UNIVERSIDAD DE COLIMA Maestría en Ciencias: Área Biotecnología
CARACTERIZACIÓN DE LOS COMPONENTES DE UN EXTRACTO DE PRIMORDIOS DE Pleurotus ostreatus QUE INDUCE SU FRUCTIFICACIÓN
Tesis que para obtener el grado de Maestra en Ciencias Área Biotecnología Presenta
MARTHA GAYOSSO CANALES ASESORES M.C. SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZ DR. ANTONIO RAFAEL TAPIA BENAVIDES
Tecomán, Col. Julio de 2001.
Agradecimientos
Expreso mi agradecimiento al Dr. Javier Farías Larios por su ayuda en la construcción de este documento, a la Dra. Ma. del Rocío Flores Bello y al Dr. Sergio Aguilar Espinosa por orientarme para no perder del rumbo en el momento que lo requerí, al Dr. Oscar Rebolledo Domínguez por ocuparse de mi formación, al Dr. Roberto Lezama Gutiérrez por la revisión del documento, a la Q.F.B. Ma. Celia Beltrán García por compartir sus conocimientos conmigo y especialmente al Dr. Jaime Molina Ochoa por ser el maestro y el amigo que necesité. Tesis realizada con beca del Programa de Mejoramiento de Profesorado (PROMEP) a través de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo.
ÍNDICE pág RESUMEN .....................................................................................................1 ABSTRACT ....................................................................................................2 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................3 2. REVISIÓN DE LITERATURA .........................................................................6 2.1 El reino fungi....................................................................................6 2.2 La morfogénesis en hongos................................................................7 2.2.1 La morfogénesis del cuerpo fructífero ...................................... 11 2.2.1.1 Control genético ........................................................ 12 2.2.1.2 Procesos citológicos ................................................... 14 2.2.1.3 Control fisiológico ..................................................... 16 2.2.1.3.1 Estado nutricional y condición fisiológica del micelio ...................................................... 16 2.2.1.3.2 Sustancias inductoras de fructificación......... 17 2.2.1.4 Control ambiental ...................................................... 20 2.2.1.5 Otros aspectos que contribuyen al desarrollo del cuerpo fructífero.................................................................. 22 2.3. La importancia biotecnológica de los hongos comestibles.................... 23 2.3.1 El género Pleurotus ............................................................... 25 3. MATERIALES Y METODOS......................................................................... 28 3.1 Infraestructura................................................................................ 28 3.2 Material biológico y condiciones de cultivo ......................................... 28 3.3 Cultivo de primordios....................................................................... 28 3.4 Obtención de extractos .................................................................... 29 3.5 Inoculación de Pleurotus ostreatus in vitro ......................................... 29 3.5.1 Diseño experimental .............................................................. 30 3.5.2 Variables y análisis de datos ................................................... 30 3.6 Análisis de la composición química de los sustratos ............................. 31 3.7 Inoculación de Pleurotus ostreatus en sustratos.................................. 31 3.7.1 Diseño experimental .............................................................. 32 3.7.2 Variables y análisis estadístico ................................................. 32 3.8 Separación de los componentes del extracto inductor .......................... 32 3.8.1 Cromatografía en capa fina...................................................... 33 3.8.2 HPLC .................................................................................... 33 3.8.3 Extracción de lípidos totales..................................................... 33 3.8.4 Aislamiento y purificación de ceramidas .................................... 34 3.9 Caracterización química de los componentes del extracto inductor ........ 34 3.9.1 Espectroscopía de Infrarrojo.................................................... 35 3.9.2 Espectrometría de masas......................................................... 35 3.9.3 Resonancia magnética nuclear ................................................. 35 4. RESULTADOS .......................................................................................... 36 4.1 Efecto de diferentes extractos de primordios de P. ostreatus sobre su
desarrollo in vitro............................................................................ 37 4.2 Efecto del extracto más sobresaliente en el ensayo in vitro sobre el desarrollo de P. ostreatus en sustratos naturales ............................... 39 4.2.1 Efecto del extracto acuoso sobre la formación del cuerpo fructífero de P. ostreatus en tres sustratos................................ 39 4.2.2 Composición proximal de los sustratos ...................................... 41 4.3 Separación y caracterización de los componentes del extracto acuoso ... 41 5. DISCUSIÓN ............................................................................................. 47 5.1 Efecto de diferentes extractos de primordios de P. ostreatus sobre su desarrollo in vitro............................................................................ 47 5.2 Efecto del extracto más sobresaliente en el ensayo in vitro sobre el desarrollo de P. ostreatus cultivado en sustratos naturales................... 49 5.3 Caracterización de los componentes del extracto de primordios más sobresaliente en el ensayo in vitro .................................................... 51 6. CONCLUSIONES....................................................................................... 54 7. REFERENCIAS ........................................................................................ 55
ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS Cuadro
Pág.
1. Producción en toneladas de varios hongos en diferentes países en 1994. ........................ 24 2. Análisis de varianza del diámetro de la colonia y del peso seco del micelio de Pleurotus ostreatus a tres periodos de incubación en agar papa dextrosa bajo el efecto de extractos de primordios del mismo hongo................................................................................................................................. 39 3. Análisis de varianza de los días para fructificar y del número de primordios de Pleurotus ostreatus en agar papa dextrosa bajo el efecto de extractos de primordios del mismo hongo ........................................................ 39 4. Análisis de varianza de los días para fructificación, el número de primordios y la eficiencia biológica de Pleurotus ostreatus en sustratos bajo el efecto de la adición del extracto de primordios..................................................... 41 5. Composición proximal de los sustratos en los que se inoculó Pleurotus ostreatus ............................................................................................................................ 41 6. Desplazamientos químicos H1 de las fracciones separadas por HPLC............................. 46 7. Desplazamientos químicos C13 de la fracción III separada por HPLC............................. 46 Figura Pág. 1. Resumen de las actividades de los hongos en relación con los humanos........................... 7 2. Simplificación de los procesos involucrados en el desarrollo de cuerpos fructíferos y otras estructuras multicelulares en hongos................................................... 10 3. Dibujo de un hongo y los términos usados. Fructificación es la formación del cuerpo fructífero.......................................................................................................... 12 4. Ciclo de vida de Schizophyllum commune y los efectos de las mutaciones constitutivas en los genes de cruza en la morfología de la hifa y formación del cuerpo fructífero. ....................................................................................... 13 5. Ciclo biológico de un macromiceto. ................................................................................. 15 6. Pleurotus ostreatus. ........................................................................................................... 26 7. Diámetro de la colonia de Pleurotu s ostreatus a tres periodos de incubación en agar papa dextrosa bajo el efecto de diferentes extractos de primordios del mismo hongo (² = desviación estándar, Tukey P=0.05, n=3) .................................................................................................................... 36 8. Peso seco del micelio de Pleurotus ostreatus a tres periodos de incubación en agar papa dextrosa bajo el efecto de diferentes extractos de primordios del mismo hongo (² = desviación estándar, Tukey P=0.05, n=3) .................................................................................................................... 37 9. Días para fructificar y número de primordios de Pleurotus ostreatus en agar papa dextrosa bajo el efecto de diferentes extractos de primordios del mismo hongo (Tukey P=0.05, n=3). .......................................................................... 38 10. Días para fructificar, número de primordios y eficiencia biológica (EB) de Pleurotus ostreatus en rastrojo de maíz (RM), paja de arroz (PA) y estopa de coco bajo el efecto de la dición de l extracto de primordios del mismo hongo (RME, PAE y ECE) (Tukey P=0.05, n=3).......................................... 40 6
11. Espectro de infrarrojo de la fracción I del extracto acuoso de primordios de Pleurotus ostreatus en pastilla de KBr .................................................. 42 12. Espectro de Infrarrojo de la fracción II del extracto acuoso de primordios de Pleurotus ostreatus en pastilla de KBr .................................................. 43 13. Espectro de infrarrojo de los lípidos totales extraídos del extracto acuoso de primordios de Pleurotus ostreatus en pastilla de KBr .................................... 43 14 Espectro de masas de un componente de los lípidos totales extraído del extracto acuoso de primordios de Pleurotus ostreatus. .................................................... 44 15. Espectro de infrarrojo de la ceramida, aislada del extracto acuoso de primordios de Pleurotus ostreatus, en película evaporando el solvente en hatr ............................................................................................................................. 45 16. Espectro de masas del metil éster del ácido hexadecanoico obtenido al analizar las ceramidas aisladas........................................................................................ 45 17. Espectro de masas del compuesto de peso molecular 294, detectado en las ceramidas .............................................................................................................. 46
7
RESUMEN
En esta investigación se evaluó el efecto de extractos de primordios de Pleurotus ostreatus en su fructificación in vitro y el extracto más activo fue probado en tres sustratos. Además, se hizó la caracterización parcial de los componentes del extracto. Micelio de P. ostreatus fue inoculado en medio PDA, conteniendo cada uno de los extractos obtenidos con agua, acetonitrilo, metanol, acetona, etanol, éter, cloroformo y tetracloruro de carbono. También fue cultivado en tres sustratos naturales complementados con el extracto más activo, cuya caracterización fue realizada por HPLC, IR, GC-MS y RMN. El mejor desarrollo del hongo en términos de crecimiento de micelio y formación de primordios fue obtenido con el extracto acuoso y en el sustrato paja de arroz. Los componentes del extracto más activo fueron ácidos grasos y fracciones caracterizadas parcialmente, que podrían ser ceramidas y oligosacarinas. Los resultados sugieren que en los primordios P. ostreatus existen sustancias que inducen su desarrollo. Palabras clave: morfogénesis, Pleurotus ostreatus,
primordios, extracto, sustratos,
cuerpo fructífero, ácidos grasos, ceramidas, oligosacarinas.
8
ABSTRACT
In this investigation was evaluate the effect of extracts from primordia of Pleurotus ostreatus in its fruiting in vitro and active extract also was test on subtrates. Furthermore it did the partial characterization of the components from extract. P. ostreatus mycelium was inoculated on PDA medium, with every extracts obtained from water, acetonitrile, methanol, acetone, ethanol, ether, chloroforme and carbon tetrachloride. Also the fungus was cultured on three subtrates complement with the more active extract, wich characterization was did by HPLC, IR, GC-MS and RMN. The best growth in terms of growth mycelium and primordia formation was got with extract from water and the rice straw. The components of the more active extract were fat acids and other compounds partially characterizated that could be ceramides and oligosaccharins. These results suggest that in the P. ostreatus primordia exist substances that induced its development. Key words: morphogenesis, Pleurotus ostreatus, primordia, fruit body, extract, ceramide, fat acid, oligosaccharins.
9
1 INTRODUCCIÓN Actualmente el fenómeno de la morfogénesis de los seres vivos se sustenta en la biología del desarrollo en términos de diferenciación celular, lo cual ha aclarado en cierta medida este fenómeno, pues esta diferenciación está asociada con la expresión genética en las diferentes partes del tejido inducida por factores químicos, eléctricos, mecánicos y ambientales (Edelman, 1992, Moore, 1998). Por estas razones se considera que la morfogénesis debe ser estudiada tanto en aspectos genéticos como fisiológicos y ambientales. Para explicar este fenómeno los hongos son modelos excelentes de estudio debido a su estructura biológica y al fácil manejo que puede hacerse de ellos, especialmente los basidiomicetos que forman cuerpos fructíferos visibles con estructuras celulares bien diferenciados (Taylor et al., 1993; Manàchere, 1988; Moore, 1998, Sánchez y Moore, 1999; Kües y Liu 2000). De los aspectos fisiológicos se ha reportado que la iniciación y desarrollo de cuerpos fructíferos es promovida por extractos de hongos (Chamberlain e Ingram, 1997). Sin embargo, la identificación de un compuesto activo se ha logrado en muy pocos casos, es notable la demostración de la intervención del monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) en la fructificación de algunos monocariones de Coprinus cinereus (Schaeff. ex Fr.) S. F. Gray (Kües, 2000) y de cerebrósidos en la fructificación dicariótica de Schizophyllum commune Fr.:Fr (Wessels, 1993a). En la mayoría de los casos la purificación de compuestos activos se ha evadido y finalizan el reporte de investigación señalando que se planea o requiere trabajo posterior (Butler et al., 2000). El trabajo de Rusmin y Leonard (1978) es un ejemplo raro en que los detalles del aislamiento y purificación se publicaron. Esto es comprensible, pues las dificultades para caracterizar compuestos activos incluyen la necesidad de bioensayos cuantitativos adecuados y procedimientos 10
efectivos para la separación de compuestos activos de extractos fúngicos (Novak Frazer, 1996).
En basidiomicetos, la mayoría de los compuestos que muestran
actividad en la inducción de la morfogénesis, pero que no se han caracterizado, tienen características comunes, como son peso molecular F F calculada Pr>F Tratamientos 26 63.30 0.0001 ** 31.92 0.0001 ** Extracto (E) 8 45.06 0.0001 ** 16.76 0.0001 ** Tiempo (T) 2 578.88 0.0001 ** 309.09 0.0001 ** E*T 16 7.98 0.0001 ** 4.86 0.0001 ** Error 54 CME 12.17617 0.1735456 CV 12.99801 14.76531 2 R 0.968234 0.938915 CME = cuadrado medio del error. CV = coeficiente de variación. ** altamente significativo Cuadro 3. Análisis de varianza de los días para fructificación y el número de primordios de Pleurotus ostreatus en agar papa dextrosa bajo el efecto de diferentes extractos de primordios del mismo hongo Fuente de variación G.L. Días para fructificación No. de primordios F calculada Pr>F F calculada Pr>F Tratamientos 8 99999.99 0** 20.21 0.0001** Error 18 CME 0 0.2087401 CV 0 11.28582 2 R 1.0 0.899831 Las abreviaturas utilizadas son las mismas que en el cuadro 3. 4.2 Efecto del extracto más sobresaliente en el ensayo in vitro sobre el desarrollo de P. ostreatus en sustratos naturales 4.2.1
Efecto del extracto acuoso sobre la formación de cuerpo fructífero de P. ostreatus en tres sustratos
El desarrollo de P. ostreatus, en relación con los días para fructificación y al número de primordios, fue afectado significativamente (P 0.01) por los factores tratamiento, sustrato, extracto y por la interacción sustrato-extracto, la eficiencia biológica también fue influida por éstos factores excepto por la interacción sustrato-extracto (Cuadro 4). Así los valores de las variables, días para fructificación, número de
46
primordios y eficiencia biológica se movieron en un rango de 1 a 5.9 días, de 1 a 6.525 primordios y de 1 a 13.53 %, respectivamente al ser afectadas por
el
tratamiento. Además la fructificación fue más temprana en RM con un valor de 4.96 días, seguida de PA con 5.18 días, en tanto que para ECE la fructificación se presentó a los 5.94 días y no hubó fructificación en EC. Mientras que el número mayor de primordios fue para RME con 6.525 primordios en promedio, en RM, PA, PAE y ECE la cantidad osciló entre 1.00 y 3.24 primordios. Para el caso de la eficiencia biológica el tratamiento PA fue el mejor con 13.53%, seguido por PAE con 11.77%, entre RM y RME no hubó diferencia significativa y los valores fueron de 9.51 y 8.33% respectivamente. En general el mejor sustrato en términos de fructificación temprana y cantidad de primordios fue RME y en relación con la EB fue mejor PA, sin embargo la adición del extracto de primordios provocó un decremento en la EB (Fig. 10).
a
14 b 12
c
c
10 8 6
a
a
c
a,b
4 2
c,d RME
b
d d
b,c
0
b
d
b c,d
dd
RM
ECE Tratamientos
EC
PAE
EB (%) Fructificación (Días) No. de primordios
PA
Figura 10. Días para fructificación, número de primordios y eficiencia biológica (EB) de Pleurotus ostreatus en rastrojo de maíz (RM), paja de arroz (PA) y estopa de coco (EC), bajo el efecto de la adición del extracto de primordios del mismo hongo (RME, PAE y ECE) (Tukey P=0.05, n=3)
47
Cuadro 4. Análisis de varianza de los días para fructificación, el número de primordios y la eficiencia biológica de Pleurotus ostreatus en sustratos bajo el efecto de la adición del extracto de primordios del mismo hongo Fuente de variación Tratamientos Sustrato (S) Extracto (E) S*E Error CME CV R2
G.L. Días para fructificación F calculada
5 2 1 2 12
1270.06 700.53 1581.81 1683.70
Pr>F
No. de primordios F calculada
0.0001** 0.0001** 0.0001** 0.0001**
69 88.87 97.04 35.11
0.007413 1.8969 0.9981
Pr>F
Eficiencia biológica F calculada
0.0001** 0.0001** 0.0001** 0.0001**
0.173974 15.12488 0.966387
Pr>F
240.56 0.0001** 592.00 0.0001** 12.08 0.0046** 3.37 0.0688N S 0.358627 7.9616 0.9901
Las abreviaturas utilizadas son las mismas que en el cuadro 3. NS = no significativo 4.2.2 Composición proximal de los sustratos Los sustratos mostraron diferencias importantes en relación con el contenido de cenizas, nitrógeno, grasa cruda y la relación carbono/nitrógeno (Cuadro 5). El contenido más alto de cenizas fue para la estopa de coco y el más bajo para el rastrojo de maíz. Por otro lado, la paja de arroz presentó el contenido más alto de nitrógeno y de grasa cruda, y la relación C/N más baja. Cuadro 5. Composición proximal de los sustratos en los que se inoculó Pleurotus ostreatus Sustrato cenizas (%) N (%) Grasa cruda (%) C:N Estopa de coco 62.74±8.68 0.335±0.10 0.11±0.011 115:1
Paja de arroz
23.91±0.17
1.145±0.041
0.71±0.065
66:1
Rastrojo de maíz
1.705±0.26
0.303±0.016
0.28±0.053
325:1
48
N = nitrógeno. C = carbono. 4.3 Separación y caracterización de los componentes del extracto acuoso En la separación por cromatografía de capa fina, el análisis del extracto acuoso mostró cinco manchas con Rf s de 0.36, 0.33, 0.12, 0.06 y una más en el origen. En un barrido de 400 a 4000 cm-1, los espectros de IR registraron picos en la región de 3400-3500 cm-1 (enlace –OH), 1000-1200 cm -1 (-C-O-C-). Por HPLC se separaron 3 fracciones, cuyos tiempos de retención fueron de 2.381, 3.216 y 5.084 min, en una proporción de 17, 76.6 y 6.4% respectivamente. La fracción I fue un polvo amarillo claro; la fracción II formó cristales incoloros cuyo punto de fusión fue de 140OC y la fracción III fue un líquido viscoso de color café. Los espectros de infrarrojo de las fracciones I y II
(Figs. 11 y 12) muestran
absorciones para enlaces OH, grupo carbonilo (C=O) y metilenos (-CH2), pero además, la fracción I
presenta una banda de absorción para NH de amida y la
fracción II una banda para el enlace C=C. De la fracción III no se obtuvó un buen espectro, pues las bandas fueron muy anchas.
49
98.0
86.0
74.0
62.0
%T 50.0
38.0 2931 C -H 2 26.0
1 0 5 5 C - OH 1545 N -H
14.0
3426 O - H
4000
3400
C=O 1656 2800
2200
cm -1
1600
1000
400
Figura 11. Espectro de infrarrojo de la fracción I del extracto acuoso de primordios de 99.0 Pleurotus ostreatus en pastilla de KBr 90.0
80.0
70.0
60.0
693.46 HC=CH
%T 50.0
2923.83 -CH 2 40.0
30.0
1061.19 C -OH 20.0
1653.67 C=O
10.0
3428 O -H 4000
3200
2400
c m -1
1600
1200
800
400
Figura 12. Espectro de Infrarrojo de la fracción II del extracto acuoso de primordios de Pleurotus ostreatus en pastilla de KBr
50
El análisis por infrarrojo de los lípidos totales (Fig. 13) presenta absorciones de enlace O-H, C=O y C-O propias de un ácido carboxílico, además de metilos (-CH3) y metilenos (-CH2). 96.0
88.0
80.0
-CH
3
1382
72.0
O -H 3436
64.0
56.0
%T 48.0
40.0
32.0
-C H
2
1464
24.0
C-O 16.0
CH
3
2950
2855 -C H 2920
8.0 4000
3600
3200
2800
1267
2
C=O 2400
c m -1
2000
1734 1600
1200
800
Figura 13. Espectro de infrarrojo de los lípidos totales extraídos del extracto acuoso de primordios de Pleurotus ostreatus en pastilla de KBr Entre los lípidos totales se encontró un ión molecular con un peso molecular m/z de 408 cuya composición fue C27H53O 2, que podría ser un metil éster de ácido carboxílico como lo indica el patrón de fragmentación, así la diferencia de 14 unidades indica pérdida de –CH2, generalmente (Fig.14). Además se detectaron otros componentes, de los que no fue posible precisar la estructura, sin embargo se observa una característica común en ellos que es la presencia de cadenas largas de –CH2 con grupos terminales –COOH o –OCH 3.
51
Abundance
57
95000 85000 71
75000 65000 55000 45000 35000
99 25000
41
113
15000 5000 m/z-->0
141
50
100
155
150
183
211 225 200
253 267 250
295 300
323 337 365 350
408 400
Figura 14. Espectro de masas de un componente de los lípidos totales extraído del extracto acuoso de primordios de Pleurotus ostreatus
La fracción ceramida aislada mostró absorciones en el infrarrojo para enlaces de tipo –OH, -CH2, -CH3, C=O, -C-O y -NH2 amida (Fig. 15).Por otra parte, el patrón de fragmentación
de acuerdo al espectro de masas (Figs. 16 y 17) manifiestó la
presencia de ésteres de ácidos grasos de cadena larga de C16 y C18, el ión de peso molecular m/z 270 corresponde al metil éster del ácido hexadecanoico (C 17H34O 2) y el ión m/z 294 pertenece al metil éster del ácido 9, 12 octadecadienoico (C 19H34O 2).
52
95.0
85.0
75.0
O-H 3442 65.0
-NH 2 1579.61 55.0
%T 45.0
35.0
C-OH 1073.32 primario
-CH 3 1462.77 25.0
C-OH 1123.41 secundario -CH 2 2858.15
15.0
C=O 1729.60 -CH 3 2958.56
5.0 4000
-CH 2 2927.95
3200
2400
1800
1400
cm
1000
600
-1
Figura 15. Espectro de infrarrojo de la ceramida, aislada del extracto acuoso de primordios de Pleurotus ostreatus, en película evaporando el solvente en hatr
Abundance
74
13000 11000 90000
87
70000 50000 43 30000
55
143 270
10000 m/z- ->0
101
32 40
60
80
100
115 120
129
157 140
160
171
185
180
199 200
227 213 220
239 240
260
280
Figura 16. Espectro de masas del metil éster del ácido hexadecanoico obtenido al analizar las ceramidas aisladas 53
Abundance
67
90000
81
70000 95
41 50000
109
30000
123 136 150 10000 0 m/z-->
164
32
294 179
262 196
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220 234 220
240
260
280
300
Figura 17. Espectro de masas del compuesto de peso molecular 294, detectado en las ceramidas En el cuadro 6 se muestran los desplazamientos químicos de H1 de la fracción II y III, de la fracción I no fue obtenido el espectro. La complejidad de los espectros hace imposible la caracterización de estos compuestos. Los desplazamientos químicos en C13 indican la presencia de carbonos de tipo HC-O, H2C-O para los valores entre 60 y 80 ppm, C=C entre 90 y 100 y de 120 a 130 ppm. Cuadro 6. Desplazamientos químicos H1 de las fracciones separadas por HPLC. Fracción
desplazamiento químico (ä) en ppm
II
1.1052 t
1.9 s
2.1 s
2.1 s
2.1 s
3.1 m
7.64
III
0.9394-1.0246
1.5
2.4
2.7
3.2
3.4-3.9
5.19
Cuadro 7. Desplazamientos químicos C13 de la fracción III separada por HPLC. desplazamiento químico (ä) en ppm 130.15 127
109
96.1
93.4
72.7
72.3 71.2
54
69.9
69.5
63.4
60.7
5 DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en las diversas variables medidas en este estudio muestran que en los primordios de P. ostreatus hay sustancias específicas que inducen su desarrollo, muy similares a las reportadas en muchos trabajos que se han hecho en basidiomicetos, en los cuales se ha utilizado tejido de micelio o del cuerpo fructífero (Eger, 1968; Uno e Ishikawa, 1971; 1973; 1976; 1982; Rusmin e Leonard, 1975; 1978: Kawai e Ikeda, 1982; Wessels, 1993a; Butler et al., 2000), sugiere que en esta etapa, de transición entre el micelio vegetativo y el cuerpo fructífero, hay generación de compuestos que probablemente sean necesarios para que se desencadene la morfogénesis del cuerpo fructífero, además al ser endógenas dichas sustancias el efecto que ejercen
esta regulado por los mecanismos de señalización molecular
intracelular (Edelman, 1992; Mizushina et al., 1998; Gooday, 1999; Huwiler et al., 2000).
Sin embargo hace falta verificar que tales compuestos se encuentren
únicamente en los primordios o en su defecto que la concentración crítica de ellos este en dicha etapa.
5.1 Efecto de diferentes extractos de primordios de P. ostreatus sobre su desarrollo in vitro El desarrollo de P. ostreatus en términos de diámetro de la colonia fue más rápido con el extracto acuoso y con el extracto en tetracloruro de carbono. La literatura reporta que un crecimiento inicial bueno es necesario pero no suficiente para asegurar el desarrollo del hongo (Labuschagne et al., 2000), además a medida que aumentó el tiempo de incubación el crecimiento fue más rápido, lo cual está de acuerdo con otros estudios (Guillén-Navarro et al., 1998). Este comportamiento se debió probablemente a que en el extracto acuoso y en el extracto en tetracloruro de carbono se encuentran las sustancias que aceleran el crecimiento del micelio vegetativo.
55
En relación con el peso seco del micelio, la mayor cantidad de biomasa también fue observada con el extracto acuoso. Éste valor está estrechamente relacionado con la densidad del micelio (Noel et al., 1995; Saltarelli et al., 1998), al parecer el extracto acuoso contiene sustancias que incrementan la densidad del micelio vegetativo de P. ostreatus in vitro, probablemente porque éstas estimulan la ramificación de las hifas. Por otra parte, la aparición de primordios también fue más temprana con el extracto acuoso, de acuerdo a Kües y Liu (2000) durante la transición de micelio vegetativo a formación de cuerpo fructífero hay una agregación alta de hifas (nudos) acompañada de un consumo elevado de polisacáridos en el micelio. Tomando como base esto, es posible que las sustancias presentes en el extracto acuoso de primordios de P. ostreatus hayan actuado como moléculas de adhesión entre hifas (Moore, 1998). En relación con el número de primordios producidos, éste fue mayor con el extracto en éter y con el extracto en tetracloruro de carbono. La posible explicación a este comportamiento es que las sustancias extraídas con éstos solventes provoquen adhesión de hifas, pero de manera tardía en relación con las sustancias del extracto acuoso. Sin embargo, cabe mencionar que los estudios en relación con la formación de cuerpos fructíferos (Manàchere, 1988; Butler et al., 2000; Kües, 2000) indican no todos los primordios inicialmente formados alcanzan la etapa de cuerpo fructífero. Dado que el extracto acuoso de primordios de P. ostreatus mostró un efecto consistente en tres de las cuatro variables medidas, se puede inferir que este extracto es el que provoca el mayor efecto en el desarrollo in vitro de P. ostreatus. Es posible que este efecto se deba a que el agua es capaz, por sus propiedades fisicoquímicas, de disolver casi cualquier tipo de compuesto, dependiendo del ambiente químico en que éste se encuentre. Así las sustancias extraídas en agua pueden ser de diferente naturaleza química. Más aún, como el extracto en tetracloruro de carbono también ejerció un efecto positivo en el crecimiento del micelio, es probable que algunos compuestos de naturaleza no polar o de polaridad 56
muy baja estén implicados en el crecimiento vegetativo de P. ostreatus. Sin embargo, es necesario hacer uso de las herramientas químicas que permitan establecer sin lugar a dudas la identidad química de los compuestos presentes.
5.2 Efecto del extracto más sobresaliente en el ensayo in vitro sobre el desarrollo de P. ostreatus cultivado en sustratos naturales El comportamiento del desarrollo de P. ostreatus en términos de días requeridos para fructificación al adicionar el extracto acuoso de primordios fue igual en paja de arroz y rastrojo de maíz excepto para la estopa de coco. Es posible que sustratos como la paja de arroz y el rastrojo de maíz debido a su composición química contengan sustancias asimilables por el hongo, como se ha reportado en otros estudios (Ardon et al., 1996, Zadrazil, 1997), y no se observe efecto significativo al adicionar cantidades tan pequeñas de sustancias como las que se utilizaron en este estudio. En el caso de la estopa de coco dichas sustancias podrían estar ausentes
o no ser
asimilables por el hongo e incluso que contenga sustancias inhibidoras de desarrollo para P. ostreatus. Por otra parte la adición del extracto al sustrato natural incrementó el número de primordios formados, pero este efecto fue sobresaliente sobre rastrojo de maíz. La composición de los sustratos es importante en el cultivo de hongos (Salmones et al., 1996; Straatsma et al., 2000) ya que un balance adecuado de nutrientes es fundamental para el desarrollo del hongo (Kües y Liu, 2000), pero éste no es suficiente para la iniciación de primordios y quizá el extracto contenga esas sustancias que provocan la iniciación. En lo relacionado a la eficiencia biológica, ésta no fue incrementada al adicionar el extracto e incluso disminuyó, pero la eficiencia biológica más alta fue obtenida en la paja de arroz sin extracto. Este resultado está de acuerdo con lo reportado, pues la paja de arroz es el mejor sustrato en términos de rendimiento para el cultivo de P.
57
ostreatus (Thomas et al., 1998). La explicación a esto podría estar por un lado en el contenido alto de lípidos en la paja de arroz, pues se ha observado que los lípidos estimulan el crecimiento del micelio y en la producción de cuerpos fructíferos en P. sajor caju, pues el porcentaje de lípidos totales durante el crecimiento del micelio (5.7%) es mayor que durante el crecimiento del carpóforo (3.7%) (Nair et al.; 1989), además en A. bisporus se observa que al adicionar materiales lipídicos al sustrato se logra un incremento del 20-60% en la producción del carpóforo (Bonzom, et al., 1999). Los niveles relativamente bajos de lípidos durante el crecimiento del hongo indican su rápida utilización durante la formación de los cuerpos fructíferos, ello también puntualiza su intervención en la morfogénesis y demuestra el efecto estimulador que los lípidos tienen en el desarrollo de P. sajor caju (Nair et al.; 1989). Por otra parte, la relación C/N es crucial en el desarrollo de los hongos (De Groot et al., 1998), para la formación del cuerpo fructífero es importante mantener un balance entre las fuentes de C y N (Sarikaya y Ladisch, 1997; Kües y Liu, 2000). Así, las investigaciones con A. bisporus indican que éste se desarrolla mejor en sustratos que tienen una relación C/N entre 80:1 y 10:1 (Scrase y Elliott, 1998) y de los tres sustratos que fueron probados solo la paja de arroz mostró una relación C/N dentro de éste intervalo. No obstante que tanto la estopa de coco como el rastro de maíz mostraron una relación C/N por encima de 80:1, cabe hacer notar que la eficiencia biológica en rastrojo de maíz fue mayor en comparación con la estopa de coco, la explicación a esto podría estar en que a pesar de que el contenido de C es mucho mayor en el rastrojo, la naturaleza de los compuestos carbonados que contiene cada sustrato es diferente y esto podría traducirse en que sean asimilables o no. Por otro parte, la eficiencia biológica se disminuyó al adicionar el extracto de primordios al sustrato en el caso de la paja de arroz y del rastrojo, es posible que estos sustratos contengan una concentración de lípidos dentro de un intervalo adecuado para el desarrollo del hongo y que una vez rebasado éste, ya sea por
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adición de sustancias similares o porque las sustancias adicionadas provoquen una indisponibilidad de los nutrimentos presentes, la eficiencia biológica es disminuida.
5.3 Caracterización de los componentes del extracto de primordios más sobresaliente en el ensayo in vitro La separación preliminar del extracto acuoso de primordios por cromatografía en capa fina mostró la posible presencia de fosfolípidos, dado que la fase móvil para el análisis fue la que se recomienda para detectar estos compuestos (Leray, 1987), además en
los espectros de infrarrojo se observaron bandas de absorción para
enlaces químicos presentes en este tipo de compuestos (Arrondo et al., 1984), sin embargo es importante realizar el análisis espectroscópico con procedimientos diversos para corroborar los tipos enlaces que se encuentran en estos compuestos. Por otra parte,
el análisis por HPLC del extracto permite sugerir la presencia de
compuestos polares, pues el fraccionamiento se consiguió usando como fase móvil acetonitrilo/agua, además los tiempos de retención fueron cortos, que por analogía con los resultados de Butler et al. (2000), se pensaría en compuestos de tipo oligosacarinas, aunque en realidad con este solo análisis no es posible precisar la estructura química de éstas fracciones. También cabe mencionar que la fracción II fue la que contribuyó mayoritariamente al efecto, dada su abundancia en el extracto. En relación con la espectroscopia de infrarrojo de las fracciones obtenidas por HPLC, se observó similitud en los espectros de las fracciones, esto probablemente se debió a errores de precisión en la colecta de las fracciones, no obstante fue posible hacer la asignación de las bandas, y las
absorciones indican la existencia de compuestos
relacionados con las amidas, también mostraron largas de carbonos (banda en 2931 cm -1) y presencia de dobles enlaces. Sin embargo, no es posible establecer la estructura química con más precisión. Por otra parte los espectros de RMN de éstas fracciones no permiten establecer la conectividad entre los átomos de éstas
59
moléculas, pero se observó la presencia mayoritaria de carbonos en desplazamientos químicos para H1 por debajo de 5 ppm, además para C13 se observaron varias señales para carbonos enlazados a oxígeno, lo cual hace posible la existencia de carbohidratos, no obstante sería importante hacer más experimentos en RMN para evitar la transposición de señales (Bonzom et al., 1999) y tratar de purificar más las fracciones. En cuanto al análisis de los lípidos totales extraídos del extracto, las bandas de absorción en el infrarrojo indicaron la presencia de enlaces propios de ésteres de ácidos grasos (Gunstone et al., 1986). Además la espectrometría de masas mostró espectros de compuestos relacionados con los lípidos principalmente cadenas largas de metilenos propios de ácidos grasos. Con esto, se puede afirmar que hubó lípidos en el extracto acuoso de primordios de P. ostreatus, no obstante es preciso realizar un estudio más completo para determinar exactamente el tipo de lípido y la concentración de cada uno en la mezcla de lípidos extraídos. Por otro lado el espectro de infrarrojo de la fracción ceramida presentó similitud al que obtuvieron Kawai e Ikeda (1982). Sin embargo, el peso molecular no coincide con él que reportan, una posible explicación a esto es que ellos trabajan con derivados de trimetilsilil éter, además la presencia de ésteres de ácidos grasos de 16 y 18 átomos de carbono fortalece en cierta medida la hipótesis de que ésta fracción es ceramida. Pero, habrá que profundizar más en la caracterización para tener todas las evidencias de la estructura de éste compuesto. Por todo lo antes mencionado y considerando que los componentes del extracto fueron efectivos en concentraciones bajas (0.5% V/V), es posible que estas sustancias funcionen como factores de crecimiento como se ha reportado en otros hongos (Gooday, 1995). Además es sabido que todo lo que sucede durante el crecimiento y morfogénesis en hongos puede describirse en términos de
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interacciones moleculares, ya que las estructuras primarias y las características químicas de las moléculas son transcritas en los genes (Harold, 1999). Por otra parte, las teorías que explican los mecanismos de acción de sustancias como éstas, establecen que podría ser por señalización molecular y de acuerdo a la hipótesis de morforregulación (Edelman, 1992) hay tres puntos clave a considerar, (1) la expresión de genes relacionados con el ambiente es epigenética y depende del la parte de la célula y del momento en el que ésta se manifiesta, contando con estructuras celulares previamente formadas; (2) las fuerzas que conducen a la morfogénesis son celulares en origen, ya sea división celular, movimiento, adhesión y muerte; (3) el nexo entre la expresión de genes y estas fuerzas es molecular, a través de proteínas, factores de crecimiento y moléculas de adhesión. En términos generales se sugieren nuevas investigaciones que permitan la caracterización total de los componentes del extracto, además
de probar por
separado y en mezcla cada componente, para establecer la relación entre la concentración y la naturaleza química de los compuestos con su capacidad para inducir la formación de cuerpos fructíferos en P. ostreatus.
61
6 CONCLUSIONES En los primordios de P. ostreatus hay sustancias que inducen la formación de su cuerpo fructífero y la naturaleza química de éstas es del tipo ésteres de ácidos grasos y muy probablemente ceramidas, además de otros compuestos que podrían ser de tipo carbohidratos y tal vez oligosacarinas.
62
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