III. HEMOSTASIA PRIMARIA

Alteraciones plaquetarias Bioq. Esp. Claudia Patricia Serrano

Alteraciones plaquetarias Evaluación Recuento de plaquetas Recuento de plaquetas -anticoagulante: EDTA -material adecuado: tubos de polipropileno, vidrio siliconado -toma de muestra adecuada: evitar ruptura de tejido Métodos manuales -sangre entera: oxalato de amonio 1% (vn: 150-400x103/mm3) -plasma rico en plaquetas: EDTA 2% (vn: 300-800x103/mm3) Contadores hematológicos Es conveniente observar un frotis de sangre periférica donde se evaluará número, forma y tamaño plaquetario.

Recuento de plaquetas

Enfoque hidrodinámico IMPEDANCIA

Recuento de plaquetas

Alteraciones plaquetarias Evaluación Recuento de plaquetas Trombocitopenia

Recuento normal

Búsqueda de causas de trombocitopenia

Trombocitosis

Búsqueda de causas de trombocitosis, y alteraciones cualitativas asociadas

METODOLOGIA DE ESTUDIO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

Tiempo de sangría Prueba global de la hemostasia primaria. Es la única prueba que evalúa las interacciones plaquetas pared-vascular “in vivo” Es función de la cantidad y calidad funcional de las plaquetas, de la cantidad y calidad funcional de vWF y de la calidad del colágeno.

Duke Ivy

vn < 2 min vn < 4.5 min

Simplate vn < 9.5 min Cohibir cuando t > 2 vn

Tiempo de sangría

TS:   sensibilidad -  especificidad -  reproducibilidad Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, “barrido” excesivo

METODOLOGIA DE ESTUDIO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

ADHESIVIDAD PLAQUETA

vW

SUPERFICIE

•In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157) •In Vitro : Mann (colágeno) Hellem II (superficie de vidrio) Scand J Haemat 1970, 7: 37

ADHESIVIDAD: método de Hellen II •Sangre entera •Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna. •Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg.

columna

cp EDTA 2%

bomba

sp EDTA 2%

%Adh = 100- SP- CP SP VN > 27%

Alteraciones plaquetarias Evaluación Adhesividad plaquetaria disminuida Enfermedad de von Willebrand Alteraciones de GP Ib-IX-V, IIb-IIIa Déficit de pool de depósito severo

Alteraciones plaquetarias Evaluación Recuento plaquetario normal

Tiempo de sangría prolongado ó normal Adhesividad plaquetaria disminuida

Estudio de trastornos plaquetarios cualitativos Congénitos ó adquiridos

Enfermedad de von Willebrand

Métodos “point of care”

PFA-100 1

2

3

Sangre entera (800 µL)

Insertar cassette

Comenzar el test

Agregación plaquetaria in vitro

Método óptico (Born, 1980) Método potenciométrico (Challen, 1982) IIHEMA-ANM

Condiciones del ensayo: -Sangre obtenida por punción con agujas 20-18 G -Tubos de polipropileno -Anticoagulante: citrato de sodio 3.8% (1:9) sin azida sódica -Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): 10-15 min a 150-200 g -Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min 1500 g -Ajustar concentración del PRP con PPP: 250 – 300 109 / mm3 -Tapar tubos para evitar cambios de pH - Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs posteriores a la extracción.

AGREGACION Agonistas panel de rutina: ADR: 10 uM ( adrenérgicos) Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa) AA: 0.5 mM (receptor de Tx) ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y1, P2Y12) Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW tipo II) Agonistas especiales TRAP6 : PAR1, PAR4 U46619: análogo de TX Endoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintaza Ionóforos (A23187): movilización de Calcio

AGREGACION

AGREGACION

Interpretación de la agregación - Cualitativa (semicuantitativa) - Cuantitativa

Reacción de liberación de ATP

Permite cuantificar la liberación plaquetaria a través de la medición del ATP liberado por el PRP del paciente en presencia de los diferentes agonistas.

Recuento de plaquetas: 326.000/mm3 Morfología normal

Glanzmann

RETRACCION DEL COAGULO (TG)

Recuento de plaquetas: 92.000 / mm3 (en cámara) Macroplaquetas (frotis)

Bernard-Soulier

?

PGG 2 PGH2 TXasa

TROMBOXANO A2/B2 TP

PLC IP3 Ca

Alteración síntesis de tromboxanos

2+

DAG PKC

?

RESPUESTA A TROMBOXANOS 100l

T : 0 seg T : 30 seg T : 1min T : 4 min

PRPn + AA Agregación + Receptores de Tx presentes.

PRPp + ASA CO Sin agregación Alteración en los receptores de Tx

AA

+

GENERACION DE TROMBOXANOS 100l

T : 0 seg T : 30 seg T : 1min T : 4 min

PRPp + AA Agregación + Sin alteración en la formación de Tx

PRPn + ASA CO

Agregación -

Alteración en la formación de Tx. Ciclooxigenasa o Tx Sintetasa?

AA

+

Estudio de la función plaquetaria Estudio de la vía de formación de Tromboxano A2 Evaluación funcional de Ciclooxigenasa y de Tromboxano A Sintasa Agregación Acido Araquidónico

PRP del paciente

PRP de normal + Aspirina

Alteración en la Tromboxano A Sintetasa

Sin agregación Alteración en la Ciclooxigenasa

Alteración en la Ciclooxigenasa

Estudio de la función plaquetaria Estudio de Agregación y Secreción plaquetaria Bernard-Soulier Glanzmann

Citometría de Flujo

Alteraciones de la activación/secreción Estudio de gránulos Gránulos densos: Marcación con Mepacrina por Citometría de flujo

Tromboxanos Síntesis Receptores

Gránulos : Fibrinógeno, FvW, Fn intraplaquetarios Disminuido

Disminuido Déficit de pool de depósito

Síndrome de las plaquetas grises

CITOMETRIA DE FLUJO FUNCIÓN PLAQUETARIA

CITOMETRIA DE FLUJO Plaquetas sin estimular

Plaquetas estimuladas

Gráfico de puntos de la dispersión frontal y lateral de una suspensión de plasma rico en plaquetas

Histograma De fluorescencia

Citometría de flujo Ventajas

Desventajas

Mínima manipulación .

Costo del equipo.

Detecta cambiossuperficiales.

Costo de reactivos.

Estudio de trobocitopenias.

Semicuantitativo.

Estudio de subpoblaciones.

Análisis y expresión de resultados

Estudio de proteínas intraplaq. Requiere 5L de SE,PRP,PL. No usa material radioactivo. Rapidez

MARCACION EN SUPERFICIE TOMA DE MUESTRA: 5 mL de sangre. ANTICOAGULANTE (1:10): citrato de sodio3.8%, EDTA 2%, PFA 1%? PANEL DE MONOCLONALES: ISOTIPO-FITC / PE CD42b ( Ib ), CD41 ( IIb ), CD61 ( IIIa ), CD29 ( Ia ) , CD36 ( GPIV )

10000 eventos CELL-QUEST IIHEMA-ANM

TROMBOASTENIA DE GLANZMANN GLICOPROTEINA IIb-IIIa • Heterodimero calcio dependiente • Integrina mas abundante en superficie • Receptor de Fibrinogeno, vW, Fibronectina ALTERACIONES DE LA GP IIb-IIIa • Ausencia del receptor en superficie • Disminución del número de receptores • Incapacidad de fijar Fibrinógeno • Retracción del Coagulo anómala IIHEMA-ANM

Agregación ADP 5 μM (TG)

Agregación y liberación con colágeno 8 ug/ml (TG)

TROMBOASTENIA DE GLAZMMAN MARCACION EN SUPERFICIE

KG KG

MM

MM

BERNARD SOULIER

•Ausencia del complejo GP Ib-IX-V •Autosómico recesivo, infrecuente •Con-sanguinidad, Cromosoma 17, 23 y 3 •Sangrado moderado a importante •Trombocitopenia •Plaquetas de mayor tamaño y deformables •Sobrevida plaquetaria acortada

Sindrome de BERNARD SOULLIER Paciente P

Dispersión frontalTamaño (FSH) P: 202 Madre: 65 Control: 47

CD 42-b (GP Ib) (IMF) P:25 Madre: 171 Control: 257

P

Madre

P

CD61 (GP IIIa) (IMF) P: 389 Madre: 176 Control: 167 IIHEMA-ANM

MYH9 ?

Dispersión frontalTamaño (FSH) P: 152 Control: 66

P

P

P

CD 42-b (GP Ib) (IMF) P: 145 Control: 63

CD61 (GP IIIa) (IMF) P: 463 Control: 168

IIHEMA-ANM

MYH9: cuerpos de Döhle

AGREGACION CON COLAGENO 1g/ml

Normal Paciente

IIHEMA-ANM

CUANTIFICACION DE GP DE MEMBRANA PLAQUETARIA. CytoQuantTMGp ( Stago) Microesferas: gráfico de puntos FSCH vs SSCH

Histogramas de fluorescencia D

B

A

Marker Media Nº GP/esferas M1 (D) 1201 63000 M2 (C) 466 19000 M3 (B) 112 4500 M4 (A) 8 350

Moléculas de Gp/plaq.

C

IMF

MARCACION INTRAPLAQUETARIA GRANULOS DENSOS CON MEPACRINA TOMA DE MUESTRA - PRP, SE (EXTRACCION CON EDTA 2% o CITRATO) - MEPACRINA, (QUINACRINA MUSTARD, 0.2 mM CF)

PREPARACION DE LA MUESTRA 40L BUFFER, 5 L MEPA, 5 L PlQ. 40L BUFFER, 5 L BUFFER, 5 L PlQ.

INCUBACION-40min LAVADO CITOMETRO IIHEMA-ANM

MARCACION INTRAPLAQUETARIA GRANULOS DENSOS CON MEPACRINA

NEGATIVO ( 3 IFM ) NORMAL ( 85 IFM ) PACIENTE ( 8 IFM)

Rango normal ≥37 IFM IIHEMA-ANM

MARCACION DE PROTEÍNAS INTRAPLAQUETARIAS PERMEABILIZACION SAPONINA 1%

FIJACION PFA 1%10 min Fg Vw

ADP ATP

GP ADP ATP

GP Superficie IIb

Marcación: - Controles negativos adecuados - Controles de permeabilización Total IIb

IIHEMA-ANM

Fg Vw

Total IIIa

Superficie IIIa

Control de permeabilización CD63

MOVILIZACION DE CALCIO

METODOLOGÍA PL en Buffer con Ca2+ ( 1mM) Incubación con FURA-2 Lavado, Resuspensión

Col 8g / mL

Sin Estimulo Col 1g/mL

Marcadores de activación plaquetaria (hiperreactividad) Interacción con matriz sub-endotelial fisiológico

Interacción con endotelio activado patológico

MARCADORES DE ACTIVACION estado de reposo  

GP IIbIIIa inactiva



L





ADP/ATP Ca2+/ Ser



vWf / Fg/ Fn

fibrinógeno

GP IIbIIIa activa



PAC-1



unión de fg

L

 estado activado

 P-SELECTINA /CD62p



GP 53 / CD63 IIHEMA-ANM

Marcadores de activación plaquetaria: - expresión de marcadores de activación en la superficie de la plaqueta (ex vivo)

CD62P P-selectina % positivos golll

IMF

Condiciones analíticas de difícil estandarización: - anticoagulantes - tiempo de ensayo - controles negativos adecuados - expresión de resultados (% de eventos positivos, intensidad media de fluorescencia) - escasas referencias de CV intra e Inter ensayo

RIBS 9F9,F2 a-Fg ACTIVO

LIBS PAC-1 AP6

REPOSO

GP IIb-III a IIHEMA-ANM

CINETICA DE UNION A RECEPTORES TOMA DE MUESTRA PRP, SE (EXTRACCION CON CITRATO) MARCADO DE PLAQUETAS 40 L buffer + 5 L Isotipo + estímulo 40 L buffer + 5 L Monoclonal + estímulo

INCUBACION Tiempos: 1min, 5min….20min a 37ºC Cortar con PFA 1% (CF) a cada tiempo Completar la incubación hasta 40min

CITOMETRO IIHEMA-ANM

CINETICA DE UNION AGONISTAS: ADP 20M, Thr 1 a 5 U/ml, TRAP MARCADORES: DE RECEPTORES: PAC-1, a-FG, a-VWF, GPs DE ACTIVACION: CD62P, CD63

IIHEMA-ANM

CINETICA DE UNION A RECEPTORES IMF Bf 11

100

%Bf 11 IMFPAC-1 11

IM F ó %

80

%PAC-1 11

60 40 20 0 0

5

10

15

20

25

TIEMPO (min) IIHEMA-ANM

Aplicaciónes de la citometría de flujo Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina, anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”

- Factor plaquetario 4 - Anexina V Tomer A, 1999

Tomer A, 1999

Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina, anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”

Tomer A, 1999

TROMBOCITOPENIA INMUNE

CAUSA: Destrucción plaquetaria por anticuerpos que reconocen glicoproteínas específicas de la menbrana plaquetaria:IIb-IIIa, Ib-IX, Ia-IIa

IgG PLAQUETAS NORMALES 1 Pool intraplaquetario (IgG totales plaq.) 20.000 moléculas gránulos  plaquetarios, adquiridas por pinocitosis

2 Pool de superficie (IgG asociada a sup. Plaq.), 100 moléculas, unión de anticuerpos naturales que reconocen estructuras modificadas sobre plaquetas viejas.

INMUNOGLOBULINAS METODOLOGIAS •EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS TOTALES •EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS ASOCIADOS A SUPERFICIE :inmuno-radiometría inmuno-fluorescencia directa MAIPA y PAICA (especifidad del anticuerpo)

IGG ASOCIADA A SUPERFICIE PLAQUETARIA

Expresión de resultados 1-IFM 2-INDICE: IFM / FSCH

Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria: detección por citometría de flujo Media: 36

M1

Control normal

Paciente CD41+

Media: 92 M1

Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria: detección por citometría de flujo Negativo 3 IFM

IgG 10 IFM

IgM 3 IFM

Control normal Negativo 3 IFM M1

Paciente

M1

IgG 34 IFM

IgM 31 IFM