AÑO 2011 R E V I S TA A R G E N T I N A D E M I C R O B I O L O G Í A VOL 43 Nº1

Nº1 VOL 43 2011

REVISTA ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA

PUBLICACIÓN DE LA ASOCIACIÓN ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA

PUBLICACION DE LA ASOCIACION ARGENTINA DE MICROBIOLOGIA Aparece en Biological Abstracts, Chemical Abstracts, Veterinary Bulletin, Index Veterinario, Embase (Excerpta Medica) Medline (Index Medicus), Tropical Diseases Bulletin, Abstracts on Hygiene and Communicable Diseases, Literatura Latinoamericana en Ciencias de la Salud (LILACS), Periódica, LATINDEX, SciELO, Science Citation Index Expanded y Redalyc. DIRECTORA Elsa C. Mercado

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Hospital de Clínicas - Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA

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ISSN 0325-7541  Revista Argentina de Microbiología (2008) 40: ---

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Volumen 43 Nº 1  ENERO-marzo de 2011

ÍNDICE EDITORIAL Microorganismos del suelo y sustentabilidad de los ecosistemas I. García de Salamone MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y DE ALIMENTOS Optimización de metodologías de cribaje para la búsqueda de Streptococcus agalactiae en embarazadas S. E. Montibello, L. I. Guelfand, M. G. Machaín, A. N. Carrión, M. D. Ferreira, J. C. Pidone, M. E. Ceregido, S. C. Kaufman, R. N. Soloaga Desarrollo de una prueba de ELISA para detectar anticuerpos en carneros vacunados o infectados con Corynebacterium pseudotuberculosis J. J. Solanet, R. Malena, S. M. Estein, S. Estevao Belchior, F. A. Paolicchi Etiología bacteriana de la neumonía nosocomial y resistencia a los antimicrobianos en pacientes con y sin tratamiento antimicrobiano previo B. Weyland, B. Perazzi, S. García, C. Rodríguez, C. Vay, A. Famiglietti β-lactamasas AmpC plasmídicas tipo CMY-2 emergentes en Tucumán, Argentina M. A. Jure, C. Presti, N. M. Cudmani, L. M. Grellet, C. López, E. H. Musa, O. C. Aulet, C. Nieto, L. Saavedra, M. C. de Castillo Descripción de un brote de intoxicación alimentaria estafilocócica ocurrido en Las Rosas, Provincia de Santa Fe, Argentina A. A. Brizzio, F. A. Tedeschi, F. E. Zalazar Brote de intoxicación alimentaria asociado al consumo de leche ultrapasteurizada en la República del Paraguay N. Weiler, G. A. Leotta, M. N. Zárate, E. Manfredi, M. E. Álvarez, M. Rivas Tuberculosis pediátrica en un hospital de referencia durante el período 2004-2008 M. G. Rodríguez, C. P. Patallo, V. A. Rizzotti, M. A. Moscoloni, D. S. Ballester Brote de leptospirosis en terneros en recría en la provincia de Corrientes, Argentina M. G. Draghi, B. Brihuega, D. Benítez, J. M. Sala, G. M. Biotti, M. Pereyra, A. Homse, L. Guariniello * Meningitis neonatal por Listeria monocytogenes en San Luis, Argentina: análisis de tres casos A. L. Laciar, M. L. Vaca Ruiz, A. Le Monnier * Efectos clínicos adversos relacionados con ivermectina en pacientes tratados por infecciones con Mansonella ozzardi A. J. Krolewiecki, S. P. Cajal, C. Villalpando, J. F. Gil ARTÍCULOS ESPECIALES Primer consenso argentino para el estudio de la sensibilidad in vitro a los antimicrobianos de las bacterias anaerobias de importancia clínica en humanos M. C. Legaria, H. M. Bianchini, L. Castello, G. Carloni, A. Di Martino, L. Fernández Canigia, M. Litterio, R. Rollet, A. Rossetti, S. C. Predari

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IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS Alicyclobacillus acidoterrestris J. M. Oteiza Alteraciones ultramicroscópicas en tejido placentario de animales infectados con Leptospira interrogans serovar Pomona B. Brihuega, A. Venzano, J. Diodati, A. Boffi, D. Funes, C. Auteri, G. Romero, L. Samartino

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INDEX EDITORIAL Soil microorganisms and sustainability of the ecosystems I. García de Salamone CLINICAL AND FOOD MICROBIOLOGY Optimization of screening methodologies for the detection of Streptococcus agalactiae in pregnant women S. E. Montibello, L. I. Guelfand, M. G. Machaín, A. N. Carrión, M. D. Ferreira, J. C. Pidone, M. E. Ceregido, S. C. Kaufman, R. N. Soloaga Development of an ELISA test to detect antibodies in vaccinated or infected sheep with Corynebacterium pseudotuberculosis J. J. Solanet, R. Malena, S. M. Estein, S. Estevao Belchior, F. A. Paolicchi Bacterial etiology of nosocomial pneumonia and antimicrobial resistance in patients with and without antimicrobial treatment B. Weyland, B. Perazzi, S. García, C. Rodríguez, C. Vay, A. Famiglietti CMY-2-type plasmid-mediated AmpC b-lactamases emerging in Tucumán, Argentina M. A. Jure, C. Presti, N. M. Cudmani, L. M. Grellet, C. López, E. H. Musa, O. C. Aulet, C. Nieto, L. Saavedra, M. C. de Castillo Description of an staphylococcal alimentary poisoning outbreak in Las Rosas, Santa Fe Province, Argentina A. A. Brizzio, F. A. Tedeschi, F. E. Zalazar Foordborne outbreak associated with consumption of ultrapasteurized milk in the Republic of Paraguay N. Weiler, G. A. Leotta, M. N. Zárate, E. Manfredi, M. E. Álvarez, M. Rivas Pediatric tuberculosis at a reference hospital during the 2004-2008 period M. G. Rodríguez, C. P. Patallo, V. A. Rizzotti, M. A. Moscoloni, D. S. Ballester Leptospirosis outbreak in calves from Corrientes Province, Argentina M. G. Draghi , B. Brihuega, D. Benítez, J. M. Sala, G. M. Biotti, M. Pereyra, A. Homse, L. Guariniello *Neonatal Listeria-meningitis in San Luis, Argentina: a three-case report A. L. Laciar, M. L. Vaca Ruiz, A. Le Monnier * Ivermectin-related adverse clinical events in patients treated for Mansonella ozzardi infections A. J. Krolewiecki, S. P. Cajal, C. Villalpando, J. F. Gil SPECIAL ARTICLES First Argentine consensus guidelines for in vitro antimicrobial susceptibility testing of clinically relevant anaerobic bacteria in humans M. C. Legaria, H. M. Bianchini, L. Castello, G. Carloni, A. Di Martino, L. Fernández Canigia, M. Litterio, R. Rollet, A. Rossetti, S. C. Predari MICROBIOLOGICAL IMAGES Alicyclobacillus acidoterrestris J. M. Oteiza Ultramicroscopic alterations in placental tissue from infected animals with Leptospira interrogans serovar Pomona B. Brihuega, A. Venzano, J. Diodati, A. Boffi, D. Funes, C. Auteri, G. Romero, L. Samartino New instructions to authors

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Editorial

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EDITORIAL

Microorganismos del suelo y sustentabilidad de los agroecocistemas El suelo es un recurso viviente y dinámico que condiciona la producción de alimentos. Su calidad tiene un papel fundamental en el mantenimiento del balance entre producción y consumo de dióxido de carbono en la biosfera. El suelo no sólo es la base para la agricultura, sino que de él depende toda la vida del planeta. La mayor parte de las etapas de los ciclos biogeoquímicos tienen lugar en él (9). La actividad microbiana del suelo (o edáfica) da cuenta de las reacciones bioquímicas que se suceden dentro de este complejo y heterogéneo sistema. Los cambios en la tasa de circulación del carbono y de los nutrientes minerales en el suelo como consecuencia de las interacciones entre las plantas y otros organismos involucran modificaciones en la estructura y el funcionamiento de sus comunidades bióticas. En un ecosistema, la pronta respuesta de los procesos microbianos y de la estructura de las comunidades a las alteraciones físicas, químicas y biológicas constituye un aspecto central de la calidad del suelo. Los cambios en la estructura de las comunidades microbianas en sistemas perturbados generalmente están asociados a emisiones de gases con efecto invernadero (CO2, NO o N2O) y a la pérdida del N por lixiviación (8).

El manejo agrícola convencional, que incluye el excesivo uso de maquinaria, ha incrementado la erosión del suelo y la concentración de dióxido de carbono atmosférico, y en consecuencia, el calentamiento global. La aplicación de sistemas de manejo con uso reducido o nulo de maquinaria ha sido una estrategia para revertir este proceso de deterioro de los suelos (6), y los productores argentinos la han adoptado en forma generalizada, sobre todo en la región pampeana. Sin embargo, esta alternativa no es suficiente para garantizar la sustentabilidad. Desarrollar sistemas de manejo sustentable conlleva una gran dificultad, pues es preciso considerar las demandas sociales vinculadas con la eficiencia en el uso del recurso y la capacidad de mantener un balance favorable (4). Hiperdensidad e hiperdiversidad son los dos aspectos fundamentales que caracterizan a las comunidades microbianas del suelo. La cantidad de microorganismos en un gramo de suelo puede variar entre 107 y 109 células, mientras que algunas estimaciones indican la posibilidad de que haya al menos 104 especies microbianas distintas por gramo de suelo (13). La biodiversidad es una propiedad que condiciona la capacidad de recuperación del sistema edáfico ante una alteración y que le asegura su estabilidad funcional (7). Además, brinda la posibilidad de obtener microorganismos con capacidad de promover el crecimiento de los cultivos de tal manera que la sustentabilidad de los agroecosistemas se vea favorecida por diversos mecanismos (1, 2, 12). La práctica de inoculación de semillas ha sido incorporada a los sistemas de cultivos en Argentina desde hace muchos años en las asociaciones Rhizobium‑leguminosa. En nuestro país, casi el 90% de los cultivos de soja son inoculados con bacterias del género Bradyrhizobium y la especie más utilizada es B. japonicum. De esta manera se logra el establecimiento de la simbiosis bacteria‑planta. Esta brinda al cultivo la posibilidad de obtener nitrógeno del aire mediante la fijación biológica por la actividad del complejo enzimático de la nitrogenasa, sólo presente en algunos procariotes. En la actualidad, otras bacterias del suelo con capacidad de asociarse a plantas de cultivo se están aplicando con éxito. Entre ellas se destacan las de los géneros Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter y Azospirillum. Este último género es uno de los más estudiados y sobre el cual se han publicado numerosos artículos científicos y de divulgación. Esto se debe a que Azospirillum tiene la capacidad de colonizar diversas especies vegetales de manera endofítica y promover su crecimiento, nutrición y productividad a través de mecanismos tales como fijación biológica de nitrógeno y producción de fitohormonas. La capacidad de aumentar el rendimiento biológico de los cultivos se asocia a favorecer la sustentabilidad de los agroecosistemas, dado que se incrementa la cantidad de materia orgánica aportada al suelo a



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través de residuos de cosecha y se reduce, en ciertas ocasiones, la necesidad de fertilización química. Con el objetivo de establecer el estado de situación respecto de su uso y de la investigación en torno al tema, la Subcomisión de Microbiología Agrícola y Ambiental de la AAM organizó el Primer Taller Internacional sobre Azospirillum que se realizó en la ciudad de Córdoba en octubre de 2007. Con los aportes realizados por investigadores nacionales y extranjeros de gran trayectoria en la temática se editó un libro que abarca tanto temas de fisiología bacteriana como de respuesta agronómica (3). La aplicación de microorganismos se realiza a través de la utilización de inoculantes sobre las semillas y/o sobre el suelo, con el fin de establecer una asociación benéfica entre la planta y el microorganismo. Los inoculantes pueden ser monovalentes, es decir, contener un solo tipo de microorganismo, o polivalentes, cuando dos o más microorganismos están incluidos en su formulación. Aunque existen formulaciones sólidas en el mercado, actualmente el comercio nacional de inoculantes ha seguido la tendencia mundial de utilizar inoculantes líquidos, formulados de tal manera que la supervivencia del microorganismo en el inoculante pueda ser mantenida durante períodos prolongados, que pueden variar entre 6 y 18 meses desde el momento de su fabricación. La utilización adecuada y sin riesgos de estos productos microbiológicos requiere el cumplimiento de ciertos parámetros de calidad, que deberían ser observados por las empresas fabricantes y controlados por el ente regulador. Los inoculantes no deben aportar microorganismos no deseados ni posibles contaminantes, y las cantidades del microorganismo a aplicar deben estar en los niveles necesarios para garantizar su eficiencia. En este sentido, la red de control de inoculantes REDCAI de la División de Microbiología Agrícola y Ambiental (DIMAYA) de la AAM ha desarrollado procedimientos interlaboratorio para la aplicación de protocolos de consenso, que ya han sido publicados (10,11). La rizosfera, definida como la porción del suelo influenciada por las raíces vegetales, es el sitio de máxima interacción entre microorganismos edáficos y entre éstos y los cultivos. Por ello, el conocimiento detallado de este ambiente y la caracterización de su biodiversidad constituyen pilares fundamentales para lograr agroecosistemas sustentables. En este sentido, la DIMAYA organizó en octubre de 2010 el Primer Taller Internacional sobre Rizosfera, Biodiversidad y Agricultura Sustentable (TIRBAS). Éste se realizó en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y tuvo como objetivo generar un ámbito de discusión e intercambio de ideas, las cuales estas en forma resumida han sido plasmadas en el libro de resúmenes de las presentaciones brindadas por disertantes nacionales y extranjeros, el que conforma una actualización exhaustiva en la temática (5). El logro y el mantenimiento de la sustentabilidad de los agroecosistemas deben ser objetivos permanentes en pos de mantener el recurso suelo en niveles de máxima calidad y salud. Todos los actores intervinientes tales como productores, fabricantes de insumos, investigadores y políticos tienen ese compromiso con las generaciones venideras. En ese sentido, la microbiología del suelo brinda la posibilidad de generar nuevos conocimientos, tanto básicos como aplicados, y de hacer valiosos aportes al desarrollo económico respetando el recurso natural. INÉS EUGENIA GARCÍA DE SALAMONE Cátedra de Microbiología Agrícola Departamento de Biología Aplicada y Alimentos Facultad de Agronomía. Universidad de Buenos Aires Avda. San Martin 4453. Ciudad Autónoma de Buenos Aires E-mail: [email protected] 1. Antoun H, Prevost D. Ecology of plant growth promoting rhizobacteria. In: Siddiqui ZA, editor. PGPR: Biocontrol and Biofertilization. Dordrecht, Springer, 2006, p. 1-38. 2. Bashan Y, de-Bashan LE. Bacteria/Plant growth-promotion. In: Hillel D, editor. ������������������������������������������ Encyclopedia of soils in the environment. Oxf����� ord, UK, �������������������� Elsevier, 2005, Volume �������������������� 1, p. 103-15.

3. Cassan FD, García de Salamone IE. Azospirillum sp.: Cell physiology, plant interactions and agronomic research in Argentina. Buenos Aires, Argentina, Asociación Argentina de Microbiología, 2008. 4. Doran JW, Zeiss MR. Soil health and sustaintability: managing the biotic component of soil quality. Appl Soil Ecol 2000; 15: 3-11.

Editorial 5. García de Salamone IE, Cassan FD. Taller Internacional sobre Rizosfera, Biodiversidad y Agricultura Sustentable. Buenos Aires, Argentina , Asociación Argentina de Microbiología, 2010. 6. Grandy AS, Robertson GP, Thelen KD. Do productivity and environmental trade-offs justify periodically cultivating no-till cropping systems? Agron J 2006; 98: 1377-83. 7. Griffiths BS, Bonkowski M, Roy J, Ritz K. Functional stability substrate, utilisation and biological indicators of soil following environmental impacts. Appl Soil Ecol 2001; 16: 49-61. 8. Jackson LE, Calderonb FJ, Steenwertha KL, Scow KM, Rolston DE. Responses of soil microbial processes and community structure to tillage events and implications for soil quality. Geoderma 2003; 114: 305-17. 9. Paul EA, Clark FE. Soil Microbiology and Biochemistry. San Diego, CA, Academic Press Inc., 1996.

 1 0. REDCAI Control de Calidad de Inoculantes en Leguminosas. Documento de Procedimientos Nº 1. Subcomisión de Microbiología Agrícola y Ambiental (SMAYA), Asociación Argentina de Microbiología, 2006. Buenos Aires, Argentina. 11. REDCAI Control de Calidad de Inoculantes que contienen Azospirillum. Documento de Procedimientos No 2. División de Microbiología Agrícola y Ambiental (DIMAYA), Asociación Argentina de Microbiología, 2010. Buenos Aires, Argentina. 12. Reed MLE, Glick BR. Applications of free living plant growth-promoting rhizobacteria. Antonie van Leeuwenhoek 2004; 86: 1-25. 13. Torsvik V, Øvreås L, Thingstad TF. Prokaryotic diversity - magnitude, dynamics, and controlling factors. Science 2002; 296: 1064-6.



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ARTÍCULO ORIGINAL

Optimización de metodologías de cribaje para la búsqueda de Streptococcus agalactiae en embarazadas Silvia E. Montibello1, Liliana I. Guelfand1, Mónica G. Machaín2, NATALIA A. Carrión3, María D. Ferreira2, Juan C. Pidone3, María E. Ceregido2, Sara C. Kaufman1, Rolando N. Soloaga3* 2

1 Laboratorio de Bacteriología del Hospital “Juan A. Fernández”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires; Laboratorio de Bacteriología del Hospital Piñeyro, Junín, Pcia. de Buenos Aires; 3Laboratorio de Microbiología del Hospital Naval “Pedro Mallo”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN Streptococcus agalactiae es una causa importante de morbimortalidad en mujeres embarazadas y neonatos en todo el mundo. El objetivo del presente trabajo fue determinar la utilidad del medio cromogénico chromID Strepto B de bioMérieux para detectar S. agalactiae en embarazadas cuando la muestra es sembrada directamente en dicho medio o después del enriquecimiento en caldo de Todd Hewitt selectivo, opciones que se compararon con la metodología propuesta por el CDC. Se analizaron 1924 hisopados, 962 de introito vaginal y 962 rectales, correspondientes a 962 embarazadas entre la semana 35 y 37 de gestación, asistidas en distintos hospitales. Los hisopados se sembraron directamente en el medio chromID Strepto B (CR) y luego se colocaron en un caldo de Todd Hewitt selectivo, suplementado con 15 μg/ml de ácido nalidíxico y 10 μg/ml de colistina (CTH-sel). Luego de 24 h de incubación, se realizaron subcultivos en el medio CR y en agar con 5% de sangre de carnero (ASO). La prevalencia global de S. agalactiae fue de 17,4%. La sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivo y negativo del subcultivo en CR del material desarrollado en el CTH-sel fueron 98,8%, 100%, 100% y 99,7% respectivamente, con una incubación de 48 h. Los valores correspondientes de la siembra directa fueron 57,8%, 100%, 100% y 90%. La sensibilidad del subcultivo en ASO del material desarrollado en el CTH-sel fue del 85%. Se destaca el excelente rendimiento del subcultivo en CR luego del enriquecimiento en caldo de Todd Hewitt selectivo en comparación con el método propuesto por el CDC. Palabras clave: Streptococcus agalactiae, embarazo, cribaje

ABSTRACT Optimization of screening methodologies for the detection of Streptococcus agalactiae in pregnant women. Streptococcus agalactiae is a significant worldwide cause of morbidity and mortality in pregnant women and their newborn infants. The objective of this work was to determine the usefulness of bioMrieux chromogenic medium chromID Strepto B (CR) for detecting S. agalactiae in pregnant women from the selective Todd-Hewitt broth (sel-THB) against the methods proposed by the CDC. A total of 1924 swabs were analyzed, 962 from vaginal introitus and 962 rectal, belonging to 962 women in weeks 35-37 of pregnancy. The swabs were directly seeded in CR. Both swabs were later placed in sel-THB with 15 μg/ml supplement of nalidixic acid and 10 μg/ml colistin. After 24 h of incubation, subcultures in CR medium and agar containing 5% sheep blood (SBA) were performed. The prevalence found was 17.4%. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of sel-THB subcultures with CR supplement and 48 h incubation were: 98.8, 100, 100 and 99.7%, respectively. The corresponding values of direct harvest of the sample were 57.8, 100, 100, and 90%, respectively. Sensitivity of sel-THB in SBA was 85%. Sel-THB subculture performance in CR was outstanding in comparison with the method proposed by the CDC. Key words: Streptococcus agalactiae, pregnancy, screening

INTRODUCCIÓN Streptococcus agalactiae fue comunicado por primera vez como patógeno humano en 1938 por Fry (13), quien describió tres casos de sepsis puerperal fatal. Algunos años antes, Lancefield y Hare (17) habían identificado a estos microorganismos en cultivos vaginales de puérperas asintomáticas. Hacia comienzos de los años 70, ya no se pudo pasar más por alto la importancia de S. agalactiae como

un patógeno humano, dado que se había convertido en una causa frecuente de infección entre las mujeres en etapa de posparto y los neonatos febriles (3-7, 11, 22, 23). Este microorganismo integra la flora comensal intestinal, principal reservorio, y en forma intermitente coloniza el área perineal y el tracto genital. La prevalencia de la colonización orofaríngea es baja (aproximadamente 5%), pero puede llegar al 20% en los hombres homosexuales (1-8, 11, 14, 16, 18, 23, 24).

S. agalactiae en embarazadas

En pacientes adultos con el sistema inmunológico alterado, como diabéticos, cirróticos, alcohólicos, dializados, personas que viven con el virus de la inmunodeficiencia humana y personas con anormalidades neurológicas (accidente cerebrovascular, demencia, paraplejía o cuadriplejía) o con úlceras por decúbito, es responsable de enfermedades tales como artritis, osteomielitis, bacteriemia, endocarditis, neumonía, meningitis, infecciones urinarias, uretritis no gonocócica (en el hombre), fiebre de origen desconocido e infecciones de piel y partes blandas. Otras formas inusuales son el absceso mamario en mujeres que no se hallan en el período de lactancia, el absceso epiglótico, el aneurisma micótico de la arteria femoral, el absceso hepático, la peritonitis, la queratitis, la endoftalmitis y la infección del cable de marcapasos (11, 23). Los objetivos de este trabajo fueron: a) comparar la prevalencia de colonización por S. agalactiae en mujeres embarazadas entre la semana 35 y 37 de gestación asistidas en 3 hospitales diferentes; b) determinar la utilidad del medio cromogénico chromID Strepto B de bioMérieux en la detección de S. agalactiae bajo dos estrategias metodológicas comparadas con la metodología propuesta por el CDC y establecer el tiempo óptimo de incubación; c) comparar el rendimiento de las muestras vaginales con las rectales y de ambas combinadas en lo que hace a la posibilidad de documentar la portación de S. agalactiae. Este estudio fue presentado en parte en el 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Viena, Austria, abril 2010.

MATERIALES Y MÉTODOS Población estudiada En los servicios de Bacteriología del Hospital “Juan A. Fernández” y del Hospital Naval “Pedro Mallo”, ambos de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires, y del Hospital Piñeyro de la ciudad de Junín, Provincia de Buenos Aires, se realizó un estudio prospectivo observacional para lo cual se analizaron 1924 hisopados, 962 de introito vaginal y 962 rectales correspondientes a 962 embarazadas que se encontraban entre la semana 35 y 37 de gestación. Las muestras fueron remitidas al laboratorio en el medio de transporte de Stuart, dentro de las 24 h de obtenidas. Procesamiento bacteriológico Un subgrupo de hisopados vaginales y rectales correspondientes a 665 pacientes se sembraron directamente en el medio cromogénico chromID Strepto B (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia) (en adelante, CR); este material se incubó en aerobiosis a 37 °C durante 24 h. De no observarse colonias sospechosas de S. agalactiae en ese plazo, la incubación se prolongó 24 h más. Todos los hisopos se colocaron luego en un caldo de Todd Hewitt suplementado con 15 μg/ml de ácido nalidíxico y 10 μg/ml de colistina (CTH-sel) (Laboratorios Britania, Buenos Aires). Luego de 24 h de incubación, se realizaron subcultivos en el medio CR y en agar tripticasa soja con 5% de sangre de carnero (ASO) (bioMérieux). Nuevamente, las placas de CR se examinaron a las 24 h, y de ser negativas se incubó un día más; las placas de ASO se observaron a las 24/48 h. Las muestras del resto de las pacientes (n: 297) se colocaron directamente en el CTH-sel y luego se continuó con su procesamiento, tal como se describió para las otras muestras.

 A las colonias sospechosas, rojas en CR y grises que presentaran o no b-hemólisis en ASO, se les realizó la coloración de Gram y las pruebas de catalasa, bilis esculina, CAMP, hidrólisis de hipurato y aglutinación con partículas de látex para estreptococos del grupo B (12, 21). Siguiendo las recomendaciones del fabricante, las colonias púrpuras o blanquecinas no fueron consideradas. Se consideró como valor de referencia o “patrón de oro” al resultado total de cultivos positivos obtenidos en CR y en ASO a partir de los subcultivos provenientes del CTH-sel. Se realizó el cálculo de la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo y el valor predictivo negativo sobre la base de la prueba t de Student. Para ello, se definieron las siguientes categorías de cultivos: - Verdaderos positivos: presencia de colonias rojas/rosadas en CR subcultivado desde CTH-sel, con confirmación de la identidad como S. agalactiae por las pruebas bioquímicas antes mencionadas y por la prueba de aglutinación con partículas de látex para S. agalactiae. - Verdaderos negativos grupo B (bioMérieux): cultivo negativo (sin desarrollo o con colonias púrpuras o blanquecinas) en CR y cultivo negativo en ASO, ambos subcultivados desde CTH-sel. - Falsos positivos: presencia en CR de colonias rojas/rosadas cuya identidad como S. agalactiae no pudo corroborarse mediante las pruebas bioquímicas efectuadas ni por aglutinación con partículas de látex. - Falsos negativos: cultivo negativo en CR (sin desarrollo o con colonias púrpuras o blanquecinas) y cultivo positivo en ASO, con confirmación de la identidad como S. agalactiae mediante las pruebas bioquímicas y la aglutinación con partículas de látex. Criterios de exclusión No fueron incluidas en el estudio aquellas pacientes que no hubieran dado su consentimiento para la toma de las muestras; también se excluyeron las muestras no pareadas y las que no cumplieron con los requisitos de transporte mencionados.

RESULTADOS I) Prevalencia Se aisló S. agalactiae de 168 pacientes, lo que implica una prevalencia global de 17,4%; sin embargo, cuando este parámetro se analizó separadamente por hospital, se encontraron valores dispares, con una prevalencia del 26,2% (47/179 pacientes) en el Hospital Naval, del 11,7% (35/297 pacientes) en el Hospital Piñeyro y del 17,7% (86/486 pacientes) en el Hospital Fernández (p=0,001 y p=0,04, respectivamente); las diferencias en prevalencia entre las poblaciones estudiadas en el Hospital Fernández y el Hospital Piñeyro no fueron significativas (p=0,09). II) Comparación de métodos a) Rendimiento del subcultivo en CR y en ASO del material previamente desarrollado en el CTH-sel De las 168 pacientes en las que se detectó S. agalactiae, 166 produjeron aislamientos a partir de uno o de ambos tipos de hisopado (vaginal y rectal) subcultivados en CR luego del cultivo inicial en CTH-sel (sensibilidad: 98,8%), en tanto que sólo 143 los produjeron en ASO (sensibilidad: 85,1%) a partir del mismo caldo (p < 0,0001). Siguiendo la indicación del fabricante de considerar sólo las colonias rojo/rosadas, no se observaron falsos positivos con el medio CR (especificidad: 100%).



b) Rendimiento comparativo del medio CR en siembra directa y en subcultivo En segundo lugar, se comparó la sensibilidad de la siembra directa en CR y de los subcultivos desde el CTH-sel a ASO y a CR. Del subgrupo de 665 pacientes cuyos hisopados se cultivaron de las dos maneras (en siembra directa y como subcultivos) se obtuvo un total de 133 cultivos positivos para S. agalactiae. De estos, 77 fueron detectados por la siembra directa en CR y 131 a partir del subcultivo en CR del material desarrollado en CTH-sel, lo que brinda valores de sensibilidad de 57,9% para la primera estrategia y del 98,5% para la segunda (p < 0,00001). Los valores predictivos positivo y negativo del subcultivo en CR desde el CTH-sel fueron 100% y 99,7%, en tanto que para la siembra directa en CR, estos valores fueron 100% y 90%, respectivamente. c) Tiempo óptimo de incubación en CR La incubación de las placas con CR durante 48 h, sembradas como subcultivo desde el CTH-sel permitió detectar a 166 de las 168 pacientes portadoras de S. agalactiae, pero sólo a 70 de estas en las primeras 24 h de incubación. Con una incubación de 24 h, esta metodología tuvo 42% de sensibilidad, 100% de especificidad, 100% de valor predictivo positivo y 89% de valor predictivo negativo; en tanto que los valores correspondientes con una incubación de 48 h fueron 98,8%, 100%, 100% y 99,7%, respectivamente. Se observó una diferencia significativa con la incubación de 48 h con respecto a la de 24 h (p < 0,00001). d) Rendimiento de los distintos tipos de muestra En 82 de las 168 pacientes que resultaron ser portadoras de S. agalactiae, (49%, IC 95%: 12-31) se obtuvo desarrollo sólo a partir del hisopado rectal, en 51 (30%, IC 95%: 20-41) a partir de la muestra rectal y vaginal y en 35 (21%, IC 95%: 12-31) sólo desde el hisopado vaginal, lo que documenta un rendimiento del cultivo vaginal significativamente inferior al del cultivo rectal (p < 0,00001).

DISCUSIÓN S. agalactiae es uno de los microorganismos habituales del intestino; desde allí puede colonizar el tracto genital femenino y convertirse en un factor de riesgo determinante en mujeres embarazadas, dada la posibilidad de transmisión al recién nacido (1, 3-8, 11, 16, 22-24). En la embarazada, S. agalactiae puede dar origen a infección urinaria, corioamnionitis, endometritis posparto, infección de la herida quirúrgica poscesárea, endocarditis y fiebre (3-8, 11, 22, 23). Según la bibliografía internacional, la prevalencia de S. agalactiae en este grupo de mujeres se encuentra entre el 10% y el 40% (1-7,18, 23); en Argentina oscila entre el 5% y el 18% (10, 14). Estas variaciones en la prevalencia de colonización asintomática se relacionan con la población estudiada y con la utilización o no de medios de enriquecimiento y selectivos para el estudio

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bacteriológico, los cuales permiten aumentar la recuperación en un 50% (2-7, 14, 16, 18, 24). Otro factor que influye en los resultados es el tipo de muestra analizada. De hecho, en algunos estudios un número significativo de pacientes no tiene realizado ambos hisopados (vaginal y rectal), lo que puede disminuir la sensibilidad en la recuperación (2-7, 14). Estos niveles de prevalencia y la considerable variabilidad ya descrita se han verificado en nuestro estudio, donde se observaron notables diferencias según el hospital considerado (rango: 11,7% al 26%), pese a que la metodología empleada fue uniforme. Es posible que estas obedezcan a diferencias en las poblaciones estudiadas. La colonización de la membrana mucosa en los recién nacidos es el resultado de la transmisión vertical del microorganismo desde la madre, ya sea en el útero siguiendo la vía canalicular ascendente o en el momento del parto. Un inóculo genital elevado en el momento del parto aumenta de modo significativo la posibilidad de transmisión vertical (2-8, 11). Además de la exposición materna durante el parto, en algunas ocasiones se puede producir la colonización de origen intrahospitalaria en el recién nacido, sobre todo cuando las condiciones de trabajo en la enfermería promueven la transmisión horizontal (11). La tasa de transmisión vertical es del 50%, y de estos recién nacidos colonizados, el 1% a 2% desarrolla infección clínica (3% de los nacidos vivos). Aproximadamente el 25% de estas infecciones ocurre en prematuros (3, 6, 7, 11). En algunos estudios, la tasa de incidencia entre los años 1998 y 2000 fue de 0,5 a 0,6 por 1000 nacimientos, nuevamente con oscilaciones vinculadas con variables étnicas y geográficas (4, 7, 14, 18, 19). Varios factores obstétricos se asocian a un mayor riesgo de infección neonatal, fundamentalmente la prematurez (< 7 semanas), la rotura prematura de membranas (> 18 h), la presencia de fiebre intraparto (> 38 °C), el antecedente de haber tenido ya un hijo con infección por S. agalactiae y la bacteriuria por dicho microorganismo durante el embarazo (3, 6, 7, 11). Asimismo, un bajo nivel de anticuerpos maternos anti-S. agalactiae incrementa la probabilidad de enfermedad invasiva en el recién nacido. Se han observados niveles mayores de 2 μg/ml de anticuerpos maternos en el 15% de las mujeres colonizadas y en el 4% de las mujeres no colonizadas (3, 6, 7, 11). Las infecciones neonatales pueden ser de comienzo temprano o de presentación tardía (11). Los Centers for Disease Control and Prevention (CDC), la American Academy of Pediatrics (APO) y el American College of Obstetrician and Gynecologists (ACOG) publicaron las siguientes recomendaciones para la prevención de la infección neonatal por S. agalactiae: 1) realizar cultivos vagino-rectales entre las semanas 35 y 37 de gestación, para luego administrar profilaxis intraparto a todas las portadoras de S. agalactiae; y 2) administrar de manera empírica profilaxis a todas las gestantes que

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presenten factores de riesgo. Independientemente de la estrategia empleada, se recomienda profilaxis antibiótica, sin necesidad de realizar ningún muestreo, en todas las mujeres que ya han tenido un hijo con infección por S. agalactiae y en aquellas con bacteriuria (recuentos > 103 UFC/ml) por este microorganismo durante el embarazo (2-8). Estas guías fueron modificadas posteriormente y ahora se recomienda realizar un cribaje que comprenda a todas las mujeres embarazadas (35-37 semanas de gestación), y dejar la metodología basada en los factores de riesgo sólo para aquellas mujeres que llegan al parto sin conocer su estado de colonización (2-8). La profilaxis con penicilina o ampicilina comenzada al menos 4 h antes del parto interrumpe la transmisión vertical y previene la infección neonatal, con lo que la incidencia se reduce hasta el 0,6-0,8‰ (4, 6, 7-9, 21). En la República Argentina, la Ley nº 26369 promulgada en 2008 establece la obligatoriedad de realizar dichos cultivos en todas las embarazadas dentro del período gestacional señalado. Es importante tener en cuenta que el aislamiento de S. agalactiae en los controles prenatales depende del sitio de búsqueda, del uso de medios selectivos y de enriquecimiento para procesar los cultivos y de las semanas de gestación (1, 2, 5,14-16, 18, 20, 23-24). Habitualmente se toma como método de referencia lo sugerido por el CDC, esto es, sembrar las muestras en un caldo selectivo, como el de Todd Hewitt suplementado con gentamicina (8 μg/ml) o colistina (10 μg/ml) y ácido nalidíxico (15 μg/ml); estas guías también sugieren el uso de medios comerciales como el caldo TransVag suplementado con 5% de sangre desfibrinada de carnero o el caldo LIM (5). Los caldos deben incubarse durante 18-24 h a 35 ºC en atmósfera aeróbica o con 5% de CO2; luego se deben subcultivar en placas con agar sangre de carnero (ej. agar tripticasa soja con 5% de sangre desfibrinada de carnero), las cuales se deben inspeccionar a las 24 h y, si no se observan colonias sospechosas de S. agalactiae, se vuelven a incubar durante 24 h adicionales (5). Sin embargo, existen otras posibilidades que presentan el mismo rendimiento que la metodología citada o incluso mayor. Rosa-Fraile et al. (20) demostraron que el medio de Granada, en el que S. agalactiae presenta colonias de color naranja, tenía la misma sensibilidad en muestras vaginales y mayor sensibilidad en muestras vagino-rectales que la metodología propuesta por el CDC (7). Por otra parte, este medio disminuye el tiempo de informe en al menos 24 h y también la carga de trabajo del laboratorio, al hacer innecesario el uso de pruebas bioquímicas. Otros estudios presentaron datos similares a los citados (2, 15, 18, 20). Cabe aclarar que en el momento en que fue realizada esta investigación, no se disponía en la Argentina del medio comercial de Granada. Los resultados del presente estudio indican que el medio CR sembrado a partir del CTH-sel es significativamente más sensible que la metodología clásica. Además, y de



modo similar a lo encontrado por Rosa-Fraile et al. (20) respecto del medio de Granada, con esta metodología disminuyen los tiempos de informe en al menos 24 h, dado que no son necesarias las pruebas bioquímicas. La especificidad del medio CR considerando las colonias de color rojo ladrillo es de 100%; una observación importante es que no se deben tener en cuenta las colonias de color púrpura o rojo-blanquecinas, tal como indican las recomendaciones del fabricante. La menor sensibilidad del método clásico puede asociarse con la existencia de muestras donde un alto inóculo de enterococos o de bacilos gram negativos “enmascara” el crecimiento de S. agalactiae. La siembra directa en CR mostró una sensibilidad muy baja; no obstante ello, el valor predictivo positivo y la especificidad fueron excelentes y, al reducir en casi 48 h el tiempo de informe con respecto al método clásico, tendría importancia en los casos de urgencia. La indicación del fabricante es realizar el subcultivo del CTH-sel a CR. La sensibilidad del cultivo en placas de CR con 24 h de incubación fue significativamente menor que la correspondiente a las 48 h (42% versus 98,8%). Sin embargo, en el 42% de las pacientes ya se podría haber informado en ese momento el resultado positivo para S. agalactiae; esto significa una disminución de al menos 24 h con respecto al método propuesto por el CDC (7). Nuevamente es importante resaltar que no se debe dar un resultado negativo antes de las 48 h de incubación, lo que concuerda con las recomendaciones del fabricante. Las guías del CDC (2-8) establecen la necesidad de tomar tanto muestras vaginales como rectales para mejorar el rendimiento del cultivo. Esto también fue establecido por diversos estudios como el de García et al. (14), en el que además se documentó que las muestras de introito vaginal tenían un rendimiento significativamente mayor que las de fondo de saco vaginal. Los datos que se presentan aquí son coincidentes con lo publicado con anterioridad y demuestran que es absolutamente necesario contar con la muestra rectal y la vaginal. Sin embargo, nuestros datos discrepan del trabajo de García et al. antes citado, en el aspecto de que encontramos una diferencia importante a favor de la muestra rectal comparada con la vaginal; esto podría deberse a las diferencias en las metodologías empleadas o en las poblaciones estudiadas. Frente a la necesidad de disminuir costos, el CDC sugiere que los hisopos correspondientes a ambas muestras se pueden colocar en el mismo tubo de transporte, el cual puede mantener su viabilidad hasta 4 días a temperatura ambiente o a 4 °C (6, 7). Las muestras de endocérvix no se recomiendan, y no se debe utilizar espéculo para la obtención del material (5, 7). Este es el primer trabajo en el que se compara el rendimiento del medio CR a diferentes tiempos de incubación con la metodología propuesta por el CDC.



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En conclusión, la sensibilidad del medio CR sembrado desde el caldo de Todd Hewitt selectivo fue excelente en comparación con la calculada con la metodología propuesta por el CDC, de modo que dicha estrategia resulta recomendable siempre y cuando se incube hasta 48 h antes de descartar el material como negativo y se siembren tanto la muestra rectal como la vaginal. Los resultados positivos a las 24 h ya pueden ser informados, lo que podría ser relevante en algunos casos de urgencia. Agradecimientos: Los autores agradecen la colaboración brindada por los Servicios de Ginecología y Obstetricia del Hospital Naval “Cirujano Mayor Dr. Pedro Mallo” y del Hospital General de Agudos “Dr. Juan Fernández”. Rolando Soloaga se desempeña en la actualidad como Asesor de la Empresa Biomérieux Argentina.

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Recibido: 10/08/10 – Aceptado: 26/01/11

Diagnóstico de pseudotuberculosis por ELISA

 ISSN 0325-7541 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 9-17

ARTÍCULO ORIGINAL

D���������� esarrollo ��� de ���� una ������� prueba ��� de ������ ELISA ����� para ��������� detectar ������������ anticuerpos en carneros vacunados o infectados con Corynebacterium pseudotuberculosis JUAN J. SOLANET1, ROSANA MALENA2, SILVIA M. ESTEIN3, SILVIA ESTEVAO BELCHIOR4, FERNANDO A. PAOLICCHI2, 5* Residencia Interna en Salud Animal, Departamento de Producción Animal, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA); 2Laboratorio de Bacteriología, Departamento de Producción Animal, INTA Balcarce; 3Laboratorio de Inmunología, Departamento de Sanidad Animal y Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, Tandil; 4Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, Comodoro Rivadavia, Chubut; 5Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata, Balcarce, Argentina *Correspondencia. E-mail: [email protected] 1

RESUMEN El objetivo de este trabajo fue evaluar un ELISA indirecto desarrollado para medir la respuesta inmune humoral en carneros vacunados contra la linfoadenitis caseosa (LC) y/o desafiados con una cepa de Corynebacterium pseudotuberculosis homóloga. Se distribuyeron corderos de 4 meses clínicamente sanos en 4 grupos: grupo 1, corderos vacunados (G1, n = 5); grupo 2, corderos vacunados e inoculados (G2, n = 8); grupo 3, corderos inoculados (G3, n = 2); y grupo 4, control (G4, n = 2). Los animales del G1 y del G2 recibieron dos dosis de una bacterina experimental; los del G2 y del G3 fueron desafiados con una cepa de C. pseudotuberculosis cuatro semanas posvacunación. Se estudiaron por ELISA los títulos serológicos durante 7 meses y se efectuaron las necropsias en los grupos G2, G3 y G4. Se tomaron muestras de pulmón y linfonódulos para efectuar estudios bacteriológicos e histopatológicos. La cepa inoculada en los animales del G2 y del G3 reprodujo las lesiones macroscópicas y microscópicas típicas de la LC; ésta fue aislada del sitio de inoculación, de linfonódulos o de pulmón en 7/8 animales del G2 y en 2/2 animales del G3. La prueba de ELISA, con una sensibilidad del 98% y una especificidad del 100%, detectó diferencias significativas entre los serorreactores de los diferentes grupos experimentales y permitió establecer una relación con el tipo de tratamiento aplicado. Se concluye que el ELISA desarrollado puede ser una herramienta útil para identificar animales infectados y con clínica positiva a la LC. Palabras clave: linfoadenitis caseosa, Corynebacterium pseudotuberculosis, ELISA indirecto, ovinos

ABSTRACT Development of an ELISA test to detect antibodies in vaccinated sheep or infected Corynebacterium pseudotuberculosi� s. The aim of this study was to evaluate an indirect specific ELISA developed for the detection of humoral immune response in vaccinated sheep and/or challenged with a Corynebacterium pseudotuberculosis strain. Healthy 4 month-old lambs were distributed into 4 groups: Group 1 immunized (G1, n = 5), Group 2 vaccinated/inoculated (G2, n = 8), Group 3 inoculated (G3, n = 2) and Group 4 control (G4, n = 2). Groups G1 and G2 received two doses of an experimental bacterin. Four weeks postvaccination, G2 and G3 groups were challenged with a C. pseudotuberculosis strain. Serological titers were studied by ELISA for 7 months and pathological studies were performed in groups G2, G3 and G4 by taking lung and lymph node samples for bacteriology and histopathology. The inoculated strain in G2 and G3 animals reproduced the macroscopic and microscopic lesions typical of caseous lymphadenitis (CL) and was isolated from the inoculation site, lymph nodes and/or lung in 7/8 animals from G2, and 2/2 animals of G3. The developed ELISA test had sensitivity and specificity of 98% and 100% respectively, detected significant differences between serological reactors of different experimental groups and allowed to establish a relationship with the type of treatment. We conclude that the developed ELISA may be a useful tool to identify infected animals with positive clinical CL. Keywords: caseous lymphadenitis, Corynebacterium pseudotuberculosis, indirect ELISA, sheep

INTRODUCCIÓN En nuestro país, las existencias de ganado ovino han disminuido en forma notable en las últimas décadas; se estima que actualmente hay alrededor de 15,3 millones de cabezas. Sin embargo, con el advenimiento de la Ley

Ovina Nacional N° 25 422 se ha incrementado el interés productivo orientado hacia los ovinos de lana fina y de carne (18). Para que ese sector se expanda, es necesario que las majadas presenten una salud productiva óptima y que sean erradicadas las enfermedades que limitan el comercio nacional e internacional.

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La linfoadenitis caseosa (LC) o pseudotuberculosis ovina es una enfermedad infectocontagiosa ocasionada por Corynebacterium pseudotuberculosis, una bacteria que se caracteriza por producir lesiones caseosas-purulentas en los linfonódulos y en otros tejidos, como el pulmón (2, 24). Esta bacteria infecta principalmente a las especies ovina y caprina, aunque puede producir alteraciones en los linfonódulos de otras especies animales y también en el hombre (10). La LC provoca cuantiosas pérdidas en la industria ovina mundial, ocasionadas por la reducción en la ganancia de peso, el menor peso del vellón y la disminución de la eficiencia reproductiva y de la producción de leche y lana, así como por el decomiso de las canales y la depreciación de las pieles. Estos hechos impactan en las exportaciones, pues disminuyen las posibilidades de comercialización y el valor de las reses ovinas (1, 19). La LC es una enfermedad cosmopolita, ya que está presente en los cinco continentes y en casi todas las zonas geográficas definidas por la Organización Internacional de Epizootias (OIE) (24). En nuestro país se estima que existe una prevalencia cercana al 70% en áreas endémicas; asimismo, se han realizado algunos relevamientos parciales de la situación de LC en estudios de frigorífico (12, 15, 23). La transmisión de esta enfermedad se produce principalmente a través de las heridas provocadas durante la esquila con cuchillas contaminadas con el material purulento de los abscesos (13), aunque existe la posibilidad de infección a través del agua contaminada con el microorganismo en los baños antiparasitarios (25). La LC ha sido reconocida como una enfermedad zoonótica emergente y, aunque las infecciones en seres humanos son raras, pueden presentarse casos de LC adquirida por exposición ocupacional o a través de lesiones cutáneas por contacto con animales enfermos (10, 17, 20). C. pseudotuberculosis es un cocobacilo gram-positivo, de 1-3 μm largo x 0,5-0,6 μm ancho, que desarrolla en agar sangre dentro de las 48 a 72 h de incubación a 37 °C formando colonias blancas, rodeadas por una tenue ß-hemólisis (9, 12). Es un microorganismo intracelular facultativo (11, 12) que pertenece al filo Actinobacteria, orden Actinomycetales, suborden Corynebacterineae y a la familia Corynebacteriaceae. Posee varios factores de virulencia, entre ellos se incluyen glucolípidos y ácidos micólicos de la pared celular y las exoenzimas fosfolipasa D y esfingomielinasa. El análisis bacteriológico de la LC comprende la microscopía y la tinción de Gram y de Ziehl Neelsen y el cultivo de las muestras. La hemólisis sinérgica con Rhodococcus equi y la inhibición de la b-hemolisina de Staphylococcus aureus (CAMP y CAMP reversa) ponen en evidencia la producción de las exotoxinas de C. pseudotuberculosis. Además de los estudios clínicos, anatomopatológicos y bacteriológicos, existen otros métodos diagnósticos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las pruebas serológicas (7, 14). Diversos autores han aplicado

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estas últimas en el diagnóstico de LC en majadas, con resultados auspiciosos (3, 6). Para detectar la infección en ovinos por C. pseudotuberculosis mediante pruebas de ELISA se han empleado diferentes componentes antigénicos, tales como extractos de la pared celular y exotoxina purificada (fosfolipasa D) u obtenida de manera recombinante. En general, los métodos serológicos pueden presentar la desventaja de dar resultados falsos positivos por producirse reacciones cruzadas con otros microorganismos o cuando los animales han sido recientemente vacunados (12, 27). En Argentina no hemos registrado datos de relevamientos serológicos o de la aplicación de ELISA en el diagnóstico de LC en ovinos naturalmente infectados o desafiados con C. pseudotuberculosis. El objetivo de este trabajo fue desarrollar y evaluar un ELISA indirecto utilizando un antígeno nativo para medir los anticuerpos generados por la infección con C. pseudotuberculosis. Para ello se desarrolló un modelo experimental de infección controlada con la cepa homóloga, con el fin de estudiar la cinética de anticuerpos generada por el desafío o por la aplicación de una bacterina. Además, se procesaron por el ELISA indirecto sueros de animales negativos o positivos con lesiones y aislamientos de C. pseudotuberculosis provenientes de frigorífico.

MATERIALES Y MÉTODOS Animales Se utilizaron 17 carneros Corriedale de 4 meses, sanos, provenientes de una majada clínicamente libre de LC de la reserva ganadera N° 8 del INTA Balcarce, provincia de Buenos Aires. Los animales fueron distribuidos al azar en 4 grupos experimentales de la siguiente manera: grupo 1, vacunado (G1; n = 5), grupo 2, vacunado y desafiado (G2; n = 8), grupo 3, desafiado (G3; n = 2), y grupo 4, control sano (G4; n = 2). Los animales del G1 y G2 recibieron dos dosis de un inmunógeno experimental (bacterina). A las 4 semanas posvacunación, los carneros del G2 y G3 fueron desafiados mediante inoculación en el rodete coronario con una cepa virulenta de C. pseudotuberculosis. Reactivación de la cepa y prueba de patogenicidad A) Reactivación de la cepa La cepa indígena de C. pseudotuberculosis fue donada por el Centro Regional de Investigación y Desarrollo Tecnológico, Universidad Nacional Pontificia San Juan Bosco (Comodoro Rivadavia, Argentina). Dicha cepa pertenece a la colección del banco de cepas con denominación C. pseudotuberculosis cepa 15, tipificada por pruebas bioquímicas, moleculares (PCR) y secuenciación del gen 16S rDNA, con un 99% de homología con secuencias alineadas con las cepas de referencia C. pseudotuberculosis CIP102968T y C. pseudotuberculosis NCTC 3450 del GenBank. La cepa fue reactivada mediante pasaje por un carnero Corriedale de 3 años, clínicamente sano, con el objetivo de reaislarla y emplearla como cepa desafío. B) Pruebas de patogenicidad en carnero Para probar la patogenicidad de la citada cepa una vez reactivada e identificar el sitio más apropiado para la reproducción experimental de la LC, se la inoculó en diferentes sitios en un carnero adulto clínicamente sano, según 3 protocolos de infección experimental: I) en el espacio subcutáneo detrás de la oreja derecha (29), II) en el pliegue inguinal de la pata izquierda por escarificación de la piel (29), y III) en el tejido subcutáneo de la

Diagnóstico de pseudotuberculosis por ELISA zona interdigital de la pata derecha (7). Como inóculo se utilizó una suspensión bacteriana en una solución de tampón fosfato salino (PBS) pH 7,2; la concentración se ajustó según trabajos previos (7) utilizando la escala de McFarland. El inóculo se transportó refrigerado y al abrigo de la luz hasta el lugar donde se lo utilizó. Para el protocolo I se aplicó 1 ml del inóculo con una concentración de 7,25 x 108 UFC/ml. Para el protocolo II se escarificó la piel y se aplicó un hisopo que contenía alrededor de 10 colonias de la cepa tomadas directamente de la placa de cultivo. Por último, para el protocolo III se aplicaron 3 ml del inóculo con una concentración de 7,25 × 108 UFC/ml. El cálculo final de la concentración bacteriana de los inóculos empleados se efectuó mediante el recuento de microorganismos viables sobre agar Columbia base. A las cuatro semanas de la inoculación se realizó la necropsia del carnero, según el protocolo tradicional empleado en INTA. Se revisaron los órganos y se tomaron muestras de los linfonódulos poplíteo y prefemoral, de pulmón, de hígado y del material purulento formado en el espacio interdigital, para realizar estudios bacteriológicos. De acuerdo con los hallazgos clínicos, patológicos macroscópicos y de aislamiento bacteriano, se seleccionó el tejido subcutáneo de la zona interdigital de la pata derecha como el sitio más adecuado para realizar el desafío experimental, en coincidencia con el utilizado en otros trabajos. Inmunización de los animales Los animales de los grupos G1 y G2 fueron inmunizados a fin de conocer los títulos serológicos desarrollados posvacunación, para lo cual se aplicaron dos dosis de 3 ml de una bacterina no comercial, separadas por un intervalo de 4 semanas. La bacterina, compuesta por la cepa 15 de C. pseudotuberculosis inactivada con 0,5% de formol tamponado a pH 7,2 y formulada en hidróxido de aluminio, contenía antígeno somático de la citada cepa en una concentración de 10 mg/ml. Desafío de los animales A las 8 semanas del inicio del ensayo, los animales de los grupos G2 y G3 fueron desafiados con la cepa 15 de C. pseudotuberculosis. El inóculo para el desafío tuvo una concentración de 7,75 x 108 UFC/ml y fue aplicado en el tejido subcutáneo de la zona interdigital de la pata derecha. A los animales del G4 se les inyectó en el mismo sitio 3 ml de PBS estéril pH 7,2. Revisación clínica y toma de muestras Todos los animales fueron revisados desde el comienzo del ensayo y cada 15 días por palpación externa de los linfonódulos preescapulares, poplíteos y prefemorales, así como por inspección del sitio de inoculación, para comprobar lesiones clínicas de LC. Para la determinación de anticuerpos, en el G1 se realizaron sangrías cada 15 días desde el comienzo del ensayo (día 0) hasta los 45 días posvacunación, mientras que en los grupos G2, G3 y G4 se realizaron muestreos adicionales a los 90 días, y luego en 4 oportunidades más hasta los 200 días, momento de finalización del ensayo. Estudios bacteriológicos y patológicos Se realizó la necropsia de los animales de los grupos G2, G3 y G4 a las 28 semanas de iniciado el ensayo. Los ovinos del grupo G1 no fueron sometidos a necropsia al momento de finalizar el ensayo; sin embargo, fueron enviados a frigorífico 6 meses después y sus carcasas y órganos fueron inspeccionados a fin de estudiar la presencia de lesiones o reacciones vacunales adversas. Las muestras seleccionadas de los grupos G2, G3 y G4 correspondieron a los linfonódulos poplíteo, prefemoral, preescapular, pulmón, sitio de inoculación y contenido de los abscesos en los animales que presentaron estas lesiones. Las muestras se cultivaron en agar sangre Columbia a 37 °C con atmósfera de 10% de CO2 durante 48-72 h. Se observó la mor-

11 fología de las colonias desarrolladas; aquellas blanquecinas y puntiformes (0,5 mm), rodeadas de un halo tenue de b-hemólisis, se seleccionaron para efectuar la tinción de Gram y las siguientes pruebas bioquímicas: ureasa; catalasa; fermentación de glucosa, maltosa y ribosa; lactosa, manitol, sacarosa y xilosa; reducción de nitratos; hidrólisis de gelatina a 37 °C, movilidad; oxidasa y b-galactosidasa. Adicionalmente, se utilizaron las pruebas de hemólisis sinérgica a Rhodococcus equi (CAMP) y de inhibición de la b-hemolisina de Staphylococcus aureus para detectar la producción de fosfolipasa D (CAMP reversa) y así diferenciar a C. pseudotuberculosis de otras especies de Corynebacterium (11). Para efectuar los estudios patológicos, las muestras obtenidas de pulmón y linfonódulos se fijaron en formol tamponado al 10%, se incluyeron en parafina, se seccionaron (5 µm), se montaron en portaobjetos y se tiñeron con hematoxilina y eosina, según las técnicas histológicas de rutina. Serología por ELISA El antígeno empleado para sensibilizar las placas de ELISA fue elaborado con la misma cepa que se usó para el desafío. Ésta fue cultivada en 500 ml de caldo tripticasa soya (Difco, EE.UU.) durante 72 h a 37 °C en agitador orbital a 50 rpm. El cultivo se centrifugó a 10 000 g durante 30 min y el pellet obtenido se resuspendió en 10 ml de PBS pH 7,2; este paso se repitió 2 veces más. Finalmente se resuspendió el pellet en PBS formolado al 0,5% y se disgregó mediante un sonicador semiautomático (Sonic Vibra Cell, Mod VCX130, EE.UU.) utilizando el siguiente protocolo: tiempo, 15 seg; pulsos, 15/05; amplitud, 1 50%; tiempo total, 1 min 30 seg. Luego se determinó la concentración proteica utilizando el kit BCA™ Protein Assay (Pierce, Reino Unido). El antígeno se almacenó en alícuotas de 0,5 ml a -20 °C. Para el desarrollo del ELISA, se adsorbieron placas de 96 pocillos (NUNC Polysorp F-96; BATCH 054480) con 100 µl del antígeno por pocillo, a una concentración de 4 µg/ml. El antígeno se preparó en buffer carbonato/bicarbonato (15 mM de carbonato de sodio y 35 mM de bicarbonato de sodio) pH 9,6; se incubó durante toda la noche a 4 °C. Luego se añadió por duplicado a cada pocillo 100 µl de los sueros en estudio diluidos 1:200. Se utilizaron en cada placa dos sueros controles positivos de animales con lesiones y con cultivo positivo de C. pseudotuberculosis, además de un suero control negativo proveniente de un carnero sano sin inocular ni vacunar y negativo al cultivo de Corinebacterias. Se incubaron las placas durante toda la noche a 4 °C y se agregó el conjugado (100 µl) a cada pocillo en una dilución 1:3000 (Proteína G conjugada a peroxidasa, BioRad, USA). Las placas se incubaron luego a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, en cada pocillo se agregó 100 µl de una solución de trabajo de sustrato/cromógeno ABTS (2.2’-azino-di [3-etil-benzotiazolin sulfonato (6)] SIGMA), H2O2 30% y tampón citrato pH 4,5. Las placas se mantuvieron en agitación constante durante 10 minutos hasta el momento de lectura. La lectura de las placas se realizó en un espectrofotómetro (Multiskan, Labsystem, Finlandia) con un filtro de 405 nm, utilizando el programa ELISA 2.20. Para una mejor interpretación de la sensibilidad (Se) y especificidad (Es) del ELISA, los resultados, obtenidos en densidad óptica (DO), se expresaron como porcentaje de positividad (PP) aplicando la siguiente la fórmula: PP = (promedio DO suero problema/promedio DO control positivo) × 100

Para calcular la exactitud del ELISA se analizó la Se y la Es mediante el método de la curva ROC utilizando el programa MedCalc (Versión 4.1, 1995). El cálculo de la sensibilidad y la especificidad de la prueba se obtuvo tomando sueros positivos y negativos. El grupo positivo verdadero (A) estuvo representado por los sueros de los ovinos desafiados y enfermos de LC, con aislamiento de la cepa de C. pseudotuberculosis (G2 y G3) pasados los 30 días posdesafío (A1), y por los 48 sueros de ovinos con LC y aislamiento positivo de C. pseudotuberculosis

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provenientes de un frigorífico localizado en un área endémica del sur del país (A2). El grupo negativo verdadero (B) estuvo integrado por los sueros de los ovinos no inoculados (G4) y por 60 sueros de ovinos jóvenes y 40 de ovinos adultos, todos ellos clínicamente negativos a la LC y provenientes de la reserva nº 8 del INTA, libre de la enfermedad (B1), y por 244 sueros de ovinos sanos, sin aislamiento de C. pseudotuberculosis, provenientes de áreas geográficas libres de la enfermedad (B2). Análisis estadístico Se realizó un análisis de medidas repetidas en el tiempo utilizando el procedimiento Mixed de SAS. Para comparar las diferencias medias de los tratamientos entre grupos se aplicó el test de Tuckey y Kramer. Para la expresión de las densidades ópticas del ELISA se utilizó el logaritmo del resultado expresado en porcentaje de positividad (PP) del ELISA indirecto (SAS Institute Inc, SAS online DOC 9.1.3, Cary, NC: SAS Institute Inc, 2002-2005).

RESULTADOS Reactivación de la cepa y pruebas de patogenicidad La cepa 15 de C. pseudotuberculosis reaislada se cultivó en agar sangre base Columbia (Oxoid). Al cabo de 72 h se obtuvieron colonias pequeñas de 1 mm de diámetro, de color blanco y consistencia seca, rodeadas de un halo tenue de b-hemólisis. Las colonias correspondían a bacilos gram-positivos pequeños, agrupados en empalizadas, lo que es característico de las corinebacterias. Para la identificación bioquímica se utilizó el sistema API®Coryne estandarizado para la identificación de bacterias corineformes (API®Coryne, bioMérieux® S.A.). La cepa 15 de C. pseudotuberculosis inoculada en el carnero utilizado como preensayo produjo en los sitios de inoculación lesiones caseopurulentas características de LC a partir de la primera semana. Tres semanas posinoculación, el linfonódulo prefemoral derecho aumentó su tamaño 3 veces respecto del homólogo izquierdo,

mientras que a las 4 semanas fue afectado el linfonódulo poplíteo derecho. La necropsia realizada a las 10 semanas posinculación reveló lesiones macroscópicas típicas de LC en los linfonódulos poplíteo y prefemoral derechos, con aumento del tamaño de hasta 5 veces comparado con el normal. En el sitio de inoculación detrás de la oreja derecha, la lesión inicial se resolvió por encapsulación fibrosa, sin afectar los linfonódulos regionales. De los linfonódulos con lesiones caseopurulentas se obtuvieron cultivos puros de C. pseudotuberculosis. La histología reveló linfonódulos reactivos con fibroplasia, que contenían macrófagos, áreas de necrosis y mineralización, neutrófilos, células epitelioides y gigantes multinucleadas, observaciones que corroboran la patogenicidad de la cepa inoculada. Hallazgos clínico-patológicos posdesafío Entre la segunda y la tercera semana posinoculación se detectó un incremento del tamaño en el linfonódulo poplíteo derecho en los animales de los grupos G2 y G3, pero no en los animales de los grupos G1 y G4. Se realizaron las necropsias de los animales de los grupos G2, G3 y G4 a las 28 semanas de iniciado el ensayo. En 7 de 8 animales del grupo G2 se detectó un agrandamiento de 2 a 3 veces en los linfonódulos poplíteo y prefemoral derechos, los que contenían material caseopurulento. Ambos carneros del grupo G3 presentaron en el linfonódulo poplíteo derecho abscesos con áreas caseopurulentas; uno de ellos presentó focos caseosos en el hígado. La histología reveló lesiones microscópicas típicas de LC similares a las descritas en otros trabajos (22). Hallazgos bacteriológicos En la Tabla 1 se describen los aislamientos bacteriológicos obtenidos de los animales de los grupos G2 y

Tabla 1. Aislamiento de C. pseudotuberculosis a partir de tejidos afectados en los animales de los grupos experimentales G2 (vacunado / inoculado), G3 (inoculado) y G4 (control) Animal nº (grupo) 1 (G2) 3 (G2) 5 (G2) 7 (G2) 9 (G2) 11 (G2) 13 (G2) 15 (G2) 4 (G3) 8 (G3) 14 (G4)

Linfonódulo poplíteo

Linfonódulo prefemoral

Linfonódulo preescapular

Sitio de inoculación

Pulmón

Abscesos

+ + + - - + + - + + -

- - - - - - - - - - -

- - + - - - - - - + -

- - + - - - - - - + -

- - + - - - - + - + -

+ + + + -

Diagnóstico de pseudotuberculosis por ELISA

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Figura 3. Diagrama de dispersión. Porcentajes de positividad (PP) de los sueros positivos verdaderos y de los negativos utilizando el ELISA indirecto. Figura 1. Curvas de los anticuerpos desarrollados por los animales de los distintos grupos experimentales, expresados como porcentaje de positividad (PP) del ELISA. Las flechas claras indican el momento de aplicación de la primera y la segunda dosis de la bacterina en los grupos G1 (vacunado) y G2 (vacunado / inoculado). La flecha oscura indica el momento de la inoculación (G2 y G3). El grupo G4 ofició como control. Letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos (p < 0,001).

Figura 2. Área bajo la curva ROC del ELISA indirecto. El análisis arroja un valor de 0,999 (error estándar 0,004) que indica la sensibilidad y especificidad de la prueba y el porcentaje de positividad (PP) seleccionado como punto de corte (≥ 17,6%) para diferenciar entre sueros ovinos positivos y negativos.

G3 a partir de las muestras tomadas de los linfonódulos afectados, del sitio de inoculación, del pulmón y de abscesos hallados en el área posterior de la pierna y en el hígado. Además, se detallan los resultados obtenidos en los mismos órganos de las muestras tomadas de un animal del grupo G4.

Resultados serológicos. En la Figura 1 se muestran los resultados de los títulos de anticuerpos séricos de modo secuencial, cada 15 días, desde el día 0 hasta el día 200 (fin del ensayo) en los diferentes grupos de animales. El análisis mediante el programa Medcalc para la elaboración de la curva ROC y el punto de corte expresado en PP ajustó un valor de 17,6%, con un 98% de Se y un 100% de Es. En la Figura 2 (área bajo la curva ROC) y en la Figura 3 (diagrama de dispersión del PP de los sueros positivos y negativos) se observa la discriminación entre los animales serorreactores al ELISA (desafiados e infectados naturalmente con C. pseudotuberculosis) y los animales negativos verdaderos (controles y sanos), teniendo en cuenta la distribución del PP para ambas poblaciones. Los valores promedio del PP en los grupos G2 y G3 mostraron diferencias cuando se los comparó con los promedios en los animales controles negativos, con una media de 46,5% (desvío estándar 12,7) versus una media de 11,1% (desvío estándar 7,1) en la población de ovinos seropositiva y seronegativa, respectivamente. Los grupos G1, G2, G3 y G4 presentaron en promedio resultados por debajo del 17% al inicio del ensayo (día 0); sin embargo, al finalizar el ensayo (día de necropsia), el promedio en el PP de los animales del G2 y del G3 presentó un aumento de al menos 4 veces como resultado de la respuesta inmune humoral generada por el desafío con la cepa 15 de C. pseudotuberculosis (Tabla 3 y Figura 1). Se observó que en el grupo G1, dos animales presentaron un PP superior al punto de corte al finalizar el ensayo, quizá como producto residual del estímulo antigénico de la bacterina usada. En los animales del G2 se observó que 7 desarrollaron lesiones compatibles con LC y se aisló C. pseudotuberculosis de todos ellos; sin embargo, los 8 animales (100%) del grupo mostraron un PP mayor de 17,6% al final del ensayo. En los dos animales del G3 se encontraron lesiones de LC y aislamiento de C. pseudotuberculosis, y ambos presentaron un PP mayor de 17,6% que correspondió al máximo título alcanzado. Uno de los animales del grupo G4 murió durante el ensayo y fue excluido del

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Tabla 2. Resumen de los hallazgos clínico-patológicos, bacteriológicos y serológicos en los distintos grupos experimentales al final del ensayo Grupo Número (y %) de animales con Número (y %) de Número de serorreactores por (nº de animales) lesiones aislamientos obtenidos ELISA al final del ensayo tratamiento Macroscópicas Microscópicas PP < 17,6% PP > 17,6% G1 (n = 5) vacunado G2 (n = 8) vacunado / inoculado G3 (n = 2) inoculado G4 (n = 1) control

--

--

--

3

2

7 (87,5)

7 (87,5)

7 (87,5)

0

8

2 (100)

2 (100)

2 (100)

0

2

--

--

--

1

0

Tabla 3. Distribución de los animales de acuerdo con los títulos de los anticuerpos (obtenidos por ELISA indirecto y expresados en PP) al inicio del ensayo y a su finalización (día de la necropsia) en los distintos grupos experimentales Grupo (tratamiento) G1 (vacunado) G2 (vacunado/inoculado) G3 (inoculado) G4 (control)

Número de animales al inicio del ensayo con PP < 17,6 (promedio PP) > 17,6 (promedio PP)

Número de animales al día de la necropsia con PP < 17,6 (promedio PP) > 17,6 (promedio PP)

5 (11,6)

0

3 (11,3)

2 (23,6)

7 (9,91)

1 (20)

0

8 (51,1)

2 (5,75)

0

0

2 (45,95)

1 (15,6)

0

1 (16,15)

0

análisis. El PP promedio para los sueros analizados de las poblaciones negativas (244 ovinos sanos, 60 sueros de ovinos jóvenes y 40 de ovinos adultos) fue de 9,73%, mientras que el de las poblaciones positivas (48 sueros de ovinos de frigorífico) fue de 48%. En la Tabla 2 se detalla el número de animales en los diferentes grupos con lesiones macroscópicas y microscópicas y con aislamientos bacteriológicos. Asimismo, se indican los resultados por ELISA al finalizar el estudio, expresados como PP. En la Tabla 3 se detallan los promedios de PP en cada uno de los grupos de animales, tanto al inicio como al finalizar el ensayo.

DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en este trabajo preliminar demuestran la utilidad de un ELISA indirecto, tanto para el diagnóstico de ovinos infectados por el agente causal de la LC como para medir la capacidad inmunogénica de bacterinas elaboradas con cepas de C. pseudotuberculosis. En otros países con diferentes niveles de prevalencia de LC se han adaptado pruebas de ELISA para la identificación

de serorreactores a C. pseudotuberculosis, con resultados promisorios para su uso en majadas en el marco de programas de erradicación de la enfermedad (6, 8). La virulencia de la cepa indígena utilizada en este trabajo (Cepa 15 C. pseudotuberculosis) fue confirmada por el establecimiento de las lesiones patognomónicas de la enfermedad y por su progresión en la cadena linfática de drenaje del sitio de desafío seleccionado para la reproducción experimental. Los hallazgos clínico-patológicos y microscópicos en los tejidos afectados son coincidentes con hallazgos presentados por otros autores en casos clínicos de LC y en ensayos de desafío (4, 5, 21). Según la bibliografía consultada, en Argentina no existen registros de ensayos de reproducción experimental de la enfermedad mediante el desafío con C. pseudotuberculosis y posterior seguimiento de la respuesta inmunitaria humoral mediante ELISA, de modo que este es el primer reporte en nuestro país y podría constituir una base para futuros ensayos de protección vacunal y de inmunopatogenicidad en casos de LC. El sitio de inoculación experimental seleccionado para nuestros grupos de ovinos fue el más representativo des-

Diagnóstico de pseudotuberculosis por ELISA

de el punto de vista del desarrollo de la infección a través del sistema linfático y por las lesiones microscópicas y macroscópicas que produjo la inoculación de la cepa indígena. A su vez, permitió simular la infección natural mediante inoculación de C. pseudotuberculosis y establecer un grado de enfermedad subagudo/crónico, con desarrollo de lesiones típicas y cultivos positivos en linfonódulos u otros órganos, sitios frecuentes de aislamiento de C. pseudotuberculosis en casos clínicos (28). La reproducción experimental con este modelo de infección con C. pseudotuberculosis en ovinos nos permitió obtener sueros controles positivos verdaderos para realizar las pruebas preliminares de Se y Es del ELISA desarrolado, a la vez que demostró la utilidad del modelo experimental en estudios de patogenia y microbiológicos de LC. En este ensayo se logró cultivar exitosamente C. pseudotuberculosis a partir de las muestras del sitio de inoculación y de los linfonódulos de los carneros, pero también de otros órganos como el pulmón, lo que ratifica la virulencia especie-específica de la cepa indígena. Una observación de interés fue que el cultivo de órganos de los grupos experimentales no presentó aislamientos de otros microorganismos productores de abscesos o lesiones similares a las de la LC, como se ha descrito en casos naturales con aislamiento de Arcanobacterium pyogenes, Nocardia brasiliensis o Staphylococcus aureus, entre los más importantes (6). La dosis de desafío utilizada en nuestro trabajo fue adecuada para la reproducción experimental de la enfermedad y también para generar anticuerpos detectables por ELISA, tempranamente y durante los 6 meses del ensayo. Otros autores han usado dosis de desafío más bajas, del orden de 4,7 x 105 células viables de C. pseudotuberculosis, con refuerzos de desafío mediante dosis de 5,3 x 108 células viables, y obtuvieron resultados similares a los nuestros en la reproducción experimental de la LC (6). Usando dosis de desafío con 104 células viables, Fontaine y Baird (13) obtuvieron un modelo experimental de LC con establecimiento de lesiones y cultivos positivos en múltiples linfonódulos y en el pulmón. El ELISA indirecto desarrollado y probado en este ensayo mostró una Se de 98% y una Es del 100%. Este resultado preliminar es comparable con los informados en pruebas de ELISA descritas en trabajos previos sobre diagnóstico de LC (3, 6, 26, 27). Aplicando un sistema de extracción de antígeno similar al usado en nuestro trabajo, otros autores lograron desarrollar un ELISA para la detección de anticuerpos anti-C. pseudotuberculosis que, después de validado, resultó tener una Se del 83%, valor comparable con el obtenido con otras técnicas de ELISA indirecto desarrolladas para el diagnóstico de la LC (3). Se ha sugerido que el uso de exotoxina o de antígenos secretados en cultivos de C. pseudotuberculosis condujeron a los mejores resultados, en los que se alcanzó una Se de 72% y una Es de 67% frente a pruebas de ELISA con diferentes

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tipos de antígenos para diagnóstico de LC (6). Utilizando la exotoxina purificada de C. pseudotuberculosis, nuestro grupo obtuvo recientemente resultados de Se y Es semejantes a los descritos en este trabajo cuando fue utilizado antígeno crudo enfrentado a los mismos sueros ovinos estudiados (datos no mostrados). Por estos resultados, es probable que el antígeno crudo utilizado en las pruebas de ELISA indirecto que describimos en este trabajo tuviera un porcentaje no conocido de exotoxina que haya contribuido a maximizar los resultados obtenidos con sueros de animales desafiados con C. pseudotuberculosis. Dercksen et al. (8) desarrollaron un ELISA doble anticuerpo para la detección de la infección con C. pseudotuberculosis y lograron así mejorar la sensibilidad respecto de otras pruebas. Se alcanzó una Se de 94% y una Es de 98% con sueros de caprinos infectados, mientras que en las pruebas con sueros de ovinos, la Se y la Es alcanzadas fueron de 99% y 79%, respectivamente. Según los citados autores, estos ensayos sirvieron para establecer una prueba adecuada para ser empleada en programas de erradicación de áreas endémicas de LC. En nuestro ensayo, luego del desafío los animales vacunados con la bacterina desarrollaron mayores niveles de anticuerpos y más precozmente que aquellos animales que sólo fueron desafiados. Esto sugiere que la memoria inmunológica de los vacunados permitió desarrollar una respuesta humoral secundaria más rápida y potente frente a los componentes bacterianos presentes en la cepa utilizada para el desafío, en coincidencia con los resultados obtenidos por otros autores (16). En otros trabajos en los que se aplicaron dosis repetidas para el desafío con C. pseudotuberculosis, se incrementó la respuesta serológica de los animales desafiados y mejoró así la detección de anticuerpos por los métodos inmunológicos (6). Mediante el test de Tuckey y Kramer se logró identificar una diferencia significativa (p < 0,001) entre los grupos experimentales; esto permite concluir que los resultados variaron a lo largo del tiempo por efecto del tratamiento y no debido al azar. Como se observa en la Figura 1, no se detectaron diferencias en los PP entre los grupos hasta el día 60 del ensayo. Sin embargo, a partir de la fecha de desafío se observó una diferencia significativa (p < 0,001) entre el grupo control (G4) y los grupos G2 y G3, aunque entre estos dos últimos no hubo diferencia significativa hasta el final del ensayo. La técnica de ELISA permitió diferenciar animales positivos de negativos, ya que los resultados promedio en PP de los infectados estuvieron al menos 4 veces por encima de los valores correspondientes a los animales negativos. De acuerdo con estos resultados, la técnica de ELISA indirecto desarrollada en este trabajo permitiría distinguir entre animales sanos y enfermos de LC, y sería un indicador de infección útil para analizar majadas en áreas endémicas de LC.

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Si bien esta prueba de ELISA discriminó con una buena Se y Es entre poblaciones positivas y negativas dentro de un esquema de infección experimental con C. pseudotuberculosis, sería necesario continuar con los estudios aplicando el ELISA en poblaciones ovinas naturalmente infectadas con el microorganismo. Otros autores sugirieron que los animales menores de 6 meses no desarrollarían títulos serológicos suficientemente altos para ser detectados por pruebas diagnósticas debido a una débil respuesta inmune a la infección con C. pseudotuberculosis (6). Utilizando un ELISA con exotoxina como antígeno, estos investigadores demostraron que los animales adultos mayores de 20 meses conformarían la categoría adecuada para analizar dentro de un programa de erradicación. Los resultados de nuestro trabajo experimental mostraron que una vez infectados, los animales jóvenes pueden desarrollar una rápida respuesta inmune, adecuada para ser medida por ELISA. Un aspecto de importancia que cabe considerar en majadas ovinas es la presencia de otras enfermedades, como listeriosis o paratuberculosis, ya que éstas en circunstancias subclínicas podrían causar reacciones cruzadas que interferirían con el diagnóstico por ELISA de LC (8). Actualmente estamos trabajando para validar la técnica de ELISA indirecta aquí descrita mediante la evaluación de un mayor número de animales provenientes de áreas endémicas afectadas de LC enviados a frigorífico. Dichos estudios serán completados con el análisis de sueros ovinos de establecimientos con diferente prevalencia clínica de LC. Futuros estudios en los que se evalúe la respuesta inmune celular podrían contribuir a completar los protocolos de diagnóstico de LC en ovinos. Agradecimientos: Los autores agradecen a los Dres. Germán Cantón y Eduardo Sánchez y a los Sres. José Llamas, Sergio Dinino y Jorge Lali por la colaboración en el desarrollo del trabajo. A los Dres. Adolfo Casaro, Ernesto Spath y María Andrea Fiorentino y a la Sra. Adriana Cano por la colaboración en el análisis de los resultados.

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Recibido: 13/04/10 – Aceptado: 20/01/11

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Revista Argentina de Microbiología (2011) 18-23 ISSN 43: 0325-7541 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 18-23

ARTÍCULO ORIGINAL

Etiología bacteriana de la neumonía nosocomial y resistencia a los antimicrobianos en pacientes con y sin tratamiento antimicrobiano previo BEATRIZ WEYLAND*, BEATRIZ PERAZZI, SUSANA GARCIA, CARLOS RODRÍGUEZ, CARLOS VAY, ANGELA FAMIGLIETTI Laboratorio de Bacteriología, ��������������������������� Departamento de Bioquímica Clínica, ��������� Hospital ������������ de Clínicas ��������� “José ������� de ��� San ���� Martín”, �������� Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Córdoba 2351, CP: 1120, Capital Federal, Argentina *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN La neumonía nosocomial (NN) se asocia a una elevada morbimortalidad y es la segunda causa de infección intrahospitalaria después de la infección urinaria. El objetivo de este trabajo fue conocer la etiología de la NN en adultos y evaluar el perfil de resistencia a los antimicrobianos de los microorganismos aislados teniendo en cuenta si los pacientes recibieron o no tratamiento antimicrobiano previo. Desde el año 2000 hasta el 2005 se analizaron 430 lavados broncoalveolares provenientes de 430 pacientes adultos con diagnóstico de neumonía internados en la unidad de cuidados intensivos del ��������������������� Hospital de Clínicas ����������������������������� “José de San Martín”��������� . El 74% ������������������������������� (199/269) de los pacientes con tratamiento previo tuvieron cultivos positivos, mientras que en el grupo sin tratamiento previo esta proporción fue del 83% (134/161) (p = 0,03). Los microorganismos prevalentes fueron Acinetobacter spp., Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa (37,9%; 21,3% y 20,9% vs. 36,1%; 26,6% y 17,7% en los pacientes con tratamiento previo o sin él, respectivamente; p > 0,05). La resistencia a los antimicrobianos de los citados microorganismos cuando los aislamientos provinieron de pacientes que recibieron antes tratamiento antibiótico fue superior a la encontrada en el grupo de pacientes que no recibió tratamiento previo (p < 0,05), excepto en el caso de la resistencia a la trimetoprimasulfametoxazol por parte de S. aureus (p = 0,29). En conclusión, el tratamiento antimicrobiano previo no modificó la etiología de la NN, pero sí provocó un aumento global de la resistencia a los antimicrobianos y un menor porcentaje de cultivos positivos. Palabras clave: etiología, neumonía nosocomial, UCI, resistencia antimicrobiana

ABSTRACT Bacterial etiology of nosocomial pneumonia and antimicrobial resistance in patients with and without antimicrobial treatment. Nosocomial pneumonia (NP) is associated with high ���������������������������������������� morbimortality, ������������������������ representing the second cause of nosocomial infection after urinary tract infection. The objective of this work was to become acquainted with the etiology of NP and to evaluate the antimicrobial resistance profile of the isolated microorganisms from adult patients with and without previous antimicrobial treatment admitted in the intensive care unit (ICU). From 2000 to 2005, 430 �������������������������������������������������������������������������������������������������������������� bronchoalveolar����������������������������������������������������������������������������������������������� lavages from 430 adult patients diagnosed with pneumonia admitted in the ICU were analyzed. Seventy-four percent (199/269) of the patients with previous treatment had positive cultures, whereas in the group without previous treatment the percentage was 83% (134/161) �(p = 0,03)����������������������������������������������� . The main agents in both groups of patients were: Acinetobacter spp. (37.9% vs 36.1%), Staphylococcus aureus (21.3% vs 26.6%) and Pseudomonas aeruginosa (20.9% vs 17.7%), respectively (p > 0,05). The antimicrobial resistance in Acinetobacter spp., P������������� . aeruginosa and S. aureus� from previously treated patients was higher than that from patients without previous antimicrobial treatment �(p < 0,05), except in the case of trimethoprim-sulfamethoxazole in S. aureus (p = 0,29). ������������������������������� In conclusion, previous antimicrobial treatment did not modify the etiology of NP, but caused an increase in overall antimicrobial resistance and a lower percentage of positive cultures. Key words: etiology, nosocomial pneumonia, ICU, antimicrobial resistance

INTRODUCCIÓN La neumonía nosocomial (NN) es la principal causa de muerte por infecciones adquiridas en el ámbito hospitalario y la segunda en frecuencia luego de la infección urinaria (7, 21). En las unidades de cuidados intensivos (UCI) representa la causa más frecuente de infección intrahospitalaria y se asocia con una elevada morbimortalidad. Aproximadamente el 81% de los episodios

de neumonía nosocomial ocurren durante la ventilación mecánica y la mortalidad puede alcanzar hasta un 76% (3, 10, 22). La asistencia respiratoria mecánica y la instrumentación de las vías aéreas rompen las barreras naturales y favorecen la aspiración de microorganismos (9). Lo mismo ocurre frente a traumatismos y con el uso de sondas nasogástricas. La obstrucción de las vías aéreas predispone a la infección respiratoria por la falta de eliminación de las secreciones orales, con el consiguiente

Etiología y resistencia bacteriana de la neumonía nosocomial

desarrollo bacteriano. Otros factores de riesgo de adquirir neumonía son la edad avanzada, la enfermedad pulmonar crónica y la internación previa (2, 5, 18, 24, 25). Conocer la prevalencia de microorganismos y la sensibilidad a los antimicrobianos en los centros asistenciales permite utilizar una terapia antimicrobiana adecuada, lo que se relaciona con una mayor supervivencia de los pacientes. El objetivo de este trabajo fue conocer la etiología de la NN en la UCI del� Hospital ��������������������� de Clínicas “José �������������� de San Martín”� y��������������������������������������������������� evaluar el perfil de resistencia a los antimicrobianos de los aislamientos obtenidos de pacientes adultos que habían recibido tratamiento antimicrobiano previo en comparación con aquellos que no lo habían recibido.

PACIENTES Y MÉTODOS El presente es un análisis retrospectivo basado en el estudio de 443 lavados broncoalveolares (LBA) enviados al laboratorio de Bacteriología entre enero de 2000 y diciembre de 2005. Estos correspondieron a 443 pacientes adultos internados en la UCI del Hospital de Clínicas “José de San Martín”, con diagnóstico de NN. La mediana de edad fue 72 años (intervalo: 20-96), 239 pacientes eran de sexo femenino. Se definió como neumonía nosocomial toda infección iniciada 48 horas después del ingreso al ámbito hospitalario que cumpliera con los criterios especificados a continuación. Clínicos: presencia de fiebre o de hipotermia (temperatura ≥ 38 °C o ≤ 35 °C, respectivamente), secreciones traqueobronquiales purulentas y leucocitosis o leucopenia. Radiológicos: presencia de infiltrados pulmonares nuevos o progresivos visibles en la radiografía de tórax. Microbiológicos: aislamiento de un patógeno en una muestra de LBA representativa (13). Se consideró como muestra de LBA representativa a aquella con menos del 1% de células epiteliales escamosas, presencia de macrófagos alveolares y al menos un 10% de neutrófilos. La presencia de células ciliadas bronquiales en elevada cantidad representó un marcador de contaminación del tracto respiratorio superior; estas muestras se excluyeron del estudio. Se consideró significativo un recuento de cada morfotipo bacteriano ≥ 103 en el caso de pacientes con tratamiento antimicrobiano previo y ≥ 104 UFC/ml en el caso de pacientes sin tratamiento previo. Las muestras fueron procesadas por técnicas cuantitativas. La prueba de sensibilidad a antimicrobianos se realizó por el método semicuantitativo de Marcenac et al. (15), ensayando ampicilina, ampicilina-sulbactama, piperacilina, piperacilina-tazobactama,

19 ceftriaxona, ceftacidima, cefepima, imipenem, meropenem, amicacina, gentamicina, colistina, trimetoprima-sulfametoxazol (TMS) y ciprofloxacina frente a bacilos gram negativos, y ampicilina, ampicilina-sulbactama, oxacilina, gentamicina, eritromicina, rifampicina, minociclina, TMS, ciprofloxacina, vancomicina y teicoplanina frente a cocos gram positvos. Para comparar las frecuencias relativas de microorganismos y los porcentajes de resistencia a los diferentes antimicrobianos en ambos grupos de pacientes se utilizó la prueba de Chi cuadrado (c2) Yates. Se consideró significativo un valor de p < 0,05.

RESULTADOS Durante el período 2000-2005 se analizaron 443 LBA, de los cuales se excluyeron 13 que no cumplieron con los criterios de inclusión. De los 430 LBA analizados, el 78% (334/430) originaron cultivos positivos, el 46% de ellos (154) produjeron cultivos mixtos. El total de aislamientos obtenidos fue de 435, lo que representa una relación de 1,3 aislamientos/paciente. El 83% de los pacientes recibían asistencia respiratoria mecánica. De los 430 pacientes estudiados, 269 correspondieron al grupo que recibió tratamiento antimicrobiano previo y 161 al grupo sin tratamiento previo. En el primer grupo, 99 sujetos (37%) habían recibido un antimicrobiano (por lo general, una cefalosporina de tercera generación), 145 individuos (54%) habían recibido dos antimicrobianos (en su mayoría, la combinación vancomicina/imipenem) y 25 (9%) más de dos antimicrobianos. El 74% de estos pacientes (199/269) tuvieron cultivos positivos; mientras que en el grupo de enfermos sin tratamiento previo el 83% (134/161) presentaron cultivos positivos (p = 0,03) (Figura 1). Los cultivos fueron mixtos en el 46% y 45% de los grupos, respectivamente (p = 0,92). Los microorganismos prevalentes tanto en pacientes con tratamiento antimicrobiano previo como en aquellos que no habían recibido tratamiento previo fueron Acinetobacter spp., Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa (37,9%; 21,3% y 20,9% vs. 36,1%; 26,6% y 17,7% en los pacientes con tratamiento previo o sin él, respectivamente). No se observó una diferencia estadísticamente significativa

Figura 1. Resultados de los cultivos de lavados broncoalveolares en pacientes con tratamiento antimicrobiano previo o sin él.

20

Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 18-23 Tabla 1. Frecuencia relativa de microorganismos aislados de lavados broncoalveolares de pacientes con y sin tratamiento antimicrobiano previo Microorganismo n

con ATM previo sin ATM previo n (%) n (%)

Acinetobacter spp. 162 105 Staphylococcus aureus 101 59 Pseudomonas aeruginosa 86 58 Klebsiella pneumoniae 18 10 Tribu Proteae(1) 18 12 Otros BNF(2) 12 10 Serratia marcescens 11 9 Enterobacter spp. 8 3 Escherichia coli 5 4 Streptococcus pneumoniae 5 1 Haemophilus influenzae 4 3 ECN 3 1 Enterococcus faecalis 2 2 Totales 435 277

(37,9) 57 (36,1) (21,3) 42 (26,6) (20,9) 28 (17,7) (3,6) 8 (5,1) (4,3) 6 (3,8) (3,6) 2 (1,3) (3,2) 2 (1,3) (1,1) 5 (3,1) (1,4) 1 (0,6) (0,4) 4 (2,5) (1,1) 1 (0,6) (0,4) 2 (1,3) (0,8) 0 (100) 158 (100)

p 0,78 0,26 0,49 0,63 0,98 0,26 0,34 ND ND ND ND ND ND

n: número de aislamientos obtenidos; ATM: antimicrobianos; ECN: estafilococos coagulasa negativos; ND: no determinado. (1) Incluye: P. mirabilis (9), Providencia spp. (5) y Morganella morganii (1) (2) Stenotrophomonas maltophilia (10) y Burkholderia cepacia (2)

Tabla 2. Resistencia a los antimicrobianos de los aislamientos de Acinetobacter spp. y P. aeruginosa recuperados de lavados broncoalveolares provenientes de pacientes con tratamiento antimicrobiano previo o sin él. Antimicrobiano

Acinetobacter spp. con ATM sin ATM previo previo (n: 105) (n: 57) p N (%) N (%)

Ampicilina-sulbactama (2/1) 96 (91,4) Piperacilina ND Piperacilina-tazobactama (7/1) 98 (93,3) Ceftacidima 98 (93,3) Cefepima 96 (91,4) Imipenem 70 (66,6) Meropenem 57 (54,2) Amicacina 91 (86,6) Gentamicina 83 (79,0) Colistina 1 (0,9) Trimetoprima-sulfametoxazol (12,5/50) 92 (87,6) Ciprofloxacina 97 (92,3)

22 (38,5) ND 30 (52,6) 32 (56,1) 34 (59,6) 21 (36,8) 15 (26,3) 34 (59,6) 28 (49,1) 0 31 (54,3) 34 (59,6)

8 ≤ 0,03 ≤ 0,03 95,2 0 Metronidazol ≤ 0,125-2 1 1 100 0 Azitromicina ≤ 0,06-16 ≤ 0,06 2 82 0 Porphyromonas spp. (N=10)(3) Ampicilina ≤ 0,25-0,25 ≤ 0,25 ≤ 0,25 100 0 Ampicilina-sulbactama ≤ 0,25 ≤ 0,25 ≤ 0,25 100 0 Cefoxitina ≤ 0,125-2 ≤ 0,125 0,5 100 0 Ceftriaxona ≤ 4 ≤ 4 ≤ 4 100 0 Imipenem 0,03-0,25 0,125 0,25 100 0 Piperacilina ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1 100 0 Piperacilina-tazobactama ≤ 0,06 ≤ 0,06 ≤ 0,06 100 0 Clindamicina ≤ 0,03-8 ≤ 0,03 ≤ 0,03 90 0 Metronidazol ≤ 0,125-0,5 0,25 0,25 100 0 Azitromicina ≤ 0,06-0,125 ≤ 0,06 0,125 100 0 Clostridium difficile (N=10) Ampicilina 2--4 2 4 0 0 Cefoxitina 4->16 >16 >16 10 0 Ceftriaxona 16-128 64 128 10 10 Imipenem 0,25-16 4 8 50 40 Piperacilina ≤ 1-8 4 8 100 0 Piperacilina-tazobactama 1-8 4 8 100 0 Clindamicina 0,5-16 16 16 30 10 Metronidazol 0,25-2 0,5 1 100 0 Otros Clostridium spp. (N=12)(4) Ampicilina ≤ 0,25-2 0,5 1 75 16,6 Ampicilina-sulbactama ≤ 0,125-0,5 ≤ 0,125 0,25 100 0 Cefoxitina ≤ 0,25-2 0,5 1 100 0 Ceftriaxona ≤ 0,125-64 0,5 4 91,6 0 Imipenem 0,03-0,25 0,06 0,25 100 0 Piperacilina ≤ 1-16 ≤ 1 ≤ 1 100 0 Piperacilina-tazobactama ≤ 0,06-4 ≤ 0,06 0,5 100 0 Clindamicina ≤ 0,125->32 0,5 8 75 8,3 Metronidazol 0,125-4 1 2 100 0 Cocos gram positivos (N=22)(5) Ampicilina ≤ 0,25-8 ≤ 0,125 1 86,3 4,5 Ampicilina-sulbactama ≤ 0,125-32 ≤ 0,125 4 95,4 0 Cefoxitina ≤ 0,125-16 ≤ 0,125 4 100 0 Ceftriaxona ≤ 0,125-8 ≤ 0,125 2 100 0 Imipenem ≤ 0,004-0,5 0,015 0,5 100 0 Piperacilina ≤ 0,5-16 ≤ 0,5 2 100 0 Piperacilina-tazobactama ≤ 0,06-16 ≤ 0,06 2 100 0 Clindamicina ≤ 0,03->32 0,5 2 95,4 0 Metronidazol ≤ 0,125-2 0,5 1 100 0 Azitromicina ≤ 0,125->32 1 >32 41 9

Resistente 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36 0 0 8,3 0 0 0 0 8,3 0 46 42,8 0 0 0 0 0 0 4,7 0 18 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 100 90 80 10 0 0 60 0 8,3 0 0 8,3 0 0 0 16,6 0 9 4,5 0 0 0 0 0 4,5 0 50

N: número total de aislamientos evaluados (1) F. necrophorum (n=6), F. mortiferum (n=4), F. varium (n=2), (2)P. intermedia/nigrescens (n=11), Prevotella spp. (n=4), P. denticola (n=2), P. melaninogenica (n=2), P. oralis (n=1), P. oris (n=1), (3)P. asaccharolytica (n=8), P. gingivalis (n=1), Porphyromonas sp. (n=1), (4)C. perfringens (n=7), C. sordellii (n=2), C. cadaveris (n=1), C. paraputrificum (n=1), C. tertium (n=1), (5)Peptostreptococcus spp. (n=14), P. anaerobius (n=8), (6)Para la azitromicina se utilizaron los puntos de corte de Streptococcus pneumoniae (CLSI 2006, en µg/ml): sensible ≤ 0,5, intermedio = 1, resistente ≥ 2.

Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad

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Tabla 6. Actividad in vitro de 12 antimicrobianos frente a 52 aislamientos de Clostridium difficile Antibióticos

Rango (µg/ml) MIC50

CIM (µg/ml) Categoría (%)(1) MIC90 Modo Resistente Intermedio Sensible

b-lactámicos Ampicilina Piperacilina Piperacilina-tazobactama Ceftriaxona Imipenem

≤ 0,06 - 4 4 - >64 0,5 - >64 1 - >128 ≤ 0,06 - 16

0,5 32 16 16 4

2 >64 64 64 8

0,5 32 32 16 4

13 15 10 21 2

23 13 15 17 12

64 72 75 62 86

No b-lactámicos Vancomicina Teicoplanina Metronidazol Clindamicina Moxifloxacina Azitromicina Tigeciclina

0,125 - 2 ≤ 0,03 - 2 ≤ 0,125 - 2 0,25 - >64 0,25 - 16 0,25 - >64 ≤ 0,016- 0,03

0,5 0,125 0,5 64 4 32 ≤ 0,016

1 0,125 1 >64 16 >64 0,03

0,5 0,125 1 >64 16 >64 ≤ 0,016

0 0 0 58 52 56 0

0 0 0 11 13 10 0

100 100 100 31 35 35 100

Se utilizaron los puntos de corte de Staphylococcus spp. (CLSI 2006, en µg/ml) para la vancomicina (sensible ≤ 2, intermedio 4 - 8, resistente ≥ 16) y para la teicoplanina (sensible ≤ 8, intermedio = 16, resistente ≥ 32); para la tigeciclina se emplearon los puntos de corte propuestos por la Food and Drug Administration (sensible ≤ 2, intermedio = 4, resistente ≥ 8). (1)

que responde a objetivos epidemiológicos y clínicos específicos (4-6, 11, 21, 29, 30, 39, 49). 3.1. Fines epidemiológicos 3.1.1. Realizar la vigilancia en forma periódica, institucional y multicéntrica, con alcance local y regional, a fin de conocer los patrones de sensibilidad y detectar las resistencias emergentes con el objeto de orientar y eventualmente modificar los esquemas terapéuticos empíricos. 3.1.2. Evaluar nuevos agentes antimicrobianos. 3.2. Fines clínicos 3.2.1. La mayoría de las infecciones por anaerobios son polimicrobianas y el éxito del tratamiento involucra la combinación de intervenciones quirúrgicas (drenaje y desbridamiento) con el uso de terapia empírica de amplio espectro. Se justifica la realización de la prueba de sensibilidad ante el aislamiento de bacterias anaerobias en forma monomicrobiana o polimicrobiana de infecciones con focos endovasculares y/o que requieren tratamiento médico prolongado, y en las que la asistencia quirúrgica no siempre es posible. Tal es el caso de los abscesos hepáticos pequeños y múltiples, los abscesos en el SNC, en el pulmón u otros, las endocarditis, las osteomielitis y las bacteriemias refractarias al tratamiento. 3.2.2. Ante el aislamiento de bacterias anaerobias con probada resistencia a los antibióticos de elección y/o reconocida patogenicidad.



3.2.3. Ante el aislamiento de microorganismos infrecuentes, con perfiles de sensibilidad desconocidos o impredecibles.

4. CÓMO REALIZAR LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD 4.1. Consideraciones generales El método de referencia recomendado por el CLSI documento M11-A7 2007 (12) es la dilución en agar o método de Wadsworth. Otros métodos aprobados por este organismo son la microdilución en caldo y la detección de b-lactamasa. La prueba por medio de tiras con gradiente de concentración de antibióticos está sugerida como una alternativa más simple y rápida para el uso de rutina en el laboratorio clínico. La elución con discos es el método recomendado por la SBA como tamizaje para los organismos de crecimiento rápido (6). El D-test es de utilidad en cocos gram positivos para la detección del fenotipo de resistencia iMLS (44). El medio de cultivo utilizado debe asegurar el adecuado desarrollo del microorganismo en estudio. Las CIM de los microorganismos utilizados como control de calidad deben estar dentro del rango de aceptación para cada antimicrobiano. Con el fin de lograr la reproducibilidad y confiabilidad de los resultados, la SBA recomienda seguir cuidadosamente las normas descritas en este documento. 4.2. Preparación del inóculo 4.2.1. Suspensión directa de colonias: se prepara una suspensión equivalente al patrón 0,5 de

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la escala de Mc Farland y al patrón 1 para el método epsilométrico a partir de colonias en agar Brucella suplementado, o en cualquier otro agar que permita el crecimiento del microorganismo a las 24 a 48 horas de incubación. Las placas no deben exponerse más de 30 minutos a la atmósfera aeróbica para evitar células no viables en la suspensión. 4.2.2. Método de crecimiento en medio líquido: con microorganismos de crecimiento rápido como los del grupo Bacteroides fragilis o Clostridium spp., el inóculo se puede preparar a partir de un caldo Brucella incubado durante 6 a 24 horas en atmósfera anaeróbica o con una suspensión del microorganismo a partir de placas de 48 horas de incubación. Luego se ajusta la turbidez a una densidad equivalente al patrón 0,5 de la escala de Mc Farland. 4.3. Atmósfera y tiempo de incubación Para las pruebas de sensibilidad, las muestras se incuban en atmósfera anaerobia (< 1% de O2 y 4-7% de CO2) durante 48 horas. La atmósfera anaerobia puede lograrse en la cámara anaerobia (10% H2 - 5% CO2 - 85% N2) o en jarras utilizando generadores comerciales. Se debe incluir un indicador de óxidoreducción como control de calidad de la anaerobiosis, la cual es indispensable para el desarrollo de los microorganismos y fundamental para que actúe el metronidazol. 4.4. Métodos para evaluar la sensibilidad de las bacterias anaerobias a los antimicrobianos 4.4.1. Dilución en agar 4.4.2. Microdilución en caldo 4.4.3. Epsilométrico 4.4.4. Elución en caldo con discos 4.4.5. Detección de b-lactamasas 4.4.6. D-test: prueba de difusión con doble disco 4.4.1. Dilución en agar Es el método de referencia. Permite evaluar prácticamente a todas las especies de anaerobios, aunque se debe tener presente que aquellas que invaden el medio pueden generar interferencias en la lectura de los resultados. Es un método laborioso que permite probar simultáneamente un gran número de aislamientos, dependiendo de la capacidad del multiinoculador empleado. Es el método utilizado para validar otros métodos y para probar nuevas drogas. Es útil para realizar los estudios de vigilancia. Medio de cultivo: agar Brucella suplementado con 5 µg/ml de hemina, 1 µg/ml de vitamina K1 y 5% de sangre lacada de carnero. Las placas con antibióticos deben prepararse preferentemente en el día de uso, si bien pueden conservarse a 2 - 8 °C hasta 72 horas.

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Inóculo final: aproximadamente 1x105 UFC/spot. Se ��� emplea una suspensión de turbidez equivalente al 0,5 de la escala de Mc Farland. Incubación: en atmósfera anaerobia, a 35 °C durante 48 horas. Todo el procesamiento puede realizarse en atmósfera ambiental, teniendo la precaución de no exponer a los microorganismos al oxígeno durante un período superior a 1 hora. Lectura e interpretación de los resultados: la lectura del punto final es una de las etapas más delicadas. En algunos casos puede llevar a interpretaciones ambiguas. La CIM es la concentración más baja de cada antimicrobiano que inhibe el crecimiento del organismo o donde se observa una marcada reducción del desarrollo (pátina, < 10 colonias pequeñas o 1-3 colonias medianas) comparado con la placa de control de desarrollo (sin antibiótico) y la de control de gota. Controles. Control de desarrollo: incluirlo al comienzo y al final de cada serie; son placas inoculadas, sin antibiótico e incubadas en atmósfera anaerobia. Control aerobio: inocular placas de agar chocolate sin antibiótico al comienzo y al final de cada serie e incubarlas en atmósfera de CO2 al 5-7%. Microorganismos utilizados como control: Bacteroides fragilis ATCC 25285, Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741, Clostridium difficile ATCC 700057 y Eubacterium lentum ATCC 43055. 4.4.2. Microdilución en caldo Utiliza pequeños volúmenes (100 µl) de caldo distribuidos en bandejas plásticas con pocillos (policubetas tipo ELISA). Es un método comercial, menos complejo y laborioso que el de referencia, que permite probar varios antibióticos simultáneamente. En la actualidad, está validado sólo para estudiar especies del grupo B. fragilis frente a agentes seleccionados, como la ampicilina-sulbactama, la cefoxitina, la clindamicina, el ertapenem, el metronidazol y la piperacilina. Medio de cultivo: caldo Brucella suplementado con 5 µg/ml de hemina, 1 µg/ml de vitamina K1 y 5% de sangre lacada de caballo. El volumen mínimo que se debe utilizar es 0,1 ml de caldo por pocillo. Las bandejas con las diluciones del antibiótico pueden ser almacenadas a -70 °C. Inóculo final: aproximadamente 1x106 UFC/ml. Incubación: en atmósfera anaerobia a 35 °C durante 48 horas, en jarras o bolsas aptas para este tipo de placas o en cámara de anaerobiosis. Para evitar la evaporación, las placas deben ser cubiertas con una tapa plástica, semiabierta, que permita el intercambio gaseoso. Lectura: la CIM es la mínima concentración donde no se observa desarrollo o donde se observa una disminución significativa del desarrollo con respecto al pocillo sin antibiótico.

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Controles. Control de desarrollo: incluir un pocillo sin antibiótico con el inóculo, en la misma placa de la CIM, para evaluar si desarrolla el microorganismo en las condiciones de la prueba. Control de esterilidad del caldo: incluir un pocillo con el medio sin inocular para verificar su esterilidad. Microorganismos utilizados como control: Bacteroides fragilis ATCC 25285, Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741, Clostridium difficile ATCC 700057 y Eubacterium lentum ATCC 43055. 4.4.3. Epsilométrico Este método está actualmente muy difundido para microorganismos exigentes, inclusive los anaerobios, ya que es muy fácil de realizar y permite tener rápidamente la CIM de un único microorganismo (10, 26, 34). Medio de cultivo: agar Brucella suplementado con 5 µg/ ml de hemina, 1 µg/ml de vitamina K1 y 5% de sangre lacada de carnero. Este medio permite un mejor crecimiento bacteriano y es el que mostró mayor reproducibilidad en los valores de las CIM. Inóculo: hisopar una placa con una suspensión equivalente al patrón 1 de la escala de Mc Farland. Luego de aproximadamente 10-15 minutos, aplicar la tira plástica con el gradiente de concentración del antimicrobiano. Se pueden colocar hasta 2 tiras en las placas de 100 mm de diámetro. Incubación: incubar las placas dentro de los 30 minutos de inoculación en atmósfera anaerobia, a 35 ºC durante 48 horas. Lectura: la CIM es el valor donde la elipse de la zona de inhibición intercepta la tira. Algunas combinaciones microorganismo-droga pueden presentar dificultades en la lectura de la CIM. 4.4.4. Elución en caldo con discos Es un método sencillo, accesible, económico y al alcance de todos los laboratorios clínicos, aunque poco conocido. Este método no está aprobado por el CLSI debido

a que se han observado discrepancias en lo que respecta al comportamiento de algunos microorganismos frente a ciertos antibióticos cuando se lo comparó con el método de microdilución (que no es el método de referencia). El método ha sido reevaluado por la SBA por ser una prueba accesible para nuestros laboratorios (6). La validación se realizó mediante: a) la estandarización de las condiciones de la prueba (medio de cultivo, inóculo, incubación), b) la comparación con el método de referencia (dilución en agar), y c) el estudio de la reproducibilidad del método. Las condiciones utilizadas fueron las siguientes: Medio de cultivo: infusión cerebro corazón Suplementos: hemina, 5 µg/ml vitamina K1, 1 µg/ml extracto de levadura, 50 mg/ml Volumen: 5 ml por tubo Inóculo: 0,1 ml de una suspensión del patrón 0,5 Mc Farland Incubación: anaerobiosis, a 35 °C durante 48 h Cada ensayo debe constar de: - Un tubo con el antibiótico a probar y el inóculo, TUBO DE LA PRUEBA - Un tubo sin antibiótico con el inóculo, CONTROL DEL DESARROLLO - Un tubo sólo con caldo, CONTROL DE ESTERILIDAD DEL MEDIO En la Tabla 7 se detallan el número de discos y la concentración de cada antimicrobiano. La manera en que se debe efectuar la lectura e interpretación de los resultados se indica en la Tabla 8. El porcentaje de concordancia con el método patrón fue 98,5%. Sólo el 0,5% de las discrepancias fueron consideradas errores muy mayores, porcentaje que está por debajo de lo que es exigido en la literatura para que un método sea aceptable (1,5%). La SBA lo recomienda como método de tamizaje en aislamientos clínicos individuales. Los resultados de resistencia o sensibilidad no habituales deberán ser confirmados por el método de referencia (6).

Tabla 7. Esquema de trabajo para el método de elución con discos Antibiótico

Potencia del disco (µg)

Nº de discos en 5 ml de BHI(1)

Concentración final (µg/ml)(2)

10 10/10 10 2 U 30 5 50

1/10 ml 8 3 5 5 4 1

1 16/16 6 2U 30 4 10



Ampicilina Ampicilina-sulbactama Imipenem Penicilina Cefoxitina Clindamicina Metronidazol (1)

Excepto para ampicilina, que se prepara con 10 ml; (2)excepto penicilina, que se expresa en unidades.

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Tabla 8. Lectura e interpretación de los resultados del método de elución con discos

5. QUÉ ANTIBIÓTICOS PROBAR EN LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

Tubo con ATB Control de desarrollo Turbio(1) turbio Límpido turbio Límpido límpido Turbio límpido

Ante el aislamiento de un anaerobio clínicamente significativo según las pautas ya expuestas, los antibióticos que se deben ensayar en el laboratorio clínico dependen del tipo de microorganismo, del sitio de la infección y de los patrones de resistencia nacionales, regionales y locales ya conocidos para ese microorganismo, los cuales orientan el esquema terapéutico empírico hasta contar con los resultados del caso en estudio (30, 55). Teniendo en cuenta estas premisas y de acuerdo con el microorganismo en estudio, se sugiere seguir el siguiente protocolo de trabajo: - Grupo Bacteroides fragilis. Determinar la sensibilidad a ampicilina-sulbactama, piperacilina-tazobactama y clindamicina. - Fusobacterium spp., Porphyromonas spp., Prevotella spp. Detección de β-lactamasa con nitrocefín. - Veillonella spp. Determinar la sensibilidad a penicilina, a ampicilina y a clindamicina. - Cocos gram positivos. Determinar la sensibilidad a penicilina y a ampicilina-sulbactama. - Bacilos gram positivos esporulados. En Clostridium no C. perfringens, detección de β-lactamasa con nitrocefín y determinación de la sensibilidad a clindamicina. - Bacilos gram positivos no esporulados. Determinar la sensibilidad a penicilina y a clindamicina.  

Interpretación resistente sensible no desarrolla: prueba no válida incoherente: prueba no válida

Cualquier grado de turbidez comparado con el control (caldo sin inocular). (1)

4.4.5. Detección de b-lactamasas Para detectar la presencia de β-lactamasas en bacterias anaerobias se recomienda el método de la cefalosporina cromogénica (nitrocefín). Las cepas productoras de β-lactamasas pueden ser consideradas resistentes a la penicilina y a la ampicilina independientemente de los resultados de otras pruebas adicionales de sensibilidad in vitro. El CLSI la recomienda para todos los organismos anaerobios con excepción del grupo B. fragilis, dado que la mayoría de los miembros de este grupo producen β-lactamasas y, por lo tanto, se deben considerar resistentes a la penicilina y a la ampicilina. Cabe aclarar que algunos anaerobios pueden requerir hasta 30 minutos para producir una prueba positiva, y algunas cepas de Parabacteroides (Bacteroides) distasonis y de B. fragilis son resistentes a los b-lactámicos por otros mecanismos, que no son detectados por esta prueba (11, 12, 54). 4.4.6. D-test: prueba de difusión con doble disco / tableta La mayoría de las publicaciones muestran que la clindamicina presenta buena actividad frente a los cocos gram positivos; sin embargo, se ha comunicado resistencia a este antibiótico (8, 35, 40, 44). Si bien el fenotipo constitutivo fue el más frecuentemente observado, también fue detectado el fenotipo inducible (41). Con el fin de evaluar el mecanismo inducible, se ha propuesto una prueba de difusión con doble disco / tableta similar a la utilizada para cocos gram positivos aerobios. Esta se realiza hisopando un agar Brucella suplementado con 5 µg/ml de hemina, 1 µg/ml de vitamina K1 y 5% de sangre con un inóculo de turbidez similar al patrón 0,5 de Mc Farland. Luego se aplican los discos / tabletas de eritromicina (15 μg) y de clindamicina (2 μg) a una distancia de 10 a 15 mm de centro a centro. El achatamiento de la zona de inhibición alrededor del disco/tableta de clindamicina se interpreta como prueba positiva.

6. CEPAS CONTROL Con el fin de monitorear los procedimientos de las pruebas de sensibilidad, deben utilizarse al menos dos de las siguientes cepas control para el método de dilución en agar y al menos una para el resto de los métodos (12). Bacteroides fragilis ATCC 25285 Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741 Clostridium difficile ATCC 700057 Eubacterium lentum ATCC 430557

7. CONSIDERACIONES FINALES Las decisiones del cuerpo médico para el tratamiento de los pacientes gravemente enfermos dependen, en gran medida, de la información que emana del Servicio de Microbiología. Es por ello que las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos para los diferentes microorganismos y por los distintos métodos deben realizarse en condiciones óptimas y estandarizadas, para que sean reproducibles, confiables y permitan la detección de las variaciones en los patrones habituales de sensibilidad que alerten acerca de probables resistencias emergentes. Este documento pretende contribuir al crecimiento de la bacteriología clínica anaerobia en nuestro medio.

Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad

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Recibido: 25/01/11 – Aceptado: 22/02/11

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IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS

ISSN 0325-7541 67 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 67

Alicyclobacillus acidoterrestris Pertenece a un grupo de bacterias aerobias estrictas, acidófilas, termófilas y esporoformadoras, a las que se conoce con la sigla TAB. Son organismos de morfología bacilar (de 0,3 a 0,8 µm x 2 a 4,5 µm), gram positivos o gram variables (Figura 1). Requieren elevadas temperaturas (40 a 70 °C) y condiciones de pH bajo (2 a 6) para su desarrollo (1). Han sido aislados de frutas, vegetales, jugos, purés, jarabes, bebidas y otros alimentos de bajo pH, así como de suelo y aguas de proceso (2). Sus esporos (Figuras 2 y 3) poseen la capacidad de tolerar temperaturas cercanas a los 120 °C. Se los considera microorganismos alteradores debido a la producción de 2-6 dibromofenol y 2-metoxifenol (guayacol), entre otros, los cuales modifican el off-flavor y el off-odour (3). De todas las especies del género, A. acidoterrestris es la que mayor impacto tiene en la industria productora de jugos. La presencia de 1 a 10 esporos por ml de jugo es suficiente para causar su deterioro. Argentina es el segundo país en el mundo exportador de jugo concentrado de manzana y pera, con volúmenes cercanos a las 100 000 toneladas al año. Uno de los principales destinos es EE. UU., donde el valor pagado por tonelada es aproximadamente de 1200 dólares. De este modo, se estima que el negocio de los jugos concentrados de fruta generaría unos 120 millones de dólares anuales. La exigencia a nivel mundial con respecto a la presencia de Alicyclobacillus es variable; sin embargo, aproximadamente el 62% de los importadores exige su ausencia (c=0). La detección de A. acidoterrestris en un lote de jugo de fruta repercute en importantes daños económicos, sumado a la desconfianza que esto genera por parte de los compradores hacia los proveedores, de ahí la importancia de su monitoreo.

Figura 2. Tinción de esporos (verde de malaquita al 5% y safranina al 0,5%). Las flechas indican la presencia de esporos (verdes) en el interior de las células vegetativas (rojas) (100x).

Figura 3. Tinción de esporos. Las flechas indican la presencia de esporos (verdes) sueltos. En rojo, las células vegetativas. (100x).

BIBLIOGRAFÍA 1. Internationale Fruchtsaft-Union. First standard IFU method on the detection of Alicyclobacillus in fruit juices. IFU Method 12. Internationale Fruchtsaft-Union, Paris, 2004. 2. Smit Y, Cameron M, Venter P, Witthunh RC. Alicyclobacillus spoilage and isolation-A review. Food Microbiol 2010; doi:10.1016/j.fm.2010.11.008. 3. Walls I, Chuyate R. Spoilage of fruit juices by Alicyclobacillus acidoterrestris. Food Australia, 2000; 52: 286-8.

Figura 1. Coloración de Gram (100x).

Juan M. Oteiza Centro de Investigación y Asistencia Técnica a la Industria Agroalimentaria (CIATI), Calle Chile y Primeros Pobladores, (8309) Centenario, Neuquén, Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). E-mail: [email protected]

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IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS

Revista Argentina de MicrobiologíaISSN (2010) 0325-7541 42: --Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 68

Alteraciones ultramicroscópicas en tejido placentario de animales infectados con Leptospira interrogans serovar Pomona En las infecciones por Leptospira interrogans de animales preñados se producen alteraciones en los tejidos placentarios, lo que provoca aborto y muerte embrionaria. El microscopio electrónico nos permite observar las alteraciones celulares que se producen en procesos como la apoptosis y la necrosis. En la apoptosis se destacan las alteraciones morfológicas del núcleo frente a las del citoplasma, a la inversa de lo que ocurre en la necrosis en general. En este ensayo se buscaron las alteraciones morfológicas ultraestructurales producidas en células endoteliales placentarias de cobayos experimentalmente inoculados con una cepa de Leptospira patógena (1). Se observaron capilares placentarios congestionados y células endoteliales con vacuolas citoplasmáticas. Se visualizaron células en necrobiosis e indicios de apoptosis, donde la cromatina condensada formaba acúmulos. La presencia de grumos de cromatina indica la existencia de un proceso de apoptosis en su fase inicial (Figura 1). Se evidenció pérdida de integridad de las uniones intercelulares endoteliales, alteración de la estructura celular y ruptura de la membrana celular (Figura 2). Las alteraciones celulares se presentaron en todos los animales inoculados, no se observaron leptospiras intactas y la estructura celular en los animales controles estaba conservada. Existe un gran número de patologías que se pensaba estaban relacionadas con la necrosis y que actualmente se relacionan también con la apoptosis, como el daño isquémico (2). El daño placentario producido por L. interrogans serovar Pomona observado en este ensayo es un ejemplo de la concurrencia de ambos procesos, necrosis y apoptosis.

Figura 1. Microfotografía electrónica de células endoteliales placentarias. Las flechas indican los grumos de cromatina característicos de la apoptosis.

Figura 2. Microfotografía electrónica de células endoteliales placentarias. La flecha indica la pérdida de integridad de las uniones intercelulares endoteliales.

Bibliografía 1. Macedo S. Ultrastructural study of Leptospira biflexa serovar Andamana, strain JNS using transmission and scanning electron microscope. Rev Peru Med Exp Salud Pública 2005; 22: 281-9. 2. Nicodemo A, Duarte M, Alves V, Takakura C, Santos R, Nicodemo E. Lung lesions in human leptospirosis: microscopic, immunohistochemical and ultrastructural features related to thrombocytopenia. Am J Trop Med Hyg 1997; 56: 181-7. Bibiana Brihuega1, Agustín Venzano1, Julián Diodati  2, Alberto Boffi  3, Daniel Funes1, Carmelo Auteri  1, Graciela Romero1, Luis Samartino1 1 Instituto de Patobiología y 2Laboratorio de Microscopía Electrónica, Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Buenos Aires, Argentina; 3Consultor Servicio Anatomía Patológica, Hospital Prof. Dr. A Posadas, Buenos Aires, Argentina.

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Guía para la preparación de los manuscritos La siguiente lista está destinada a servir de guía para la preparación y revisión de su manuscrito de acuerdo con el estilo y formato de la revista. Para más detalles consultar las Instrucciones a los Autores (http://www.aam.org.ar). Los manuscritos que no cumplan con el formato especificado serán devueltos a los autores, retrasándose el proceso de evaluación y publicación.

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Texto No supera el máximo de palabras permitidas No supera el máximo de tablas y/o figuras permitidas Contiene las secciones correspondientes Hace uso correcto de las abreviaciones Cita la marca y procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equipos Cita el número de acceso de las nuevas secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos

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Tablas y Figuras Incluye cada una en hoja aparte Los títulos son claros y concisos Incluye las leyendas Las citas en el texto se corresponden con el número de cada tabla y figura Explica las abreviaciones no convencionales al pie de las tablas Envía las figuras y fotografías en archivos adjuntos

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Autores Identifica al autor responsable Incluye dirección, teléfono y correo electrónico del autor responsable Incluye a todos los autores Incluye el lugar de trabajo de cada autor Incluye nota de presentación del manuscrito por el autor responsable

Bibliografía Respeta estrictamente el formato requerido por la revista Ordena las citas bibliográficas en forma alfabética Incluye las referencias en el texto en correspondencia con el número con el que aparecen en esta sección Agradecimientos Cita las fuentes de financiamiento

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Revista Argentina de MicrobiologíaISSN (2010) 42: --0325-7541 Revista Argentina de Microbiología (2010) 42: 78

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Title

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Authors Identifies corresponding author Includes corresponding author’s address, telephone number and e-mail adress Includes all the authors Includes authors’ affiliations Includes cover letter for manuscript submission signed by corresponding author

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Abstracts Each abstract does not exceed the maximum number of words allowed Includes an abstract in Spanish Includes key words in Spanish Includes an abstract in English Includes key words in English

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Text Does not exceed the maximum number of words allowed Does not exceed the maximum number of tables and/or figures allowed Has the corresponding sections Makes correct use of abbreviations Mentions trademarks and origin of reagents, culture media and equipment Mentions accession number of new amino acids and nucleic acids sequences

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Tables and Figures Each of them is included on a separate page Titles are clear and concise Legends are included Citations in the text correspond with the numbers of each table and figure Abbreviations are explained as a table footnote Figures and photographs are sent in attached files

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References Strictly adheres to the format required by the journal Items in this section are listed in alphabetical order Citations in the text correspond with the numbers appearing in this section

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Acknowledgements Funding sources are mentioned

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NUEVAS INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES (VIGENTES A PARTIR DE 2011) La Revista Argentina de Microbiología (RAM) es una publicación trimestral editada por la Asociación Argentina de Microbiología y destinada a la difusión de trabajos científicos en las distintas áreas de la Microbiología. La Asociación Argentina de Microbiología se reserva los derechos de propiedad y reproducción del material aceptado y publicado. REQUISITOS GENERALES Los manuscritos enviados a esta revista deben constituir informes de investigación original. El envío de un manuscrito implica que los autores tienen las autorizaciones institucionales para proceder a la publicación de los datos y que el mismo manuscrito (u otro de contenido similar) no ha sido previamente publicado (salvo presentaciones parciales en reuniones científicas) ni se encuentra en consideración por otra revista. Los datos originales deberán ser presentados al Comité Editor en caso de ser necesario. Se debe explicitar que los resultados que se muestran provienen de proyectos aprobados por los Comités de Bioseguridad y/o Bioética de las instituciones participantes, así como que respetan la Ley de Hábeas Data en caso de incluir datos de pacientes. PRESENTACIÓN DE LOS ORIGINALES Y DERECHOS DE AUTOR Los manuscritos deben dirigirse al Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología acompañados de una nota de acuerdo con el siguiente modelo: “Sres. Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología: en mi carácter de autor responsable declaro que el resto de los autores han acordado que los represente frente a la RAM con respecto al envío del manuscrito …[Título]… y son responsables junto a mí de su contenido. Este trabajo (u otro de contenido similar) no ha sido publicado previamente ni está siendo considerado en otra revista para su publicación. Asimismo, manifiesto mi conformidad de otorgar los derechos de copia (copyright) a la Revista Argentina de Microbiología, una vez concretada la publicación”. Todos los autores de un manuscrito deberán acceder explícitamente a su publicación, serán responsables de la veracidad de los contenidos y deberán explicitar su conformidad para que uno de ellos, que es quien suscribirá la nota arriba citada, actúe como autor para la correspondencia a los fines del manejo editorial. Asimismo, los autores manifestarán su conformidad con la posición de cada uno en la lista de autores, en la que se indicará su filiación académica. Un cambio de autor o de orden de autores sólo será considerado si se solicita mediante una nota firmada por todos los autores a tal efecto. En una carta adjunta, los autores deberán especificar la existencia de conflictos de interés que puedan afectar la evaluación del manuscrito. Estos serán confidenciales y mantenidos en reserva por el Comité Editor. Deben especificarse en la sección agradecimientos las fuentes de financiación para la tarea experimental descrita en el manuscrito, ya sean éstas institucionales, oficiales o privadas. También se deberán especificar en esta sección las afiliaciones comerciales o los vínculos tales como consultorías, así como la copropiedad de licencias con fines comerciales por parte de uno o más autores. El material será analizado por el Comité Editor y sometido a la consideración de dos árbitros científicos designados para cada caso. El Comité Editor se reserva el derecho de rechazar aquellos manuscritos cuyos contenidos se superponen total o parcialmente con trabajos ya publicados, o cuyas temáticas no se correspondan con las de la RAM. Asimismo, son motivos de rechazo la falta de cumplimiento de las reglas editoriales, violaciones éticas, baja calidad científica y un uso pobre del idioma, sea éste inglés o español. El Comité Editor se reserva el derecho de efectuar las modificaciones gramaticales o de estilo que considere necesarias. ORGANIZACIÓN Y FORMATO La RAM acepta artículos originales, informes breves, artículos especiales, imágenes microbiológicas, editoriales y también edita suplementos. Se solicita leer cuidadosamente las especificaciones de cada formato a los efectos de elegir el más apropiado y de esta manera agilizar el proceso de evaluación. Los manuscritos podrán redactarse indistintamente en español o en inglés, aunque el Comité Editor estimula a los autores a escribir los trabajos en inglés para favorecer su difusión y lectura a nivel internacional. Artículos originales. Son trabajos de investigación completos y deben redactarse respetando las siguientes secciones: Título (en español y en inglés) y Título abreviado, Resumen y Palabras clave (en español y en inglés), Introducción, Materiales y métodos, Resultados, Discusión, Agradecimientos y Bibliografía. El manuscrito no deberá exceder las 8000 palabras incluyendo a todas las secciones, con hasta 6 tablas o figuras. Informes breves. Son trabajos de menor extensión, entre los que se incluyen casuísticas, casos clínicos y descripciones de técnicas o dispositivos nuevos, avalados por trabajos experimentales concluyentes. Se debe omitir la división del texto en secciones y todo el manuscrito no podrá exceder las 3000 palabras, con un máximo de quince citas bibliográficas y de tres tablas o figuras. Es necesario un análisis cuidadoso de la presentación de los datos para evitar su reiteración en el texto, en las tablas y en las figuras, a fin de mantener la característica de brevedad de este tipo de artículos. Artículos especiales. Son actualizaciones o consensos de grupos de trabajo acerca de temas de gran interés en el ámbito regional o internacional. Sus autores deben ser especialistas en la materia y el texto debe incluir una revisión bibliográfica amplia y actualizada. Los artículos especiales admiten hasta 10 000 palabras, 8 tablas o figuras y no más de 100 citas bibliográficas. Imágenes microbiológicas. Pueden corresponder a fotos de bacterias, hongos, parásitos o virus, tomadas de exámenes en fresco o con coloraciones, y observadas bajo microscopía óptica, electrónica o de fluorescencia. También se admiten otras imágenes fotográficas, por ejemplo, microorganismos en medios de cultivo, lesiones ilustrativas en pacientes o en animales de experimentación, imágenes radiográficas y ecográficas, de tomografías computarizadas, de resonancia magnética nuclear, etc. Estas imágenes, de gran valor didáctico y no necesariamente excepcionales, deben estar acompañadas de un texto explicativo y de flechas indicadoras, cuando corresponda. El conjunto no debe exceder una página impresa. Los requisitos de calidad para el envío de las imágenes se describen bajo el ítem “Figuras”.

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Editoriales. Abordan tópicos científicos de gran actualidad y particular relevancia para la comunidad científica especializada en la Microbiología, o trabajos de opinión sobre política científica. La oportunidad y autoría de los editoriales, así como sus lineamientos generales, quedan exclusivamente a criterio del Comité Editor. Suplementos. Corresponden a revisiones extensas de un tema específico realizadas por una o varias sociedades científicas o universidades, o a los resúmenes de las contribuciones efectuadas en el marco de eventos científicos organizados por la Asociación Argentina de Microbiología o alguna de sus Divisiones o Filiales (comunicaciones orales, paneles, conferencias, mesas redondas, etc.). Los suplementos estarán a cargo de editores invitados; sus propuestas temáticas y lineamientos generales deberán ser aceptados por el Comité Editor. La revisión de los manuscritos correspondientes a los suplementos estará a cargo de revisores elegidos por el Comité Editor (revisiones extensas) y de los editores invitados (resúmenes de eventos). El suplemento deberá ser financiado en su totalidad por la entidad que ha organizado la reunión científica, la que tendrá en cuenta que el suplemento deberá ser accesible a todos los participantes del evento o a todos los socios de la Asociación Argentina de Microbiología (por suscripción y on line). Con respecto a la edición, el suplemento deberá respetar exactamente el formato y el estilo de la Revista Argentina de Microbiología en todos sus aspectos (tapa, tipo de papel, impresión, tablas, figuras, fotos, etc.), tal como se describe en este instructivo. Los suplementos correspondientes a los resúmenes de los eventos deben incluir en este orden: nómina de los miembros del Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología, datos de presentación del evento (título completo, lugar y fecha), índice en español y en inglés, agradecimientos, nómina de las autoridades del evento y mensaje/s del/de los presidente/s. A continuación se presentarán los resúmenes numerados desde el uno con números arábigos. Al final del suplemento debe incluirse el índice alfabético de autores y las “Instrucciones para los autores” de la Revista Argentina de Microbiología, en español y en inglés. El programa esquemático del evento sólo se podrá incluir en forma de tríptico, suelto en el interior del suplemento. ELABORACIÓN DE LOS MANUSCRITOS Los manuscritos se deben escribir en hoja A4 con márgenes de 3 cm de lado. Se deberá utilizar formato de fuente Times New Roman, estilo regular, tamaño 12 puntos, a doble espacio. Las letras en negrita o itálica se usarán sólo cuando corresponda. A partir del resumen, se deberán numerar consecutivamente las páginas (en el ángulo inferior derecho) y las líneas del manuscrito. Esto se aplicará tanto para el texto como para las tablas, figuras y leyendas, y también para la bibliografía. Las páginas correspondientes a las tablas, figuras y leyendas se incluirán después de la sección de bibliografía. Carátula. En la primera página se debe indicar el título del trabajo (sólo la primera letra en mayúscula, el resto en minúscula); los autores (primer nombre completo, iniciales de los nombres restantes y apellidos completos de todos los autores); lugar de trabajo (nombre de la institución y dirección postal) y título abreviado del trabajo, de hasta 50 caracteres, para cabeza de página. Si el trabajo incluye autores con distintos lugares de trabajo, se colocarán superíndices numéricos (no encerrados entre paréntesis) junto a los nombres, de manera de identificar a cada autor con su respectivo lugar de trabajo. El autor responsable de la correspondencia se indicará con un asterisco en posición de superíndice ubicado junto al nombre; se detallará su dirección de correo electrónico. En aquellos casos en que uno o varios de los autores hayan cambiado de filiación, se debe consignar la filiación donde se realizó el trabajo y al pie de página, su lugar de trabajo actual. Resúmenes. Se incluirán sólo en los artículos originales, informes breves y artículos especiales y podrán tener una extensión máxima de 250 palabras para los artículos originales y de 150 palabras para los informes breves. El primero de ellos estará redactado en el idioma empleado en el trabajo; el segundo, en el otro idioma y estará encabezado por el título completo del trabajo. Cada uno de ellos estará seguido de una lista de tres a seis palabras clave en el idioma correspondiente. Se debe evitar en los resúmenes el uso de abreviaturas y de citas bibliográficas. Dado que el resumen puede ser publicado separadamente por servicios bibliográficos, se deberá asegurar que resulte comprensible aun en ausencia del texto completo. Introducción. Debe suministrar suficiente y adecuada información sobre el tema en cuestión, como para permitir su comprensión al lector no especializado. Asimismo debe incluir la hipótesis o la base científica que guió el diseño experimental y los objetivos del trabajo definidos con claridad. Las referencias citadas en esta sección deberán ser elegidas muy cuidadosamente y ser las más importantes del tema. Materiales y métodos. Debe contener una adecuada descripción de los métodos, aparatos, reactivos y procedimientos utilizados, con el detalle suficiente como para permitir la reproducción de los experimentos. Los procedimientos o técnicas comunes y de utilización de rutina pueden citarse por medio de una referencia (ej., determinación de la CIM según el CLSI, 2010). Los métodos nuevos o desarrollados especialmente para el trabajo deben ser descritos con detalle, como así también la fuente de drogas poco comunes o materiales biológicos (cepas bacterianas, virales, fúngicas, plásmidos, etc.). La marca y la procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equipos deben consignarse en el texto la primera vez que se los cita identificando marca, ciudad/ estado (si correspondiera) y país de origen. Resultados. Debe incluir el diseño experimental y su base científica, así como los resultados obtenidos presentados en forma concisa como texto (preferentemente) o como tabla(s) o figura(s). Evite el uso innecesario de tablas y figuras para mencionar datos que podrían ser presentados en el texto. No duplique la misma información incluyéndola en el texto y en las tablas o figuras. Limite el número de fotografías a las mínimas necesarias para mostrar los resultados experimentales. Numere las tablas y figuras en el orden en el que se citan en el texto. Se deben evitar las repeticiones y destacar sólo los datos importantes. Se debe dejar para la sección Discusión la interpretación más extensa. Discusión. Debe hacer énfasis sobre los aspectos más importantes y novedosos del estudio, e interpretar los datos experimentales obtenidos en relación con los ya publicados. Indique las conclusiones a las que se arribó y evite la reiteración de datos y conceptos ya vertidos en secciones anteriores. Se admite la presentación de Resultados y Discusión como una sección conjunta. Agradecimientos. Esta sección se debe presentar en un solo párrafo, en un tamaño de letra menor al usado en el texto del manuscrito (Times New Roman, tamaño 11 puntos). Se mencionarán en esta sección las fuentes de financiación y los individuos o instituciones que hayan contribuido con reactivos, materiales biológicos o discusión de resultados. Bibliografía. En todos los manuscritos es conveniente que el 70% de las citas bibliográficas corresponda a los últimos 10 años y el 30% restante se distribuya entre los trabajos clave publicados durante los años anteriores. Las citas bibliográficas se deben escribir en hoja aparte y presentarse en orden alfabético de autores, numeradas correlativamente empleando números arábigos. En el texto, las citas deben aparecer con números entre paréntesis, en correspondencia con el número con que aparecen en la bibliografía. Las referencias a comentarios personales y a trabajos inéditos deberán mencionarse en el texto como comunicación personal, escrito entre paréntesis. Para las referencias, se deberán citar la totalidad de los autores y seguir los siguientes modelos: a. Publicaciones periódicas Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202.

71 Los títulos de las revistas serán abreviados según el Index Medicus (el listado puede obtenerse en http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sites/entrez?db=journals). b. Capítulos de libros/módulos Martins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. ���������������������������������� Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42. c. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos Aguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoarculus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Resumen J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. d. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos reproducidas dentro de un suplemento publicado por una revista de publicación periódica. Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacientes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Resumen 10416. Rev Argent Microbiol 2005; 37 Supl 1: 95. e. Institucionales Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, EE.UU. f. Tesis Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría en Microbiología Molecular 2009. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín. g. Referencias on line 1. Para libros on line Sullivan CJ, editor. 1999-2001. ������������������������������������������������������������������������������������������������ Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. ��������� [Online] http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Consultado el 7 de setiembre de������ 2001. 2. Para versiones on line de revistas disponibles en forma impresa. van der Zeiss L, Danziger VB. ��������������������������������������������������������������������� History of clinical microbiology. Clin Microbiol �������������������� 1999;��������������� 100: 123–234. [Online] ��������� 3. Para revistas únicamente disponibles on line Zellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. [Online] http://www. avj.html. 4. Para trabajos publicados on line como manuscritos de publicación adelantada Zheng Z, Zou J. 5 September 2001. ����������������������������������������������������������������������������������������������� The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxyacetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 10. 1074/jbc.M104749200. h. Los ítems, referencias a trabajos o a resúmenes de congresos no publicados, en proceso de publicación o bajo revisión; comunicaciones personales; patentes en aplicación o en trámite; bases de datos y páginas web deben ser citadas en el texto entre paréntesis como se muestra: … resultados similares (Gómez H, resultados no publicados) … nuevo protocolo de detección empleado (González JL, enviado para su publicación). … concentraciones de droga (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother; abstr. 114, 1994). … nueva especie de bacteria celulolítica (Márquez W, comunicación personal) … comentados previamente por diversas fuentes (http://fcen.uba.edu.ar) Tablas. Se presentarán en hoja aparte, numeradas consecutivamente con números arábigos, encabezadas con un breve título explicativo (que en lo posible no reitere los títulos de las filas y las columnas), con las leyendas y/o aclaraciones que correspondan al pie. Las llamadas para las aclaraciones al pie se harán empleando números arábigos entre paréntesis y superíndice. Sólo los bordes externos de la primera y la última fila y la separación entre los títulos de las columnas y los datos se marcarán con línea continua. No se marcarán las filas ni los bordes de las columnas. Figuras. Se presentarán en hoja aparte, con el número de figura en el margen superior izquierdo y en el orden que aparecen en el texto. Los dibujos deberán estar en condiciones que aseguren una adecuada reproducción. Los números, letras y signos tendrán dimensiones adecuadas para ser legibles cuando se hagan las reducciones necesarias. Las referencias de los símbolos utilizados en las figuras deberán incluirse dentro de la misma figura y no en el texto de la leyenda. Las fotografías podrán ser realizadas en color o en blanco y negro, en el formato JPEG o TIFF. Las resoluciones mínimas requeridas son 300 dpi para las imágenes y fotografías en color y escala de grises, 600 dpi para las imágenes de arte de combinación (letras e imágenes) y 1200 dpi para las imágenes de arte de línea (gráficos y dibujos). Nota: es muy importante que se use una adecuada resolución de archivo. Todas las imágenes individuales que se importan en un archivo gráfico deben estar en la resolución correcta antes de su carga. Tenga en cuenta, sin embargo, que cuanto mayor sea la resolución más grande será el archivo y más tiempo demandará su envío por medios electrónicos. Las leyendas de las figuras se presentarán reunidas en una hoja aparte, ordenadas consecutivamente con números arábigos. Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Las secuencias nuevas comunicadas a través de la publicación en esta revista deberán ser depositadas en una base de datos y sus números de acceso incluidos en el manuscrito, no más tarde de la etapa de revisión. Los números de acceso deberán ser incorporados en un párrafo separado al final de la sección “Materiales y métodos” en el caso de trabajos originales, o luego del texto en el caso de informes breves. La información sobre bases de datos actualmente disponibles es la siguiente: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan National Institute of Genetics; e-mail: [email protected]; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail: [email protected]; URL, http:// www.ebi.ac.uk GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail: [email protected]; URL, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov En lo que respecta a la presentación de nuevas secuencias de ácidos nucleicos, aquellas de hasta 50 nucleótidos pueden ser presentadas en cualquier estilo. Las secuencias de longitud importante deben ser presentadas como Figuras para reducir espacio, indicando 80 a 120 nucleótidos por línea, en un tipo de letra que lo haga fácilmente legible en las condiciones de publicación (16 cm, ancho de dos columnas de la RAM). De ser posible, se dividirán las líneas de la secuencia en bloques de 10 o 20 nucleótidos separados por un espacio o por números indicativos encima de la secuencia. Las líneas deberán estar numeradas, indicando el número correspondiente a la izquierda de la primera base de cada línea. Las anotaciones necesarias se marcarán en negrita, subrayadas o entre paréntesis. Si se requiriere presentar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica,

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se indicará mediante el uso de símbolos de una letra aceptados como indicativos de aminoácidos, los que se localizarán debajo del primer nucleótido del codón codificante. Siglas. Las siglas y demás abreviaciones (cuando esto corresponda) deberán ser explicitadas después de su primera mención en el texto. Las unidades de medida se expresarán siguiendo las normas del Système International d´Unités. ENVÍO DE LOS MANUSCRITOS Los manuscritos podrán ser enviados por correo electrónico ([email protected]) o por correo postal (Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina), incluyendo una versión electrónica en CD-ROM, el que deberá estar identificado con una etiqueta o rótulo que indique el nombre del trabajo y los programas (y versiones) usados para confeccionar el texto, las figuras y las fotografías, así como el nombre de los archivos que contiene. Se recomienda incluir todo el texto del artículo en un solo archivo; en caso de haber imágenes, éstas deben enviarse en archivos separados. Se recomienda además tipear las mayúsculas, los espacios entre palabras, las itálicas y las negritas tal como se desea se muestren luego en el impreso; no dejar espacios antes y después de los subtítulos; justificar el texto y usar la tecla de tabulación y no la barra espaciadora para encolumnar las tablas. Se recomienda a los autores revisar la lista de chequeo que figura a continuación de estas instrucciones y verificar que se ha cumplido con todos los requisitos allí señalados. Antes de enviar un manuscrito, es también recomendable consultar algún ejemplar reciente de la RAM para verificar si se han seguido las pautas requeridas de formato y estilo y, eventualmente, efectuar las modificaciones necesarias. Se aconseja a los autores eliminar de las propiedades de los archivos que envíen todo tipo de información que identifique su autoría. PROCESO EDITORIAL Una vez que el manuscrito ha cumplido el proceso editorial y se encuentra listo para su publicación, se enviará por correo electrónico al autor responsable el archivo en formato pdf de la prueba de galera, para que realice las correcciones tipográficas que correspondieran. No podrá cambiar conceptos ni modificar párrafos que alteren el formato de la impresión. Se deberá imprimir el documento, realizar las correcciones sobre el texto y devolverlo por fax o como archivo escaneado por correo electrónico. Las correcciones también pueden ser enviadas por correo electrónico, especificando claramente la página, el párrafo y la línea que se desea corregir. La corrección deberá ser devuelta en un plazo no superior a los siete días corridos de remitida la prueba de galera, caso contrario se considerará como declinada su publicación. En ese momento se le enviará al autor el monto que deberá abonar para que el artículo pueda ser publicado. La Revista Argentina de Microbiología apoya las políticas para el registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de estas iniciativas para el registro y la divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se aceptarán para publicación los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por la OMS y el ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá registrar al final del resumen. Costo de la página. Por cada página publicada se cobrarán $ 75 o $ 200 si ésta incluye fotografías en color (Argentina, socios de la AAM), $ 200 o $ 600 (Argentina, no socios de la AAM) y USD 70 o USD 180 (otros países). Separatas. Se suministrarán 25 separatas sin cargo.

Secretaria: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 y (54-11) 4932-8948; e-mail: [email protected]; http://www.aam.org.ar SUSCRIPCIÓN ANUAL (4 números) Socios AAM $ 120 Argentina no socios $ 240 América Latina USD 100 Otros países USD 200 Formas de pago Si es socio y abona sus cuotas por débito, puede suscribirse abonando con débito con solo solicitarlo por mail a [email protected] con copia a [email protected] Por depósito en Banco Galicia, (cualquier sucursal),cta. cte. Nº 10980/6 007/1, CBU 0070007820000010980619, enviándonos la fotocopia de la boleta de depósito por fax, aclarando nombre, domicilio y concepto del pago, a los TE/FAX: 011 4 932-8858 y 8948 -CUIT: 30-60746436-3 o escaneada por mail a [email protected] Banco Nación, (cualquier sucursal), cta. cte. Nº 000969700035/74 suc. Bulnes, CBU: 0110697420069700035747, CUIT: 30-60746436-3 enviándonos la fotocopia, idem instrucciones para Bco. Galicia.

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NEW INSTRUCTIONS TO AUTHORS (VALID AS OF 2011) Revista Argentina de Microbiología (RAM) is published by the Asociación Argentina de Microbiología on a quarterly basis. The aim of this journal is to publish current scientific works in the different areas of Microbiology. The Asociación ����������� Argentina ��������������������������� de Microbiología reserves the right to use, reproduce and publish the accepted material. GENERAL REQUIREMENTS Manuscripts submitted for publication in RAM should be original research articles. Submitting a manuscript for publication implies that the authors have been authorized by the corresponding institutions to publish relevant data and that neither the manuscript nor one with substantially similar content has been previously published, except in the case of partial presentations at scientific meetings, or is being considered for publication by another journal. If necessary, original data should be submitted to the Editorial Board. It should also be made clear that results come from projects approved by the Biosafety and Bioethics Committees of the participating institutions, and that when those results include patient information they conform to the Habeas Data Act. SUBMISSION OF ORIGINALS AND COPYRIGHT Manuscripts should be addressed to the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología accompanied by a cover letter according to the following model: “Dear Editors Revista Argentina de Microbiología, ������������������������ As corresponding author ���������������������������������������������������������������������������������������������������� (to whom correspondence should be addressed), hereby declare that the coauthors have accepted to be represented by myself before RAM with regard to the submission of the manuscript “…Title…”, and they are jointly responsible with me for the contents of this work. Neither this manuscript (nor any other with similar contents) has been previously published or is being considered for publication by another journal. I also agree to transfer copyright to Revista Argentina de Microbiología once published.” All the authors of a manuscript should explicitly authorize its publication and will be responsible for the truthfulness of its contents. They should also express their agreement regarding the choice of one of them to become the corresponding author for editorial purposes. Furthermore, they should express their agreement with respect to their position in the list of authors, indicating their academic affiliation. A change of the corresponding author or in the order of the list of authors shall only be considered by a note signed by all the authors to that effect. The authors shall also disclose any existing conflict of interests that might affect the manuscript assessment on an attached letter. The Editorial Board shall treat all received manuscripts in strict confidence. Funding sources for research work described in the manuscript, either from public or private institutions, commercial affiliations or consultancies, as well as co-ownership of patents for business purposes by one or more authors shall be indicated under the Acknowledgements Section. Contributions will be assessed by the Editorial Board and submitted to the consideration of two scientific referees appointed for each case. The Editorial Board reserves the right to reject those manuscripts whose contents partially or totally overlap with works already published or whose topics are irrelevant to those of RAM. Furthermore, reasons for rejection are non-compliance of editorial requirements, ethical violations, low scientific quality and poor use of language, either English or Spanish. The Editorial Board reserves the right to make all necessary grammatical and style modifications. ORGANIZATION AND FORMAT RAM accepts original articles, brief reports, special articles, microbiological images, editorials and supplements. ���������������� Careful reading of the specifications for each special format is recommended in order to choose the most adequate one and therefore, to expedite the evaluation proceedings. Manuscripts shall be written in Spanish or English. The Editorial Board encourages authors to use English as their language of choice so that their work reaches wider international scope and readership. Original Articles. They ����������������������������������������������������������������������������������������������������� are full research papers which must be submitted in accordance to the following sections: Title (in ��������� Spanish and English) and Short Title, Abstract and Key words (in Spanish and English), Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements and References. Manuscripts shall not exceed 8,000 words including all the sections and shall include a maximum of 6 tables or figures. Brief reports. They are less extensive works. They include case reports, descriptions of new tecniques or equipment based on conclusive experimental work. Manuscripts should not be divided into sections and shall not exceed 3,000 words. References should be limited to fifteen citations and tables and figures to a maximum of three. Careful analysis of data presented should be observed so as to avoid their repetition in the text, tables and figures, in order to maintain the typical concision in style that characterizes this type of articles. Special Articles. ����������������������������������������������������������������������������������������������������������� They are updates or workshop results on topics of regional and international weight. Their authors must be specialists in their field of study. Texts must include updated and comprehensive bibliography. Updates may include up to 10,000 words, 8 tables or figures. ������������������������������������������������������������ References should be limited to 100 bibliographic citations. Microbiological Images. They may include high-quality pictures of bacteria, fungi, parasites and viruses, from direct observation or staining under optical, electronic or fluorescent microscopy. They may also include other photographic images of microorganisms in culture media, lesions in humans or laboratory animals, x-ray and ultrasound images, computed tomography scans, nuclear magnetic resonance, etc. These images having great instructional value though not necessarily ground-breaking, should be accompanied by an explanatory text and indicating arrows when necessary. The set of images should fit one printed page at most. Quality requirements for images are described under the “Figures” section below. Editorials. They ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� focus on current scientific topics of special relevance to the scientific community specialized in Microbiology, or are opinion works on scientific policies.������������������������������������������������������������������������������������������������ This ����������������������������������������������������������������������������������������������� section is the sole domain of the Editoral Board, who will determine editorial policy and authorship, as well as the general guidelines. Supplements. �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� They will consist of detailed reviews of a specific subject conducted by one or several scientific organizations or universities, as well as abstracts of contributions presented at scientific meetings or universities organized by the Asociación Argentina

75 de Microbiología or any of its divisions or branches (oral communications, boards, lectures, round tables,etc.), and chaired by guest editors. Topics to be considered in the supplements and general outlines should be approved by the Editorial Board. Revision of manuscripts under the Supplements section will be in charge of reviewers appointed by the Editorial Board in the case of extensive reviewing, and of guest editors in the case of abstracts of meetings. Supplements will be wholly financed by the body organizing the scientific meeting, which will bear in mind that supplements should be distributed among participants to the meetings and all members of the Asociación Argentina de Microbiología either by subscription or on line. As regards style and format, supplements shall strictly conform to the standards of Revista Argentina de Microbiología in all respects (cover, paper quality, printing, tables and figures, illustrations, etc.), as described in the “Instructions to Authors” section. Supplements corresponding to abstracts of meetings shall include the following information in this order: names of members of the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología, data about the event (complete title, venue and date), content list of meetings (in Spanish and English), acknowledgements, names of organizing officers and message delivered by the Chair/s. ������������������������������������ Abstracts consecutively numbered in Arabic ������� numerals as from 1 (one) should subsequently follow. An ����������������������������������������������������������������������������� alphabetical index of authors and the English and Spanish versions of the instructions to authors of Revista Argentina de Microbiología should be printed next. The meeting schedule will only be included in the Supplement as a separate leaflet in the form of a triptych. PREPARATION OF MANUSCRIPTS Manuscripts should be written in A4 paper format with 3 cm margins on each side, using Times New Roman font, regular, 12, and double-spaced. Bold and italics printing types should be used when necessary. Counting from the abstract section of the manuscript onwards, all pages should be consecutively numbered in the lower right margin, as well as the manuscript lines. This shall also apply to text, tables, figures, legends and references. Pages including tables, figures and legends shall be included after the References section. Front or Title Page. The first page shall include the manuscript title using capitals only for the first letter and lowercase for the rest, the author’s names (complete first name, initials of other names and surname of all authors); place of work (institution name and mailing address), and a short title of the work with a maximum of 50 characters as running head. If authors have different working places, the institutional affiliation of each autor shall be indicated by numerical superinscriptions added to their names (not between parenthesis) to identify each author with his/her affiliation. The name of the corresponding author shall be marked by an asterisk in superscript position next to his/her name. The corresponding author’s e-mail shall also be included. If one or several authors have changed his/her/their affiliation, the current affiliation where work was performed should be indicated and the current place of work in a footer. Abstracts. They �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� will only be included in original articles, brief reports and special articles and shall have a maximum of 250 words for original and special articles, and 150 words for brief reports. The first abstract will be written in the language used in the work and the second in the other language. It shall be headed by the complete title of the work. Abstracts shall be followed by a list of three to six key words in the corresponding language. Abbreviations and bibliographic citations should be avoided. A clear understanding of abstracts should be ensured since they may be separately published by bibliographic services. Introduction. ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������� It should provide sufficient and relevant information on the topic to be analyzed to allow the understanding of non-specialized readers. It should also include the hypothesis or scientific background that guided the experimental layout of the work as well as its clearly defined objectives. References mentioned in this section should be the most relevant ones with respect to the topic and must be carefully chosen. Materials and Methods. This section should include an accurate and detailed description of the methods, equipment, reagents and procedures used, so that the experiments could be replicated. Frequently used or routine procedures and techniques may be mentioned by specific reference (eg., MIC determination by the CLSI methods, 2010). New methods or those especially developed for the study should be described in detail, as well as infrequent drug sources or biological materials (bacterial, viral, fungal strains and plasmids, etc.). Trademarks and origin of reagents, culture means and equipment should be indicated in the text the first time they are mentioned, identifying the commercial brand name, state and country of origin. Results. It should include the experimental layout and its scientific background as well as the results obtained presented in a concise way preferably as text, or as table/s or figure/s). Unnecessary use of tables and figures to mention data should be avoided when they could be included in the text. Do not repeat the same information in the text and in the tables or figures. Limit the number of photographs to the minimum necessary to support experimental results. Number the tables and figures in the order they are mentioned in the text. Avoid repetitions and include only most relevant data. In-depth interpretation will be included in the Discussion section. Discussion. Emphasis should be placed on important cutting-edge findings; experimental data should be examined in the light of previously published works. Conclusions should be presented avoiding unnecessary repetition of data and concepts already included in preceding sections. Results and Discussion can be presented as a joint section. Acknowledgements. This ��������������������������������������������������������������������������������������������� section shall be typed in smaller printing characters than those used in the manuscript (Times ����������� New Roman, 11). Financing sources and names of individuals and/or institutions contributing with reagents, biological material or result discussions should be briefly mentioned. References. It is convenient that 70% whenever possible of bibliographic citations in all manuscripts correspond to the last 10 years and the remaining 30% be distributed in key works from previous years. Names of authors cited shall be listed in alphabetical order and numbered in sequence with Arabic numerals on a separate page. Citations in the text should appear in numbers placed between parenthesis, to coincide with the number they have in the References section. Reference to personal comments and unpublished works should be presented as personal communication, written between parenthesis. References should include the name of all the authors and conform to the following models: a. Periodical publications Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob ����������� Agents ������������������������������������ Chemother 2005; 49: 3198-202. Names of journal titles shall be abbreviated according to Index Medicus, a list of which can be obtained at http://www.ncbi.nlm. nih.gov/sites/entrez?db=journals. b. Chapters of books/modules Martins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. ��������������������������������� Manual of Clinical Microbiology, 9 �th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42. c. Presentations in scientific meetings or other events Aguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoar-

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culus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Abstract J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. d. Presentations in congresses or other scientific meetings in a supplement published by a periodic academic journal Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacientes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Abstract 10416. Rev Argent Microbiol 2005; 37 Supl 1: 95. e. Institutional Publications Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, USA. f. Theses Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría en Microbiología Molecular 2009. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín. g. On line Refe�������� rences 1. For on line Books Sullivan CJ, editor. 1999-2001. ������������������������������������������������������������������������������������� Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM ����������� Press. (On � line) http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. �������������������������� Accessed 7 September 2001. 2. For on line versions of printed journals van der Zeiss L, Danziger VB. ��������������������������������������������������������������������� History of clinical microbiology. Clin Microbiol �������������������� 1999;��������������� 100: 123–234. (On � line) 3. For journals only available on line Zellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. (�On line) http://www. avj.html. 4. For manuscripts published� on line in advance of their publication Zheng Z, Zou J. 5 September 2001. The ����������������������������������������������������������������������������������������������� initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxyacetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J�������������������������������������� Biol Chem. 10. 1074/jbc.M104749200. g. Items, references to works or congress abstracts not yet published, about to be published or under revision, personal communications, existing or pending patents, databases and web pages shall be mentioned in the text between parenthesis as shown: … similar ���������������� results (Gómez ������������������������������ H, unpublished results) … new ���������������������������� detection protocol used (González ����������������������������������������� JL, Submitted for publication). … drug �������������������� concentrations (López ������������� GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother, abstr. 114, 1994). … new ��������������������������������� type of cellulolytic species (Márquez ����������������������������������� W, personal communication) previously commented by different sources (http://fcen.uba.edu.ar) Tables. They ����������������������������������������������������������������������� should be included on separate pages, consecutively numbered with Arabic �������������������������������������������� numerals, preceded by an explanatory title, with captions and/or the corresponding explanations below. Reference marks for explanations in the form of footnotes shall use superscripted Arabic numbers betweeen parenthesis. Lines shall only be used in the external borders of the first and last row, and to separate the headings of the columns from the data. Rows and column borders shall not be inserted. Figures. They will be included on separate pages with the figure number in the upper left margin and in the order they are mentioned in the text. Drawings should be clear enough to ensure suitable reproduction. Numbers, letters and signs shall have the adequate size to be readable once reduced as needed. References to symbols used in the figures shall be included within the same figure and not in the text legend. Photographs may be in colour or black and white, in JPEG or TIFF formats. Minimum photo resolution requirements are 300 dpi for color and grayscale images and photo prints, 600 dpi for combined art images (letters and images) and 1200 dpi for images composed of lines (graphs and drawings). Note: It is very important to use the adequate file resolution. All individual images imported in a graphic file should be in the correct resolution before uploading them. Bear in mind that the higher the resolution, the larger the file and the longer it will take to send it electronically. Captions to the illustrations should be included on a separate page, in consecutive order using Arabic numerals. Aminoacid and nucleic acid sequences. New ������������������������������������������������������������������������������� sequences informed by publication in this journal should be deposited in a database and their accession number included in the manuscript, no later than revision stage. �������������������������������� The mentioned accession numbers should be included in a separate paragraph at the end of the Materials and Methods section in the case of original works or at the end of the text in the case of brief reports. The information about currently available databases is the following: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, National Institute of Genetics; e-mail: [email protected]; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail: ��������������������������������� [email protected]; URL, http:// www.ebi.ac.uk GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail: [email protected]; URL, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov Nucleic acid sequences of up to 50 nucleotides included in the work developed in the manuscript may be presented in any style whatsoever. Significantly long sequences should be presented as Figures so as to reduce space, printing those having 80 to 120 nucleotides per line in a readable font according to publishing guidelines (16 cm, width of two RAM columns). If possible, the sequence should be divided into blocks of 10 to 20 nucleotides separated by a space or by indicative numbers placed above the sequence. Lines should be numbered, indicating the corresponding number to the left of the first pair on each line. Any necessary comments shall be bold-typed, underlined or written between parentheses. If it is necessary to include the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence, it shall be indicated by the use of one-letter symbols accepted as amino acid indicators placed under the first nucleotide of the encoding codon. Abbreviatons. They ������������������������������������������������������������������������������������������������������������� must be made explicit when mentioned for the first in the text. Units of measurements will be expressed according to the standards of Système International d´Unités. SUBMITTANCE OF MANUSCRIPTS Manuscripts may be submitted by e-mail ([email protected]) or ordinary mail to Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, including a CD-ROM electronic version, with a label or inscription indicating: title of work, the program and program version used for the text, figures, photographs and the title of all the files it contains. The complete text of the article should be included in only one file. If there are images, they should be sent on separate files. Besides, it is advisable that capital letters, spaces between words, italics and bold letters are typed in the same way they appear in the printed version. There should be no spaces before and after subheadings, the text should be justified and tab-setting should be used instead of the spacing bar for columns in tables.

77 Authors should revise the check list shown after these instructions and see that all the requirements therein have been fulfilled. Before submitting the manuscripts, authors should also examine one of the latest RAM issues in order to verify if all guidelines have been followed as regards format and style and to make all necessary modifications if neccessary. Authors should delete from file properties all kind of information that could identify their authorship. EDITORIAL PROCESS Once the manuscript has completed the editorial process and is ready for publication, a file in pdf format with the galley proof shall be sent by e-mail to the corresponding editor for making the corresponding typing corrections. He/she should not change concepts nor modify paragraphs which could alter the print format.. The document should be printed after making the corrections on the text and sent by fax or as a scanned file by e-mail. Corrections may also be sent by e-mail, clearly specifying the page, paragraph and line to be corrected and should be returned within seven running days of reception, otherwise it shall be assumed that its publication has been declined. At that moment, the amount to be paid for the publication of the article will be sent to the author. Revista Argentina de Microbiología follows the policies for clinical trial registration of the World Health Organization (WHO) and of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), acknowledging the importance of those initiatives for the international dissemination of information on clinical research in open access format. Therefore, only articles referring to trials previously registered with an identifying number in one of the Clinical Trial Registers that meet WHO and ICMJE requirements will be accepted for publication. Their addresses are available in the ICMJE site. The identifying registration number shall be published at the end of the abstract. Publishing charges. Each �������������������������������������������� published page will cost $ 75 or $ 200 (pesos) ������������������������������������������������� when the page includes color photographs (AAM ����� members in Argentina,), $ 200 o $ 600 (pesos) (AAM non-members in Argentina) and U$S 70 o U$S 180 (in other countries). Reprints. Twenty five off prints will be provided free of charge.

The Secretary: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 and (54-11) 4932-8948; e-mail: [email protected]; http://www.aam.org.ar ANNUAL SUBSCRIPTION (4 issues) AAM members $ 120 Argentina non members $ 240 Latin America U$S 100 Other countries U$S 200 Payment: By check or money order, to the order of Asociación Argentina de Microbiología. Price includes mail postage.

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