 7.05. Minor changes were observed. No changes that could be involved in the different virulence in the mouse model of three EHV-1 Argentinean strains were found. No genetic variants were observed. The genomic regions analyzed are unsuitable for differentiation between abortigenic strains and those isolated from neonatal deaths. Key words: Equid herpesvirus 1, genomic analysis, virulence

RESUMEN Estudio genómico de cepas argentinas de Herpesvirus equino 1. La infección por Herpesvirus equino 1 (EHV-1) tiene un significativo impacto económico en la producción equina mundial al causar abortos, enfermedad respiratoria, muertes perinatales y desórdenes neurológicos. La identificación de genes específicos relacionados con la virulencia y patogenicidad de este virus ha sido el propósito de varios grupos de investigación. En este trabajo se analizaron diferentes regiones genómicas de cepas argentinas de EHV-1 para determinar la posible relación entre la estructura genómica y la virulencia o los signos clínicos producidos. Veinticinco cepas aisladas de diferentes casos clínicos observados entre los años 1979 y 2007 y dos cepas de referencia fueron amplificadas y secuenciadas. El alineamiento de las secuencias se realizó con el programa Clustal X versión 1.92; el programa Bio-Edit versión 7.05 permitió deducir la secuencia de aminoácidos. Solo se observaron cambios menores, no se encontraron variaciones que pudieran estar relacionadas con la diferencia de virulencia observada previamente en el modelo ratón. No se hallaron variantes genómicas. Las regiones genómicas analizadas no permitieron diferenciar cepas abortigénicas de aquellas aisladas de muertes neonatales. Palabras clave: Herpesvirus equino 1, análisis genómico, virulencia

Equid herpesvirus 1 (EHV-1) is endemic in horse populations throughout the world. EHV-1 infection has a significant economic impact on equine production, causing abortion, respiratory disease, neonatal death and neurological disorders (1, 3). In Argentina, the first EHV1 isolate was reported in 1979 from aborted fetuses (4). Neurological signs in adult horses were described in 1984 and the virus was first isolated from a horse with respiratory symptoms in 1985. Since then, other viral isolates have been obtained from abortion storms, individual cases of neonatal disease and abortion associated or not with neurological signs. Preliminary molecular studies of Argentinean isolates showed genetic homogeneity between strains and the presence of the EHV-1B genome (10). The first analysis that established phylogenetic relationships among Argentinean EHV-1 strains was conducted

in 2007 (8). A retrospective study carried out in 2009 determined that 7 % of Argentinean strains recovered from aborted fetuses were neuropathogenic mutants (13). The identification of specific EHV-1 genes related to virulence and pathogenicity has been the aim of several research groups. Studies of EHV-1 pathogenesis demonstrated differences among strains, correlated with the ability of strains to disseminate and establish infection at vascular endothelial sites, in particular within the endometrium and central nervous system (4, 5). Nugent et al. (11) showed that variation of a single amino acid of the DNA polymerase is strongly associated with neurological versus non-neurological disease. In addition, Ibrahim et al. (7) suggested that differences found in a conserved domain of the intergenic region between ORF 62 and ORF 63 might be one of the factors affecting virulence. Ghanem et al. (5)

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proposed that point nucleotide differences in ORF 46 and the gene encoded for glycoprotein D in RacL11 and Kentucky D strains could be responsible for their pathogenicity in a rodent model. Gupta et al. (6) postulated that ORFs 1, 2 and 3 could be markers for differentiating abortigenic strains from those causing neonatal disease. Osterrieder et al. (12) proposed that the IR6 protein, encoded by ORF 67, is a major determinant of EHV-1 virulence and might play a role in virus maturation and egress of the cell. Carvalho et al. (2) analyzed the ORF37 of the EHV-1 that encodes a nucleus-associated protein homolog to the UL24 gene product of human herpesviruses and related with virulence in animal models. This protein also plays a role in viral replication in ganglionic neurons, which may be related to the reactivation of latency. The purpose of the present study was to analyze different genomic regions of Argentinean EHV-1 strains and to determine their possible relationship with virulence or clinical signs. To this end, 25 Argentinean EHV-1 isolates recovered from different clinical cases between 1979 and 2007 and two reference strains (HH1 Japanese strain and KyB

American strain) were used in this study (Table 1). In previous studies, the AR1 strain showed low virulence in a respiratory and abortion mouse model (4). In addition, AR2 and AR8 showed different virulence in the abortion mouse model (9). All strains were isolated in primary tissue culture of equine fetal kidney or in rabbit kidney epithelial (RK13) cells. Each strain was then propagated for only three passages in RK13 cells in Minimal Essential Medium (MEM) supplemented with 2 % of fetal calf serum before DNA extraction. Infected RK13 cells were treated with proteinase K and total DNA was extracted with phenol and phenol-chloroform-isoamylalcohol and precipitated by adding 1/10 volume of sodium acetate (3 mol/l) and 2.5 volumes of cold absolute alcohol. The DNA pellets were washed twice with 70 % ethanol and resuspended in distilled water (10). A polymerase chain reaction (PCR) was carried out in an Eppendorf thermal cycler in a final volume of 25 µl, using an amplification reagent kit (PCR Master Mix, Promega Lab., Madison, WI, USA). Six sets of primers amplifying different regions of EHV-1 were used. The DNAs were amplified with an initial denaturation step

Table 1. Equid herpesvirus 1 strains used in this study Origin Strain Clinical Signs Year Place Source AR1 AR2 AR5 AR6 AR7 AR8 AR10 AR11 AR12 AR13 AR14 AR15 AR16 AR17 AR18 AR19 AR20 AR21 AR22 AR50 AR51 AR52 AR53 AR103 AR104 HH1 KyB

Abortion Rhinopneumonitis Abortion Abortion Abortion Abortion Abortion Multiple abortions Abortion Abortion Neonatal disease Neonatal disease Multiple abortions Neonatal Disease Abortion Multiple abortions Multiple abortions Abortion Abortion Neonatal Disease Abortion Neonatal Disease Abortion Abortion associated with neurological signs

1979 1985 1991 1990 1990 1996 2002 2004 2001 1997 1998 1999 1997 1999 1999 2000 1999 2001 1998 2004 2004 2005 2007 1990

La Plata. Bs As La Plata. Bs As Corrientes Tucumán Capitán Sarmiento. Bs As Magdalena. Bs As San Antonio de Areco. Bs As San Antonio de Areco. Bs As Trenque Lauquen. Bs As General Villegas. Bs As Pilar. Bs As San Antonio de Areco. Bs As Entre Ríos Cañuelas. Bs As General Pueyrredón. Bs As General Pueyrredón. Bs As La Plata. Bs As Córdoba Trenque Lauquen. Bs As Bavio. Bs As Chascomús. Bs As Chascomús. Bs As Brandsen. Bs As 25 de mayo. Bs As

CM Galosi CM Galosi CM Galosi CM Galosi CM Galosi CM Galosi CM Galosi M Barrandeguy CM Galosi M Barrandeguy M Barrandeguy M Barrandeguy M Barrandeguy CM Galosi M Barrandeguy M Barrandeguy CM Galosi M Barrandeguy M Barrandeguy CM Galosi CM Galosi CM Galosi CM Galosi CM Galosi

Neonatal Disease Abortion Abortion

1990 1970 1954

Gral Belgrano. Bs As Japan USA

CM Galosi Y Kawakami ER Doll

Genomic study of EHV-1 strains

of 94 °C for 5 min, followed by 30 cycles of amplification, using denaturation at 94 °C for 1 min, annealing at a temperature determined for each primer pair (Table 2), and followed by a final extension at 72 °C for 1 min. The PCR products were run on a 1.5 % agarose gel in 1X TBE Buffer (45 mM Tris-borate, 1 mM ethylenediamine tetraacetic acid –EDTA–, pH 8). The bands were visualized by ultraviolet transillumination after staining with ethidium bromide at a final concentration of 0.5 µg/ml. Each band was purified using a commercial kit (Wizard SV Gel & PCR Clean Up, Promega), quantified by a spectrophotometer (Smart specTM 3000, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and sequenced (Biotechnology Resource Center, University of Cornell, Ithaca, USA). The sequence alignments were carried out using Clustal X version 1.92 and the putative amino acid sequences were deduced using Bio-Edit version 7.05. When primer pairs I, II, III, V and VI were used, single PCR products of 794, 850, 911, 864 and 1188 bp were respectively obtained in all strains analyzed (Table 2). Single PCR products of different sizes between 500 and 800 bp were obtained by ORF 71 amplification when using primer pair IV in all strains. Combination of primer IF and IIIR rendered a single band of ~ 2529 bp in all strains. The nucleotide and amino acid sequences of the Argentinean strains and the AB4 (accession number AY665713) and V592 (accession number AY464052) strains obtained from GenBank were compared. The sequence analysis of ORF 1 showed a 13 nt deletion (nt 1630-1643) in the AR14 strain, isolated from neonatal disease (Figure 1). This deletion generates a frame shift. Three changes were found when ORF 2 was compared: 1) AR5 and AR8 code for glycine at residue

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136 rather than for arginine, as found in other Argentinean strains and AB4 and V592; 2) all Argentinean strains and V592 encode aspartic acid in residue 59, while AB4 encodes glycine, 3) V592 differs from all Argentinean strains and AB4 in one nucleotide at position 2162. ORF 3 was identical among all isolates, including AB4 and V592. Two changes were found when ORF 67 was compared: 1) AR51 strain differs in one nucleotide with respect to all Argentinean strains and AB4 (position 124664) and V592 (position 124141). However, this is a synonymous substitution; 2) V592 differs from all Argentinean strains and AB4 in one nucleotide at position 123890 encoding serine instead of phenylalanine. ORF 46 was identical among all isolates including AB4. Previous research conducted by Gupta et al. (6) reported the finding of an additional band when ORF 1-2-3 was amplified using a single primer pair. In our study, this band was not observed in the Argentinean and reference strains analyzed. These authors hypothesized that ORFs 1-2-3 could be used as potential markers for differentiating the EHV-1 isolates obtained from abortion cases from those obtained from perinatal foal mortality. However, they examined only one strain derived from neonatal disease and suggested that more strains should be analyzed to test this hypothesis. When six Argentinean strains isolated from neonatal diseases were studied, only a 13 nt deletion in the ORF 1 of AR14 was found, allowing to infer that this region might not be used as a marker for differentiation (Figure 1). According to the results obtained by the same authors, the amplification of ORF 71 (a membrane glycoprotein) is variable among all strains because this region is known to contain two 15 bp repeat sequences. Furthermore, from the analysis of ORF 71, these authors

Table 2. Oligonucleotide primer pairs used for PCR amplification of 25 Argentinean EHV-1 strains and reference strains (HH1 Japanese strain and KyB American strain). Annealing temperature and expected product size for each primer pair are indicated Position in Sequence Annealing Primer pair EHV-1 (5’ to 3’) temperature genome (bp)

Product size

I (ORF1)

F: TTTCCATCTCCTCTCCAACT 48 °C 1271 R: CGGCTCTACAGTAAAACCTT 2064

794

II (ORF2)

F: CCGCAAAGGTTAATCGCATT 48 °C 1920 R: CAATCACGGGGACAGCTATT 2769

850

III (ORF3)

F: CACGTACTACGGTTGTTCTA 48 °C 2730 R: ACCGTATATGGTGTTTTGCT 3640

911

IV (ORF71)

F: CTACAACCACAGCTGTTACT 50 °C R: TAGTAGCCGCAGCTGATGTTG

504

V (ORF67)

F: ATTTACACCGTTCCAACTTC 46 °C 124352 R: CCTTTGAAGATAACAGACGT 125215

864

VI (ORF46)

F: GATCATCTCTACGTGCCGCA 52 °C R: GCAAGGCTGTCAGTATCGAG

1188

F: forward

R: reverse

129488 129991

86601 87789

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Figure 1. Sequences of regions with changes in the Argentinean strains. Dashes (-) indicate nucleotide deletion.

classified Indian isolates into two genetic variants (6), but in our study of Argentinean strains this difference was not observed. Osterrieder et al. (12) postulated that a mutation or deletion of the IR6 gene (ORF 67) is correlated with loss of virulence in different isolates, and demonstrated this postulate by converting the non-pathogenic RacH virus into a highly virulent form by insertion of a wild type IR6 gene. However, all Argentinean strains, including AR1, which is less virulent in the mouse model (4), showed no differences in this gene. Other researchers have proposed that some tegument proteins might be involved in the pathogenicity of herpesviruses. Ghanem et al. (5) analyzed several of these genes and found that the serine residue at position 140 in ORF 46 was conserved among RacL11, Kentucky D, and V592. In addition, they found that RacL11 and Kentucky D showed different pathogenicity with respect to AB4 and Japanese strains in a hamster infection model, but were unable to find any reports on the pathogenicity of V592 strains for the same model. Moreover, they demonstrated that AB4 and Japanese strains encode phenylalanine instead of serine in the same position. All Argentinean strains, including

AR1, which proved to be less virulent than other strains, encode phenylalanine. This result suggests that changes in ORF 46 are irrelevant to differentiate among virulent strains. The analysis of ORF 37, a region closely related to viral latency, of two Brazilian EHV-1 isolates and reference strains showed that this genomic region is highly conserved (2). However, this region was not studied in Argentinean strains. The Argentinean strains showed genetic homogeneity when they were studied from the analysis of the intergenic region (ORF62-ORF63) postulated by Ibrahim et al. (7) as an indicator of virulence. In addition, phylogenetic analysis performed using parsimony as an optimality criterion and equal weighting strategies based on this region revealed that these Argentinean EHV-1 strains constitute a polyphyletic group (8, 9). A new study analyzed the genetic distance among the same EHV-1 strains based on the ORFs 1-2-3 and confirmed our previous results (Martín Ocampos GP et al., unpublished data). We conclude that the genomic regions analyzed are unsuitable for differentiation between abortigenic strains and those isolated from neonatal deaths. In addition, in these regions there were no changes that could be

Genomic study of EHV-1 strains

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involved in the different virulence of EHV-1 Argentinean strains AR1, AR2 and AR8 shown in the mouse model. Further studies are needed to know and to determine which genomic regions are involved in the virulence of strains and whether virulence is related to other factors not yet determined. This report describes the first genomic study performed with Argentinean strains to determine the cause of the different virulence or clinical signs produced. Accession Numbers: The coding sequences of the strains showing variations have been deposited in the GenBank database under the accession numbers: JN562754 (ORF1 AR14), JN613350 (ORF2 AR5), JN613351 (ORF2 AR8), JN613352 (ORF67 AR51), JN613371 (ORF71 AR1), JN613363 (ORF71 AR2), JN613368 (ORF71 AR5), JN613364 (ORF71 AR6), JN613354 (ORF71 AR7), JN613369 (ORF71 AR8), JN613362 (ORF71 AR10), JN613366 (ORF71 AR11), JN613353 (ORF71 AR12), JN613357 (ORF71 AR13), JN613377 (ORF71 AR14), JN613367 (ORF71 AR15), JN613372 (ORF71 AR16), JN613355 (ORF71 AR17), JN613358 (ORF71 AR18), JN613370 (ORF71 AR19), JN613359 (ORF71 AR20), JN613360 (ORF71 AR21), JN613365 (ORF71 AR22), JN613373 (ORF71 AR50), JN613374 (ORF71 AR51), JN613375 (ORF71 AR52), JN613376 (ORF71 AR53), JN613361 (ORF71 AR103), JN613356 (ORF71 AR104). Acknowledgements: CMG is a researcher of the Scientific Research Commission (CIC) Buenos Aires Province (PBA); NAF and MLE are fellows of CCT-CONICET-La Plata, Argentina. We thank Dr. María Barrandeguy for providing some of the strains used in this study. This study was supported by grants from CIC-PBA and the Department for Science and Technology at the Universidad Nacional de La Plata.

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Recibido: 21/05/11 – Aceptado: 11/11/11

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43:0325-7541 278-286 ISSN Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 278-286

ARTÍCULO ORIGINAL

Métodos para la detección de Agrobacterium a partir de muestras de material vegetal, suelo y agua ADRIANA M. ALIPPI1*, ANA C. LÓPEZ2, PEDRO A. BALATTI1 Centro de Investigaciones de Fitopatología (CIDEFI), Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, Calles 60 y 119 S/N, 1900, La Plata Argentina. 1 Investigadores de la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CIC), Argentina; 2 Investigadora de CONICET (CCT La Plata), Argentina. *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN El género Agrobacterium incluye especies fitopatógenas que inducen la formación de agallas en el cuello o la proliferación de raíces en cabellera en más de 600 especies de dicotiledóneas, y especies no patógenas cuyo hábitat natural es el suelo. Como no es posible erradicar a las especies patógenas y habida cuenta de que más del 80 % de las infecciones puede provenir de viveros, es importante evitar la diseminación de la enfermedad. Por ello, el objetivo de este trabajo ha sido desarrollar técnicas sensibles y precisas que, aisladamente o combinadas, permitan detectar la presencia de especies y biovares de Agrobacterium a partir de muestras de material vegetal, suelo y agua. Se comprobó que con la estrategia combinada de realizar aislamientos en los medios semiselectivos D1, D1-M y YEM-RCT; PCR multiplex sobre el gen 23S ADNr; PCR específica sobre los genes virC1 y virC2 y bioensayos en plántulas de pimiento cv. California Wonder y en hojas cortadas de kalanchoe, se reduce la posibilidad de obtener falsos negativos y/o falsos positivos. Por lo expuesto, esta combinación de técnicas constituye una herramienta adecuada para el diagnóstico de cepas patógenas de Agrobacterium a partir de distintos tipos de muestras. Palabras clave: Agrobacterium, técnicas de detección, suelo, agua, agalla de corona, PCR

ABSTRACT Methods for the detection of Agrobacterium from plant, soil and water samples. The genus Agrobacterium includes phytopathogenic bacteria that induce the development of root crown galls and/or aerial galls at the base of the stem or hairy roots on more than 600 species of plants belonging to 90 dicotyledonous families and non-pathogenic species. These bacteria being natural soil inhabitants are particularly difficult to eradicate, which is a problem in nurseries where more than 80% of infections occur. Since early detection is crucial to avoid the inadvertent spread of the disease, the aim of this work was to develop sensitive and precise identification techniques by using a set of semi-selective and differential culture media in combination with a specific PCR to amplify a partial sequence derived from the virC operon, as well as a multiplex PCR on the basis of 23SrDNA sequences, and biological assays to identify and differentiate species and biovars of Agrobacterium obtained either from soil, water or plant samples. The combination of the different assays allowed us to reduce the number of false positive and negative results from bacteria isolated from any of the three types of samples. Therefore, the combination of multiplex PCR, specific PCR, isolations in semi-selective D1, D1-M and YEM-RCT media combined with bioassays on cut leaves of Kalanchoe and seedlings of California Wonder pepper cultivar constitute an accurate tool to detect species and biovars of Agrobacterium for diagnostic purposes. Key words: Agrobacterium, soil, water, crown gall disease, detection techniques, PCR

INTRODUCCIÓN Agrobacterium es un género polifilético que pertenece a la subdivisión alfa de la subclase Proteobacteria, familia Rhizobiaceae. Incluye tanto especies fitopatógenas que inducen la formación de agallas en el cuello o la proliferación de raíces en cabellera, según contengan el plásmido Ti o Ri, respectivamente, como especies no patógenas cuyo hábitat natural es el suelo (3, 13, 19, 20, 22). Agrobacterium infecta a más de 600 especies ubicadas dentro de 90 familias de dicotiledóneas, que incluyen cultivos de importancia económica como frutales (ciruelos, durazneros, perales, frambuesos, nogales, cerezos, arándanos),

hortícolas (tomate, pimiento, berenjena), industriales (girasol, olivo, soja), ornamentales (rosales, crisantemos) y forestales (álamos, sauces) (13, 22). Las especies patógenas de Agrobacterium comparten una característica: contienen un plásmido de entre 200 y 800 pkb denominado plásmido Ti (tumor-inducing) o Ri (root-inducing), según su capacidad de inducir en el hospedante la formación de agallas en la zona del cuello o la corona y/o agallas aéreas en la parte inferior del tallo, o la proliferación de raíces en cabellera, respectivamente. Esto es el resultado de un mecanismo complejo y único codificado en el plásmido, por medio del cual la bacteria transfiere ADN del plásmido Ti o Ri, que se expresa y por

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ello afecta a las células vegetales. La virulencia está determinada por diferentes regiones presentes en estos plásmidos; estas incluyen el ADN de transferencia (T-DNA) y los genes de virulencia (vir) (7). Si bien los plásmidos Ti y Ri varían en gran medida entre las diferentes cepas bacterianas, siempre contienen genes vir similares (15). Tradicionalmente, las especies del género se clasificaban de acuerdo con su capacidad patogénica; estas comprendían A. tumefaciens, especie polífaga que induce la formación de agallas en cuello y raíz; A. rubi, que induce la formación de agallas sobre un rango de hospedantes limitado, principalmente frambueso; A. vitis, específico de vid; A. larrymoorei, que provoca agallas aéreas en Ficus benjamina, y A. rhizogenes, que induce el desarrollo de raíces en cabellera. Por otra parte se ubicaban las especies no patogénicas, como Agrobacterium radiobacter (5, 9). Posteriormente, el género aparece dividido en 4 especies, A. tumefaciens, A. rhizogenes, A. rubi y A. vitis, las cuales, con excepción de A. rubi, se subdividen a su vez en biovares sobre la base de características fisiológicas y bioquímicas (9, 22). Este género almacena un considerable nivel de diversidad, que tal vez sea el resultado de la transferencia horizontal de ADN que ocurre naturalmente en los suelos (11). Por esta razón, las características tumorigénicas y rizogénicas de las especies se pueden transmitir al transferirse los plásmidos en forma separada, lo que genera una dinámica que determina la aparición de estirpes de A. tumefaciens o A. rhizogenes no patógenas, por haber perdido sus respectivos plásmidos. De este modo, pueden coexistir cepas de A. tumefaciens que contienen el plásmido Ri y cepas de A. rhizogenes que contienen el plásmido Ti, que inducen la formación de raíces o de agallas, respectivamente. Esta movilidad de plásmidos no ha sido descrita ni en A. rubi ni en A. vitis, en donde solo se ha encontrado el plásmido Ti (15, 22). Más allá de estas denominaciones, Young et al. (23) propusieron incluir a Agrobacterium dentro del género Rhizobium. Sin embargo, otros autores como Farrand et al. (6) discuten que Agrobacterium constituye un grupo definido y distinto dentro de la familia Rhizobiaceae. Por su parte, Pulawska et al. (18) desarrollaron una clasificación más simple basada en las diferencias encontradas en la secuencia del gen 23S ARNr. Esta metodología permite discriminar por un sistema de PCR multiplex 4 taxones, Agrobacterium bv. 1, Agrobacterium bv. 2, Agrobacterium vitis (bv. 3) y A. rubi, que se correlacionan con la primitiva diferenciación en biovares manteniendo a A. larrymorei como una especie separada. Esta última será la nomenclatura que se empleará en este trabajo. Si bien las agrobacterias son comunes en la microbiota del suelo, tanto en forma saprobia como patógena, se conoce muy poco sobre la estructura de estas poblaciones bacterianas, principalmente debido a la dificultad de detectar su presencia en el suelo, la rizosfera y el material vegetal asintomático (16). Parte de esta dificultad se debe

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a la presencia en el suelo de agrobacterias no patógenas y bacterias de la familia Rhizobiaceae, que comparten características similares. Si se emplea una técnica única de detección pueden generarse falsos positivos o falsos negativos. En el caso de los medios semiselectivos o selectivos, no todos los biovares y/o especies de Agrobacterium desarrollan en ellos y, por el contrario, pueden desarrollar muchas especies de rizobios presentes en el suelo, superficies vegetales y agua de riego. De esta forma, muchas especies patógenas de Agrobacterium pueden pasar desapercibidas al dar lugar a falsos negativos (8, 10, 13, 14, 16) cuando se emplean medios con insuficiente o con demasiada selectividad. Por otra parte, si solo se emplean métodos moleculares para su detección, pueden originarse resultados contradictorios, como ha sucedido al emplearse los primers A-C desarrollados por Haas et al. (8), que amplifican una secuencia del gen virD2 presente en los plásmidos Ti y Ri. Con este sistema se ha observado entre un 12 y un 15 % de falsos positivos y un 7 % de falsos negativos (8). Por lo expuesto, el objetivo de este trabajo ha sido desarrollar técnicas sensibles y precisas que, aisladamente o combinadas, permitan detectar la presencia de especies patógenas de Agrobacterium a partir de muestras de material vegetal, suelo y agua.

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas bacterianas Para el presente estudio se seleccionaron aislamientos de diversos hospedantes herbáceos y leñosos que presentaron síntomas de agalla en la zona del cuello o corona, aislamientos de muestras de suelo y suelo rizosférico en contacto directo con el rizoplano y aislamientos obtenidos de agua de riego provenientes de diversas regiones de la Argentina (Tabla 1). Se incluyeron cepas de colecciones internacionales de A. tumefaciens (ATCC 15955, LBA 958), A. radiobacter (K1026) y A. vitis (K 306 y S4), y una cepa previamente caracterizada y secuenciada de A. rubi (F 210) (Genbank GU580894) (2). Como controles adicionales se emplearon cepas de Rhizobium etli bv. phaseoli (CFN4), Rhizobium galegae, Bradyrhizobium japonicum (E109), Synorhizobium melilotti (2011) y Synorhizobium freedi (1031 HH). Aislamientos de bacterias a partir de plantas con síntomas Los aislamientos a partir de plantas con síntomas de agalla en el cuello o corona se obtuvieron luego de desinfectar las agallas sin cortar (previo lavado con agua corriente para eliminar restos de suelo) por inmersión en hipoclorito de sodio al 1 %, durante 15 min en el caso de plantas leñosas (olivo, arándano, flor de cera, frambueso) y durante 5 min para las herbáceas (tomate, pimiento), y posterior enjuague por 3 pasajes en agua destilada estéril (5 min c/u). Luego del último enjuague, las agallas se cortaron en dados de 2 × 2 mm en forma aséptica. Estos se colocaron en 15 ml de agua destilada estéril, se maceraron y dejaron durante 45 min, al cabo de los cuales se agitó en un agitador tipo vórtex; con ese material se efectuaron estrías en los siguientes medios: D1 (12); D1-M (20) y YEM rojo congo (21) adicionado con telurito de potasio (Britania®, Argentina) (YEM-RCT) a una concentración final de 60 µg/ml, para aumentar la selectividad (14). Las placas se incubaron a 27 ± 1 °C por el término de 7 días como mínimo; cada 24 h se observaron para determinar desarrollo bacteriano.

280 Aislamientos de suelo y suelo rizosférico en contacto directo con el rizoplano Las muestras de suelo se tomaron a una profundidad de entre 5 y 10 cm. Cada submuestra de 1 g de suelo se suspendió en 10 ml de agua destilada estéril; esta suspensión se mantuvo en agitación constante a 10 °C durante 30 min. Luego la suspensión se decantó y se mantuvo 5 min a la misma temperatura. Posteriormente se efectuaron 6 diluciones seriadas en agua destilada estéril, para luego sembrar en placas, alícuotas de 100 µl de cada una de las 3 últimas diluciones, en todos los medios de cultivo antes detallados, que se suplementaron con 50 µg/ml de cicloheximida para evitar el desarrollo de especies fúngicas presentes en las muestras de suelo. Las placas se incubaron a 27 °C ± 1 por el término de 7 días como mínimo; cada 24 h se observaron para detectar desarrollo bacteriano. En el caso de muestras de suelo rizosférico, se trabajó con el suelo en contacto directo con el rizoplano. Las plantas se descalzaron cuidadosamente y el suelo adherido a las raíces y la zona del cuello se recolectó dentro de bolsas plásticas, luego de separarlo del material vegetal. Se tomaron submuestras de 5 g de suelo y se suspendieron en 50 ml de agua destilada estéril dentro de frascos con tapa a rosca, se mantuvo en agitación a 10 °C durante 30 min. Posteriormente se procedió de la misma manera que para las muestras de suelo. Aislamientos de agua de riego Para el análisis a partir de agua, se tomaron alícuotas de 25 ml y se centrifugaron a 10 °C durante 45 minutos. Se eliminó el sobrenadante dejando el pellet formado en un volumen de 5 ml, este se homogeneizó por agitación en agitador tipo vórtex durante 5 min, para posteriormente efectuar diluciones seriadas en agua destilada estéril y sembrar alícuotas de 100 µl por placa en todos los medios de cultivo detallados anteriormente para suelo. Las placas se incubaron a 27 ± 1 °C por el término de 7 días como mínimo, cada 24 h se observaron para detectar desarrollo bacteriano. Mantenimiento de la colección bacteriana Todas las colonias que presentaron morfología similar a la exhibida por Agrobacterium en los distintos medios se purificaron en medio YDC (13). Los aislamientos Gram negativos, oxidasa positivos, cuando eran cultivados en medios sin glucosa y que presentaron metabolismo oxidativo de glucosa (13, 22), se emplearon para los estudios posteriores, para lo cual se hicieron stocks en medio YEM líquido con 20 % de glicerol v/v y se mantuvieron a -80 °C. Bioensayos sobre kalanchoe empleando agua del lavado del material A partir del agua de lavado del material vegetal y del concentrado de agua de riego, del suelo y del suelo rizosférico en contacto directo con el rizoplano, se efectuaron bioensayos sobre hoja cortada de kalanchoe (Bryophyllum daigremontiana), de acuerdo con la metodología propuesta por Beriam et al. (4), con las siguientes modificaciones: se seleccionaron las hojas más jóvenes, de por lo menos 4 cm de largo, provenientes de plantas de entre 10 y 20 cm de alto, las que luego del lavado en agua corriente se desinfectaron superficialmente por inmersión en etanol al 70 % durante 2 min y se dejaron en una solución comercial de hipoclorito de sodio (5 % v/v) durante 15 min. Después se realizaron 3 lavados en agua destilada estéril, de 10 min cada uno. Las hojas se lesionaron en su parte basal mediante un corte con escalpelo estéril y se colocaron con pinzas estériles en cada suspensión de lavado o concentrado (3 repeticiones por muestra); como control se utilizó agua destilada estéril. Las hojas se dejaron en contacto con la suspensión durante 45 min, al cabo de los cuales se llevaron a tubos de Roux estériles previamente preparados con algodón y 10 ml de agua destilada estéril en la parte inferior, para mantener la humedad. Los tubos se mantuvieron en condiciones de laboratorio bajo una fuente

Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 278-286 de iluminación conformada por 8 tubos GRO KLUX MP100 con un fotoperíodo de 12 h de luz y a una temperatura de 24-28 °C. La presencia de agallas en la zona lesionada se evaluó a partir de los 10 días de la inoculación mediante la comparación con la muestra de kalanchoe control lacerada con escalpelo. El sistema se mantuvo por espacio de 4 semanas; las muestras libres de proliferaciones se consideraron negativas. A partir de las agallas desarrolladas se efectuaron aislamientos según lo detallado anteriormente. Bioensayo semicuantitativo sobre hoja cortada de kalanchoe a partir de cultivos bacterianos. Con el objeto de determinar la virulencia relativa de los aislamientos de Agrobacterium obtenidos en los medios semiselectivos, se empleó un bioensayo semicuantitativo en hoja cortada de kalanchoe, usando una modificación de la técnica descrita por Minnemeyer et al. (12). Se emplearon las hojas más jóvenes de plantas de kalanchoe desinfectadas de la forma detallada anteriormente. Estas se lesionaron empleando el extremo distal de una punta de micropipeta desechable estéril, sin atravesarlas. Se realizaron 4 lesiones por hoja, sobre las que se colocaron 5 µl de cada suspensión bacteriana en agua destilada estéril, preparada a partir de un cultivo en YEM rojo congo (YEM-RC) desarrollado a 28 °C durante 24-48 h; la concentración bacteriana fue del orden de 109 UFC/ml. Las hojas así inoculadas se colocaron dentro de placas de Petri que contenían agar agua al 2 % y 50 µg/ml de cicloheximida, para evitar la proliferación de hongos, y se mantuvieron bajo un fotoperíodo de 12 h de luz a una temperatura que osciló entre los 24 y los 28 °C. A partir de los 10-12 días se evaluó la formación de tumores en el área lesionada. Pruebas de patogenicidad Adicionalmente, con el fin de evaluar la patogenicidad de todos los aislamientos, se emplearon plantas de pimiento (Capsicum annuum) cv. California Wonder de 4 semanas, obtenidas de semillas desinfectadas superficialmente y cultivadas en macetas con sustrato estéril. Se realizaron 2 repeticiones por cepa y controles. La inoculación se efectuó por lesión del tallo con aguja estéril, previamente sumergida en cada suspensión bacteriana preparada como ya se describió. Luego, cada lesión se rodeó con un trozo de Parafilm® (Pechinary Plastic Packaging Company, Chicago, EE.UU.). Las plantas inoculadas se mantuvieron dos días en cámara húmeda y después se llevaron a invernáculo durante un período de 45 días a una temperatura de 24 ± 4 °C; semanalmente se fueron registrando los síntomas observados. Producción de 3-cetolactosa Para efectuar una diferenciación primaria entre los biovares 1 y 2, se evaluó la producción de 3-cetolactosa en medio agar levadura-lactosa (13). Brevemente, se sembraron en placas cultivos de 24 h y se incubó a 28 °C; a los 3 días las placas se cubrieron con 15 ml de reactivo de Benedict y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 1 hora. La presencia de 3-cetolactosa se detectó por formación de un anillo amarillo de CuO2 alrededor de las colonias bacterianas (13). Obtención de ADN molde para las reacciones de PCR Se obtuvo ADN bacteriano a partir de los siguientes tipos de muestras: cultivo bacteriano puro, material vegetal con síntomas, agua de riego y agua de lavado de suelo y de lavado de suelo rizosférico. En el caso de los cultivos puros, la extracción de ADN se efectuó a partir de colonias individuales desarrolladas en medio sólido empleando una técnica de extracción rápida mediante resina de intercambio iónico (1). Brevemente, se tomaron una a dos colonias bacterianas mediante un palillo estéril y se suspendieron en 300 µl de NaCl 1M. Cada muestra se agitó en un agitador tipo vórtex y se centrifugó a 16 000 g durante 3 minutos. El sobrenadante se descartó y el pellet bacteriano se resuspendió

Métodos de detección de Agrobacterium en 150 µl de una suspensión acuosa de una resina de intercambio iónico (Chelex®, Sigma‑Aldrich, Argentina) preparada al 6 % p/v. La mezcla se incubó a 56 °C durante 20 min, se agitó en agitador vórtex durante 30 segundos y se incubó a 99 °C durante 8 min. Los restos bacterianos junto con la resina se eliminaron por centrifugación y se empleó como templado de ADN 5 µl del sobrenadante. Para la obtención de ADN molde a partir de material vegetal con síntomas, se tomaron 100 µl del agua de difusión luego de 45 minutos y se transvasaron a un tubo Eppendorf con 900 µl de agua bidestilada. Se mezcló vigorosamente (agitador vórtex) durante 30 segundos y se transvasaron alícuotas de 50 µl de la dilución realizada a nuevos tubos Eppendorf. Se incubó en un baño seco a 56 °C durante 20 minutos, luego se mezcló en agitador vórtex durante 1 min y se incubó a 95 °C durante 15 minutos. En el caso del agua de riego o del lavado de suelo, el molde fue el mismo que el mencionado para el material vegetal, con la diferencia de que la segunda incubación fue a una temperatura de 99 °C durante 8 minutos. Identificación por PCR Se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un fragmento de 730 pb correspondiente a las secuencias del operón virC localizado en los plásmidos Ti y Ri de las cepas patógenas de Agrobacterium. A tal fin se siguió la metodología descrita por Sawada et al. (19), pero se emplearon 5 µl de ADN molde (obtenido según se detalló en el apartado correspondiente) en un volumen total de reacción de 25 µl. Previamente se probaron diferentes cantidades de ADN, y se determinó que la óptima para esta premix era aquella contenida en 5 µl del fluido sobrenadante de la preparación cruda de ADN. Se empleó un ciclador marca Eppendorf modelo Mastercycler personal®. Para la diferenciación entre los biovares 1 y 2 y entre las especies A. rubi y A. vitis, se empleó la técnica de PCR multiplex basada en las diferencias en el gen 23S ADNr. Se utilizó para ello un primer universal forward UF y 4 primers

281 especies/biovar-específicos: B1R para el bv. 1; B2R para el bv. 2, AvR para A. vitis y ArR para A. rubi, respectivamente (18). Se siguieron las especificaciones de Pulawska et al. (18), pero empleando 5 µl de ADN molde para un volumen final de reacción de 25 µl. En todos los casos, los resultados de las reacciones de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 1,6 %; el ADN fue teñido con bromuro de etidio y observado mediante un transiluminador UV (UVP®, Instrumentación Científica Técnica, S.L., La Rioja, España). Las imágenes de los geles se digitalizaron y fotografiaron empleando el sistema de captura digital de geles Digi Doc-it, UVP v.1.1.25.

RESULTADOS Aislamiento de cepas de Agrobacterium en medios semiselectivos y diferenciales La metodología utilizada para aislar cepas de Agrobacterium resultó efectiva cuando se emplearon los medios semiselectivos D1, D1-M y YEM-RCT, tanto en la evaluación de muestras vegetales provenientes de plantas con síntomas de agalla de la corona como de muestras de suelo, de suelo rizosférico en contacto directo con el rizoplano y de agua de riego. En los medios D1 y D1-M, las colonias presentaron coloración y características típicas del género Agrobacterium. En el medio D1, las colonias observadas eran circulares y convexas, de color verdoso-amarillento con centros más oscuros y bordes de color blanco cremoso; a las 48-72 h de incubación presentaron un color azul muy claro y con

Figura 1. A. Colonias de Agrobacterium tumefaciens bv. 1 en medio D1, luego de 6 días de incubación. Un aislamiento de agallas (cepa F241) dio lugar a estas colonias, que son de forma convexa, mucosas, brillantes, de color verde oliva B. Colonias de Agrobacterium rubi desarrolladas en medio D1-M a partir de un aislamiento de agallas (cepa F253). Las colonias típicas se indican con una flecha, estas aparecen circulares, convexas, mucosas, brillantes, de color verde azulado con centros más oscuros por absorción del colorante verde de malaquita, a los 4 días de incubación. C. Colonias de Agrobacterium bv. 2 desarrolladas en YEM- RCT a partir de una muestra de agua de riego (cepa 100/09M1). Las colonias aparecen como muy mucosas, convexas y con los centros de color negro por acumulación de cristales de telurito metálico, a las 48 h de incubación. Las colonias típicas se indican con una flecha. D. Producción de 3-cetolactosa: 1: positivo, Agrobacterium tumefaciens bv. 1 cepa F268; 2: negativo, Agrobacterium rubi F 253.

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Figura 2. Bioensayo semicuantitativo en hoja cortada de kalanchoe (Bryophyllum daigremontiana). A. Control lesionado más agua destilada estéril. B. Inoculada con la cepa F 241 de Agrobacterium tumefaciens bv. 1, a los 14 días.

Figura 3. Plántulas de pimiento (Capsicum annuum cv. California Wonder): A. Control. B. Plántula de pimiento inoculada artificialmente con la cepa F 241 de A. tumefaciens bv. 1. Las flechas indican las lesiones positivas a los 45 días de efectuada la inoculación.

el correr del tiempo se tornaron de color verde oliva, pero siempre con bordes más claros, estas tomaron el color del azul de bromotimol (Figura 1A). Por otra parte, las colonias desarrolladas en el medio D1-M resultaron circulares, convexas, mucosas, brillantes, de color azul verdoso, tenue al principio, pero con centros de color azul más oscuro, debido a que metabolizan el verde de malaquita, y bordes más claros. A veces resultaron ser grisáceas o blancuzcas, pero con los centros azulados (Figura 1B). En YEM-RCT, las colonias aparecen mucosas, convexas, circulares, con márgenes enteros y de color negro más marcado en la parte central, probablemente debido a una acumulación de cristales negros de telurito metálico (Figura 1C). Los medios D1, D1-M y YEM-RCT restringieron el crecimiento de otras bacterias saprobias, con excepción de algunas especies de Rhizobium, Bradyrhizobium y Synorhizobium, lo que en el caso del medio YEM-RCT se debería a que son resistentes al telurito. Con respecto a los medios D1 y D1-M, las células de Rhizobium, Bradyrhizobium y Synorhizobium que pueden estar presentes en las muestras de suelo y suelo rizosférico desarrollan en estos medios, pero luego de un período de incubación de más de 7 días pueden presentar una coloración diferente (de acuerdo con la cepa probada); asimismo, en el medio D1 pueden verse inhibidas por el LiCl.

En el medio D1-M, todas las cepas de Agrobacterium identificadas como bv. 1 y bv. 2, lo mismo que A. rubi y A. radiobacter, mostraron un activo crecimiento, con excepción de las cepas control de A. vitis K 306 y S4. No obstante, estas últimas presentaron un muy buen desarrollo al cultivarlas en YEM-RCT. Bioensayos y pruebas de patogenicidad Todas las cepas de Agrobacterium bv. 1, Agrobacterium bv. 2 y A. rubi provocaron la formación de agallas esféricas y esponjosas en los puntos de inoculación en hojas cortadas de kalanchoe; estas se visualizaron entre los 7 y 14 días de efectuada la inoculación (Figura 2). Las cepas de A. vitis K 306 y S4 indujeron zonas necróticas alrededor de los puntos de lesión, que no evolucionaron a proliferaciones celulares. La cepa de A. radiobacter K 1026 y los rizobios no produjeron síntomas, solo se observaron los puntos de lesión, al igual que en el testigo colocado en agua. El pimiento cv. California Wonder respondió rápidamente a la inoculación, ya que en los puntos de lesión del tallo generó a los 7 días agallas esféricas, de color blanco-rosado a castaño claro y de aspecto verrugoso (Figura 3). Todas las cepas probadas de Agrobacterium bv. 1, bv. 2 y A. rubi indujeron lesiones en pimiento, las cepas de A. vitis K 306 y S4 solamente manifestaron aparición de áreas necróticas en los puntos de inoculación.

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Tal cual era de esperar, las cepas de A. radiobacter K 1026 y los rizobios no provocaron la aparición de ningún tipo de síntoma. En todos los casos en los que se observaron lesiones o sintomatología típica, se procedió a efectuar los reaislamientos de las cepas inoculadas y se cumplimentaron los postulados de Koch. Producción de 3-cetolactosa La habilidad de las cepas de utilizar 3-cetolactosa permitió efectuar una diferenciación primaria entre los diferentes biovares y la especie A. rubi. Solo las cepas de Agrobacterium tumefaciens bv. 1 mostraron que su metabolismo da lugar a la formación de un anillo amarillo de óxido cuproso alrededor de las colonias luego del agregado del reactivo de Benedict (reacción positiva) (Figura 1D). Todas las cepas de A. rubi, Agrobacterium bv. 2, A. radiobacter, A. vitis y los rizobios dieron reacción negativa (Tabla 1).

Identificación por PCR El 100 % de los aislamientos sospechados de ser Agrobacterium mostraron el producto de amplificación esperado de 730 pb mediante una PCR específica empleando los primers VCF/VCR, homólogos a una secuencia parcial del operón virC (genes virC1 y virC2) presente en los plásmidos Ti y Ri (Figura 4). Este resultado permitió identificar con precisión la totalidad de los aislamientos que inducían la formación de agallas en kalanchoe y en pimiento, tanto de aquellos recuperados del agua de lavado de lesiones y/o de suelo como de los que fueron previamente aislados en los medios semiselectivos. De acuerdo con lo esperado, las cepas de Rhizobium etli bv. phaseoli (CFN4), Rhizobium galegae, Bradyrhizobium japonicum (E109), Synorhizobium melilotti (2011) y Synorhizobium freedi (1031 HH) y la cepa control de A. radiobacter no generaron producto de amplificación alguno. Los resultados obtenidos mediante el empleo de PCR multiplex basada en las diferencias del gen 23S ADNr con-

Tabla 1. Denominación, hospedante, origen geográfico y algunas características de las cepas de Agrobacterium y las cepas de referencia utilizadas en este trabajo. Cepa ATCC 15955 LBA 958 K 1026 K 306 S4 F 266 F 210 F 236 F 241 F 253 F 268 F 272 F 342 F 350 F 351 F 352 F 353 F 359 F 362 F 382 F 400 F 448 F 450 100/09M1 100/09M2 110/10

Género, especie y/o biovar Agrobacterium tumefaciens A. tumefaciens A. radiobacter A. vitis A. vitis A . rubi A. rubi A. tumefaciens A. tumefaciens A. rubi A. tumefaciens A. rubi A. tumefaciens A. tumefaciens A. tumefaciens A. tumefaciens A. tumefaciens A. rubi Agrobacterium bv. 2 A. tumefaciens Agrobacterium bv. 2 A. tumefaciens A. tumefaciens Agrobacterium A. tumefaciens A. tumefaciens

Fuente de aislamiento N/D N/D N/D vid vid arándano arándano flor de cera frambueso arándano arándano arándano cv. O´Neil tomate cv. He Man suelo rizosférico de cerezo suelo rizosférico de cerezo suelo suelo suelo Olivo cv. Picual Olivo cv. Barnea arándano pimiento suelo rizosférico de duraznero agua de riego agua de riego agua de riego

Región de origen

3-ceto- PCR lactosa

N/D N/D N/D Australia Hungría Morón, Argentina Pilar, Argentina La Plata, Argentina Mar del Plata, Argentina Tucumán, Argentina Concordia, Argentina Entre Ríos, Argentina La Plata, Argentina La Rioja, Argentina La Rioja, Argentina La Rioja, Argentina La Rioja, Argentina La Rioja, Argentina La Rioja, Argentina La Rioja, Argentina Buenos Aires, Argentina La Rioja, Argentina Córdoba, Argentina La Rioja, Argentina La Rioja, Argentina Mendoza, Argentina

Multiplex

- + bv. 2 + + bv. 1 - - N/D - + vitis - + vitis - + rubi - + rubi + + bv. 1 + + bv. 1 - + rubi + + bv. 1 - + rubi + + bv. 1 + + bv. 1 + + bv. 1 + + bv. 1 + + bv. 1 - + rubi - + bv. 2 + + bv. 1 - + bv. 2 + + bv. 1 + + bv. 1 - + bv. 2 + + bv. 1 + + bv. 1

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Figura 4. Productos de amplificación obtenidos por PCR empleando los primers VCF/VCR, homólogos a una secuencia parcial del operón virC (genes virC1 y virC2) con ADN de las siguientes cepas bacterianas: calle 1, Agrobacterium tumefaciens bv. 1 cepa LBA958; calle 2, Agrobacterium rubi cepa F 266; calle 3, Agrobacterium bv. 2 cepa F 362. M, marcador de peso molecular ladder 100 bp Promega®.

firmaron que las cepas que pertenecían al biovar 1, que resultaron cetolactosa positivas, exhibieron un amplicón de 184 pb. Dentro de las cepas cetolactosa negativas, las pertenecientes al biovar 2 exhibieron un amplicón de 1066 pb. En las cepas de A. rubi el amplicón característico correspondió a 1006 pb (Figura 5A), en tanto que las cepas de A. vitis K306 y S4 exhibieron un amplicón de 478 pb (Figura 5B). Como era previsible, ninguna de las cepas de Rhizobium, Bradyrhizobium y Synorhizobium generaron productos de amplificación con la multiplex (Figura 5B).

DISCUSIÓN Uno de los aspectos claves para el diagnóstico y el control de las enfermedades de origen bacteriano en los vegetales es disponer de metodologías precisas que no generen falsos positivos y/o falsos negativos, para una correcta identificación de los agentes patógenos y el análisis de potenciales fuentes de inóculo, tanto en el suelo como en el material vegetal. Con respecto al aislamiento y la posterior identificación de cepas de Agrobacterium, con la combinación de las reacciones de PCR empleadas, el aislamiento en los medios semiselectivos D1, D1M y YEM-RCT y los bioensayos en kalanchoe y pimiento cv. California Wonder se obtuvo una efectividad mayor del 99 % en la identificación de cepas patógenas provenientes de agallas, suelo, suelo rizosférico y agua.

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Figura 5. Productos de amplificación obtenidos por PCR multiplex basada en las diferencias del gen 23s ADNr entre especies y biovares de Agrobacterium, empleando el primer universal UF (forward) y 4 primers especies/biovar-específicos (B1R para el bv. 1; B2R para el bv. 2, AvR para A. vitis y ArR para A. rubi), con ADN de las cepas bacterianas que se detallan a continuación. 5A: calle 1, Agrobacterium bv. 2 cepa F 362; calle 2, Agrobacterium rubi cepa F 266; calle 3, Agrobacterium tumefaciens bv. 1 cepa LBA 958; 5B: calle 1, Agrobacterium vitis cepa K306; calle 2, Agrobacterium vitis cepa S4; calles 3 y 4, controles negativos (Rhizobium galegae y Synorhizobium freedii 1031HH, respectivamente). M, marcador de peso molecular ladder 100 bp Promega®.

La amplificación por PCR con los primers VCF/VCR, al igual que la reacción PCR multiplex, permitió identificar con precisión la totalidad de los aislamientos que inducían la formación de agallas en kalanchoe y pimiento. En ambos casos, ninguno de los rizobios ni la cepa control de A. radiobacter dieron producto de amplificación alguno con ninguna de las combinaciones de primers probadas. Adicionalmente, se probaron también los primers A-E y A-C para amplificar dos fragmentos de 338 pb y de 224 pb, respectivamente, correspondientes a la secuencia parcial del gen virD2 presente en los plásmidos Ti y Ri de las cepas patógenas de Agrobacterium, de acuerdo con la metodología descrita por Hass et al. (8). Se halló un 30 % de falsos negativos y tres cepas de Rhizobium arrojaron resultados positivos (datos no mostrados), por lo que esta combinación de primers no sería útil para el diagnóstico ni podría emplearse por sí sola para caracterizar poblaciones de agrobacterias. Los medios semiselectivos D1, D1-M y YEM-RCT resultaron efectivos para aislar cepas de Agrobacterium, no solo cuando el material de partida fueron plantas con síntomas de agalla, sino también al tratarse de muestras de suelo, suelo rizosférico y agua de riego. Tanto en el medio D1 como en el D1-M, las colonias presentaron coloración y características típicas del género Agrobacterium, de acuerdo con lo descrito por Kado y Heskett (10) y Perry y Kado (17), respectivamente. En el medio D1, las colonias de todas las especies y biovares de Agrobacterium presentaron forma convexa y coloración verdoso-amarillenta con centros más oscuros, porque metabolizan el azul de bromotimol, y bordes de color blanco cremoso; con el correr del tiempo las colonias se tornan de color verde

Métodos de detección de Agrobacterium

oliva, pero siempre mantienen los bordes más claros. En este medio, ciertas especies de Erwinia, Pseudomonas y Acidovorax pueden desarrollar, pero con una coloración diferente a la observada en Agrobacterium, dado que no metabolizan el colorante y pueden dar una coloración amarilla en el medio de cultivo debido a un cambio de color del indicador, que vira al amarillo al bajar el pH del medio. Al efectuar aislamientos en el medio D1, se encontró una eficiencia mayor del 90 % para la recuperación de Agrobacterium a partir de poblaciones mixtas; esta eficiencia mejora con el enriquecimiento previo en D1 líquido y también con el agregado de telurito de potasio al medio, lo que aumenta la selectividad a tal punto que algunas cepas de Agrobacterium bv. 2 no desarrollan o lo hacen en forma limitada. En el medio D1-M, las colonias de Agrobacterium presentaron color azul verdoso con centros más oscuros y bordes más claros, también hubo colonias grisáceas o blancuzcas con centros azulados (por su capacidad de metabolizar el verde de malaquita), circulares, convexas, mucosas y brillantes. En algunos casos, se observaron colonias con bordes irregulares, probablemente debido a una excesiva producción de mucopolisacárido. En este medio el crecimiento de saprobios es limitado, aunque algunas especies de Pseudomonas y géneros afines desarrollan, pero sin las características de pigmentación particulares observadas en Agrobacterium. Cuando se emplea YEM-RCT, las colonias son muy mucosas, circulares, convexas y de color negro más intenso en la parte central debido a la acumulación de cristales de telurito metálico. Por lo observado, cuando se realizan estudios epidemiológicos que incluyen la distribución espacial del patógeno, es recomendable utilizar los tres medios de cultivo para aumentar la eficiencia de recuperación, puesto que en una misma agalla pueden cohabitar diversas cepas pertenecientes a especies o biovares diferentes (13). Los medios con telurito contribuyeron a identificar a las agrobacterias sobre la base de la característica típica de sus colonias. Mougel et al. (14) demostraron que la resistencia a telurito no es de carácter plasmídico, dado que todas las especies y biovares de Agrobacterium y aquellas cepas que han perdido el plásmido Ti o el Ri desarrollan en presencia de telurito acumulando cristales de telurito metálico en sus células, como fue observado en cepas curadas del plásmido Ti y otros plásmidos crípticos (14). No obstante, es importante destacar que los rizobios, organismos estrechamente relacionados con las agrobacterias, generan colonias de aspecto similar cuando se cultivan en YEM-RCT, lo que no ocurre en los medios D1 y D1-M, en los que los rizobios no desarrollan o lo hacen en forma extremadamente lenta (más de 7 días). En el medio D1 pueden ser inhibidos por el cloruro de litio presente, que afecta el modo de unión del aminoacil ARN de transferencia y altera la síntesis de proteínas bacterianas (10). Si bien las cepas de A. radiobacter y las cepas no patógenas de Agrobacterium desarrollaron en todos los

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medios de cultivo probados, con morfología similar a las presentadas por las cepas patógenas, ninguna de ellas indujo la formación de agallas en kalanchoe ni en pimiento. En el caso de los rizobios, si bien desarrollaron en YEMRCT con las mismas características que los aislamientos de Agrobacterium, se diferenciaron posteriormente tanto por PCR (multiplex y específica) como por bioensayo, dado que en ningún caso indujeron síntomas ni presentaron los productos de amplificación correspondientes al gen virD2 presente en los plásmidos Ti y Ri; de esta forma, se evitó la posibilidad de detectar falsos positivos, particularmente en el caso de muestras de suelo. No obstante, empleando esta metodología sería imposible diferenciar entre rizobios y cepas de Agrobacterium que hubieran perdido los genes de virulencia. Con respecto a las pruebas de patogenicidad, el pimiento California Wonder demostró ser un hospedante diferencial en el que es posible visualizar los síntomas en menor tiempo que en otras especies herbáceas usualmente empleadas como indicadoras, como por ejemplo girasol y tomate. La respuesta a la inoculación en pimiento se generó rápidamente, a los 7 días, bajo la forma de agallas esféricas en los puntos de lesión del tallo, de color blanco-rosado a castaño claro y aspecto verrugoso, tras la inoculación de todas las cepas de Agrobacterium bv. 1, Agrobacterium bv. 2 y A. rubi. En estos ensayos, las cepas de A. vitis K 306 y S4 no interactuaron con el pimiento, lo que quedó en evidencia porque únicamente aparecieron zonas necróticas alrededor de los puntos de inoculación. No obstante, en otras plantas de la familia Solanaceae, como tomate y tabaco, se han encontrado diferencias en la producción de agallas en inoculaciones con diferentes cepas de A. vitis (15). Por ello sería interesante evaluar el comportamiento de un mayor número de aislamientos de A. vitis, con el fin de determinar si el pimiento cv. California Wonder es un hospedante diferencial con potencial en el diagnóstico de cepas virulentas de esta especie. En el caso de A. radiobacter K 1026 y de las cepas control de Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium y Synorhizobium, estas no indujeron ningún tipo de síntoma en pimiento, lo cual es lógico, considerando que carecen de genes de virulencia. Por otra parte, el bioensayo cuantitativo sobre kalanchoe desarrollado en este trabajo resultó una prueba económica, sencilla y fácil de manejar en condiciones de laboratorio. Además, demanda poco espacio, por lo que es ideal para realizar screenings de un alto número de cepas y especies de Agrobacterium. En conclusión, el empleo combinado de PCR multiplex, PCR específica, aislamientos en medios semiselectivos y bioensayos en kalanchoe y pimiento redujo significativamente la posibilidad de obtener resultados falsos negativos a partir de muestras de agallas, suelo, suelo rizosférico y agua. Este conjunto de métodos representa una herramienta adecuada para la detección de cepas patógenas de Agrobacterium en estudios fitopatológicos y ecológicos.

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Agradecimientos: Los autores agradecen a los Dres. DH Grasso (Instituto de Suelos, INTA Castelar, Argentina) y S Süle (Plant Protection Institute, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungría) por facilitar las cepas de referencia LBA 956 de A. tumefaciens y K 306 y S4 de A. vitis, respectivamente. Esta investigación fue parcialmente subsidiada por la CIC (Provincia de Buenos Aires, Argentina).

13.

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Recibido: 15/03/11 – Aceptado: 02/09/11

Maize plantlets inoculated with Enterobacter spp.

287 ISSN 0325-7541 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 287-293

ARTÍCULO ORIGINAL

Growth response of maize plantlets inoculated with Enterobacter spp., as a model for alternative agriculture YOLANDA E. MORALES-GARCÍA1, DALIA JUÁREZ-HERNÁNDEZ2, CELIA ARAGÓN-HERNÁNDEZ3, MIGUEL A. MASCARUA-ESPARZA1, MARÍA R. BUSTILLOS-CRISTALES1, LUIS E. FUENTES-RAMÍREZ1, REBECA D. MARTÍNEZ-CONTRERAS1, JESÚS MUÑOZ-ROJAS*1 Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas-Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Edificio 103 J, Ciudad Universitaria, Col. San Manuel, 72570, Puebla, México; 2 Escuela de Biología-Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Edificio 112-A, Ciudad Universitaria, 3 Laboratorio clínico del ISSSTEP, Av. Venustiano Carranza 810. Col. San Baltazar Campeche, 72550, Puebla, México. *Correspondence. E-mail: [email protected] 1

ABSTRACT A maize rhizosphere isolate was phenotypically and genotypically characterized and identified as Enterobacter spp. bacterium. Germinated seeds were inoculated, the plantlets were sown in vermiculite and in soil and grown under laboratory and field conditions, respectively. The adherence, colonization and plant growth promotion capability of Enterobacter sp. UAPS03001 was evaluated in “Rojo-Criollo” maize under laboratory conditions. Twenty days after inoculation, the treated plantlets showed larger biomass than non-inoculated ones. In field grown plants, the kernel biomass was also greater in inoculated than in non-inoculated plants. The inoculation of maize sprouts with plant growth- promoting bacteria before their sowing in the field would be an alternative practice for achieving successful yield in temporal agriculture. Key words: inoculated plantlets, PGPR, maize, Enterobacter spp.

RESUMEN Respuesta de plántulas de maíz inoculadas con Enterobacter spp. como un modelo de agricultura alternativa. En este trabajo se aisló una bacteria de la rizósfera de maíz, que fue caracterizada mediante métodos fenotípicos y genotípicos e identificada como Enterobacter sp. UAPS03001. La bacteria fue inoculada en semillas de maíz “RojoCriollo” germinadas en forma axénica. Las semillas germinadas e inoculadas se plantaron en vermiculita y posteriormente las plántulas fueron cultivadas en vermiculita o en suelo, para evaluar el efecto promotor del crecimiento vegetal de dicha bacteria, bajo condiciones de laboratorio y de campo. Bajo condiciones de laboratorio, también se evaluó la capacidad de esta cepa para adherirse a las plantas de maíz y colonizarlas. Veinte días después de la inoculación, las plántulas inoculadas mostraron una biomasa mayor con referencia a las no inoculadas. En campo, la biomasa de la mazorca fue también mayor en las plantas inoculadas respecto de las plantas no inoculadas. La inoculación de germinados de maíz con una bacteria promotora del crecimiento vegetal y su posterior transferencia a campo podría ser una práctica alternativa para llevar a cabo una producción exitosa en agricultura de temporal. Palabras clave: plántulas inoculadas, PGPR, maíz, Enterobacter spp.

INTRODUCTION Zea mays (Poaceae) apparently evolved from Teocintle (Zea perennis), (6, 48) in a geographic region that comprises the Central and Southeast regions of Mexico. Its origin as a crop dates back to 5400 (31) to 7000 years BC (32, 33) and was eventually disseminated to other regions in the Americas and the entire world (19, 36). This plant forms the basis of the Mexican diet. For instance, the grains are used for preparing diverse traditional foods and beverages like tortillas, molotes, tamales, gorditas, tostadas, tesgüino, and tejuino (13, 27). Nowadays, maize uses include modern exploitation for producing fructose syrup (46), bio-oil, and others (18). The local “Rojo-Criollo”

maize cultivar is used for preparing traditional candies (Secretaría de Turismo de Tlaxcala, México 2010: Tlaxcala pre-hispanicgastronomy, http://www.tlaxcala.gob.mx/ turismo/anexo/gastronomico/b_mestiza.html) and a kind of red tortillas. Bacterial inoculation of maize, mainly with Azospirillum, has been a successful common practice (5, 23, 30). Additionally, growth enhancement has also been observed by experimental inoculation with many other bacteria, for instance Pseudomonas (17, 23, 39), Klebsiella pneumoniae, Pantoea agglomerans, Gluconacetobacter diazotrophicus and Herbaspirillum seropedicae (40). Temporal agriculture is the most common farming for maize cultivation in Central Mexico, which is also characterized by poor income. This and other facts have provoked a

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continuous reduction of traditionally cultivated maize fields (22). One of the greatest problems is related to the erratic start of the rainy season, especially in current times, which is probably due to global climatic change (16, 34, 45). The deficiency of water on time and the presence of seed-feeding fauna have forced farmers to invest more in seed (38). In this work, a bacterial strain was isolated from the maize rhizosphere, and was further characterized by phenotypic and genotypic assays. The aim of this work was to inoculate axenic maize seedlings with the isolated bacteria, and to assess their capacity to promote the growth of plants both at growth chamber level and in the field. The growth of corn plants was stimulated under the conditions explored in this work, so it is proposed that the inoculation of germinated axenic maize sprouts with beneficial bacteria, their subsequent growth, and the introduction of inoculated plantlets to the fields, could be an alternative production system in temporal crops.

the bacterial growth/activity for 24 biochemical tests (including the use of carbon sources) and resistance to 23 antibiotics. Bacterial response was detected with the automated system MicroScan 4 (Baxter Inc. Mexico). The phenotypic tests performed are listed in Table 1. The sequence of the 16S rDNA gene was compared with public sequences. Briefly, genomic DNA was extracted and purified from bacterial cells grown to stationary phase with a Wizard Genomic DNA Isolation kit (Promega). A fragment of ca. 1365 bp of the 16S rDNA gene was amplified with the universal primers: UN27F 5’-TAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ and UN1392R 5’-CAGGGGCGGTGTGTACA-3’ (Biodiversa Inc., Mexico). The PCR product was sequenced with the same primers at the Instituto de Biotecnología (UNAM). The sequence was initially analyzed with BLAST, and subsequently with DNA Star. The GenBank accession number of the 16S rDNA sequence of UAPS03001 is HM355806.

MATERIAL AND METHODS

Germination of maize seeds Seeds of the “Rojo-Criollo” maize variety were germinated as follows: the seeds were washed with distilled water and rinsed with 70% ethanol for 10 min and immersed under agitation in 6.5% sodium hypochlorite for 20 min. The seeds were washed eight times with sterile distilled water under sterile conditions, and incubated for three days at 30°C under high environmental humidity on MS solid medium (29) supplemented with 20 mM glucose and 30 mM sucrose (medium MSJ3). Seeds showing microbial growth after incubation were discarded.

Bacterial isolation and characterization Strain UAPS03001 was isolated from the rhizosphere of “Rojo Criollo” maize .This variety has been cultivated by some people in San Diego Buena Vista Tlaxcala (Figure 1) for a long time, but, similarly to many other native varieties from Mexico, it has not been genetically characterized yet. Five plants grown for one month were extracted from soil (19° 10’ 30.59” N, 98° 09’ 50.05” W, Elevation: 2408 MASL) and transported to the laboratory in sterile conditions where soil adhered to their roots (considered rhizosphere) was resuspended in water (1:10 w/v). This mixture was vortexed at 3000 rpm for 3 min and one hundred microliters of serial dilutions (1:10 factor) were plated on Congo Red agar media (37). Bacteria from high dilution were isolated. The strain UAPS03001 was selected for testing its plant growth promoting activity. This strain was characterized by phenotypic characteristics and by 16S rDNA similarity. Biochemical testing was performed with MARK 20 panels from DADE Behring, analyzing

Antibiotic resistance Antibiotic resistance was tested for designing media for the reisolation of the inoculated strain. UAPS03001 was plated on LB and Congo Red media (37). Antibiotic multidiscs (Bio Rad, Mexico) were placed in duplicate on inoculated agar plates.

Growth promotion experiment in environmental chamber Strain UAPS03001 was grown overnight in LB broth. Bacterial growth was inoculated in the same medium and grown until stationary phase. The cells were washed and resuspended in the same volume in sterile distilled water. Cell quantity was determined in triplicate with the drop plate method (12). Forty germinated maize seeds were immersed in the bacterial suspension for 1 h and sown in tubes containing 5 g of sterile vermiculite.

Figure 1. Aerial view of San Diego Buenavista (closed in bold line) belongs to “Papalotla de Xicohtencatl” community. It is a place located to the south of Tlaxcala in the Central Mexican Plateau (Altiplano de México). Photo obtained from Google Earth.

Maize plantlets inoculated with Enterobacter spp. As a control, other forty germinated maize seeds were immersed in sterile distilled water under the conditions mentioned above. The sprouts were grown under the following conditions: 25 to 28°C, light/darkness cycle 16/8 h, 70% humidity. The plantlets were watered once with 25 ml of MS solution without carbon source (medium MSJ1). a) Quantification of bacterial adherence. The number of cells adhering to the sprouts was quantified after 12 h. Six replicates and six controls were vigorously vortexed in a volume of sterile distilled water. Cell numbers were determined by the drop plate method on agar selective media. b) Quantification of bacterial colonization. Ten and 20 days after inoculation, the roots of ten plants for each treatment were immersed in 20 ml of sterile distilled water and vigorously vortexed for 40 s. Rhizospheric bacteria were determined with serial dilutions of the bacterial suspension by dropping 20 µl on selective media plates and 24-hour incubation. c) Aerial plant biomass. The aerial region of 20 plants was chopped into small pieces, dehydrated at 70°C for four days, and weighed. Data were compared with the Student’s t-test. Field experiment Plantlet production. Two hundred “Rojo-Criollo” maize variety seeds were germinated in MSJ3 medium as explained above. One-half of the sprouts was inoculated with bacterial cells as mentioned whereas the other half was treated as control. The sprouts were seeded in sterile vermiculite and watered with MSJ1 as described above. The plantlets were incubated for five days under the conditions of the previous experiment and subsequently transferred to the field. Plant growth . Sowing was at the start of the rainy season in May 2007. The field, located in Papalotla, Tlaxcala, Mexico (19° 10’ 19.93” N, 98° 09’ 52.74” W, Elevation: 2394 MASL), was ploughed and the plantlets were sown with 0.8 m of distance between them, placing 10 plants by furrow, with a total of 10 rows for each treatment. The space between rows was 70 cm and each experimental block was in a space of 10 m in length (distance from the furrow) by 8 m wide. The border between inoculated and non-inoculated plantlets was 3 m in length. Holes, ca. 15 cm in depth and 20 cm in diameter were made with the aid of a spade. The plantlets were introduced in the holes (one plantlet per hole), covered with soil, and watered with 500 ml distilled water. Two days later the plantlets were watered as before. One month after seeded, each plant was fertilized with 7.5 g of NPK 17:17:17 (containing 1.7 g of nitrogen, 1.7 g of P2O5, and1.7 g of K2O per 10 g) (15), and a final plough was made. Eight month-old plants were harvested and the maize kernels were weighed. Data Analysis Statistical analysis for rhizospheric colonization and aerial dry biomass was performed using Sigma Plot (Handel Scientific Software). Differences were considered according to the Student´s t test results.

RESULTS Isolation and characteristics of rhizospheric bacteria The strain designated UAPS03001 was isolated from the rhizosphere of “Rojo-Criollo”maize. The morphology of this strain in Congo Red agar corresponded to small red circular translucent colonies, showing regular margin, convex elevation and smooth texture. Phenotypic tests of strain UAPS03001 showed 95% similarity to Enterobacter cloacae (Table 1) and the sequence comparison of the 16S rDNA gene showed 96.3% identity with the same species (Table 2). This strain was resistant to some anti-

289 Table 1. Phenotypical traits and antibiotic pattern of strain UAPS03001, obtained with the panel MARK 20 from Dade Behring (ID = Enterobacter cloacae with 99.99% of probability) Biochemical test

Result

E. cloacae

Glucose + +3 Sucrose + +1 Sorbitol + +1 Raffinose + +1 Arabinose + +3 Inositol - +1 Adonitol - -1 Melobiose + +1 Urea use - -1 H2S - -3 Indole - -3 Lysine decarboxylase - -1 Arginine dihydrolase + +1 Ornithine decarboxylase + +1 Tryptophan deaminase - -3 Esculin hydrolysis + V1 Voges-Proskauer + +2 Citrate + +3 Malonate + +1 O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside + +1 (β-galactosidase activity) Oxidase activity - -3 means reference 11, 2means reference 42, 3means reference 44. V means variable. 1

biotics (Table 3), and ampicillin (Ap) and erythromycin (E) were chosen for the selective media added with Ap (50 µg/ml) and E (50 µg/ml). Bacterial growth was comparable in selective and non-selective media (results not shown). Adherence and colonization assays Adherence and colonization assays were developed in triplicate with similar results for each independent experiment. We are showing results for one of them. The sprouts were inoculated with a suspension containing 9 × 108 CFU/ml, showing an adherence of 1.05 × 107 CFU per plant (SD 7 × 106). The bacterial population in the rhizosphere 10 days after inoculation (dai) was 7.12 ×108 CFU/g vermiculite and at 20 days had increased to 1.86 × 109 UFC/g vermiculite (Fig. 2). Several microbial morphologies, different from those of strain UAPS03001 were detected from non-inoculated plantlets. Those microorganisms were recovered in low quantities (1 × 103 CFU/g vermiculite) and were not further characterized. Growth promotion experiments both in environmental chamber and in the field Adherence and colonization assays were developed in triplicate with similar results for each independent experiment. We are showing results for one of them. The

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Table 2. Sequence similarity with 16S rRNA of Enterobacteriaceae species [% identity] UAPS01001 (GQ267502) Averyella dalhousiensis (DQ481464) 93.4 Brenneria alni (AJ223468) 89.8 Budvicia aquatica (AJ233407) 91.0 Buttiauxella agrestis (DQ223871) 93.4 Edwarsiella hoshinae (AB050825) 91.8 Enterobacter aerogenes (AB004750) 94.7 Enterobacter amnigenus (AB004749) 94.7 Enterobacter asburiae (AB004744) 94.9 Enterobacter cancerogenus (Z96078) 95.0 Enterobacter cloacae (AJ251469) 96.3 Enterobacter gergoviae (AB004748) 93.9 Enterobacter helveticus (DQ273688) 94.1 Enterobacter hormaechei (AJ853889) 94.8 Enterobacter kobei (AJ508301) 95.5 Enterobacter ludwigii (AJ853891) 95.9 Enterobacter nimipresuralis (Z96077) 94.7 Enterobacter radicincitans (AY563134) 94.6 Enterobacter turicensis (DQ273681) 94.4 Enterobacter cowanii (AJ508303) 94.6 Erwinia billingiae (AM055711) 93.2 Ewingella americana (DQ383802) 91.1 Hafnia alvei (DQ412565) 91.8 Pantoea ananatis (U80196) 92.5 Tatumella ptyseos (AJ233437) 92.9 The accession number of each bacterial species is shown in parentheses and Enterobacter species identities in bold letters.

inoculated plants showed statistically significant greater biomass than the controls (Figure 3) 0.168 g (±0.034) for inoculated plants and 0.080 g (±0.049) for non-inoculated plants. All the plants survived and showed strong vigor throughout the experiment (Results not shown). In inoculated plants, the flowering started ca. 200 days after transplantation. The total kernel biomass of eight month‑plants, obtained from 100 plants of each treatment, was higher in inoculated than in non-inoculated plants, 19.6 and 12.86 kg, respectively.

DISCUSSION The strain UAPS03001 isolated from the rhizosphere of “Rojo-Criollo” maize was designated as Enterobacter spp. because phenotypic tests of the strain showed 95% similarity to Enterobacter cloacae (Table 1) and the sequence comparison of the 16S rDNA gene showed high identity value (96.3%) with the same species (Table 2). However, according to polyphasic taxonomy, more studies are needed to designate the species name (47). Enterobacter spp. has also been isolated from the rhizosphere of other plants, e.g. from Lolium perenne rhizosphere (41), rice rhizosphere (26) and from soil near the roots of leguminous plants (49), showing its natural association to this environment. It is desirable to find native strains for inoculation attempts. The first advantage would be the adaptation to local biological and non-biological conditions, whereas the second advantage would be the use of indigenous organisms that would prevent environmental disturbance.

Table 3. Resistance of Enterobacter spp. to antibiotics from Multidiscs Biorad Antibiotic Ampicillin Erythromycin Cephalotin Penicillin Dicloxacillin Ceftriaxone Cefotaxime Netilmicin Nitrofurantoin Chloramphenicol Amikacin Carbencillin Trimethoprim/ Sulfamethoxazole Cefuroxime Pefloxacin Gentamicin Tetracicline Ceftazidime

Biorad abbreviation

µg in the disc

Resistance (R) or Susceptibility (S) with diameter of effect (cm)

AMP 10 E 15 CF 30 PE 10 DC 1 CRO 30 CTX 30 NET 30 NF 300 CL 30 AK 30 CB 100 SXT 25 CXM 30 PEF 5 GE 10 TE 30 CAZ 30

S S S S S S S S S S S S S

R R R R R (2.7) (2.4) (1.8) (1.2) (1.8) (1.3) (2.0) (2.5) (1.8) (3.0) (2.3) (2.2) (2.1)

Maize plantlets inoculated with Enterobacter spp.

Figure 2. Enterobacter spp. UAPS03001 cell numbers colonizing maize rhizosphere. Quantifications were done at 10 and 20 days after inoculation (dai) in selective medium. Mean of ten replicates and standard deviations are presented. Differences were statistically significant with the Student’s t-test (p≤0.05).

Figure 3. Aerial dry biomass of maize plants at twenty days after inoculation. Dark grey bar, non-inoculated controls; grey bar, inoculated plants. Mean of twenty plants and standard deviations are presented. Differences were statistically significant with the Student’s t test (p≤0.05).

The strain herein isolated showed good adherence to seed sprouts and root colonization capability, similar to other rhizospheric bacteria (3, 4, 8, 28). Inoculation experiments were performed under environmental chamber conditions, where non-inoculated plants showed low quantities of other microorganisms different from strain UAPS03001 after 20 days. This means that a natural bacteria population is present inside the maize seed, which could not be eliminated by superficial sterilization, as suggested by Bresan and Borges (2). The inoculated plants showed statistically significant greater biomass than the controls under environmental chamber conditions and the total kernel biomass of eight month plants was higher in inoculated than in non-inoculated plants. Other experiments have demonstrated growth promotion by some Enterobacter strains on different plants, i.

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e. stimulation of the growth of tomato, pepper and mung bean plants by the plant growth-promoting bacterium Enterobacter cloacae CAL3 (25) or the stimulation of the growth of Brassica oleracea by the nitrogen-fixing endophytic bacteria Enterobacter spp. strain 35 (50). In the present work, the mechanisms for promoting plant growth by Enterobacter spp. are not definite but as in other growth promoting bacteria, N-fixation, production of IAA and cytokinins, phosphate solubilization, and phytopathogen antagonism could participate in this activity (24), as has been suggested for Enterobacter ludwigii (41) and Enterobacter radicincitans (14). Temporal agriculture is dependent on climate, so it is also highly susceptible to even minor environmental alterations (16). Particularly, plant germination is extremely vulnerable to lack of water. Most of the inoculation experiments have been done with seeds, so the bacterial survival capability in the soil had been determinative for plant colonization (1, 43). In this work, the inoculation was done in sprouts instead, in an attempt to increase bacterial and plant survival. Under our conditions, Enterobacter spp. UAPS03001 was proficient at promoting the growth of inoculated maize sprouts. Even though some Enterobacter strains have been designed as beneficial bacteria given their capability to suppress plant disease (20) and their biocontrol properties (21), some species of Enterobacter have been reported as opportunistic human pathogens (10). Hence, the results presented in this work have to be taken only as a model of study of inoculated plantlets, because they could be a latent danger when applied extensively. More studies are needed to determine potential hazards or benefits of Enterobacter spp. UAPS03001. At the present time, other beneficial bacteria such as Azospirillum brasilense could result more suitable to that end (5, 8, 24, 30). Sprout inoculation with beneficial bacteria as an alternative to seed inoculation could be advantegeous to maize sown in temporal agriculture and could possibly ameliorate foraging by seed-feeding fauna (9, 38). In this work, the maize seeds were germinated in MSJ3 medium, but less expensive substrates, such as vermiculite, could also be used. The scaling-up of this procedure for application in productive farms is a problem for maize but has been currently developed in other crops such as strawberry (7). Nevertheless, the process can be used for green house plantlet production without scaling-up. This procedure of inoculation in other crops is under test in our lab. A future variant of particular interest is the remediation of polluted temporal soils with plants inoculated via sprouts, for instance, with P. putida KT2440, which is able to use a variety of carbon sources (35), including xenobiotic compounds. Acknowledgements: We are indebted to Dr. Michael Dunn for constructive English corrections, and Dr. Alfredo Torres for valuable opinions on the work. Jesus Muñoz-Rojas and Yolanda Elizabeth Morales-García were partially supported by PROMEP/103.5/09/1852 (BUAP-PTC-116) and by VIEP-BUAP MURJNAT10G.

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Recibido: 15/03/2011 – Aceptado: 31/08/2011

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43:0325-7541 294-310 ISSN Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 294-310

ARTÍCULO ESPECIAL

Bacillus anthracis: una mirada molecular a un patógeno célebre MARÍA E. PAVAN1*, MARÍA J. PETTINARI2, FABIÁN CAIRÓ1, ESTEBAN E. PAVAN3, ANGEL A. CATALDI4 Biochemiq S.A., Laboratorio de Biología Molecular. Ingeniero Butty 240, 4to piso. (C1001AFB), CABA; 2Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, CABA, Argentina; 3Laboratorio di Tecnologie Biomediche, Dipartimento di Bioingegneria, Politecnico di Milano, Italia; 4Instituto de Biotecnología, CNIA-INTA. Castelar, CC77 (1708) Buenos Aires, Argentina. *Correspondencia. E-mail: [email protected]

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RESUMEN Bacillus anthracis es un bacilo gram positivo del grupo Bacillus cereus, que posee un genoma extremadamente monomórfico y comparte gran similitud fisiológica y de estructura genética con B. cereus y Bacillus thuringiensis. En este artículo se describen nuevos métodos moleculares para la identificación y tipificación de B. anthracis, basados en repeticiones en tándem de número variable o en diferencias genéticas detectadas por secuenciación, desarrollados en los últimos años. Los aspectos moleculares de los factores de virulencia tradicionales, cápsula, antígeno protector, factor letal y factor edema se describen en profundidad, junto con factores de virulencia recientemente propuestos, como los sideróforos, petrobactina y bacilibactina, la adhesina de la capa S y la lipoproteína MntA. También se detalla la organización molecular de los megaplásmidos pXO1 y pXO2, incluyendo la isla de patogenicidad de pXO1. El esqueleto genético de estos plásmidos se ha encontrado en otras especies relacionadas, probablemente debido a eventos de transferencia lateral. Finalmente, se presentan los dos receptores celulares del antígeno protector, ANTXR1/TEM8 y ANTXR2/CMG2, esenciales en la interacción del patógeno con el hospedador. Los estudios moleculares realizados en los últimos años han permitido aumentar enormemente el conocimiento de los diferentes aspectos de este microorganismo y su relación con el hospedador, pero a la vez han abierto nuevos interrogantes sobre este notorio patógeno. Palabras clave: Bacillus anthracis, ántrax, aspectos moleculares, factores de virulencia, megaplásmidos, diversidad genética

ABSTRACT Bacillus anthracis: a molecular look at a famous pathogen. Bacillus anthracis, a gram-positive rod belonging to the Bacillus cereus group, has an extremely monomorphic genome, and presents high structural and physiological similarity with B. cereus and Bacillus thuringiensis. In this work, the new molecular methods for the identification and typing of B. anthracis developed in the last years, based on variable number tandem repeats or on genetic differences detected through sequencing, are described. The molecular aspects of traditional virulence factors: capsule, protective antigen, lethal factor and edema factor are described in depth, together with virulence factors recently proposed, such as the siderophores petrobactin and bacillibactin, the S-layer adhesin and the MntA lipoprotein. It is detailed the molecular organization of megaplasmids pXO1 and pXO2, including the pathogenicity island of pXO1. The genetic skeleton of these plasmids has been observed in related species, and this could be attributed to lateral gene transfer. Finally, the two anthrax toxin protective antigen receptors, ANTXR1/TEM8 and ANTXR2/CMG2, essential for the interaction of the pathogen with the host, are presented. The molecular studies performed in recent years have greatly increased knowledge in different aspects of this microorganism and its relationship with the host, but at the same time they have raised new questions about this noted pathogen. Key words: Bacillus anthracis, anthrax, molecular aspects, virulence factors, megaplasmids, genetic diversity

Bacillus anthracis es el agente causal del ántrax, una enfermedad zoonótica conocida desde la antigüedad. Desde su mención en el libro bíblico del Éxodo1 hasta su La quinta plaga: la mortandad del ganado. “...la mano del Señor enviará una peste mortífera contra el ganado que está en los campos: contra los caballos, los asnos, los camellos, los bueyes y el ganado menor... Y el Señor fijó un plazo, diciendo: ‘Mañana cumpliré esta amenaza contra el país’. En efecto, al día siguiente el Señor cumplió su palabra y entonces murió todo el ganado de Egipto”. Éx. 9, 3. 5-6. Estos detalles sugieren que la quinta plaga se trató de B. anthracis, que afecta primariamente a los herbívoros ungulados y sólo ocasionalmente a los carnívoros o al hombre. 1

papel en el avance de la microbiología moderna, con el desarrollo de los postulados de Koch (47), y las primeras inmunizaciones contra el ántrax utilizando cepas bacterianas atenuadas (26, 73), este viejo y conocido patógeno animal se hizo célebre en los últimos años por su uso como arma biológica debido a su alta toxicidad. B. anthracis es un bacilo gram positivo que se encuentra en una amplia variedad de ambientes y en numerosos hospedadores mamíferos en todo el mundo. Pertenece al grupo Bacillus cereus que engloba también a las especies esporuladoras Bacillus cereus sensu stricto, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus

Bacillus anthracis: una mirada molecular

pseudomycoides y Bacillus weihenstephanensis y a las especies recientemente propuestas Bacillus cytotoxicus (53) y Bacillus gaemokensis (38). B. anthracis comparte gran similitud fisiológica y de estructura genética con B. cereus, un microorganismo ubicuo y patógeno humano oportunista, y con B. thuringiensis, un patógeno de insectos utilizado como biopesticida del que se han descripto algunas cepas que pueden ser patógenas para los humanos (28, 70, 100). Sin embargo, estas especies poseen diferente patogenicidad en términos de virulencia y rango de hospedadores. Dada la gran similitud entre los genomas de B. anthracis, B. cereus y B. thuringiensis, existe actualmente un importante debate sobre la clasificación sistemática de los miembros del grupo B. cereus e incluso se ha planteado si los tres taxa deberían ser considerados como una única especie bacteriana o si se debería mantener el status de especies separadas a causa de sus características patogénicas distintivas (5, 9, 28, 30, 70). B. anthracis se encuentra habitualmente en el suelo como una espora en dormición, muy estable y extremadamente resistente al estrés ambiental. Luego de la infección por contacto, ingestión o inhalación de esporas, éstas germinan transformándose en células vegetativas que pueden replicarse exponencialmente en casi todos los tejidos del cuerpo del hospedador. La forma cutánea de infección es relativamente benigna y permanece localizada, es fácilmente identificable y puede ser tratada efectivamente con antibióticos, mientras que las infecciones por inhalación de esporas son extremadamente severas, fulminantes y difíciles de diagnosticar. Una vez muerto el hospedador, el contacto de los tejidos infectados con el oxígeno del aire induce la esporulación de la bacteria, que de ese modo puede sobrevivir en reposo en el suelo por varias décadas hasta que encuentra condiciones ambientales favorables para la germinación. El ántrax es principalmente una enfermedad de los herbívoros (vacas, cabras y ovejas) pero todos los mamíferos son susceptibles. En humanos el ántrax ocurre usualmente por exposición cutánea a animales o productos de animales infectados (cuero, carne, lana, huesos) y aún en la actualidad el hombre es infectado ocasionalmente por inhalación o ingestión de esporas de B. anthracis (4). El objetivo de este artículo especial es presentar aspectos moleculares de este importante patógeno animal y humano en los que se han hecho importantes avances a nivel mundial en los últimos años. Los temas considerados son diversidad molecular y genotipificación, aspectos moleculares de los factores de virulencia tradicionales y de otros factores recientemente propuestos, y la organización molecular de los plásmidos pXO1 y pXO2, incluyendo la isla de patogenicidad de pXO1 y la transferencia lateral de genes de virulencia. También se describen los dos receptores del antígeno protector, esenciales en la interacción del patógeno con el hospedador.

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I. Diversidad molecular en B. anthracis B. anthracis posee un genoma extremadamente monomórfico, con muy poca variabilidad entre las distintas cepas (81). Una explicación para esta alta estabilidad genética podría ser la limitada posibilidad de acumular mutaciones y la falta de recombinación entre cepas de B. anthracis, debido a un crecimiento vegetativo corto y explosivo. Recientemente se ha postulado el concepto, ya ampliamente aceptado, que B. anthracis representa un derivado clonal de un miembro ancestral del grupo B. cereus, que obtuvo su potencial patogénico principalmente a través de la adquisición de dos grandes plásmidos, pXO1 y pXO2, que codifican factores de virulencia (28, 31). En un principio, el análisis de la diversidad molecular de B. anthracis, así como los estudios epidemiológicos de este patógeno, se vieron limitados por la escasa disponibilidad de marcadores moleculares que permitieran diferenciar los distintos aislamientos de este microorganismo. Los dos plásmidos son necesarios para la virulencia de B. anthracis, por lo que su presencia puede servir como una indicación de la patogenicidad de un determinado aislamiento. Sin embargo, dado que la gran mayoría de los aislamientos contienen ambos plásmidos, el análisis de la presencia de los mismos per se no brinda información útil desde el punto de vista epidemiológico (15, 74). Además, estudios recientes demostraron que el “esqueleto genético” de los plásmidos pXO1 y pXO2 no estaba restringido únicamente a B. anthracis sino que también podía ser encontrado en plásmidos de distintos aislamientos de B. cereus y B. thuringiensis y aun de otras especies de Bacillus (32, 34, 45, 55, 57, 77). Por otro lado, las secuencias del gen ribosomal ARNr16S, cronómetro molecular por excelencia y comúnmente utilizado para la identificación y discriminación de bacterias, poseen muy pocas diferencias entre B. anthracis, B. cereus y B. thuringiensis (5, 80). Entre las distintas cepas de B. anthracis las secuencias del ARNr 16S son altamente homogéneas presentando una variabilidad muy baja (5, 80). En un análisis reciente de 153 cepas de B. anthracis, más de la mitad pertenecieron al mismo grupo filogenético entre seis grupos que se definieron en base a este gen (80). Las secuencias del ARNr 23S de varios aislamientos de B. anthracis poseen un conjunto de variaciones que posibilitan la diferenciación de B. anthracis de otras especies del grupo B. cereus pero no la diferenciación entre ellos. La electroforesis de campo pulsado (PFGE, pulsedfield gel electrophoresis), un método de referencia para otras bacterias, se ha utilizado para diferenciar entre B. anthracis, B. cereus y B. thuringiensis. Este método corroboró la baja variabilidad genética entre varias cepas de B. anthracis y permitió diferenciarlas de B. cereus y B. thuringiensis, aunque éstas no pudieron distinguirse entre sí (100).

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I. a. Genotipificación de cepas de B. anthracis En 1996, durante un estudio sistemático (3) realizado para identificar diferencias a nivel molecular entre distintas cepas de B. anthracis, se detectó una variación debida a la presencia en el cromosoma de una repetición en tándem de número variable (VNTR, variable number tandem repeat) embebida en un gran marco de lectura abierto al que se denominó vrrA (variable repeat region A). Una VNTR consiste en repeticiones de secuencias cortas de aproximadamente diez a cien pares de bases unidas cabeza-cola y la variación molecular se debe a la diferencia en el número de unidades repetitivas presentes. Estas regiones repetitivas, que mutan más rápidamente y son más divergentes que otras regiones genómicas, se han utilizado extensivamente para el fingerprinting de eucariotas superiores, incluyendo humanos, y recientemente se han aplicado al estudio de poblaciones microbianas. El análisis de VNTR permite la caracterización genética de distintos aislamientos y estudios filogenéticos, epidemiológicos y de estructura de poblaciones bacterianas, debido a su gran poder de discriminación. En especies altamente monomórficas como B. anthracis, estas regiones ofrecen un gran potencial para estudiar su diversidad molecular (40). El locus vrrA precedentemente mencionado presenta un polimorfismo que involucra variantes que difieren en el número de copias de una repetición de doce pares de bases (3, 36) (Figura 1). A través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) fue posible distinguir las distintas formas alélicas que se utilizaron para tipificar aislamientos de B. anthracis de diferente origen geográfico (3, 35, 36). A nivel mundial los alelos más comunes son el VNTR4 y el VNTR3 (36, 40), y en Argentina los aislamientos estudiados hasta la fecha pertenecieron a tres categorías: VNTR2, VNTR4 y VNTR5 (36, 40, 74). La cepa vacunal Sterne 34F2 presenta la variante VNTR4 (74). El locus vrrA fue utilizado para estudiar (35) el brote de ántrax humano causado por la liberación de esporas desde una planta de investigación militar en Sverdlowsk, Rusia (ex Unión de las Repúblicas Socialistas Soviéticas), en 1979. Este estudio se realizó luego de 20 años de ocurrido el brote, utilizando tejidos que se habían conservado de once de las víctimas. Recientemente se ha dado un gran paso con el secuenciamiento completo del genoma de varias cepas de B. anthracis, que posee tres replicones: un cromosoma circular de 5,5 megabases y dos elementos extracromosomales, los plásmidos pXO1 y pXO2 (81). La secuencia del plásmido pXO1 reveló la presencia de posibles transposasas, resolvasas e integrasas que sugieren una evolución por movimiento lateral de ADN y cierto grado de plasticidad genética, aun cuando el análisis filogenético del gen pagA, presente en este plásmido y que codifica al antígeno protector, indicaba que en la evolución de pXO1 había ocurrido poca o ninguna transferencia horizontal entre distintas cepas (69).

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A nivel mundial se están desarrollando y aplicando nuevos sistemas de tipificación molecular para B. anthracis (40) y otros microoganismos patógenos, como Leptospira interrogans (58, 75, 76), basados en el análisis de distintos loci de VNTR. Estos análisis se conocen como MLVA (multiple-locus VNTR analysis). En un principio, para B. anthracis se utilizaron ocho loci: vrrA, vrrB1, vrrB2, vrrC1, vrrC2, CG3, pXO1-aat y pXO2-at (Tabla 1) (40). Para realizar esta técnica, primero se generan productos de amplificación de estos loci y luego se analizan los amplicones utilizando secuenciadores automáticos para determinar los pesos moleculares, a partir de los cuales se calcula el número de copias de cada VNTR. Los patrones de VNTR así obtenidos se utilizan para tipificar los aislamientos. De este modo, con ocho loci se caracterizaron más de cuatrocientos aislamientos de B. anthracis, identificándose 89 genotipos únicos (genotipos MLVA8) que se agruparon en dos grandes linajes clonales, A y B respectivamente (40). Algunos de estos genotipos presentaron una distribución mundial, mientras que otros estaban restringidos a determinadas regiones geográficas (40, 55). Dos cepas de B. anthracis aisladas en Argentina presentaron cada una de ellas un genotipo MLVA8 diferente, uno de ellos propio solamente para una de estas cepas (40). El genotipo de la otra cepa argentina fue idéntico al de cepas aisladas en Turquía, Sudáfrica y Estados Unidos. Los genotipos de las dos cepas argentinas pertenecen al subgrupo A3.a dentro del linaje A, están altamente relacionados entre sí y difieren únicamente en el número de copias de la repetición del locus vrrA (40). Este esquema de tipificación se expandió luego a quince loci VNTR, con los que se obtienen los genotipos MLVA15 (Tabla 1) (96). Por otro lado, en base al genoma completo de varias cepas de B. anthracis se identificaron aproximadamente 3500 SNP (single nucleotide polymorphisms) con los que se realizaron reconstrucciones filogenéticas en base a distintos modelos evolutivos (78, 81). El análisis de alrededor de mil de estos SNP (78) permitió identificar tres linajes (A, B y C), determinando que la raíz ancestral de B. anthracis yacía más cercana a una tercera rama C, diferente de las ya descriptas ramas A y B (40). Estudios posteriores indicaron que un número selecto de SNP, representativo de ramas y nodos específicos del árbol de B. anthracis, eran suficientes para determinar con exactitud la posición filogenética de cualquier aislamiento de esta especie (96). La hipótesis de trabajo original proponía que un número pequeño de SNP canónicos (canSNPs) sería suficiente para obtener la información genotípica completa de cualquier aislamiento, reemplazando el análisis exhaustivo de los SNP de todo el genoma (41). Estos SNP canónicos, de evolución lenta y altamente estables, en conjunto con los 15 marcadores VNTR, de evolución más rápida, fueron utilizados para tipificar una colección de 1033 aislamientos de B. anthracis provenientes de 42 países. Este análisis, con alto poder de resolución, dividió a los aislamientos en los tres linajes

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Figura 1. Alineamiento de las secuencias repetitivas de distintas variantes del locus vrrA. En diferentes colores se muestran las repeticiones de 12 bases. Tabla 1. Loci utilizados para obtener los genotipos MLVA8 (en verde) y MLVA15 (en verde y azul) de B. anthracis, con indicación del tamaño correspondiente de la repetición (40, 96). pb, pares de bases.

mayores conocidos, con doce sublinajes o subgrupos, y 221 genotipos únicos (96). Los aislamientos del linaje A están ampliamente dispersos y se encontraron en todos los países estudiados, mientras que los linajes B y C existen en una escala geográfica mucho más restringida, con genotipos más raros presentados por pocos aislamientos (sólo dos cepas pertenecieron al linaje C y menos de una centena al linaje B) (40, 41, 55, 78, 81, 96). Dentro de la colección de 1033 cepas, se analizaron treinta cepas argentinas aisladas entre 1977 y 2001 (96). Éstas presentaron siete genotipos diferentes: seis de estos genotipos pertenecieron al subgrupo A.Br.003/004 (incluyendo los dos genotipos MLVA8 descriptos previamente para la Argentina [40]) y uno al subgrupo A.Br.008/009, todos dentro del linaje mayor A (96). A nivel mundial, A.Br.003/004 agrupó cepas aisladas principalmente en Sudamérica mientras que para el subgrupo A.Br.008/009 las cepas provenían principalmente de Europa y Asia. En el análisis genotípico global de van Ert et al. (96) se tomó en cuenta también una mutación puntual en el gen plcR. Pc/ R es un regulador pleiotrópico que activa la transcripción de muchos genes que codifican factores de virulencia extracelulares, como fosfolipasas C, proteasas

y hemolisinas, en B. thuringiensis y B. cereus (2, 87). En B. anthracis una mutación sin sentido en plcR torna a la proteína inactiva y explica por qué, por ejemplo, B. anthracis es no hemolítico a pesar de poseer los genes para hemolisinas (87). La mutación en plcR es considerada esencial para el mantenimiento de los plásmidos de virulencia y representa un carácter distintivo de B. anthracis (22, 87). Todos los aislamientos de B. anthracis analizados en el trabajo de van Ert et al. (96) mostraron la mutación inactivante en plcR. Con la idea de lograr un mayor poder discriminatorio y obtener mejores estimaciones filogenéticas, diferentes grupos de investigación han subtipificado cepas de B. anthracis a través del análisis de loci VNTR adicionales o de determinados SNP (24, 42, 71). Estas herramientas permitieron, por ejemplo, determinar que la población de B. anthracis dominante en el centro de Canadá y el oeste de Estados Unidos fue introducida al continente americano a través de un puente terrestre, en lo que hoy es el estrecho de Bering, con las primeras migraciones humanas en el Pleistoceno tardío (42). Recientemente se ha agregado el análisis de los SNR (single nucleotide repeats), que representan una categoría especial de VNTR donde la longitud de la repetición es de un único nucleótido, que en la mayoría de los casos es A o T dado el alto contenido A+T del genoma de B. anthracis (39). Los SNR son los VNTR que presentan mayor variabilidad, debido a una rápida evolución (24, 39, 88). En el genoma de la cepa Ames, una de las más conocidas de B. anthracis, hay más de 50 SNR con un mínimo de nueve nucleótidos de longitud (39). El locus HM-1, en el plásmido pXO2, es un SNR que tiene un gran número de alelos de entre 9 y 60 nucleótidos (39). Para los patógenos bacterianos más importantes se han desarrollado esquemas de tipificación denominados MLST (multilocus sequence typing), que consisten en el secuenciamiento de un determinado número de genes esenciales, generalmente seis o siete, dispersos a lo largo del cromosoma bacteriano. Estos genes (housekeeping genes) codifican proteínas con funciones metabólicas importantes y como tales suelen tener baja variabilidad, de manera de favorecer la conservación de su función. Debido a que evolucionan lentamente, son útiles para caracterizar la variabilidad genética bacteriana y para desarrollar marcos evolutivos que interpreten esta diversidad. Las diferencias entre las secuencias son usadas para definir perfiles alélicos o ST (sequence types), a partir de cuya comparación se establecen las relaciones

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genéticas entre los aislamientos. El método MLST aporta resultados fácilmente intercambiables entre laboratorios, que en la actualidad constituyen bancos de datos en sitios web como http://www.mlst.net. En los últimos años se han diseñado MLST para B. anthracis y el grupo B. cereus. Dos sitios web específicos están disponibles libremente: Bacillus cereus MLST Databases http://pubmlst.org/bcereus/ (31, 37), que hasta la fecha consta de unos 550 perfiles alélicos para aproximadamente 1000 aislamientos, y Bacillus cereus group Typing Databases http://mlstoslo. uio.no/ (37, 92), de la Universidad de Oslo con datos de más de 2200 aislamientos.

I.b. Posibles funciones de los polimorfismos La función de las VNTR no está completamente dilucidada en las bacterias. En L. interrogans estas unidades repetitivas están dispersas a lo largo del genoma y generalmente no están localizadas en marcos de lectura abierta (58). En B. anthracis algunas VNTR se encuentran en zonas codificantes donde las repeticiones pueden conservar el marco de lectura, resultando en la adición o deleción de aminoácidos a las proteínas codificadas (40, 84). En el caso de los loci SNR, éstos están casi siempre localizados en regiones que no codifican proteínas (39) y sus efectos biológicos aún permanecen oscuros. Debido a las escasas diferencias moleculares presentes en B. anthracis, los cambios en los loci VNTR representan una fracción significativa de la variación genética encontrada dentro de esta especie y podrían representar un mecanismo adaptativo importante. El locus vrrA codifica una proteína hipotética de 30 kDa, rica en glutamina y prolina, que tiene una homología significativa con una proteína microfilarial de la vaina del nematode parásito Litomosoides carinii (3). Esto sugiere una potencial exposición superficial del producto de vrrA de B. anthracis, que podría ser de naturaleza antigénica, y debido a ello las repeticiones podrían estar involucradas en la generación de variación antigénica. También los loci vrrB1, vrrB2, vrrC1 y vrrC2 se encuentran en marcos de lectura abierta y la variación en el número de repeticiones no afecta el marco de traducción (40, 84). Sin embargo, las proteínas codificadas en estos cinco loci no han sido identificadas todavía. Otro ejemplo, en este caso bien caracterizado, es el del gen bclA que codifica una glicoproteína inmunodominante que es un componente estructural de los filamentos del exosporio de la espora madura de B. anthracis (89). La región central de la proteína BclA (Bacillus collagen-like protein) contiene un motivo repetitivo Gly-X-X (en gran proporción Gly-Pro-Thr) que además se encuentra dentro de una repetición de 21 aminoácidos del tipo (Gly-ProThr)5-Gly-Asp-Thr-Gly-Thr-Thr (89, 90). Ambos tipos de repeticiones varían considerablemente en número entre distintos aislamientos, y este polimorfismo es el responsable de la variación de la longitud del filamento del exosporio: cuando el tándem repetitivo dentro del

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gen es más largo, el filamento posee mayor longitud (90). Entonces, en este caso hay un efecto fenotípico controlado por cambios en un locus VNTR, aun cuando esa variación sea detectada sólo en microfotografías con tinciones especiales. BclA, al formar parte del exosporio, es probablemente una de las primeras moléculas con las que B. anthracis interactúa con el hospedador, es así que sus características y funciones están siendo intensamente estudiadas en la actualidad.

II. Aspectos moleculares de la virulencia de B. anthracis Los principales factores de virulencia a los que B. anthracis debe su patogenicidad son una cápsula de poliglutamato y las toxinas que produce, compuestas por tres proteínas que actúan combinadas de a dos (62). Estas proteínas son respectivamente el antígeno protector, conocido por su uso en la elaboración de vacunas, el factor edema y el factor letal. Los genes de las toxinas se encuentran codificados en el plásmido pXO1 y el operón biosintético de la cápsula es llevado por el plásmido pXO2. Sólo recientemente comenzó a revelarse la importancia de otros factores de virulencia, como por ejemplo los sideróforos.

II.a. Cápsula B. anthracis, al igual que muchas bacterias patógenas, forma como su estructura más externa una cápsula que está involucrada en el primer contacto entre la bacteria y las células del hospedador. En general, las cápsulas bacterianas están compuestas de polisacáridos. Por el contrario, en B. anthracis la cápsula es peptídica y está constituída por un homopolímero linear de poli-g-D-glutamato con una inmunogenicidad extremadamente débil, lo que le permite a la bacteria escapar de la fagocitosis. Así, la cápsula contribuye a la patogenicidad de este microorganismo permitiéndole evadir las defensas inmunológicas y su dispersión en diversos tejidos del hospedador. Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis también sintetizan poliglutamato, pero mientras que B. anthracis produce una cápsula compuesta únicamente por un polímero de D-glutamato y anclada al peptidoglicano, las otras dos especies, en general, producen un polímero no asociado al peptidoglicano y compuesto por los isómeros D- y L- en distintas proporciones (11). Hasta hace pocos años la síntesis de la cápsula de B. anthracis se adjudicaba a tres enzimas, CapB, CapC y CapA. Actualmente se sabe que un pequeño péptido, CapE, de sólo 47 aminoácidos, es necesario para la síntesis de la cápsula, y que la proteína CapD interviene en su anclado al peptidoglicano (10, 12, 82). Los genes capB, capC, capA, capD (inicialmente denominado dep) y capE se encuentran ubicados secuencialmente en el operón capBCADE del plásmido pXO2 (Figura 2B) (1012). El control de la síntesis de la cápsula ocurre a nivel

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de la transcripción e involucra la regulación del operón biosintético a través de la concentración de CO2/bicarbonato y de tres genes reguladores: atxA, acpA y acpB, el primero localizado en pXO1 y los dos últimos codificados por pXO2 (21). Para la síntesis del poliglutamato, B. anthracis utiliza como sustratos glutamato y ATP. La reacción puede ser dividida en dos pasos: la producción del polímero y su transporte a través de la membrana celular (Figura 2A). La síntesis depende de CapB y CapC, mientras que el transporte requiere la presencia de CapA y CapE (11). Las funciones de las proteínas CapB, CapC, CapA y CapE de B. anthracis se dedujeron por comparación con las secuencias de las proteínas correspondientes de B. subtilis (10, 11). Sus secuencias de aminoácidos, con claras regiones hidrofóbicas, sugieren que son enzimas asociadas a membrana y probablemente constituyan un complejo (23). La proteína CapD es una γ-glutamil transpeptidasa, que posee el sitio de corte consenso de estas enzimas, se autocliva en este sitio y produce dos subunidades desiguales, altamente entrelazadas, que permanecen asociadas y son necesarias para su actividad (10). CapD está localizada en la superficie de B. anthracis, asociada tanto con la membrana como con el peptidoglicano, y se propone que cumpla dos funciones: catalizar el anclado covalente del poliglutamato al peptidoglicano y controlar el tamaño de la cápsula catalizando la hidrólisis del polímero que la conforma (10, 82). La cápsula de B. anthracis está formada por poliglutamato de bajo peso molecular, y fragmentos pequeños del polímero se liberan en el medio extracelular por la acción depolimerasa de CapD (59). El anclado del poliglutamato a la superficie bacteriana es importante para la virulencia (10).

Figura 2. A) Síntesis de la cápsula de poliglutamato en B. anthracis. Adaptado de Richter et al. (82). B) Organización de los genes de la cápsula (operón capBCADE) en el plásmido pXO2 de B. anthracis.

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II.b. Toxinas del ántrax y su mecanismo de acción desde el punto de vista molecular Aunque la cápsula es un factor de virulencia importante para el establecimiento de la enfermedad, los síntomas asociados con el ántrax son el resultado de la producción de toxinas durante el desarrollo bacteriano. El efecto combinado de toxemia y bacteremia conduce a la muerte del hospedador infectado, y aunque los antibióticos pueden liberarlo del patógeno no pueden protegerlo de los efectos de las toxinas. Las toxinas consisten, como se mencionó anteriormente, en un complejo de tres proteínas: el antígeno protector (PA, protective antigen), llamado así por su habilidad para desarrollar en el hospedador una respuesta inmune protectora frente a este microorganismo, el factor letal (LF, lethal factor) y el factor edema (EF, edema factor). Individualmente ninguna de estas proteínas es tóxica, pero se combinan de a pares para formar la toxina letal y la toxina edemática (14). La combinación de PA y LF forma la toxina letal que causa la muerte en animales de experimentación y la lisis de ciertas líneas celulares eucarióticas. La toxina edemática, constituida por PA y EF, induce un incremento en los niveles de AMPc (AMP cíclico) intracelular generando edema en los tejidos. En condiciones de laboratorio, estas toxinas son inducidas por la temperatura (37 °C) y la presencia de CO2 y bicarbonato en el medio de cultivo (8, 13, 14, 86). Estas condiciones reflejan el ambiente normal en el hospedador mamífero. Los mecanismos moleculares que regulan la síntesis de las toxinas han sido revisados en profundidad (48, 65). Las toxinas del ántrax siguen un modelo binario A-B en el cual el componente B, en este caso PA, es el dominio que se une al receptor de la célula blanco y envía al componente A, que posee actividad enzimática, a través de la membrana para que acceda a las proteínas blanco (Figura 3). PA actúa como una entidad común de unión al receptor e interactúa tanto con EF como con LF para mediar sus entradas en las células blanco. Llamativamente, en B. anthracis EF y LF tienen regiones idénticas de unión a PA, y estos dos componentes catalíticos tienen una unión competitiva con PA (27, 50). El antígeno protector, el factor edema y el factor letal se encuentran codificados por los genes pagA, cya y lef, localizados en el plásmido pXO1. Estos genes han sido clonados y secuenciados; las tres proteínas tienen peptido señal. El PA se une al receptor de la célula blanco y es el responsable del transporte de EF y LF dentro de la célula, en una serie compleja de eventos. En un primer paso (Figura 3) el PA, como proteína madura de 83 kDa (PA83), se une específicamente por lo menos a dos receptores de superficie celular distintos (7, 85) y es escindido por una proteasa celular del tipo furina, quedando su región carboxilo-terminal de 63 kDa (PA63) unida a la superficie de la célula blanco. PA63 se oligomeriza espontáneamente

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formando el heptámero PA7mer, al que se unen EF y/o LF, ya que al separarse el fragmento amino-terminal de 20 kDa (PA20), queda expuesto en PA63 un sitio al cual se unen competitivamente EF y LF con alta afinidad. El complejo proteico formado ingresa a la célula por endocitosis mediada por receptor. Finalmente, el ambiente acídico del endosoma induce cambios conformacionales en el heptámero que conducen a su inserción en la membrana endosomal. La actividad formadora de canales de PA63 produce la traslocación de EF y LF dentro del citosol de la célula blanco, donde ejercen sus efectos tóxicos. La unión al receptor, entrada de las toxinas a la célula hospedadora y la traslocación a través de la membrana endosomal han sido recientemente revisadas en forma extensiva (19).

II.b.1. Antígeno protector PA83 tiene 735 aminoácidos y se ha determinado su estructura cristalina (79). La molécula de PA83 está plegada en cuatro dominios funcionales (Figura 4): § el dominio amino-terminal (dominio 1, residuos 1-249) que contiene el sitio de corte para la proteasa activadora, una secuencia de aminoácidos que fija establemente dos iones calcio que estabilizan la estructura del dominio y una zona hidrofóbica de unión al EF y al LF (79). § un dominio de heptamerización (dominio 2, residuos 250-487) que contiene un gran rulo flexible implicado en la inserción en la membrana y la formación del poro; este dominio también participa en el contacto con el receptor (52, 79, 83).

§ un pequeño dominio (dominio 3, residuos 488-594) que posee una zona hidrofóbica y participa en la oligomerización de PA63 (79). § un dominio carboxilo-terminal (dominio 4, residuos 595-735) de unión al receptor (51, 52, 79, 83). Cada uno de los dominios de PA es requerido para un paso particular del proceso de infección (Figura 3). La remoción de PA20, el fragmento amino-terminal del dominio 1, permite el ensamblado del heptámero PA7mer. Aun cuando cada monómero de PA63 puede unirse a EF o LF, sólo tres moléculas de EF y/o LF pueden unirse simultáneamente sobre el heptámero por impedimentos estéricos (66). EF y LF poseen secuencias homólogas de unos 250 aminoácidos en sus regiones amino-terminal, que están implicadas en la unión al PA (27, 50) (Figura 5). Se han encontrado homólogos de PA en varias bacterias gram positivas formadoras de esporas como es el caso de la toxina iota-b de Clostridium perfringens y las toxinas conocidas como Vip1 (vegetative insecticidal protein 1) de B. cereus y B. thuringiensis. Todas estas proteínas tienen la habilidad de traslocar enzimas tóxicas al citosol de las células del hospedador.

II.b.2. Factor edema El factor edema como proteína madura tiene 767 aminoácidos y un peso molecular de 89 kDa (Figura 5A). Es una adenilato ciclasa que causa edema al incrementar fuertemente los niveles intracelulares de AMPc a partir de ATP, luego de su entrada en la célula hospedadora. El

Figura 3. Modelo de acción de las toxinas del ántrax. Adaptado de Mock et al. (64).

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Figura 4. Esquema del antígeno protector PA83 como proteína madura.

Figura 5. Representación esquemática de las proteínas maduras del factor edema (A) y factor letal (B).

AMPc intracelular es un mensajero secundario que regula muchas respuestas celulares, entre ellas la producción de citoquinas que modulan la formación de edema. La actividad enzimática de EF depende de iones de calcio y magnesio y de calmodulina (20). La calmodulina está presente en todas las células eucariotas, en las que modula muchos procesos intracelulares incluyendo la

transducción de señales y la transcripción de genes. Esta proteína transduce las señales intracelulares de calcio a través de dos dominios globulares conectados por una hélice central flexible. El calcio es necesario para formar el complejo adenilato ciclasa/calmodulina, mientras que el magnesio forma un complejo con el sustrato ATP. Es importante decir que las adenilato ciclasas que requie-

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ren calmodulina son típicas de los eucariotas, mientras que sólo unas pocas adenilato ciclasas procariotas, como la toxina CyaA de Bordetella pertussis, la ExoY de Pseudomonas aeruginosa y la adenilato ciclasa de Yersinia pestis, además del EF de B. anthracis, requieren calmodulina. Por otro lado, el EF de B. anthracis no comparte una homología estructural significativa con las adenilato ciclasas de mamíferos y posee un mecanismo de acción diferente del propuesto para éstas (20). Las bases moleculares de la actividad adenilato ciclasa del EF han sido revisadas recientemente (91). La región amino-terminal del EF (Figura 5A) contiene los aminoácidos responsables de la unión a PA63 incluyendo siete aminoácidos (Val-Tyr-Tyr-Glu-Ile-Gly-Lys) que se encuentran presentes también en el LF (27). La región carboxilo-terminal del EF contiene el sitio catalítico y el dominio de activación dependiente de calmodulina. Esta región está compuesta por tres dominios globulares, CA1, CB y CA2, y un dominio helicoidal en el extremo. El sitio activo yace en la interfase entre los dominios CA y CB, los cuales constituyen juntos un centro catalítico. Se sabe que el sitio de unión a la calmodulina involucra los aminoácidos 499 a 532 y los 150 aminoácidos de la región carboxilo-terminal. El factor edema de B. anthracis comparte tres secuencias altamente conservadas con la adenilato ciclasa dependiente de calmodulina de B. pertussis, incluyendo 24 aminoácidos que participan en la unión y catálisis del ATP. El EF, a diferencia del LF que se dispersa en el citosol, permanece asociado a la membrana del endosoma tardío luego de su translocación (Figura 3), con sus dominios catalíticos expuestos hacia el citoplasma.

II.b.3. Factor letal El factor letal es una metaloproteasa dependiente de zinc altamente específica, similar a las toxinas de Clostridium botulinum y Clostridium tetani. Posee 776 aminoácidos como proteína madura y un peso molecular de 90 kDa (Figura 5B). El LF corta la región amino-terminal de una familia de quinasas (MAPKK, mitogen-activated protein kinase kinases), que modulan la expresión genética a través de la fosforilación de proteínas, inactivando de esta manera varios mecanismos de señalización celulares (63). Estos mecanismos juegan importantes roles en numerosas funciones de las células, que van desde la proliferación celular y regulación del ciclo celular hasta la modulación de la respuesta inmunológica. Las MAPKK son el único sustrato conocido del LF. Según el análisis de su estructura cristalina, el LF comprende cuatro dominios (72) (Figura 5B): § el dominio I que participa en la unión al antígeno protector, § el dominio II, conformado por dos segmentos no contiguos, importante para la unión al sustrato MAPKK, § el dominio III, pequeño segmento, insertado dentro del dominio II, que se pliega independientemente y que

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está caracterizado por la presencia de cuatro repeticiones que probablemente se originaron por duplicación de un elemento del dominio II, § y el dominio IV que contiene el centro catalítico. Los dominios II, III y IV crean conjuntamente un profundo surco que sostiene los primeros aminoácidos del amino-terminal de las MAPKK antes de su escisión (72). En el dominio IV se ha identificado la secuencia consenso His-Glu-X-X-His, característica de las metaloproteasas dependientes de zinc (Figura 5B). Las mutaciones que involucran estos aminoácidos anulan la unión del zinc a la toxina letal eliminando su actividad (46). Las deleciones en la región central del LF tornan a la toxina inestable e inactiva. El LF es un blanco potencial para el diseño de nuevos agentes terapéuticos que inhiban su actividad catalítica o bloqueen su asociación al PA. La toxina letal, que es letal para animales de laboratorio, exhibe una citotoxicidad específica para los macrófagos y células dendríticas, que son los centinelas de primera fila en varios portales de entrada del cuerpo. Inicialmente se propuso que la toxina letal disparaba en los macrófagos una liberación incontrolada de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, estudios posteriores demostraron que la toxina letal inhibe la producción y secreción de citoquinas proinflamatorias en los macrófagos y células dendríticas con la cooperación de la toxina edemática (93). La toxina letal también promueve la apoptosis de los macrófagos. Las dos toxinas inhiben la secreción del TNF-a (Tumor Necrosis Factor-a) (93). De esta manera ambas toxinas suprimen la respuesta inmunológica innata del hospedador contribuyendo a la diseminación de B. anthracis y a la progresión de la enfermedad. Los efectos celulares y sistémicos de las toxinas del ántrax, y el desmantelamiento de las defensas inmunológicas del hospedador han sido revisados recientemente (63, 94).

II.c. Otros factores de virulencia en B. anthracis II.c.1. Sideróforos: bacilibactina y petrobactina Los sideróforos son moléculas quelantes de Fe(III) que poseen una afinidad extremadamente alta por éste. Son sintetizados comúnmente por los patógenos bacterianos para la adquisición de hierro en respuesta a su escasez en el ambiente normal de los mamíferos, ya que el hierro necesario para establecer una infección exitosa se encuentra unido a diversas moléculas del hospedador y su disponibilidad está altamente regulada por mecanismos homeostáticos. El fuerte crecimiento de B. anthracis observado durante una infección, desde la captura de las esporas por los fagocitos hasta la liberación de los bacilos vegetativos desde los nódulos linfáticos con la subsiguiente infección sanguínea, ha llevado a sugerir que la biosíntesis de sideróforos es un requerimiento adicional para la virulencia (16). B. anthracis produce dos sideróforos distintos, la bacilibactina y la petrobactina, llamadas inicialmente

Bacillus anthracis: una mirada molecular

antrabactina y antraquelina respectivamente, que le suministran el hierro necesario durante los estadios de rápido crecimiento (16). Ambos sideróforos son catecolatos con diferente patrón de hidroxilación, la bacilibactina es un 2,3-catecolato y la petrobactina tiene unido un 3,4-catecolato a un esqueleto citrato (Figura 6) (16). Todos los miembros del grupo B. cereus secretan bacilibactina, que es similar a la enterobactina producida por las bacterias Gram negativas (98). B. anthracis y B. cereus producen primariamente petrobactina. Algunos aislamientos no patógenos de B. thurigiensis y B. cereus también producen petrobactina, por lo que su presencia en sí misma no es indicativa de virulencia (49). A pesar de la gran eficiencia de la bacilibactina para quelar hierro, la petrobactina sería el único sideróforo necesario para asegurar la virulencia y el crecimiento de B. anthracis dentro del hospedador, ya que la pérdida de la bacilibactina no altera la virulencia en modelos animales (16). La petrobactina como factor de virulencia evade a la proteína siderocalina, una proteína que forma parte del sistema inmune innato del hospedador (1). En el caso de B. anthracis, la siderocalina se une a la bacilibactina o su complejo con hierro, pero no reconoce a la petrobactina, debido a que la diferencia en el patrón de hidroxilación de la petrobactina provoca un gran cambio conformacional que impide su inserción en el bolsillo de unión de la siderocalina (1). Esta diferencia estructural es inusual en un sideróforo, y permite a la petrobactina libre o unida al hierro férrico evadir sigilosamente al sistema inmune del hospedador (1). En medios de cultivo con bajo contenido de hierro, la petrobactina y la bacilibactina son producidas temporalmente durante la germinación de la espora y el crecimiento de B. anthracis. La petrobactina se secreta primero mientras que la liberación de la bacilibactina comienza varias horas más tarde, lo que sugiere que esta última puede cumplir un rol en los estadios tardíos de la infección (97). La síntesis de los sideróforos está regulada por el nivel de hierro, la temperatura y la presencia de CO2/bicarbonato (97). En el genoma de B. anthracis hay al menos dos grupos de genes que codifican la biosíntesis independiente de los dos sideróforos, y otros genes que son homólogos a los presentes en otras bacterias y que están relacionados al transporte y almacenamiento de hierro y a proteínas re-

Figura 6. Fórmulas de los sideróforos bacilibactina y petrobactina.

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guladoras (16). La producción de la bacilibactina depende del operón bacACEBF (B. anthracis catecol), compuesto por cinco genes, que tiene un 79 % de similitud con el operón de la bacilibactina de B. subtilis (1, 16, 33, 98). Para la biosíntesis de la petrobactina se requieren seis genes biosintéticos organizados en el operón asbABCDEF (anthrax siderophore biosynthesis) (16, 33, 98). Los últimos avances en el campo de los sideróforos se han hecho en relación al camino biosintético de la petrobactina (54) y al estudio de las proteínas asociadas a membrana que participan en la captación y transporte de la petrobactina unida al hierro en B. anthracis, B. cereus y también B. subtilis (99). Sin embargo, se requieren estudios adicionales para demostrar el rol exacto que cumplen estas proteínas. Hipotéticamente, el bloqueo de la petrobactina o de las proteínas transportadoras de este sideróforo podría limitar la habilidad de la bacteria para replicarse durante la infección.

II.c.2. Capa S en B. anthracis Además de los principales factores de virulencia ya analizados, actualmente se considera también importante para la virulencia la presencia en B. anthracis de una capa S (S-layer, surface layer) rodeando la pared de las células vegetativas (60). La capa S es una capa proteica de apariencia cristalina y con variadas simetrías, presente sobre la superficie de muchos géneros bacterianos. Se piensa que esta capa es importante en la interacción entre un microorganismo y su ambiente. Se han propuesto varias funciones para la capa S, tales como el mantenimiento de la forma del microorganismo y el tamizado molecular permitiendo el paso diferencial de sustancias de bajo peso molecular, entre otras. La capa S podría ser un factor de virulencia en las bacterias patógenas actuando como un elemento de protección frente a ciertos mecanismos de defensa del hospedador, facilitando la unión de la bacteria a moléculas presentes en las células infectadas o aumentando su capacidad para asociarse con los macrófagos. Las capas S se encuentran en otros patógenos además de B. anthracis como en B. pertussis y en varias especies de Clostridium, Aeromonas, Campylobacter, Treponema, Chlamydia o Rickettsia, entre otras. Si bien en B. anthracis la presencia de la capa S no influye en la dosis letal 50 % en los animales de experimentación, tendría un efecto acumulativo junto con la cápsula, incrementando la resistencia del patógeno frente a las defensas del hospedador mediadas por el complemento (64). Aunque la capa S no se requiere para la formación normal de la cápsula de B. anthracis, esta capa puede modificar su estructura fina. Cuando la bacteria no produce la cápsula, la capa S es el elemento más externo de la pared celular del microorganismo. Los componentes más abundantes de la capa S de B. anthracis son dos proteínas, Sap (surface-array protein) y EA1 (extractable antigen 1), sintetizadas secuencialmente de una manera dependiente de la fase de crecimiento. En

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medio rico, durante la fase exponencial del crecimiento, la capa S de B. anthracis está formada por la proteína Sap y, cuando las células entran en la fase estacionaria, esta capa es reemplazada por una capa S constituida por EA1. La proteína EA1 es un importante antígeno de superficie (60). Sap y EA1 están codificadas por los genes cromosomales sap y eag, ubicados uno a continuación del otro, con la misma orientación, pero separados entre sí por unos 720 pares de bases. Estos dos genes son regulados por los productos de los genes atxA y pagR, codificados por el plásmido pXO1, indicando que genes de un plásmido pueden regular genes cromosomales (61). Sap, de 814 aminoácidos, y EA1, de 862 aminoácidos, poseen varias características en común: ambas tienen un péptido señal, acorde con la localización de estas proteínas en la superficie celular. Los dominios amino-terminal de Sap y EA1 son muy similares entre sí (66 % de identidad) (60). Esto se debe principalmente a la presencia en ambas proteínas de tres secuencias repetitivas de unos 50 aminoácidos cada una, involucradas en el anclado no covalente a la superficie celular. Estas secuencias se conocen como motivos SLH (S-layer homology). El dominio carboxilo-terminal es una zona resistente a proteasas y en esta región EA1 y Sap difieren significativamente. Por delante de los genes sap y eag se localiza el operón csaAB (S-layer cell surface anchoring) que contribuye al anclado de la capa S a la superficie celular. En B. anthracis hay 24 regiones con motivos SLH, la mayoría de las cuales se encuentran en el cromosoma, y unas pocas en los plásmidos pXO1 y pXO2 (43, 69). Los motivos SLH se encuentran en muchas proteínas de superficie de bacterias Gram positivas y podrían ser los elementos responsables de la unión de estas proteínas a la pared celular de estos microorganismos. Recientemente se ha descripto la proteína BslA (B. anthracis S-layer protein A), una adhesina de la capa S, que media la adherencia de la forma vegetativa de B. anthracis a la célula hospedadora y que se propone como factor de virulencia para el ántrax (43, 44). Se ha demostrado que BslA contribuye de manera importante en la dosis letal 50 % en cobayos (44). También BslA posee un dominio con tres motivos SLH (43). El gen bslA, originalmente denominado pXO1-90, se encuentra dentro de una isla de patogenicidad (ver más adelante) en el plásmido pXO1 (43, 68).

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II.c.3. Lipoproteína MntA Recientemente se propuso que la lipoproteína de membrana MntA sería un nuevo factor de virulencia esencial para el desarrollo del ántrax (25). Está codificada en el cromosoma y forma parte de un sistema ABC de captación de manganeso. La deleción del gen mntA provoca defectos en el crecimiento de la bacteria compensado por la adición de Mn2+, sensibilidad al stress oxidativo y una severa atenuación en la dosis letal 50 en cobayos. Posteriormente se observó que MntA es un fuerte antígeno, aunque a diferencia de PA no induce protección (17).

III. Organización molecular de los plásmidos de B. anthracis Tradicionalmente se consideró la presencia de los dos grandes plásmidos de virulencia, pXO1 y pXO2, como la característica principal para distinguir a B. anthracis de otras especies del grupo B. cereus. En 1999, el plásmido pXO1 de la cepa Sterne fue secuenciado (68, 69). Se trata de un megaplásmido circular de 181.654 pb que tiene el potencial de codificar 143 proteínas, de las cuales sólo un pequeño porcentaje tiene una similitud significativa con secuencias disponibles en los bancos de datos (69). Este plásmido lleva los genes estructurales de las toxinas del ántrax (pagA, lef y cya); dos genes reguladores, atxA y pagR, que controlan varios genes involucrados en la virulencia; un gen que codifica una topoisomerasa; el operón gerX con tres genes cuyas funciones afectan la germinación; y el gen bslA que codifica la ya mencionada adhesina de la capa S (43) (Figura 7). Además pXO1 incluye una colección de posibles transposasas, resolvasas e integrasas (69). El plásmido pXO2 de una cepa Pasteur también fue secuenciado (68). pXO2 es un megaplásmido que tiene 96.231 pb, con 85 marcos de lectura abiertos cuyas funciones en su gran mayoría se desconocen (64). Además del operón capBCADE, con los genes esenciales para la formación de la cápsula, pXO2 lleva también los genes reguladores acpA y acpB, específicos para la expresión de los genes biosintéticos de la cápsula (12, 48, 65). El tamaño promedio de un marco de lectura abierto en pXO1 es de 610 pb, significativamente menor que el tamaño promedio generalmente encontrado en genomas microbianos (unos 1000 pb) (69). Por otro lado, sólo el 75 % del plásmido pXO1 presenta secuencias codificantes (69). El tamaño de los marcos de lectura abiertos y la

Figura 7. Mapa de la isla de patogenicidad en el plásmido pXO1. La dirección de las flechas indica la dirección de transcripción de cada marco de lectura abierto. Adaptado de Okinaka et al. (69).

Bacillus anthracis: una mirada molecular

densidad potencial de codificación podría reflejar la presencia en pXO1 de genes remanentes no funcionales, y concuerda con la tendencia general de los plásmidos a tener espacios intergénicos más amplios que sus genomas correspondientes, cuyas densidades de genes oscilan entre 85 y 93 % (69).

III. a. La isla de patogenicidad de pXO1 La característica más notable en la organización de pXO1 es la presencia de una isla de patogenicidad (Figura 7) definida por una región de aproximadamente 56.000 pb, que contiene los genes lef, pagA y cya de las toxinas, los genes reguladores atxA y pagR, el operón gerX y el gen bslA (43, 69). En total, en esta región se encontraron una treintena de marcos de lectura abierta, que incluyen además algunas posibles integrasas y transposasas. El contenido de G+C de la isla es del 30 %, difiriendo apenas del resto del plásmido (32,5 %) o del genoma (33 %) (69). Una región de la isla de patogenicidad está delimitada por dos secuencias de inserción invertidas y prácticamente idénticas (IS1627) y se ha observado que dos cepas diferentes de B. anthracis pueden poseer esta región, invertida en sus respectivos plásmidos pXO1 (69). En general, las islas de patogenicidad llevan varios genes de virulencia, están presentes en cepas patógenas y generalmente ausentes en cepas menos patógenas, ocupan grandes regiones cromosomales (generalmente mayores a 30 kb), difieren en el contenido de G+C en comparación con el ADN de la misma bacteria, representan unidades genéticas distintivas a menudo flanqueadas por repeticiones directas, secuencias de inserción (IS, insertion sequence) y/o genes tRNA, presentan “genes de movilidad” (elementos IS, integrasas, transposasas) y son inestables. Estos criterios se definieron tomando en cuenta principalmente a microorganismos gram negativos, ya que las islas de patogenicidad encontradas en los genomas de patógenos gram positivos no cumplen todos los criterios de la definición: no poseen repeticiones directas o loci tRNA en sus extremos y parecen estar establemente integradas al genoma de las cepas respectivas. Sin embargo, codifican importantes factores de virulencia y son específicas de las cepas patógenas de algunas especies. En el caso de B. anthracis se cumplen prácticamente todos los criterios de la definición con las salvedades que se dan en otros patógenos gram positivos. Una característica especial de la isla de patogenicidad de B. anthracis es su ubicación en un megaplásmido. Otro microorganismo gram positivo, el patógeno equino Rhodococcus equi, también tiene un gran plásmido con una isla de patogenicidad, que codifica proteínas asociadas a la virulencia y le permiten a la bacteria resistir el ataque de los macrófagos y proliferar en la célula hospedadora. Y algunas cepas de C. perfringens, que poseen la habilidad de producir ureasa como factor de virulencia, tienen los genes estructurales ureABC localizados sobre

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un gran plásmido, que a menudo codifica también a la toxina letal e, la toxina i o la enterotoxina. La comparación de las secuencias completas de los genomas de B. anthracis y B. cereus permitió encontrar tres islas genómicas en el genoma de B. cereus que a su vez están ausentes en el genoma de B. anthracis. A diferencia de lo que sucede en B. anthracis, estas tres islas tienen abruptas diferencias en el contenido G+C comparado con las regiones que las rodean (69).

III.b. Relevancia de los megaplásmidos de B. anthracis para la virulencia Se ha notado que la virulencia de B. anthracis puede diferir entre distintas cepas o aislamientos. Las diferencias en virulencia están relacionadas con la presencia o ausencia de los plásmidos, aunque también hay otros factores que la modulan. La pérdida de pXO2, así como las mutaciones en capBCADE, reducen marcadamente la patogenicidad de B. anthracis (15, 21). La pérdida de pXO1 también conduce a una disminución significativa de la virulencia o anula la protección vacunal. El número de copias del plásmido pXO1 puede variar entre 33 y 243 entre distintas cepas de B. anthracis, mientras que la cantidad de copias de pXO2 varía entre 1 y 32 (18, 81). El número de copias del plásmido pXO2 contribuye al nivel de virulencia asociado con un aislamiento y no puede descartarse que el de pXO1 contribuya también a diferencias en la virulencia (18). En el laboratorio, las cepas de B. anthracis pueden curarse de uno o ambos plásmidos por incubación a 42-43 °C, en atmósfera de 30 % CO2, o en presencia de determinados antibióticos. Sin embargo, en la naturaleza el plásmido pXO1 no suele perderse espontáneamente. Desde el punto de vista fenotípico las cepas curadas de pXO1, más allá de no producir toxinas, lo que las torna avirulentas, poseen diferentes requerimientos nutricionales sobre ciertos medios mínimos, esporulan tempranamente y son más sensibles a algunos bacteriófagos. A diferencia de pXO1, el plásmido pXO2 puede perderse espontáneamente. El único fenotipo asociado a pXO2, hasta ahora es la formación de la cápsula que se detecta observando la morfología mucosa de las colonias o mediante coloraciones especiales. Es posible hallar mutantes sin cápsula que poseen el plásmido pXO2, por lo que se especula que este plásmido podría ser más susceptible a rearreglos que pXO1.

III.c. Evidencia de transferencia lateral de los genes de virulencia de B. anthracis Hace ya dos décadas, Turnbull et al. (95) publicaron un trabajo con el título: “B. anthracis pero no siempre ántrax”, reflejando que no todas las cepas de esta especie son patógenas. Ahora, Okinaka et al. (70) plantean la pregunta: “Ántrax, pero no B. anthracis?”, debido a la existencia de genes de patogenia asociados al ántrax, en otras especies de Bacillus.

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Como ya se ha mencionado, recientemente se ha demostrado que el “esqueleto genético” de los plásmidos pXO1 y pXO2 no está restringido únicamente a B. anthracis sino que también pudo ser encontrado en distintos aislamientos de B. cereus y B. thuringiensis (9, 28, 32, 34, 57). Por ejemplo, recientemente se identificaron los genes de las toxinas del ántrax, y en algunos casos también los de la cápsula, en varios aislamientos de B. cereus asociados a severas neumonías parecidas al ántrax por inhalación. Uno de estos aislamientos fue identificado fenotípicamente y por análisis del gen 16S rRNA como B. cereus pero, a su vez, presentaba un plásmido circular con un 99,6 % de similitud con el plásmido pXO1, al que se denominó pBCXO1 para diferenciarlo del pXO1 de B. anthracis (32). pBCXO1 codificaba el complejo biosintético de las toxinas del ántrax completo (99,7 %, 99 % y 96 % de identidad a nivel de aminoácidos con PA, LF, EF, respectivamente) y las proteínas regulatorias AtxA y PagR con 100 % y 98,6 % de identidad respectivamente. En este aislamiento no se encontraron homólogos de pXO2, aunque poseía otro plásmido con genes para la formación de una cápsula de polisacáridos, a diferencia de la de B. anthracis que es peptídica. Otros aislamientos de B. cereus, más allá de contener los genes de las toxinas, presentaron también los genes de la cápsula capA, capB y capC aunque no formaban la cápsula típica de B. anthracis. No sólo el hombre se ha visto afectado por estas cepas que comparten genes de virulencia con B. anthracis, ya que también B. cereus que llevaban los plásmidos pXO1 y pXO2 causaron ántrax respiratorio en varios chimpancés y un gorila en Costa de Marfil y Camerún, demostrando la íntima relación entre la presencia de los plásmidos de virulencia y la patogenicidad (45, 55).

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En un estudio (34) de 1.000 aislamientos del grupo B. cereus para los cuales se analizó la presencia de replicones semejantes a pXO1 y pXO2 se encontró que los del tipo pXO1 estaban presentes en 6,6% de las muestras y los del tipo pXO2 lo estaban en 7,7% de las muestras ambientales obtenidas al azar de diferentes nichos ecológicos y diversas distribuciones geográficas. En todos estos casos se observó al menos un gran plásmido, pero ninguno de estos aislamientos llevaba los genes de las toxinas o de la cápsula de B. anthracis. Recientemente, se ha aislado una cepa, CBD 119T, que no pertenece al grupo B. cereus y que lleva un gran plásmido con genes que comparten casi el 100 % de identidad con los genes de la cápsula de B. anthracis (57). Esta cepa es ahora la cepa tipo de la especie Bacillus acidibacter y es el primer caso de genes del plásmido pXO2 en una especie de Bacillus que no pertenece al grupo B. cereus (77).

IV. Receptores del antígeno protector Los receptores para el PA de B. anthracis juegan un rol crucial en la patogénesis de la enfermedad. El primer receptor de superficie celular humano identificado ha sido TEM8 (tumor endothelial marker 8), actualmente conocido como ANTXR1 (7). Posteriormente se demostró que la proteína CMG2 (capillary morphogenesis protein 2), ahora ANTXR2, también funciona como receptor de PA (85). Ambos receptores son proteínas de transmembrana muy similares entre sí, con un único dominio transmembrana, y cuya característica distintiva es la presencia de un dominio extracelular de unos 200 aminoácidos que está relacionado al factor von Willebrand tipo A (vWFA) (Figura 8). Estos receptores unen a PA con alta (ANTXR2/

Figura 8. Representación esquemática de las isoformas conocidas de los receptores ANTXR1/TEM8 y ANTXR2/CMG2.

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CMG2) o baja (ANTXR1/TEM8) afinidad, por intermedio de esta región. Los dominios extracelulares de ANTXR1/TEM8 y ANTXR2/CMG2 comparten entre ellos un 60% de identidad a nivel de sus aminoácidos, son similares al dominio I encontrado en proteínas de adhesión como las α-integrinas y poseen un sitio de adhesión dependiente de ión metálico, conocido como MIDAS (7, 52, 83). El sitio MIDAS tiene una secuencia conservada (DxSxS...T...D, donde x es un aminoácido variable y los puntos representan un número variable de aminoácidos) y media con alta afinidad la unión al PA a través de su interacción con los dominios II y IV de éste (7, 52, 83). La estructura cristalina del complejo PA-ANTXR2/CMG2 revela una extensa superficie de interacción receptor-patógeno que mimetiza el reconocimiento normal de la matriz extracelular realizado por las integrinas (83). Los ligandos naturales de los dos receptores no se han identificado formalmente, aunque ANTXR1/TEM8 interactúa con el colágeno a3(VI) y ANTXR2/CMG2 se une al colágeno tipo IV y a laminina, y se ha sugerido que éstos serían sus ligandos naturales in vivo (67). El receptor ANTXR1/TEM8 se expresa fuertemente sólo en las células epiteliales humanas de los órganos que constituyen los sitios de entrada de la toxina del ántrax: el epitelio respiratorio de los bronquios, los queratinocitos de la epidermis y las células epiteliales del intestino delgado, y se observó que su expresión aumenta en las células endoteliales durante la formación de vasos sanguíneos en tumores de colon, por lo que se ha sugerido que cumple un rol en la angiogénesis tumoral (6, 67, 85). ANTXR2/CMG2 se expresa ampliamente en humanos en tejidos de corazón, pulmón, hígado, músculo esquelético, placenta, intestino delgado, riñón, colon y bazo, y en leucocitos en sangre periférica (85). Si bien no está claro el rol fisiológico de ANTXR2/CMG2, las mutaciones dentro del gen causan los desórdenes conocidos como fibromatosis hialina juvenil y hialinosis sistémica infantil (29). Se han descripto al menos tres isoformas diferentes de la proteína ANTXR1/TEM8 (Figura 8) que son producidas por splicing alternativo del gen correspondiente (7). La isoforma larga (sv1) es una proteína de transmembrana con una larga cola citoplasmática rica en prolina. La isoforma media (sv2) que ha sido el primer receptor de la toxina del ántrax descripto, es una proteína que posee una cola citoplasmática corta de 25 aminoácidos. Las isoformas larga y media son idénticas a lo largo de la región extracelular, el dominio transmembrana y una porción de la cola citoplasmática. Como ambas isoformas contienen el dominio vWFA, que se une al PA, ambas funcionan como receptores pero no así la isoforma corta (sv3), que a pesar de contener el dominio vWFA no funciona como receptor de PA porque no posee la secuencia de fijación a la membrana y se especula que sería secretada (7, 56). Las colas citoplasmáticas del ANTXR1/TEM8 no

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son estrictamente esenciales para la unión al PA ni para la entrada de la toxina, la traslocación o la intoxicación (7), sin embargo modulan la afinidad de la unión al PA, presumiblemente a través de su interacción con factores citoplasmáticos. Es interesante que ANTXR1/TEM8 está altamente conservado en diferentes especies y los homólogos humanos y murinos comparten 98 % de identidad en las secuencias del dominio extracelular (7). El dominio vWFA de ANTXR1/TEM8 se ha expresado como una proteína de fusión funcional en Escherichia coli con alta afinidad por PA y capaz de bloquear la citotoxicidad de las toxinas del ántrax. También se han descripto (85) al menos cuatro isoformas de ANTXR2/CMG2 obtenidas por splicing alternativo de transcriptos del gen CMG2 (Figura 8). CMG2386, con 386 aminoácidos, fue la primera isoforma descripta. Se expresa predominantemente dentro del retículo endoplasmático de las células, por lo que esta isoforma no podría funcionar como receptor de PA, al tener una localización intracelular (85). La potencial isoforma CMG2489 difiere de la anterior en la presencia de una región de 100 aminoácidos entre el dominio vWFA y la región transmembrana (85). La isoforma CMG2488, aún no caracterizada, sería idéntica a CMG2489 excepto en los últimos trece aminoácidos de su extremo carboxilo-terminal. La potencial isoforma CMG2322 sería una proteína de 322 aminoácidos secretada, sin dominio transmembrana, por lo cual tampoco funcionaría como receptor (85). Se ha propuesto que una versión soluble del dominio vWFA de ANTXR2/ CMG2 podría ser útil en el tratamiento del ántrax como una potente antitoxina (7, 85).

Reflexiones finales Si bien B. anthracis es un patógeno de importancia veterinaria y médica conocido desde tiempos remotos, hay muchos aspectos de su virulencia y toxicidad aún poco conocidos. En los últimos años ha aumentado el interés en su estudio, se ha publicado la secuencia de su genoma, y se han obtenido datos acerca del modo de acción de muchas de las proteínas y genes importantes para su patogenia. En este artículo hemos considerado su diversidad molecular, los diferentes aspectos moleculares de la virulencia, incluyendo factores de virulencia recientemente descriptos, así como los receptores involucrados en la interacción de este patógeno con el hospedador. Se ha detallado la organización molecular de los plásmidos y la transferencia lateral de genes de virulencia hacia otras especies relacionadas. Los abordajes moleculares han permitido aumentar enormemente el conocimiento de los diferentes aspectos de este microorganismo y su relación con el hospedador, pero a la vez han abierto nuevos interrogantes sobre este notorio patógeno. Agradecimientos: A la Dra Laura Levin por la lectura crítica del manuscrito original.

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Recibido: 07/06/2011 – Aceptado: 21/09/2011

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IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS

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Micorrizas arbusculares: asociaciones simbióticas e indicadores de calidad ambiental en sistemas de cultivos extensivos Arbuscular mycorrhiza: symbiotic associations and environmental quality indicators in extensive crop-systems Dentro de la gran diversidad de microorganismos del suelo, los hongos formadores de micorrizas arbusculares (MA) son de gran importancia agrícola y ambiental, pues desempeñan funciones claves en el ciclado de nutrientes, nutrición vegetal y en la protección de las plantas frente a situaciones de estrés ambiental (1). Los hongos formadores de MA (HFMA) forman una relación simbiótica con la raíz de la planta hospedante, beneficiándose ambos de tal asociación. El hongo aumenta la capacidad de la planta de absorber agua y nutrientes minerales a cambio de la obtención de fuentes carbonadas provenientes de la misma (4). Estos hongos pertenecen a la clase Zygomycetes, orden Glomerales. Se caracterizan por producir estructuras típicas (2) que, a diferencia de otras asociaciones micorrícicas tales como las ectomicorrizas en plantas arbóreas, no se pueden ver a simple vista. Necesariamente se deben seccionar las raíces de la planta hospedante, teñirlas y observarlas al microscopio. Una metodología frecuentemente aplicada es la tinción con azul de Tripán, el cual tiñe específicamente el tejido fúngico, diferenciándose de las células vegetales (3). Entre las estructuras típicas, los arbúsculos (Figuras 1 y 2) poseen forma de árbol y constituyen ramificaciones de las hifas dentro de las células vegetales. Allí tiene lugar el intercambio de nutrientes y metabolitos entre el hongo y la planta. Las vesículas (Figuras 3 y 5), a menudo ovoides, pueden formarse inter o intracelularmente. Ellas constituyen el sitio de almacenamiento de sustancias de reserva y polifosfatos (2). Sin embargo, algunos HFMA no forman vesículas. Las esporas (Figuras 4 y 5) de forma globosa, extracelulares, cumplen la función de almacenamiento y propagación. Al germinar éstas, las hifas generadas exploran el suelo. Al encontrar raíces de una planta potencialmente hospedante generan un apresorio o ensanchamiento en su extremo, a partir del cual comienza la infección (Figura 6). La capacidad exploratoria del suelo por parte de las raíces se ve incrementada significativamente cuando la asociación micorrícica se establece. Estudiar las estructuras de las MA posibilita determinar el grado de micorrización de cultivos de interés agronómico, tales como el trigo. Evaluar las asociaciones micorrícicas naturales presentes en los distintos ecosistemas permite definir su función y los cambios que se generan debidos a las condiciones de manejo imperantes.

Figuras. Raíces de trigo cultivado a campo teñidas con azul de Tripán. 1: Arbúsculos en tejido cortical a 100x. 2: Arbúsculos dentro de célula vegetal a 1000x. 3: Vesículas a 400x. 4: Espora germinada cuya hifa ha penetrado la raíz (flecha) (100x). 5: Vesículas (flecha negra) y esporas (flecha blanca) en tejido cortical. 6: Hifas y apresorio (flecha) sobre células de la raíz (400x). Carolina B Nardini, Luciana P. Di Salvo, Inés E. García de Salamone Cátedra de Microbiología Agrícola, Departamento de Biología Aplicada y Alimentos, Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires. Avda. San Martín 4453, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. E-mail: [email protected]

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43:0325-7541 312-313 ISSN Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 312-313

LETTERS TO THE EDITOR

Aerococci: hard to find and classify Dear Editor, I read with interest the case report entitled “Aerococcus viridans urinary tract infection in a pediatric patient with secondary pseudohypoaldosteronism” by Leite and coworkers in Revista Argentina de Microbiología, volume 42, number 4. This report is important since it shows that aerococci can also cause disease in pediatric patients. Previous reports indicate that aerococci mostly infect elderly people (3, 7), causing invasive disease mainly in older males (6). Since aerococci are often mistaken for streptococci, enterococci or staphylococci in clinical practice, an increased awareness of aerococci is needed and thus, the report by Leite et al. is indeed relevant. A. viridans was described in 1953 (8) and additional aerococcal species, including Aerococcus urinae (1) and Aerococcus sanguinicola (5), have now been defined. A. viridans and A. sanguinicola have similar biochemical properties (4) but A. sanguinicola seems to be more commonly isolated from infected patients than A. viridans (2, Senneby et al. in preparation). Importantly, the GPIVitek2 system used by Leite et al. fails to recognize A. sanguinicola and misclassifies this species as A. viridans (2). Thus, it is possible that the organism that had caused the urinary tract infection described by Leite et al. was not A. viridans but A. sanguinicola. This potential misidentification may have occurred in several published cases where A. viridans was identified only on the basis of the API or Vitek2 systems. Since biochemical typing of aerococci is difficult, 16S rRNA gene PCR and sequencing would be

helpful to clarify which aerococcal species had caused the infection in this interesting case. 1. Aguirre M, Collins MD. Phylogenetic analysis of some Aerococcus like organisms from urinary tract infections: description of Aerococcus urinae sp. nov. J Gen Microbiol 1992; 138: 401-5. 2. Cattoir V, Kobal A, Legrand P. Aerococcus urinae and Aerococcus sanguinicola, two frequently misidentified uropathogens. Scand J Infect Dis 2010; 42: 775-80. 3. Christensen JJ, Vibits H, Ursing J, Korner B. Aerococcuslike organism, a newly recognized potential urinary tract pathogen. J Clin Microbiol 1991; 29: 1049-53. 4. Facklam RM, Lovgren P, Shewmaker L, Tyrrell G. Phenotypic description and antimicrobial susceptibilities of Aerococcus sanguinicola isolates from human clinical samples. J Clin Microbiol 2003; 41: 2587-92. 5. Lawson PA, Falsen E, Truberg-Jensen K, Collins MD. Aerococcus sanguinicola sp. nov., isolated from a human clinical source. Int J Syst Evol Microbiol 2001; 51: 475-9. 6. Senneby E, Petersson AC, Rasmussen M. Clinical and microbiological features of bacteremia with Aerococcus urinae. Clin Microbiol Infect 2011: DOI: 10.1111/j.14690691.2011.03609.x. 7. Sierra-Hoffman M, Watkins K, Jinadatha C, Fader R, Carpenter JL. Clinical significance of Aerococcus urinae: a retrospective review. Diagn Microbiol Infect Dis 2005; 53: 289-92. 8. Williams RE, Hirch A, Cowan ST. Aerococcus, a new bacterial genus. J Gen Microbiol 1953; 8: 475-80.

Sincerely yours Magnus Rasmussen, M.D. Ph.D. Division for Infection Medicine, Lund University; Sweden

Reply to Dr. Rasmussen Dear Editor, We were pleased with the compliments made by Rasmussen in his article entitled “Aerococci: hard to find and classify” with reference to our work, “Aerococcus viridans urinary tract infection in a pediatric patient with secondary pseudohypoaldosteronism”, which was published in Revista Argentina de Microbiología, volume 42, number 4. However, we would like to clarify some aspects. The genus Aerococcus was first described in 1953 by Williams et al. to accommodate some gram-positive, microaerophilic, catalase-negative organisms that were

visibly distinguishable from streptococci (6). At first, Aerococcus viridans was the only species known, but in recent years, four additional members have been described: Aerococcus urinae [1], Aerococcus christensenii [2], Aerococcus sanguinicola [5] and Aerococcus urinaehominis [4]. Even though there are clear similarities between their morphological and biochemical characteristics, there are some reactions in each of these species that allow their own identification without having to resort to gene amplification techniques and PCR identification [5]. Particularly, in differentiating Aerococcus sanguinicola from other

Letters to the Editor

Aerococci species, which, as suggested by Rasmussen may be difficult, it is important to know that these organisms fail to produce acid from lactose (while the majority of A. viridans strains ferment this substrate) and produce arginine dihydrolase [5]. Unfortunately, the commercially available products distributed for the identification of gram-positive cocci do not have this new species in their data banks. Therefore, unlike Aerococcus viridans, the correct identification of these other species would be “unacceptable profile (or identification),” “unidentified”, or “no match” [3]. In the previously reported case of an Aerococcus viridans urinary tract infection in a child, the automatic method was used by applying both GPI-Vitek 2 (bioMérieux SA, France) and PosID-Walkaway (Dade-Behring, Germany). The concordance of results, with the clear identification of A. viridans after using both systems, makes a mismatch most improbable. However, genetic testing based on the uniqueness of these bacteria 16S rRNA gene sequences would be definitely the most accurate technique [3, 5]. As the clinical case described involved a child that was already under antibiotic treatment and clinically improving when the urine culture was known, the PCR identification of the strain was not performed, since it would no longer be cost-effective. In fact, some authors even question whether it is clinically relevant to differentiate between the Aerococcus species or not [3].

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REFERENCES 1. Aguirre M, Collins MD. Phylogenetic analysis of some Aerococcus-like organisms from urinary tract infections: description of Aerococcus urinae sp. nov. J Gen Microbiol 1992; 138: 401-5. 2. Collins MD, Rodriguez JM, Hutson RA, Ohlen M, Falsen E. Aerococcus christensenii sp. nov., from the human vagina. Int J Syst Bacteriol 1999(b); 49: 1125-8. 3. Facklam R, Lovgren M, Shewmaker PL, Tyrrell G. Phenotypic description and antimicrobial susceptibilities of Aerococcus sanguinicola Isolates from human clinical samples. J Clin Microbiol 2003; 41: 2587-92. 4. Lawson PA, Falsen E, Ohlen M, Collins MD. Aerococcus urinaehominis sp. nov., isolated from human urine. Int J Syst Evol Microbiol 2001; 51: 68-6. 5. Lawson PA, Falsen E, Truberg-Jensen K, Collins MD. Aerococcus sanguinicola sp. nov., isolated from a human clinical source. Int J Syst Evol Microbiol 2001; 51: 475-9. 6. Williams RE, Hirch A, Cowan ST. Aerococcus, a new bacterial genus. J Gen Microbiol 1953; 8: 475-80.

Best regards, Ana Luísa Leite, MD1, António Vinhas-da-Silva, MD1, Luísa Felício, MD2, António Vilarinho, MD1, Graça Ferreira, MD1 Department of Pediatrics, Centro Hospitalar de Vila Nova de Gaia/Espinho, EPE, 2Department of Microbiology, Centro Hospitalar de Vila Nova de Gaia/Espinho, EPE; Rua Dr. Francisco Sá Carneiro 4400-129,Vila Nova de Gaia, Portugal E-mail: [email protected] 1

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Volumen 43 - Año 2011

ÍNDICE GENERAL DEL VOLUMEN 43

Número 1 EDITORIAL Microorganismos del suelo y sustentabilidad de los ecosistemas I. García de Salamone MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y DE ALIMENTOS Optimización de metodologías de cribaje para la búsqueda de Streptococcus agalactiae en embarazadas S. E. Montibello, L. I. Guelfand, M. G. Machaín, A. N. Carrión, M. D. Ferreira, J. C. Pidone, M. E. Ceregido, S. C. Kaufman, R. N. Soloaga Desarrollo de una prueba de ELISA para detectar anticuerpos en carneros vacunados o infectados con Corynebacterium pseudotuberculosis J. J. Solanet, R. Malena, S. M. Estein, S. Estevao Belchior, F. A. Paolicchi Etiología bacteriana de la neumonía nosocomial y resistencia a los antimicrobianos en pacientes con y sin tratamiento antimicrobiano previo B. Weyland, B. Perazzi, S. García, C. Rodríguez, C. Vay, A. Famiglietti β-lactamasas AmpC plasmídicas tipo CMY-2 emergentes en Tucumán, Argentina M. A. Jure, C. Presti, N. M. Cudmani, L. M. Grellet, C. López, E. H. Musa, O. C. Aulet, C. Nieto, L. Saavedra, M. C. de Castillo Descripción de un brote de intoxicación alimentaria estafilocócica ocurrido en Las Rosas, Provincia de Santa Fe, Argentina A. A. Brizzio, F. A. Tedeschi, F. E. Zalazar Brote de intoxicación alimentaria asociado al consumo de leche ultrapasteurizada en la República del Paraguay N. Weiler, G. A. Leotta, M. N. Zárate, E. Manfredi, M. E. Álvarez, M. Rivas Tuberculosis pediátrica en un hospital de referencia durante el período 2004-2008 M. G. Rodríguez, C. P. Patallo, V. A. Rizzotti, M. A. Moscoloni, D. S. Ballester Brote de leptospirosis en terneros en recría en la provincia de Corrientes, Argentina M. G. Draghi, B. Brihuega, D. Benítez, J. M. Sala, G. M. Biotti, M. Pereyra, A. Homse, L. Guariniello * Meningitis neonatal por Listeria monocytogenes en San Luis, Argentina: análisis de tres casos A. L. Laciar, M. L. Vaca Ruiz, A. Le Monnier * Efectos clínicos adversos relacionados con ivermectina en pacientes tratados por infecciones con Mansonella ozzardi A. J. Krolewiecki, S. P. Cajal, C. Villalpando, J. F. Gil ARTÍCULOS ESPECIALES Primer consenso argentino para el estudio de la sensibilidad in vitro a los antimicrobianos de las bacterias anaerobias de importancia clínica en humanos M. C. Legaria, H. M. Bianchini, L. Castello, G. Carloni, A. Di Martino, L. Fernández Canigia, M. Litterio, R. Rollet, A. Rossetti, S. C. Predari IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS Alicyclobacillus acidoterrestris J. M. Oteiza Alteraciones ultramicroscópicas en tejido placentario de animales infectados con Leptospira interrogans serovar Pomona B. Brihuega, A. Venzano, J. Diodati, A. Boffi, D. Funes, C. Auteri, G. Romero, L. Samartino Nuevas instrucciones para los autores

1

4

9

18 24

28

33 37 42 45

48

51

67

68 69

Índice General del Volumen

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Número 2

EDITORIAL El fallecimiento del Dr. Mariano J. Levin A. A. Cataldi MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS Bacteriemia por Vibrio cholerae no-O1, no-O139 en un paciente en hemodiálisis crónica M. S. Zárate, M. Giannico, C. Colombrero, J. Smayevsky * Primera comunicación del virus israelí de la parálisis aguda en colmenas asintomáticas de la República Argentina F. J. Reynaldi, G. H. Sguazza, M. A.Tizzano, N. Fuentealba, C. M. Galosi, M. R. Pecoraro

79

81 84

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL La textura del suelo como factor regulador de la adsorción de Escherichia coli en una cuenca de la Pampa Ondulada, Argentina F. B. Kraemer, C. I. Chagas, D. J. Cosentino, M. Paz, J. A. Moretton 87 * Explorando el metagenoma del suelo antártico como fuente de nuevas enzimas adaptadas al frío y elementos génicos móviles. R. Berlemont, D. Pipers, M. Delsaute, F. Angiono, G. Feller, M. Galleni, P. Power 94 *Presencia de Staphylococcus aureus enterotoxigénico en leche de tanque de frío de tambos de Argentina V. E. Neder, V. R. Canavesio, L. F. Calvinho 104 * Respuesta quimiotáctica hacia gasoil de cepas de Halomonas spp. aisladas de ambientes salinos de Argentina S. D’Ippólito, R. E. De Castro, K. Herrera Seitz 107 Calidad microbiológica del agua utilizada en establecimientos lecheros de la zona de Villa María (Córdoba) S. G. Bettera, S. A. Dieser, C. Vissio, G. Geuna, C. Díaz, A. J. Larriestra, L. M. Odierno, C. 111 Frigerio AGENTES ANTIMICROBIANOS Sensibilidad de Acinetobacter a la colistina evaluada mediante los métodos de predifusión y de concentración inhibitoria mínima. Detección de aislamientos heterorresistentes M. E. Herrera, L. N. Mobilia, G. R. Posse 115 Evaluación de tres métodos para la detección de la sensibilidad in vitro de especies de Candida a los antifúngicos I. Maldonado, L. Fernández Canigia, W. Vivot, P. Domecq, G. Davel, S. Córdoba 120 ARTICULOS ESPECIALES Impacto de los recientes avances en el análisis de comunidades microbianas sobre el control del proceso del tratamiento de efluentes L. Erijman, E. L. M. Figuerola, L. D. Guerrero, J. M. Ayarza 127 Criterios de ensayo, interpretación e informe de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos en los bacilos gram negativos no fermentadores de importancia clínica: recomendaciones de la Subcomisión de Antimicrobianos de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínicas, Asociación Argentina de Microbiología M. Radice, M. Marín, M. Giovanakis, C. Vay, M. Almuzara, A. Limansky, J. M. Casellas, A. Famiglietti, 136 M. Quinteros, C. Bantar, M. Galas, J. Kovensky Pupko, F. Nicola, F. Pasterán, R. Soloaga, G. Gutkind Fe de erratas Instrucciones para los autores

154 155

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 314-317

Número 3 EDITORIAL Y finalmente……la Revista Argentina de Microbiología impactó S. C. Predari

165

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS Evaluación de los sistemas comerciales automatizados VITEC 2 y API 20NE para la identificación de organismos del complejo Burkholderia cepacia aislados de muestras clínicas S. Oderiz, M. J. Palau, P. del Palacio, M. C. Lewis, M. P. Bettiol, P. Martina, A. Bosch, O. M. 168 Yantorno, B. M. Gatti *Distribución de especies y perfil de sensibilidad de levaduras aisladas de hemocultivos: resultados de un estudio multicéntrico de vigilancia de laboratorio en Argentina S. Córdoba, W. Vivot, M. E. Bosco-Borgeat, C. Taverna, W. Szusz, O. Murisengo, G. Isla, G. 176 Davel, Red Nacional de Laboratorios de Micología, Argentina Predictibilidad de la propagación espacial y temporal de la epidemia de influenza A H1N1 en la Argentina por el método de percolación E. Cuestas, M. Vilaró, P. Serra 186 Diagnóstico bacteriológico de tuberculosis renal: experiencia del Laboratorio Regional de Tuberculosis de la provincia de Córdoba M. Berta, G. Sturm, L. Juri, M. C. Cosiansi, S. Barzón, A. I. Barnes, S. Rojo 191 Queratopatía cristalina: diagnóstico clínico y microbiológico de una infección corneal infrecuente causada por el grupo Streptococcus mitis 195 G. J. Galperín, G. Boscaro, J. Tau, M. Berra Detección del gen codificante de la metalo-β-lactamasa VIM-2 en un integrón de clase 1 asociado con el gen blaCTX-M-2 en un aislamiento clínico de Pseudomonas aeruginosa en el Uruguay: primera comunicación A. J. Ingold, M. Castro, A. Nabón, G. Borthagaray, C. Márquez 198 AGENTES ANTIMICROBIANOS Prescripción de antibióticos en unidades de cuidados intensivos de Latinoamérica D. J. Curcio, Grupo Latinoamericano de Uso de Antibióticos en las Unidades de Cuidados Intensivos 203 MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL *Caracterización fenotípica y genotípica de Streptococcus uberis aislados de mastitis bovina subclínica en tambos de Argentina M. C. Lasagno, E. B. Reinoso, S. A. Dieser, L. F. Calvinho, F. Buzzola, C. Vissio, C. I. Bogni, L. M. Odierno 212 *Optimización de la producción de biomasa de una cepa mutante de Yarrowia lipolytica con actividad incrementada de lipasa, usando glicerol crudo 218 M. A. Galvagno, L. J. Iannone, J. Bianchi, F. Kronberg, E. Rost, M. R. Carstens, P. Cerrutti *Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) asociado a estromas de Cyttaria hariotii en bosques de Nothofagus en el noroeste de la Patagonia D. Libkind, C. Tognetti, A. Ruffini, J. P. Sampaio, M. Van Broock 226 IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS Asociaciones polimorfas de Malassezia G. E. Giusiano

233

Nuevas instrucciones para los autores

234 238

Guía para la preparación de los manuscritos

Índice General del Volumen

317

Número 4 EDITORIAL Primer simposio de virología veterinaria en 2011: Año veterinario mundial A. M. Jar MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS Importancia del estudio del balance del contenido vaginal (BACOVA) en el control preventivo de las trabajadoras sexuales R. Bologno, Y. M. Díaz, M. C. Giraudo, R. Fernández, V. Menéndez, J. C. Brizuela, A. A. Gallardo, L. A. Álvarez, S. G. Estevao Belchior *Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis de cepas de referencia usadas para el diagnóstico de leptospirosis en Argentina M. E. Paván, B. Brihuega, M. J. Pettinari, F. Cairó Efecto de la temperatura sobre la viabilidad de larvas de Trichinella spiralis V. R. Randazzo, L. F. La Sala, S. R. Costamagna *Detección del virus papiloma humano (HPV) y citología de Papanicolaou en mujeres de bajos recursos de la ciudad de Posadas, Misiones, Argentina I. Badano, R. W. Pedrozo, L. S. Ruíz Díaz, J. A. Galuppo, M. A. Picconi, R. H. Campos, J. D. Liotta Infección diseminada por Penicillium marneffei en un paciente HIV positivo. Primera observación en la República Argentina G. Santiso, V. Chediak, E. Maiolo, M. T. Mujica, J. San Juan, A. Arechavala, R. Negroni *Estudio genómico de cepas argentinas de Herpesvirus equino 1 N. A. Fuentealba, G. H. Sguazza, M. L. Eöry, A. R. Varela, M. R. Pecoraro, C. M. Galosi

243

246 251 256 263 268 273

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL Métodos para la detección de Agrobacterium a partir de muestras de material vegetal, suelo y agua 278 A. M. Alippi, A. C. López, P. A. Balatti *Respuesta de plántulas inoculadas con Enterobacter spp. como un modelo de agricultura alternativa Y. E. Morales-García, D. Juárez-Hernández, C. Aragón-Hernández, M. A. Mascarua-Esparza, M. R. Bustillos-Cristales, L. E. Fuentes-Ramírez, R. D. Martínez-Contreras, J. Muñoz-Rojas 287 ARTÍCULO ESPECIAL Bacillus anthracis: una mirada molecular a un patógeno célebre M. E. Paván, M. J. Pettinari, F. Cairó, E. E. Paván, A. A. Cataldi

294

IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS Micorrizas arbusculares: asociaciones simbióticas e indicadores de calidad ambiental en sistemas de cultivos extensivos C. B. Nardini, L. P. Di Salvo, I. E. García de Salamone 311 CARTAS AL EDITOR *Aerococos: difíciles de hallar y de clasificar M. Rasmussen Respuesta al Dr. Rasmussen A. L. Leite, A. Vinhas-da-Silva, L. Felicio, A. Vilarinho, G. Ferreira

312

Índice general de volumen 43 Índice de temas Índice de autores Agradecimiento a los revisores Nuevas instrucciones para los autores Guía para la preparación de los manuscritos

314 318 322 325 326 331

* En inglés

312

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Volumen 43 - Año 2011 ÍNDICE DE TEMAS

Abejas melíferas 84 Ácidos grasos 218 Aerococos 312 Agrobacterium - agalla de corona 278 - agua 278 - suelo 278 - técnicas de detección 278 Alicyclobacillus acidoterrestris 67 Antimicrobianos - Acinetobacter 115 - Bacilos gram negativos no fermentadores 136 - β-lactamasas 203 - AmpC plasmídica tipo 24 - Metalo-β-lactamasa 198 - Carbapenem 203 - Carbapenemasas 198 - Complejo Burkholderia cepacia 168 - Corynebacterium pseudotuberculosis 9 - Escherichia coli 87 - Pseudomonas 198 - Recomendaciones 136 - Resistencia a los antibióticos 203 - Sensibilidad a antimicrobianos 51, 136 - Streptococcus - agalactiae 4 - grupo S. mitis 195 - uberis 212 - Staphylococcus aureus 28, 33, 104 Agroecosistemas 1 Agua de pozo 111 Ambientes salinos 107 API 2ONE 168 Argiudolis 87 Astaxantina 226 Bacillus anthracis - aspectos moleculares 294 - diversidad genética 294 - factores de virulencia 294 - megaplásmidos 294 BACOVA - control preventivo 246 - trabajadoras sexuales 246 - vaginosis bacterianas 246 Bacterias anaerobias 51

Bacteriemia 81 Biogeografía 226 Biomasa 218 Brote 42 Calidad de aguas 87, 111 Candida 120 Celulasas 94 Cyttaria hariotii 226 Colistina 115 Consenso 51 Contaminación bacteriológica 111 Cribaje 4 CTX-M-2 198 Cuenca de la Pampa Ondulada 87 Dr. Mariano Levin 80 Electroforesis de campos pulsados 212 ELISA indirecto 9 Embarazo 4 Enfermedad alimentaria 33 Enterobacter spp. - maíz 287 - PGPR 287 - Plántulas inoculadas 287 Enterobacteriaceae 24 Enterotoxinas 28,104 Enzimas - adaptadas al frío 94 Epidemia 186 Etiología bacteriana 18 Factor de impacto 165 Factores de virulencia 212 Fibrosis quística 168 Filariosis 48 Filogenia molecular 226 Fungemia 176 Gastroenteritis 33 Gen recA 168 Glicerol 218 Halófilos 107 Halomonas spp. 107 Herpesvirus equino 1 273 - análisis genómico 273 - virulencia 273 Heterorresistencia 115 Hidrocarburos - degradación 107

Indice de Temas

Hospedero inmunocomprometido 81 Infección corneal 195 Influenza A H1N1 186 Integrasas 94 Integrón 198 Ivermectina 48 Latinoamérica 203 Leche - de tanque 104 - ultrapasteurizada 33 Leptospira interrogans 42, 68, 251 - cepas de referencia 251 - multiple-locus variable number tandem repeat analysis 251 Levaduras 120,176 Linfadenitis caseosa 9 Lipasa 218 Listeria monocytogenes 45 Lodos activados 127 Malassezia 233 Mansonella ozzardi 48 Mastitis 104 - subclínica bovina 212 Meningitis neonatal 45 Metagenómica 94, 127 Micorrizas arbusculares - asociaciones simbióticas 311 - cultivos extensivos 311 Microorganismos 1 Natracualfes 87 Neumonía nosocomial 18 Nitrificación 127 Ovinos 9 Paraguay 33 Patagonia 226 PCR 168 - múltiple 28 - RT-PCR 84

319

Penicillium marneffei - HIV 268 Predifusión 115 Propagación 186 Pruebas de sensibilidad 51 Queratopatía cristalina 195 Quimiotaxis 107 RAM 165 Resistencia antimicrobiana 18 Sensibilidad a los antifúngicos 120, 176 Serovar Pomona 42, 68 Suelo 1 - antártico 94 - textura 87 Tambos - Argentina 104, 111, 212 Tejido placentario 68 Terneros 42 Tipo CMY-2 24 Toxiinfección alimentaria 28 Tratamiento de efluentes 127 Trichinella spiralis - larvas 256 - temperatura 256 Tuberculosis - pediátrica 37 - renal 191 Unidades de cuidados intensivos 18, 203 Vibrio cholerae no-01, no-0139 81 VIM-2 198 Virus israelí de la parálisis aguda 84 Virus papiloma humano 263 - tamizaje 263 - cáncer cervical 263 Vitek 2 compact 168 Xanthophyllomyces dendrorhous 226 Yarrowia lipolytica - Mutante 218

320

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Volume 43 - Año 2011 SUBJECT INDEX

Activated sludge 127 Aerococci 312 Agrobacterium - crown gall disease 278 - detection techniques 278 - soil 278 - water 278 Agroecosystems 1 Alicyclobacillus acidoterrestris 67 Anaerobic bacteria 51 Antifungal susceptibility 120, 176 Antimicrobials - Acinetobacter 115 - Antimicrobial resistance 1 - Antimicrobial susceptibility testing 51, 136 - β-lactamases 203 - Metallo-β-lactamase 198 - Plasmid-mediated AmpC 24 - Burkholderia cepacia complex 168 - Carbapenem 203 - Carbapenemase 198 - Corynebacterium pseudotuberculosis 9 - Drug resistance 203 - Escherichia coli 87 - Non-fermenting gram-negative bacilli 136 - Pseudomonas 198 - Recommendations 136 - Staphylococcus aureus 28, 33,104 - Streptococcus - agalactiae 4 - mitis group 195 - uberis 212 API 20NE 168 Arbuscular mycorrhizas - extensive crop-systems 311 - symbiotic associations 311 Argiudoles 87 Astaxanthin 226 Bacillus anthracis - genetic diversity 294 - megaplasmids 294 - molecular aspects 294 - virulence factors 294 Bacteremia 81 Bacterial etiology 18 Bacteriological contamination 111

BAVACO - bacterial vaginosis 246 - preventive control 246 - sex workers 246 Biogeography 226 Biomass 218 Calves 42 Candida 120 Caseous lymphadenitis 9 Cellulases 94 Chemotaxis 107 CMY-2 type 24 Colistin 115 Consensus guidelines 51 Cyttaria hariotii 226 Crystalline keratopathy 195 Corneal infection 195 CTX-M-2 198 Cystic fibrosis 168 Dairy farms - Argentina 104, 111, 212 Dr. Mariano Levin 80 Enterobacter spp. - inoculated plantlets 273 - maize 273 - PGPR 273 Enterobacteriaceae 24 Enterotoxins 28, 104 Enzymes - cold-adapted 94 Epidemic 186 Equid herpesvirus 1 273 - genetic analysis 273 - virulence 273 Fatty acids 218 Filariasis 48 Foodborne disease 33 Food poisoning 28 Fungemia 176 Gastroenteritis 33 Glycerol 218 Halophiles 107 Halomonas spp. 107 Heteroresistance 115 Human papillomavirus (HPV) 263 - screening 263

Indice de Temas

- cervical cancer 263 Hydrocarbon - degradation 107 Honey bees 84 Immunocompromised host 81 Impact factor 165 Indirect ELISA 9 Influenza A H1N1 186 Integrases 94 Integron 198 Intensive care units 18, 203 Israeli acute paralysis virus 84 Ivermectin 48 Latin America 203 Leptospira interrogans 42, 68, 251 - multiple-locus variable- number tandem repeat analysis 251 - reference strains 251 Lipase 218 Listeria monocytogenes 45 Malassezia 233 Mansonella ozzardi 48 Mastitis 104 - bovine subclinical 212 Metagenomics 94, 127 Microorganisms 1 Milk - tank 104 - ultrapasteurized 33 Molecular phylogeny 226 Natraqualfs 87 Neonatal meningitis 45 Nitrification 127 Non-01, non-0139 Vibrio cholerae 81 Nosocomial pneumonia 18 Nothofagus forests 226 Outbreak 42

321

Paraguay 33 Patagonia 226 PCR 168 - multiplex 28 - RT-PCR 84 Penicillium marneffei - Aids-related infections 268 Placental tissue 68 Pomona serovar 42, 68 Prediffusion 115 Pregnancy 4 Pulsed-field gel electrophoresis 212 RAM 165 recA gene 168 Rolling Pampa basin 87 Saline environments 107 Screening 4 Sheep 9 Soil 1 - Antarctic 94 - texture 87 Trichinella spiralis - larvae 256 - temperature 256 Tuberculosis - pediatric 37 - renal 191 VIM-2 198 Virulence factors 212 VITEK2 compact 168 Wastewater treatment 127 Water - quality 87, 111 - well 111 Xanthophyllomyces dendrorhous 226 Yarrowia lipolytica mutant 218 Yeasts 120, 176

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 322-324

Volumen 43 - Año 2011 ÍNDICE DE AUTORES

Alippi AM Almuzara M Álvarez LA Álvarez ME Angiono F Aragón-Hernández C Arechavala A Aulet OC Auteri C Ayarza JM Badano I Balatti PA Ballester DS Bantar C Barnes AI Barzón S Benítez D Berlemont R Berra M Berta M Bettera SG Bettiol MP Bianchi J Bianchini HM Biotti GM Boffi A Bogni CI Bologno R Borthagaray G Boscaro G Bosch A Bosco-Borgeat ME Brihuega B 42, 68, Brizuela JC Brizzio AA Bustillo-Cristales MR Buzzola F Cairó F 251, Cajal SP Calvinho LF 104, Campos RH Canavesio VR Carloni G Carrión AN Carstens MR Casellas JM Castello L Castillo MC Castro M Cataldi AA 79,

278 136 246 33 94 287 268 24 68 127 263 278 37 136 191 191 42 94 195 191 111 168 218 51 42 68 212 246 198 195 168 176 251 246 28 287 212 294 48 212 263 104 51 4 218 136 51 24 198 294

Ceregido ME 4 Cerrutti P 218 Chagas CI 87 Chediak V 268 Colombrero C 81 Córdoba S 120, 176 Cosentino DJ 87 Cosiansi MC 191 Costamagna SR 256 Cudmani NM 24 Cuestas E 186 Curcio DJ 203 Davel G 120, 176 De Castro RE 107 Del Palacio P 168 Delsaute M 94 Di Martino A 51 Di Salvo LP 311 Díaz C 111 Díaz YM 246 Dieser SA 111, 212 Diodati J 68 D’Ippólito S 107 Domecq P 120 Draghi MG 42 Eöry ML 273 Erijman L 127 Estein SM 9 Estevao Belchior SG 9, 246 Famiglietti A 18, 136 Felicio L 312 Feller G 94 Fernández Canigia L 51, 120 Fernández R 246 Ferreira G 312 Ferreira MD 4 Figuerola ELM 127 Frigerio C 111 Fuentealba NA 84, 273 Fuentes-Ramírez LE 287 Funes D 68 Galas M 136 Gallardo AA 246 Galleni M 94 Galosi CM 84, 273 Galperín GJ 195 Galuppo JA 263 Galvagno MA 218 García de Salamone IE 1, 311 García S 18

Indice de Autores

Gatti BM Geuna G Giannico M Gil JF Giovanakis M Giraudo MC Giusiano GE Grellet LM Guariniello L Guelfand LI Guerrero LD Gutkind G Herrera ME Herrera Seitz K Homse A Iannone LJ Ingold AJ Isla G Jar A Juárez-Hernández D Jure MA Juri L Kaufman SC Kobensky Pupko J Kraemer FB Krolewiecki AJ Kronberg F La Sala LF Laciar AL Larriestra AJ Lasagno MC Le Monnier A Legaria MC Leite AL Leotta GA Lewis MC Libkind D Limansky A Liotta DJ Litterio M López AC López C Machain MG Maiolo E Maldonado I Malena R Manfredi E Marín M Márquez C Martina P Martínez-Contreras RD Mascarua-Esparza MA Menéndez V

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168 111 81 48 136 246 233 24 42 4 127 136 115 107 42 218 198 176 243 287 24 191 4 136 87 48 218 256 45 111 212 45 51 312 33 168 226 136 263 51 278 24 4 268 120 9 33 136 198 168 287 287 246

Mobilia LN 115 Montibello SE 4 Morales-García YE 287 Moretton JA 87 Moscoloni MA 37 Mujica MT 268 Muñoz-Rojas J 287 Murisengo O 176 Musa EH 24 Nabón A 198 Nardini CB 311 Neder VE 104 Negroni R 268 Nicola F 136 Nieto C 24 Oderiz S 168 Odierno LM 111, 212 Oteiza JM 67 Palau MJ 168 Paolicchi FA 9 Pasterán F 136 Patallo CP 37 Paván EE 294 Paván ME 251, 294 Paz M 87 Pecoraro MR 84, 273 Pedrozo RW 263 Perazzi B 18 Pereyra M 42 Pettinari MJ 251, 294 Picconi MA 263 Pidone JC 4 Pipers D 94 Posse GR 115 Power P 94 Predari SC 51, 165 Presti C 24 Quinteros M 136 Radice MA 136 Randazzo VR 256 Rasmussen M 312 Red Nacional de Micología 176 Reinoso EB 212 Reynaldi FJ 84 Rivas M 33 Rizzotti VA 37 Rodríguez C 18 Rodríguez MG 37 Rojo SC 191 Rollet R 51 Romero G 68 Rossetti A 51 Rost E 218

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Ruffini A Ruiz Díaz LS Saavedra L Sala JM Samartino L Sampaio JP San Juan J Santiso G Serra P Sguazza GH Smayevsky J Solanet JJ Soloaga RN Sturm G Szusz W Tau J Taverna C Tedeschi FA

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226 263 24 42 68 226 268 268 186 84, 273 81 9 4, 136 191 176 195 176 28

Tizzano MA Tognetti C Vaca Ruiz ML Van Broock M Varela AR Vay C Venzano A Vilarinho A Vilaró M Villalpando C Vinhas-da-Silva A Vissio C Vivot W Weiler N Weyland B Yantorno OM Zalazar FE Zárate MN Zárate MS

84 226 45 226 273 18, 136 68 312 186 48 312 111, 212 120, 176 33 18 168 28 33 81

Agradecimientos

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AGRADECIMIENTO A REVISORES El Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología agradece a los señores revisores el tiempo, esfuerzo y experiencia dedicados a mejorar la calidad de la revista.

Almeida da Silva P Almuzara M Amoroso A Aranaz A Arduino S Argaraña C Ávila M Baldini M Barrera VA Bentancor A Betriú C Binsztein N Bocco J Bratanich A Brizzio A Campero C Capozzo A Castañeda E Centrón D Chiocchio V Citate J Creus C de la Peña Moctezuma A Di Bartolomeo S Dionisi H Dolcini G Duffy S Eraso E Espinel Ingroff A Famiglietti A Farías ME Farinati A Fermepín EZ Fernández Canigia L Galas M Gimeno EJ

Giri A Golijow CD González Cappa S González Fraga S Gottschalk M Grasso D Guiamet P Imaz S Juste R Lasala MB Libkind D Limansky A Lossa G Mac Cormack W Maiolo E Manfredi E Mangano A Martínez Nazaret RM Massa R Mollerach M Morcillo N Moredo F Moreno A de. Moreno Espinosa S Negroni R Nicola F Noceda RP Pardo A Parma A Parreño V Pasterán F Pedraza RO Pérez P Pérez S Petroni A Pettinari MJ

Piñeyro P Power P Queiroz Telles F Quinteros M Radice M Refojo N Relloso S Ribon W Ritacco V Rivera MC Robledo GL Rodríguez Fermepín M Romano M Santiso G Schelotto F Sechi LA Signorini M Soloaga R Sordelli D Taboga O Teixeira KRS Tiraboschi IN Tolmasky M Travería G Uez O Vaamonde G Valverde C Vanasco V Vay C Venturini C Videla C Vigo G Zorreguieta A Zumárraga M Zurita J

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NUEVAS INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES (VIGENTES A PARTIR DE 2011) La Revista Argentina de Microbiología (RAM) es una publicación trimestral editada por la Asociación Argentina de Microbiología y destinada a la difusión de trabajos científicos en las distintas áreas de la Microbiología. La Asociación Argentina de Microbiología se reserva los derechos de propiedad y reproducción del material aceptado y publicado. REQUISITOS GENERALES Los manuscritos enviados a esta revista deben constituir informes de investigación original. El envío de un manuscrito implica que los autores tienen las autorizaciones institucionales para proceder a la publicación de los datos y que el mismo manuscrito (u otro de contenido similar) no ha sido previamente publicado (salvo presentaciones parciales en reuniones científicas) ni se encuentra en consideración por otra revista. Los datos originales deberán ser presentados al Comité Editor en caso de ser necesario. Se debe explicitar que los resultados que se muestran provienen de proyectos aprobados por los Comités de Bioseguridad y/o Bioética de las instituciones participantes, así como que respetan la Ley de Habeas Data en caso de incluir datos de pacientes. PRESENTACIÓN DE LOS ORIGINALES Y DERECHOS DE AUTOR Los manuscritos deben dirigirse al Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología acompañados de una nota de acuerdo con el siguiente modelo: “Sres. Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología: en mi carácter de autor responsable declaro que el resto de los autores han acordado que los represente frente a la RAM con respecto al envío del manuscrito …[Título]… y son responsables junto a mí de su contenido. Este trabajo (u otro de contenido similar) no ha sido publicado previamente ni está siendo considerado en otra revista para su publicación. Asimismo, manifiesto mi conformidad de otorgar los derechos de copia (copyright) a la Revista Argentina de Microbiología, una vez concretada la publicación”. Todos los autores de un manuscrito deberán acceder explícitamente a su publicación, serán responsables de la veracidad de los contenidos y deberán explicitar su conformidad para que uno de ellos, que es quien suscribirá la nota arriba citada, actúe como autor para la correspondencia a los fines del manejo editorial. Asimismo, los autores manifestarán su conformidad con la posición de cada uno en la lista de autores, en la que se indicará su filiación académica. Un cambio de autor o de orden de autores sólo será considerado si se solicita mediante una nota firmada por todos los autores a tal efecto. En una carta adjunta, los autores deberán especificar la existencia de conflictos de interés que puedan afectar la evaluación del manuscrito. Estos serán confidenciales y mantenidos en reserva por el Comité Editor. Deben especificarse en la sección agradecimientos las fuentes de financiación para la tarea experimental descrita en el manuscrito, ya sean éstas institucionales, oficiales o privadas. También se deberán especificar en esta sección las afiliaciones comerciales o los vínculos tales como consultorías, así como la copropiedad de licencias con fines comerciales por parte de uno o más autores. El material será analizado por el Comité Editor y sometido a la consideración de dos árbitros científicos designados para cada caso. El Comité Editor se reserva el derecho de rechazar aquellos manuscritos cuyos contenidos se superponen total o parcialmente con trabajos ya publicados, o cuyas temáticas no se correspondan con las de la RAM. Asimismo, son motivos de rechazo la falta de cumplimiento de las reglas editoriales, violaciones éticas, baja calidad científica y un uso pobre del idioma, sea éste inglés o español. El Comité Editor se reserva el derecho de efectuar las modificaciones gramaticales o de estilo que considere necesarias. ORGANIZACIÓN Y FORMATO La RAM acepta artículos originales, informes breves, artículos especiales, imágenes microbiológicas, editoriales y también edita suplementos. Se solicita leer cuidadosamente las especificaciones de cada formato a los efectos de elegir el más apropiado y de esta manera agilizar el proceso de evaluación. Los manuscritos podrán redactarse indistintamente en español o en inglés, aunque el Comité Editor estimula a los autores a escribir los trabajos en inglés para favorecer su difusión y lectura a nivel internacional. Artículos originales. Son trabajos de investigación completos y deben redactarse respetando las siguientes secciones: Título (en español y en inglés) y Título abreviado, Resumen y Palabras clave (en español y en inglés), Introducción, Materiales y métodos, Resultados, Discusión, Agradecimientos y Bibliografía. El manuscrito no deberá exceder las 8000 palabras incluyendo a todas las secciones, con hasta 6 tablas o figuras. Informes breves. Son trabajos de menor extensión, entre los que se incluyen casuísticas, casos clínicos y descripciones de técnicas o dispositivos nuevos, avalados por trabajos experimentales concluyentes. Se debe omitir la división del texto en secciones y todo el manuscrito no podrá exceder las 3000 palabras, con un máximo de quince citas bibliográficas y de tres tablas o figuras. Es necesario un análisis cuidadoso de la presentación de los datos para evitar su reiteración en el texto, en las tablas y en las figuras, a fin de mantener la característica de brevedad de este tipo de artículos.

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Artículos especiales. Son actualizaciones o consensos de grupos de trabajo acerca de temas de gran interés en el ámbito regional o internacional. Sus autores deben ser especialistas en la materia y el texto debe incluir una revisión bibliográfica amplia y actualizada. Los artículos especiales admiten hasta 10 000 palabras, 8 tablas o figuras y no más de 100 citas bibliográficas. Imágenes microbiológicas. Pueden corresponder a fotos de bacterias, hongos, parásitos o virus, tomadas de exámenes en fresco o con coloraciones, y observadas bajo microscopía óptica, electrónica o de fluorescencia. También se admiten otras imágenes fotográficas, por ejemplo, microorganismos en medios de cultivo, lesiones ilustrativas en pacientes o en animales de experimentación, imágenes radiográficas y ecográficas, de tomografías computarizadas, de resonancia magnética nuclear, etc. Estas imágenes, de gran valor didáctico y no necesariamente excepcionales, deben estar acompañadas de un texto explicativo y de flechas indicadoras, cuando corresponda. El conjunto no debe exceder una página impresa. Los requisitos de calidad para el envío de las imágenes se describen bajo el ítem “Figuras”. Cartas al Editor. Pueden corresponder a comentarios o nuevos datos. Los primeros consisten en observaciones sobre los artículos publicados en la revista; los segundos están destinados a comunicar hallazgos concisos que no son apropiados para su publicación como trabajo completo o informe breve. Ambas clases de contribuciones no deben exceder las 500 palabras, deben tener título en español e inglés, no deben llevar resumen y pueden contener no más de una figura o tabla. Los autores y sus filiaciones aparecerán al pie de la carta. Se debe proporcionar solo la filiación primaria de cada autor. Los comentarios deben hacer mención del volumen y el número en que se publicó el artículo comentado, de su título completo y del apellido del primer autor. Asimismo, deben contener referencias bibliográficas que apoyen el argumento de quien envía la carta. Para considerar la publicación de un comentario, se solicitará primero una respuesta al autor de correspondencia del artículo publicado; la aprobación final y publicación de ambas quedará a criterio del editor. En el caso de una contribución presentada como nuevos datos, ésta se asignará a un editor experto en la materia, quien junto con revisores externos se encargará de su evaluación. Se debe tener en cuenta que algunos de los servicios de indexación no incluyen las Cartas al Editor en sus bases de datos. Editoriales. Abordan tópicos científicos de gran actualidad y particular relevancia para la comunidad científica especializada en la Microbiología, o trabajos de opinión sobre política científica. La oportunidad y autoría de los editoriales, así como sus lineamientos generales, quedan exclusivamente a criterio del Comité Editor. Suplementos. Corresponden a revisiones extensas de un tema específico realizadas por una o varias sociedades científicas o universidades, o a los resúmenes de las contribuciones efectuadas en el marco de eventos científicos organizados por la Asociación Argentina de Microbiología o alguna de sus Divisiones o Filiales (comunicaciones orales, paneles, conferencias, mesas redondas, etc.). Los suplementos estarán a cargo de editores invitados; sus propuestas temáticas y lineamientos generales deberán ser aceptados por el Comité Editor. La revisión de los manuscritos correspondientes a los suplementos estará a cargo de revisores elegidos por el Comité Editor (revisiones extensas) y de los editores invitados (resúmenes de eventos). El suplemento deberá ser financiado en su totalidad por la entidad que ha organizado la reunión científica, la que tendrá en cuenta que el suplemento deberá ser accesible a todos los participantes del evento o a todos los socios de la Asociación Argentina de Microbiología (por suscripción y on line). Con respecto a la edición, el suplemento deberá respetar exactamente el formato y el estilo de la Revista Argentina de Microbiología en todos sus aspectos (tapa, tipo de papel, impresión, tablas, figuras, fotos, etc.), tal como se describe en este instructivo. Los suplementos correspondientes a los resúmenes de los eventos deben incluir en este orden: nómina de los miembros del Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología, datos de presentación del evento (título completo, lugar y fecha), índice en español y en inglés, agradecimientos, nómina de las autoridades del evento y mensaje/s del/de los presidente/s. A continuación se presentarán los resúmenes numerados desde el uno con números arábigos. Al final del suplemento debe incluirse el índice alfabético de autores y las “Instrucciones para los autores” de la Revista Argentina de Microbiología, en español y en inglés. El programa esquemático del evento sólo se podrá incluir en forma de tríptico, suelto en el interior del suplemento. ELABORACIÓN DE LOS MANUSCRITOS Los manuscritos se deben escribir en hoja A4 con márgenes de 3 cm de lado. Se deberá utilizar formato de fuente Times New Roman, estilo regular, tamaño 12 puntos, a doble espacio. Las letras en negrita o itálica se usarán sólo cuando corresponda. A partir del resumen, se deberán numerar consecutivamente las páginas (en el ángulo inferior derecho) y las líneas del manuscrito. Esto se aplicará tanto para el texto como para las tablas, figuras y leyendas, y también para la bibliografía. Las páginas correspondientes a las tablas, figuras y leyendas se incluirán después de la sección de bibliografía. Carátula. En la primera página se debe indicar el título del trabajo (sólo la primera letra en mayúscula, el resto en minúscula); los autores (primer nombre completo, iniciales de los nombres restantes y apellidos completos de todos los autores); lugar de trabajo (nombre de la institución y dirección postal) y título abreviado del trabajo, de hasta 50 caracteres, para cabeza de página. Si el trabajo incluye autores con distintos lugares de trabajo, se colocarán superíndices numéricos (no encerrados entre paréntesis) junto a los nombres, de manera de identificar a cada autor con su respectivo lugar de trabajo. El autor responsable de la correspondencia se indicará con un asterisco en posición de superíndice ubicado junto al nombre; se detallará su dirección de correo electrónico. En aquellos casos en que uno o varios de los autores hayan cambiado de filiación, se debe consignar la filiación donde se realizó el trabajo y al pie de página, su lugar de trabajo actual. Resúmenes. Se incluirán sólo en los artículos originales, informes breves y artículos especiales y podrán tener una extensión máxima de 250 palabras para los artículos originales y de 150 palabras para los informes breves. El primero de ellos estará redactado en el idioma empleado en el trabajo; el segundo, en el otro idioma y estará encabezado por el título completo del trabajo. Cada uno de ellos estará seguido de una lista de tres a seis palabras clave en el idioma correspondiente. Se debe evitar en los resúmenes el uso de abreviaturas y de citas bibliográficas. Dado que el resumen puede ser publicado separadamente por servicios bibliográficos, se deberá asegurar que resulte comprensible aun en ausencia del texto completo.

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Introducción. Debe suministrar suficiente y adecuada información sobre el tema en cuestión, como para permitir su comprensión al lector no especializado. Asimismo debe incluir la hipótesis o la base científica que guió el diseño experimental y los objetivos del trabajo definidos con claridad. Las referencias citadas en esta sección deberán ser elegidas muy cuidadosamente y ser las más importantes del tema. Materiales y Métodos. Debe contener una adecuada descripción de los métodos, aparatos, reactivos y procedimientos utilizados, con el detalle suficiente como para permitir la reproducción de los experimentos. Los procedimientos o técnicas comunes y de utilización de rutina pueden citarse por medio de una referencia (ej., determinación de la CIM según el CLSI, 2010). Los métodos nuevos o desarrollados especialmente para el trabajo deben ser descritos con detalle, como así también la fuente de drogas poco comunes o materiales biológicos (cepas bacterianas, virales, fúngicas, plásmidos, etc.). La marca y la procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equipos deben consignarse en el texto la primera vez que se los cita identificando marca, ciudad/estado (si correspondiera) y país de origen. Resultados. Debe incluir el diseño experimental y su base científica, así como los resultados obtenidos presentados en forma concisa como texto (preferentemente) o como tabla(s) o figura(s). Evite el uso innecesario de tablas y figuras para mencionar datos que podrían ser presentados en el texto. No duplique la misma información incluyéndola en el texto y en las tablas o figuras. Limite el número de fotografías a las mínimas necesarias para mostrar los resultados experimentales. Numere las tablas y figuras en el orden en el que se citan en el texto. Se deben evitar las repeticiones y destacar sólo los datos importantes. Se debe dejar para la sección Discusión la interpretación más extensa. Discusión. Debe hacer énfasis sobre los aspectos más importantes y novedosos del estudio, e interpretar los datos experimentales obtenidos en relación con los ya publicados. Indique las conclusiones a las que se arribó y evite la reiteración de datos y conceptos ya vertidos en secciones anteriores. Se admite la presentación de Resultados y Discusión como una sección conjunta. Agradecimientos. Esta sección se debe presentar en un solo párrafo, en un tamaño de letra menor al usado en el texto del manuscrito (Times New Roman, tamaño 11 puntos). Se mencionarán en esta sección las fuentes de financiación y los individuos o instituciones que hayan contribuido con reactivos, materiales biológicos o discusión de resultados. Bibliografía. En todos los manuscritos es conveniente que el 70% de las citas bibliográficas corresponda a los últimos 10 años y el 30% restante se distribuya entre los trabajos clave publicados durante los años anteriores. Las citas bibliográficas se deben escribir en hoja aparte y presentarse en orden alfabético de autores, numeradas correlativamente empleando números arábigos. En el texto, las citas deben aparecer con números entre paréntesis, en correspondencia con el número con que aparecen en la bibliografía. Las referencias a comentarios personales y a trabajos inéditos deberán mencionarse en el texto como comunicación personal, escrito entre paréntesis. Para las referencias, se deberán citar la totalidad de los autores y seguir los siguientes modelos: a. Publicaciones periódicas Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202. Los títulos de las revistas serán abreviados según el Index Medicus (el listado puede obtenerse en http://www.ncbi.nlm. nih.gov/sites/entrez?db=journals). b. Capítulos de libros/módulos Martins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42. c. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos Aguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoarculus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Resumen J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. d. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos reproducidas dentro de un suplemento publicado por una revista de publicación periódica. Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacientes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Resumen 10416. Rev Argent Microbiol 2005; 37 Supl 1: 95. e. Institucionales Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, EE.UU. f. Tesis Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría en Microbiología Molecular 2009. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín. g. Referencias on line 1. Para libros on line Sullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. [Online] http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Consultado el 7 de setiembre de 2001. 2. Para versiones on line de revistas disponibles en forma impresa. van der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123–234. [Online] 3. Para revistas únicamente disponibles on line Zellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. [Online] http://www.avj.html. 4. Para trabajos publicados on line como manuscritos de publicación adelantada

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Zheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/ dihydroxyacetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 10. 1074/jbc. M104749200. h. Los ítems, referencias a trabajos o a resúmenes de congresos no publicados, en proceso de publicación o bajo revisión; comunicaciones personales; patentes en aplicación o en trámite; bases de datos y páginas web deben ser citadas en el texto entre paréntesis como se muestra: … resultados similares (Gómez H, resultados no publicados) … nuevo protocolo de detección empleado (González JL, enviado para su publicación). … concentraciones de droga (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother; abstr. 114, 1994). … nueva especie de bacteria celulolítica (Márquez W, comunicación personal) … comentados previamente por diversas fuentes (http://fcen.uba.edu.ar) Tablas. Se presentarán en hoja aparte, numeradas consecutivamente con números arábigos, encabezadas con un breve título explicativo (que en lo posible no reitere los títulos de las filas y las columnas), con las leyendas y/o aclaraciones que correspondan al pie. Las llamadas para las aclaraciones al pie se harán empleando números arábigos entre paréntesis y superíndice. Sólo los bordes externos de la primera y la última fila y la separación entre los títulos de las columnas y los datos se marcarán con línea continua. No se marcarán las filas ni los bordes de las columnas. Figuras. Se presentarán en hoja aparte, con el número de figura en el margen superior izquierdo y en el orden que aparecen en el texto. Los dibujos deberán estar en condiciones que aseguren una adecuada reproducción. Los números, letras y signos tendrán dimensiones adecuadas para ser legibles cuando se hagan las reducciones necesarias. Las referencias de los símbolos utilizados en las figuras deberán incluirse dentro de la misma figura y no en el texto de la leyenda. Las fotografías podrán ser realizadas en color o en blanco y negro, en el formato JPEG o TIFF. Las resoluciones mínimas requeridas son 300 dpi para las imágenes y fotografías en color y escala de grises, 600 dpi para las imágenes de arte de combinación (letras e imágenes) y 1200 dpi para las imágenes de arte de línea (gráficos y dibujos). Nota: es muy importante que se use una adecuada resolución de archivo. Todas las imágenes individuales que se importan en un archivo gráfico deben estar en la resolución correcta antes de su carga. Tenga en cuenta, sin embargo, que cuanto mayor sea la resolución más grande será el archivo y más tiempo demandará su envío por medios electrónicos. Las leyendas de las figuras se presentarán reunidas en una hoja aparte, ordenadas consecutivamente con números arábigos. Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Las secuencias nuevas comunicadas a través de la publicación en esta revista deberán ser depositadas en una base de datos y sus números de acceso incluidos en el manuscrito, no más tarde de la etapa de revisión. Los números de acceso deberán ser incorporados en un párrafo separado al final de la sección “Materiales y métodos” en el caso de trabajos originales, o luego del texto en el caso de informes breves. La información sobre bases de datos actualmente disponibles es la siguiente: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan National Institute of Genetics; e-mail: [email protected]. ac.jp; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail: [email protected]; URL, http://www.ebi.ac.uk GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail: [email protected]; URL, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov En lo que respecta a la presentación de nuevas secuencias de ácidos nucleicos, aquellas de hasta 50 nucleótidos pueden ser presentadas en cualquier estilo. Las secuencias de longitud importante deben ser presentadas como Figuras para reducir espacio, indicando 80 a 120 nucleótidos por línea, en un tipo de letra que lo haga fácilmente legible en las condiciones de publicación (16 cm, ancho de dos columnas de la RAM). De ser posible, se dividirán las líneas de la secuencia en bloques de 10 o 20 nucleótidos separados por un espacio o por números indicativos encima de la secuencia. Las líneas deberán estar numeradas, indicando el número correspondiente a la izquierda de la primera base de cada línea. Las anotaciones necesarias se marcarán en negrita, subrayadas o entre paréntesis. Si se requiriere presentar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica, se indicará mediante el uso de símbolos de una letra aceptados como indicativos de aminoácidos, los que se localizarán debajo del primer nucleótido del codón codificante. Siglas. Las siglas y demás abreviaciones (cuando esto corresponda) deberán ser explicitadas después de su primera mención en el texto. Las unidades de medida se expresarán siguiendo las normas del Système International d´Unités. ENVÍO DE LOS MANUSCRITOS Los manuscritos podrán ser enviados por correo electrónico ([email protected]) o por correo postal (Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina), incluyendo una versión electrónica en CD-ROM, el que deberá estar identificado con una etiqueta o rótulo que indique el nombre del trabajo y los programas (y versiones) usados para confeccionar el texto, las figuras y las fotografías, así como el nombre de los archivos que contiene. Se recomienda incluir todo el texto del artículo en un solo archivo; en caso de haber imágenes, éstas deben enviarse en archivos separados. Se recomienda además tipear las mayúsculas, los espacios entre palabras, las itálicas y las negritas tal como se desea se muestren luego en el impreso; no dejar espacios antes y después de los subtítulos; justificar el texto y usar la tecla de tabulación y no la barra espaciadora para encolumnar las tablas. Se recomienda a los autores revisar la lista de chequeo que figura a continuación de estas instrucciones y verificar que se ha cumplido con todos los requisitos allí señalados. Antes de enviar un manuscrito, es también recomendable consultar algún ejemplar reciente de la RAM para verificar si se han seguido las pautas requeridas de formato y estilo y, eventualmente, efectuar las modificaciones necesarias.

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Se aconseja a los autores eliminar de las propiedades de los archivos que envíen todo tipo de información que identifique su autoría. PROCESO EDITORIAL Una vez que el manuscrito ha cumplido el proceso editorial y se encuentra listo para su publicación, se enviará por correo electrónico al autor responsable el archivo en formato pdf de la prueba de galera, para que realice las correcciones tipográficas que correspondieran. No podrá cambiar conceptos ni modificar párrafos que alteren el formato de la impresión. Se deberá imprimir el documento, realizar las correcciones sobre el texto y devolverlo por fax o como archivo escaneado por correo electrónico. Las correcciones también pueden ser enviadas por correo electrónico, especificando claramente la página, el párrafo y la línea que se desea corregir. La corrección deberá ser devuelta en un plazo no superior a los siete días corridos de remitida la prueba de galera, caso contrario se considerará como declinada su publicación. En ese momento se le enviará al autor el monto que deberá abonar para que el artículo pueda ser publicado. La Revista Argentina de Microbiología apoya las políticas para el registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de estas iniciativas para el registro y la divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se aceptarán para publicación los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por la OMS y el ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá registrar al final del resumen. Costo de la página. Por cada página publicada se cobrarán $ 75 o $ 200 si ésta incluye fotografías en color (Argentina, socios de la AAM), $ 200 o $ 600 (Argentina, no socios de la AAM) y USD 70 o USD 180 (otros países). Separatas. Se suministrarán 25 separatas sin cargo.

Secretaria: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 y (54-11) 4932-8948; e-mail: [email protected]; http://www.aam.org.ar

SUSCRIPCIÓN ANUAL (4 números) Socios AAM $ 120 Argentina no socios $ 240 América Latina USD 100 Otros países USD 200

Formas de pago Si es socio y abona sus cuotas por débito, puede suscribirse abonando con débito con solo solicitarlo por mail a [email protected] con copia a [email protected] Por depósito en Banco Galicia, (cualquier sucursal),cta. cte. Nº 10980/6 007/1, CBU 0070007820000010980619, enviándonos la fotocopia de la boleta de depósito por fax, aclarando nombre, domicilio y concepto del pago, a los TE/FAX: 011 4 932-8858 y 8948 -CUIT: 30-60746436-3 o escaneada por mail a [email protected] Banco Nación, (cualquier sucursal), cta. cte. Nº 000969700035/74 suc. Bulnes, CBU: 0110697420069700035747, CUIT: 30-60746436-3 enviándonos la fotocopia, idem instrucciones para Bco. Galicia.

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Guía para la preparación de los manuscritos La siguiente lista está destinada a servir de guía para la preparación y revisión de su manuscrito de acuerdo con el estilo y formato de la revista. Para más detalles consultar las Instrucciones a los Autores (http://www.aam.org.ar). Los manuscritos que no cumplan con el formato especificado serán devueltos a los autores, retrasándose el proceso de evaluación y publicación.

Título

Sí No No corresponde

Incluye título en español Incluye título en inglés Incluye título abreviado

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Resúmenes No supera el máximo de palabras permitidas Incluye resumen en español Incluye palabras clave en español Incluye resumen en inglés Incluye palabras clave en inglés

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Texto No supera el máximo de palabras permitidas No supera el máximo de tablas y/o figuras permitidas Contiene las secciones correspondientes Hace uso correcto de las abreviaciones Cita la marca y procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equipos Cita el número de acceso de las nuevas secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos

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Tablas y Figuras Incluye cada una en hoja aparte Los títulos son claros y concisos Incluye las leyendas Las citas en el texto se corresponden con el número de cada tabla y figura Explica las abreviaciones no convencionales al pie de las tablas Envía las figuras y fotografías en archivos adjuntos

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Autores Identifica al autor responsable Incluye dirección, teléfono y correo electrónico del autor responsable Incluye a todos los autores Incluye el lugar de trabajo de cada autor Incluye nota de presentación del manuscrito por el autor responsable

Bibliografía Respeta estrictamente el formato requerido por la revista Ordena las citas bibliográficas en forma alfabética Incluye las referencias en el texto en correspondencia con el número con el que aparecen en esta sección Agradecimientos Cita las fuentes de financiamiento

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NEW INSTRUCTIONS TO AUTHORS (VALID AS OF 2011) Revista Argentina de Microbiología (RAM) is published by the Asociación Argentina de Microbiología on a quarterly basis. The aim of this journal is to publish current scientific works in the different areas of Microbiology. The Asociación Argentina de Microbiología reserves the right to use, reproduce and publish the accepted material. GENERAL REQUIREMENTS Manuscripts submitted for publication in RAM should be original research articles. Submitting a manuscript for publication implies that the authors have been authorized by the corresponding institutions to publish relevant data and that neither the manuscript nor one with substantially similar content has been previously published, except in the case of partial presentations at scientific meetings, or is being considered for publication by another journal. If necessary, original data should be submitted to the Editorial Board. It should also be made clear that results come from projects approved by the Biosafety and Bioethics Committees of the participating institutions, and that when those results include patient information they conform to the Habeas Data Act. SUBMISSION OF ORIGINALS AND COPYRIGHT Manuscripts should be addressed to the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología accompanied by a cover letter according to the following model: “Dear Editors of Revista Argentina de Microbiología, ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������� As corresponding author (to whom correspondence should be addressed), hereby declare that the coauthors have accepted to be represented by myself before RAM with regard to the submission of the manuscript “…Title…”, and they are jointly responsible with me for the contents of this work. Neither this manuscript (nor any other with similar contents) has been previously published or is being considered for publication by another journal. I also agree to transfer copyright to Revista Argentina de Microbiología once published.” All the authors of a manuscript should explicitly authorize its publication and will be responsible for the truthfulness of its contents. They should also express their agreement regarding the choice of one of them to become the corresponding author for editorial purposes. Furthermore, they should express their agreement with respect to their position in the list of authors, indicating their academic affiliation. A change of the corresponding author or in the order of the list of authors shall only be considered by a note signed by all the authors to that effect. The authors shall also disclose any existing conflict of interests that might affect the manuscript assessment on an attached letter. The Editorial Board shall treat all received manuscripts in strict confidence. Funding sources for research work described in the manuscript, either from public or private institutions, commercial affiliations or consultancies, as well as co-ownership of patents for business purposes by one or more authors shall be indicated under the Acknowledgements Section. Contributions will be assessed by the Editorial Board and submitted to the consideration of two scientific referees appointed for each case. The Editorial Board reserves the right to reject those manuscripts whose contents partially or totally overlap with works already published or whose topics are irrelevant to those of RAM. Furthermore, reasons for rejection are non-compliance of editorial requirements, ethical violations, low scientific quality and poor use of language, either English or Spanish. The Editorial Board reserves the right to make all necessary grammatical and style modifications. ORGANIZATION AND FORMAT RAM accepts original articles, brief reports, special articles, microbiological images, editorials and supplements. Careful reading of the specifications for each special format is recommended in order to choose the most adequate one and therefore, to expedite the evaluation proceedings. Manuscripts shall be written in Spanish or English. The Editorial Board encourages authors to use English as their language of choice so that their work reaches wider international scope and readership. Original articles. They are full research papers which must be submitted in accordance to the following sections: Title (in Spanish and English) and Short Title, Abstract and Key words (in Spanish and English), Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements and References. Manuscripts shall not exceed 8,000 words including all the sections and shall include a maximum of 6 tables or figures. Brief reports. They are less extensive works. They include case reports, descriptions of new tecniques or equipment based on conclusive experimental work. Manuscripts should not be divided into sections and shall not exceed 3,000 words. References should be limited to fifteen citations and tables and figures to a maximum of three. Careful analysis of data presented should be observed so as to avoid their repetition in the text, tables and figures, in order to maintain the typical concision in style that characterizes this type of articles. Special articles. They are updates or workshop results on topics of regional and international weight. Their authors must be specialists in their field of study. Texts must include updated and comprehensive bibliography. Updates may include up to 10,000 words, 8 tables or figures. References should be limited to 100 bibliographic citations. Microbiological images. They may include high-quality pictures of bacteria, fungi, parasites and viruses, from direct observation or staining under optical, electronic or fluorescent microscopy. They may also include other photographic images of microorganisms in culture media, lesions in humans or laboratory animals, x-ray and ultrasound images, computed

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tomography scans, nuclear magnetic resonance, etc. These images having great instructional value though not necessarily ground-breaking, should be accompanied by an explanatory text and indicating arrows when necessary. The set of images should fit one printed page at most. Quality requirements for images are described under the “Figures” section below. Letters to the Editor. Letters can include either comments or new data. The comments consist in observations made on the articles published in the journal; the latter are aimed at communicating short pieces of work which do not have the appropriate length to be published as a complete work or brief report. Both contributions must not exceed 500 words, they should include the title in Spanish and English, they must not have an abstract, and may contain only one figure or table. The authors’affiliations should be placed at the bottom of the letter. Only the primary affiliation of each author should be indicated. The comments should mention the volume and issue number where the article was published, as well as the complete title and the first author’s last name. Furthermore, the sender should mention the bibliographical references that support the letter contents. In order to publish a comment, the corresponding author of the published article will be first consulted, the final decision and publication will remain at the editor‘s discretion. Contributions of new facts will be submitted to a specialist editor with knowledge in the subject matter, who along with external reviewers will assess the information. It should be noted that some journal indexing services do not include Letters to the Editor in their databases. Editorials. They focus on current scientific topics of special relevance to the scientific community specialized in Microbiology, or are opinion works on scientific policies. This section is the sole domain of the Editoral Board, who will determine editorial policy and authorship, as well as the general guidelines. Supplements. They ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ will consist of detailed reviews of a specific subject conducted by one or several scientific organizations or universities, as well as abstracts of contributions presented at scientific meetings or universities organized by the Asociación Argentina de Microbiología or any of its divisions or branches (oral communications, boards, lectures, round tables,etc.), and chaired by guest editors. Topics to be considered in the supplements and general outlines should be approved by the Editorial Board. Revision of manuscripts under the Supplements section will be in charge of reviewers appointed by the Editorial Board in the case of extensive reviewing, and of guest editors in the case of abstracts of meetings. Supplements will be wholly financed by the body organizing the scientific meeting, which will bear in mind that supplements should be distributed among participants to the meetings and all members of the Asociación Argentina de Microbiología either by subscription or on line. As regards style and format, supplements shall strictly conform to the standards of Revista Argentina de Microbiología in all respects (cover, paper quality, printing, tables and figures, illustrations, etc.), as described in the “Instructions to Authors” section. Supplements corresponding to abstracts of meetings shall include the following information in this order: names of members of the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología, data about the event (complete title, venue and date), content list of meetings (in Spanish and English), acknowledgements, names of organizing officers and message delivered by the Chair/s. Abstracts consecutively numbered in Arabic numerals as from 1 (one) should subsequently follow. An alphabetical index of authors and the English and Spanish versions of the instructions to authors of Revista Argentina de Microbiología should be printed next. The meeting schedule will only be included in the Supplement as a separate leaflet in the form of a triptych. PREPARATION OF MANUSCRIPTS Manuscripts should be written in A4 paper format with 3 cm margins on each side, using Times New Roman font, regular, 12, and double-spaced. Bold and italics printing types should be used when necessary. Counting from the abstract section of the manuscript onwards, all pages should be consecutively numbered in the lower right margin, as well as the manuscript lines. This shall also apply to text, tables, figures, legends and references. Pages including tables, figures and legends shall be included after the References section. Front or title page. The first page shall include the manuscript title using capitals only for the first letter and lowercase for the rest, the author’s names (complete first name, initials of other names and surname of all authors); place of work (institution name and mailing address), and a short title of the work with a maximum of 50 characters as running head. If authors have different working places, the institutional affiliation of each autor shall be indicated by numerical superinscriptions added to their names (not between parenthesis) to identify each author with his/her affiliation. The name of the corresponding author shall be marked by an asterisk in superscript position next to his/her name. The corresponding author’s e-mail shall also be included. If one or several authors have changed his/her/their affiliation, the current affiliation where work was performed should be indicated and the current place of work in a footer. Abstracts. They will only be included in original articles, brief reports and special articles and shall have a maximum of 250 words for original and special articles, and 150 words for brief reports. The first abstract will be written in the language used in the work and the second in the other language. It shall be headed by the complete title of the work. Abstracts shall be followed by a list of three to six key words in the corresponding language. Abbreviations and bibliographic citations should be avoided. A clear understanding of abstracts should be ensured since they may be separately published by bibliographic services. Introduction. It should provide sufficient and relevant information on the topic to be analyzed to allow the understanding of non-specialized readers. It should also include the hypothesis or scientific background that guided the experimental layout of the work as well as its clearly defined objectives. References mentioned in this section should be the most relevant ones with respect to the topic and must be carefully chosen. Materials and Methods. This section should include an accurate and detailed description of the methods, equipment, reagents and procedures used, so that the experiments could be replicated. Frequently used or routine procedures and techniques may be mentioned by specific reference (eg., MIC determination by the CLSI methods, 2010). New methods or those especially developed for the study should be described in detail, as well as infrequent drug sources or biological materials (bacterial, viral, fungal strains and plasmids, etc.). Trademarks and origin of reagents, culture means and equipment should be indicated in the text the first time they are mentioned, identifying the commercial brand name, state and country of origin. Results. It should include the experimental layout and its scientific background as well as the results obtained presented in a concise way preferably as text, or as table/s or figure/s). Unnecessary use of tables and figures to mention data should be avoided when they could be included in the text. Do not repeat the same information in the text and in the tables or figures.

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Limit the number of photographs to the minimum necessary to support experimental results. Number the tables and figures in the order they are mentioned in the text. Avoid repetitions and include only most relevant data. In-depth interpretation will be included in the Discussion section. Discussion. Emphasis should be placed on important cutting-edge findings; experimental data should be examined in the light of previously published works. Conclusions should be presented avoiding unnecessary repetition of data and concepts already included in preceding sections. Results and Discussion can be presented as a joint section. Acknowledgements. This section shall be typed in smaller printing characters than those used in the manuscript (Times New Roman, 11). Financing sources and names of individuals and/or institutions contributing with reagents, biological material or result discussions should be briefly mentioned. References. It is convenient that 70% whenever possible of bibliographic citations in all manuscripts correspond to the last 10 years and the remaining 30% be distributed in key works from previous years. Names of authors cited shall be listed in alphabetical order and numbered in sequence with Arabic numerals on a separate page. Citations in the text should appear in numbers placed between parenthesis, to coincide with the number they have in the References section. Reference to personal comments and unpublished works should be presented as personal communication, written between parenthesis. References should include the name of all the authors and conform to the following models: a. Periodical publications Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202. Names of journal titles shall be abbreviated according to Index Medicus, a list of which can be obtained at http://www. ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals. b. Chapters of books/modules Martins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42. c. Presentations in scientific meetings or other events Aguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoarculus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Abstract J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. d. Presentations in congresses or other scientific meetings in a supplement published by a periodic academic journal Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacientes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Abstract 10416. Rev Argent Microbiol 2005; 37 Supl 1: 95. e. Institutional publications Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, USA. f. Theses Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría en Microbiología Molecular 2009. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín. g. On line references 1. For on line Books Sullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. (On line) http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Accessed 7 September 2001. 2. For on line versions of printed journals van der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123-234. (On line) 3. For journals only available on line Zellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. (On line) http://www.avj.html. 4. For manuscripts published on line in advance of their publication Zheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/ dihydroxyacetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 10. 1074/jbc. M104749200. g. Items, references to works or congress abstracts not yet published, about to be published or under revision, personal communications, existing or pending patents, databases and web pages shall be mentioned in the text between parenthesis as shown: … similar results (Gómez H, unpublished results) … new detection protocol used (González JL, Submitted for publication). … drug concentrations (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother, abstr. 114, 1994). … new type of cellulolytic species (Márquez W, personal communication) previously commented by different sources (http://fcen.uba.edu.ar) Tables. They should be included on separate pages, consecutively numbered with Arabic numerals, preceded by an explanatory title, with captions and/or the corresponding explanations below. Reference marks for explanations in the form of footnotes shall use superscripted Arabic numbers betweeen parenthesis. Lines shall only be used in the external borders of the first and last row, and to separate the headings of the columns from the data. Rows and column borders shall not be inserted. Figures. They will be included on separate pages with the figure number in the upper left margin and in the order they are mentioned in the text. Drawings should be clear enough to ensure suitable reproduction. Numbers, letters and signs shall have the adequate size to be readable once reduced as needed. References to symbols used in the figures shall be included within the same figure and not in the text legend. Photographs may be in colour or black and white, in JPEG or TIFF formats. Minimum photo resolution requirements are 300 dpi for color and grayscale images and photo prints, 600 dpi for combined

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art images (letters and images) and 1200 dpi for images composed of lines (graphs and drawings). Note: It is very important to use the adequate file resolution. All individual images imported in a graphic file should be in the correct resolution before uploading them. Bear in mind that the higher the resolution, the larger the file and the longer it will take to send it electronically. Captions to the illustrations should be included on a separate page, in consecutive order using Arabic numerals. Aminoacid and nucleic acid sequences. New sequences informed by publication in this journal should be deposited in a database and their accession number included in the manuscript, no later than revision stage. The mentioned accession numbers should be included in a separate paragraph at the end of the Materials and Methods section in the case of original works or at the end of the text in the case of brief reports. The information about currently available databases is the following: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, National Institute of Genetics; e-mail: ddbj@ddbj. nig.ac.jp; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail: [email protected]; URL, http://www.ebi.ac.uk GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail: [email protected]; URL, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov Nucleic acid sequences of up to 50 nucleotides included in the work developed in the manuscript may be presented in any style whatsoever. Significantly long sequences should be presented as Figures so as to reduce space, printing those having 80 to 120 nucleotides per line in a readable font according to publishing guidelines (16 cm, width of two RAM columns). If possible, the sequence should be divided into blocks of 10 to 20 nucleotides separated by a space or by indicative numbers placed above the sequence. Lines should be numbered, indicating the corresponding number to the left of the first pair on each line. Any necessary comments shall be bold-typed, underlined or written between parentheses. If it is necessary to include the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence, it shall be indicated by the use of one-letter symbols accepted as amino acid indicators placed under the first nucleotide of the encoding codon. Abbreviatons. They ������������������������������������������������������������������������������������������������������ must be made explicit when mentioned for the first in the text. Units of measurements will be expressed according to the standards of Système International d´Unités. SUBMITTANCE OF MANUSCRIPTS Manuscripts may be submitted by e-mail ([email protected]) or ordinary mail to Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, including a CD-ROM electronic version, with a label or inscription indicating: title of work, the program and program version used for the text, figures, photographs and the title of all the files it contains. The complete text of the article should be included in only one file. If there are images, they should be sent on separate files. Besides, it is advisable that capital letters, spaces between words, italics and bold letters are typed in the same way they appear in the printed version. There should be no spaces before and after subheadings, the text should be justified and tab-setting should be used instead of the spacing bar for columns in tables. Authors should revise the check list shown after these instructions and see that all the requirements therein have been fulfilled. Before submitting the manuscripts, authors should also examine one of the latest RAM issues in order to verify if all guidelines have been followed as regards format and style and to make all necessary modifications if neccessary. Authors should delete from file properties all kind of information that could identify their authorship. EDITORIAL PROCESS Once the manuscript has completed the editorial process and is ready for publication, a file in pdf format with the galley proof shall be sent by e-mail to the corresponding editor for making the corresponding typing corrections. He/she should not change concepts nor modify paragraphs which could alter the print format.. The document should be printed after making the corrections on the text and sent by fax or as a scanned file by e-mail. Corrections may also be sent by e-mail, clearly specifying the page, paragraph and line to be corrected and should be returned within seven running days of reception, otherwise it shall be assumed that its publication has been declined. At that moment, the amount to be paid for the publication of the article will be sent to the author. Revista Argentina de Microbiología follows the policies for clinical trial registration of the World Health Organization (WHO) and of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), acknowledging the importance of those initiatives for the international dissemination of information on clinical research in open access format. Therefore, only articles referring to trials previously registered with an identifying number in one of the Clinical Trial Registers that meet WHO and ICMJE requirements will be accepted for publication. Their addresses are available in the ICMJE site. The identifying registration number shall be published at the end of the abstract. Publishing charges. Each published page will cost $ 75 or $ 200 (pesos) when the page includes color photographs (AAM members in Argentina,), $ 200 o $ 600 (pesos) (AAM non-members in Argentina) and U$S 70 o U$S 180 (in other countries). Reprints. Twenty five off prints will be provided free of charge. The Secretary: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 and (54-11) 4932-8948; e-mail: [email protected]; http://www.aam.org.ar

ANNUAL SUBSCRIPTION (4 issues) AAM members $ 120 Argentina non members $ 240 Latin America U$S 100 Other countries U$S 200

Payment: By check or money order, to the order of Asociación Argentina de Microbiología. Price includes mail postage.

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Revista Argentina de MicrobiologíaISSN (2010) 42: --0325-7541 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 336

Manuscript Preparation Checklist The following checklist is designed to help you prepare and revise your manuscript according to journal style and format. For additional details, consult the Instructions to Authors (http://www.aam.org.ar). Manuscripts not following the specified format shall be returned to their authors, delaying the evaluation and publication process.

Title

Yes No Does not apply

Includes title in Spanish Includes title in English Includes abbreviated title

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Authors Identifies corresponding author Includes corresponding author’s address, telephone number and e-mail adress Includes all the authors Includes authors’ affiliations Includes cover letter for manuscript submission signed by corresponding author

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Abstracts Each abstract does not exceed the maximum number of words allowed Includes an abstract in Spanish Includes key words in Spanish Includes an abstract in English Includes key words in English

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Text Does not exceed the maximum number of words allowed Does not exceed the maximum number of tables and/or figures allowed Has the corresponding sections Makes correct use of abbreviations Mentions trademarks and origin of reagents, culture media and equipment Mentions accession number of new amino acids and nucleic acids sequences

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Tables and Figures Each of them is included on a separate page Titles are clear and concise Legends are included Citations in the text correspond with the numbers of each table and figure Abbreviations are explained as a table footnote Figures and photographs are sent in attached files

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References Strictly adheres to the format required by the journal Items in this section are listed in alphabetical order Citations in the text correspond with the numbers appearing in this section

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Acknowledgements Funding sources are mentioned

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Edición realizada por Estudio Sigma S.R.L. - J. E. Uriburu 1252 - 8º F - Buenos Aires - Tel.: 4824-9431 / 4821-2702 E-mail: [email protected] - www.estudiosigma.com.ar Impreso en el mes de Diciembre de 2011