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Diss. ETH No 12360

Oxidative Stress and Mitochondrial DNA Deletion and

Depletion

A dissertation submitted to the

Swiss Federal Institute Of Technology for the

degree of

Doctor of Natural Sciences

presented by Nicole Stella Filser

Dipl.-Biol.

of

University

Kaiserslautem

born 7th October 1967 citizen of

accepted

on

Germany

the recommendation of

Prof. Dr. K.H. Winterhalter, examiner Prof. Dr. C.

Richter, co-examiner

Prof. Dr. G.A.

Spinas,

co-examiner

Zurich, 1997

V

SUMMARY

This thesis focuses

on

the

question whether

there is

a

relationship

between

oxidative stress and mtDNA alterations. The detection of mtDNA deletions

prone to artefacts. Here,

an

by polymerase

method suitable to

improved PCR

scale mtDNA deletions in human

chain reaction

is introduced. Artifacts

beings

(PCR)

screen

is

large

be reduced

can

high melting temperatures, no overlaps, hairpins, and false priming sites, as well as by suboptimal annealing temperature. Reduction of false priming and increase of amplification efficiency is also achieved by by

use

prior to PCR. systematic investigation of

mtDNA restriction

appropriate In the

with

primers

of

present study,

a

organs of 20 months-old rats 4.8 kb deletion

dependent

was

performed.

(AmtDNA4834)

ten different tissues and

The amount of mtDNA and age-

determined

was

along

superoxide

with

glutathione peroxidase (GSHPx) activities. The data were related to the corresponding metabolic rates. A negative correlation between mtDNA content and AmtDNA4834, and a positive correlation between metabolic

dismutase

(SOD)

and

rate, GSHPx, and the deletion occurrence

of

AmtDNA4834

was

found.

in rats is related to

These

results

long-term

suggest that the

oxidative stress.

poorly equipped with antioxidative defense systems and therefore, prone to oxidative damage. DNA of islets from rats with inherited (Goto-Kakizaki (GK) rats) and experimentally induced (with streptozotocin injected) diabetes were analyzed for the occurrence of AmtDNA4834. Although Pancreatic islets

the deletion

difference Islets

was

was

seem

occasionally

same

Hyperthyroidism treatment with

to form

corresponding control animals. AmtDNA4834 undetectable in liver of

AmtDNA4834

age. However, the

major

role

increased metabolic rate. A 10

day

does not

play

a

of islet function in these animals. is characterized

trijodothyronine (T3)

damage

of mitochondrial

rats resulted in mtDNA

stress and

no

observed between diabetic and

perturbation

oxidative

detected in GK rats and control littermates,

particularly prone

animals of the in the

are

by

an

hyperthyroidism in rats and led protein, lipid and DNA. Hyperthyroidism induced

to

in

loss, but did not increase deletions. Short-term oxidative

oxidatively damaged

DNA may rather initiate

a

loss of mtDNA than

result in deletions.

Alloxan is toxic to

pancreatic (3-cells

unknown. Reactive oxygen

species (ROS)

of alloxan. The effect of alloxan alone

cysteine

was

investigated

but the mechanism of action is

on

cell

protein oxidation, mitochondrial

or

are

in combination with the

viability,

DNA

generated during

the

largely

redox-cycle

reducing agent

nitrite formation, insulin secretion,

(mtDNA) content,

occurrence

of mtDNA

deletions, oxygen consumption, and ATP content in the rat insulinoma cell line,

VI

INS-1.

collectively

formation,

nitrite

Viability,

defined

dysfunction)

as

insulin

and as

well

(their

secretion

oxidation

protein

as

alteration

is

remained

unchanged after 24h incubation with sublethal concentrations of alloxan, alloxan/cysteine, and cysteine. MtDNA deletions were not detected. A loss of mtDNA and lower activity of complex I precede the p-cell dysfunction and death upon alloxan exposure. These the

primary target

of alloxan

findings support

toxicity

J3-cells.

in

the notion that mitochondria

are

Also in this short-term model of

oxidative stress mtDNA is lost. There is evidence that ROS

complications. DNA

of

We did not find

due

lymphocytes

However,

the

mtDNA

hyperglycemia

content

and vascular

stress

which

a

an

important

change

diabetes

to

with well-controlled diabetes oxidative

play

of

role in the

or

vascular

related from

healthy

leads to

controls. Diabetes

decreased

a

mtDNA

and

complications.

diabetics with

complications is decreased compared or

of diabetic

oxidatively damaged protein

lymphocytes

of

etiology

to

imposes

a

content.

It

severe

patients

long-term was

not

examined whether the amount of mtDNA deletions is increased because of diabetes. Taken a

dual

together

consequence

oxidative mtDNA via

a

the data on

damage

presented mtDNA:

and

indicate that oxidative stress has at least

Short-term

precedes

represents

impaired

a

stress

may

lead

to

depletion, whereas prolonged stress may result

damaged replication machinery

MtDNA loss

oxidative

sensitive

mitochondrial

in the formation of mtDNA deletions.

marker for disturbed metabolism

function

and

cell

decreased mtDNA content should also be considered and diseases related to increased oxidative stress.

death.

as a

as

Therefore,

contributor to

it a

aging

VII

ZUSAMMENFASSUNG

vorliegende Dissertation konzentriert sich auf die Frage nach Zusammenhang zwischen oxidativem Stress und mtDNA Deletionen Die

dem und

Verlust.

Nachweis

Der

Kettenreaktion

mtDNA

von

(PCR)

ist

anfallig

mittels

Deletionen

der

Polymerase-

fur Artefakte. Eine verbesserte PCR Methode

Aufspuren grosser mtDNA Deletionen im Menschen wurde entwickelt. Die hohe welche Primern, Artefaktbildung wird durch Verwendung von Schmelztemperaturen, keine Uberlappungen, Haarnadelstrukturen und falsche durch und haben, suboptimale Basenpaarungsstellen Primer an falsche Anlagerungstemperaturen verringert. Das Anlagern der zum

Stellen

minimiert

wird

DNA

die

indem

geschnitten Amplifikationseffizienz fuhrt.

wird,

Restriktionsendonukleasen verbesserten

PCR

dem

vor

zusatzlich

was

mit einer

zu

Organe von 20monatigen Ratten auf ihren Gehalt an mtDNA, der altersabhangigen Deletion (AmtDNA4834) und der Aktivitaten der Superoxiddismutase sowie der Glutathionperoxidase (GSHPx) untersucht. Die Ergebnisse wurden mit der Stoffwechselrate in Beziehung gesetzt. Der Gehalt an mtDNA und AmtDNA4834 sind positiv korreliert, wahrend die Stoffwechselrate, die Aktivitat der GSHPx und die AmtDNA4834 Menge negativ korreliert sind. Diese Resultate legen eine dem und Stress oxidativem langandauemden Verbindung zwischen Vorkommen der AmtDNA4834 nahe. In

dieser Arbeit wurden

10

verschiedene Gewebe

Pankreatische Inseln haben eine

und

neigen

antioxidative Abwehr und

geringe

Langerhahns'schen Inseln von (Goto-Kakizaki (GK) Ratten) und mit experimentell induziertem (mit Streptozotozin) Diabetes wurde untersucht, ob AmtDNA4834 in GK- und vermehrt vorkommt. Obwohl die AmtDNA4834 gelegentlich daher

zu

Ratten

oxidativen Schaden.

mit

DNA

An

aus

vererbtem

Kontrol I ratten auftrat, konnten keine Unterschiede zwischen

entsprechenden

gesunden Tieren festgestellt werden. Weil die AmtDNA4834 in Lebern gleichaltriger Ratten nicht nachgewiesen wurde, wird gefolgert, dass pankreatische Inseln fur das Ereignis der AmtDNA4834 besonders anfallig sind. In diesen beiden Tiermodellen spielt AmtDNA4834 keine Rolle bei der Storung

diabetischen und

der Inselfunktion. Fur

eine

Schilddrusenuberfunktion

charakteristisch. Durch eine

Hyperthyroidism us

in

eine

ist

10-tagige Behandlung

Ratten induziert und fuhrte

mitochondrialen Proteinen,

Lipiden

erhohte

mit zu

Trijodthyronin (T3) oxidativen

Kurzzeitiger

wurde

Schaden

an

und DNA. Die Schilddrusenuberfunktion in

Ratten bewirkte einen mtDNA Verlust, stimulierte aber die nicht.

Stoffwechselrate

oxidativer Stress und oxidativ

einen DNA-Verlust ein, anstatt Deletionen

von

Deletionsbildung

geschadigte DNA DNA-Segementen.

leiten eher

Alloxan wirkt iiber einen unbekannten Mechanismus besonders toxisch fur

pankreatische

8-Zellen.

Wahrend

des

Redoxzykluses

werden

reaktive

VIII

Sauerstoffradikale Kombination

mit

Insulinsekretion,

(ROS) freigesetzt. Der Effekt des Alloxans allein und in reduzierendem Cystein auf Zellviabilitat, Nitritbildung, Proteinoxidation, mtDNA Gehalt, Vorkommen mtDNA

Sauerstoffverbrauch

Deletionen,

INS-1

Ratteninsulinoma-Zellinie

Insulinsekretion,

und

Gehalt

ATP

untersucht.

der

Nitritbildung gemeinschaftlich

und

Viabilitat,

Veranderung

deren

in

wurde

als

Funktionsbeeintrachtigung definiert wurde, sowie Proteinoxidation blieben nach 24-stiindiger Inkubation mit sublethalen Konzentrationen von Alloxan, Alloxan/Cystein und Cystein unverandert. MtDNA Deletionen wurden nicht Der durch Alloxan herbeigefuhrte mtDNA Verlust und die beobachtet. verminderte Aktivitat des Komplex I geht der Funktionsbeeintrachtigung und dem Tod der R-Zelle voraus. Diese Entdeckung starkt die Vorstellung, dass Mitochondrien den primaren Wirkort der Alloxantoxizitat in der B-Zelle darstellen. Auch hier bewirkt kurzzeitiger oxidativer Stress einen mtDNA Verlust. Es wird vermutet, dass ROS eine

wichtige Rolle in der Krankheitsentstehung diabetischer Spatfolgen spielen mdgen. Oxidative Schaden an Proteinen und DNA der Lymphozyten, welche auf Diabetes oder dessen pathologische kardiovaskulare Folgen zuruckzufuhren waren, waren nicht nachweisbar. Bei Patienten mit schwerer Hyperglykamie und diabetischen Spatfolgen ist der mtDNA-Gehalt erniedrigt im Vergleich zu gut eingestellten Diabetikern und gesunden Kontrollpersonen. Diabetes reprasentiert einen lang andauemden oxidativen Stress, der den mtDNA-Gehalt vermindert. Ob vermehrt Deletionen

vorliegen, wurde nicht untersucht. Zusammengefasst decken diese

Daten die zumindest

oxidativen Stresses auf mtDNA auf:

oxidativen

Schaden

andauernder

Stress

und uber

zum

einen

Kurzzeitiger

Verlust

der

fehlerhaften

des

doppelte Wirkung

oxidativer Stress kann

mtDNA

fiihren,

wahrend

Replikationsmechanismus

zu

lang zur

fuhren konnte. MtDNA Verlust ist ein fruhes Kennzeichen

Deletionsentstehung einen gestorten

fur

mitochondrialen

Zellstoffwechsel,

weil

Funktionen und dem Zelltod

er

den

vorangeht.

beeintrachtigten

Aus diesem Grund

sollte die Abnahme des mtDNA-Gehaltes als beisteuernder Effekt bei Altern und Krankheiten, die mit erhohtem oxidativen Stress werden.

einhergehen,

betrachtet