GUSTAVO SILVEIRA BREGUEZ

SÍNTESE DE PEPTÍDEOS RICOS EM PROLINA E ARGININA E ATIVIDADE INIBITÓRIA SOBRE O COMPLEXO PROTEOLÍTICO PROTEASSOMA 20S DE MAMÍFEROS E DO PARASITO Schistosoma mansoni

Ouro Preto – MG, março de 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

SÍNTESE DE PEPTÍDEOS RICOS EM PROLINA E ARGININA E ATIVIDADE INIBITÓRIA SOBRE O COMPLEXO PROTEOLÍTICO PROTEASSOMA 20S DE MAMÍFEROS E DO PARASITO Schistosoma mansoni

AUTOR: Gustavo Silveira Breguez ORIENTADOR: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade COORIENTADOR: Prof. Dr. William de Castro Borges

Dissertação submetida ao programa de PósGraduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia, área de concentração: Biotecnologia aplicada a processos e ao tratamento de doenças.

Ouro Preto – MG, março de 2012

Breguez, G. S.

Catalogação

i

Breguez, G. S.

Laboratório/Auxílio

Este trabalho foi realizado no LABORATÓRIO DE ENZIMOLOGIA E PROTEÔMICA – ICEB/NUPEB/UFOP, com auxílio da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

ii

Breguez, G. S.

Dedicatória

Dedico

esta

dissertação

aos

meus pais, fontes de força, amor, carinho

e

apoio

incondicional

perante todas as dificuldades.

iii

Breguez, G. S.

Epígrafe

“Loucura é fazer a mesma coisa e esperar um resultado diferente.”

Albert Einstein

iv

Breguez, G. S.

Agradecimentos

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelo privilégio de alcançar mais essa conquista. Aos meus pais, Geraldo e Marúcia, pelo amor, carinho e por toda a dedicação. Obrigado por serem exemplos de pessoas dignas e honestas, por me transmitirem os melhores valores e abrirem mão de seus planos para a realização dos meus objetivos. Às minhas irmãs, Gerúcia e Michele, e minha sobrinha Milena pelo companheirismo, apoio e amizade ao longo dessa jornada. À todos familiares, que mesmo distantes, sempre estiveram ao meu lado. Ao Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade, pela confiança depositada durante o desenvolvimento do mestrado. Obrigado pela orientação e por todo o aprendizado. Ao Prof. Dr. William de Castro Borges, pela coorientação e por todos os ensinamentos. Obrigado por ser sempre solícito, paciente e disposto a colaborar para a finalização deste trabalho. Aos amigos/irmãos da gloriosa República Cruz Vermelha, por fazerem parte do meu profissional

nesses

7

crescimento pessoal

anos

(bem)

vividos

e minha formação

em

Ouro

Preto.

Aos

cruzvermelhanos Katatau, Mr. Bin e Tomeli pela amizade durante a convivência diária na república. À Karina (LEP), que apesar de sermos apenas “colegas de trabalho”, mostrou-se ser uma grande amiga, suportando as minhas conversas e meus repetidos desabafos. Obrigado pelos inúmeros conselhos e por toda a ajuda.

v

Breguez, G. S.

Agradecimentos

Aos demais amigos do laboratório, principalmente aqueles os quais mais convivi (Jonathan, Igor, Marina, Lorran, Leandro, André, Simone, Aline). Obrigado pelas conversas, risadas e festas (“poucas, é verdade”), por todo o auxílio e incentivo para o término dessa dissertação. Ao nosso técnico, José Henrique Braga Fortes, muito obrigado por toda a ajuda e conselhos, principalmente nos momentos mais difíceis desse mestrado. À toda equipe do Laboratório de Caracterização Molecular da UFOP, pela disponibilização de equipamentos e auxílio na execução de alguns experimentos. Aos laboratórios do NUPEB, pela permissão e ajuda no uso de diversos aparelhos. Por fim, agradeço a todos que de maneira direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.

vi

Breguez, G. S.

Índice

ÍNDICE

Resumo......................................................................................................................................ix Abstract......................................................................................................................................x Lista de abreviaturas...............................................................................................................xi Lista de figuras.......................................................................................................................xiii Lista de tabelas.......................................................................................................................xiv 1. Introdução..............................................................................................................................2 1.1. Proteólise intracelular...............................................................................................2 1.2. O complexo proteolítico proteassoma 20S...............................................................3 1.3. Reguladores do proteassoma 20S.............................................................................5 1.4. Inibidores do proteassoma........................................................................................9 1.5. O proteassoma em Schistosoma mansoni...............................................................12 1.6. Peptídeos ricos em prolina e arginina: PR-39 e análogos......................................14 1.7. Síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS)...........................................................17 2. Justificativa..........................................................................................................................22 3. Objetivos..............................................................................................................................24 3.1. Objetivo geral.........................................................................................................24 3.2. Objetivos específicos..............................................................................................24 4. Materiais e métodos............................................................................................................26 4.1. Síntese de peptídeos...............................................................................................26 4.1.1. Ativação da resina...................................................................................26 4.1.2. Ativação e adição dos aminoácidos a serem acoplados..........................27 4.1.3. Clivagem do peptídeo..............................................................................28 4.1.4. Ciclização dos peptídeos contendo cisteína............................................28 4.1.5. Purificação dos peptídeos por cromatografia de fase reversa em sistema HPLC........................................................................................................................................29 4.1.6. Caracterização dos peptídeos por espectrometria de massas LCMS-ITTOF electrospray......................................................................................................................29 4.2. Extração de proteínas solúveis...............................................................................30 4.2.1. Fígado de camundongos Swiss................................................................30 vii

Breguez, G. S.

Índice

4.2.2. Eritrócitos humanos.................................................................................30 4.2.3. Vermes adultos do parasito Schistosoma mansoni..................................31 4.3. Cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400...................................32 4.3.1. Identificação das frações enriquecidas com o proteassoma 20S pela medida da atividade quimotripsina-símile................................................................................33 4.4. Eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)...................33 4.5. Obtenção de soro policlonal para a detecção de subunidades α do proteassoma 20S............................................................................................................................................34 4.6. Western Blotting.....................................................................................................35 4.7. Ensaios de atividade peptidásica com os inibidores sintetizados...........................35 4.8. Análise estatística...................................................................................................36 5. Resultados e discussão........................................................................................................38 5.1. Síntese de peptídeos...............................................................................................38 5.1.1. Síntese em fase sólida e purificação em sistema HPLC..........................38 5.1.2. Caracterização dos peptídeos por espectrometria de massas..................44 5.2. Identificação das frações enriquecidas com o proteassoma 20S submetidas à cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400.......................................................45 5.2.1. Ensaios de atividade peptidásica quimotripsina-símile...........................45 5.2.2. Análise dos perfis proteicos e ensaios de Western Blotting....................48 5.3. Medida da atividade peptidásica com os inibidores PR-11 e análogos..................50 5.3.1. Avaliação da atividade quimotripsina-símile..........................................50 5.3.1.1. Proteassoma 20S de camundongos e humanos.........................51 5.3.1.2. Proteassoma 20S de vermes adultos de S. mansoni..................52 5.3.2. Avaliação da atividade tripsina-símile....................................................52 6. Conclusões............................................................................................................................56 7. Perspectivas.........................................................................................................................58 8. Referências bibliográficas..................................................................................................60 9. Apêndice...............................................................................................................................73

viii

Breguez, G. S.

Resumo

RESUMO

O proteassoma tem sido considerado um potencial alvo farmacológico devido ao seu envolvimento em processos vitais relacionados à proteólise celular, sendo a mais importante entre as vias de degradação. Recentemente, foi demonstrado que moléculas análogas ao peptídeo PR-11(RRRPRPPYLPR), que corresponde aos 11 primeiros aminoácidos da porção N-terminal do peptídeo PR-39, apresentam uma forte inibição sobre o proteassoma humano 20S, inibindo a atividade quimotripsina-símile em concentrações namolares (nM). Os peptídeos

dessa

classe

desempenham

importantes

atividades

anti-inflamatórias

e

angiogênicas. Novas moléculas envolvendo substituições conservativas de aminoácidos e sínteses de peptídeos cíclicos podem ser derivadas dessas estruturas, com o intuito de se encontrar melhores inibidores. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos a síntese do peptídeo PR-11 e análogos para a realização de ensaios de atividade peptidásica in vitro, visando verificar o potencial inibitório dos peptídeos sintetizados em frações enriquecidas com proteassoma 20S de fígado de camundongos Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os peptídeos foram sintetizados empregando-se a estratégia Fmoc em fase sólida, purificados em sistema HPLC e identificados por espectrometria de massas. As frações com proteassoma 20S foram obtidas a partir de cromatografias de filtração molecular em Sephacryl S-400, as quais permitiram preparar satisfatoriamente enriquecidos de proteassoma livres de proteases de baixa massa molecular. Todos os análogos foram capazes de inibir a atividade quimotripsina-símile in vitro do proteassoma 20S das três espécies estudadas, utilizando a concentração final de 1μM de peptídeo. De um modo geral, as intensidades das atividades inibitórias foram similares para o proteassoma 20S de camundongos e humanos e menores para o de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os análogos cíclicos C8C15 e C9C15, quando comparados ao PR-11, apresentaram menor atividade sobre o proteassoma de humanos e atividade similar quanto à inibição em Schistosoma mansoni. Tal fato sugere que esse tipo de alteração estrutural possa ser útil na busca por inibidores mais seletivos para o proteassoma 20S do parasito.

ix

Breguez, G. S.

Abstract

ABSTRACT

The proteasome has been considered a potential pharmacologic target due to its participation in various processes related to intracellular protein turnover. It was recently demonstrated that analogues of the PR-11 peptide (RRRPRPPYLPR), which corresponds to the first 11 amino acids of the PR-39 molecule, exhibit a potent inhibition over the human 20S proteasome. At the tissue level, these peptides display anti-inflammatory and angiogenic properties. Therefore, new molecules containing conservative amino acid substitutions as well as cyclic analogues could be designed towards the production of more suitable inhibitors. The present work aimed the synthesis of the PR-11 peptide and its various analogues followed by their use in peptidasic assays containing 20S proteasome enriched fractions obtained from mice liver, human erythrocytes and Schistosoma mansoni adult worms. Peptides were synthesized through the Fmoc strategy in solid phase, purified by HPLC and identified by mass spectrometry. Proteasome containing fractions were recovered after gel filtration in Sephacryl-S400. This resulted in fractions free of contaminating low molecular mass proteases. All PR-11 analogues were able to inhibit at 1μM the 20S proteasome chymotrypsinlike activities from the three investigated species. Overall the intensities of inhibitory activities were similar to 20S proteasomes from mice and human and comparatively lower for the S. mansoni complex. The cyclic analogues C8C15 and C9C15 exhibited decreased inhibitory activity over the human 20S proteasome compared to PR-11, however, a significant inhibition towards the parasite´s proteasome was observed. Altogether, our data suggest that cyclic PR-11 analogues represent interesting alternatives for the development of more selective proteasome inhibitors.

x

Breguez, G. S.

Lista de abreviaturas

LISTA DE ABREVIATURAS ACN – Acetonitrila

mA – Miliampere

ADP – Adenosine diphospate

MDa – MegaDaltons

ALLN – Acetil-Leu-Leu-norleucinal

MG115 – Cbz-Leu-Leu-norvalinal

ATP – Adenosine triphosphate

MG132 – Cbz-Leu-leucinal

BCA – Bicinchoninic Acid

MHC – Major histocompability complex

CEUA – Comissão de Ética no Uso de

MPTs – Modificações pós-traducionais

Animais

NBT/BCIP – Nitro Blue Tetrazolium/5-

DCM – Diclorometano

Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato

DMF – Dimetilformamida

PA – Proteassome activator

DMSO – Dimetilsulfóxido

Pbf

DTT – Ditiotreitol

benzofuran-5-sulfonyl

E1 – Enzimas ativadoras

PBS – Tampão fosfato salino

E2 – Enzimas conjugadoras

pI – ponto isoelétrico

E3 – Enzimas ligases

PI31 – Protein inhibitor of 31 kDa

FGF – Fibroblast growth factor

PSI – Cbz-Ile-Glu(O-t-Bu)-Ala-leucinal

Fmoc – 9-fluorenilmetiloxicarbonil

PVDF – Polyvinylidene Fluoride

HF – Ácido fluorídrico

qRT-PCR – Quantitative real-time PCR

HIF-1α – Hypoxia inducible factor-1α

RMN – Ressonância magnética nuclear

HOBt – 1-hidroxibenzotriazol

Rpn – Regulatory particle non-ATPase

HPLC

–

High

Performance

–

2,2,4,6,7-pentamethyldihydro-

Rpt – Regulatory particle of triple-ATPase

Liquid

Chromatography

SDS – Dodecil sulfato de sódio

IC50 – Concentração inibitória 50%

SPFS – Síntese de peptídeos em fase

ICAM-1

–

Intercellular

adhesion

sólida

molecule-1

t-Boc – tert-butiloxicarbonil

IL – Interleucina

TFA – Ácido trifluoracético

INF-γ – Interferon-gamma

TNF-α – Tumor necrosis factor-αlpha

kDa – KiloDaltons

Tris – Tris-(hidroximetil)-aminometano

LCMS-IT-TOF

–

Liquid

Trt – Tritil

Chroma-

tography Ion Trap Time Of Flight

xi

Breguez, G. S.

UAF

–

Unidades

Lista de abreviaturas

arbitrárias

de

VCAM-1

–

Vascular

cell

adhesion

fluorescência

molecule-1

Ub – Ubiquitina

VEGF – Vascular endothelial growth

UV – Ultravioleta

factor

V – Volts

WHO – World Health Organization

xii

Breguez, G. S.

Lista de figuras

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura do proteassoma 20S em eucariotos ............................................................4 Figura 2: O sistema de ubiquitinação .......................................................................................7 Figura 3: Quantidade relativa das diferentes formas do proteassoma 20S encontradas no citosol de células HeLa ..............................................................................................................8 Figura 4: Sítios de ação dos inibidores do proteassoma .........................................................11 Figura 5: Mecanismo de inibição reversível do bortezomib sobre a subunidade β5 do proteassoma 20S ......................................................................................................................12 Figura 6: Regulação proteassomal do fator de transcrição NFκB ..........................................16 Figura 7: Esquema geral da síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS) ...............................18 Figura 8: Etapas realizadas para a extração de proteínas solúveis a partir fígado de camundongos Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de S. mansoni .............................32 Figura 9: Perfis cromatográficos iniciais em sistema HPLC dos peptídeos sintetizados .......39 Figura 10: Estrutura dos aminoácidos derivatizados arginina e triptofano ............................41 Figura 11: Estrutura do aminoácido derivatizado cisteína .....................................................42 Figura 12: Perfis cromatográficos em sistema HPLC dos peptídeos nas condições cromatográficas que permitiram a purificação .........................................................................43 Figura 13: Espectros de massas obtidos por LCMS-IT-TOF electrosray dos análogos F8W12, I9F12 e I9W12 ...........................................................................................................44 Figura 14: Cromatogramas a 280 nm e medidas da atividade peptidásica quimotripsinasímile dos extratos proteicos de fígado de camundongo Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni submetidos à cromatografia em Sephacryl S-400 ...............46 Figura 15: SDS-PAGE 10% e ensaios de Western Blotting das frações enriquecidas com proteassoma 20S identificadas pela medida da atividade quimotripsina-símile ......................48 Figura 16: Perfil de enriquecimento com proteassoma 20S da amostra de fígado de camundongo submetido à cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400 ............49 Figura 17: Atividade inibitória dos peptídeos sintetizados sobre o proteassoma 20S de camundongos, humanos e vermes adultos de S. mansoni.........................................................50 Figura 18: Atividade inibitória dos peptídeos PR-11, C8C15 e C9C15 sobre o proteassoma 20S de humanos e vermes adultos de S. mansoni ....................................................................53 xiii

Breguez, G. S.

Lista de tabelas

Figura 19: Avalição da atividade tripsina-símile de proteassomas 20S de fígado de camundongo na presença dos peptídeos PR-11, W12, F12 e C9C15 ......................................53 Figura 20: Recromatografias em sistema HPLC e caracterização por espectrometria de massas de todos os peptídeos purificados ................................................................................73

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Diferentes classes de inibidores do proteassoma ....................................................10 Tabela 2: Peptídeos sintetizados com suas respectivas sequências ........................................27

xiv

1. Introdução

Breguez, G. S.

Introdução

1. INTRODUÇÃO

1.1. Proteólise intracelular

A funcionalidade e viabilidade de uma célula são mantidas pelo seu conjunto de proteínas denominado proteoma (Wilkins et al., 1996). O proteoma é dependente do turnover protéico, definido como o estado dinâmico de equilíbrio entre os processos de síntese e degradação. A síntese ocorre pela transcrição do DNA a RNA mensageiro acoplado a tradução a proteínas, enquanto a degradação envolve diferentes vias de proteólise, realizada por um grupo heterogêno de enzimas denominadas proteases (Turk, 2006; Jung et al., 2009). Proteases são moléculas capazes de promover a hidrólise de ligações peptídicas, tendo ampla distribuição filogenética. De acordo com a posição da ligação a ser clivada, as proteases podem ser classificadas em exopeptidases e endopeptidases. As exopeptidases clivam ligações peptídicas nas extremidades amino e carboxi-terminal das proteínas, enquanto as endopeptidases realizam a clivagem no meio da cadeia polipeptídica. Considerando os diferentes mecanismos catalíticos de hidrólise envolvendo o sítio ativo, as proteases podem ser divididas em seis classes: metalo-proteases, serino-proteases, cisteíno-proteases, aspárticoproteases, glutâmico-proteases e treonino-proteases (Neurath, 1994; Turk, 2006). A degradação de proteínas é essencial para a manutenção da homeostase celular. As células possuem diversos sistemas proteolíticos associados a complexos mecanismos regulatórios que juntos asseguram a degradação seletiva de substratos alvo. Falhas na degradação de proteínas de meia-vida curta ou uma proteólise desorganizada podem afetar drasticamente as funções celulares (Hargrove and Schmidt, 1989). As células eucarióticas possuem ao menos três importantes vias proteolíticas, as quais podem atuar de maneira coordenada e cooperativa (Donald and Judith, 1995). A via lisossomal constitui uma rota segregada para degradação protéica, devido suas enzimas proteolíticas, denominadas catepsinas, localizarem-se no interior de uma membrana lipídica formando o lisossoma (Guha and Padh, 2008). Um outro grupo de enzimas, de micro e macro calpaínas, refere-se a uma via intracelular dependente de cálcio envolvida na degradação de proteínas do citoesqueleto, de transdução de sinal e fatores de transcrição (Mykles, 1998; 2

Breguez, G. S.

Introdução

Dargelos et al., 2008). A proteólise dependente do proteassoma é formada por uma partícula central (proteassoma 20S) e várias proteínas reguladoras que podem alterar a atividade e a especificidade do complexo (Glickman and Ciechanover, 2002; Jung et al., 2009).

1.2. O complexo proteolítico proteassoma 20S

O proteassoma recebeu diferentes nomes ao longo dos anos, sendo a nomenclatura atual proposta por Arrigo et al., 1988, para indicar sua natureza proteolítica e particulada e, desde então, esta denominação tem sido amplamente utilizada. O proteassoma é altamente conservado, estando presente em todas as células eucarióticas (Voges et al., 1999) e em diferentes espécies de arquéias (Rivett, 1993) e bactérias (Tamura et al., 1995). Apresenta localização tanto citoplasmática quanto nuclear, podendo representar até 1% das proteínas totais de uma célula (Coux et al., 1996). Particularmente no citoplasma, a degradação pelo sistema proteassomal é a mais importante entre as vias de proteólise. Está envolvido nos mais distintos processos: degradação de proteínas oxidadas e/ou danificadas, regulação da meiavida proteica, regulação do ciclo celular, expressão gênica, stress, reposta imune, carcinogênese, reparo de DNA (Jung et al., 2009). O proteassoma 20S, o qual possui uma massa molecular aproximada de 700-750 kDa, pode estar ligado ou não em suas terminações por partículas regulatórias, sendo formado por múltiplas subunidades de 19 a 36 kDa (Peters, 1994). A nomenclatura 20S refere-se ao coeficiente de sedimentação desta partícula central isolada (Hough et al.,1987). Estudos de microscopia eletrônica e cristalografia de raio-X revelaram que esta estrutura é cilíndrica, possuindo um diâmetro aproximado de 10 nm e um comprimento de 16 nm. O proteassoma 20S é composto por quatro anéis superpostos com sete subunidades cada um, o que favorece a formação de um poro central por onde passam as proteínas totalmente desenoveladas para, então, serem degradadas. Os dois anéis periféricos são compostos de 7 subunidades alfa e os dois centrais por 7 subunidades do tipo beta, formando um arranjo al., 1995; Baumeister et al., 1998).

3

(figura 1) (Löwe et

Breguez, G. S.

Introdução

Figura 1: Estrutura do proteassoma 20S em eucariotos. Quatro anéis heptaméricos superpostos mantêm a estrutura cilíndrica ou em forma de barril do proteassoma 20S. Os anéis periféricos são compostos de 7 subunidades catalíticas

e os dois centrais por 7 subunidades , formando um arranjo 1,

2 e

. Em destaque, as subunidades

5 responsáveis pelas atividades proteolíticas semelhantes às de caspase, tripsina e

quimotripsina, respectivamente. Fonte: Jung et al., 2009.

Além da manutenção estrutural em forma de cilindro, as subunidades

controlam a

ligação de partículas regulatórias ao proteassoma 20S. No proteassoma 20S de eucariotos, ao menos três subunidades

demonstram importantes atividades catalíticas, sendo as

subunidades 1, 2 e 5 responsáveis pelas atividades proteolíticas semelhantes às de caspase (peptidil-glutamil hidrolase), tripsina e quimotripsina, clivando ligações peptídicas após o Cterminal de aminoácidos ácidos, básicos e hidrofóbicos, respectivamente. A cadeia lateral do resíduo de treonina aminoterminal (Thr-1) das subunidades

age como o nucléofilo

responsável pelo ataque catalítico ao carbono carbonil da ligação peptídica, sendo as subunidades proteolíticas 1, 2 e 5 os locais que abrigam os sítios ativos (Kloetzel, 2001). As subunidades proteolíticas são capazes de processar tanto a degradação de proteínas quanto peptídeos, gerando sequências curtas de 3 a 15 aminoácidos. Uma vez liberados no citosol, amino e carboxipeptidases podem atuar sobre estes oligopeptídeos, reciclando, assim, aminoácidos para o meio celular (Tanaka, 2009).

4

Breguez, G. S.

Introdução

As subunidades componentes do proteassoma 20S variam entre as espécies. As arqueobactérias, por exemplo, contém anéis externos com apenas um tipo de subunidade alfa e anéis internos com subunidades beta, dispostos em um arranjo

7 7 7 7

(Dahlmann et al.,

1989). O proteassoma 20S de eucariotos exibem o mesmo arranjo de subunidades, mas contem 7 diferentes alfa e beta (

1-7 1-7 1-7 1-7 )

(Baumeister et al., 1998).

Outra diferença entre proteassomas de diferentes espécies está relacionada com a atividade catalítica preferencial. Entre a maioria dos eucariotos, a atividade principal é a atividade semelhante à quimotripsina, enquanto que nos tripanossomatídeos a atividade principal é a semelhante à tripsina (Paugam et al., 2003). Já o proteassoma da arqueobactéria Thermoplasma acidophilum possui as 14 subunidades

proteoliticamente ativas, porém

apresenta apenas a atividade semelhante à quimotripsina (Wenzel and Baumeister, 1993; Orlowski and Wilk, 2000).

1.3. Reguladores do proteassoma 20S

A degradação proteolítica pelo proteassoma é altamente eficaz, devendo ser estritamente regulada para evitar a proteólise descontrolada das proteínas celulares. A abertura ordenada do poro central do proteassoma 20S permite a entrada seletiva de substratos específicos. Ao longo da evolução, vários reguladores surgiram a fim de controlar o reconhecimento e a degradação das proteínas-alvo (Jung et al., 2009). O regulador do proteassoma melhor descrito na literatura é o complexo denominado 19S ou PA700 (Proteasome Activator 700 kDa) (DeMartino et al., 1994). O proteassoma 20S associado aos complexos 19S formam o proteassoma 26S, sendo encontrado apenas em eucariotos. O proteassoma 26S apresenta uma massa molecular aproximada de 2.0-2.5 MDa, com um coeficiente de sedimentação entre 26-30S. Esse complexo enzimático é responsável pela degradação de substratos alvos marcados com a proteína ubiquitina (Ub). A proteólise seletiva envolve uma série de proteínas que podem estar relacionadas a vários processos regulatórios (Coux et al., 1996; Tanaka, 2009).

5

Breguez, G. S.

Introdução

O complexo 19S é didaticamente dividido em dois subcomplexos denominados base e tampa. A base é formada por seis subunidades ATPásicas (Regulatory particle of tripleATPase – Rpt1-Rpt6) e quatro subunidades não-ATPásicas (Regulatory particle non-ATPase – Rpn1, Rpn2, Rpn10 e Rpn13), possuindo três principais funções: reconhecimento e desenovelamento de proteínas poliubiquitinadas, e abertura do anel

externo. Já o complexo

tampa é composto por ao menos nove subunidades não-ATPásicas (Rpn3, Rpn5-Rpn9, Rpn11, Rpn12 e Rpn15), sendo responsável pela desubiquitinação de proteínas capturadas e, consequentemente, a reciclagem das moléculas de ubiquitina (Tanaka, 2009; Lasker et al., 2012). A ubiquitina é uma proteína de 76 aminoácidos, altamente conservada, utilizada na marcação ATP-dependente de substratos proteicos destinados à degradação (Peters, 1994). O processo de ubiquitinação se dá através de ligações isopeptídicas, que envolvem a ativação da glicina C-terminal da ubiquitina por uma enzima ativadora (E1), a transferência da ubiquitina para uma enzima conjugadora (E2), e, finalmente, após a ligação do complexo E2-ubiquitina a um enzima ligase (E3), a ubiquitina é transferida diretamente para um resíduo de lisina do substrato alvo ou primeiramente para a E3 e desta para o substrato (figura 2). Para que haja o reconhecimento e a degradação da proteína alvo pelo proteassoma 26S, esta deve ser poliubiquitinada com ao menos quatro moléculas, processo o qual envolve o resíduo de lisina 48 da ubiquitina (Glickman and Ciechanover, 2002). Existe uma hierarquia estrutural destes grupos de enzimas envolvidas no processo de ubiquitinação. Em mamíferos, foram identificadas duas E1, em torno de trinta E2 e centenas de E3 (mais de setecentas), conferindo, assim, uma interação específica das enzimas E3 com os substratos a serem ubiquitinados (Jariel-Encontre et al., 2008).

6

Breguez, G. S.

Introdução

Figura 2: O sistema de ubiquitinação. Depois de uma ativação ATP-dependente da glicina C-terminal de uma molécula de ubiquitina (Ub) por E1, a Ub é transferida para E2, e, finalmente, após a ligação do complexo E2ubiquitina a E3, a Ub é transferida diretamente para um resíduo de lisina do substrato alvo (A) ou primeiramente para E3 e desta para o substrato (B). O substrato poliubiquitinado com ao menos quatro moléculas de Ub é reconhecido e degradado pelo proteassoma 26S. Fonte: adaptado de Hoeller and Dikic, 2009.

Outros importantes reguladores do proteassoma 20S são as partículas denominadas 11S ou PA28, capazes de se ligarem aos anéis , aumentado a taxa de proteólise de proteínas desenoveladas de uma maneira independente de ATP (Rechsteiner et al., 2000). Os reguladores PA28 são encontrados como complexos heterogêneos de seis ou sete subunidades (cadeias

e ) ou complexos homogêneos de sete subunidades (cadeia γ). A distribuição

intracelular de PA28αβ é preferencialmente no citoplasma, enquanto que o PA28γ é de localização nuclear. A partícula PA28αβ associada ao proteassoma 20S está envolvida na apresentação de antígenos via MHC de classe I, formando o complexo PA28αβ-20S-PA28αβ denominado imunoproteassoma. Durante a formação do imunoproteassoma, as subunidades β proteoliticamente ativas são substituídas por outras equivalentes (β1i, β2i e β5i) induzidas por sinais celulares como o INF-γ e TNF-α (Rivett et al., 2001; Lin et al., 2005). A função biológica do PA28γ é pouco compreendida, porém há estudos que relacionam este complexo com a regulação do ciclo celular e apoptose (Rechsteiner and Hill, 2005). A literatura demonstra que o proteassoma 20S pode estar ligado em uma extremidade pela partícula 19S e na extremidade oposta pela PA28αβ, formando a estrutura denominada 7

Breguez, G. S.

Introdução

proteassoma híbrido (Tanahashi et al., 2000). A exata função deste complexo é desconhecida, estando envolvido com o processamento de antígenos e eficiência da taxa de proteólise (Hendil et al., 1998). A figura 3 ilustra as quantidades relativas do proteassoma 20S associado a seus reguladores encontrados no citosol de células HeLa (Tanahashi et al., 2000), ilustrando a dinâmica e a heterogeneidade dos processos de regulação. Um dos mais recentes ativadores do proteassoma 20S são as partículas PA200, localizadas exclusivamente nos núcleos celulares com uma massa molecular de 200 kDa. Foi proposto que o papel funcional do PA200 relaciona-se ao reparo de DNA (Ustrell et al., 2002). Diferentemente dos reguladores citados até o momento, o PI31 (Protein Inhibitor of 31 kDa) atua como um inibidor endógeno do proteassoma 20S (Chu-Ping et al., 1992). O PI31, proteína rica em prolina, age como um modulador seletivo do proteassoma, mediando as vias de processamento de antígeno via MHC de classe I e a maturação dos precursores do imunoproteassoma (Zaiss et al., 2002).

Figura 3: Quantidade relativa das diferentes formas do proteassoma 20S encontradas no citosol de células HeLa (Tanahashi et al., 2000). Fonte: Adaptado de Jung et al., 2009.

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Breguez, G. S.

Introdução

Vários tipos de modificações pós-traducionais (MPTs) também regulam o proteassoma 20S. Em resposta a diferentes estímulos biológicos, as MPTs modulam a montagem, a meia-vida e a atividade do proteassoma 20S. Dentre outras modificações, a fosforilação, desfosforilação, glicosilação, nitrosilação, acetilação, glutationilação e ADPribosilação do proteassoma já foram documentadas (Kimura et al., 2000; Iwafune et al., 2002; Zong et al., 2008).

1.4. Inibidores do proteassoma

O proteassoma têm sido considerado um potencial alvo terapêutico em muitas patologias, dado o seu envolvimento em várias vias fisiológicas através da clivagem de numerosos reguladores do ciclo celular, antígenos proteicos e fatores de transcrição (Reinstein and Ciechanover, 2006). Nos últimos 20 anos, investigações com inúmeros inibidores proporcionaram a descoberta de importantes mecanismos celulares envolvendo o proteassoma (Kisselev et al., 2012). A primeira consequência da inibição do proteassoma é uma diminuição global do nível de proteólise celular, levando a um rápido acúmulo de proteínas de meia-vida curta, oxidadas e/ou danificadas. Este acumulado de proteínas desencadeia um aumento na expressão de proteínas heat shock como um mecanismo de proteção contra as condições tóxicas do ambiente celular (Kisselev and Goldberg, 2001). Observa-se que, na maior parte das espécies, apenas a inibição da atividade semelhante à quimotripsina já causa uma grande diminuição nos níveis de degradação. Por outro lado, a inativação dos sítios das atividades semelhantes à caspase e tripsina tem pouco efeito sobre a proteólise total. Os inibidores da atividade quimotripsina-símile são hidrofóbicos, sendo mais permeáveis à membrana celular. De modo contrário, os inibidores das atividades tripsina- e caspase-símile contêm resíduos carregados que dificultam a captação pela célula (Heinemeyer et al., 1997; Kisselev et al., 1999). Os inibidores do proteassoma são classificados como sintéticos ou naturais, apresentando uma grande diversidade de estruturas químicas (Tabela 1). Alguns inibidores sintéticos são formados pela combinação de um peptídeo com um grupo farmacofórico 9

Breguez, G. S.

Introdução

reativo como, por exemplo, aldeídos, boronatos, vinilsulfonas, semicarbazonas, dentre outros (Bochtler et al., 1999). Os peptídeos aldeídicos foram os primeiros inibidores a serem identificados e, a partir destes, inúmeros outros têm sido desenvolvidos (Vinitsky et al., 1992; Rock et al., 1994). Dentre os peptídeos aldeídicos, os mais utlizados são o Cbz-Leu-leucinal (MG132), Cbz-Leu-Leu-norvalinal (MG115), acetil-Leu-Leu-norleucinal (ALLN) e Cbz-IleGlu(O-t-Bu)-Ala-leucinal (PSI). Estes agentes são análogos de substratos e potentes inibidores da atividade semelhante à quimotripsina do proteassoma (Rock et al., 1994). Tabela 1: Diferentes classes de inibidores do proteassoma. Fonte: adaptado de de Bettignies and Coux, 2010.

Classes de inibidores do proteassoma Peptídeos aldeídicos

Flavonóides

Peptídeos vinilsulfonas

Triterpenóides

Peptídeos boronatos

Derivados de enxofre

Peptídeos epoxicetonas

Derivados TMC-95

Peptídeos semicarbazonas

Peptídeos naturais

Sirbactinas

Pseudo-peptídeos

Beta-lactonas

Compostos organometálicos

Além dos inibidores sintéticos, existem vários inibidores naturais do proteassoma que exibem uma ampla variedade de grupos farmacofóricos. Epoxicetonas e beta-lactonas são as classes de inibidores naturais com mais compostos conhecidos, tendo como principais estruturas a epoximicina e a lactacistina, respectivamente. Assim como outras dezenas de inibidores, estas estruturas atuam diretamente sobre os resíduos de treonina (Thr-1) das subunidades β proteolíticas (Myung et al., 2001). Existem inibidores do proteassoma que não agem diretamente sobre os sítios catalíticos. Como exemplos, a cloroquina atua sobre o proteassoma pelo seu lado externo, através da interação com a interface formada entre as subunidades α e β (Sprangers et al., 2008). Já o peptídeo natural PR-39 liga-se às subunidades α, dificultando a ligação de partículas regulatórias às extremidades do proteassoma 20S (figura 4) (Gao et al., 2000).

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Breguez, G. S.

Introdução

Figura 4: Sítios de ação dos inibidores do proteassoma. O inibidor reversível bortezomib e os inibidores irreversíveis carfilzomib, ONX 0192 e NPI 0052 (salinosporide A) se ligam diretamente à subunidade proteolítica β5. A cloroquina atua sobre o proteassoma pelo seu lado externo, através da interação com a interface entre as subunidades α e β. O peptídeo PR-39 liga-se às subunidades α dificultando a interação de partículas regulatórias. Fonte: Ruschak et al., 2011.

Nos últimos anos, têm sido demonstrado que inibidores do proteassoma são capazes de induzir a apoptose de algumas células malignas em cultura (Mitsiades et al., 2002; Poulaki et al., 2007). Tal propriedade não é surpreendente, dado o importante papel do proteassoma na regulação dos níveis de muitas proteínas necessárias para a manutenção da homeostase celular. O que é intrigante é o fato da inibição ser preferencialmente tóxica para células tumorais, através de um padrão específico e coordenado de transcrição gênica direcionado a eventos pró-apoptóticos (Ruschak et al., 2011). A atividade anti-tumoral baseada na inibição do proteassoma tem encorajado muitos pesquisadores a desenvolver novas estruturas ativas (Baldisserotto et al., 2009). Dessa forma, encontram-se em fases clínicas I e II: CEP-18770, MLN-9708, carfilzomib (PR-171), NX 0912 e salinosporamide A (NPI 0052) (Ruschak et al., 2011). Bortezomib (PS-341 ou Velcade®), um inibidor do tipo peptídeo boronato, é o primeiro e, atualmente, o único inibidor do proteassoma aprovado para uso clínico, sendo utilizado para o tratamento de mieloma múltiplo e linfoma desde 2003 (de Bettignies et al., 11

Breguez, G. S.

Introdução

2010). O bortezomib é um inibidor competitivo do proteassoma, ligando-se reversivelmente à subunidade catalítica β5 (figura 5). Apesar da eficácia deste composto, inibidores do proteassoma com diferentes mecanismos de ação têm sido desenvolvidos no intuito de superar a resistência e a toxicidade ao bortezomib observada em alguns pacientes (Ruschak et al., 2011).

Figura 5: Mecanismo de inibição reversível do bortezomib sobre a subunidade β5 do proteassoma 20S. Fonte: adaptado de Moore et al., 2008.

Dezenas de estudos em animais têm indicado que os inibidores do proteassoma podem ser úteis no tratamento de outras neoplasias. Além disso, benefícios destes inibidores na terapêutica experimental de doenças cardiovasculares, distrofias musculares, pancreatite aguda, artrites, disfunção renal aguda, isquemia cerebral, dentre outras patologias, já foram destacadas pela literatura (Meiners et al., 2007).

1.5. O proteassoma em Schistosoma mansoni

A esquistossomose mansônica humana, popularmente conhecida como barriga d´água, xistose ou mal do caramujo, é causada pelo helminto Schistosoma mansoni. Esta doença possui uma ampla distribuição geográfica, sendo endêmica em 76 países, constituindo, dessa forma, uma das parasitoses humanas mais difundidas mundialmente. De acordo com WHO (2010), 207 milhões de pessoas estão infectadas e que 1,7 milhões dessas estão gravemente incapacitadas pela doença. Anualmente, a mortalidade estimada é superior a 280 mil pessoas e cerca de 600 milhões estão expostas ao risco de contaminação (Engels et al., 2002). O Brasil,

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Introdução

devido ao clima tropical e condições favoráveis à transmissão da parasitose, também é um país endêmico, tornando-a um importante problema de saúde pública (Katz et al., 2003). Uma vez que genes que codificam subunidades do proteassoma estão sendo identificados nos mais diversos organismos (Voges et al., 1999) e que a proteólise regulada por este influencia o ciclo celular, o controle transcricional e outros processos celulares críticos, é possível admitir que o proteassoma possa constituir um importante alvo de ação de drogas no combate a essa parasitose. Em 2005, Guerra-Sá et al. descreveram pela primeira vez as evidências bioquímicas para a existência do proteassoma 20S em cercárias e vermes adultos deste parasito. Todas as três atividades proteolíticas mais bem caracterizadas do proteassoma estão presentes, com a predominância da atividade semelhante à quimotripsina. Essa principal atividade do proteassoma foi analisada em cercárias e vermes adultos na presença de alguns inibidores clássicos, como o MG-132, a epoximicina e a lactacistina, onde todos demostraram, em baixas concentrações, uma inibição em torno de 90%. Os perfis de atividades proteolíticas e inibição com inibidores clássicos dos proteassomas de Schistosoma mansoni e eucariotos se aproximam, diferenciando-se dos proteassomas de parasitos protozoários (Guerra-Sá et al., 2005). A via dependente de ubiquitina-proteassoma também está envolvida em outros estágios do ciclo biológico, como no desenvolvimento dos ovos eliminados pelo parasito (Mathieson et al., 2011). Além disso, a estrutura do inibidor PI31 é altamente conservada no parasito, sendo expressa em seus diferentes estágios biológicos (Botelho-Machado et al., 2010). O uso de ferramentas de genômica e proteômica vem sendo utilizadas para a caracterização do proteassoma em Schistosoma mansoni (Nabhan et al., 2007; Castro-Borges et al., 2007). A partir da comparação do genoma completo deste parasito e as sequências gênicas das subunidades do proteassoma de leveduras e humanos, foram identificadas 31 sequências homólogas, das quais 14 são referentes às subunidades

e , indicando que a

organização estrutural deste proteassoma 20S é similar entre as demais espécies. Pela análise de algumas dessas subunidades por qRT-PCR (quantitative real-time PCR), observou-se que as quantidades de proteassoma são diferentemente expressas entre as formas evolutivas do parasito (Nabhan et al., 2007). O proteassoma 20S do verme adulto foi purificado com sucesso a partir de um protocolo desenvolvido por Castro-Borges et al., 2007. A análise por eletroforese 13

Breguez, G. S.

Introdução

bidimensional e espectrometria de massas do proteassoma isolado permitiu a caracterização das subunidades

e

, as quais possuem uma considerável diversidade de isoformas,

provavelmente decorrentes de uma série de modificações pós-traducionais. Os fatores que controlam o desenvolvimento do Schistosoma mansoni são de grande interesse para o entendimento dos processos metabólicos, associados com a biologia do parasito, envolvidos na esquistossomose (Guerra-Sá et al., 2005). Dessa forma, um melhor entendimento do proteassoma do Schistosoma mansoni, seu papel no desenvolvimento do parasito e os efeitos da ação de inibidores sobre este complexo podem levar à descoberta de novos agentes quimioterápicos (Nabhan et al., 2007).

1.6. Peptídeos ricos em prolina e arginina: PR-39 e análogos

PR-39 é um peptídeo da família das catelicidinas rico nos aminoácidos prolina e arginina (49% e 24%, respectivamente - RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRF PPRFP), tendo sido originalmente isolado do intestino de suínos por exibirem propriedades antimicrobianas (Agerberth et al., 1991; 1996). O PR-39 e homólogos são secretados por macrófagos, sendo encontrados em fluidos de feridas de muitos animais e em lesões de infarto agudo do miocárdio (Gallo et al., 1994). Assim como os demais compostos da família das catelicidinas, este peptídeo catiônico é sintetizado como um precursor inativo e estocado em grânulos celulares como um pró-peptídeo. Sob ativação celular e degranulação, o PR-39 maduro é liberado por uma rápida clivagem do peptídeo sinal N-terminal (Gudmundsson et al., 1995; Lehrer et al., 2002). Este peptídeo é capaz de atravessar rapidamente as membranas celulares (Chan and Gallo, 1998). O mecanismo de inibição do PR-39 sobre o proteassoma é alostérico, através da interação reversível com as subunidades α7. Dado que este peptídeo é positivamente carregado (pI – ponto isoelétrico – teórico = 12.60), ligações iônicas entre os resíduos de arginina do PR-39 e a porção ácida C-terminal das subunidades α7 (pI teórico = 3.45) são propostas como as responsáveis pelo mecanismo de ação (Gao et al., 2000; Gaczynska et al., 2003). Estudos utilizando microscopia de força atômica demonstraram que a ligação do PR39 ao proteassoma 20S altera sua forma cilíndrica. Além disso, em decorrência da semelhança 14

Breguez, G. S.

Introdução

estrutural do PR-39 com uma porção do regulador 19S, a sua ligação inibe a montagem do proteassoma 26S. Esses efeitos do PR-39 foram observados tanto em proteassomas de leveduras quanto humanos (Gaczynska et al., 2003). A maior parte dos inibidores do proteassoma em estudo são competitivos, os quais bloqueiam diretamente os sítios catalíticos, impedindo a clivagem de uma grande quantidade de substratos destinados à degradação pelo proteassoma e desencadeando a apoptose celular. Ao contrário destes, inibidores alostéricos oferecem um potencial de uso mais preciso, visto que a atividade sobre o proteassoma se manifesta de modo regulatório, não influenciando de forma significativa as taxas de proteólise por este complexo (Gaczynska et al., 2003). Nos últimos anos, diferentes pesquisadores têm demonstrado os efeitos e as bases moleculares da inibição do PR-39 sobre o proteassoma, exibindo como principais atividades a diminuição de danos inflamatórios e a indução da angiogênese. Estes processos são parcialmente explicados pela inibição da degradação seletiva pelo proteassoma dos fatores IκB e HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor -1α), respectivamente (Gao et al., 2000; Li et al., 2000; Bao et al., 2001) O fator de transcrição NFκB é o regulador de uma série de genes que codificam citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, moléculas de adesão celular e receptores de superfície (Pando and Verma, 2000; Frankland-Searby and Bhaumik, 2011). Em células não estimuladas, o NFκB está disperso no citoplasma como um complexo formado pelas suas subunidades p50 e p65 ligados ao seu inibidor IκB. Quando as células são estimuladas (por citocinas ou stress), a enzima IκB quinase é ativada, fosforilando duplamente o fator IκB. Uma vez fosforilado, o IκB é reconhecido por uma E3 ligase, levando à ubiquitinação. O IκB é então degradado pela via proteassomal, liberando o NFκB que transloca-se para o núcleo e desencadeia a transcrição de diferentes genes (figura 6) (Wu, 2002). A inibição da degradação proteassomal do IκB pelo PR-39 diminui a expressão de moléculas dependentes do fator de transcrição NFκB, como as moléculas de adesão celular VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1) e ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1). Portanto, o PR-39 reduz a lesão em estados inflamatórios por diminuir a adesão de leucócitos no endotélio e, consequentemente, o fluxo destas para os tecidos (Gao et al., 2000; Bao et al., 2001).

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Breguez, G. S.

Introdução

Figura 6: Regulação proteassomal do fator de transcrição NFκB. Após a fosforilação do IκB e sua degradação pelo proteassoma 26S, o NFκB, formado pelas subunidades p50 e p65, é liberado para o núcleo e ativa a expressão gênica (VCAM: Vascular Cell Adhesion Molecule; ICAM: Intercellular Adhesion Molecule). Fonte: adaptado Jung et al., 2009.

O PR-39 também é capaz de estimular a angiogênese, tanto in vitro quanto in vivo. Estudos demonstraram que a expressão transgênica do PR-39 em cardiomiócitos resultou no aumento do número de vasos, redução da resistência coronariana e hipertrofia miocárdica (Li et al., 2000; Tirziu et al., 2007). Estes efeitos são explicados pela inibição da degradação via ubiquitina-proteassoma da proteína HIF-1α, a qual regula a expressão de muitos genes relacionados à angiogênese, incluindo o VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) e o seu receptor FLT1 (Chan and Gallo, 1998). Além disso, o PR-39 aumenta a expressão de receptores do fator FGF (Fibroblast Growth Factor), como o receptor FGFR-1, sugerindo a atividade angiogênica do peptídeo através desta via (Li et al., 1997; Volk et al., 1999). Para definir a região do PR-39 envolvida diretamente na interação com o proteassoma 20S, Gaczynska et al., 2003, produziram variantes do peptídeo com progressivas deleções de aminoácidos a partir de sua extremidade C-terminal. Estes pesquisadores demonstraram que o peptídeo contendo os 11 primeiros aminoácidos da região N-terminal conservados da

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Breguez, G. S.

Introdução

sequência do PR-39 (PR-11 – RRRPRPPYLPR) inibe eficientemente o proteassoma in vitro de maneira dose-dependente. Estes resultados observados in vitro estão de acordo com os dados in vivo, uma vez que a indução da angiogênese pelo PR-11 foi similar à observada pelo PR-39. A partir de estruturas análogas de peptídeos sintéticos e estudos espectroscópicos de ressonância magnética nuclear (RMN), Anbanandam et al., 2008, identificaram alguns requisitos estruturais essenciais do PR-11 para a inibição do proteassoma 20S de humanos. Ao menos dois dos três resíduos da porção N-terminal carregados positivamente (arginina ou lisina) e resíduos hidrofóbicos na região C-terminal são imprescindíveis para a atividade inibitória. As propriedades requeridas pelo PR-11 para a inibição do proteassoma 20S in vitro também alteram a expressão de fatores da via do NFκB, mantendo-se, assim, os efeitos antiinflamatórios verificados in vitro. Além disso, Anbanandam et al., 2008, verificaram que alguns análogos ao PR-11 demonstraram ação inibitória superior sobre o proteassoma 20S, encorajando a busca por moléculas mais ativas. Dessa forma, modificações estruturais sutis envolvendo substituições por aminoácidos semelhantes e sínteses de peptídeos cíclicos poderiam gerar melhores inibidores e compostos com potenciais terapêuticos.

1.7. Síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS)

A síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS) foi desenvolvida por Bruce Merrifield (Merrifield, 1963), resultando em uma grande mudança nas perspectivas de síntese de peptídeos (Chan and White, 2000). A viabilização da síntese em fase sólida permitiu o estudo de peptídeos naturais de baixa abundância e a obtenção de análogos em quantidades suficientes para testes biológicos (Zasloff, 2002). A SPFS é realizada utilizando-se um suporte sólido que consiste de pequenos grãos porosos e insolúveis (beads) em soluções aquosas e orgânicas. Estes beads são polímeros com grupos funcionais que proporcionam a ligação covalente do primeiro aminoácido da posição C-terminal da sequência. O peptídeo permanece ligado ao suporte polimérico durante toda a síntese e, ao final, é clivado, geralmente em uma condição ácida.

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Breguez, G. S.

Introdução

O mecanismo geral da SPFS consiste em ciclos repetidos de formação da ligação peptídica (etapa de acoplamento) e desproteção. Inicialmente, o primeiro aminoácido, modificado de maneira a proteger o N-terminal, reage pelo seu grupo carboxila a um ligante da fase sólida (amino, halogênio ou hidroxila). Em seguida, a proteção do N-terminal é removida, gerando um grupo amino livre, ao qual será acoplado a outro resíduo. Todos os aminoácidos a serem empregados na síntese possuem as cadeias laterais, quando reativas, também protegidas, impedindo a formação de reações secundárias durante a síntese da cadeia peptídica. As etapas de acoplamento e desproteção do N-terminal são alternadamente repetidas, até a obtenção da sequência peptídica desejada. Ao final da síntese, o peptídeo é liberado de seu suporte polimérico. Nesta mesma etapa, os grupos protetores das cadeias laterais também são removidos (figura 7). Geralmente, a resina e os grupos protetores das cadeias laterais dos aminoácidos são escolhidos de forma que ambos sejam removidos sob as mesmas condições (Chan and White, 2000).

Figura 7: Esquema geral da síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS). O primeiro aminoácido com o Nterminal protegido é fixado pelo seu grupo carboxila ao suporte polimérico. Sucessivas etapas de desproteção e acoplamento de aminoácidos são alternadamente repetidas até que a sequência requerida seja obtida. Por fim, o peptídeo é clivado da resina e as cadeias laterais desprotegidas. Fonte: adaptado de Amblard et al., 2006.

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Breguez, G. S.

Introdução

As principais vantagens da SPFS sobre a síntese orgânica clássica em solução são a velocidade, praticidade e quimioseletividade, com a consequente diminuição de reações secundárias e formação de subprodutos. Sendo o suporte polimérico insolúvel em todos os sistemas de solventes orgânicos usados, cada etapa de reação é facilmente lavada por filtração. As reações de acoplamento devem ser realizadas na presença de excesso molar de aminoácidos para garantir melhores rendimentos. As lavagens com grandes volumes de solventes retiram de maneira adequada os excessos de reagentes e os produtos solúveis, promovendo uma purificação rápida e parcial a cada ciclo de acoplamento (Merrifield, 1997). A SPFS pode ser realizada manual ou automaticamente, utilizando-se mais comumente as estratégias tert-butiloxicarbonil (t-Boc) ou 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) (Alewood et al., 1997). Estas duas estratégias estão baseadas no sistema de proteção do Nterminal e das cadeias laterais reativas que são removidos em diferentes condições no meio reacional. Na primeira estratégia, o grupo protetor t-Boc é removido rapidamente usando ácidos orgânicos e inorgânicos (usualmente TFA - ácido trifluoracético). Este protetor ligado ao grupo amino é removido após cada aminoácido ser incorporado na sequência, sendo denominado protetor temporário. Após o término dos ciclos de acoplamento, a clivagem do peptídeo da resina e a remoção dos protetores das cadeias laterais (protetores permanentes e estáveis ao TFA) são realizadas em condições extremamente ácidas, utilizando-se o ácido fluorídrico (HF) a 0oC ou ácido trifluorometanosulfônico a 25 oC (Barany and Merrifield, 1979). Na segunda estratégia, o protetor temporário do grupo amino Fmoc é removido por uma base fraca (usualmente piperidina ou um derivado). A clivagem do peptídeo da resina e a remoção dos protetores da cadeia lateral são realizadas por TFA à temperatura ambiente (Fields and Noble, 1990). O princípio geral dos métodos de acoplamento consiste na ativação do grupo carboxila que formará a ligação amida. Durante a ativação, o átomo de carbono da carboxila terá sua eletrofilicidade aumentada por substituintes ligados diretamente a ele, favorecendo o ataque nucleofílico do grupo amino de um aminoácido. As carbodiimidas são os reagentes de acoplamento mais utilizados, conduzindo a bons rendimentos. Apesar da reação também ocorrer apenas na presença das carbodiimidas, é necessário a adição de um nucleófilo auxiliar (como o HOBt - 1-hidroxibenzotriazol – e derivados), o qual aumenta a eficiência da síntese e 19

Breguez, G. S.

Introdução

suprime a racemização, formando um intermediário altamente reativo que rapidamente reage com o N-terminal do aminoácido (Chan and White, 2000). O HOBt e derivados, tendo em vista suas propriedades explosivas, vêm sendo substituídos por oximas sem alterar a eficiência do procedimento (Subiros-Funosas et al., 2009). A SPFS é limitante quando se deseja a síntese de peptídeos com um número elevado de aminoácidos (aproximadamente 20 resíduos), devido à possibilidade de erros acumulativos e de dobramentos das sequências peptídicas que dificultam a ligação ao resíduo N-terminal. Nestes casos, são realizadas sínteses convergentes, nas quais porções mais curtas do peptídeo desejado são primeiramente sintetizadas e posteriormente unidas (Chan and White, 2000).

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2. Justificativa

Breguez, G. S.

Objetivos

2. JUSTIFICATIVA

Dado que o proteassoma está envolvido na regulação de uma série de funções, qualquer pertubação desse sistema pode comprometer a homeostasia celular. Nesse sentido, o proteassoma têm sido considerado um alvo potencial na terapêutica de diversas patologias. Recentemente, foi demonstrado que análogos à porção N-terminal do peptídeo natural PR-39 (PR-11 - RRRPRPPYLPR) inibem fortemente o proteassoma humano 20S. A literatura demonstrou que a introdução de um resíduo de triptofano na posição C-terminal do PR-11 aumentou em mais de 100 vezes a potência inibitória do peptídeo sobre o proteassoma 20S humano, sendo similar à atividade observada para a sequência completa do PR-39 (Anbanandam et al., 2008). Dessa forma, novas moléculas podem ser derivadas destes análogos estudados, por modificações estruturais sutis, como a mudança conservativa da sequência de aminoácidos e a introdução de resíduos de cisteína para formação de peptídeos cíclicos com diferentes curvaturas. Além disso, as atividades inibitórias observadas para o proteassoma humano das estruturas propostas podem apresentar diferentes resultados em relação aos proteassomas de outros organismos como os parasitos. Assim sendo, este trabalho apresenta como proposta a síntese de análogos estruturais ao PR-11 e avaliação da atividade inibitória em proteassomas de camundongos, de humanos e de vermes adultos do parasito Schistosoma mansoni. Um estudo comparativo entre os proteassomas destas três espécies pode ser útil para futuros experimentos in vivo, dado a manutenção do ciclo do parasito Schistosoma mansoni em camundongos.

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Breguez, G. S.

Objetivos

3. Objetivos 23

Breguez, G. S.

Objetivos

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Obter análogos ao peptídeo PR-11 que possuam atividade sobre o proteassoma 20S de mamíferos e do parasito Schistosoma mansoni.

3.2. Objetivos específicos 1 – Sintetizar e purificar o peptídeo modelo PR-11 e análogos, através da substituição conservativa de aminoácidos e a introdução de pares de cisteína para obtenção de peptídeos cíclicos; 2 – Padronizar uma metodologia para obtenção de frações enriquecidas de proteassoma 20S de fígado de camundongo Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni; 3 – Realizar ensaios de atividade peptidásica in vitro das frações enriquecidas de proteassoma 20S para a avaliação da atividade inibitória dos peptídeos sintetizados.

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4. Materiais e Métodos

Breguez, G. S.

Materiais e Métodos

4. MATERIAIS E MÉTODOS

Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto e catalogado sob o protocolo nº 2009/32.

4.1. Síntese de peptídeos

A síntese dos peptídeos propostos (tabela 2) foi realizada sob a forma solúvel, utilizando-se um protocolo de síntese em fase sólida estabelecido por Merrifield (1965), com algumas modificações. O processo adotado neste trabalho requer a utilização de aminoácidos derivatizados, através da proteção da porção amino com o grupo Fmoc. Caso sua cadeia lateral também seja reativa, ela estará igualmente protegida por um grupo que deva responder às exigências de ser adaptado à natureza da cadeia lateral e ser clivado na última etapa da síntese pelo TFA. A síntese de peptídeos requer um suporte sólido insolúvel para o acoplamento dos aminoácidos. A resina utilizada foi a Rink Amide Resin HL (Merck, Alemanha) a 0,78 mmol/g, partindo-se de um rendimento máximo de 40 µmoles de peptídeo por síntese.

4.1.1. Ativação da resina

Para a ativação da resina adotou-se o seguinte procedimento: 40 µmoles de resina (52 mg) foram colocados em um tubo de síntese com DMF (dimetilformamida) suficiente para cobrir toda a resina, permanecendo sob agitação constante por três horas à 37ºC. Para a liberação do seu grupamento Fmoc, a resina foi coberta com 3 mL de 4-metilpiperidina 20% em DMF e lavada três vezes, por 20 minutos cada, sob agitação contínua a temperatura de 37ºC. Em seguida, a resina foi lavada três vezes alternadamente com metanol e DMF com 2 mL de solvente por lavagem. Todas as lavagens foram realizadas com auxílio de uma bomba de vácuo.

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Materiais e Métodos

Tabela 2: Peptídeos sintetizados com suas respectivas sequências.

Peptídeo

Sequência

1

PR-11

RRRPRPPYLPR

2

W12

RRRPRPPYLPRW

3

F8W12

RRRPRPPFLPRW

4

G9

RRRPRPPYGPR

5

G9W12

RRRPRPPYGPRWR

6

G9F12

RRRPRPPYGPRF

7

A8F12

RRRPRPPALPRF

8

F12

RRRPRPPYLPRF

9

I9F12

RRRPRPPYIPRF

10

I9W12

RRRPRPPYIPRW

11

C8C15

RRRPRPPCLPRWRPCG

12

C9C15

RRRPRPPYCPRWRPCG

13

S9S15

RRRPRPPYSPRWRPSG

14

S1S14

SRRRPRPPYLPRWSG

4.1.2. Ativação e adição dos aminoácidos a serem acoplados

Os aminoácidos e demais reagentes auxiliares foram adicionados em concentrações quatro vezes superiores (160 µmoles) à quantidade de resina para favorecer o acoplamento. Estes são ligados pelo seu grupamento carboxila ao grupamento amino da resina, formando uma ligação peptídica. O primeiro aminoácido foi adicionado ao tubo de síntese em um volume de 2 mL de DMF, acrescido de 25µL de DIPC (diisopropilcabodiimida) e 23 mg de oxyma pure [ethyl 2-cyano-2-(hydroxyimino)acetate]. O DIPC e a oxyma pure são reagentes que permitem a ativação da função carboxílica dos aminoácidos Fmoc. Após 2 horas de agitação à 37ºC, todo o líquido do tubo de síntese foi retirado, sendo então submetida a uma acetilação preventiva. A acetilação impede a continuação do crescimento das cadeias que não reagiram com o aminoácido a ser incorporado, e que, consequentemente, se mantêm com o grupo amino-terminal livre. Dessa forma, 50 µL de uma solução 1:1 de DIPC e anidrido acético foram adicionados em 1 mL de DMF ao tubo de síntese, permanecendo sob agitação à 37ºC por 30 minutos. Ao fim desta etapa, a resina foi lavada três vezes alternadamente com 27

Breguez, G. S.

Materiais e Métodos

metanol e DMF. O grupamento amino desse primeiro aminoácido acoplado foi então desprotegido, lavando-se a resina com 3 mL de uma solução de 4-metilpiperidina 20% em DMF, por três vezes de 10 minutos cada, com agitação contínua à 37°C. Os demais aminoácidos foram processados conforme descrito para o acoplamento do primeiro aminoácido.

4.1.3. Clivagem do peptídeo

Após o término dos ciclos de acoplamento, o último grupamento Fmoc foi eliminado com 4-metilpiperidina 20% em DMF, como descrito previamente, e a resina lavada por quatro vezes, durante cinco minutos, com 3 mL de diclorometano (DCM). As cadeias laterais foram desprotegidas e o peptídeo dissociado da resina pelo uso de 5 mL de uma solução de clivagem contendo 95% de TFA. Para os peptídeos contendo cisteína, a solução de clivagem continha 2,5% de β-mercaptoetanol, a fim de se evitar a formação de pontes dissulfeto. O tubo de reação permaneceu sob agitação por quatro horas. A solução contendo os peptídeos foi coletada, transferida para tubos de ensaio e os produtos de síntese precipitados com 50 mL de éter etílico, permanecendo em repouso durante a noite à 4ºC. Posteriormente, os precipitados foram lavados com éter etílico e centrifugados por três vezes a 1.500 x g por 5 minutos. Na última etapa, o sobrenadante foi desprezado e o peptídeo ressuspenso em 3 mL de água milliQ. Após a obtenção dos peptídeos, esses foram liofilizados, analisados em sistema HPLC (High Performance Liquid Chromatography) e caracterizados em espectrômetro de massas LCMS-IT-TOF operando via electrospray.

4.1.4. Ciclização dos peptídeos contendo cisteína

O processo de ciclização permite a formação de pontes dissulfeto entre as cadeias laterais de cisteínas por oxidação. Os peptídeos liofilizados foram dissolvidos em 50 mL de uma solução tampão de acetato de amônio 50 mM, pH 7.4, contendo 16% de DMSO (dimetilsulfóxido). As soluções foram submetidas à agitação por 48 horas na ausência de luz e analisadas como os demais peptídeos, conforme descrito no item 4.1.3.

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Materiais e Métodos

4.1.5. Purificação dos peptídeos por cromatografia de fase reversa em sistema HPLC

Os peptídeos sintetizados em fase sólida foram submetidos à cromatografia de fase reversa para a análise de sua pureza. As cromatografias foram realizadas em coluna C18 (250 mm x 4,6mm) (Shim-pack CLD-ODS (M)-Shimadzu®), em sistema HPLC da Shimadzu®. A coluna foi previamente equilibrada com uma solução de água mili-Q e TFA 0,1%. Inicialmente, eluiu-se alíquotas de todos os peptídeos (20 μL) em um gradiente de ACN (acetonitrila) de 0 a 80% e TFA 0,1% durante 30 minutos com um fluxo de 1 mL/minuto. A concentração de ACN atingiu 80% em 20 minutos e retornou a 0 em 25 minutos, monitorando-se a eluição a 280nm ou a 260nm para os peptídeos que não continham tirosina ou triptofano. Para aqueles cromatogramas que não possuíam uma resolução adequada, novas condições foram desenvolvidas até que a purificação do peptídeo se tornasse satisfatória. Estas outras condições cromatográficas abrangeram gradientes de ACN/TFA 0,1% variáveis entre 20% a 60%, durante até 35 minutos com um fluxo de 1 mL/minuto. Após a purificação, os peptídeos foram caracterizados e identificados por espectrometria de massas.

4.1.6. Caracterização dos peptídeos por espectrometria de massas LCMS-IT-TOF electrospray

Analisou-se os peptídeos purificados por espectrômetro de massas LCMS-IT-TOF (Liquid Chromatography Ion Trap Time Of Flight), que opera por ionização do tipo electrospray (Shimadzu®). O equipamento foi calibrado utilizando trifluoroacetato de sódio. A voltagem capilar foi de 4500 V no modo positivo de ionização, com tempo de acumulação de 10 ms. Aplicou-se as amostras através de injeções diretas (alíquotas de 5 μL). A ferramenta ExPASy – Compute PI/Mw tool (disponível em http://web.expasy.org/compute_pi/) foi utilizada para a predição das massas moleculares dos peptídeos.

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Materiais e Métodos

4.2. Extração de proteínas solúveis

4.2.1. Fígado de camundongos Swiss

A extração de proteínas de fígado de camundongos Swiss foi realizada de acordo com um protocolo modificado de Abramova et al., 2004. Aproximadamente, 5.0 g de fígado foram lavados em PBS (tampão fosfato salino) 0,1 M, pH 7.4, e homogeneizados com tampão A (Tris-HCl 30 mM pH 7.5; NaCl 100 mM; ditiotreitol – DTT 1 mM; EDTA 1 mM; MgCl2 5 mM; glicerol 10%) em tubo Potter por 10 minutos em banho de gelo (100 mg de tecido/mL de tampão A). O homogenato foi transferido para tubos de ensaio (1 mL cada) e esses sonicados por 15 segundos, três vezes a 25 watts, com intervalo de 45 segundos entre cada ciclo (Sonifier 250 Branson). O homegenato foi reunido e centrifugado a 2.000 x g por 15 minutos para remoção de debris celulares (centrífuga Sorvall 5C). O sobrenadante contendo a fração solúvel foi novamente centrifugado, desta vez a 46.000 x g por 140 minutos. A seguir, o sobrenadante resultante foi reunido e submetido à precipitação por sulfato de amônio a 40% (20 minutos para adição contínua do sal; 20 minutos em repouso; 20 minutos de centrifugação a 16.000 x g). O precipitado foi descartado e as proteínas presentes no sobrenadante submetidas à precipitação com sulfato de amônio a 70%, conforme descrito anteriormente. Ao final, o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em 3 mL de tampão B (TrisHCl 20 mM pH 7.5; NaCl 250 mM; DTT 1 mM; EDTA 1 mM; MgCl2 5 mM; glicerol 20%).

4.2.2. Eritrócitos humanos

A extração de proteínas de eritrócitos humanos foi desenvolvida de acordo com a metodologia modificada de Claverol et al., 2002, utilizando-se 10 mL de sangue coletado com citrato de sódio a 4% proveniente de um voluntário saudável. A amostra foi centrifugada a 1.500 x g por 15 minutos para a separação dos eritrócitos e o sedimento lavado 5 vezes com PBS 0,1M pH 7.4, gelado. Ao final das lavagens, realizou-se a lise osmótica ressuspendendo os eritrócitos em um quinto do volume em água. Em seguida, o rompimento das membranas celulares foi intensificado por 4 ciclos de congelamento/descongelamento em nitrogênio 30

Breguez, G. S.

Materiais e Métodos

líquido e o material resultante centrifugado a 20.000 x g por 30 minutos. O sobrenadante foi novamente centrifugado, desta vez a 46.000 x g por 140 minutos. A seguir, o sobrenadante resultante foi submetido à 2 etapas de precipitação por sulfato de amônio a 40% e 70%, conforme descrito no item 4.2.1. Por fim, ressuspendeu-se o precipitado obtido pela precipitação a 70% em 2 mL de tampão B.

4.2.3. Vermes adultos do parasito Schistosoma mansoni

Aproximadamente, 500 mg de vermes adultos do parasito, gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. William de Castro Borges (Laboratório de Enzimologia e Proteômica - UFOP), foram ressuspensos em 10 mL de tampão A. A seguir, o material foi sonicado por 15 segundos, três vezes a 25 watts, com intervalo de 45 segundos entre cada ciclo. O homegenato foi reunido e centrifugado a 2.000 x g por 15 minutos para remoção de debris celulares. O sobrenadante contendo a fração solúvel foi novamente centrifugado (46.000 x g por 140 minutos). Submeteu-se o sobrenadante resultante desta centrifugação à precipitação por sulfato de amônio a 30% (20 minutos para adição contínua do sal; 20 minutos em repouso; 20 minutos de centrifugação a 16.000 x g). O precipitado foi descartado e o sobrenadante precipitado por sulfato de amônio a 90%, conforme descrito anteriormente. Ao final, o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em 2 mL de tampão B. As etapas realizadas para a extração de proteínas solúveis a partir fígado de camundongos Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de S. mansoni estão esquematizadas na figura 8.

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Materiais e Métodos

Figura 8: Etapas realizadas para a extração de proteínas solúveis a partir fígado de camundongos Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de S. mansoni.

4.3. Cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400

Os extratos de proteínas solúveis das diferentes espécies, pré-enriquecidos como descrito no item 4.2, foram submetidos à uma cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400 HR (Sigma Aldrich, Suécia). A coluna utilizada (dimensões: 60 x 1,5 cm) foi previamente equilibrada em tampão B (Tris-HCl 20 mM pH 7.5; NaCl 250 mM; DTT 1 mM; EDTA 1 mM; MgCl2 5 mM; glicerol 20%). As proteínas foram eluídas com um fluxo aproximado de 12 mL/hora e frações de 4 mL recolhidas a cada 20 minutos. O acompanhamento das eluições foi realizado em Espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu® duplo feixe no comprimento de onda de 280 nm.

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Breguez, G. S.

Materiais e Métodos

4.3.1. Identificação das frações enriquecidas com o proteassoma 20S pela medida da atividade quimotripsina-símile

Alíquotas de 10 µL das frações eluídas para os extratos de fígado de camundongo e eritrócitos humanos e de 50 µL para o de vermes adultos de Schistosoma mansoni foram ensaiados quanto à atividade peptidásica em três diferentes condições: substrato; substrato e SDS 0,02%; substrato e MG-132 20 μM. Utilizou-se o substrato fluorogênico N-Suc-LeuLeu-Val-Tyr-7-amido-4-metilcumarina (Sigma Aldrich, EUA) para a determinação da atividade quimotripsina-símile. Inicialmente, as alíquotas das frações proteicas foram préincubadas a 37ºC por 15 minutos em tampão 20S (Tris-HCl 50 mM pH 7,5; DTT 1 mM; MgCl2 5 mM). Após o período de pré-incubação, adicionou-se o substrato para uma concentração final de 25 μM em um volume reacional de 125 μL. A reação permaneceu incubada por mais 1 hora, sendo interrompida pela adição de 2 mL de SDS 1%. Realizou-se a detecção fluorimétrica em espectrofluorímetro Shimadzu® RF-5301PC nos comprimentos de onda 380nm (excitação) e 440nm (emissão). As frações que possuíam maior quantidade de proteassoma 20S, ou seja, frações ativadas pelo SDS 0,02% e inibidas pelo MG-132, eram então agrupadas para os ensaios de atividade proteolítica com os inibidores sintetizados. A determinação da concentração proteica destas frações foi realizada utilizando-se o método do BCA (Smith et al., 1985) (Thermo Scientif, EUA), segundo recomendações do fabricante.

4.4. Eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Cerca de 10 µg das frações enriquecidas com proteassoma 20S provenientes da cromatografia de filtração molecular foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. A eletroforese foi realizada segundo o método descrito por Laemmli (1970), utilizando géis de separação a 10% e géis de concentração a 5% em condições desnaturantes. As amostras foram diluídas (1:1) em tampão da amostra (Tris-HCl 0,125 M pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%, azul de bromofenol 0,002%) e submetidas a banho de água fervente por 5 minutos para desnaturação das proteínas. Utilizou-se como padrão de peso molecular o 33

Breguez, G. S.

Materiais e Métodos

Molecular Weight Marker Kit (Sigma Aldrich, EUA). A amperagem adotada foi de 20 mA por gel. Após a corrida em tampão Tris-HCl 25 mM, glicina 0,19 M e SDS 0,1%, o gel foi corado com Coomassie Blue R-250 0,025% em 40% de etanol e 7% de ácido acético. Utilizou-se o software Quantity One (Bio-Rad®) versão 4.6.9 para a realização das análises densitométricas.

4.5. Obtenção de soro policlonal para a detecção de subunidades α do proteassoma 20S

A produção de soro policlonal para detecção do proteassoma foi induzida utilizando-se como antígeno imunogênico o peptídeo TVWSPQGRLHQVEYAMEA, sintetizado conforme a metodologia descrita no item 4.1. Este peptídeo corresponde a uma sequência N-terminal presente nas subunidades α do proteassoma 20S, altamente conservada em eucariotos (Hendil et al., 1995). O peptídeo foi ligado ao carregador proteico KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) (Sigma Aldrich, EUA) através de ligação com glutaraldeído. Para cada 1 mg de peptídeo, adicionou-se 1 mg de KLH em 200 μL de tampão borato pH 10 e 100 μL de glutaraldeído 0,3%, permanecendo a reação sob agitação contínua por 2 horas. Após este período, o glutaraldeído reativo foi inativado durante 30 minutos após adição de 25 μL de glicina 1M. A solução resultante foi dializada contra tampão borato pH 8,5 e posteriormente liofilizada. O regime de imunização consistiu em administração intraperitonial de três doses em camundongos Swiss machos com idade aproximada de 10 semanas. Quinzenalmente, cada camundongo recebeu uma dose de 50 μg do conjugado KLH-peptídeo, sob a forma de emulsão com o adjuvante hidróxido de alumínio a 10%. Após 45 dias da primeira dose, os camundongos foram necropsiados e o soro coletado para os ensaios de Western Blotting.

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Breguez, G. S.

Materiais e Métodos

4.6. Western Blotting

Realizou-se a técnica de Western Blotting (Towbin et al., 1979) para a detecção do proteassoma 20S nas frações enriquecidas com este complexo obtidas após a cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400. Cerca de 10 μg das frações enriquecidas de proteassomas obtidas de fígado de camundongo, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni foram submetidas à eletroforeses em gel de poliacrilamida 10% e transferidas para membranas de PVDF (Polyvinylidene Fluoride) (Invitrogen) a 200 mA em tampão Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, etanol 20% e SDS 0,02% sob refrigeração por duas horas. Em seguida, as membranas foram bloqueadas durante a noite em tampão TrisHCl 50 mM pH 7,5, Tween-20 0,3% e leite em pó desnatado 5%, sendo posteriormente lavadas por três vezes com Tris-HCl 10 mM pH 7,5. Após essas lavagens, incubou-se a membrana em tampão imunoblotting (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, Tween-20 0,013% e leite em pó desnatado 5%) sob agitação por 30 minutos. Soro contendo anticorpos policlonais anti-proteassoma, produzidos conforme descrito no item 4.5, foram adicionados ao tampão immunoblotting (1:500), reagindo por 3 horas à temperatura ambiente.

Após o

período de incubação, as membranas foram lavadas três vezes com Tris-HCl 10 mM pH 7,5 e novamente incubadas por 2 horas com tampão imunoblotting contendo o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado com fosfatase alcalina (1:2000) (Sigma Aldrich, EUA). As membranas foram lavadas com Tris-HCl 10 mM pH 7,5 e reveladas com solução de NBT/BCIP (Nitro Blue Tetrazolium/5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato) (Sigma Aldrich, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante.

4.7. Ensaios de atividade peptidásica com os inibidores sintetizados

As atividades proteolíticas semelhantes à tripsina e quimotripsina das frações enriquecidas com proteassoma 20S das três espécies estudadas foram analisadas na presença dos inibidores propostos. Os substratos fluorogênicos Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4metilcumarina e N-Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amido-4-metilcumarina (Sigma Aldrich, EUA) 35

Breguez, G. S.

Materiais e Métodos

foram utilizados para a determinação das atividades tripsina- e quimotripsina-símile, respectivamente. Para cada reação, utilizou-se entre 5 e 20 μg de proteínas. As alíquotas das frações proteicas foram pré-incubadas a 37ºC por 15 minutos em tampão 20S juntamente com 1 μM de cada peptídeo sintetizado. Em seguida, a reação iniciou-se pela adição de 25 μM do substrato fluorogênico e do ativador SDS 0,02% em um volume reacional de 125 µL, sendo interrompida após 1 hora com 2 mL de SDS a 1%. A detecção fluorimétrica foi realizada em espectrofluorímetro nos comprimentos de onda 380nm (excitação) e 440nm (emissão). Determinou-se a concentração dos peptídeos pelos coeficientes de extinção molar a 280 nm dos aminoácidos tirosina (1280 M -1 cm-1), triptofano (5700 M-1 cm-1) e cisteína (125 M-1 cm-1) ou a 260 nm para a fenilalanina (220 M-1 cm-1). As medidas de fluorescência foram realizadas em quintuplicata para cada peptídeo sintetizado e os resultados expressos pela atividade inibitória em relação à obtida em um grupo controle na ausência de inibidores.

4.8. Análise estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada com o software Graph Pad Prism (Versão 5.0). Utilizou-se ANOVA seguido de pós-teste de Tukey para verificar as diferenças entre o potencial inibitório dos peptídeos sintetizados sobre as atividades peptidásicas nas frações enriquecidas de proteassoma 20S de fígado de camundongos, eritrócitos humanos e do verme adulto de S. mansoni. Adotou-se o nível de significância p < 0,05 para todas as análises.

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5. Resultados e Discussão

Breguez, G. S.

Resultados e Discussão

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Síntese de peptídeos

5.1.1. Síntese em fase sólida e purificação em sistema HPLC

As sínteses do peptídeo PR-11 e de outras 13 estruturas análogas foram realizadas conforme especificado em materiais e métodos (item 4.1). Os peptídeos W12, F8W12 e G9 são análogos já descritos na literatura, os quais apresentaram um potencial de inibição superior ao PR-11 sobre o proteassoma 20S de humanos (Anbanandam et al., 2008). Os demais peptídeos foram propostos baseados na estrutura desses análogos, através da substituição conservativa de aminoácidos e a introdução de pares de cisteína para obtenção de peptídeos cíclicos. Assim sendo, alterou-se uma série de aminoácidos na região C-terminal: substituições de triptofano (W) por fenilalanina (F); leucina (L) por isoleucina (I); tirosina (Y) por alanina (A) e fenilalanina; tirosina, leucina e prolina (P) por cisteína (C) para a síntese de análogos cíclicos. As modificações concentraram-se na região C-terminal dos peptídeos, dado que a região N-terminal é importante para a manutenção da atividade inibitória sobre o proteassoma 20S (Gaczynska et al., 2003; Anbanandam et al., 2008). As sínteses dos 14 peptídeos foram realizadas em fase sólida utilizando a via Fmoc. A estratégia Fmoc foi escolhida por apresentar consideráveis vantagens em relação à estratégia t-Boc, como um maior percentual de rendimento e pureza do peptídeo esperado. Na estratégia Fmoc, além das condições reacionais serem menos agressivas, as remoções dos protetores do N-terminal e das cadeias laterais dos aminoácidos ocorrem em meios completamente distintos (o grupo Fmoc é clivado em meio básico, enquanto os protetores permanentes das cadeias laterais são removidos em meio ácido juntamente com a dissociação do peptídeo da resina) (Fields and Noble, 1990). As condições fortemente ácidas da estratégia t-Boc (uso de TFA para a remoção do protetor t-Boc e HF - ácido fluorídrico - para a clivagem dos protetores permanentes das cadeias laterais) podem produzir alterações na integridade estrutural de peptídeos contendo sequências lábeis (Amblard et al., 2006).

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Breguez, G. S.

Resultados e Discussão

Após a síntese em fase sólida, todos os peptídeos foram submetidos à cromatografia de fase reversa em sistema HPLC para a análise de pureza (figura 9).

Figura 9: Perfis cromatográficos iniciais em sistema HPLC dos peptídeos sintetizados (fase estacionária: coluna C18 - 250 mm x 4,6mm - Shim-pack CLD-ODS). As separações cromatográficas foram realizadas em gradiente de ACN de 0 a 80% e TFA 0,1% durante 30 minutos sob um fluxo de 1 mL/min.. Os peptídeos que apresentaram um componente principal facilmente purificável (picos indicados pelas setas vermelhas) foram recolhidos para a caracterização em espectrômetro de massas. Os demais foram submetidos a novas condições cromatográficas até que a purificação fosse alcançada.

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Breguez, G. S.

Resultados e Discussão

Figura 9: Continuação.

Conforme observado na figura 9, os peptídeos sintetizados apresentaram diferentes perfis cromatográficos, dado que o rendimento e a pureza de síntese são dependentes do tamanho e da própria natureza da sequência de aminoácidos. As sínteses de peptídeos com um número elevado de aminoácidos ou envolvendo sequências que geram agregações justificam a maior impureza nos produtos de síntese e os cromatogramas mais complexos. A agregação impede uma completa solvatação do peptídeo ligado à resina e a acessibilidade de reagentes para permitir o acoplamento com os grupos amino N-terminais (Chan and White, 2000). Os cromatogramas dos peptídeos PR-11, G9, G9F12, A8F12, F12 e I9F12 demonstraram um grau satisfatório de pureza, visto que houve a predominância de um único componente principal (picos indicados pelas setas vermelhas). Os demais peptídeos demonstraram perfis cromatográficos menos homogêneos e, consequentemente, apresentaram 40

Breguez, G. S.

Resultados e Discussão

maiores dificuldades na etapa de purificação. Todavia, tal fato não impediu que todos os peptídeos fossem satisfatoriamente purificados. Observou-se que todas as sínteses envolvendo o resíduo triptofano apresentaram cromatogramas complexos. Há duas reações laterais principais que ocorrem com esse aminoácido: oxidação durante a síntese e a alquilação do anel indólico por carbocátions gerados durante a etapa de clivagem (Stewart and Young, 1984). O grupo protetor Pbf liberado durante a desproteção de argininas pode alquilar a cadeia lateral do triptofano gerando subprodutos sulfonados (Fields and Fields, 1993). A figura 10 ilustra os aminoácidos derivatizados arginina e triptofano utilizados durante a síntese.

Figura 10: Estrutura dos aminoácidos derivatizados arginina e triptofano, destacando-se os respectivos protetores das cadeias laterais Pbf e Boc.

Os cromatogramas dos análogos C8C15 e C9C15 apresentaram-se ainda mais complexos com a introdução dos pares de resíduos de cisteína, uma vez que grupos sulfidrila (SH) das cadeias laterais desse aminoácido podem estar nas formas reduzidas ou oxidadas. O processo de oxidação envolve ligações dissulfeto que podem resultar na agregação das sequências peptídicas. Além disso, nas sínteses envolvendo resíduos de cisteína protegidos com Trt (tritil) (figura 11), a remoção desse grupamento durante a desproteção pode ser incompleta, dada a reversibilidade da ligação. Esse processo ocorre pela elevada reatividade do grupo tiol e a alta estabilidade do cátion Trt (Chan and White, 2000). Problemas com a desproteção incompleta de Cys(Trt) podem ser resolvidos pelo emprego de trialquilsilanos na solução de clivagem, os quais removem os cátions Trt (Pearson et al., 1989).

41

Breguez, G. S.

Resultados e Discussão

Figura 11: Estrutura do aminoácido derivatizado cisteína com o protetor da cadeia lateral Trt.

As

sínteses

dos

peptídeos

contendo

cisteína

no

C-terminal

apresentam,

frequentemente, baixos rendimentos. Desta maneira, as sínteses dos análogos C8C15 e C9C15 foram iniciadas com um resíduo de glicina para facilitar a adição de cisteína, sem alterar, presumidamente, a atividade dos peptídeos (Chan and White, 2000). Logo, a introdução de um aminoácido pouco volumoso (glicina) funciona apenas como um espaçador entre a sequência peptídica e a resina. Os análogos S9S15 e S1S14 mimetizam as estruturas de peptídeos cíclicos pelas substituições de resíduos de cisteína por serina. Esses aminoácidos podem ser considerados equivalentes quanto ao volume e hidrofilicidade, diferindo-se apenas quanto aos grupos funcionais das cadeias laterais. As alterações de cisteínas por serinas visam à obtenção de peptídeos semelhantes aos cíclicos, porém com um arranjo estrutural estendido. Os análogos S9S15 e S1S14 também tiveram as sínteses iniciadas por um resíduo de glicina. Os peptídeos W12, F8W12, G9W12, I9W12, C8C15, C9C15, S9S15 e S1S14 foram purificados sob diferentes condições cromatográficas, as quais permitiram a purificação do componente principal de cada síntese (picos indicados pelas setas vermelhas na figura 12). Após o processo de purificação, os peptídeos foram submetidos à identificação por espectrometria de massas.

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Resultados e Discussão

Figura 12: Perfis cromatográficos em sistema HPLC (fase estacionária: coluna C18 - 250 mm x 4,6mm - Shimpack CLD-ODS) dos peptídeos nas condições cromatográficas que permitiram a purificação (conforme especificado). Os componentes principais foram purificados (picos indicados pelas setas vermelhas) e destinados à identificação por espectrometria de massas.

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Breguez, G. S.

Resultados e Discussão

5.1.2. Caracterização dos peptídeos por espectrometria de massas

Os peptídeos purificados foram analisados por espectrômero de massas LCMS-ITTOF do tipo electrospray. Todos os peptídeos sintetizados apresentaram massas moleculares condizentes com as preditas pela ferramenta ExPASy – Compute PI/Mw tool, confirmando o alto grau de pureza e suas identidades. A figura 13 apresenta os espectros de massas de alguns dos análogos identificados, destacando-se os picos correspondentes ao peptídeo de massa molecular esperada.

Figura 13: Espectros de massas obtidos por LCMS-IT-TOF electrosray dos análogos F8W12, I9F12 e I9W12. Os picos destacados apresentam a relação massa/carga (m/z) referente ao peptídeo com a massa molecular esperada. Entre parênteses, é demonstrada a carga positiva adquirida durante a ionização. A ferramenta ExPASy – Compute PI/Mw tool foi utilizada para a predição das massas moleculares dos peptídeos.

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Breguez, G. S.

Resultados e Discussão

As recromatografias de todos os peptídeos purificados, juntamente com a caracterização por espectrometria de massas, estão apresentadas na seção apêndice.

5.2. Identificação das frações enriquecidas com o proteassoma 20S submetidas à cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400

5.2.1. Ensaios de atividade peptidásica quimotripsina-símile

Os extratos de proteínas solúveis obtidas de fígado de camundongo Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni, pré-enriquecidos como descrito no item 4.2, foram submetidos à cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400, resina com faixa de resolução de 20 a 8000 kDa. Após a determinação do intervalo de frações no qual as proteínas estavam presentes pela medida da absorbância a 280 nm, as frações foram ensaiadas quanto à atividade peptidásica quimotripsina-símile em três diferentes condições: substrato; substrato e SDS 0,02%; substrato e MG-132 20 µM. Realizando-se ensaios de atividade peptidásica quimotripsina-símile nestas diferentes condições, é possível identificar quais frações estão enriquecidas com o proteassoma 20S (figura 14).

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Resultados e Discussão

Figura 14: Cromatogramas a 280 nm e medidas da atividade peptidásica quimotripsina-símile dos extratos proteicos de fígado de camundongo Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni submetidos à cromatografia em Sephacryl S-400. As frações, coletadas em um volume aproximado de 4 mL, foram ensaiadas quanto à atividade peptidásica quimotripsina-símile em três diferentes condições: substrato; substrato + SDS 0,02%; substrato + MG-132 20 µM. Alíquotas de 10 µL das frações eluídas para os extratos de fígado de camundongo e eritrócitos humanos e de 50 µL para o de vermes adultos de Schistosoma mansoni foram utilizadas nas reações de atividade peptidásica. As setas em vermelho indicam as frações enriquecidas com o proteassoma 20S, ou seja, frações ativadas por baixas concentrações de SDS e fortemente inibidas pelo MG-132. Substrato: Suc-LLVY-MCA. UAF: Unidades Arbitrárias de Fluorescência.

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Breguez, G. S.

Resultados e Discussão

Baixas concentrações de SDS são capazes de ativar a atividade quimotripsina-símile in vitro. Embora o mecanismo de ativação não esteja claro, sugere-se que agentes caotrópicos como o SDS ou o calor podem seletivamente desnaturar a região N-terminal das subunidades α, facilitando o acesso do peptídeo ao núcleo catalítico (Kimura et al., 2000). Além disso, observa-se, in vivo, que os proteassomas interagem com várias proteínas intracelulares denominadas PIPs (Proteasome Interacting Proteins), responsáveis por regular a proteólise. A ruptura destas interações pelo SDS pode favorecer a entrada do peptídeo no núcleo catalítico, aumentando, assim, a taxa de hidrólise (Verma et al., 2000). O MG-132, assim como outros peptídeos aldeídicos, são inibidores clássicos da atividade quimotripsina-símile do proteassoma. Apesar da alta seletivade para o proteassoma, o MG-132 também é capaz de inibir certas cisteíno-proteases lisossomais e calpaínas (Lee and Goldberg, 1998). A análise dos gráficos permitiu a identificação das frações enriquecidas com proteassoma 20S (ativadas por baixas concentrações de SDS e fortemente inibidas pelo MG132): fração 15 para o extrato de fígado de camundongo Swiss, fração 16 para o extrato de eritrócitos humanos e frações 17 a 19 para o extrato de vermes adultos de S. mansoni (setas indicativas em vermelho). Observa-se que essas frações correspondem ao início dos picos cromatográficos, o que proporcionou uma separação satisfatória do proteassoma 20S das demais proteínas e proteases de menor massa molecular. Além disso, o fato dos 3 proteassomas apresentarem picos em frações aproximadamente equivalentes, indica que no enriquecimento predomina a forma 20S, de massa molecular altamente conservada entre os eucariotos. Nas frações das amostras de eritrócitos humanos e S. mansoni, observa-se um menor conteúdo e heterogeneidade de proteases, uma vez que as mesmas foram fortemente inibidas pelo MG-132. Por outro lado, é possível notar que na amostra de fígado de camundongo, entre as frações 16 a 18, há uma maior proporção de outras proteases citossólicas, dado que a presença de SDS 0,02% no meio reacional diminuiu a atividade peptidásica e o MG-132 não a inibiu totalmente. As frações enriquecidas com proteassoma 20S foram submetidas à SDS-PAGE e ensaios de Western Blotting para as análises dos perfis proteicos e do enriquecimento das preparações de proteassoma 20S.

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Resultados e Discussão

5.2.2. Análise dos perfis proteicos e ensaios de Western Blotting

Os perfis eletroforéticos e os ensaios de Western Blotting das frações enriquecidas com proteassoma 20S de fígado de camundongo Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni são apresentados na figura 15.

Figura 15: SDS-PAGE 10% e ensaios de Western Blotting das frações enriquecidas com proteassoma 20S identificadas pela medida da atividade quimotripsina-símile (item 5.2.1). Amostras: FC – fígado de camundongo; EH – eritrócitos humanos; SM – vermes adultos de S. mansoni. PMM: Padrão de Massa Molecular. Fr: fração.

A análise por Western Blotting das amostras detectaram bandas proteicas na região compreendida entre 20 e 30 kDa, compatíveis com as massas moleculares de subunidades α do proteassoma 20S. A produção do soro policlonal contendo anticorpos para a detecção do proteassoma foi induzida utilizando-se como antígeno imunogênico o peptídeo sintético TVWSPQGRLHQVEYAMEA. Esta sequência representa um motivo filogeneticamente conservado comum a seis tipos de subunidades α (α1, α2, α3, α5, α6 e α7), embora não necessariamente idêntico em todas (Hendil et al., 1995).

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Breguez, G. S.

Resultados e Discussão

O enriquecimento com proteassoma 20S pela cromatografia de filtração molecular é demonstrado na figura 16. Quantidades equivalentes de proteínas (cerca de 10 μg) do extrato total e da fração enriquecida de fígado de camundongo foram utilizadas para tal procedimento. A análise densitométrica pelo software Quantity One da área correspondente às subunidades α do proteassoma 20S, detectadas pela técnica de Western Blotting, demonstrou um enriquecimento aproximado de 33%. O percentual alcançado foi considerado satisfatório, tendo em vista a utilização de uma única etapa cromatográfica e a separação do proteassoma 20S de outras proteases citosólicas (conforme discutido no item 5.2.1).

Figura 16: Perfil de enriquecimento com proteassoma 20S da amostra de fígado de camundongo submetido à cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400. Quantidades equivalentes de proteínas (cerca de 10μg) do extrato total (ET) e da fração enriquecida (FE) foram utilizadas para tal procedimento. As análises densitométricas realizadas no SDS-PAGE 10% e na membrana de Western Blotting pelo software Quantity One indicaram um enriquecimento aproximado de 33%. PMM: Padrão de Massa Molecular. Fr: fração.

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Resultados e Discussão

5.3. Medida da atividade peptidásica com os inibidores PR-11 e análogos

5.3.1. Avaliação da atividade quimotripsina-símile

Os potenciais inibitórios dos peptídeos sintetizados foram avaliados pela medida da atividade peptidásica na concentração de 1 µM de inibidores. Os resultados para a inibição do proteassoma 20S de camundongos, humanos e de vermes adultos de Schistosoma mansoni estão expressos nos gráficos da figura 17.

Figura 17: Atividade inibitória dos peptídeos sintetizados sobre o proteassoma 20S de camundongos, humanos e S. mansoni. A atividade quimotripsina-símile foi avaliada na concentração de 1µM de peptídeos. *atividade inibitória significativamente diferente em relação ao PR-11 (p ≤ 0,05). n = 5. Substrato: Suc-LLVY-MCA.

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Resultados e Discussão

5.3.1.1. Proteassoma 20S de camundongos e humanos

Todos os peptídeos sintetizados foram capazes de inibir a atividade quimotripsinasímile do proteassoma 20S, com perfis de inibição similares para as duas espécies de mamíferos estudadas. Os análogos W12, F8W12 e G9 são estruturas descritas na literatura que apresentaram IC50 inferiores ao PR-11 quando avaliados em proteassoma 20S de humanos. Nesse estudo, destacou-se o peptídeo W12, dado que o IC50 determinado refere-se a ordem namolar, enquanto o do PR-11 compreende a ordem micromolar (IC50 W12 = 0,006 ± 0,019 µM; IC50

PR-11

= 0,805 ± 0,321 µM) (Anbanandam et al., 2008). As atividades

inibitórias desses análogos observadas em nosso trabalho diferem das encontradas na literatura. A atividade inibitória para o PR-11 foi semelhante para os peptídeos F8W12 e W12 e significativamente menor para o G9. Dessa forma, a substituição de Tyr na posição 8 do PR-11 por uma Phe e/ou a introdução de Trp na extremidade C-terminal realizadas nos análogos F8W12 e W12 não influenciaram a atividade inibitória. Por outro lado, a troca de uma Leu na posição 9 por uma Gly no análogo G9 prejudicou a atividade, sugerindo a importância de um resíduo de cadeia lateral hidrofóbica nesta posição. Os peptídeos G9W12, G9F12, A8F12, F12, I9F12 e I9W12 foram estruturas propostas por substituições conservativas de aminoácidos. Dessas estruturas, o G9W12 e o A8F12 apresentaram atividades inibitórias significativamente inferiores ao PR-11. A alteração de uma Leu na posição 9 por uma Gly, juntamente com a introdução de Trp na posição Cterminal (G9W12) diminuiu de maneira significativa a atividade. Tal fato não foi notado quando o Trp é substituído por uma Phe no análogo G9F12. Esses dados realçam o envolvimento da Leu da posição 9 na atividade inibitória. Os resultados também destacam a importância da Tyr na posição 8, dado que a troca por um Ala (aminoácido de cadeia lateral hidrofóbica pouco volumosa) diminuiu a potência inibitória. Dessa forma, sugere-se que a presença de um anel aromático e/ou de um grupo hidroxila na cadeia lateral do aminoácido na posição 8 seja importante para a atividade inibitória. Em geral, pequenos peptídeos ricos em prolina e arginina contêm uma estrutura secundária randômica. O alto conteúdo em prolina promove uma elevada rigidez na cadeia peptídica, a qual impede a formação de alfa-hélices e folhas-beta (Shinnar et al., 2003; Scocchi et al., 2011). A introdução de pares de cisteína ao longo da sequência para a obtenção de peptídeos cíclicos confere uma maior estabilidade conformacional, a qual poderia 51

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Resultados e Discussão

modificar a interação peptídeo-proteassoma. Dessa maneira, foram propostas as sínteses das moléculas C8C15, C9C15, S9S15 e S1S14. Os análogos contendo serinas representam moléculas quimicamente semelhantes ao peptídeos cíclicos, porém com um arranjo estrutural estendido. Verificou-se que as potências inibitórias dos análogos cíclicos C8C15 e C9C15 foram significativamente reduzidas em relação ao PR-11 para as duas espécies de mamíferos estudadas. A atividade inibitória do S1S14 apresentou diminuição apenas para o proteassoma 20S de camundongos. Desse modo, a estabilidade estrutural conferida pela ciclização dos peptídeos C8C15 e C9C15 não mostrou-se vantajosa quanto a atividade inibitória, principalmente para o proteassoma 20S de humanos, uma vez que há diferenças significativas em relação a atividade em camundongos para estes análogos cíclicos.

5.3.1.2. Proteassoma 20S de vermes adultos de Schistosoma mansoni

Considerando a ausência de dados dos efeitos de peptídeos ricos em prolina e arginina sobre o proteassoma de parasitos, ensaios de atividades peptidásicas foram realizados utilizando proteassoma 20S de vermes adultos de S. mansoni como modelo experimental in vitro. Como observado na figura 17, todos os peptídeos sintetizados foram capazes de inibir a atividade quimotripsina-símile do proteassoma 20S. As atividades inibitórias dos análogos em relação ao PR-11 não foram significativamente diferentes, exceto para o peptídeo C8C15. Entretanto, de um modo geral, as intensidades de inibição sobre o proteassoma 20S de vermes adultos de S. mansoni foram menores quando comparadas às obtidas para camundongos e humanos. A comparação das atividades inibitórias dos peptídeos C8C15 e C9C15 sobre o proteassoma 20S de vermes adultos de S. mansoni e humanos não mostraram diferenças significativas (figura 18). O fato das modificações dos análogos cíclicos reduzirem fortemente a potência do PR-11 sobre o proteassoma 20S de humanos e pouco alterarem a atividade em S. mansoni, sugere que o processo de ciclização possa ser útil na busca por inibidores mais seletivos para o proteassoma 20S do parasito.

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Resultados e Discussão

Figura 18: Atividade inibitória dos peptídeos PR-11, C8C15 e C9C15 sobre o proteassoma 20S de humanos e vermes adultos de S. mansoni. A inibição da atividade quimotripsina-símile foi avaliada na concentração de 1µM de inibidores. * atividade inibitória significativamente diferente sobre os proteassomas 20S das duas espécies (p ≤ 0,05). n = 5. Substrato: Suc-LLVY-MCA.

5.3.2. Avaliação da atividade tripsina-símile

Para verificarmos se os efeitos sobre a atividade quimotripsina-símile de proteassomas 20S se repetem sobre a tripsina-símile, essa atividade foi avaliada na presença do PR-11 e de alguns análogos, conforme a figura 19.

Figura 19: Avalição da atividade tripsina-símile de proteassomas 20S de fígado de camundongo na presença dos peptídeos PR-11, W12, F12 e C9C15. Os resultados foram expressos pela atividade residual na concentração de 1 µM de inibidores. Dados semelhantes foram encontrados para o proteassoma 20S de humanos e S. mansoni (não mostrados). n = 5. Substrato: Boc-VPR-MCA.

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Resultados e Discussão

Para a concentração de 1 μM de peptídeos, não foram observadas diferenças estatísticas sobre a atividade tripsina-símile de proteassomas 20S de camundongos. Os dados obtidos estão de acordo com os de Gaczynska et al., 2003. Nesse trabalho, todas as três atividades peptidásicas do proteassoma 20S de humanos foram avaliadas variando-se concentrações do PR-39. As atividades caspase- e quimotripsina-símile foram reduzidas de maneira similar, enquanto a atividade tripsina-símile foi pouco afetada. Esses resultados sugerem que o mecanismo de inibição destes peptídeos sobre o proteassoma 20S é estritamente regulado, sendo mais seletivo para substratos hidrolisados pelas atividades caspase- e quimotripsina-símile. Dados semelhantes para a atividade tripsina-símile encontrados para o proteassoma 20S de camundongos foram observados para as amostras de humanos e S. mansoni (não mostrados).

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6. Conclusões

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Conclusões

6. CONCLUSÕES

As sínteses de peptídeos propostas apresentaram resultados satisfatórios e as condições cromatográficas estabelecidas foram adequadas para a purificação dos análogos obtidos; As cromatografias de filtração molecular em Sephacryl S-400 realizadas para a obtenção de frações com proteassoma 20S de fígado de camundongo Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni foram eficiente para o enriquecimento desses proteassomas, proporcionando uma separação satisfatória das demais proteínas e proteases de menor massa molecular; Todos os peptídeos sintetizados foram capazes de inibir a atividade quimotripsinasímile in vitro do proteassoma 20S nas três espécies estudadas. De uma maneira geral, as intensidades das atividades inibitórias foram similares para o proteassoma 20S de camundongos e humanos e menores para o de vermes adultos de Schistosoma mansoni; Os análogos cíclicos C8C15 e C9C15, quando comparados ao PR-11, apresentaram menor atividade sobre o proteassoma de humanos e atividade similar quanto à inibição em Schistosoma mansoni. Tal fato sugere que esse tipo de alteração estrutural possa ser útil na busca por inibidores mais seletivos para o proteassoma 20S do parasito.

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7. Perspectivas

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Perspectivas

7. PERSPECTIVAS

Sintetizar novos análogos explorando outras possibilidades de alterações estruturais, envolvendo principalmente peptídeos cíclicos; Realizar estudos cinéticos dos peptídeos empregados nesse trabalho sobre o proteassomas 20S de diferentes espécies de parasitos; Avaliar os efeitos biológicos desses análogos, utilizando a análise proteômica como ferramenta.

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8. Referências Bibliográficas

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Referências Bibliográficas

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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9. Apêndice

Breguez, G. S.

Apêndice

9. APÊNDICE

Figura 20: Recromatografias em sistema HPLC e caracterização por espectrometria de massas de todos os peptídeos purificados.

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Breguez, G. S.

Apêndice

Figura 20: Continuação.

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Breguez, G. S.

Apêndice

Figura 20: Continuação.

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Breguez, G. S.

Apêndice

Figura 20: Continuação.

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Breguez, G. S.

Apêndice

Figura 20: Continuação.

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