CUIB FACULTAD DE MEDICINA

ESTUDIO DE CANALES PERMEABLES A CALCIO DE MEMBRANAS INTRACELULARES DE CÉLULAS VEGETALES Tesis para obtener el grado de

Doctor en Ciencias Fisiológicas

Presenta:

M.C. Vadim Pérez Koldenkova

Asesor:

Dr. Igor Pottosin

Colima, Col. Junio de 2007

Índice

Índice ............................................................................................................................................... i Abreviaturas ................................................................................................................................. iii 1. Introducción ............................................................................................................................... 1 1.1 Generalidades ......................................................................................................................... 1 1.1.1 Concentraciones y transporte de Ca2+ en las plantas....................................................... 2 1.1.2 Depósitos intracelulares de Ca2+ en plantas.La vacuola lítica y el retículo endoplásmico................................................................................................................... 3 1.1.3 Transporte de Ca2+ en las vacuolas y el retículo endoplásmico....................................... 5 1.1.4 Transducción de señales por calcio en células vegetales................................................. 8 1.2 Antecedentes ........................................................................................................................ 13 1.2.1 Canales vacuolares, permeables a Ca2+. ........................................................................ 13 1.2.2 SV—el único canal vacuolar permeable a Ca2+ establecido firmemente. ..................... 15 1.2.3 Canales permeables a Ca2+ del retículo endoplásmico .................................................. 28 2. Objetivos del proyecto............................................................................................................. 32 2.1 Hipótesis............................................................................................................................... 32 2.2 Objetivos .............................................................................................................................. 32 3. Metodología.............................................................................................................................. 34 3.1 Preparaciones ....................................................................................................................... 34 3.1.1 Objeto de estudio. .......................................................................................................... 34 3.1.2 Obtención de vacuolas. Soluciones de trabajo............................................................... 34 3.1.3 Obtención de fracción microsomal enriquecida de RE ................................................. 36 3.1.4 Obtención de liposomas gigantes. Técnica de deshidratación-rehidratación. ............... 36 3.2 Registros electrofisiológicos ................................................................................................ 37 Patch Clamp............................................................................................................................ 37 3.2.1 Generalidades................................................................................................................. 37 3.2.2 Fabricación de micropipetas .......................................................................................... 38 3.2.3 Registros de actividad de canales en las configuraciones attached, vacuola-completa, parche aislado. .............................................................................................................. 38 3.2.4 Medición del potencial a través de la membrana vacuolar............................................ 38 3.2.5 Protocolos de voltaje para el estudio del canal vacuolar SV. Obtención de relación corriente-voltaje del canal unitario................................................................................ 40 i

3.2.6 Determinación de la probabilidad de apertura............................................................... 40 3.2.7 Calibración del efecto de Ca2+ vacuolar sobre el canal SV. .......................................... 41 3.2.8 Estimación del nivel de calcio vacuolar libre, utilizando la curva de calibración......... 41 3.2.9 Protocolos de voltaje para el estudio de canales permeables a Ca2+ del retículo endoplásmico................................................................................................................. 43 Microelectrodos ionoselectivos .............................................................................................. 43 3.2.10 Mediciones de la actividad de cationes vacuolares con la técnica tradicional de electrodos ionoselectivos............................................................................................... 43 3.2.11 Técnica MIFE (Microelectrode Ion Flux Estimation)................................................. 44 4. Concentraciones libres de los principales cationes fisiológicos vacuolares y sus efectos sobre el canal SV. .................................................................................................................... 47 4.1 Introducción. ........................................................................................................................ 47 4.2 Resultados. ........................................................................................................................... 47 4.2.1 Osmolaridad y valor del pH del jugo vacuolar. ............................................................. 47 4.2.2 Registros en configuración attached. ............................................................................. 49 4.2.3 Concentraciones vacuolares fisiológicas de K+, Na+, Ca2+ y Mg2+. .............................. 51 4.2.4 Efecto del pH vacuolar sobre el umbral de activación del canal SV. ............................ 53 4.2.5 Efecto del Na+ vacuolar sobre la curva de activación del canal SV en condiciones de pH fisiológico...................................................................................................................... 56 4.2.6 Efecto conjunto de los cationes fisiológicos más importantes — H+, Na+, Mg2+, Ca2+ — que modulan la cinética de activación del canal SV. .................................................... 60 4.2.7 Evaluación de la actividad del canal SV en condiciones iónicas fisiológicas. .............. 62 4.3 Discusión.............................................................................................................................. 69 5. Estudios de canales permeables a Ca2+ del RE. .................................................................... 75 5.1 Introducción. ........................................................................................................................ 75 5.2 Resultados. ........................................................................................................................... 75 5.2.1 Selectividad.................................................................................................................... 77 5.2.2 Modulación por voltaje.................................................................................................. 77 5.3 Discusión.............................................................................................................................. 77 6. Conclusiones............................................................................................................................. 82 Agradecimientos .......................................................................................................................... 84 Bibliografía................................................................................................................................... 85 Appéndice ................................................................................................................................... 102

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Abreviaturas

ABA — ácido abscísico (fitohormona), cADPR — adenosin-fosfato-ribosa cíclico, CAX — (cation exchangers), en este trabajo — intercambiadores Ca2+/H+, IP3 — inositol-3,4,5-trisfosfato, LCIC — liberación de calcio inducida por calcio, MIFE — (microelectrode ion flux estimation) — técnica de estimación de flujo iónico con microelectrodos, RE — retículo endoplásmico, SV — (slow vacuolar channel) — canal vacuolar lento, TPC — (two pore channel) — canal de doble poro, V1% — potencial de apertura de 1% del total de canales abiertos registrados.

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1. Introducción

1.1 Generalidades A diferencia de otros seres vivos, las plantas no tienen la capacidad de escoger el entorno en el que ocurre su crecimiento y desarrollo. Por esta razón, los organismos vegetales requieren de mecanismos específicos, destinados a asegurar el funcionamiento normal de sus células en el rango de condiciones que se puedan presentar en su medio ambiente. Entre los factores con mayor variabilidad para las plantas se encuentra el suministro mineral procedente del suelo. En base a las concentraciones de nutrientes disponibles en el suelo y las necesidades de las plantas, éstos pueden encontrarse en deficiencia o en exceso, obligando a las plantas a poner en funcionamiento los mecanismos correspondientes para el mantenimiento de la homeostasis iónica celular. El mecanismo que tiene la mayor distribución en el reino vegetal es el almacenamiento o acumulación, utilizado por las plantas tanto para la prevención de deficiencias, como para la eliminación de excesos de nutrientes en el citoplasma y el aislamiento de metabolitos y substancias tóxicas. El calcio es uno de los elementos esenciales para la vida, que, sin embargo, se encuentra en su mayor parte almacenado en organelas especiales o en el exterior de la célula — el apoplasto, y se encuentra en mínimas y rigurosamente mantenidas concentraciones (alrededor de 100-200 nM en condiciones de reposo) en el citoplasma. Su alto grado de compartimentación es una necesidad para evitar su precipitación en el citoplasma con el fosfato inorgánico (Sanders y col., 1999), y la competencia por los sitios de unión con el Mg2+ citosólico (Marschner, 1995). La gran diferencia de concentraciones entre el citoplasma, por una parte, y el apoplasto y los compartimentos intracelulares, por la otra, probablemente son la razón del uso de las señales de Ca2+ como vínculo entre los estímulos extracelulares y las respuestas intracelulares1. Actualmente, esta ruta de señalización se encuentra en tal grado de desarrollo que permite con tan solo un evento — la elevación del calcio citoplásmico — generar respuestas opuestas, como, por ejemplo, el cierre o 1

Maathuis F. Ligand-gated ion channels. En: Blatt M.R. (Ed.) Membrane transport in plants. Blackwell Publishing, CRC Press, 2004, p. 199. 1

la apertura de las células de guarda en respuesta a la aplicación de las hormonas reguladoras ABA (ácido abscísico) o IAA (ácido indolilacético). En las plantas la elevación del Ca2+ citosólico en numerosos casos es el resultado del influjo a través de la membrana plasmática. Sin embargo, muchos procesos fisiológicos requieren la participación de depósitos intracelulares de calcio. Su presencia permite localizar la señal de Ca2+ y su tiempo de vida (patrón espacio-tiempo), y, por otra parte, — amplificar y prolongar la señal inicial de calcio, así como diseñar su forma (patrón amplitud-frecuencia) de manera específica para cada estímulo (Allen y col., 2001). Por esto, el estudio de los canales iónicos permeables a calcio — los componentes primarios que permiten la entrada y la elevación del nivel de Ca2+ en el citoplasma — es una de las principales tareas para el entendimiento del funcionamiento de la maquinaria llamada “señalización por calcio”.

1.1.1 Concentraciones y transporte de Ca2+ en las plantas. En las plantas que crecen en condiciones adecuadas de calcio en su medio habitual, el contenido promedio de calcio en los tallos es de 0.1-5% de su masa seca (Marschner, 1995) o, en términos de concentraciones — 0.3-16.5 mM (White y col., 1992; de Silva y col., 1998). Estos valores reflejan tanto la disponibilidad del calcio en el suelo, como las diferentes necesidades de las plantas en este mineral. La deficiencia por calcio raramente se presenta en la naturaleza pero ocurre con más frecuencia en la horticultura y se debe principalmente a la indisponibilidad momentánea del mineral para los tejidos en desarrollo, causada por la imposibilidad de su redistribución de los tejidos más maduros vía la floema (White y Broadley, 2003). Por su relación al calcio, las plantas son agrupadas en calcífugas (calcifuges, de suelos ácidos pobres en calcio) y calcícolas (calcicoles, habitantes de suelos calcáreos). Aunque es la tolerancia a Al, Mn y Fe lo que principalmente determina la flora de los suelos ácidos, y la insensibilidad a la deficiencia de P y Fe lo que determina la flora en suelos calcáreos (Lee, 1999), las calcífugas generalmente crecen bien en bajas concentraciones de calcio en la rizósfera y no presentan amplia respuesta al incremento de calcio. Al contraste, se considera que los mecanismos que le permiten a las calcícolas mantener en su hábitat natural un bajo nivel de Ca2+ en el citoplasma, no les permiten crecer en condiciones de bajo suplemento de éste, induciendo deficiencia por calcio (Lee, 1999). Probablemente, calcio, al igual que otros iones, penetra por las puntas de las raíces, de donde se mueve por el apoplasto hacia los vasos de la xilema (Ferguson y Clarkson, 1976; Clarkson,

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1993; White, 2001), en los cuales principalmente ocurre su movimiento, siguiendo el flujo de agua causado por la transpiración (Epstein y Bloom, 2005). Por otra parte, en las raíces de cebolla (Allium cepa) existen evidencias de que el transporte de calcio a la xilema puede ocurrir a través del simplasto (Cholewa y Peterson, 2004). Se considera que en esta ruta los iones de calcio entran al simplasto a través de canales permeables a calcio de la membrana plasmática, siendo bombeados después a los tejidos de conducción por las Ca2+-ATPasas y los intercambiadores H+/Ca2+ (White y Broadley, 2003) — los transportadores de Ca2+ más importantes de las células vegetales.

1.1.2 Depósitos intracelulares de Ca2+ en plantas. La vacuola lítica y el retículo endoplásmico. La capacidad de secuestrar el calcio citoplásmico en las células vegetales ha sido probada para la vacuola, el retículo endoplásmico, las mitocondrias y los cloroplastos (Bush, 1995). No obstante, son escazos los estudios sobre las concentraciones de calcio libre presentes en estos compartimentos, y generalizados sus resultados, a pesar de que las mediciones de calcio total demuestran claramente una distribución no uniforme de éste a nivel de órganos, tejidos e incluso a nivel celular, en dependencia de la disponibilidad de Ca2+ en el suelo y las características funcionales de los tejidos (Dietz y col., 1992; Fricke y col., 1995; Karley y col., 2000).

En las células vegetales la vacuola central o lítica es el mayor depósito (más del 80% del volumen de la célula) de calcio intracelular. A pesar de esto, existe solo un reporte ampliamente conocido de la actividad del Ca2+ en vacuolas de las plantas superiores Riccia fluitans (en rizoides) y Zea mays (en raíces) — 2.3 y 1.5 mM, respectivamente (Felle, 1988). Sorprendentemente, estos datos insuficientes han sido puestos en base de la opinión de un alto nivel de calcio libre, existente en las vacuolas, y son utilizados en modelos de transporte a través de la membrana vacuolar, aunque estudios de tan solo calcio total demuestran una localización asimétrica de este catión en las hojas con patrones distintos para diferentes tejidos (Fricke y col., 1995; aparte — Karley y col., 2000). Incluso así, ha sido mostrado que la concentración de calcio en los tejidos se encuentra en función del calcio presente en el suelo (Dietz y col., 1992) y depende de la estación del año, sufriendo cambios en vacuolas de tejidos dedicadas al almacenamiento en época de invierno (Stelzer y col., 1990, 1993) y manipulándose de diferentes 3

formas en hojas deciduas e invernales (en Larix decidua es acumulado en vacuolas del endodermo y desechado durante el deshoje; en la planta de hojas perenes Picea abies el Ca2+ es almacenado hasta la primavera en las vacuolas y en el apoplasto del mesófilo; Gierth y col., 1998; Stelzer y col., 1990). Se considera, que la mayor parte del Ca2+ vacuolar se encuentra ligado por aniones orgánicos (oxalato, citrato, isocitrato, malato) formando, en muchos casos, complejos de baja solubilidad precipitados en forma de cristales (principalmente — de oxalato de calcio). Las funciones primarias de estos complejos son la regulación de alta capacidad del calcio vacuolar (tanto almacenamiento de Ca2+, como la precipitación de sus excedentes en una forma osmótica- y fisiológicamente inerte), la defensa contra herbívoros, así como la detoxificación de Al3+ y metales pesados (ver Franceschi y Nakata, 2005 para una revisión reciente). En las plantas conocidas como “precipitadoras de oxalato” (a las que pertenece el betabel (White y Broadley, 2003) — el objeto de estudio del presente trabajo) en los tejidos en crecimiento se encuentran células especializadas — idioblastos — que precipitan en sus vacuolas en forma de oxalato el calcio del apoplasto impidiendo así que éste interfiera con el crecimiento de las células inmaduras, que, debido a su pobre vacuolación, tienen una capacidad reducida para secuestrar el calcio (Franceschi y Nakata, 2005). Es interesante, que los idioblastos poseen una densa red de retículo endoplásmico, cuya principal tarea, por lo visto, es el rápido secuestro del calcio entrante al citoplasma y su transportación a la vacuola central para su precipitación (Kostman y col., 2003; Franceschi y Nakata, 2005). Estos datos pueden revelar las funciones de los dos mayores depósitos de calcio celulares: el retículo endoplásmico (como secuestrador de Ca2+) y la vacuola central (como su almacén), en el mantenimiento de la homeostasis de calcio en la célula vegetal, discutidos más adelante (ver. p.1.1.3)

El retículo endoplásmico (RE) es el segundo depósito intracelular de calcio más importante en las células vegetales, después de la vacuola. La concentración libre de calcio en el RE fue igualmente determinada en un solo trabajo y estimada en alrededor de 3 μM (en células aleurónicas de cebada; Bush y col., 1989). Por otra parte, la similitud de las funciones del RE en las células eucariotas permite considerar como cercana la actividad de Ca2+ en el RE de las células vegetales a la observada en células animales y cuyos valores varían entre 0.1-2 μM (Kendall y col., 1994, 1996) y 100-400 μM (Solovyeva y Verkhratsky, 2003). El RE de las plantas pudiera presentar similar variación en el nivel de Ca2+ libre lumenal en dependencia de la 4

presencia de calreticulina — proteína de gran capacidad para secuestrar el calcio con baja afinidad, la función de la cual es mantener un alto nivel de Ca2+ en el lumen del RE (Persson y col., 2001; Wyatt y col., 2002).

En otros organelos la concentración libre de calcio en reposo determinada es menor que la estimada para la vacuola, aunque presenta elevaciones en respuesta a diversos estímulos. La concentración de Ca2+ libre en mitocondrias, determinada con la técnica camaleón, en condiciones de reposo se encuentra alrededor de 200 nM y puede aumentar hasta 800 nM durante diferentes estreses (Logan y Knight, 2003). En cloroplastos el nivel de Ca2+ en reposo también es relativamente bajo (menos de 150 nM), pero el cambio de exposición luz-oscuridad genera una elevación transitoria del nivel de calcio hasta 5-10 μM (Johnson y col., 1995). Igualmente, en el núcleo la concentración libre de calcio es menor de 100 nM, pero presenta una breve elevación hasta cerca de 500 nM en condiciones de estrés (van der Luit y col., 1999).

1.1.3 Transporte de Ca2+ en las vacuolas y el retículo endoplásmico. En general, los sistemas intracelulares de aislamiento de Ca2+ realizan cuatro importantes tareas, necesarias para el funcionamiento normal de las células vivas (Sanders y col., 2002): 1. Mantienen el calcio citoplásmico al nivel de reposo y ayudan de esta forma a la extinción de señales de calcio. 2. Acumulan el Ca2+ en compartimentos tales como el RE y la vacuola para liberarlo de forma regulada durante el proceso de señalización. 3. Suplementan Ca2+ a organelos específicos que requieren un alto nivel de calcio para el curso normal de sus reacciones bioquímicas. Por ejemplo, estas condiciones son necesarias para el procesamiento adecuado de las proteínas que van a ser secretadas desde el RE (Rudolph y col., 1989; Gill y col., 1996). 4. Aislando el Ca2+, evitan su precipitación con el fosfato inorgánico (Pi) en complejos de baja solubilidad (Sanders y col., 1999). Las proteínas que ejercen el transporte de calcio en las células vegetales son los H+/Ca2+intercambiadores (del tipo CAX, por las siglas en inglés CAtion eXchangers) y las bombas de calcio o Ca2+-ATPasas. Para el transporte de Ca2+ en dirección opuesta a su gradiente, los CAX utilizan el gradiente de pH a través de la membrana, generado y mantenido por la actividad de la

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pirofosfatasa (PPiasa) y las bombas de protones (H+-ATPasas), mientras que las Ca2+-ATPasas para este fin utilizan la energía del ATP. La actividad de los intercambiadores H+/Ca2+ ha sido demostrada en vesículas de tonoplasto de diferentes especies, por lo que se estima su amplia distribución en el reino vegetal (Schumaker y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Blackford y col., 1990; Chanson, 1991; Hirschi y col., 1996; Ueoka-Nakanishi y col., 1999). La primer isoforma definida de estos transportadores fue la CAX1, localizada en vacuolas de Arabidopsis thaliana (Hirschi y col., 1996). El CAX1 intercambia H+ vacuolar por Ca2+ citosólico en razón de 3 por 1 y, en comparación con las Ca2+ATPasas, con poca afinidad al calcio — Km 10-13 μM — característica general de los intercambiadores Ca2+/H+ (Schumaker y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Hirschi y col., 1996; Hirschi, 2001); no obstante, en comparación con las Ca2+-ATPasas, la capacidad de transporte de estas enzimas es más alta (Hirschi, 2001) — Vmax = 25 nM·min–1·mg–1proteína (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). De los miembros de la familia CAX investigados (que incluye 12 isoformas en el genoma de Arabidopsis (Sanders y col., 2002) de las cuales han sido caracterizadas cuatro), solo el CAX1 y el CAX2 (con menor afinidad) poseen la capacidad confirmada de transportar Ca2+ (Hirschi y col., 1996). Los otros miembros de esta familia (incluyendo el CAX2), al parecer, confieren a las plantas tolerancia a otros metales potencialmente tóxicos (Mn2+, Cd2+, Zn2+) mediante su aislamiento del citoplasma, y sus capacidades de transporte de Ca2+ se desconocen (Sanders y col., 2002). Aparte de la vacuola, existen evidencias de la presencia de los CAX en la membrana citoplasmática (Kasai y col., 1990). Al igual que los CAX, las Ca2+-ATPasas aíslan el Ca2+ del citoplasma, transportándolo adentro de organelos-depósitos de Ca2+ o hacia el apoplasto, pero con una mayor afinidad — Km 1-10 μM (Evans y Williams, 1998) y menor capacidad de transporte (White y Broadley, 2003) — Vmax = 6 nM·min–1·mg–1proteína (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). Las Ca2+-ATPasas de las células vegetales pertenecen a la superfamilia de las P-ATPasas y están representadas por dos familias (Geisler y col., 2000a; Axelsen y Palmgrem, 2001): IIA (4 miembros identificados en el genoma de A. thaliana; nombrados, respectivamente, ECA1-4) y IIB (reguladas por calmodulina o protein-kinasas dependientes de Ca2+ (CDPKs), 10 miembros identificados en A. thaliana — AtACA1, 2, 4 y 7-13, respectivamente). La localización interna de las Ca2+-ATPasas tipo IIA incluyen el RE y el aparato Golgi (AtECA1, en A. thaliana; Liang y 6

col., 1997), y la membrana plasmática y el tonoplasto (LeLCA1, en tomate Lycopersicon esculentum; Ferrol y Bennet, 1996; Navarro-Avino y col., 1999), aunque en Arabidposis no existen reportes de la presencia de Ca2+-ATPasas de ninguna de las dos familias en la membrana vacuolar (Maeshima, 2001). Las Ca2+-ATPasas del tipo IIB residen en la membrana plasmática (AtACA8; Bonza y col., 2000), en el RE (AtACA2; Liang y col., 1997; Hong y col., 1999) y en la membrana interna de los plástidos (AtACA1; Huang y col., 1993). Una alta actividad de Ca2+ATPasas en membranas vacuolares fue inicialmente reportada en células de raíz de maíz (Zea mays; Gavin y col., 1993; Pfeiffer y Hager, 1993; estos dos estudios en el mismo objeto se distinguen drásticamente en los niveles reportados de actividad de Ca2+-ATPasas asociada con el RE). La presencia de una bomba de Ca2+ del tipo IIB fue demostrada en vesículas de tonoplasto de Brassica (Askerlund, 1996; ésta fue denominada más tarde BCA1 por Malström y col., 1997). Aparte, una gran actividad de Ca2+-ATPasas ha sido reportada en vesículas de la misma fracción de membranas de diferentes especies de plantas (Sze y col., 2000), aunque el contenido de proteína fue insuficiente para su detección como banda en gel de SDS-poliacrilamida. Estudios más detallados en Arabidopsis mostraron la presencia de Ca2+-ATPasas (isoforma AtACA4) en vacuolas pequeñas, pero no en la membrana de la vacuola lítica (Geisler y col., 2000b). Por lo tanto, queda abierta la cuestión — están las Ca2+-ATPasas asociadas con el tonoplasto o con membranas de la misma fracción, pero pertenecientes a organelas particulares. En base a las propiedades de transporte de Ca2+ — la capacidad de transporte y la afinidad al Ca2+ — de los CAX y las Ca2+-ATPasas, a estas proteínas les fueron asignados diferentes papeles en el mantenimiento de la homeostasis de Ca2+ en el citoplasma. En condiciones fisiológicas, la concentración de Ca2+ libre en el citosol es de alrededor de 0.1 μM, aumentando ésta a centenas de nanomoles e incluso micromoles durante la aplicación de diversos estímulos (McAinsh y Hetherington, 1998) y pudiendo, probablemente, alcanzar el valor 10 μM en regiones anexas a la vacuola durante el inicio de la señalización (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). La gran capacidad de transporte de Ca2+ de los CAX permite rápidamente disminuir este incremento, sin afectar, por su baja afinidad al Ca2+ (Km 10-15 μM), las enzimas Ca2+-dependientes y Ca2+-activadas del citosol, el Km de las cuales al Ca2+ se encuentra en el rango micromolar (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). Por otra parte, la poca afinidad al Ca2+ no permite a los CAX lograr un nivel de Ca2+ citosólico menor de 1 μM (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). Es estimado que el nivel de Ca2+ citosólico es regresado a sus valores de reposo (alrededor de 0.1 μM) por las Ca2+-ATPasas que poseen una 7

mayor afinidad (Km 1-10 μM) al Ca2+ (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). En otras palabras — después de la elevación del Ca2+ citosólico, los CAX cumplen la función de la rápida disminución de éste a niveles en los cuales el Ca2+ es menos tóxico y las Ca2+-ATPasas se encargan de la subsecuente disminución de la concentración de Ca2+ citosólico y de su manutención en un rango estrecho en condiciones de reposo. Esta hipótesis es sostenida por las observaciones hechas en Saccharomyces cerevisiae utilizadas como modelo de procesos de transporte en plantas, en las cuales los intercambiadores H+/Ca2+, pero no las Ca2+-ATPasas, participan en la eliminación de las señales de calcio después de la aplicación de un choque hipertónico (Denis y Cyert, 2002). No, obstante, el mutante de Arabidopsis det3 que posee una baja actividad de H+-ATPasa vacuolar y, probablemente, de intercambio H+/Ca2+, presenta una relativamente alta concentración de Ca2+ citoplásmico (Allen y col., 2000) y las plantas tratadas con bafilomicina — inhibidor de H+-ATPasas tipo V — presentan una mayor elevación de Ca2+ citosólico en respuesta a choques hiperosmóticos (Takahashi y col., 1997).

1.1.4 Transducción de señales por calcio en células vegetales Los efectos de calcio pueden ser agrupados en 3 tipos, que describen su papel fisiológico en las células vegetales (Plieth, 2005): 1) Ca2+ como protector (un gran número de evidencias demuestra una disminución del efecto de estreses iónico o toxicidad mineral en presencia de una alta concentración de Ca2+ en el apoplasma; ver Plieth, 2005 para más detalles y referencias); 2) Ca2+ como switch (interruptor) químico (activador de canales y proteínas dependientes y/o reguladas por calcio); 3) Ca2+ como acarreador de la información codificada sobre los estímulos que causan su liberación. La elevación de la concentración de calcio libre citosólico [Ca2+]cit es causada por numerosos factores fisiológicos y externos (Tabla 1), y es considerada un elemento clave para la generación de la respuesta fisiológica adecuada (White y Broadley, 2003). Sanders y col. (1999) propusieron su aparición en el proceso evolutivo en base de la necesidad del mantenimiento de un nivel muy bajo de [Ca2+]cit, en el fondo del cual las señales de calcio podrían conferir sensibilidad y velocidad a las respuestas originadas por estímulos de diferente naturaleza. Actualmente se considera, que, para evocar la respuesta adecuada, la alteración del [Ca2+]cit (“Ca2+-signature” — “firma de Ca2+”) generada por cada estímulo es única. Ésta exclusividad se manifiesta en su 8

TABLA 1. Ejemplo de procesos de desarrollo y respuestas a estímulos bióticos y abióticos, iniciados por la perturbación en [Ca2+]cit (White y Broadley, 2003). Evento de desarrollo o respuesta a estímulo externo Elongación de tubos polinarios

Perturbación de [Ca2+]cit Oscilaciones de alta [Ca2+]cit apical

Onda de [Ca2+]cit en el tallo Respuesta de autoincompatibilidad del tubo polinario

Liberador de Ca2+ al citosol

Referencias selectas

Apoplasto e interno

Malhó y Trewavas, 1996; Holdaway-Clarke y col, 1997; Malhó y col., 1998, 2000; Messerli y col., 2000; Rudd y Franklin-Tong, 2001

Apoplasto e interno (IP3 dependiente)

Rudd y Franklin-Tong., 2001; Straatman y col., 2001; Franklin-Tong y col., 2002

Polarización celular después de fertilización

Onda de [Ca2+]cit desde el sitio de Apoplasto penetración del espermo, causa la elevación de [Ca2+]cit sostenida

Antoine y col., 2001

División celular

Elevación de [Ca2+]cit

Bush, 1995 2+

Bush, 1995; Anil y Sankara Rao, 2001

Germinación de semillas Elevación lenta de [Ca ]cit (giberelinas)

Levine y col., 1996

Apoptosis

Elevación lenta y sostenida de [Ca2+]cit

Luz roja

Elevación de [Ca2+]cit

Apoplasto

Shacklock y col., 1992; Malhó y col., 1998

Luz azul

Picos cortos de elevación de [Ca2+]cit (segundos)

Apoplasto

Malhó y col., 1998; Baum y col., 1999

Ritmos circadianos

Oscilaciones circadianas de [Ca2+]cit

Cierre de células de guarda (ABA, esfingosina-1-fosfato)

1. Elevación de [Ca2+]cit en la periferia celular 2. Elevación de [Ca2+]cit alrededor de la vacuola 3. Oscilaciones de [Ca2+]cit

1. Apoplasto 2.Vacuola 3. Apoplasto e interno

McAinsh y col., 1992; Allen y col., 1999,2000; Blatt, 2000a,b; White, 2000; Anil y Sankara Rao, 2001; Evans y col., 2001; Ng y col., 2001a,b; Schroeder y col., 2001; Klüsener y col., 2002

CO2

Elevación de [Ca2+]cit en células de guarda

Apoplasto

Webb y col., 1996

Apoplasto

McAinsh y col., 1995; Allen y col., 1999, 2000

2+ Incremento de Ca2+ en el Oscilaciones de [Ca ]cit en células de guarda apoplasto

Johnson y col., 1995; Wood y col., 2001

Respuestas a auxinas

1. Elevación lenta y prolongada de [Ca2+]cit 2. Oscilaciones de [Ca2+]cit

Felle, 1988; Malhó y col., 1998; Ng y col., 2001b; Plieth, 2001; Plieth y Trewavas, 2002

Elevación de K+ en el xilema

Elevación de [Ca2+]cit

De Boer, 1999

Exocitosis

Elevación de [Ca2+]cit

Battey y col., 1999; Camacho y Malhó, 2003 2+

Elongación de células de Elevación sostenida de [Ca ]cit raíz

Apoplasto

Cramer y Jones, 1996; Demidchik y col., 2002

Elongación de pelos radiculares

Elevación sostenida de [Ca2+]cit en el ápex

Apoplasto

Wymer y col., 1997; White, 1998; Bibikova y col., 1999

Inhibición de la ciclósis citoplásmica

Elevación de [Ca2+]cit

Ayling y Clarkson, 1996

Nodulación

Elevación inicial de [Ca2+]cit, con Apoplasto subsecuentes oscilaciones

Cárdenas y col., 2000; Wais y col., 2000; Walker y col., 2000; Lhuissier y col., 2001; Shaw y Long, 2003

Senescencia

Elevación sostenida de [Ca2+]cit

Huang y col., 1997

9

Radiación UV

Elevación lenta de [Ca2+]cit, elevación de [Ca2+]cit sostenida por minutos

Apoplasto

Frohnmeyer y col., 1999

Estrés térmico

Elevación de [Ca2+]cit sostenida por 15-30 minutos

Apoplasto e interno (IP3-

Gong y col., 1998; Malhó y col., 1998

dependiente)

Estrés de frío

1. Picos unitarios de [Ca2+]cit 2. Oscilaciones de [Ca2+]cit

1. Apoplasto

Knight y col., 1991; Malhó y col., 1998; White, 1998; Plieth y col., 1999; van der Luit, 1999; Allen y col., 2000; Kiegle y col., 2000; Knight, 2000; Cessna y Low, 2001; Plieth, 2001

Enfriamiento gradual

Bifásica 1. Picos cortos de elevación de [Ca2+]cit (segundos) 2. Elevación lenta de [Ca2+]cit

1. Apoplasto 2. Apoplasto e interno (IP3-

Knight y col., 1996; Plieth y col., 1999; Knight, 2000; Knight y Knight, 2000; Moore y col., 2002

dependiente)

Estrés oxidativo (paraquat, superóxidos, H2O2, ozono)

1. Picos cortos de elevación de [Ca2+]cit 2. Elevación sostenidade [Ca2+]cit 3. Oscilaciones de [Ca2+]cit

1. Apoplasto 2.Apoplasto e interno (IP3dependiente)

Price y col., 1994; Levine y col., 1996; McAinsh y col., 1996; Knight y col., 1998; Malhó y col., 1998; Clayton y col., 1999; Allen y col, 2000; Kawano y Muto, 2000; Knight, 2000; Klüsener y col., 2002; Lecourieux y col., 2002

Anoxia

Bifásica 1. Picos cortos (duración— minutos) 2. Elevación sostenida de [Ca2+]cit (horas)

1. Apoplasto 2. Interno, incluyendo mitocondrias

Subbaiah y col., 1994, 1998; Sedbrook y col., 1996; Malhó y col., 1998; Plieth, 2001

Sequía / Estrés hiperosmótico (mannitol)

Bifásica Apoplasto y 1. Picos cortos (duración de vacuola minutos) 2+ 2. Elevación sostenida de [Ca ]cit (horas)

Knight y col., 1997; Malhó y col., 1998; Kiegle y col., 2000, Cessna y col., 2001; Pauly y col., 2001; Plieth, 2001

Estrés salino (NaCl)

Bifásica Apoplasto y Ondas de elevación de [Ca2+]cit en vacuola (IP3tejidos dependiente) 1. Picos cortos (de minutos de duración) 2. Elevación sostenida de [Ca2+]cit (horas) 3. Disminución de [Ca2+]cit (días)

Knight y col., 1997; Kiegle y col., 2000; Knight, 2000; DeWald y col., 2001; Pauly y col., 2001; Moore y col., 2002; Halperine y col., 2003

Estrés hipoosmótico

Bifásica 1. Pequeña elevación de [Ca2+]cit 2. Gran elevación de [Ca2+]cit

1. Apoplasto 2. Apoplasto e interno

Takahashi y col., 1997; Malhó y col., 1998; Knight y col., 2000; Cessna y Low, 2001; Cessna y col., 2001; Pauly y col., 2001; Plieth, 2001

Estimulación mecánica (movimiento, roce, viento)

Picos unitarios de [Ca2+]cit (segundos) Onda de elevación de [Ca2+]cit en tejidos

Interno

Knight y col., 1991, 1992; Haley y col., 1995; Legué y col., 1997; Malhó y col., 1998; van der Luit, 1999; Plieth, 2001 Fasano y col., 2002

Estrés de Al

elevación de [Ca2+]cit

Zhang y Rengel, 1999

Patógenos (elicitors)

Bifásica 1. Picos lentos de elevación de [Ca2+]cit (duración de minutos) 2. Elevación sostenida de

Knight y col., 1991; Malhó y col., 1998; Mithöfer y col., 1999; Blume y col., 2000; Fellbrich y col., 2000; Grant y col., 2000; Cessna y Low, 2001; Cessna y col., 2001; Rudd y Franklin-Tong, 2001; Klüsener y col., 2002; Lecourieux y col., 2002

[Ca2+]cit (horas) 3. Oscilaciones de [Ca2+]cit (la magnitud relativa de las diferentes fases dependen del patógeno)

1. Apoplasto 2. Apoplasto e interno (IP3dependiente)

10

localización subcelular y/o en su cinética o magnitud de la alteración de [Ca2+]cit (Mcainsh y Hetherington, 1998; Trewavas, 1999; Rudd y Franklin-Tong, 2001). Para la coordinación de la respuesta celular, son producidas “ondas de [Ca2+]cit” que involucran sucesivamente canales dependientes de Ca2+. Varios mecanismos han sido propuestos para la generación de estas ondas (ver White y Broadley, 2003 para más detalles y referencias): la generación por la elevación de [Ca2+]cit de segundos mensajeros (IP3, cADPR) que a su vez activan canales de Ca2+ distantes; la activación de canales de Ca2+ mecanosensibles (por la penetración del espermo durante la fecundación); influjo repetitivo a través de la membrana plasmática (en la respuesta de autoincopatibilidad durante el crecimiento del tubo polinario); la activación sucesiva de canales de la membrana plasmática activados por hiperpolarización y canales activados por ligandos en el tonoplasto (en células de guarda tratadas con ABA). Sin embargo, la elevación de [Ca2+]cit no puede ser prolongada, ya que de otra forma causaría la muerte de la célula (la elevación sostenida del Ca2+ citosólico se encuentra implicada en la apoptosis, tanto durante el desarrollo normal, como en respuestas de hipersensibilidad; White y Broadley, 2003) y, por lo tanto, debe ser transitoria o de pequeña amplitud. Entre los patrones que caracterizan la distribución temporal de la alteración de [Ca2+]cit se destacan los siguientes (ver Tabla 1.): 1. evento transitorio — elevación de [Ca2+]cit inmediata y transitoria, con la restauración del nivel de Ca2+ de reposo en minutos (causada por estímulos mecánicos no dañinos y choque de frío — cold shock); 2. respuesta bifásica — elevación inmediata y transitoria de [Ca2+]cit seguida por una elevación de [Ca2+]cit más prolongada (minutos-horas; inducida por choque térmico, estrés salino agudo, estrés hiperosmótico, anoxia, estrés oxidativo; aplicación prolongada de temperaturas menores a las umbrales; patógenos y elicitors); 3. oscilaciones — con variaciones en su duración, periodicidad y amplitud, así como en su forma, en dependencia de la intensidad y la combinación de estímulos específicos; los modelos propuestos para su generación incluyen (i) el vaciado y rellenado sucesivo de depósitos de Ca2+ agotables, (ii) la activación / desactivación sucesiva de canales de Ca2+ mediante cascadas de señalización concurrentes, (iii) la distensión y relajación de la membrana (White y Broadley, 2003). En cuanto al origen espacial del Ca2+ — este puede provenir tanto del exterior de la célula — el apoplasto, como de depósitos internos. En la Fig. 1 se representan el origen y la localización de señales de calcio en respuesta a algunos estímulos específicos.

11

ABA, Señales polarizantes endógenas, Choque osmótico, Frío, Sequía

Polarización, Choque hipoosmótico

RE

Vacuola

0.1-200 mM Ca

Frío, Sequía

1-3 mM Ca2+

2+

o Cloroplast a

2+

m

a

2+

las C Citop

a

0.1-10 mM C

m 0.1-10

M

Luz / Oscuridad

Fig.1 Representación esquemática de las señales conocidas que inician la liberación de calcio en la célula vegetaln (fuente: Sanders y col., 2002, modificado). Las flechas señalan a los compartimirnetos celulares, donde es notada la liberación de Ca2+, originada por los estreses mencionados.

1.2 Antecedentes

1.2.1 Canales vacuolares, permeables a Ca2+. Actualmente existe un gran número de reportes de canales vacuolares permeables a Ca2+, tanto dependientes de voltaje, como activados por ligandos. A continuación son mencionados algunos de ellos y sus características. SV (Slow Vacuolar channels; Hedrich y col., 1986) es el canal permeable a calcio más común de la membrana vacuolar, y, probablemente, como es discutido más adelante — es el único canal permeable a Ca2+ firmemente establecido en el tonoplasto. Este canal posee una severa rectificación saliente y modulación por Ca2+ por ambos lados de la membrana vacuolar, y es regulado por numerosos factores. Una descripción más detallada del canal SV es realizada en el p.1.2.2.1. VVCa (Vacuolar Voltage-gated Ca2+ channels; Johannes y col., 1992; Allen y Sanders, 1994b, Johannes y Sanders, 1995) fueron reportados en vacuolas de la raíz napiforme de Beta y en células de guarda de Vicia faba y caracterizados como rectificadores-entrantes activos a potenciales fisiológicos y activados por Ca2+ vacuolar. La ausencia de corrientes generadas por este canal en parches en la configuración vacuola-completa (análogo de “whole-cell”) y la comparación cuantitativa de la conductancia, selectividad y de los valores absolutos de la modulación por calcio y por voltaje, les permitió a Pottosin y Schönknecht (2007) concluir que en los experimentos reportados se trataba del canal SV, registrado en parches invertidos (con una orientación opuesta a la asumida por los investigadores). Aparte, otra corriente de Ca2+ de rectificadores-entrantes distinta a la del VVCa fue reportada en vacuolas de betabel (Gelli y Blumwald, 1993), aunque, según Pottosin y Muñiz (2002), la existencia de canales permeables a Ca2+, permanentemente abiertos a potenciales fisiológicos es poco probable, ya que mediarían una rápida liberación de Ca2+ al citoplasma, que causaría la muerte de la célula. Canales permeables a Ca2+, activados por ligandos (IP3, cADPR) pudieran encontrarse en la membrana vacuolar. Varios estudios sostienen esta suposición: 13

Estudios en células completas: (i) tanto IP3, como cADPR causan el cierre de la estoma en las células de guarda (Blatt y col., 1990; Leckie y col., 1998); (ii) el tratamiento con ABA induce, por una parte — el aumento del nivel de cADPR (Wu y col., 1998), por otra — una onda de Ca2+ en el citosol, que inicia la liberación de calcio de depósitos intracelulares, inhibida por rianodina (Grabov y Blatt, 1999); (iii) el bloqueo de la fosfolipasa C (PLC, enzima-productora de IP3) elimina los efectos de ABA — oscilaciones de [Ca2+]cit y el cierre de las células de guarda (Staxen y col., 1999); (iv) choques hiperosmóticos (NaCl, en raíz de Arabidopsis) producen IP3 y la simultánea movilización del Ca2+ intracelular (DeWald y col., 2001). Estudios en preparaciones de membranas: (i) IP3 causa la liberación de Ca2+ en vesículas de membrana vacuolar (de avena Avena — Shumaker y col., 1987; y Beta — Allen y col., 1995). Un estudio más detallado (Muir y Sanders, 1997) en coliflor (Brassica) mostró la asociación de este efecto del IP3 principalmente con la fracción de membrana plasmática, y en menor grado — con la fracción enriquecida de RE y la de membranas vacuolares; (ii) cADPR induce la liberación de Ca2+ en vesículas de RE (pero no en membranas plasmáticas) de Brassica (Navazio y col., 2001); (iii) al igual que IP3, cADPR induce la liberación de Ca2+ en vesículas de membrana vacuolar de Beta (Allen y col., 1995). Aparte, se ha reportado la participación de ligandos en la mediación de respuestas a diversos estímulos: IP3 media la respuesta a los estreses salino e hiperosmótico (Drobak y Watkins, 2000; DeWald y col., 2001) y gravitropismo (Perera y col., 1999) y cADPR participa en la activación de genes de defensa (Durner y col., 1998) y en la transducción de la señal generada por ABA (Wu y col., 1997; McAinsh y Htherington, 1998). No obstante, a pesar de estos encuentros, los canales-responsables de la liberación de Ca2+ todavía no han sido caracterizados. Alexandre y col. (1990) reportaron la existencia de canales activados específicamente por IP3 en vacuolas de raíz de betabel. Este fue el único trabajo en células vegetales, en el que fueron registrados canales unitarios activados por ligandos, no obstante, estos registros no pudieron ser reproducidos posteriormente en varios trabajos (Chasan y Schroeder, 1992; Gelli y Blumwald, 1993). Allen y Sanders (1994a, 1995) mostraron la generación de corrientes a través de la membrana vacuolar de Beta con la aplicación de IP3 y cADPR. No obstante, en ambos casos la corriente registrada constituyó una pequeña fracción sobre la corriente de fuga no específica y probablemente es un artefacto causado por el intercambio de solución. Además, a diferencia de los canales activados por ligandos de células animales, las corrientes generadas por IP3 y cADPR 14

en estos trabajos fueron independientes del nivel de Ca2+ citosólico hasta concentraciones milimolares, en contraste con el reporte de Leckie y col (1998) de un Km de ~100 nM para la inhibición por Ca2+ citosólico de corrientes vacuolares originadas por cADPR en células de guarda. No obstante, este valor de Km para calcio coincide con el Km de inhibición del canal vacuolar rápido (Fast Vacuolar channel — FV), las corrientes del cual no fueron eliminadas en este estudio. Otra de las evidencias en contra de los estudios realizados para la determinación de canales activados por ligandos en células vegetales es la alta concentración de rojo de rutenio — 100 μM — con la que fue inhibida la ‘corriente’ inducida por cADPR (la concentración utilizada es 100 veces mayor a la empleada para el bloqueo del receptor de ryanodina en las células animales). De esta manera, de todos los canales permeables a Ca2+ reportados, la existencia y la permeabilidad a Ca2+ hasta el momento solamente han sido establecidas para el canal SV — uno de los objetos de estudio del presente trabajo.

1.2.2 SV—el único canal vacuolar permeable a Ca2+ establecido firmemente. Los primeros estudios de los mecanismos de transporte a través de la membrana vacuolar fueron realizados utilizando como objetos experimentales hojas enteras de plantas y grandes cantidades de vacuolas por lo que estos experimentos no permitían distinguir la aportación de transportadores individuales como canales iónicos o bombas (Hedrich y col. 1986). Con el fin de detallar estos mecanismos, en 1986 Hedrich y col. aplicaron la técnica de patch-clamp a vacuolas individuales aisladas del mesófilo de cebada en una configuración analóga a la whole-cell conocida como whole-vacuole. Entre otros resultados, este trabajo reveló la presencia en el tonoplasto de un canal rectificador entrante (“–“ del lado vacuolar) no selectivo que posteriormente (Hedrich y Neher, 1987), debido a su lenta cinética de activación, recibió el nombre de canal vacuolar lento (SV — del inglés slow vacuolar) y fue el primer canal de la membrana vacuolar caracterizado. La relativamente alta expresión del canal SV en la membrana vacuolar, así como la modulación de su actividad tanto por el calcio citosólico como vacuolar, hizo de este canal un blanco muy atractivo para numerosos estudios de selectividad, permeabilidad, bloqueo-activación y, recientemente — de participación en la señalización por Ca2+; todos éstos realizados en objetos

15

y condiciones iónicas muy diferentes que dificultan enormemente el análisis comparativo de los datos obtenidos. La adopción de la convención sobre mediciones electrofisiológicas en endomembranas (Bertl y col, 1992) sirvió como primer paso para la estandarización de la técnica de obtención de registros, particularmente, de las corrientes vacuolares. Por esta convención, el potencial Vm a través de las endomembranas es registrado respecto al potencial del citoplasma y calculado para la vacuola como Vm = Vcytosol – Vvacuola. En este caso, las corrientes positivas o salientes representan el flujo de cationes fuera del citosol (entrantes a la vacuola). Siguiendo esta convención, el canal SV actualmente es caracterizado como canal-rectificador saliente.

1.2.2.1 Localización y Estructura del Canal SV Localización Originalmente, la presencia del canal SV fue reportada en vacuolas de raíz de betabel (Beta vulgaris; Coyaud y col., 1987; Hedrich y Neher, 1987). En estudios posteriores fue demostrado que el canal SV está ampliamente distribuido en reino vegetal y se encuentra presente en diferentes tejidos de las plantas (Tabla.2). Canales de la misma familia, aparte, se encuentran presentes en animales (Ishibashi y col., 2000 ver Peiter y col., 2005). TABLA 2. Especies de plantas en las que ha sido mostrada la presencia del canal SV (fuente: elaboración propia). Especie Musgos y hepática Posidonia oceanica Allium cepa Eichhornia crassipes Triticum aestivum Hordeum sp. Oriza sativa Chenopodium rubrum Plantago sp. Vicia faba Beta vulgaris Daucus carota Lycopersicon sp. Raphanus sativus Arabidopsis thaliana

Referencia Trebacz y Schönknecht., 2000 Carpaneto y col., 1997 Amodeo y col., 1994 Paganetto y col., 2001 Wherret y col., 2005 Bethke y Jones, 1994; Pottosin y col., 1997 Furuichi y col., 2001; Hashimoto y col., 2004; Kurusu y col., 2004 Reifarth y col., 1994 Maathuis y Prins, 1990 Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995 Hedrich y Neher, 1987; Pottosin y col., 2004; 2005 Scholz-Starke y col., 2004 Pantoja y col., 1989 Gambale y col., 1993; Carpaneto, 2003 Colombo y col., 1994; Peiter y col., 2005

16

En las plantas antofitas, el canal SV ha sido registrado ordinariamente en la membrana vacuolar de distintos tejidos (Tabla 3.). No obstante, en trabajos recientes en arroz (Oriza sativa) se ha apuntado que el TPC1 (TPC — two-pore channel, que, según Peiter y cols (2005) corresponde al TABLA 3. Localización del canal SV en tejidos de plantas superiores (fuente: elaboración propia). Tejido o tipo de célula Hojas Raíz Mesófilo Células de guarda Células aleurónicas Células cultivadas

Referencia Hedrich y col., 1986 Gambale y col., 1993; Pottosin y Schönknecht, 2007 Pottosin y col., 1997 Ward y Schroeder, 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995 Bethke y Jones., 1994 Colombo y col., 1988; Weiser y col., 1990

canal SV de la membrana vacuolar, se localiza en la membrana plasmática celular (Furuichi y col., 2001; Hashimoto y col., 2004; Kurusu y col., 2004) aunque no se presentan claras evidencias de ello y, probablemente, esta conclusión es errónea. En las vacuolas la expresión del canal SV es relativamente alta, alcanzando valores de varios miles de copias por vacuola (Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995; Pottosin y col., 1997) que pueden mediar una corriente de 100-1000 pA·pF-1. Estructura La estructura del canal SV fue revelada recientemente por Peiter y col. (2005) en experimentos con plantas modificadas de Arabidopsis thaliana. Según este trabajo, el canal SV pertenece a la familia de canales de doble poro TPC ampliamente presentada en mono-, dicotiledóneas, gimnospermas, musgos, así como en animales (ver. Peiter y col., 2005). La estructura del canal SV (TPC1, producto de la expresión del gen tpc1) comprende dos unidades similares al canal Shaker, con 6 dominios transmembranales cada una y un sitio de unión en el lado citosólico con dos motivos EF-hand (Fig.2) y varios sitios de fosforilación. Interesante, que la estructura presentada potencialmente explica la sensibilidad del canal SV al Ca2+ citosólico (por la presencia de los motivos EF-hand) pero no incluye motivo conocido que explicara la afinidad del SV al Ca2+ vacuolar. Dobrovinskaya y colaboradores (1999b) en un estudio con bloqueadores permeables del canal SV determinaron algunas de las características físicas del poro del canal SV. Éste, en su parte más angosta, tiene un diámetro mayor al del catión cuaternario permeable tetrametilamonio (TMA+) de aproximadamente 5.5 Ǻ, pero es menor que el catión impermeable tetraetilamonio (TEA+) de aprox. 8 Ǻ (Fig. 2). Además, utilizando las propiedades estructurales de poliaminas 17

Vacuola +

1 2 34 5 +

P

6 EF

+

P

7 8 9 10 11

12

+

EF

Citosol

8Å

vacuola

20 Å

citosol

Fig.2 Estructura del canal TPC1, correspondiente al SV, y representación esquemática (fuente: A. Peiter y col., 2005; B. elaboración propia). A. Es considerado que el canal TPC1, la estructura del cual fue revelada recientemente, corresponde al canal SV. El gen TPC1 codifica una proteína que presenta una estructura similar a dos unidades de Shaker fusionadas, con dos estructuras EF-hand en el lado citosólico, residuos básicos en el cuarto dominio de cada unidad (+) que, probablemente, constituyen el sensor de voltaje, y dominios formadores de poro entre los quintos y sextos dominios transmembranales. B. Representación esquemática de la estructura del canal SV, mostrando características físicas del poro del canal, obtenidas en experiementos con bloqueadores permeables (Dobrovinskaya y cols., 1999b).

(bloqueadores permeables del canal SV; específicamente — espermina (Spm4+), espermidina (Spd3+) y putrescina (Put2+) y apoyándose en los registros con TMA+ y Tris+, en este estudio fue determinada la asimetría de la localización de la mayor barrera eléctrica (probablemente — el filtro de selectividad) dentro del tonoplasto a una distancia de 30% de el lado vacuolar (en términos de distancia eléctrica). Utilizando la espermidina y putrescina (por su rigidez y cargas uniformemente distribuidas a lo largo de las moléculas que las permitieron utilizar como reglas) fue calculado el largo físico del poro del canal que constituye alrededor de 20 Å (Fig. 2). La aproximación del poro a un cilindro de 8 Å de diámetro y 20 Å de largo resulta (en condiciones de 0.1 M K+ simétrico) en una conductancia máxima calculada de 206 pS, que concuerda bien con el valor experimental de 208 ± 8 pS registrado (Dobrovinskaya y col., 1999).

1.2.2.2 Características del canal SV Selectividad y Permeabilidad Originalmente, el canal SV fue caracterizado como canal selectivo para cationes monovalentes permeable al K+ y al Na+ (Coyaud y col., 1987; Colombo y col., 1988; Pantoja y col., 1989; Maathuis y Prins, 1990; 1991), que, además, pudiera presentar una notable permeabilidad a aniones (Hedrich y col., 1986; Coyaud y col., 1987; Hedrich y Kurkdjian, 1988). Sin embargo, ésta última propuesta, deducida del análisis de los potenciales de inversión en gradientes de KCl, no fue sostenida por experimentos con sustitución de Cl– por aniones impermeables (Colombo y col., 1988; Lado y col., 1989; Amodeo y col., 1994; Allen y col., 1996) y experimentos donde se establecía un potencial de inversión para Cl– diferente del potencial de inversión para los otros iones (Ward y col., 1995). Finalmente, Pottosin y col. (2001) mostraron que la permeabilidad a Cl– del canal SV no sobrepasa el 1% de su permeabilidad al K+. En trabajos posteriores fue mostrada la permeabilidad del SV para Ca2+, Ba2+ (Pantoja y col., 1992; Ward y Schroeder, 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y Mg2+ (Pottosin et al., 2001). Los diferentes valores de la permeabilidad relativa PCa : PK, obtenidos en estos trabajos, le permitieron a Allen y col. (1996) sugerir que el canal SV posee un poro multiiónico, para el cual es característico la dependencia anómala de fracciones molares (anomalous mole-fraction dependence) — el valor de la permeabilidad relativa disminuye con el aumento de la relación de concentraciones [K+] / [Ca2+]. La permeabilidad absoluta para los cationes divalentes es en un orden de magnitud menor a la misma para los cationes monovalentes (Ward y Schroeder, 1994) y

19

los cationes divalentes en su moviemiento a través del poro se comportan como bloqueadores permeables (Pottosin y col., 2004). Las filas de selectividad determinadas para los canales SV de diferentes especies de plantas, son mostradas en la Tabla 4. TABLA 4. Selectividad y permeabilidad del canal SV (fuente: elaboración propia). Especie Allium cepa Beta vulgaris, Vicia faba

Fila +

Referencias +

+

+

Selectividad: Na > K > Rb > Cs 2+

2+

Selectividad: Ba > Ca > Mg

2+

Amodeo y col., 1994 Pottosin y col., 2001; 2000

a

Dauca carota

Permeabilidad relativa : K+ ≈ NH +4 > Rb+ > Cs+ >> TMA+ ≈ TEA+ Conductancia : K+ > Rb+ > Cs+ > NH +4 >> TMA+ ≈ TEA+

Scholz-Starke y col., 2004

a. Determinado por los potenciales de inversión.

Conductancia En diferentes objetos la conductancia del canal SV varía entre 26 y 280 pS en condiciones de 100 mM KCl simétrico y potenciales entre 20 y 80 mV, con actividad media del canal (Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995). La mayor conductancia en estas condiciones la presentan los canales SV de las células de guarda — 280 pS (Vicia faba, Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y 210 pS (Allium cepa, Amodeo y col., 1994). La conductancia mas baja corresponde al canal SV de vacuolas de reserva de aleurona — 26 pS (Bethke y Jones, 1994). La conductancia del canal unitario SV depende principalmente de la concentración de K+, con los parámetros de Km ~ 100 mM y Gmax ~ 280 pS determinados para vacuolas de betabel (Gambale y col., 1996; Pottosin et al., 2001). El incremento de la concentración libre de cationes divalentes en el lado vacuolar afecta la conductancia del canal SV. En presencia de 100 mM KCl y pH 7.5 simétricos y 2 mM Ca2+ del lado citoplásmico, el aumento de calcio o magnesio vacuolar libre de nanomoles a 10 mM causa la reducción dependiente de voltaje de la corriente del canal unitario, siendo esta reducción mayor a potenciales más negativos (Pottosin y col., 2004): a –200 mV la corriente relativa del canal unitario para condiciones de 10 mM de Ca2+ o Mg2+ vacuolar, respectivamente, constituye solamente el 21 y 28% de la corriente en control, mientras que a potenciales positivos (+200 mV) no hay diferencia en las corrientes del control y con la aplicación vacuolar de uno de los cationes divalentes; a 0 mV (potenciales fisiológicos) la corriente relativa representa el 35 o 50% (Ca2+, Mg2+, respectivamente) de la corriente en el control. Los potenciales negativos (citosólicos)

20

favorecen la aproximación de Ca2+ y Mg2+ al sitio de unión dentro del poro. A la vez, estos últimos impiden el flujo libre de cationes monovalentes. Bloqueadores En la Tabla 5. se muestran algunos de los bloqueadores del canal SV, con las respectivas características del bloqueo. Interesantemente, el canal SV es bloqueado por concentraciones submicromolares de rojo de rutenio — agente químico empleado como bloqueador del receptor de ryanodina (RR) e inhibidor de la liberación de calcio inducida por calcio en células animales, lo que pudiera sugerir cierta similitud de los papeles que juegan el RR y el SV en los respectivos organismos. TABLA 5. Bloqueadores y características del bloqueo del canal SV (fuente: elaboración propia). Bloqueadores Características del bloqueo Referencias Fisiológicos Ca , Mg2+ vacuolar y citosólico 2+

Poliaminas citosólicas Zn2+ No fisiológicos DIDS, SITS A-9-C Charibdotoxina Tubocurarina Quinacrina

Rojo de rutenio TEA+ Tris+ Neomicina

Dependiente de voltaje, Kd ~ 1-3 mM (Beta) Pottosin y col., 2000 Ca2+ citosólico causa la rectificación saliente de la corriente Dependiente de voltaje, Spm4+ > Spd3+ > Put2+ Kd: 30; 400; Dobrovinskaya y col., 1999a, b 2,500 μM (Beta) Kd = 5 μM

Hedrich y Kurkdjian, 1988

Kd = 1 μM

Hedrich y Kurkdjian, 1988

Kd = 25 μM Kd = 20 nM Kd = 60 μM

Weiser y col., 1990, 1991a, 1993

Kd = 15 μM 50 μM (Hordeum) Pottosin y col., 1997 En Dauca carota, el canal SV presenta la mayor conductancia en condiciones de pH citosólico neutro (pH 7.0), disminuyendo con la acidificación o alcalinización del medio. El pH óptimo se encuentra en dependencia de la presencia de agentes oxidantes-reductores (es recorrido a valores más básicos con el aumento de la concentración de Scholz-Starke y col., 2004 agentes reductores) Los agentes reductores DTT, GSH (1 mM; pH neutro), ácido ascórbico

Agentes oxidantesincrementan la probabilidad de apertura del canal SV. reductores Cloramina-T (agente oxidante) causa la inhibición irreversible del canal.

Scholz-Starke y col., 2004; 2005; Carpaneto y col., 1999 Allen y Sanders, 1995

Fosforilación

Activación por la fosfatasa calcineurina (0.4 unidades/ml). El aumento de la concentración de calcineurina causa la disminución de las corrientes registradas. Se proponen dos sitios de fosforilación del canal SV, con distintos efectos: “+”, sensible al ácido okadaico — inhibidor de fosfatasas, y “–”, Bethke y Jones, 1997 sensible a H-7 — inhibidor de kinasas

Proteínas 14-3-3

La 14-3-3B (100 nM) reduce la corriente acarreada por el SV en un 80% Van den Wijngaard y col., 2001 (τ1/2 = 5s). La dependencia de voltaje no es afectada.

Metales pesados

Ni2+ citosólico (Km = 99 μM, Eichornia crassipes; Km = 25 μM, Beta Paganetto y col., 2001; vulgaris) disminuye la corriente del canal SV y afecta moderadamente la Carpaneto, 2003; 2+ corriente del canal unitario, uniéndose a un sitio diferente al del Ca .

Al3+

1.4 μM Al3+ vacuolar causa la reducción en un orden de magnitud la probabilidad de apertura por desplazamiento de la dependencia de voltaje.

Wherret y col., 2005

Neomicina

neomicina en el citosol causa los siguientes efectos: a) (10-200 μM) aumenta el tiempo de activación (modestamente) y desactivación (>100 Scholz-Starke y col., 2006 veces) del canal, b) >10 μM causa el desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales más negativos, sin afectar la carga de compuerta.

Na+ (específicamente)

Aumento de Na+ vacuolar causa el desplazamiento de la dependencia de Ivashikina y Hedrich., 2005 voltaje a potenciales más positivos (en el cambio de 150 mM K+ a 150 mM Na+, 0 Ca2+, el desplazamiento total es por ~80 mV).

22

actividad del canal son el resultado de la acción directa sobre él, o sobre proteínas-reguladoras adicionales, cooexpresadas junto con en el canal SV en la membrana vacuolar. La regulación del canal SV es efectuada por los lados tanto vacuolar como citosólico y puede consistir igualmente en la disminución de la probabilidad de apertura del canal, como en su aumento (Tabla 6.). Entre todos los agentes que regulan la actividad del canal SV, los cationes monovalentes (K+, Na+) y los divalentes (especialmente — Ca2+, Mg2+), son, probablemente, los factores conocidos más importantes que modulan la actividad del canal SV en condiciones fisiológicas. K+ y Na+, a pesar de ser cationes monovalentes, regulan al canal SV de maneras diferentes. La modulación causada por K+ (Tabla 6.) es de carácter inespecífico y es efectuada a través del cambio del potencial de superficie del tonoplasto, que se encuentra en función de la fuerza iónica del contenido vacuolar. La sustitución de K+ en este caso por una concentración equivalente de otros cationes orgánicos impermeables devuelve el mismo resultado — la disminución de la sensibilidad al voltaje aplicado con el aumento de la fuerza iónica de la solución vacuolar (Pottosin y col., 2005). El efecto de Na+ vacuolar, en contraste, al parecer es de carácter específico, ya que no es reproducido por el reemplazamiento de un concentración equivalente de K+ (Tabla 6., Ivashikina y Hedrich., 2005), y puede, según los autores, jugar un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis iónica durante el estrés salino. Los efectos de Ca2+ y Mg2+ en ambos lados del tonoplasto sobre la actividad del canal SV son similares (Tabla 6.), aunque el SV presenta una afinidad superior al Ca2+ que al Mg2+: para evocar los efectos del primero es necesario aplicar una concentración mucho mayor (en órdenes de magnitud) de Mg2+. El aumento de la concentración libre de Ca2+ o Mg2+ en el lado citosólico causa el desplazamiento de la curva de activación del canal SV a potenciales más negativos. El canal SV es activado ya por concentraciones micromolares de Ca2+ citosólico (Bethke y Jones, 1994; Reifarth y col., 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich., 1995; Allen y col., 1996), aunque los valores del desplazamiento de la dependencia de voltaje difieren en los trabajos mencionados, principalmente por la presencia de Mg2+ en las soluciones de trabajo. Para originar una activación similar a la causada por micromoles de Ca2+, son necesarias concentraciones milimolares de Mg2+ (Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001), aunque en Hordeum el canal SV no era activado ni en la aplicación de 50 mM Mg2+ citosólico + EGTA — agente quelante de Ca2+ (Pottosin y col., 1997). No obstante, el Mg2+ citosólico fue propuesto como sensibilizador del canal SV al Ca2+ que pudiera jugar cierto papel en la regulación del canal SV durante la elevación fisiológica del 23

Ca2+ citoplásmico (Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001) mediante la sensibilización del canal SV a las bajas concentraciones de Ca2+ presentes en el citoplasma. A diferencia de sus efectos en el lado citosólico, el aumento de la concentraciones de Ca2+/Mg2+ en el lado vacuolar disminuye la probabilidad de apertura del canal SV mediante el desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales más positivos (Pottosin y col., 1997; Ward y Schroeder, 1994; Pei y col., 1999; Pottosin y col., 2004). En un estudio detallado de la modulación del SV por cationes divalentes, Pottosin y col. (2004) determinaron que la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal en función del Ca2+ vacuolar aplicado es bifásica y no se describe con la simple ecuación de Boltzmann. A potenciales más negativos la dependencia de voltaje es muy abrupta, pero esta función disminuye drásticamente su pendiente a potenciales más positivos. Por esta razón, según los autores, el esquema cinético mínimo que describe la transición del canal SV entre los estados cerrado y abierto debe contener 3 estados: C2 ↔ C1 ↔ O. Cada uno de los procesos de transición C2↔C1 y C1↔O es descrito por la ecuación de Boltzmann y es caracterizado por sus potenciales de punto medio (midpoint potentials, V2 y V1), en los cuales la ocupación de los respectivos estados se encuentra en equilibrio, y por sus cargas de compuerta (gating charges; z2 y z1), que definen la pendiente de la transición dependiente de voltaje entre los respectivos estados. La probabilidad de apertura del canal, de esta forma, es determinada con la ecuación

Po =

1 F F 1 + exp(- z1 (V - V1 ) ) × (1 + exp(- z2 (V - V2 ) )) RT RT

,

parte del modelo matemático, elaborado por Pottosin y col. (2004) que describe las transiciones del canal y permite describir de una manera muy exacta la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal en presencia de diferentes niveles de calcio vacuolar. En concordancia con el modelo, la transición al estado abierto del canal (C1↔O) es la menos dependiente de voltaje (z1 = 0.7), mientras que la precedente (C2↔C1) es caracterizada por una mayor dependencia de voltaje (z2 = 2.9). Aparte, fue determinado, que ambos equilibrios V1 (C1↔O) y V2 (C2↔C1) son afectados por el incremento de la concentración de calcio vacuolar, aunque de distinta manera: en condiciones de bajo calcio vacuolar V2 es menor que V1 y 24

predomina la transición C1↔O. El aumento del calcio vacuolar causa el desplazamiento del equilibrio hacia el estado C1 y el umbral de activación del canal se recorre a potenciales más positivos. Un aumento mayor de la concentración del calcio vacuolar trae como consecuencia el desplazamiento del equilibrio hacia el estado C2 de la transición C2↔C1. En otras palabras, el incremento del calcio vacuolar suprime efectivamente la actividad del canal: un aumento del calcio vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento de la probabilidad de apertura del canal a potenciales más positivos (a nivel 1% de canales abiertos — desde –80 a +70 mV). A potenciales fisiológicos (alrededor de 0 mV) en presencia de 2 mM de Ca2+ simétricos la probabilidad de apertura del canal SV es menos de 0.01% o menos de un canal por vacuola, incluso en condiciones que favorecen la activación del canal (2 mM Ca2+ citoplásmico) (Pottosin y col., 2004). La modulación causada por Mg2+ vacuolar es similar a la originada por Ca2+, aunque su efecto es más modesto: un incremento del Mg2+ vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento de la dependencia de voltaje de solo unos 70 mV (desde –80 hasta –10 mV) a 1% de canales abiertos. El modelo propuesto por Pottosin y col. (2004) indica la existencia de una unión cooperativa de varios cationes divalentes para la regulación de la apertura del canal SV, especifica la etapa limitante (C1↔O) de la activación del canal y predice correctamente la dependencia de los tiempos medios de activación y desactivación del canal en función de la concentración vacuolar de los cationes divalentes. No obstante, este modelo describe la regulación de la compuerta (gating) del canal SV en condiciones lejanas de las fisiológicas — pH vacuolar neutro (probablemente, presentado solo en vacuolas aleurónicas de almacenamiento, pero no en vacuolas líticas, utilizadas en los experimentos de ese trabajo) y alto Ca2+ citosólico (2 mM), empleado para activar las corrientes del canal SV. Por lo tanto, no es posible estimar la probabilidad de apertura del canal en condiciones fisiológicas y determinar si la elevación del calcio citosólico es suficiente para la activación del canal SV.

Posibilidad de la participación del canal SV en la Liberación de Calcio Inducida por Calcio, LCIC (Calcium-Induced Calcium Release, CICR). La permeabilidad del canal SV al calcio, así como su activación por el incremento del calcio citosólico, permitió a Ward y Schroeder (1994) proponer la participación del canal en la liberación de calcio inducida por calcio (LCIC; de calcium-induced calcium release) en la regulación del cierre de las células de guarda y en las células vegetales en general. Esta propuesta 25

rápidamente recibió amplia aceptación sin revisión previa (Allen y col., 1996; Barkla y Pantoja, 1996; Ward y col., 1995). Según Ward y Schroeder (1994) la liberación de calcio, mediada por el canal SV, requiere un incremento inicial del calcio citosólico, inducido por un estímulo (por ejemplo, por la fitohormona ABA). La subsecuente activación de canales de potasio dependientes de Ca2+ (VK) pudiera causar un desplazamiento del potencial a través de la membrana vacuolar a valores más positivos. Finalmente, el aumento del calcio citosólico y el potencial positivo de la membrana puede causar la apertura de los canales SV, permeables a calcio, dando paso, de esta forma, a la liberación de calcio de la vacuola (Ward y col., 1995; 1994). Pottosin y col. (1997) argumentaron que en condiciones fisiológicas, caracterizadas por un nivel bajo de calcio citosólico y alto — dentro de la vacuola, así como por potenciales negativos a través de la membrana vacuolar, la probabilidad de apertura del canal SV es muy baja. Para aumentar la probabilidad de la apertura del SV en presencia del alto calcio vacuolar, como fue mencionado más arriba, se requiere Ca2+ citosólico en el rango de micromoles, así como potenciales positivos de varias decenas de milivoltios. Sin embargo, estas condiciones reducen la fuerza motriz de la liberación del calcio de las vacuolas de mesófilo de cebada (Pottosin y col., 1997). Aplicando concentraciones de calcio en el rango 13-2000 μM en el lado citoplásmico en presencia de 50 μM o 2 mM en el lado vacuolar, este grupo de colaboradores determinó que la probabilidad de la apertura del canal depende en un mayor grado del gradiente de calcio aplicado a través de la membrana vacuolar, que de la concentración del calcio citosólico sola. En condiciones de nula fuerza motiva neta para calcio (ΔμCa = V – ECa = 0), la probabilidad de apertura del canal SV es de 0.35% o, aproximadamente, 10 canales abiertos por una vacuola típica de 20 μm de diámetro. Para las condiciones que favorecen la liberación de calcio de la vacuola (ΔμCa < 0) esta probabilidad es menor todavía — asumiendo una actividad de calcio vacuolar 1000 veces mayor que en el citoplasma (ECa = +87 mV) y un pequeño potencial de membrana, estos autores calcularon una actividad promedia mucho menor de 1 canal abierto por vacuola (Po = 0.0025%), y solo en condiciones que favorecen la acumulación de calcio dentro de la vacuola esta probabilidad de apertura aumentaba considerablemente (Pottosin y col., 1997). Esta observación les permitió a los autores señalar la dificultad de la participación del canal SV en la liberación de calcio inducida por calcio. Este resultado, a su vez, fue criticado por Bewell y col. (1999), argumentando que en presencia de milimoles de Mg2+ citosólico, como sensibilizador, el umbral de activación del canal SV puede recorrerse a potenciales más negativos obteniéndose así las condiciones para la 26

liberación de calcio a potenciales fisiológicos. Este mecanismo fue respaldado por Carpaneto y col. (2001). En condiciones de 10 mM de Mg2+y nanomoles de Ca2+ en el citoplasma, y 2 mM y 1 mM, respectivamente, de Mg2+ y Ca2+ vacuolar — condiciones que favorecen la salida de calcio de las vacuolas, — fue obtenida la actividad del canal SV, aunque solamente a partir de +100 mV. El aumento del calcio citosólico recorre el umbral de activación del canal y el potencial de reversión de calcio ECa a potenciales más negativos. Pero a 100 μM de calcio citosólico el potencial de reversión ECa es más negativo que el potencial del umbral de activación del canal SV y en estas condiciones el calcio a través de los canales SV puede fluir solamente desde el citosol adentro de la vacuola. Adicionalmente, estos autores remarcan que la concentración citoplásmica utilizada (10 mM), puede corresponder solamente al Mg total en las células vegetales y es lejana de la concentración libre de magnesio citosólico, aunque ya su cambio en el rango fisiológico (0.1-1 mM; Bruggemann y col., 1999) puede causar el desplazamiento del potencial de membrana unos 20 mV hacia potenciales más negativos. No obstante, el umbral de activación del canal SV sigue situado considerablemente lejos del potencial vacuolar en condiciones fisiológicas. Por esta razón, la presencia de activadores adicionales es requerida para la liberación de calcio (Carpaneto y col., 2001). Trabajos más recientes se han centrado en la búsqueda de agentes que pudieran actuar como activadores adicionales del canal SV y que le permitieran participar en la liberación de Ca2+ inducida por Ca2+. Como tales posibles factores fueron determinados los agentes reductores — particularmente DTT, la forma reducida de glutationa (GSH) y el ácido ascórbico (Tabla 6.; Carpaneto y col., 1999; Scholz-Starke y col., 2004; 2005) y recientemente – el antibiótico neomicina. Este último agente mostró la mayor potencia de modulación positiva del canal SV, desplazando el umbral de activación a potenciales negativos (Scholz-Starke y col., 2006). No obstante, probablemente estos resultados muestran más que nada la posibilidad de una activación adicional del canal SV en condiciones fisiológicas por algún agente, no precisamente neomicina, que pueda determinar la especificad de la liberación de Ca2+ desde la vacuola como respuesta a diferentes estímulos (ver. Tabla. 1).

1.2.2.3 Función del Canal SV Actualmente, la función del canal SV en las células vegetales no está determinada. Por una parte, su amplia distribución en el reino vegetal y el alto número de canales expresados en una vacuola llevan a considerar como muy importante el papel que puede jugar este canal. Por otra 27

parte,

líneas de Arabidopsis con knock-out por el gen tpc (tpc1-2 SALK_125658, tpc1-1

SALK_145413) no presentan genotipos letales e incluso, aparentemente, las plantas modificadas llegan a reproducirse (Peiter y col., 2005). Sin embargo, es necesario señalar que las condiciones experimentales, utilizadas en este trabajo (agua desionizada, 10 mM MES-KOH, pH 6.0 como substrato), son lejanas de las que se presentan en cualquier suelo; además, de el artículo no se entiende si las semillas transgénicas examinadas fueron obtenidas de plantas cultivadas en ese medio o con suministro de una composición iónica mas compleja. Por esto, existe la posibilidad que no se hayan cumplido las condiciones necesarias para revelar la función del canal SV a través de disfunciones a nivel de organismo. Ward y Schroeder (1994) propusieron la participación del canal SV en procesos vinculados con la liberación de calcio inducida por calcio (ver p.1.2.2.2), basándose principalmente en la permeabilidad del SV al Ca2+, así como por su activación por el Ca2+ citoplásmico, mostrada ya en 1987 en el trabajo de Hedrich y Neher. Esta propuesta fue argumentada por el encuentro que en células de guarda la actividad del canal SV aumenta con la alcalinización del medio de cualquier lado de la membrana vacuolar (Shulz-Lessdorf y col., 1995) — efecto inducido en condiciones fisiológicas en el lado citosólico por la fitohormona ABA durante el cierre de las células de guarda (Irving y col., 1992; Blatt y Armstrong, 1993). De este modo, la actividad del canal SV refleja la dirección de los cambios de Ca2+ y pH citosólicos que acompañan el cierre de las células de guarda 2 . No obstante, en experimentos con vacuolas de mesófilo de cebada (Hordeum) y en base del estudio de Shulz-Lessdorf y Hedrich (1995) en células de guarda de Vicia faba, Pottosin y col. (1997) descartaron la posibilidad de la participación del canal SV en la señalización de calcio mediante la liberación de calcio inducida por calcio.

1.2.3 Canales permeables a Ca2+ del retículo endoplásmico Actualmente existen reportes de solamente dos canales permeables a calcio en el retículo endoplásmico de las células vegetales: el primero fue descubierto en los órganos mecanoreceptivos de Bryonia dioica (BCC1, de Bryonia Calcium Channel; Klüsener y col., 1995; 1997) y el segundo fue reportado en el retículo endoplásmico del ápex de raíz de lechuga

2

Allen G.J., Sanders D. Vacuolar Ion Channels in Higher Plants. En: Roger A. Leigh, Dale Sanders (Eds.) The Plant Vacuole. Advances in Botanical Research incorporating Advances in Plant Pathology. V. 25. Acdemic Press, 1997, p. 227. 28

Lepidium sativum (LCC1, de Lepidium Calcium Channel; Klüsener y col., 1999), estudiados ambos con la técnica de bicapas lipídicas. El canal BCC1 presenta actividad en ráfagas y posee al menos dos estados abiertos (Klüsener y col., 1995; 1997), mientras que el LCC1 tiene solamente un estado abierto, caracterizado por su tiempo medio de 2.8 ms (Klüsener y col., 1999). En la Tabla.7 se hace una comparación de estos dos canales reportados. Aunque los estudios presentes fueron realizados en bicapas lipídicas y la orientación absoluta de los canales no se puede determinar, las características registradas permiten solo una orientación compatible con las condiciones fisiológicas, esta es — permitiendo la salida de Ca2+ del RE al citoplasma (Klüsener y col., 1995, 1997, 1999). El canal BCC1 fue propuesto para la participación en la transducción de las señales en los órganos mecanoreceptivos de Bryonia, TABLA 7. Característica de los canales catiónicos del RE reportados en plantas superiores Parámetro

Conductancia

BCC1 (Klüsener y col., 1995; 1997) Es función del gradiente de Ca2+ aplicado (Km = 8.8 mM): 50/50 mM Ca2+ — 29 pS 50/5.0 mM Ca2+ — 23.6 pS 50/0.5 mM Ca2+ — 14.4 pS

LCC1 (Klüsener y col., 1999) Ca2+ Gmax(100 mM) = 27.9 pS (Km = 7.3 mM)

Selectividad

Ba2+ ≈ Ca2+ > Sr2+ > Mg2+ > X+ PCa:PK = 6.6

Ca2+ > Ba2+ > Sr2+ PCa:PK = 9.4

Bloqueadores

Gd3+ EC50 1.1 μM Cu2+ EC50 1.2 μM Zn2+ EC50 3.4 μM La3+ EC50 9.0 μM Cd2+ EC50 100 μM (obstruyen la entrada del poro del canal)

Cu2+ EC50 5 μM La3+ EC50 5 μM Gd3+ EC50 10 μM

Eritrosina-B EC50 1 μM

Eritrosina-B EC50 1.8 μM

Verapamila (10-30 μM) causa 2 efectos: i) reduce tiempo de apertura dentro de rafagas de actividad ii) aumento de intervalos entre paquetes

NO tiene efecto:Verapamila (10-100 μM)

NO causan efecto: Ryanodina (≤70 μM), thapsigargina (inhibidor de Ca-ATPasas, ≤20 μM), trifluoperazina (antagonista de CM, ≤40 μM)

29

Regulación

Voltaje

Activación por potenciales positivos. Los potenciales de punto medio son función del gradiente de Ca2+ aplicado: V1/2 50/50 mM Ca2+ — +46.2 mV V1/2 50/5.0 mM Ca2+ — +15.7 mV V1/2 50/0.5 mM Ca2+ — –16.6 mV

pH

La elevación citoplásmica del pH disminuye la conductancia del canal (de 29 a 16 pS en el rango pH 7.0 - 7.75)

Otros

NO tienen efecto: IP3 (≤10 μM), ADP o ATP (≤2 mM)

Activación por potenciales positivos. Con el aumento del potencial disminuye el tiempo medio del estado cerrado. El tiempo medio del estado abierto no es afectado.

H2O2 citosólico (0.1-1 mM) inhibe la actividad del canal (a 1 mM — completamente)

formando junto con la Ca2+-ATPasa del RE un oscilador de Ca2+ que permite la “identificación” espacio-temporal del estímulo (Klüsener y col., 1995). Por otra parte, la inhibición del canal LCC1 (así como el BCC1) por el inhibidor de Ca2+ATPasa eritrosina-B en bajas concentraciones pudiera ser indicación de que estos canales pueden aparecer como resultado del desacoplamiento de la Ca2+-ATPasa, cuyos dominios transmembranales, como se ha mostrado en el caso de proteínas de retículo sarcoplásmico, pueden actuar como canales permeables a Ca2+ (de Meis y col., 1996). Este desacople, según Klüsener y col. (1999), puede fácilmente ocurrir durante el procedimiento de extracción de la membrana, por lo que estudios más minuciosos son requeridos. Aparte, en varios estudios fue reportada la liberación de Ca2+ de vesículas de RE, causada por ligandos — cADPR, NAADP (Navazio y col., 2000; 2001). Martinec y col (2000) reportaron en este compartimiento la presencia de sitios de unión a IP3. Sin embargo, en ninguno de estos trabajos fueron determinados o caracterizados los canales sensibles a ligandos responsables de la liberación de calcio. En la Fig.3 son resumidos los mecanismos de transporte y liberación de Ca2+ conocidos hasta hoy en las membranas intracelulares, específicamente — del tonoplasto y el retículo endoplásmico, de las células vegetales.

30

ADP+Pi

H+-ATPasa

H

+

ATP PPi

H

RE

2+

1-3 mM

2+

CAX

0.1-200 mM Ca2+ ACA ECA BCC1 LCC1

Vacuola

+

Ca

ADP+Pi

Ca

pH 4..6.5

H+-PPasa

ACA

ATP

SV

ATP

ADP+Pi

ADP+Pi

Ca Citoplasma

2+

0.1-20 mM Ca

2+

2+

2+

Fig.3 Rutas conocidas de transporte de Ca en los mayores depósitos de Ca en las células vegetales (fuente: elaboración propia)

ATPasas: ACA - ATPasas con mecanismo de autoihibición y regulación por calmodulina, ECA - ATPasas tipo RE; H+-ATPasa, H+-PPasa - respectivamente, bomba de protones y pirofosfatasa vacuolares que generan el gradiente de H+, necesario para el funcionamiento de los CAX. Transportadores: CAX - intercambiadores H+/Ca2+. Canales: SV - canal vacuolar lento, el único establecido firmemente hasta el momento en la membrana vacuolar con permeabilidad al Ca2+; BCC1, LCC1 - canales determinados en vesículas del retículo endoplásmico.

2. Objetivos del proyecto

2.1 Hipótesis La actividad del Ca2+ en vacuolas vegetales varía. En el rango micromoles-1 mM es posible realizar el monitoreo de la actividad de Ca2+ en la vacuola, utilizando como reportero intrínseco el canal SV — el canal vacuolar con mayor distribución y con sensibilidad al Ca2+ vacuolar en el rango señalado. El canal SV es el único canal con permeabilidad a Ca2+ establecida, presente en el mayor depósito intracelular de Ca2+ — la vacuola central. Por lo tanto, el canal SV pudiera participar en la señalización por Ca2+, particularmente — en la liberación de calcio inducida por calcio (LCIC). En la membrana del segundo mayor depósito intracelular de Ca2+ — el retículo endoplásmico, se encuentran canales permeables a Ca2+. Es probable, que algunos de estos canales sean activados por ligandos (IP3) y participen en la liberación de calcio desde este compartimiento.

2.2 Objetivos Generales: Determinar la concentración de Ca2+ vacuolar libre en vacuolas de células vegetales y las rutas de movilización de Ca2+ intracelular desde los principales depósitos internos de Ca2+ — la vacuola y el retículo endoplásmico. Específicos: 1. Elaborar una técnica no invasora de la medición del calcio vacuolar libre, basada en el efecto modulador del Ca2+ sobre el canal SV. Utilizando ésta, determinar el nivel de calcio vacuolar libre en vacuolas de betabel. Comparar los datos obtenidos con datos de técnicas alternativas de medición de Ca2+. 32

2. Determinar la actividad del canal SV en condiciones iónicas fisiológicas y estimar la posibilidad de la participación de este canal en la señalización por Ca2+. 3. Elaborar una técnica que permita la búsqueda y caracterización de canales iónicos en membranas nativas de retículo endoplásmico. Por medio de dicha técnica, realizar la búsqueda de canales permeables a calcio en membranas de retículo endoplásmico. Caracterizar los canales hallados en el RE y determinar su sensibilidad a ligandos.

33

3. Metodología 3.1 Preparaciones 3.1.1 Objeto de estudio. En el presente trabajo fueron estudiados canales permeables a Ca2+ de membranas intracelulares de la raíz napiforme de betabel (Beta vulgaris L.; Chenopodiacea), específicamente — de la vacuola y el retículo endoplásmico.

3.1.2 Obtención de vacuolas. Soluciones de trabajo. Para el trabajo utilizamos raíces frescas de betabel compradas en un supermercado. Las vacuolas fueron obtenidas de manera mecánica — destrozando un pequeño corte de raíz de betabel en la solución isoosmótica de baño (modificación de la técnica de Trebacz y Schönknecht, 2000) y después de esto — trasladadas a la cámara de trabajo. Las soluciones de trabajo son descritas más abajo (Tablas 8-12). Las soluciones con baja concentración de Ca2+ fueron preparadas con búferes para calcio, calculando las cantidades de reagentes necesarias con el programa Winmaxc32 v2.50 (Patton y col, 2004). El ajuste de la osmolaridad de las soluciones fue realizado con sorbitol, agregado en la cantidad definida por mediciones de osmolaridad En los experimentos de calibración (Tablas 8-11) la solución citosólica empleada contenía 2 mM Ca2+ para mayor activación del canal SV.

Soluciones para registros en configuración attached TABLA 8. Soluciones para registros en configuración attached

Solución de baño

Solución de pipeta

KCl — 100 mM KCl — 100 Mm 2+ Ca — 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 10.0 mM* Ca2+ — 2 mM MES — 10 mM HEPES — 10 mM Sorbitol Sorbitol pH 6.4 pH 7.5 2+ * — las soluciones con 0 y 0.05 mM de Ca fueron preparadas utilizando búferes para calcio (Tabla I en el Apéndice).

34

Soluciones para registros en parches aislados TABLA 9. Soluciones para determinar el efecto de pH sobre la actividad del canal SV

Vacuola

Citosol

KCl — 100 mM KCl — 100 mM Ca2+ — 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 10.0 Ca2+ — 2 mM mM* MES — 10 mM HEPES — 10 mM sorbitol sorbitol pH 5.5 / 6.4 pH 7.5 2+ * - las soluciones con 0, 0,01 y 0,05 mM de Ca fueron preparadas utilizando búferes para calcio, como es mostrado en la Tabla II del Apéndice. TABLA 10. Soluciones para determinar el efecto de Na+ vacuolar sobre la actividad del canal SV.

Vacuola

Citosol

KCl — 187 mM KCl — 125 mM KCl — 125 mM KCl — 100 mM NaCl — 62 mM Ca2+ — 2 mM 2+ 2+ 2+ Ca — 0, 0.5 mM* HEPES — 10 mM Ca — 0, 0.5 mM* Ca — 0, 0.5 mM* MES — 10 mM MES — 10 mM MES — 10 mM Sorbitol Sorbitol sorbitol sorbitol pH 7.5 pH 5.5 pH 5.5 pH 5.5 * - las soluciones con 0 mM de Ca2+ fueron preparadas utilizando los valores de la Tabla II del Apéndice. TABLA 11. Soluciones para determinar el efecto conjunto de H+, Na+, Ca2+, Mg2+ sobre la actividad del SV.

Vacuola

Citosol

KCl — 125 mM KCl — 100 mM NaCl — 62 mM Ca2+ — 2 mM 2+ HEPES — 10 mM Ca — 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 mM * 2+ sorbitol Mg — 8 mM MES — 10 mM pH 7.5 sorbitol pH 5.5 * - las soluciones con bajo Ca2+ fueron preparadas utilizando búferes para calcio, como es mostrado en la Tabla III del Apéndice. TABLA 12. Soluciones de modelación del entorno iónico fisiológico del canal SV (0.5-1.5 mM Mg2+ citosólico).

Vacuola KCl — 125 mM NaCl — 62 mM Ca2+ — 0,25 mM Mg2+ — 8 mM MES — 10 mM sorbitol pH 5.5

Citosol 100 nM Ca2+ KCl — 100 mM Mg2+ — 0.5, 1.5 mM Ca2+ — 100 nM HEPES — 10 mM Sorbitol pH 7.5

20 μM Ca2+ KCl — 100 mM Mg2+ — 0.5, 1.5 mM Ca2+ — 20 μM HEPES — 10 mM sorbitol pH 7.5

35

Las osmolaridad de las soluciones de trabajo fue ajustada con sorbitol a la osmolaridad del jugo celular, determinada con un osmómetro crioscópico Osmomat 030 (Gonotec).

3.1.3 Obtención de fracción microsomal enriquecida de RE 1. 250 gramos de betabel fueron homogenizados a 4°C en un búfer de la siguiente composición (en mM): 50 — Tris-HCl, 1 — EDTA, 1 — dithiothreitol (DTT; antioxidante), 250 — sacarosa y 5 μg/ml leupeptina (inhibidor de proteasas). El volumen de la solución necesario fue determinado calculando 2 ml por gramo de betabel utilizada. 2. El homogenato fue filtrado a través de una gasa. 3. Centrifugación del filtrado a 4°C por 10 minutos y 10,000 g para aislar paredes celulares y otros residuos sólidos. 4. Centrifugación en alícuotas de 40 ml por una 1 hora a 4°C y 100,000 g (modificado 50,000 g por 1,5 horas debido a la ausencia de equipo requerido). 5. Obtención del pellet (pastilla) de membrana total. 6. Resuspensión del pellet en 0.5 ml de búfer de resuspensión que contiene (en mM): 5 — KH2PO4, 4 — KCl, 250 — sacarosa, 1 — DTT y 5 μg/ml de leupeptina. 7. Separación de fracciones de membranas (alícuotas de 1 ml) en gradiente de sacarosa (10% - 60%, volumen — 40 ml) con 1 mM EDTA-KOH (pH 7.5) agregado. Temperatura — 4°C. Tiempo de rotación — 1 hora a 30,000 g. Las fracciones fueron identificadas por los siguientes marcadores enzimáticos — ATPasa mitocondrial, vacuolar y plasmática; NADPH : citocromo C (P-450)-reductasa y citocromo Coxidasa. La fracción correspondiente al RE (marcador específico — NADPH : citocromo Creductasa) fue extraída, aliquotada y conservada a –20 °C.

3.1.4 Obtención de liposomas gigantes. Técnica de deshidrataciónrehidratación. 1. 200 ml de suspensión de membrana de RE en sacarosa fueron diluidos en 2 ml de búfer de lavado del siguiente contenido (en mM): 50 — Tris-HCl, 1 — EDTA (pH 7.8), 1 — DTT y 5 μg/ml leupeptina (para extracción de la sacarosa que dificulta la formación de liposomas).

36

2. Centrifugación a 100,000 g por 1 hora (igualmente modificado a 50,000 g por 1.5 horas) a 4°C. Obtención del pellet (pastilla) de membrana de retículo endoplásmico. 3. Resuspensión en 5 μl de MOPS (10 mM, pH 7.4), 10 μl de etilenglycol (5%). 4. los 15 μl resultantes fueron colocados en la cámara experimental para la deshidratación (4-6 horas a 4°C con o sin silicagel). 5. Hidratación de la preparación mediante la agregación de 20 μl KCl (100 mM) durante la noche a 4°C o exponiendo la preparación 2-3 horas a temperatura ambiente. 6. Una vez observadas la liposomas, fue cuidadosamente añadida la solución de baño (inicialmente — KCl (100 mM), sorbitol; reemplazada después por soluciones de otra composición, según el experimento).

3.2 Registros electrofisiológicos Patch Clamp 3.2.1 Generalidades Los registros electrofisiológicos fueron realizados a temperatura ambiente con la técnica de fijación de voltaje (patch-clamp) descrita por Hamill y colaboradores (1981). Todas las manipulaciones eran seguidas bajo un microscopio Nikon-Diaphot TMC invertido. El electrodo de medición fue ubicado con respecto a la vacuola con la ayuda de micromanipuladores Burleigh XYZ con soporte de Newton (XYZ manual y Z piezoeléctrico). Como electrodo referente fue utilizado un puente de agar (2%, solución acuática) con 100 mM de KCl. Los voltajes de mantenimiento y de comando fueron ajustados desde un amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments, USA) y una computadora 486DX con el software pClamp v.6 instalado. Aparte, en la computadora fueron diseñados los protocolos de voltaje. Las corrientes registradas fueron seguidas en el osciloscopio Tektronix 511A y grabadas en la computadora 486DX por un convertidor análogo-digital DigiData1200. El análisis inicial de los datos digitalizados fue realizado con el software de la serie pClamp v.6. Siguiendo la propuesta realizada en el trabajo de Bertl y colaboradores (1992), el signo del potencial se toma respecto al citosol y las corrientes positivas (salientes) representan la entrada de cationes a la vacuola.

37

3.2.2 Fabricación de micropipetas Las micropipetas fueron fabricadas de capilarios de vidrio marca KIMAX (Kimble Products, USA) o Kwik Fill (World Precision Instruments Inc, USA) en un estirador horizontal P-97 (Sutter Instruments) y pulidas en una microforja L/M-CPZ 101 bajo un microscopio invertido Zeiss. Las micropipetas, hechas de vidrio KIMAX, además de esto, fueron cubiertas con resina sintética Sylgard (List Biomedical) para disminuir la capacitancia, causada por el estrecho grosor de sus paredes. La resistencia de las pipetas utilizadas en los experimentos era de 10-20 MOhm para las configuraciones attached y parche aislado (inside-out, outside-out) y de 24 MOhm para la configuración vacuola entera.

3.2.3 Registros de actividad de canales en las configuraciones attached, vacuola-completa, parche aislado. Las configuración attached fue obtenida mediante una gentil succión de la membrana vacuolar adentro de la micropipeta hasta la formación de un sello de alta resistencia, y era la configuración básica para la obtención sucesiva de otros dos tipos de configuraciones — vacuola completa (mediante una succión fuerte para romper la membrana del sello, pero sin perder el contacto de alta resistencia) y parche aislado en la configuración outside-out (obtenido mediante un movimiento rápido del micromanipulador que causa la ruptura del contacto entre la vacuola y la micropipeta, dejando en esta última un pequeño fragmento de membrana con la orientación similar a la de la configuración vacuola completa). Otra de las configuraciones de parche aislado, inside-out (que se obtiene de manera similar al outside-out, pero desde la configuración attached), fue utilizada en algunas ocasiones, aunque su obtención presentaba cierta dificultad y en esta configuración el número de canales en el parche fue menor, en comparación con el outside-out. Un esquema de la obtención de las diferentes configuraciones es mostrado en la Fig.4. Para los experimentos fueron utilizados muestras, donde la resistencia del sello fue mayor de 1GOhm.

3.2.4 Medición del potencial a través de la membrana vacuolar. El potencial a través del tonoplasto fue determinado en condiciones de 100 mM KCl simétrico en la configuración ‘vacuola entera’ y fijación de corriente (I=0). Debido a la presencia de aniones orgánicos dentro de la vacuola, los datos fueron corregidos por el factor del potencial de unión líquida — cerca de 8 mV (electrodo — positivo), determinado en mediciones con microelectrodos con una solución de KCl de 3M. 38

Attached

Inside-out Whole-vacuole

Outside-out Fig.4 Esquema de la obtención de las diferentes configuraciones, utilizadas en la técnica de patch-clamp (fuente: elaboración propia). La obtención de cualquier configuración empieza por la obtención de un sello de alta resistencia (>1GOm) en la configuración attached. Con base en esta se pueden obtener dos configuraciones: mediante la ruptura de la unión entre la micropipeta y la membrana se obtiene la configuración inside-out, la ruptura de la membrana directamente debajo de la pipeta origina la configuración ‘vacuola entera’ - análogo de whole-cell. A su vez, la ruptura de la unión de la micropipeta a la vacuola causa el aislamiento de un fragmento de membrana en la configuración outside-out.

3.2.5 Protocolos de voltaje para el estudio del canal vacuolar SV. Obtención de relación corriente-voltaje del canal unitario. Las corrientes de los canales SV eran evocadas por pulsos rectangulares. Para los registros en configuración outside (vacuolar)-out, el potencial de mantenimiento fue establecido en +60 mV. El protocolo de voltaje era iniciado por un prepulso de +100 mV para la desactivación de los posibles canales abiertos. Los pulsos de voltaje fueron aplicados desde –100 mV con un paso de 20 mV hasta llegar a –160 ó –180 mV. El protocolo lo finalizaba otro pulso a +100 mV para poder observar las colas de desactivación de los canales. La duración del pulso era escogido de tal manera, que las corrientes activadas alcanzaran un nivel estacionario, esto generalmente ocurría entre 3-5 segundos, en dependencia del calcio vacuolar aplicado. Los registros en las configuraciones inside-out y attached fueron realizados con el mismo protocolo, excepto que todos los signos de voltajes cambiaban al opuesto. La obtención de curvas I-V de los canales unitarios fue realizada con la técnica descrita por Dobrovinskaya y col. (1999). Para obtener la relación corriente-voltaje de un canal unitario, manualmente se escogía un voltaje de mantenimiento en el cual se encontraba abierto no más de un canal SV al mismo tiempo. Sobre este potencial de mantenimiento fueron aplicados pulsos de voltaje en forma de rampa muy rápida (con duración de 15 ms) que recorría durante este corto tiempo el voltaje de –200 mV hasta +200 mV. En ausencia de canales abiertos, este pulso nos da la corriente de fuga, mientras que la aplicación de la rampa durante el estado abierto del canal nos regresa la suma de la corriente-fuga y la corriente del canal unitario abierto. Restando de esta última la corriente-fuga obtuvimos la corriente que pasa por un canal unitario en dependencia del voltaje aplicado, es decir, — la relación corriente-voltaje.

3.2.6 Determinación de la probabilidad de apertura. La corriente macroscópica I generada por la populación de canales en un parche es determinada como I = i · N · P, dónde i — corriente del canal unitario, N — número de canales, P — probabilidad de apertura del canal unitario. Para comparar muestras con un diferente número de canales presentes primero fue evaluado el número promedio de los canales abiertos (NP) en cada pulso de voltaje en el estado estacionario de la corriente de activación. Para eso, la corriente total de un parche (aislado o no) fue dividida 40

por el valor de la corriente del canal unitario (obtenida con la técnica de rampas) en el valor de voltaje correspondiente. Los datos normalizados (Fig. 5A) (NP/NPmax, donde NPmax es el mayor número promedio de canales abiertos obtenido) de diferentes parches, de esta manera, pudieron ser comparados y representan la probabilidad de apertura Po/Pomax del canal SV a cierto potencial.

3.2.7 Calibración del efecto de Ca2+ vacuolar sobre el canal SV. En nuestro caso, la curva de calibración representa una relación del voltaje en el cual la probabilidad de apertura de canales SV es 1% en dependencia de la concentración de Ca2+ vacuolar aplicada (Fig. 5B). Las razones por las cuales fue escogido el valor de 1% de canales abiertos son las siguientes: 1) cerca del umbral de activación por voltaje son más estables los estados cerrados del canal, los cuales definen su sensibilidad al Ca2+ vacuolar. Es decir, en condiciones de 1% de canales abiertos nuestro electrodo es mas sensible al nivel de Ca2+, que en condiciones cuando todos los canales están abiertos, 2) en este por ciento de canales abiertos el desplazamiento de la dependencia del voltaje con el cambio del nivel de Ca2+ vacuolar es casi paralelo, 3) este por ciento de canales abiertos normalmente es detectable. La curva de calibración para el canal SV fue hecha a partir de los datos obtenidos en parches aislados, para poder controlar la actividad de Ca2+ a ambos lados de la membrana.

3.2.8 Estimación del nivel de calcio vacuolar libre, utilizando la curva de calibración. Los datos utilizados para estimar el nivel de calcio vacuolar fueron los obtenidos en registros en configuración attached. Haciendo el mismo procedimiento descrito en los p.3.2.6-7 obtenemos la relación del voltaje de 1% de canales abiertos en dependencia de la actividad nativa del calcio vacuolar (a estimar). Superponiendo estos datos sobre la curva de calibración obtuvimos el valor del nivel de calcio vacuolar buscado. No obstante, por manipulaciones con el nivel de Ca2+ en el baño tenemos que suponer que el nivel de calcio vacuolar puede sufrir cambios — disminuir o aumentar, según sea la dirección del potencial electroquímico para Ca2+. Por eso, para averiguar la actividad auténtica del calcio vacuolar los resultados obtenidos son comparados con valores-límites de la actividad de calcio, calculadas por la ecuación de Nernst: en ausencia de ATP u otra fuente de energía, se supone que dominan los procesos pasivos de transporte, por lo que la concentración del Ca2+ vacuolar tiende a su valor de equilibrio. Para obtener la concentración de equilibrio necesitamos el valor del

41

A

1 NP / NPmax

0.01

V / mV V1

V1% / mV

V2

V3

Potenciales de 1% de canales abiertos

V1% en registros attached

V3

Curva de calibración obtenida en parches aislados

B V2 V1 2+

lg [Ca ]vac / mM [Ca2+]vac en dependencia 2+ de [Ca ]baño 2+

C

lg [Ca ]vac / mM Equilibrio de [Ca2+]vac, determinado por la ecuación de Nernsto

[Ca2+]vac vera

2+

lg [Ca ]baño / mM Fig.5 Pasos ejecutados para la comparación de registros en diferentes parches, la 2+ calibración del efecto de Ca sobre el canal SV y para la estimación de la actividad del calcio vacuolar (fuente: elaboración propia).

A. Determinación del voltaje de 1% de canales abiertos, a partir de datos obtenidos y los fit, realizados con el modelo matemático (Pottosin et al., 2004); B. Obtención del nivel de Ca2+ vacuolar con la influencia del nivel de Ca2+ aplicado en el baño; C. Obtención de la verdadera actividad de Ca2+, comparando los datos obtenidos en B, con la actividad-límite para calcio, obtenida con la ecuación de Nernst y el potencial a través de la membrana. Detalles - en el texto.

potencial a través de la membrana que es registrado al fin del experimento con el parche attached vía ruptura de la membrana y medición en condiciones de fijación de corriente (I=0). Colocando en una dependencia ‘nivel Ca2+ vacuolar del nivel de Ca2+ en el baño’ los datos del Ca2+ vacuolar obtenidos y los datos de la actividad-límite calculados podemos compararlos. Suponemos, que el nivel de Ca2+ vacuolar vero es aquel que se encuentre en el cruce de las curvas, de límite y obtenida de la curva de calibración (Fig. 5C), ya que este cruce representa la condición de equilibrio de flujos de Ca2+ entre la vacuola y el baño, cuando la diferencia en el potencial electroquímico para Ca2+ es nulo.

3.2.9 Protocolos de voltaje para el estudio de canales permeables a Ca2+ del retículo endoplásmico. Los estudios de la activación de los canales del RE fueron realizados a un potencial de mantenimiento de –60 mV con pulsos rectangulares de voltaje desde –140 y hasta +140 mV (paso de 40 mV) y un postpulso a –100 mV para observar la desactivación de los canales. En otra modificación del protocolo, el signo tanto del potencial de mantenimiento como del postpulso eran cambiados al opuesto y consituían, respectivamente, +60 y +100 mV. Estos protocolos de 750 ms de duración fueron aplicados tanto en configuración inside-out, como outside-out, ya que, al parecer, los canales no presentaban una orientación determinada. Al igual que los canales vacuolares, a los canales del RE fueron fueron aplicadas las rampas de voltaje para determinar la relación I-V del canal unitario, pero en el rango desde +150 hasta – 150 mV para evitar la perforación de la membrana. En algunos casos la polaridad de la rampa fue invertida. La duración de la rampa, aplicada a los canales del RE fue similar a la aplicada al canal SV — 15 ms.

Microelectrodos ionoselectivos 3.2.10 Mediciones de la actividad de cationes vacuolares con la técnica tradicional de electrodos ionoselectivos. La técnica estándar de microelectrodos ionoselectivos incluye el uso de microelectrodos de doble barril: uno — para la determinación del potencial a través de la membrana, y un segundo — para la medición del potencial del electrodo con la resina ionoselectiva. La substracción del potencial consecuentemente permite calcular la actividad corregida del ion registrado. Desafortunadamente, esta técnica no se encontraba disponible, por lo que fue necesario el uso de 43

sólo el microelectrodo ionoselectivo, haciendo las respectivas correcciones para el potencial de unión líquida y el potencial a través de la membrana vacuolar. Para realizar la correción originada por la presencia del potencial a través del tonoplasto, fue utilizado un segundo microelectrodo con 1M KCl que permitía registrar simultáneamente el potencial de la membrana. El potencial de unión líquida fue determinado para el electrodo ionoselectivo determinando el cambio de potencial causada por la sustitución de la solución de baño de 50 mM KCl (pH5.5) por 50 mM de ácido málico (pH 5.5, KOH). Ya que la selectividad de las resinas es afectada por la fuerza iónica de las soluciones, primero eran determinadas las concentraciones de los mayores osmóticos (K+, Na+) y después era incluidas en la solución de calibración de los otros electrodos ionoselectivos (para Ca2+ — en nuestro caso). Lamentablemente, la selectividad de la resina selectiva para Na+ es afectada drásticamente por la presencia de K+, por lo que para determinar la concentración de Na+ fue empleado el método de fotometría. Las resinas ionoselectivas empleadas fueron las siguientes: para K+ — ionoforo de potasio, cocktail I (Fluka 60031), para Na+ — ionoforo de sodio, cocktail A (Fluka 24902), para Ca2+ — ionoforo de calcio, cocktail A (Sigma I-1772).

3.2.11 Técnica MIFE (Microelectrode Ion Flux Estimation). El flujo neto causado por la difusión de un ion a través de una membrana puede ser determinado sabiendo el potencial electroquímico de ese ion, su movilidad y su concentración en la solución (ver teoría en Newman, 2001). El sistema MIFE permite realizar mediciones del gradiente del potencial electroquímico cerca del objeto de estudio, para después calcular el flujo neto del ion a través de la membrana, teniendo en cuenta la geometría del objeto de estudio, la movilidad del ion y las características del electrodo de medición (para más detalles ver Shabala y col., 1997 o Newman, 2001). El proceso de adquisición de los registros consiste en el movimiento controlado de un electrodo ionoselectivo entre dos posiciones — cercana y más alejada en respecto al objeto de estudio (‘x’ y ‘x + dx’, respectivamente). El cambio del voltaje dV en el electrodo (causado por la diferencia en las concentraciones a diferente distancia del objeto) es registrado y convertido en el flujo neto J de un ion específico (ver Fig.6):

⎛ dV J = cuzFg ⎜ ⎝ dx

⎞ ⎟, ⎠

44

donde, J — flujo neto del ion, c — concentración del ion, u — movilidad del ion, F — constante de Faraday, y asumimendo que el potencial electroquímico dμ, es regitrado por el electrodo como

d μ = zFgdV , donde g — el factor de subestimación del valor dμ por la característica interna del electrodo dV. El factor dx depende de la geometría de la superficie del objeto y para el caso de un objeto esférico (la vacuola) de radio r, se define como 1 ⎡ 1 ⎤ dx = r 2 ⎢ . − ⎣ r + x r + x + dx ⎥⎦ (Newman, 2001). Los electrodos para la técnica fueron elaborados en varios pasos que constituyeron su estiración, secado, el recubrimiento con silicona, el rellenado con la solución apropiada y el rellenado de la punta del electrodo con el intercambiador ionico líquido (liquid ion exchanger — LIX; cocktail 21048, Fluka, para Ca2+). Después de esto, los electrodos fueron calibrados utilizand soluciones-estándares con concentraciones de Ca2+ en el rango 0.05-1 mM. El objeto de estudio lo constituyeron vacuolas de betabel, aisladas como fue mencionado anteriormente.

45

m Citosol Vacuola

dx x

Fig.6 Técnica MIFE de medición de flujos (fuente: elaboración propia). La técnica se basa en la medición con electrodos ionoselectivos de la concentración del ion estudiado a diferentes distancias del objeto de estudio (x y x+dx). En estas posiciones son registrados los potenciales V y V+dV, que son la característica del potencial electroquímico m y m+dm para el ion estudiado y permite, sabiendo la composición de las soluciones y la geometría del objeto de estudio, obtener el flujo del ion (ver detalles en el texto).

4. Concentraciones libres de los principales cationes fisiológicos vacuolares y sus efectos sobre el canal SV.

4.1 Introducción. La aplicación de una fila de concentraciones de Ca2+ para el estudio de la “calibración” del canal SV reveló algunos datos similares a los presentados en varios trabajos anteriores. No obstante, a diferencia de estos últimos, el estudio del efecto de las altas y bajas concentraciones de iones individuales tanto en el lado vacuolar, como en lado citosólico, mostró algunas diferencias que impidieron el cumplimiento de unos de los objetivos del presente proyecto — la estimación del calcio vacuolar libre, utilizando el canal SV de vacuolas de raíz de betabel como reportero interno de la actividad de Ca2+. Sin embargo, el mismo principio pudo ser exitosamente aplicado con la técnica MIFE de medición de flujos y originalmente no diseñada para la medición de concentraciones iónicas intramembranales.

4.2 Resultados. 4.2.1 Osmolaridad y valor del pH del jugo vacuolar. El valor de la osmolaridad del jugo celular fue medido durante los meses de las cuatro estaciones del año y se encontraba entre 212 y 680 mOs, con un valor promedio de 498 ± 96 mOs (n=59) (Fig. 7). De todas las raíces, para el trabajo fueron escogidas las que presentaban una mayor osmolaridad del jugo celular, ya que se asumía que éstas tenían un mayor potencial metabólico para la expresión de proteínas y, particularmente — del canal vacuolar lento SV. Esta asunción coincide con cierta correlación notada entre la amplitud de las corrientes macroscópicas del canal SV en los parches y la osmolaridad determinada del contenido vacuolar, disminuyendo ambos al iniciar la época de lluvia. El pH del jugo celular también presentó variaciones entre 6.4 ± 0.2 en abril 2004 (n = 9, entre 6.16 y 6.73) y 6.0 ± 0.3 en febrero 2005 (n = 4, con valores entre 5.85 y 6.31). Estos valores fueron utilizados a continuación para la preparación de las soluciones vacuolares.

47

Presión osmótica / mOs

750

500

250

2

4

6

8

10

12

mes

Fig.7 Evolución anual de la presión osmótica del jugo celular de betabel. Para el betabel de origen local, los valores de la mayor osmolaridad coinciden con los meses de febreromarzo (promedio por arriba de 550 mOs), mientras que los valores de menor osmolaridad fueron registrados en los meses de junio y julio (valores promedio opr abajo de 450 mOs). Diferentes símbolos corresponden a diferentes años, en los que fueron realizadas las mediciones. Los símbolos corresponden a un promedio de más de 3 raíces examinadas por mes, aunque en algunos casos valores individuales son presentados.

4.2.2 Registros en configuración attached. Según estudios anteriores, es considerado que el papel principal en la regulación de la actividad del canal SV por el lado vacuolar pertenece al Ca2+ libre (ver Pottosin y col., 2004 para una revisión reciente). El aislamiento de la vacuola y su exposición a soluciones con diferentes concentraciones de Ca2+ pudieran influir en el nivel de Ca2+ vacuolar original (Fig.5C en Metodología), lo que causaría un cambio en la probabilidad de apertura del canal SV y, por lo tanto — del valor reportado de calcio vacuolar libre. Para determinar la magnitud de ésta influencia, los registros en la configuración attached fueron realizados aplicando diferentes concentraciones de Ca2+ en el baño. Las corrientes de activación del canal SV, evocadas en estas condiciones, son mostradas en la Fig.8A. La activación del canal ocurría, típicamente, en la aplicación de un potencial de comando Ev de –20 mV, sin embargo, en presencia de 1 mM Ca2+ en el baño, el umbral de activación del canal SV fue desplazado unos 20 mV a potenciales más positivos, probablemente, debido a la penetración del Ca2+ externo a la vacuola y la consecuente disminución de la probabilidad de apertura del canal. El estudio de la variación de la concentración de Ca2+ externo sobre la corriente del canal unitario (Fig.8B,C) no reveló tampoco tendencias muy notables — en presencia de tanto bajas, como altas concentraciones de Ca2+ en el baño, las relaciones I-V del canal de vacuola en vacuola mostraron una gran diversidad, muy probablemente provocada por la presencia en las vacuolas de otros componentes con la capacidad de bloquear el poro del canal (p.e., — poliaminas, ver p.1.2.2.3).

4.2.2.1 Potencial a través de la membrana vacuolar. El potencial E establecido con la técnica patch clamp a través de una membrana es igual a la suma del potencial de comando aplicado Ev y el potencial propio de esta membrana Em: E = Ev + Em. Por lo tanto, la probabilidad de apertura determinada en los registros realizados en la configuración attached, fue corregida por el factor del potencial a través de la membrana vacuolar. Éste fue determinado en la configuración ‘vacuola entera’ en condiciones de KCl 100 mM simétrico y en dependencia de las mismas concentraciones de Ca2+ en el baño, que las

49

A

0Ca

0.05Ca

250 pA 0.5 s

0.5 s

0.1Ca

0.2Ca

0.5 s

1s

0.5Ca

1.0Ca

1s

B -200

1s

C

10

I / pA

-200

-100

100

10

I / pA

-100 100

200

V / mV

V / mV -10

-10

-20

-20

1Ca 0Ca

200

-30

Fig. 8 Registros de las corrientes del canal SV en configuración attached en presencia de 2+ diferentes niveles de Ca en el baño. Los registros de la actividad del canal SV fueron obtenidos, aplicando en la pipeta 100 mM K+ y 2 mM de Ca2+ para su mayor activación. A. Registros originales. Desde el potencial de mantenimiento de -100 mV fueron aplicados pulsos de voltaje hasta +160 con un paso de 20 mV. La concentración de Ca2+ aplicada en 2+ el baño es mostrada en cada caso. B, C. I/V relaciones de canales SV unitarios en presencia de 0 mM Ca 2+ (B) y 1 mM Ca (C). Cada curva representa el promedio de 4-18 curvas corriente-voltaje, registradas en 3 2+ vacuolas a cada concentración de Ca .

aplicadas en los experimentos en configuración attached. A su vez, este potencial fue corregido por el valor del potencial de unión líquida, originado por la presencia dentro de la vacuola de grandes aniones orgánicos, y que constituyó cerca de +8 mV. La dependencia del potencial a través de la membrana vacuolar es mostrada en la (Fig.9). Finalmente, fueron determinados los potenciales de 1% de canales activos (V1%), resumidos en la Tabla 13. TABLA 13. Potencial de 1% de canales SV abiertos en parches en configuración attached en dependencia de la concentración de Ca2+ aplicada en el baño. Concentración de Ca2+ en el baño, mM

V1%, mV

0

–14.4

0.05

–2.1

0.1

–11.3

0.2

–3.9

0.5

–14.9

1.0

+5.3 2+

El potencial V1% fue determinado en el rango 0-1.0 mM de Ca en el baño. La realización de registros en la configuración attached en presencia de mayores concentraciones de Ca2+ (2-10 mM) no fue posible por el aumento de la rigidez de la membrana vacuolar en estas concentraciones. El valor de V1% fue determinado utilizando los fits de los datos de la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura, obtenidos para el promedio de por lo menos 3 mediciones en diferentes vacuolas.

4.2.3 Concentraciones vacuolares fisiológicas de K+, Na+, Ca2+ y Mg2+. Una de las principales dificultades para la interpretación de los registros electrofisiológicos del canal SV, obtenidos en trabajos anteriores, es la ausencia de datos sobre el entorno iónico presente en condiciones fisiológicas. En este trabajo fueron determinadas las concentraciones de los cationes fisiológicos más relevantes para la actividad del canal SV, resumidas en la Tabla 14. Es necesario aclarar que los valores presentados corresponden a una serie de mediciones realizadas en un lapso de tiempo pequeño (menos de 1 mes) en muestras de un solo origen, por lo que no podemos presumir que estos valores sean fijos y similares a los presentes en muestras de otro origen u obtenidas en otras estaciones del año. No obstante, las concentraciones obtenidas nos sirvieron de referencia para los fines de nuestro trabajo. A la vez fue aprovechada la posibilidad de realizar la medición de la concentración vacuolar de Ca2+ libre, inicialmente — con fines de realizar una comparación entre estos datos y los ‘reportados’ por la actividad del canal SV. Lamentablemente, como es mostrado en el p.4.2.7, la actividad del canal no pudo ser

51

10

V / mV

5

0

-5

-10 0.0001

0.01

1

lg[Ca2+]baño / mM

Fig.9 Dependencia del potencial a través de la membrana vacuolar de la concentración de Ca2+, aplicada en el baño. +

El potencial de la vacuola fue determinado en condiciones de 100 mM de K en la pipeta y en el baño en la configuración ‘vacuola-entera’ (n>10 para cada concentración) y calculando el potencial como Vvacuola - Vcitosol. Debido a la presencia de aniones orgánicos, el potencial fue corregido por el valor del potencial de unión líquida - alrededor de +8 mV (electrodo más positivo), utilizando registros con solución de 3M KCl en la pipeta. Es notable el aumento del declive de la curva a concentraciones mayores a 1 mM de Ca2+ en el baño. Esto sugiere una pronunciada activación del canal SV, producida por el Ca2+ citoplásmico, con la subsecuente entrada del Ca2+ a la vacuola.

utilizada para la medición del Ca2+ vacuolar. No obstante, el mismo principio3 pudo ser aplicado con la técnica MIFE (Fig.10A), donde, sin embargo, no eran las corrientes del canal SV el evento monitoreado, sino el flujo de Ca2+ a través de la membrana vacuolar, posiblemente causado por la actividad del canal SV. Como es mostrado en la Fig. 10B, el flujo registrado fue sensible al Zn2+ (100 μM) — bloqueador inespecífico del canal SV (Hedrich y Kurkdjian, 1988). El flujo remanente registrado en la aplicación de Zn2+ pudiera corresponder a otros canales permeables para Ca2+, hasta ahora desconocidos. Adicionalmente, esta modificación de la técnica MIFE (originalmente diseñada para la medición de flujos), aplicada en condiciones de ~5 μM Ca2+ citoplásmico (por la contaminación), permitió estimar la corriente del canal SV, acarreada por Ca2+ (alrededor de 1 pA para una vacuola típica de 50 μm de diámetro), asumiendo que este último cruza el tonoplasto solamente a través del canal SV (Fig.10A). TABLA 14. Concentraciones de los cationes fisiológicos más relevantes en vacuolas de betabel (Beta vulgaris L.). Ion

Concentración o actividad determinada

Técnica de medición

K

125.4 ± 3.7 mM

Microelectrodos K+-selectivos

Na+

62 mM

Fotometría de flama

Mg2+

8.3 ± 0.7 mM

Electrodos Mg2+ selectivos

Ca2+

0.196 ± 0.179 mM 0.21 mM

Electrodos Ca2+ selectivos Modificación de la técnica MIFE

+

El efecto del cambio de las concentraciones iónicas vacuolares fue estudiado por separado y en conjunto, para determinar sus efectos sobre la actividad final del canal SV.

4.2.4 Efecto del pH vacuolar sobre el umbral de activación del canal SV. El efecto del pH sobre la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal SV fue determinado en condiciones de 100 mM KCl simétrico, 2 mM Ca2+ y pH 7.5 en el lado citoplásmico y aplicando en el lado vacuolar una serie de concentraciones de Ca2+ (0-10 mM) en un fondo de pH 6.4 y pH 5.5. Las corrientes generadas en estas condiciones se muestran en la Fig. 11. La dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura obtenida fue satisfactoriamente descrita por el modelo propuesto por Pottosin y col. (2004; Fig.13A) con valores de cargas de 3

Aplicación de una fila de concentraciones de Ca2+ en el baño y determinación, mediante interpolación, del punto de equlibrio, donde el flujo neto de Ca2+ a través del tonoplasto debe ser nulo. Después, utilizando la ecuación de Nernst — determinación del calcio vacuolar libre, teniendo en cuenta el potencial a través del tonoplasto. Ver p.3.2.9 de Metodología, para más detalles. 53

Flujo de Ca2+ / nmol m-2 s-1

A

2 2+

Reversión de flujo de Ca a través de la membrana vacuolar

0 2+

Flujo de Ca , correspondiente 2+ a condiciones de 5 mM Ca citosólico

-2

-4 100

Flujo de Ca / nmol m s

-2

0

-0.5

2+

B

[Ca2+] / mM

-1

10

-1.0

-1.5

testigo

+1.5 mM Mg

2+

+0.1 mM Zn

2+

Fig.10 Utilización de la modificación de la técnica MIFE para la estimación de la 2+ concentración del Ca vacuolar.

A. Aplicando en el baño soluciones con diferentes valores de [Ca ], fue obtenida la inversión del flujo de Ca2+ a través de la membrana vacuolar en la concentración alrededor de 0.2mM, estimada como cercana a la concentración de Ca2+ dentro de la vacuola debido al pequeño potencial a través del tonoplasto. Es notable la activación consecutiva del flujo de Ca2+ con el aumento de la concentración de [Ca2+]cit hasta 0.05mM que, probablemente, representa la activación del canal SV. En este caso, el valor del flujo a través del tonoplasto en condiciones de ‘0’ Ca2+ en el baño, representa el flujo neto de Ca2+ a través del canal SV en condiciones de 5 mM de Ca2+, por la contaminación del agua de las soluciones y la imposibilidad de utilizar agente quelantes. B. Evidencias de que el flujo registrado es originado por el canal SV. La 2+ 2+ aplicación de 1.5 mM Mg en el citosol aumenta el flujo de Ca registrado en comparación con el testigo (probablemente, mediante la coactivación del canal; ver texto). Al mismo tiempo, la aplicación de 0.1 mM 2+ de Zn (bloqueador inespecífico del SV) causa la inhibición del flujo por más del 50%. El flujo restante probablemente pertenece a los canales SV no bloqueados y/u otros canales, permeables a Ca2+, no identificados hasta ahora. Los valores del flujo son el promedio de 6-8 mediciones en vacuolas individuales. 2+

1s

pH 6.4

250pA

pH 5.5 500 pA

0Ca

0.01Ca

500 pA

0.1Ca

1.0Ca

10.0Ca

Fig.11 Registros de corrientes del canal SV en condiciones de pH vacuolar ácido. +

La actividad del canal SV fue registrada en parches aislados en condiciones de 100 mM de K simétrico, 2 mM Ca2+ y pH 7.5 en el lado citoplásmico y diferentes concentraciones de Ca2+ en el lado vacuolar en un fondo de pH 6.4 ó 7.5. Los registros fueron realizados desde el potencial de mantenimiento de -100 mV con un paso hasta +160 mV (para más claridad aquí son mostrados con un paso de 40 mV). Al igual que en condiciones de pH vacuolar neutro (pH 7.5), el canal SV presentó sensibilidad al Ca2+ vacuolar - en condiciones ya de 0.05 mM de éste, son abolidas las corrientes entrantes. Para más claridad, los registros se muestran reflejados verticalmente, pero representan las corrientes salientes del citoplasma, como establece la convención de Bertl y cols., (1992).

compuertas (z1=0.6 y z2=2.9), similares a las reportadas en ese trabajo (z1=0.7 y z2=2.9; Pottosin y col., 2004), por lo tanto, el esquema general de las transiciones del canal del estado cerrado al estado abierto no es afectado por la disminución del pH vacuolar. La acidificación del lado vacuolar a pH 6.4 y 5.5 no tuvo efecto sobre la amplitud de las corrientes de los canales unitarios (Fig.12). En contraste, la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal mostró un comportamiento particular con la disminución del pH vacuolar (Fig.13A,B) en comparación con datos reportados anteriormente para un rango similar de Ca2+ vacuolar, pero en condiciones de pH 7.5 (Pottosin y col., 2004). En presencia de bajas (‘0’ mM) concentraciones de Ca2+, la disminución del pH desde 7.5 (referencia) hasta 5.5, no tuvo efecto notable sobre el potencial del umbral de activación del canal y sobre la dependencia de voltaje de su probabilidad de apertura (Fig.13). Sin embargo, en el rango de concentraciones de 0.05-1.0 mM de Ca2+ éstos mostraron una consecutiva desensibilización al nivel de Ca2+ con la disminución del pH, revelándose a pH 5.5 como una meseta en la dependencia del potencial V1% en función del Ca2+ aplicado en el lado vacuolar (Fig.13B), con un potencial V1% promedio de –14.7 ± 4.4 mV (valores entre –19.5 y – 13.5 mV para un cambio de concentración de Ca2+ en el rango 0.05-1 mM; comparar con el desplazamiento del potencial V1% desde –63.2 hasta –21.0 en el cambio de concentración de Ca2+ vacuolar de 0.01 a 0.05 mM.).

4.2.5 Efecto del Na+ vacuolar sobre la curva de activación del canal SV en condiciones de pH fisiológico. En nuestro trabajo, las vacuolas de betabel presentaron una concentración de Na+ aproximadamente igual a la mitad de ésta para K+ (ver Tabla 14, p.4.2.3). La regulación del canal SV por este último cation, reportada previamente en el trabajo de Ivashikina y Hedrich (2005; ver también p.1.2.2.5), y del Ca2+ vacuolar fue investigada en detalles en nuestro estudio. En presencia de ‘0’ Ca2+ vacuolar y en el fondo fisiológico de K+ (125 mM), la aplicación de Na+ en concentraciones cercanas a las fisiológicas (62 mM), causó un desplazamiento del potencial V1% desde –61 mV hasta –48 mV (Fig.14A). Este efecto de disminución de la probabilidad de apertura del canal SV es evocado por Na+ de manera específica, ya que la sustitución de Na+ por una concentración equivalente de K+ no resultó en un desplazamiento del umbral de igual magnitud (Fig.14A). A diferencia de esto, la probabilidad de apertura del canal en presencia en el lado vacuolar de 62 mM Na+ y 0.5 mM Ca2+ en el fondo de 125 mM K+, es mayor, en comparación con la aplicación de la misma concentración de calcio pero en el fondo de una 56

A

pH 6.4 -200

10

I / pA

-100

100 10Ca

200

-10

-20 2.0Ca 1.0Ca

-30

0.5Ca 0.2Ca 0.01Ca 0.05Ca 0Ca

B

-40

pH 5.5 -200

10

I / pA

-100 100

10Ca

200

-10

-20 2.0Ca 1.0Ca 0.5Ca 0.2Ca 0.05Ca 0Ca 0.01Ca

-30

-40

Fig.12 Efecto del pH vacuolar sobre la relación corriente-voltaje del canal SV unitario. Las curvas corriente-voltaje fueron obtenidas con la aplicación de rampas de voltaje de +200 a -200 mV de 15 ms de duración, en condiciones iguales a las de la Fig.10. Aparentemente, el pH vacuolar aplicado no tuvo efecto sobre las corrientes del canal unitario, por lo que los efectos del pH se deben al cambio en la probabilidad de apertura del canal y no involucran el bloqueo de éste. Cada curva representa el promedio de n>20 registros.

A NPo / NPomax

1

0 Ca 0.01 Ca 0.05 Ca 0.5 Ca 2 Ca 10 Ca

0.01

0.0001 -50

0

50

100

150

V / mV

B 60

pH 7.5

V1% / mV

pH 6.4

30

pH 5.5

0 -30 -60 -7

10 10

-5

0.01

0.1

Ca

2+

1

10

/ mM

Fig.13 Efecto del pH vacuolar sobre la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal SV. Utilizando los registros de la Fig.11 fueron determinados los potenciales de 1% de canales abiertos en presencia de diferentes concentraciones de Ca2+ en el lado vacuolar. A. Dependencia de voltaje de las corrientes del canal SV en parches aislados con 0-10 mM de Ca2+ y pH 5.5 en el lado vacuolar, ajustados con la ecuación de Boltzman doble. El potencial de 1% de canales abiertos fue determinado y utilizado para la construcción de la curva de calibración (B). Las curvas para 0.1 y 0.2 mM Ca2+ están situadas entre las curvas para 0.05 y 0.5 mM de Ca2+ y fueron omitidas para más claridad. Los puntos son el promedio de 4-8 parches individuales y son presentados con la desviación estándar. B. Curvas de calibración del potencial V1% en función del Ca2+ vacuolar y diferentes pH vacuolares. La curva para pH 7.5 fue elaborada a partir de los datos de Pottosin y col., 2004 y es presentada sin SD. Es notable la aparición de un plato a pH 6.4 en el rango de 0.2-0.5 mM de Ca2+, que se extiende al rango de 0.05-0.5 mM de Ca2+ a pH 5.5, sugeriendo una pequeña especificad del canal SV al Ca2+ dentro de estos rangos a pH vacuolar bajo.

A NPo / NPomax

1

0 Ca 0.01

125 K 187 K 125 K + 62 Na

0.0001 -100

-50

0

50

100

150

V / mV

B NPo / NPomax

1

0.5 Ca 0.01

125 K 187 K 125 K + 62 Na

0.0001 -100

-50

0

50

100

150

V / mV

+

Fig.14 Efecto del Na vacuolar sobre la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal SV. El efecto del Na+ vacuolar fue estudiado en parches aislados en presencia de 100 mM K+ simétrico, 2 mM Ca2+ y pH 7.5 en el lado citosólico y las concentraciones señaladas de K+ y Na+ y pH 5.5 en el lado vacuolar. Los símbolos corresponden al promedio de por lo menos 3 parches individuales. A. Efecto del Na+ vacuolar sobre la probabilidad de apertura del canal SV en ausencia de Ca2+ vacuolar. El recorrimiento del potencial del umbral de activación del canal en presencia de 62 mM de Na+ vacuolar es un efecto específico, ya que no es evocado por una sustitución equivalente de Na+ por K+. B. Efecto del Na+ vacuolar sobre la probabilidad de apertura del canal SV en presencia de 0.5 mM de Ca2+. A diferencia de los resultados en A, el Na+ vacuolar aumenta la probabilidad de apertura del canal SV en presencia de Ca2+. Sin embargo, la comparación de los efectos de Na+, revela más bien una dessensibilización del canal SV al Ca2+ vacuolar. En ambos experimentos los datos fueron ajustados, utilizando el modelo matemático, propuesto por Pottosin y cols., (2004).

concentración equivalente de K+ (Fig.14B). Esta diferencia equivale a un desplazamiento del umbral de activación del canal SV por alrededor de 20 mV a potenciales más negativos en presencia de Na+ (Fig.14B). Esta aparente ambigüedad del efecto de Na+ desaparece, si comparamos las curvas de probabilidad de apertura con diferentes niveles de Ca2+: la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal en ambos casos es igual (V1% = –46 mV y –43 mV, respectivamente en condiciones de 0 y 0.5 mM Ca2+), y no presenta sensibilidad al nivel de Ca2+ vacuolar aplicado (Fig.14).

4.2.6 Efecto conjunto de los cationes fisiológicos más importantes — H+, Na+, Mg2+, Ca2+ — que modulan la cinética de activación del canal SV. El efecto conjunto del pH, Na+, Ca2+ y Mg2+ vacuolar, fue investigado en presencia de concentraciones fisiológicas de estos cationes (Na+ — 62 mM, Mg2+ — 8 mM y pH 5.5) en el lado vacuolar y en un fondo de 100 mM de K+ y 2 mM de Ca2+ citosólico para una mayor activación de las corrientes generadas por el canal SV. En ausencia virtual de Ca2+ (Ca2+ libre — 60 nM), la presencia de otros iones recorría el potencial V1% desde –76/–78 mV (respectivamente, a pH 5.5 y 7.5 y en ausencia de Na+, Ca2+ y Mg2+) hasta –40 mV (Fig.15). Al igual que en los experimentos para mostrar el efecto del pH, la función de V1%([Ca2+]vac) presentó una meseta en el rango de 0.05-0.5 mM de Ca2+ vacuolar (V1% = –18.7 ± 3.8; valores de V1% entre

–22 y –13.5 mV). Sumados, estos dos factores ocasionaron un desplazamiento de la

dependencia de voltaje por tan sólo 20 mV a potenciales más positivos en un cambio de concentración de Ca2+ desde ‘0’ hasta 0.5 mM de Ca2+ vacuolar. Para comparar, un mismo cambio de concentración de Ca2+ en condiciones de pH 7.5, 100 mM K+ y en ausencia de otros cationes, causa el desplazamiento de la probabilidad de apertura por un valor casi 5 veces mayor — alrededor de 95 mV (Pottosin y col., 2004). Este comportamiento de la curva de calibración V1%([Ca2+]vac) se distingue drásticamente de lo esperado en base a la curva de calibración obtenida en experimentos con pH vacuolar 7.5 y en ausencia de cationes excepto Ca2+ (Fig.13B; Pottosin y col., 2004), lo que hace ineficiente su utilización para determinar el nivel de Ca2+ vacuolar libre: en experimentos en configuración attached, la determinación del potencial V1% no permite resolver de una manera precisa la concentración de Ca2+ vacuolar en el rango bajo nanomolar-submilimolar.

60

A NPo / NPomax

1

0 Ca 0.01 Ca 0.05 Ca 0.1 Ca 0.2 Ca 0.5 Ca 1 Ca 2 Ca

0.01

0.0001 -100

-50

0

50

100

150

V / mV

B

V1% / mV

60 30

pH 5.5 pH 5.5 +125 K +62 Na +8 Mg attacheds

0 -30 -60

0.01

0.1

1

10

Ca2+ / mM

+

+

2+

Fig.15 Efecto conjunto de los cationes fisiológicos más relevantes (H , Na , Ca , Mg2+) para la regulación de la actividad del canal SV desde el lado vacuolar. +

+

2+

Los registros, obtenidos en condiciones de (en mM): 125 K , 62 Na , 8 Mg , pH 5.5 y diferentes concentraciones de Ca2+ en el lado vacuolar y 2 mM de Ca2+, pH 7.5 en el lado citosólico, fueron utilizados para la determinación de la probabilidad de apertura del canal SV en condiciones de composición vacuolar cercana a la fisiológica. Registros ajustados con la ecuación Boltzmann doble, segun Pottosin y cols., 2004 (A). B. Curva de calibración del canal SV en un entorno iónico vacuolar cercano al fisiológico. Se nota el pequeño desplazamiento del potencial V1% en el rango de concentraciones de Ca2+, cercano al que tiene lugar en las vacuolas intactas, lo que impide el uso del canal SV como reportero intrínseco de la actividad de Ca2+ en la vacuola (en gris se muestran los potenciales V1% de los registros en configuración attached). Para comparar se muestras la curva de calibración del canal SV a pH 5.5 y en ausencia de otros cationes excepto Ca2+ (ver Fig.13). Los registros son el promedio de 3-5 mediciones en parches aislados individuales.

4.2.7 Evaluación de la actividad del canal SV en condiciones iónicas fisiológicas. La evaluación de la probabilidad de apertura del canal a potenciales fisiológicos en el experimento anterior nos devuelve la actividad del canal SV en condiciones iónicas fisiológicas en la vacuola. Sin embargo, este resultado es obtenido en condiciones de un alto Ca2+ en el lado citosólico, utilizado en estos experimentos para evocar una mayor actividad del canal. Para obtener una idea de la actividad básica del canal en su entorno iónico natural, en el lado citosólico fueron aplicadas concentraciones cercanas a las que tienen lugar en las células vivas: Ca2+ — 0.1 ó 20 μM (respectivamente, para modelar condiciones de reposo o elevación de calcio citosólico), K+ — 100 mM, pH 7.5. En estas condiciones en el citoplasma, además, se encuentra presente cierta cantidad de Mg2+ — otro de los cationes que regulan la actividad del canal SV (ver p.1.2.2.4), aunque no existen mediciones precisas de su actividad. El nivel de Mg2+ en el citosol es estimado entre 0.3-1.0 mM en base de mediciones realizadas en el citoplasma de células animales y escasas mediciones en plantas4 (Yazaki y col., 1988; Romani y Scarpa, 2000). En nuestros experimentos fueron utilizadas soluciones citosólicas con 0.5 y 1.5 mM de Mg2+, consideradas como abarcantes del rango que se puede presentar en las células vivas. Los registros fueron realizados en parches aislados aplicando en el lado vacuolar la solución empleada para modelar el contenido vacuolar (ver p.4.2.6) y después comparados con registros en configuración attached, obtenidos en la aplicación de las soluciones citoplásmicas tanto en el baño, como en la micropipeta. Las corrientes del canal SV evocadas en condiciones de distintas concentraciones de Ca2+ y Mg2+ citosólico en parches aislados y en configuración attached, son mostradas en las Figs.16-19. Es notable, que en presencia de tanto 0.5 como 1.5 mM de Mg2+, las corrientes originadas por 0.1 μM de Ca2+ (condiciones de ‘reposo’) representan solamente alrededor del 10% de la corriente originada en la aplicación de 20 μM de Ca2+ (condiciones de ‘elevación de Ca2+ cit’, Fig.1619B), sin afectar drásticamente el potencial del umbral de activación (alrededor de –60 mV en parches aislados). En el caso de los registros en configuración attached, la activación del SV fue registrada a los 40 mV en presencia de Ca2+ 20 μM citosólico, y a 60 mV para condiciones de ‘reposo’ (0.1 μM Ca2+) (Figs. 18,19). Esta diferencia en los valores del potencial del umbral de 4

Ver también Hawkesford M.J., Miller A.J. Ion-coupled transport of inorganic solutes. En: Blatt M.R. (Ed.) Membrane transport in plants. Blackwell Publishing, CRC Press, 2004, p. 106. 62

1s 250pA

A 160 140

Ca 0.1 mM, Mg2+ 0,5 mM 2+

120 100 80 60

O/Out B 160

140

Ca 20 mM, Mg2+ 0,5 mM 2+

120

100 80 60

Fig.16 Registros de corrientes del canal SV en parches aislados en condiciones que modelan su entorno fisiológico vacuolar y citoplásmico. I. Los registros fueron obtenidos en un parche aislado en condiciones que modelan las fisiológicas: la solución vacuolar contenía (en mM): 125 K+, 62 Na+, 8 Mg2+, 0.25 Ca2+ y pH 5.5, determinadas + 2+ como se menciona en el p.4.2.3; la solución citoplásmica contenía 100 mM K y 0.1 ó 20 mM Ca 2+ en el fondo de 0.5 ó 1.5 mM Mg y pH 7.5. Los registros fueron obtenidos desde un potencial de mantenimiento de -100 mV aplicando pulsos de voltaje hasta +160 con un paso de 20 mV. A,B - Registros en presencia de 0.5 mM Mg2+ citosólico y 0.1 mM (A) ó 20 mM (B) de Ca2+. Se nota claramente que en presencia de 0.1 mM de Ca2+, se activa sólo una pequeña fracción del total de los canales SV presentes en el parche. Para más claridad, los registros se muestran reflejados verticalmente, pero representan las corrientes salientes del citoplasma, como establece la convención de Bertl y cols., (1992).

1s 250pA

A

160

140 120

Ca 0.1 mM, Mg2+ 1,5 mM 2+

100 80 60

O/Out

B 160

Ca 20 mM, Mg2+ 1,5 mM 2+

140

120

100 80 60

Fig.17 Registros de corrientes del canal SV en parches aislados en condiciones que modelan su entorno fisiológico vacuolar y citoplásmico. II. Los registros fueron obtenidos en un parche aislado en condiciones que modelan las fisiológicas: la solución vacuolar contenía (en mM): 125 K+, 62 Na+, 8 Mg2+, 0.25 Ca2+ y pH 5.5, determinadas como se menciona en el + 2+ 2+ p.4.2.3; la solución citoplásmica contenía 100 mM K y 0.1 ó 20 mM Ca en el fondo de 0.5 ó 1.5 mM Mg y pH 7.5. Los registros fueron obtenidos desde un potencial de mantenimiento de -100 mV aplicando pulsos de 2+ voltaje hasta +160 con un paso de 20 mV. A,B - Registros en presencia de 1.5 mM Mg citosólico y 0.1 mM (A) 2+ ó 20 mM (B) de Ca . Al igual que en la Fig.16A, la corriente del canal SV en presencia de 0.1 mM de Ca2+ citosólico es una fracción de la corriente total, evocada por la presencia de 20 mM de Ca2+. No obstante, en comparación con la Fig.16A,B se nota una mayor amplitud de las corientes originadas, probablemente, por el efecto activador del Mg2+ citosólico. Para más claridad, los registros se muestran reflejados verticalmente, pero representan las corrientes salientes del citoplasma, como establece la convención de Bertl y cols., (1992).

1s 250pA

A 160 140 120

Ca 0.1 mM, Mg2+ 0,5 mM 2+

100 80 60

Attached B

160 140

Ca 20 mM, 2+ Mg 0.5 mM 2+

120 100 80 60 40

Fig.18 Registros de corrientes del canal SV en parches attached en condiciones que modelan su entorno fisiológico citoplásmico. I. Los registros presentados fueron obtenidos en parches attached en condiciones citoplásmicas, que + 2+ 2+ modelan las fisiológicas (en mM): 100 mM K y 0.1 ó 20 mM Ca en el fondo de 0.5 ó 1.5 mM Mg y pH 7.5. Los registros fueron obtenidos desde un potencial de mantenimiento de +100 mV aplicando pulsos de voltaje hasta -160 con un paso de 20 mV. A,B - Registros en presencia de 0.5 mM Mg2+ citosólico y 0.1 mM (A) ó 20 mM (B) de Ca2+. Los registros fueron obtenidos de la misma vacuola. El potencial señalado al lado de cada registro representa el potencial de comando aplicado y no está corregido por el valor del potencial a través del tonoplasto y por el potencial de unión líquida.

1s 250pA

A 160 140 120

Ca 0.1 mM, Mg2+ 1,5 mM 2+

100 80 60

Attached B 160

Ca 20 mM, 2+ Mg 1,5 mM 2+

140 120 100 80 60 40

Fig.19 Registros de corrientes del canal SV en parches attached en condiciones que modelan su entorno fisiológico citoplásmico. II. Los registros fueron obtenidos en parches attached en condiciones citoplásmicas que modelan + 2+ 2+ las fisiológicas (en mM): 100 mM K y 0.1 ó 20 mM Ca en el fondo de 0.5 ó 1.5 mM Mg y pH 7.5. Los registros fueron obtenidos desde un potencial de mantenimiento de +100 mV aplicando pulsos de voltaje hasta -160 con un paso de 20 mV. 2+ 2+ A,B - Registros en presencia de 1.5 mM Mg citosólico y 0.1 mM (A) ó 20 mM (B) de Ca . Al 2+ igual que en la Fig.18, la corriente del canal SV en presencia de 0.1 mM de Ca citosólico es una fracción de la corriente total, evocada por la presencia de 20 mM de Ca2+. El potencial señalado al lado de cada registro representa el potencial de comando aplicado y no está corregido por el valor del potencial a través del tonoplasto y por el potencial de unión líquida.

activación entre los registros en configuración attached y outside-out probablemente se debe a la existencia del potencial a través del tonoplasto, cuyo valor es cercano a los 20 mV de diferencia entre los registros (+15-+17, en dependencia de la concentración de Mg2+ aplicada). Adicionalmente, en presencia de 0.1 μM Ca2+, probablemente por la baja densidad de canales abiertos en los parches, el umbral de activación fue registrado a potenciales aún más positivos (a +80, tomando en cuenta el potencial a través del tonoplasto; Figs. 18-19A). La normalización y descripción de los datos obtenidos en parches aislados con el modelo matemático, propuesto por Pottosin y cols. (2004), nos devuelve la probabilidad de apertura del canal a potenciales fisiológicos (+15-+17 mV; Fig. 20) — alrededor de 0.02% y cerca de 0.0004%, respectivamente en condiciones de “máxima elevación de Ca2+ cit” (20 μM Ca2+ y 1.5 mM Mg2+) y condiciones de “reposo” (0.1 μM Ca2+ y 0.5 mM Mg2+). El análisis de los datos obtenidos en parches attached mostró que en éstos la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal SV es muy similar a la obtenida en parches aislados; los valores de la probabilidad de apertura a potenciales fisiológicos para las diferentes concentraciones de Ca2+ y Mg2+ en ambos casos son prácticamente iguales (Fig. 20). Al igual que en trabajos anteriores (Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001), tanto en parches aislados, como en parches attached fue obtenido el efecto activador del Mg2+ citosólico, que se reveló en los experimentos con 1.5 mM Mg2+ como un aumento del número de canales abiertos en comparación con los registrados en presencia de 0.5 mM Mg2+ (Figs. 16-20). No obstante, este incremento no fue producido por el desplazamiento del umbral de activación, que se mantuvo intacto (alrededor de los 60 mV) en experimentos en las ambas configuraciones empleadas. El efecto descrito pudiera ser explicado, si asumir que en el tonoplasto existe un pool de canales SV inactivos, activados por la presencia de Ca2+ (en bajas concentraciones) y/o Mg2+ en el citosol. En otras palabras, Ca2+ y Mg2+ aumentan el número de canales que pueden ser activados por voltaje y regulan el equilibrio de los estados activo-inactivo, en los que puede encontrarse el canal.

67

A NPo / NPomax

1 0.01

Parches aislados

0.0001

0.1mM Ca , 1.5 Mg 2+

2+

20mM Ca , 1.5 Mg 2+

1e-006

2+

0.1mM Ca2+, 0.5 Mg2+ 20mM Ca , 0.5 Mg 2+

1e-008

50

100

V / mV

B

2+

150

200

NPo / NPomax

1 0.01

Parches attached 0.0001

0.1mM Ca2+, 1.5 Mg2+ 20mM Ca2+, 1.5 Mg2+

1e-006

0.1mM Ca2+, 0.5 Mg2+ 20mM Ca2+, 0.5 Mg2+

1e-008

50

100

150

200

V / mV

Fig.20 Comparación de la modulación de la probabilidad de apertura del canal SV por cationes fisiológicos más relevantes en parches aislados y en configuración attached. En base de la amplitud de las corrientes macroscópicas del canal SV y de la corriente del canal unitario, determinada en la Fig.16, fue determinada la probabilidad de apertura del canal SV en condiciones cercanas a las fisiológicas. A. Probabilidad de apertura del canal en parches aislados. Los puntos son el promedio de 2+ por lo menos 3 registros en parches individuales. Ya que en condiciones de 0.1mM Ca citosólico las corrientes evocadas constituían una fracción del total de canales, presentes en los parches, la normalización fue realizada respecto a la corriente en condiciones de la máxima activación obtenida (20 mM Ca2+, 1.5 mM Mg2+). B. Probabilidad de apertura del canal en parches en configuración attached. Los puntos son el promedio de 6-11 parches obtenidos en 2-3 vacuolas diferentes. El potencial a través de la membrana vacuolar fue corregido por el valor del potencial del tonoplasto: +15 mV en 0.5 mM Mg2+ y +17 mV en 1.5 mM Mg2+. Las corrientes fueron normalizadas a la corriente máxima. Como referencia se emplearon las fracciones de las corrientes máximas normalizadas en condiciones de 20 mM Ca2+, 1.5 mM Mg2+ ( ) y 0.1 mM Ca2+, 0.5 mM Mg2+ ( ), obtenidas en los parches aislados.

4.3 Discusión. A diferencia de estudios anteriores, en los cuales el canal SV emergía como un canal versátil que responde a la aplicación de diferentes estímulos y reagentes, los datos de nuestro trabajo revelan un alto nivel de control de la actividad del canal SV por su entorno iónico, que se revela en una ‘buferización’ de la actividad del canal en rangos bastante estrechos, en los cuales la probabilidad de apertura del SV es relativamente insensible incluso al nivel de Ca2+ vacuolar en el rango micromolar-milimolar — uno de los factores propuestos como de mayor importancia para la determinación de la actividad del canal (Pottosin y col., 2004). Efectos del pH sobre la actividad del canal SV. El efecto del pH vacuolar sobre la probabilidad de apertura del canal SV fue estudiado en dos trabajos, en células de guarda de Vicia (Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y en vacuolas de Hordeum (Pottosin y col., 1997). En el primer caso fue mostrada una disminución de la probabilidad de apertura del canal con la acidificación del contenido vacuolar, aunque ésta disminución fue obtenida en presencia de 1 mM de Ca2+ y 5 mM de Mg2+ dentro de la vacuola. Pottosin y col. (1997, en Hordeum) señalaron que en presencia de concentraciones de Ca2+ en el rango 0.05-2 mM de Ca2+ dentro de la vacuola, la disminución del pH vacuolar no tiene efecto sobre la probabilidad de apertura del canal SV (a diferencia del desplazamiento del umbral de activación de –20 a +40 mV en la disminución del pH vacuolar de 7.5 a 5.5, en ausencia de Ca2+ vacuolar). En el presente estudio es mostrado que la disminución del pH vacuolar no tiene efecto sobre el potencial V1% en condiciones de nulo calcio vacuolar, lo que significa que el valor de pK para los grupos funcionales (sitios de unión con Ca2+, ver abajo) en el caso de vacuolas de raíz de betabel no varía para los estados cerrados y abierto del canal y, por lo tanto, la protonización no ocurre preferentemente en ninguno de los estados. En el rango de Ca2+ vacuolar de 0.05-1.0 mM en la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal aparece una meseta en la curva de calibración del potencial V1% (Fig.13B). Este fenómeno pudiera deberse a que en condiciones de pH vacuolar bajo disminuye la afinidad al Ca2+ de uno de los estados cerrados del canal, probablemente por la competencia entre dos cationes — H+ y Ca2+ (Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995; Pottosin y col., 1997). El cambio de pH de 7.5 a 5.5 en el lado vacuolar causó una

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disminución poco significativa de la corriente del canal unitario SV (Pottosin y col., 2004; presente estudio, Fig.12) al igual que en el trabajo de Schulz-Lessdorf y Hedrich (1995). Efectos del Na+ vacuolar sobre la actividad del canal SV Recientemente, Ivashikina y Hedrich (2005) en Arabidopsis mostraron que el aumento de la concentración del Na+ vacuolar causa el desplazamiento del umbral de activación del canal hacia potenciales más positivos, disminuyendo así la probabilidad de apertura del canal (ver p.1.2.2.2 para más detalles), lo que podría sirvir como mecanismo para la disminución de la liberación proveniente de la vacuola de excedentes tóxicos de Na+ al citoplasma durante el estrés salino. De manera similar, nuestros datos señalan que, en ausencia de Ca2+ en el lado vacuolar el Na+ causa un desplazamiento específico de la probabilidad de apertura del canal a potenciales más positivos (más significativo que el provocado por los cationes monovalentes en general, p.e. K+ [Fig.13A], o cationes monovalentes orgánicos [Pottosin et al., 2005]). Sin embargo, el estudio de los efectos conjuntos de Na+ vacuolar en presencia de Ca2+ vacuolar reveló, más que nada, una desensibilización de la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal SV al nivel de Ca2+ cercano al presente en la vacuola (Fig.14B). La naturaleza de este efecto específico del Na+ vacuolar se desconoce, pero pudiera tratarse de una competencia entre el Na+ y el Ca2+ vacuolares por un sitio de unión al canal. A pesar de la ‘ambigüedad’ de la modulación del canal SV por Na+ vacuolar, este efecto requiere un estudio más detallado, ya que en condiciones fisológicas potencialmente puede jugar un papel importante en la resistencia de las plantas al estrés salino. Efecto conjunto de los cationes fisiológicos más importantes para la regulación de la actividad del canal SV La actividad del canal SV en condiciones iónicas vacuolares cercanas a las fisiológicas no ha sido previamente estudiada. Como muestra la Fig.15, en estas condiciones la actividad del canal SV se encuentra rigurosamente mantenida en un estrecho rango, que, en términos de un desplazamiento de la dependencia de voltaje del canal, representa menos de 20 mV alrededor del rango de Ca2+ vacuolar estimado. Posiblemente, esta fuerte ‘buferización’ de la actividad del canal SV le permite desarrollar sus funciones en las diversas condiciones presentes en las vacuolas de distintos tejidos de las plantas, caracterizadas, al menos, por una gran diferencia en la concentración total de Ca2+ presente (ver.p1.1.2).

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Adicionalemente, para fines de nuestro estudio, este resultado significó la imposibilidad del uso del canal SV como reportero intrínseco de la actividad del Ca2+ dentro de las vacuolas líticas de betabel, como muestra la colocación del potencial V1% de los registros realizados en parches attached sobre la curva de calibración del canal SV. No obstante, existe la posibilidad de que el método propuesto para la medición del Ca2+ vacuolar pudiera ser aplicado a otros objetos de estudio, por ejemplo — vacuolas de células aleurónicas, que, a diferencia de las vacuolas líticas, presentan un pH lumenal neutro, y en las cuales se ha reportado la presencia de canal SV (Bethke y Jones, 1997). Modelación del entorno iónico del canal SV y estimación de la actividad del canal SV. La elevación fisiológica del Ca2+ citosólico es suficiente para evocar la liberación de Ca2+ inducida por Ca2+. La modelación de las concentraciones de los cationes fisiológicos más importantes que regulan la actividad del canal SV requirió la determinación previa de esas concentraciones, ya que a pesar de que son ampliamente especuladas en la bibliografía, existen contados estudios dedicados a la determinación de la actividad iónica en compartimientos específicos. Un ejemplo de ésto es la actividad de Ca2+ dentro de la vacuola, postulada como de rango milimolar, después de la medición realizada por Felle (1988) en vacuolas de dos especies de plantas. En nuestro estudio fue determinado que, al menos en las vacuolas de las raíces de betabel examinadas, la concentración de Ca2+ libre es menor en un orden de magnitud a lo establecido en la literatura (Tabla.15). Adicionalmente, utilizando la técnica de microelectrodos ionoselectivos fue determinada la concentración vacuolar de otro cation fisiológico abundante y pobremente estudiado — Mg2+, que, a diferencia del Ca2+, en nuestro objeto de estudio se encuentra en niveles milimolares (Tabla.14). Lamentablemente, la concentración citosólica de Mg2+ tampoco ha sido objeto de estudios detallados en células de plantas superiores, por lo que para la estimación de la actividad TABLA 15. Comparación de la actividad de Ca2+ dentro de la vacuola, reportada en diferentes objetos de estudio. Valor de [Ca2+]vac / mM 2.3 1.5 0.2

Objeto de estudio Riccia fluitans (rizoides) Zea mays (raíces) Beta vulgaris (raíces)

Referencia Felle, 1988 Presente estudio

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del canal SV en condiciones cercanas a las fisiológicas, fueron aplicadas concentraciones consideradas como abarcantes del rango de Mg2+ libre en el citoplasma de las células vegetales, estimado en base a estudios de la actividad de Mg2+ en células animales (Romani y Scarpa., 2000). Para establecer la relevancia de los cationes más importantes para la actividad del canal SV en condiciones fisiológicas, así como para determinar la actividad (el número de canales abiertos) en diferentes condiciones de Ca2+ (que modelan los estados “reposo” y “elevación de calcio” de la célula) y Mg2+, fue realizada una comparación de los registros en las configuraciones outside-out (modelando el entorno citosólico y vacuolar) y attached (empleando las soluciones citosólicas anteriores) (Fig. 20). A pesar de cierta diferencia, las curvas de probabilidad de apertura obtenidas en ambas configuraciones resultaron ser muy similares, al igual que los valores de la probabilidad de apertura del SV a potenciales fisiológicos (Fig. 20). Esto indica que en las células vivas la actividad de los canales SV, al menos en gran medida, es determinada por las concentraciones de los principales cationes inorgánicos presentes (K+, H+, Na+, Ca2+ y Mg2+ en el lado vacuolar, y Ca2+ y Mg2+ en el citosol). Como siguiente paso, para estimar la magnitud de la corriente de Ca2+ generada en condiciones fisiológicas de calcio citosólico elevado (20 μM Ca2+), así como para determinar si pueden los canales SV mediar la liberación de calcio inducida por calcio, es necesario realizar una comparación de los datos obtenidos con las diferentes técnicas (patch-clamp, MIFE), descritas en el presente trabajo. Para una vacuola típica de 50 μm de diámetro (con un área A = πd2 = 7,850 μm2) obtenemos una corriente por vacuola en condiciones de Ca2+ citosólico elevado igual a: I ( pA/vacuola ) = inpA = 0.1 ⋅ 8 ⋅ 0.0002 ⋅ 7,850 = 1.26 , donde i (pA/canal) — corriente del canal unitario (alrededor de 100 fA; Gradmann et al., 1997; Allen et al., 1998); n (canal/μm-2) — densidad de canales, alrededor de 8 canales por μm2 (Igor Pottosin, datos no publicados); p (sin unidad) — probabilidad de apertura del canal a potenciales fisiológicos (0,0002; valor obtenido de la curva de probabilidad de apertura, Fig. 20); A (μm2/vacuola) — área de la membrana vacuolar. Este valor corresponde, aproximadamente, a unos 13 canales SV abiertos en condiciones de Ca2+ citosólico elevado, a potenciales fisiológicos (Fig. 21). Es interesante notar, que este número de canales abiertos se presenta en un total de

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Total de canales por vacuola

NPo / NPomax 1

10,000 0.01 100 0.0001 1 1e-006 0.01 1e-008

50

150

100

200

V / mV 20mM Ca2+, 1.5 Mg2+ 0.1mM Ca , 0.5 Mg 2+

2+

Fig.21 Estimación de la actividad del canal SV en condiciones fisiológicas. El número aproximado de canales fue estimado en base a la densidad de 8 canales / mm (Igor Pottosin, datos no publicados) para una vacuola típica de 50 mm de diámetro. En condiciones de elevación de Ca2+ citosólico el número estimado de canales activos por vacuola es aproximadamente 13 (corresponde a la fracción de 0,0002 canales activos por vacuola en estas condiciones, ver Fig. 20), mientras que en condiciones de reposo en estado abierto se encuentran menos de un canal por vacuola. El número de copias del SV calculado sobrepasa los 10,000 (~62,000) por vacuola. Para más claridad, son mostrados únicamante los registros obtenidos en las concentraciones abarcantes de Ca2+ y Mg2+. 2

canales SV calculado de más de 60,000 por vacuola, lo que constituye un valor mayor al número de canales, tomado como referencia en la literatura (Pottosin y Schönknecht, 2007).

Un cálculo similar para los datos, obtenidos con la técnica MIFE, nos devuelve: I ( pA/vacuola ) = zFJA = 2 ⋅ 9.65 ⋅10 4 ⋅ 3 ⋅10−9 ⋅ 7.85 ⋅10−9 = 4.55 , donde z (sin unidad) — carga eléctrica del ion analizado; +2 para Ca2+; F (Coul/mol) — constante de Faraday (carga eléctrica de un mol de sustancia; 9,65·104 Coul/mol); J (mol m-2 s-1) — flujo de iones; en nuestro caso — flujo de Ca2+, registrado con la técnica MIFE; A (m2/vacuola) — área de la membrana vacuolar. Las corrientes de Ca2+ calculadas, salientes de la vacuola, son del mismo orden de magnitud; la diferencia entre los dos valores determinados podría ser causada por: i) la contribución de canales hasta ahora desconocidos con permeabilidad para Ca2+ (diferentes del SV); 2) la sobreestimación del flujo de Ca2+ por la técnica MIFE; 3) posibles errores de extrapolación al rango de bajas probabilidades de apertura y/o 4) por la subestimación de la fracción de la corriente de Ca2+ en condiciones fisiológicas. Sin embargo, los valores estimados son del rango de pA, y por lo tanto pueden causar una significante y rápida elevación del Ca2+ en el citoplasma (Pottosin y Schönknecht, 2007). En otras palabras, la elevación del Ca2+ citosólico es suficiente para provocar la liberación de calcio inducida por calcio, mediada por los canales SV de la membrana vacuolar. Por otra parte, en condiciones fisiológicas deben existir factores-reguladores adicionales que controlan esta activación, ya que como es mostrado en el p.1.1.4, Tabla 1, no todos los estreses que causan la elevación del Ca2+ citosólico provocan la liberación de Ca2+ desde la vacuola. El estudio de las condiciones en las que se origina la liberación de Ca2+ desde la vacuola durante esos estreses (frío, sequía) pudiera, tal vez, revelar el mecanismo regulador adicional que le permite al SV u otro canal permeable a Ca2+, hasta ahora desconocido, participar en la liberación de Ca2+ inducida por Ca2+.

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5. Estudios de canales permeables a Ca2+ del RE.

5.1 Introducción. En general, la técnica de deshidratación-rehidratación mostró ser adecuada para la formación de liposomas gigantes, aunque se tuvieron ciertos problemas de carácter técnico respecto a la optimización desde la cantidad de membrana a utilizar, hasta los tiempos y las condiciones requeridas para la obtención de liposomas adecuadas para la realización de registros con la técnica de patch clamp. Con visualmente ‘buenas’ preparaciones fue logrado obtener sellos de alta resistencia (2-7 GOhm) con un alto rendimiento (más del 50%). En éstas pudieron ser obtenidas las cuatro configuraciones básicas para la realización de registros con la técnica patch clamp: attached, inside-out, un análogo del whole-cell — ‘liposoma entera’, y outside-out. Las configuraciones attached e inside-out presentaron resultados idénticos (Fig.22), mientras que la configuración ‘liposoma entera’ mostró en la mayoría de los casos un alto nivel de fuga inespecífica. Probablemente esto se debe a que las liposomas no representan vesículas completamente cerradas y, por lo tanto, carecen de potencial de membrana y las concentraciones iónicas en su interior son iguales a las del baño. Entonces, las configuraciones recomendadas para el estudio con la técnica de patch clamp son las de parche aislado — inside-out y outside-out. La utilización de estas dos orientaciones inversas de la membrana podría ayudar a investigar los efectos de moduladores desde ambos lados de la membrana del RE, así como verificar la orientación preferente de la membrana de los liposomas gigantes.

5.2 Resultados. Finalmente, se pudo caracterizar un canal catiónico del retículo endoplásmico no reportado previamente. Algunas de las carácterísticas de este novedoso canal son mencionadas a continuación.

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A

B

Fig.22 Registros de un canal catiónico del RE, previamente no reportado. Los registros de corrientes en liposomas de membranas de retículo endoplásmico revelaron la presencia de un canal catiónico (PCl / PK < 0.03) no selectivo de una conductancia alrededor de 165 pS. A. Registros de corrientes de canales unitarios del RE, evocadas por una rampa de voltaje de +150 a + -150 mV de 15 ms de duración. El potencial de reversión para K es señalado. Las condiciones de los experimentos son señaladas en cada caso. B. Fragmento de la relación corriente-voltaje del canal unitario. Se puede observar que el potencial de inversión del canal coincide con el potencial de equilibrio + para K , por lo que se concluye que el canal no presenta selectividad entre K+ y Na+.

5.2.1 Selectividad. La selectividad del canal fue estudiada aplicando la técnica de rampas para determinar el potencial de inversión de la corriente del canal. Aplicando pulsos de 15 ms de duración de +150 a -150 mV fueron registradas las corrientes de canales unitarios en gradientes de 10K/100K o 10K/100Na (pipeta-baño, respectivamente). Esto permitió demostrar la selectividad para cationes (PCl/PK < 0.03) del nuevo descubierto canal y la ausencia de selectividad específica para K+ o Na+ (Fig.22). Estudios preliminares de la permeabilidad a Ca2+ fueron realizados mediante la aplicación de un gradiente bi-iónico (150Ca/100K, respectivamente para la micropipeta y el baño) y la obtención de la curva corriente-voltaje del canal unitario. El potencial de inversión obtenido en estas condiciones es de cerca de 30 mV (Fig. 23) y corresponde a una permeabilidad relativa PCa / PK ≈ 3.5. La conductancia del canal para Ca2+ y K+, determinada en estas condiciones, fue de 157 pS para ambos.

5.2.2 Modulación por voltaje. La modulación del nuevo descubierto canal por voltaje fue estudiada mediante la aplicación de pulsos rectangulares de –140 hasta +140 con un paso de 40 mV desde un potencial de mantenimiento de –60 mV. En estas condiciones fue determinada la activación del canal estudiado, aparentemente — de manera transitoria (Fig.24). Interesante, que el cambio del signo del potencial de mantenimiento — a +60 mV — disminuía el tiempo de inactivación del canal en comparación con la inactivación presentada a –60 mV (Fig.24). Igualmente es interesante la activación espontánea del canal en la aplicación de rampas de voltaje de +150 a –150. Al contraste, el cambio del signo del potencial de mantenimiento (de –60 a +60, como en el caso anterior) y la aplicación de rampas de voltaje invertidas (–150 / +150 mV) resultó en una actividad reducida durante la rampa.

5.3 Discusión. Como es mostrado en este trabajo, la combinación de las técnicas de patch-clamp y de lipososmas gigantes permite realizar de una manera efectiva el estudio de canales iónicos localizados en la membrana del retículo endoplásmico. A continuación son mencionados algunas de las limitantes y ventajas del método desarrollado. 77

I / pA

10

100 KCl

0

150 CaCl2

-10

Er = 30 mV

-20 150

-100

-50

0

50

100

V / mV

2+

Fig.23 Datos preliminares de permeabilidad para Ca del canal descubierto en el RE. 2+

La permeabilidad a Ca fue estudiada en condiciones bi-ionicas 150Ca2+/100K+ en protocolos de rampa (+150 / -150 mV). En estas condiciones la corriente del canal presenta su inversión al potencial de +30 mV, correspondiente a una permeabilidad relativa PCa/PK ~3.5 y una conductancia de 157 pS igual para Ca2+ y K+.

Fig.24 Modulación de la actividad del canal del RE por voltaje. Los registros fueron obtenidos en parches aislados mediante la aplicación de pulsos de voltaje de +140 a -140 mV, con un paso de 40 mV. Aparentemente, el canal se activa de manera transiente. La inactivación resulta más prolongada a potenciales de mantenimiento de -60 mV, en comparación con +60 mV.

Las principales limitantes encontradas son las siguientes: • La técnica elaborada por nosotros requiere la purificación previa de la fracción membranal,

correspondiente al RE. Este procedimiento pudiera traer como consecuencias: la pérdida de proteínas solubles que pudieran participar en la regulación de los canales iónicos, cambios en la estructura de los canales u otras proteínas a ser estudiadas. No obstante, las mismas limitaciones las tiene el único método empleado actualmente para el estudio de las propiedades electrofisiológicas de los canales del ER — la técnica de incorporación de proteínas a bicapas lipídicas, que, sin embargo, ha permitido realizar el estudio de los canales-receptores de IP3 del RE de células animales (ver, p.e., Tu y col., 2005). • La orientación de los canales puede no coincidir con su orientación fisiológica, por lo que

existe cierta incertidumbre en el tipo de configuración en la que son realizados los registros con la técnica de patch-clamp. Las ventajas principales del método desarrollado que permiten posicionarlo como el más apropiado hasta el momento para el estudio de canales iónicos de las membranas del retículo endoplásmico, son: • La rapidez relativa de la técnica. Debido a que las proteínas del retículo endoplásmico no

pasan por el proceso de purificación, el tiempo de preparación de la muestra se reduce considerablemente en comparación con el método convencional. • El entorno lipídico de los canales queda intacto, lo que permite determinar las

características del canal en un entorno más cercano al natural, sin lípidos adicionales. Esto permite realizar los registros electrofisiológicos en condiciones lo más cercanas posible a las que se dan en el retículo endoplásmico intacto. Los registros presentados más arriba muestran la presencia en liposomas gigantes de retículo endoplásmico de un canal catiónico que no conduce aniones (Cl–) y posee una alta permeabilidad para K+, Na+ y Ca2+, similar al canal formado por el receptor de ryanodina en el retículo endoplásmico de células animales. Sin embargo hay diferencias cuantitativas entre estos dos canales, principalmente, en valores de conductancia para K+ y la sensibilidad al Ca2+. La dependencia de voltaje del canal estudiado en betabel (Fig.24) es diferente a la reportada para los canales permeables a Ca2+ del retículo endoplásmico de Bryonia y Lepidium: BCC1 y LCC1 son activados únicamente por potenciales positivos; nuestro canal no presenta este tipo 80

rectificación (Klüsener y col., 1995; 1997; 1999). Por lo tanto, se puede afirmar que fue registrado un canal novedoso, cuyo mecanismo de funcionamiento y sensibilidad a moduladores quedan por ser estudiados. Al igual que en los trabajos de Klüsener y col. (1995) no fue detectada ninguna actividad de canales iónicos en la agregación de IP3 (2 μM). Estos resultados pudieran sugerir que el receptor de IP3 no forma parte de la estructura del canal permeable a Ca2+, sino que pudiera estar acoplado a éste último, lavándose durante el proceso de purificación de la fracción membranal del retículo endoplásmico. Otra opción pudiera ser que los canales-receptores de IP3 no se encuentran presentes (al menos, en cantidades determinables con las técnicas electrofisiológicas actuales) en los tejidos de la raíz napiforme de betabel, ya que se ha demostrado que en preparaciones vesiculares el IP3 es capaz de evocar la liberación del Ca2+ almacenado (aunque en otra fracción membranal y en otra especie de planta; Schumaker y Sze, 1987).

81

6. Conclusiones.

1. El nivel de Ca2+ libre en vacuolas de raíz de betabel (Beta vulgaris) es de alrededor de 0.2 mM — un valor 10 veces menor, que el establecido en la literatura para las vacuolas de células vegetales. 2. En condiciones que modelan el entorno iónico fisiológico vacuolar del canal SV, éste presenta una sensibilidad disminuida a la variacion de Ca2+ vacuolar en el rango fisiológico, por lo que no puede ser utilizado como reportero intrínseco para la medición de la actividad del Ca2+ en vacuolas de raíz de betabel. En estas condiciones (caracterizadas, básicamente, por los niveles vacuolares de cationes fisiológicos abundantes — K+, Na+, Ca2+, Mg2+ y H+), la actividad del canal SV se encuentra mantenida (‘buferizada’) en un rango estrecho. 3. La comparación de los registros obtenidos (i) mediante la modelación del entorno iónico fisiológico vacuolar y citoplasmático del canal SV en parches aislados, y (ii) mediante la modelación del entorno iónico citoplasmático del canal SV en parches attached, revela la semejanza de la dependencia de la probabilidad de apertura del canal SV en ambos casos. La elevación del Ca2+ citosólico en el rango 0.1-20 μM no afecta a la dependencia de voltaje del canal; más bien incrementa el número de canales “activables” por voltaje. 4. Datos obtenidos con las técnicas de MIFE y patch-clamp sugieren que en condiciones de Ca2+ citosólico elevado (varios μM) la actividad de los canales SV permite una liberación de Ca2+ de alrededor de picoamperios por vacuola; esta corriente es suficiente para mantener la liberación de calcio inducida por calcio (LCIC). 5. El uso combinado de las técnicas de liposomas gigantes y de patch clamp (por primera vez— en células vegetales) permitió registrar canales iónicos en membranas del retículo 82

endoplásmico. Empleando esta combinación, fue descubierto en membranas de retículo endoplásmico un canal catiónico permeable a Ca2+ no descrito previamente. El canal fue caracterizado: determinada su selectividad y modulación por voltaje, pero todavía requiere estudios adicionales. 6. Lamentablemente, en experimentos preliminares para la búsqueda de canales activados por ligandos, al igual que en trabajos previos, no fue detectada actividad alguna evocada en la aplicación del ligando intracelular IP3. Sin embargo, la relativa sencillez de la técnica de liposomas gigantes pudiera permitir en un futuro la determinación en membranas del RE de canales activados por ligandos.

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Agradecimientos

A Dios, por ayudarme a concluir esta tesis. Se agradece a la Q.B.B Ligia Brito Argáez, técnico-académico del Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY), Mérida, por su invaluable comprensión y apoyo en la obtención de las membranas de RE y la obtención de las liposomas gigantes. Se agradece al Ph.D. Tim Wherret, de la Universidad de Tasmania, Hobart, por la realización de las mediciones con microelectrodos ionoselectivos y la técnica MIFE, y por compartir los resultados obtenidos para los fines del presente trabajo. La realización de esta tesis fue posible gracias al apoyo financiero otorgado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) para la realización del proyecto 38181N a cargo del Dr. Igor Pottosin del Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Colima. Personalmente, le agradezco profundamente al Dr. Igor Pottosin su dedicación al trabajo y su apoyo a mi establecimiento en Colima para la realización de esta tesis. A él, mis más sinceras gracias por mantener firmes mis pies en la tierra. A todas las otras personas, que aunque no las menciono aquí merecen mis agradecimientos de todo corazón, tan solo por existir.

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Bibliografía

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Appéndice

TABLA I. Obtención de bajos valores de calcio libre para registros en configuración attached.

[Ca2+] deseada / μM

CaCl2 / μM

EGTA / mM (Kd 3.38e-05)

HEDTA / mM (Kd 5.53e-06)

[Ca2+] libre / μM