CONGRESO FORESTAL ESPAÑOL - Lourizán 1.993. Ponencias y comunicaciones. Tomo 11

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MICROPROPAGACION, CULTIVO EN VIVERO Y CALIDAD DE PLANTA DE CLONES HffiRIDOS DE CASTANEA SATIVA y CASTANEA CRENATA

M.E. Miranda Fontaíña & J. Femández López Centro de Investigaciones Forestales de Lourizán, Xunta de Galicia. Apartado 127. 36080, Pontevedra. Resumen Se describe la técnica de micropropagación aplicada a la multiplicación clonal de híbridos interespecíficos de Castanea crenata y C. sativa, en sus diferentes etapas: cultivo en laboratorio, aclimatación y cultivo en vivero. Se compara la calidad de la planta procedente de micropropagación con la obtenida por acodo. La utilización de la planta micropropagada como planta madre de estaquillas, abre nuevas perspectivas en la utilización del estaquillado semiherbáceo como método de multiplicación en masa de castaño. P.C.: Micropropagación, Hibridos Castanea crenata y C.sativa, calidad de planta. Abstraet Micropropagation technic for clonal multiplication of interespecific hybrids of Castanea crenata and C. sativa is described at its different stages: culture in laboratory, acclimatization and culture in nursery. Plant quality from micropropagation and stooling is compared. The use of micropropagated plants as stockplant for cutting production, open up new prospects in the use of propagation by leafy cuttings as a method for mass multiplication of chestnut. K. W.: Micropropagation, Hybrids Castanea crenata and C. sativa, Plant Quality. INTRODUCCION Existe en la actualidad una fuerte demanda de plantas de castaño destinada a plantaciones, 10 que hace necesaria la disponibilidad de material vegetal con garantías en cuanto a adaptación, resistencia a Phytopthora en áreas de alto riesgo y calidad forestal o de fruto. Los clones híbridos de castaño resistentes a la enfermedad de la tinta y resultado de una selección por su aptitud forestal y de fruto, deben ser propagados asexualmente para mantener las características de los individuos seleccionados. El método de propagación comercial tradicionalmente utilizado en la multiplicación vegetativa de castaño es el acodo bajo, sin embargo, presenta diversos inconvenientes que originan una baja eficiencia en el proceso de. producción (FERNANDEZ, 1992): a) los viveros de cepas madre destinados a la propagación clonal de castaño mediante acodo bajo, necesitan al menos cinco años para su entrada en producción; b) baja producción por hectárea con menos de 20.000 plantas.Ha- 1 ; c) Altos costos en mano de obra; d) Mala calidad de

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planta con sistema radical frágil y escaso. Los métodos alternativos al acodo bajo son el estaquillado herbáceo o semiherbáceo y la micropropagación. El castaño es una especie de difícil enraizamiento y ésto supone un inconveniente cuando se pretende aplicar el estaquillado como método de multiplicación comercial, sobre todo si el material de partida es adulto. Estas dificultades han sido superadas parcialmente con las técnicas de tratamiento de plantas madre de estaquillas y con la utilización del fog que permite estaquillar material herbáceo o semiherbáceo (PONCHIA y HOWARD, 1988; FERNANDEZ y cols., 1992). Sin embargo, aún en condiciones de enraizamiento óptimas, los porcentajes de éxito obtenidos no son suficientes para que la técnica sea aplicable en la producción a gran escala. Los resultados aquí expuestos forman parte de un proyecto de selección clonal de castaño y de técnicas de propagación desarrollado en el Centro de Investigaciones Forestales de Lourizán, con financiación de INIA y de la ConsellerÍa de Agricultura de la Xunta de Galicia. El objetivo de la micropropagación ha sido la puesta a punto de un método simple de multiplicación, aclimatación y cultivo en vivero. Se ha aplicado a 42 clones seleccionados para producción de madera y/o de fruto y también de portainjertos. PROCESO DE MICROPROPAGACION La información científica contiene varias referencias de procedimientos para el cultivo in vitro de castaño, debiendo destacar los trabajos de VIEITEZ y cols. (1986); CHAUVIN y SALESSES (1988). En el proceso de multiplicación de plantas por cultivo tejidos se distinguen varias etapas (O, 1, 11, lIla, IlIb y IV) (DEBERG Y MAENE, 1981) Y para la elección de medios de cultivo y condiciones ambientales, en las etapas de laboratorio de multiplicación y elongación de brotes (11 y lIla) nos hemos basado en los trabajos mencionados previamente. Establecimiento y Crecimiento in vitro: En esta fase se incluyen las etapas de establecimiento (etapa 1), multiplicación (11) y elongación (lIla) cuyo fin es obtener el mayor nO posible de brotes elongados, manteniendo la estabilidad genética. Además estos brotes deberán presentar buen aspecto, crecimiento activo y poseer un tamaño adecuado para favorecer en enraizamiento. El material de partida para el establecimiento del cultivo, fue recogido a partir de brotes recientes de castaños recepados, de los clones preseleccionados. Después de la esterilización, yemas axilares y ápices caulinares fueron usados para el cultivo inicial. Para la etapa de multiplicación se mantuvieron subcultivos mensuales en medio formado por macronutrientes de Heller (1963) + 1 mM SOlNH4 ) y para la elongación, el subcultivo anterior al enraizamiento se realiza en medio compuesto por sales minerales de MURASHIGE y SKOOG (MS)(1962) con la dosis de nitratos reducida a la mitad (VIEITEZ y cols., 1986). Ambos medios de cultivo se suplementaron con 0.2 mgr.l- 1 de BAP, FeS04 NA2 EDTA, micronutrientes de MS, tiamina (1 mg.l- 1), piridoxina (1 mg.l- 1), m-Inositol (100 mg.l- 1), ácido nicotínico (1 mg.l- 1), ácido ascórbico (1 mg.l- 1), pantotenato cálcico (1 mg.l- 1), sacarosa (30 g.l-l) Yagar (6 g.l-l). Los cultivos se mantuvieron en una cámara de crecimiento con temperatura 25°C, 16 horas de fotoperíodo y luminosidad de 50.00 J.tmol.m-2 .seg- 1 • Estas etapas no presentan demasiadas dificultades. El análisis estadístico de las tasas de multiplicación de 21 clones (tabla 1) muestra diferencias significativas entre clones al nivel de P~0.05 que pueden condicionar la elección de los clones a multiplicar, el éxito o la rentabilidad económica del proceso de micropropagación. Etapa de Enraizamiento: En un sistema de micropropagación comercial el enraizamiento (etapa IlIb) debe desarrollarse preferentemente en condiciones in vivo, debido

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a razones de importancia económica y fitopatológica (MAENE y DEBERGH, 1983). Los brotes del sistema de proliferación son directamente enraizados en sustrato y para ello, las bases de las microestaquillas individualizadas son sumengidas durante unos segundos en una solución de AIB (1 g.l-l) Y colocadas en un sustrato humedecido (66.6% de humedad) y esterilizado, en bandejas de poliestireno que inmediatamente son pulverizadas y cubiertas con una lámina transparente gruesa de plástico, para mantener la humedad. El sustrato de enraizamiento consiste en una mezcla de perlita y corteza de pino compostada y esterilizada (Dermont) (mezcla 2: 1). Para la elección de este sustrato y del método de enraizamiento nos basamos en experiencias anteriores (MIRANDA YFERNANDEZ, 1992a). Despues de cuatro semanas en cámara de cultivo bajo las mismas condiciones que las etapas anteriores, el porcentaje de brotes enraizados es muy alto (próximo al 99 %), con un número medio de 11.52 + 1.38 raices y con abundantes raices laterales. Aclimatacion y Cultivo en Vivero: Las plantas son aclimatadas mediante una redu~ción progresiva de la humedad relativa (desde el 100 al 70%), en un túnel de poli~tileno transparente de 600gg, situado en un invernadero que posee condiciones ambientales controladas. Los túneles de aclimatación tienen una longitud de 8 metros de largo, 1 2 metros de ancho y 60 cm de alto en su punto central, están provistos de un sistema fog que funciona a ocho atmósferas y está controlado con un humidostato, para conseguir la humedad deseada. La temperatura en el interior oscila entre 26° y 21°C y la luminosidad es próxima a 350 ttmol.m2.seg-l al medio dia solar. Las plantas son tratadas semanalmente con fungicida (Benomilo 2 g.l-l) Y abonadas con solución nutritiva. En estás condiciones se consigue al menos un 90% de supervivencia. El crecimiento inicial de las plántulas en el invernadero es muy lento, pero después de cuatro semanas se alcanza un crecimiento vigoroso y un considerable aumento en el tamaño de las nuevas hojas desarrolladas. Tras la aclimatación, las plantas son transplantadas a recipientes individuales para el cultivo en invernadero o son establecidas en campo durante la primavera, para su cultivo a raiz desnuda, con un espaciamiento de 20x20 cm, en eras cubiertas con polietileno negro para el control de malas hierbas. CALIDAD DE PLANTA

La plantas procedentes de micropropagación presentan durante el primer año menor tamaño que la obtenidas por acodo, debido al pequeño tamaño inicial, sin embargo su crecimiento posterior es muy rápido. Son plantas mucho más equilibradas, ya que el sistema radical supone más del 50% de la materia seca total de la planta, frente al 7.6 % en plantas de acodo (tabla 3). Además poseen un sistema radical muy bien formado, con raices muy largas, abundantes y ramificadas. Estas características intervienen directamente en el éxito en el transplante y la supervivencia en campo (superior al 90 %). Despues de uno o dos años de crecimiento en vivero, presentan tamaño y crecimiento suficiente (Tabla 2) para ser usadas .. en plantaciones forestales. Las plantas procedentes de cultivo in vitro mantienen una dominancia apical muy marcada, pero además se caracterizan por producir, durante el primer y segundo año, ramas laterales más grandes y en mayor número que las plantas de cepa, esta misma tendencia en plantas micropropagadas ha sido encontrada en rododendro n (ETTINGER y PREECE, 1985) y en grosella (WAINWRIGHT and FLEGMANN, 1985). Esta forma de desarrollo disminuye durante el tercer año de crecimiento. La propagación por acodo ocasiona problemas de plagiotropismo que a veces se subsanan con la edad, en la plantas de castaño micropropagadas, esta forma de crecimiento aparece

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raramente durante el primer año de desarrollo y desaparece casi completamente durante el segundo periodo vegetativo, resultados similares con planta micropropagada han sido encontrados por RITCHIE y LONG (1986) trabajando con Pseudotsuga menziesii. Es necesario elaborar una Norma de Calidad de Planta Micropropagada de castaño a través del estudio de la influencia de esta técnica (utilización de medios de cultivo y . reguladores de crecimiento, nO de repicados, etc.) en diversos aspectos de calidad de las plantas (forma de crecimiento, época de entrada en producción, etc) realizando la evaluación tanto en la fase de vivero como en plantación. En tanto no esté alaborada, se puede asumir la normativa del Reglamento Técnico de Control y Certificación de Planta de Vivero de Frutales (BOE nO 19, 6 de Mayo de 1992). UTILIZACION DE PLANTA MICROPROPAGADA COMO PLANTA MADRE DE ESTAQUILLAS Las plantas de castaño procedentes de cultivo in vitro son muy adecuadas para su utilización como material de partida de estaquillas semiherbáceas. Estas estaquillas enraizan más rápidamente, en porcentaje más alto (90.33%) y crecen más rápido que las estaquillas procedentes cepa (MIRANDA y FERNANDEZ, 1992b). Resultados similares de estaquillado con planta micropropagada fueron encontrados con Pyrus communis por JONES y WEBSTER (1989) y con Ficus benjamina por KRISTIANSEN (1991). Esto permite combinar fácilmente la micropropagación con el estaquillado semiherbáceo, con el consiguiente aumento de producción y disminución de costes. CONCLUSIONES 1) El cultivo in vitro tiene un importante papel que cumplir en la propagación vegetativa en masa de castaño, al existir una técnica sencilla que proporciona plantas de buena calidad. 2) La micropropagación permite la rápida propagación clonal, debido a que el ciclo de multiplicación del vegetal es muy breve (unas pocas semanas), lo que permite agilizar la puesta en funcionamiento de clones de castaño seleccionados para producción de madera y portainjertos cuya propagación por otros métodos resulta menos rentable o más lenta. 3) Al desarrollar el proceso de producción en condiciones ambientales controladas, su uso no está limitado a la estación más favorable y existe la posibilidad de adaptar rápidamente la producción a la demanda del momento. 4) Las necesidades de superficie de vivero son más pequeñas que en los viveros de acodo ya que el número de plantas por hectárea puede llegar a 200.000. BIBLIOGRAFIA CHAUVIN, J.E. et SALESSES, G. (1988). Advances in chestnut micropropagation (Castanea sp.). Acta Horticulturae, 227: 340-345. DEBERGH, P.C. and MAENE, L.J. (1981). Ascheme for commercial propagation ofhomamental plants by tissue culture. Scientia Hortic. 14:335-345. ETTINGER, T,L. and PREECE, J.E. (1985). Aseptic micropropagation of Rhododendron P.J.M. hybrids. J. Hortic. Sci. 60: 269-274. FERNANDEZ, J. (1992). El material de castaño resistente a Phytophthora sp. Ponencia en el Seminario Internacional sobre los aprovechamientos del Castaño: una economz'a ecológica. Salas (Asturias) , FERNANDEZ, J., PEREIRA, S. and MIRANDA, E.(1992). Fog and substrate conditions for

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chestnut propagation by leafy cuttings. In: Mass Production Techn%gy for Genetically improved fast Growing Forest Tree Species II: 379-383. Bordeaux, France. HELLER, R. (1953). Recherches sur la nutrition minérale des tissus végétaux cultivés in vitro. Ann. Sci. Nat. Bot. Bio/. 14: 473-497. JONES, O.P. and WEBSTER, C.A. (1989). Improved rooting from conventional cuttings taken from micropropagated plants of Pyrus communis rootstocks. J. Hortic. Sei. 64 (4): 429-434. KRIS TIANS EN, K. (1991). Post-propagation growth of cuttings from in vitro and in vivo propagated stockplants of Ficus benjamina. Scientia Hortic. 46 (3-4): 315-322. MAENE, L. and DEBERGH, P. (1983). Rooting of tissue cultured plants under in vivo conditions. Acta Horticu/turae, 131: 201-208. MIRANDA, E. and FERNANDEZ, J. (1992a). Micropropagation as Nursery Technique in Chestnut Hybrid Clones. International Chestnut Conference. Morgantown, West Virginia (USA). MIRANDA, E. and FERNANDEZ, J. (1992). The micropropagation of Cestnut tree: in vivo establishment and post-propagation growth. In: Mass Production Technology for Genetically improved fast Growing Forest Tree Species 1: 421-426. AFOCEL-IUFRO. Bordeaux, France. MURASlllGE, T. and SKOOG, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Planto 15: 473-497. PONCHIA, G., HOWARD, B.H. (1988). Chestnut and hazel propagation by leafy summer cuttings, Acta Horticulturae, 227, 236-341. RITCHIE, G.A. and LONG, A.J. (1986). Field performance of micropropagated Douglas Fir. New Zeland Journal of Forestry Science 16 (3): 343-356. VIEITEZ, A.M., SAN-JOSE, M.C. and VIEITEZ, E. (1986). Chestnut (Castanea spp). In: Y.P.S. Bajaj (Ed) Biotechn%gy in Agricu/ture and Forestry (1): 393-414. Springer-Verlag, Berlin. WAINWRINGHT, H. and FLEGMANN, A.W. (1985). The micropropagation ofgooseberry (Rives uvacrispa L.): II. In vitro proliferation and in vivo establishment. J. Hortic. Sci. 60 (4): 481-491.

Tabla 1: Diferentes Tasas de multiplieation de algunos clones híbridos interespecifteos de Caslanea crenala y C. saliva. Valores seguidos por la misma letra no difieren a p~0.05.

CLON HS 90.043 90.025 156 90.015 111 16 CA-118 100 CA-15 2 3237 19 2003 10 2034 RH-13 X

MARA 130 2671

N° Medio de Brotes/explanto 4.81 3.22 3.17 2.92 2.85 2.67 2.63 2.57 2.48 2.38 2.36 2.32 2.27 2.25 2.20 2.17 2.09 2.04 1.85 1.75 1.67

a b be be bed bede bede bedef edef edefg edefg edefg edefg edefg edefg defg efg efg fg g g

Longitud del brote más alto (cm) 2.09 1.26 1.80 2.35 1.82 2.77 1.69 1.98 2.82 1.44 3.22 2.73 1.43 2.60 1.64 1.70 2.31 2.08 1.08 1.55 1.42

bede fg defg bed defg ab defg edef ab efg a ab efg abe defg defg bed bcde g defg efg

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Nivel de Nitratos

Plern

.GD

Total 1I2x 1I4x

97a 90a 87a

MS

Total 1I2x 1I4x

100a 100a 100a

Medio

NRa

LMRa (mm)

LmRa

Supervivencia

(mm)

(%)

4.lb 5.lb 4.lb

43.2a 35.6ab 33.8ab

25.2ab 23.4b 23.3b

27c 20c 20c

5.7b 7.5a 5.0b

3l.5b 34.4ab 33.9ab

22.3b 27.8ab 26.6ab

40bc 73a 60ab

(%)

Tabla 2. Efecto del medio de cultivo y nivel de nitratos utilizados en el último subcultivo de multiplicación, en el enraizamiento de brotes de alcornoque (Q. suber) regenerados in vitro.

,

Figura 1. Desarrollo de raices en brotes de Q. suber. Véase la formación de nuevas hojas.

'

Figura 2. Microplanta de alcornoque después de 90 días de aclimatación.