UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Programa de Pós-Graduação em Patologia

Bruno Costa Silva

EFEITO DO INIBIDOR DA 5-LIPOXIGENASE (ZILEUTON) NA ISQUEMIA E REPERFUSÃO CEREBRAL MURINA

Belo Horizonte 2014

Bruno Costa Silva

EFEITO DO INIBIDOR DA 5-LIPOXIGENASE (ZILEUTON) NA ISQUEMIA E REPERFUSÃO CEREBRAL MURINA

Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Geral da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito para a obtenção do título de Mestre em Patologia Investigativa

Orientadora: Dra. Milene Alvarenga Rachid Co-orientador: Dr. Antônio Lúcio Teixeira Jr.

Belo Horizonte 2014

Bruno Costa Silva

EFEITO DO INIBIDOR DA 5-LIPOXIGENASE (ZILEUTON) NA ISQUEMIA E REPERFUSÃO CEREBRAL MURINA

Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Geral da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito para a obtenção do título de Mestre em Patologia Investigativa

Orientadora: Dra. Milene Alvarenga Rachid Co-orientador: Dr. Antônio Lúcio Teixeira Jr.

___________________________________________ Dr. Anilton Cesar Vasconcelos (UFMG)

____________________________________________ Dra. Eliane Gonçalves de Melo (UFMG)

___________________________________________ Dra. Lucíola da Silva Barcelos (Orientador - UFMG)

___________________________________________ Dra. Milene Alvarenga Rachid (Orientador - UFMG)

____________________________________________ Dr. Antônio Lúcio Teixeira Jr. (Co-orientador - UFMG)

Belo Horizonte, 27 de Fevereiro de 2014.

DEDICATÓRIA

Dedico...

...a todos esses por estarem sempre ao meu lado. Honra a quem merece honra.

“Agora, pois, permanecem a fé, a esperança, o amor, estes três; mas o maior destes é o amor.”

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao Eterno

‫יהוה‬,

fonte de toda vida e de toda sabedoria

inesgotável, que desde a eternidade passada, quando ainda não existia a dimensão espaço-tempo, antes de Bara (‫ )א ָָּּרב‬a energia (E=mc2), antes mesmo que eu tivesse forma, planejou esse momento. Escreveu no Livro da Vida e determinou que minha vitória já estava pronta. Me concedeu o privilégio de iniciar e concluir este Mestrado, capacitando-me, protegendo-me, sustentando-me ao longo desse caminho. As Suas promessas são para aqueles que O amam. “Saberás, pois, que o Senhor teu D-us é D-us, o D-us fiel que guarda o concerto e a misericórdia até mil gerações aos que O amam e guardam seus mandamentos.” (Devarim 7:9). Que o Eterno traga a paz a todos!

Baruch Hashem! “O segredo do Eterno é para aqueles que O temem aos quais Ele dará a conhecer a sua aliança” (Tehilim 25:14)

Aos meus pais (Romeu e Ilma), fontes inesgotáveis de inspiração. De vocês recebi a vida, já por isso seria infinitamente grato, mas se não bastasse encheram minha existência de amor e com o maior presente que poderiam me oferecer: o conhecimento sobre o Eterno. Vocês são exemplos de vida, de honestidade, de caráter, de sabedoria, de força de vontade, carinho, amor, compreensão. Minha eterna gratidão pela formação moral, intelectual e espiritual. Nunca pouparam esforços para o meu engrandecimento, sempre acreditaram em mim, passaram-me confiança e, com muita convicção, fizeramme seguir em frente, até nos momentos em que eu mesmo não acreditava ser capaz. Muito obrigado por estarem sempre ao meu lado, renunciando, em muitos momentos, aos próprios sonhos para que eu pudesse realizar os meus. Eu amo muito vocês!

À Marcela Fantoni, minha melhor amiga, companheira e futura esposa, que apoiou e acreditou na minha decisão a dois anos atrás. Sonhou juntamente comigo a possibilidade de realização desse projeto de vida. Mostrou-me de forma simples o que é o verdadeiro amor. Por estar sempre ao meu lado nos momentos mais difíceis da minha vida. Você me ensinou que a vida pode ser vivida com leveza e tranquilidade. Que viver o hoje é mais importante que esperar pelo amanhã. Com você aprendi o verdadeiro significado da palavra cumplicidade. Hoje é apenas parte da realização do nosso sonho! Como diria Sheldon Cooper “não é uma surpresa, mas o inevitável!”. Esta conquista é nossa! Te amo para todo o sempre! Aos meus familiares, pelo amor, carinho, companheirismo, apoio, pela confiança e compreensão. Obrigado por entenderem minha ausência, participarem dos meus sonhos e me apoiarem para realizá-los.

À Larissa Fonseca, pela atenção e auxílio no início deste trabalho. Sua ajuda foi essencial para a continuidade e sucesso desta pesquisa. À Aline Miranda, pela amizade e atenção, me acolhendo em momentos difíceis. Apesar do nosso breve convívio aprendi a admirá-la pela sua força e dedicação. Desejo a você todo sucesso! À Ana Letícia (Aninha), pela atenção, carinho e por me ajudar em diversos momento difíceis nesses dois anos. À todos do Laboratório de Farmacologia: Prof. Dr. Antônio Carlos e suas alunas (Bel, Soraia e Paula) por todo apoio e sugestões, também por cederem espaço e conforto para realização desse trabalho. À “turminha” do Laboratório de Bioquímica: Cynthia, Bruno Cabral, Fátima, Ronan e Poliana, por todo apoio, carinho, atenção, vocês foram muito importantes para o meu crescimento como pesquisador. Ao amigo Vitor Barbosa, por esses dois anos de feliz convivência. Por estar sempre disposto a ajudar nos vários momentos de dificuldade. Por sempre estar pronto a me atender, mesmo nas horas mais inusitadas. Admiro sua dedicação e trabalho.

À Carolina Souza (Carol), pela paciência e generosidade com que dispôs do seu tempo e de sua energia para ensinar-me a usar o programa Image J. Ao Gustavo Rezende, por toda dedicação e atenção na realização da Ressonância Magnética. Obrigado também por compartilhar seu conhecimento. Às amigas do Laboratório de Apoptose: Núbia, Tereza, Camila e Elô, meus agradecimentos a todas vocês por terem me acolhido no laboratório. De fato me senti um “apoptótico”. À Tatiane Carvalho

(Tati), pela

sincera

amizade e

prazerosa

convivência. Pelo tempo que passamos juntos compartilhando experiências. Você sabe que admiro muito a sua força e dedicação, vindo de tão longe para brilhar em terras mineiras. Conte sempre comigo! À Mirna, pela extrema dedicação em todos os momentos necessários, pelas horas de conversa, pelo carinho e principalmente pela amizade que construímos. Já sinto saudades. As “mais do que somente técnicas”: Olinda, Vânia e Jaqueline, que não medem esforços para ajudar, sempre atenciosas e dedicadas. Sem vocês esse trabalho não seria possível. Meu muito obrigado e respeito.

À Regina e Marília, por toda atenção e carinho.

Às alunas de iniciação científica: Bárbara, Larissa e Sabrina, vocês chegaram em um momento importante desse trabalho. Muito obrigado por todo apoio. Espero ter contribuído para o crescimento científico e profissional de vocês. Aqui não é o fim, estaremos em breve juntos novamente.

À Dra. Flávia Rodrigues, minha eterna gratidão. Sua inteligência e caráter farão de você uma mulher de sucesso. Você é exemplo de trabalho e disciplina. Obrigado pela amizade, pelos conselhos e pela ajuda constante nos momentos em que precisei. Não conseguiria sem você.

Ao raríssimo decantadíssimo filtradíssimo Amigo: Louis Marlon, o importante não é ter ou fazer amigo – é ser Amigo. Pela eterna paciência, pela eterna parceria e colaboração nos momentos difíceis e complicados. Que também dedicou parte do seu tempo para confeccionar parte das ilustrações deste trabalho À todos os amigos, mesmo aqueles que não participaram diretamente desse trabalho, que me ajudaram a ter forças para seguir em frente, a não desistir quando as coisas pareciam não dar certo. “Não vale a pena viver quando não se tem um bom amigo” - Demócrito.

Ao prof. Dr. Marcelo Vidigal Caliari, pelo carinho e confiança no meu trabalho. Por acreditar no meu potencial como professor. A você, meu respeito e reconhecimento. À Prof. Dra. Luciana Moro, pelo feliz convívio, mulher batalhadora, dedicada, exemplo de pesquisadora, sempre atenta às minhas necessidades, pelas horas de conversa e conselhos. Sua garra e seu entusiasmo pela pesquisa são contagiantes e dignos de serem seguidos. Obrigado, professora, pelas suas dicas e pelos seus conselhos. A você, meu respeito e reconhecimento.

À Prof. Dra. Tatiane Alves da Paixão, pelas sugestões na fase inicial desse trabalho, mas principalmente por compartilhar de seu conhecimento durante esses dois anos. Admiro muito a sua dedicação e conhecimento. À Patrícia Parreiras, pela valiosa colaboração, cedendo os animais para realização desse trabalho. À Dra. Lucíola da Silva Barcelos, pelas maravilhosas imagens do Laser Doppler. Obrigado, professora, pelas suas dicas. À Dra. Fabiana Simão Machado, por fornecer o Zileuton e colaborar com valiosas sugestões. Aos Profs. que colaboraram e contribuíram de forma brilhante com esse trabalho: Dr. Mauro Martins Teixeira, Dr. Helton J. Reis, Dr. Márcio Flávio Dutra

Moraes e Dra. Rosa M. Arantes, por disponibilizarem a infraestrutura de seus laboratórios para o desenvolvimento desse trabalho. Aos Professores do Curso de Pós-Graduação em Patologia, por terem transmitido com muita dignidade seus conhecimentos, os quais adquiriram com muito esforço e dedicação. Ao Prof. Dr. Anílton Cesar Vasconselos, pelo estímulo e incentivo, pelo grande ser humano e pesquisador que sempre contribui para o avanço e crescimento dos que estão a sua volta. Obrigado, por sua amizade e carinho e também por aceitar minha solicitação, fazendo parte da banca examinadora. Obrigado por me acolher em seu laboratório. Surpresa agradável descobrir que temos muito mais em comum do que poderíamos imaginar. À Profa. Dra. Eliane Gonçalves de Melo, pela atenção e por prontamente participar da minha banca de mestrado. Ao meu co-orientador Prof. Dr. Antônio Lúcio, Teixeira exemplo de pesquisador. Obrigado pelas sugestões e apoio, mas acima de tudo por auxiliar no meu crescimento como pesquisador. Por último, mas não menor que os outros, a minha Orientadora Dra. Milene Rachid, pelo exemplo de competência, paciência, carinho, gentileza, conhecimento e determinação e pela forma como me acolheu e manteve sua amizade e fidelidade ao longo desses 9 anos de convivência. Sua dedicação, convivência, amizade, além de apoio e incentivo constante trouxeram influências marcantes em minha conduta científica, profissional e pessoal. Sou eternamente grato por me ensinar com esse trabalho a importância da paciência, determinação, da superação das dificuldades surgidas, da beleza e glória ao final de todo este processo, e a descoberta do meu potencial profissional e pessoal. Poucas pessoas sabem como ela, ser enérgica quando é preciso, mas também meiga e gentil quando foi necessário, poucas, raríssimas, dencantadíssimas, filtradíssimas pessoas têm esse dom! Parte da minha paixão pela patologia devo a ela, e muito mais que a patologia, ensinoume sua paixão e dedicação pela docência e pela ciência, o que transformou minha vida. Obrigado por permitir o convívio com sua família. Tenho uma grande gratidão para com Lucas e Giovanna, me perdoem por muitas vezes

tomar tempo dessa grande mulher, que também é mãe e esposa. Tive a honra de ser seu aluno na graduação. E agora expresso meu orgulho, agradecimento e minha felicidade por ter sido seu orientado. Nada em nossa vida acontece por acaso, tudo o que aprendemos juntos, a amizade, o companheirismo que construímos tem um sentido próprio. Após todos esses anos de alegrias e tristezas comuns, é impossível que esses anos não vivam para sempre em nossas lembranças. Sejamos nobres o bastante para esquecer as mágoas, se é que existiram algum dia! Hoje não é o fim, nem adeus, mas um até breve. Estaremos sempre juntos! Conte sempre comigo. Obrigado por ser Professora, Orientadora, mas acima de tudo Amiga!!! Milene... “Mestre é aquele que caminha com o tempo, propondo paz, fazendo comunhão, despertando sabedoria. Mestre é aquele que estende a mão, inicia o diálogo e encaminha para a aventura da vida. Não é aquele que ensina fórmulas, regras, raciocínios, mas o que questiona e desperta para a realidade. Não é aquele que dá o seu saber, mas aquele que faz germinar o saber do discípulo. Eu serei sempre seu discípulo na escola da vida.” (N. Maccari)

Ao CNPq, por ter colaborado financeiramente durante todo o desenvolvimento da pesquisa. E a todos que ajudaram, de forma direta ou indiretamente, na finalização desse trabalho. “Agradecer é admitir que houve um momento em que se precisou de alguém, é reconhecer que o homem jamais poderá lograr para si o dom de ser auto-suficiente. Ninguém e nada cresce sozinho, é sempre preciso um olhar de apoio, uma palavra de incentivo, um gesto de compreensão, uma atitude de amor.” (Autor desconhecido)

RESUMO

O Acidente Vascular Encefálico (AVE) é uma das causas mais frequentes de morte e incapacidade em todo o mundo acarretando um grande impacto clínico e sócio-econômico. Embora a fisiopatologia da isquemia e reperfusão cerebral seja complexa, o processo inflamatório tem um papel importante na patogênese, contribuindo para a expansão da lesão cerebral. A 5-LOX é uma enzima chave na biossíntese de leucotrienos e está implicada em doenças do sistema nervoso central (SNC), como a doença de Alzheimer e AVE isquêmico agudo. Zileuton, um inibidor seletivo da 5-LOX, possui propriedades antiinflamatórias e exerce efeito inibidor sobre as doenças inflamatórias. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do Zileuton nas alterações patológicas e nos parâmetros inflamatórios presentes no SNC de camundongos submetidos à isquemia e reperfusão (I/R) global transitória. Sugere-se que a inibição da 5-LOX possa promover neuroproteção, minimizando os efeitos deletérios encontrados na I/R cerebral. A interrupção do fluxo sanguíneo para o encéfalo foi confirmada utilizando-se Imagem de perfusão pelo Laser Doppler. A avaliação histopatológica e TTC (Triphenyltetrazoliun chloride) revelaram lesões principalmente no córtex cerebral e hipocampo. Áreas de necrose circundadas por neurônios isquêmicos foram encontradas nos animais do grupo I/R. O grupo I/R + Zileuton apresentou pequenos focos necróticos. O grupo I/R também apresentou intensa destruição neuronal no hipocampo, enquanto no grupo I/R + Zileuton demonstrou alguns neurônios hipercromáticos e condensados na mesma região. A localização dessas lesões foram confirmadas pela Ressonância Magnética. O grupo I/R + Zileuton apresentou sinais clínicos menos intensos e uma maior porcentagem de sobrevivência

em

relação

ao

grupo

I/R.

Além

disso,

através

do

ensaio

imunoenzimático (ELISA) foi detectado aumento dos mediadores pró-inflamatórios (TNF-, IFN-, IL-1, IL-6, CXCL1, CCL5 e CCL3) no grupo I/R, enquanto no grupo I/R + Zileuton esses mediadores apresentaram-se reduzidos. A concentração do mediador anti-inflamatório IL-10 mostrou-se aumentado no grupo I/R + Zileuton, comparado com o grupo I/R. Em conclusão, o modelo de I/R global transitória em camundongos foi capaz de induzir lesões isquêmicas e inflamatórias no encéfalo 24 horas pós isquemia. Zileuton, na dose de 30mg/Kg exerceu efeito protetor na I/R global, diminuindo a área de isquemia, bem como o processo inflamatório local. Palavras chaves: Encéfalo, Zileuton, Isquemia e Reperfusão, Camundongos, 5Lipoxigenase.

ABSTRACT

Stroke is one of the most frequent causes of death and disability worldwide causing a major clinical and socioeconomic impact. Although the pathophysiology of brain ischemia and reperfusion is complex, the inflammatory process plays an important role in pathogenesis, contributing to the expansion of brain injury. The 5-LOX is a key enzyme in the biosynthesis of the leukotrienes and has been implicated and in the central nervous system (CNS) disorders such as Alzheimer's disease and acute ischemic stroke. Zileuton, a selective 5-LOX inhibitor, has antiinflammatory properties and exerts an inhibitory effect on inflammatory diseases. The objective of this study was to evaluate the effect of zileuton on pathological changes and inflammatory parameters in the CNS of mice submitted to ischemia and reperfusion (I/R) global transient. It is suggested that inhibition of 5- LOX can promote neuroprotection while minimizing the deleterious effects found during I/R brain. The interruption of blood flow to the brain was confirmed using Laser Doppler Perfusion Imaging. Histopathology and TTC (Triphenyltetrazoliun chloride) analysis revealed brain lesions, mainly in the cerebral cortex and hippocampus. Areas of necrosis surrounded by ischemic neurons were found in the animals of I/R with smaller necrotic focus detected in group I/R + Zileuton group. The I/R group also had severe neuronal damage in the hippocampus, while in group I/R + Zileuton showed some condensed and hyperchromatic neurons in the same region. The location of these lesions were confirmed by MRI. Group I/R + Zileuton showed less intense clinical signs and a higher percentage of survival compared to the I/R group. Furthermore, by enzyme immunoassay (ELISA) increased pro-inflammatory mediators (TNF-, IFN-, IL-1, IL-6, CXCL1, CCL3 and CCL5) was detected in the I/R group, whereas in I/R + Zileuton group presented reduction of these mediators. The concentration of the antiinflammatory mediator IL-10 was increased in I/R + zileuton, compared with the I/R group. In conclusion, the model of transient global I/R in mice was able to induce ischemic and inflammatory lesions in the brain 24 hours after ischemia. Zileuton, at a dose of 30mg/Kg had a protective effect on I/R, decreasing the area of ischemia as well as the local inflammatory process.

Keywords: Brain, Zileuton, Ischemia and Reperfusion, Mice, 5-Lipoxygenase

LISTA DE FIGURAS

 Figura 1- Esquema mostrando as artérias cerebrais e Polígono de Willis........................................................................................................27  Figura 2- Quadro apresentando os modelos animais de isquemia cerebral...................................................................................................28  Figura 3- Sequência de eventos relacionados a I/R cerebral.................31  Figura 4- Mecanismos envolvidos no processo de excitotoxicidade......34  Figura 5- Cascata de sinalização das vias da apoptose após a I/R cerebral...................................................................................................38  Figura 6- Mecanismos de ativação das células da glia e leucócitos após a I/R.........................................................................................................40  Figura 7- Síntese e função dos eicosanóides na inflamação..................46  Figura 8- Resumo geral dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na I/R cerebral..............................................................................................47  Figura 9- Estrutura química do Zileuton..................................................50  Figura 10- Laser Doppler Flow……………………………………….……..65  Figura 11- Novel object recognition memory impairment without locomotor changes following brain ischemia and reperfusion…….........65  Figura 12- Representative TTC stained brain sections were shown where mice were subjected to 15 minutes of ischemia followed by 24 h reperfusion…….......................................................................................66  Figura 13- Histopathology analysis of brain sections of Sham and I/R mice……………………………………………………………………………66  Figura 14- Brain ischemia and reperfusion induces an increase in tissue levels of TNF-α, IL-1-β and CXCL1………………………........................67  Figura 15- Delineamento experimental (Pré-tratamento com Zileuton)..70  Figura 16- Protocolo experimental. Pré-tratamento dos animais com Zileuton...................................................................................................70  Figura 17- Diagrama da anatomia vascular cerebral em camundongos e oclusão das artérias carótidas comuns...................................................71  Figura 18- Sequência da mensuração da área de isquemia no programa Image J...................................................................................................74  Figura 19- Avaliação do fluxo sanguíneo cerebral grupo Sham e I/R.....76

 Figura 20- Avaliação do déficit neurológico e sobrevivência após a I/R............................................................................................................78  Figura 21- Imagem de MRI avaliando a área de infarto..........................79  Figura 22- Avaliação da densidade e volume da área de infarto pela MRI..........................................................................................................80  Figura 23- Efeito do Zileuton sobre a área de infarto cerebral após I/R............................................................................................................81  Figura 24- Efeito do Zileuton sobre o volume de infarto.........................81  Figura 25- Fotomicroscopia do cérebro de camundongos......................82  Figura 26- Avaliação de citocinas e quimiocinas (ELISA) no cérebro dos camundongos submetidos a I/R..............................................................83

LISTA DE SIGLAS

 5-LOX - 5-Lipoxigenase  2VO - two vessel occlusion  3VO - three vessel occlusion  4VO - four vessel occlusion  AA - Ácido araquidônico  ACCE - Artéria carótida comum esquerda  ACCD - Artéria carótida comum direita  AGL - Ácido graxo livre  AIF - Fator indutor de Apoptose  AMPA - Ácido amino-3-hidroxi-5-metil-isoxasole-propiônico  ADP- Adenosina difosfato  AMP- Adenosina monofosfato  ATP - Trifosfato d eadenosina  AVE - Acidente vascular encefálico  AVEi - Acidente vascular encefálico isquêmico  BHE - Barreira hematoencefálica  BLT- Receptor de LTB4  Ca+2 - Cálcio  CA - Cornu Ammonis area (região anatômica do Hipocampo)  CCR - Chemokine receptor (Receptor de quimiocina)  CD - Cluster of Differentiation (Grupamento de Diferenciação)  CEBIO - Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas  CETEA - Comitê de Ética em Experimentação Animal  C5 - Sistema complemento 5  CSF- Líquido cerebroespinhal  Cl- - Cloreto  Core - Núcleo  COX - Cicloxigenase

 CysLT - Cys-leucotrieno  CCL - Subfamília quimiocina CCL  CXCL - Subfamília quimiocina CXCL  DNA - Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico)  DVC - Doenças Cardiovasculares  ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio Imunoenzimático)  EPM - Erro padrão da média  EROs - Espécies reativas de oxigênio  FA - Fibrilação atrial  FADD - Fas-Associated protein with Death Domain (Domínio de morte)  FLAP - Five-lypoxigenase-activating protein  FSC- Fluxo sanguíneo cerebral  g - grama  GluR2 - Subunidade GluR2  GSH-Px - Glutationa peroxidase  GSH- Glutationa  H&E - Hematoxilina e Eosina  H2O2 - Peróxido de Hidrogênio  HO2• - Radical peroxila  ICAM-1 - Molécula de adesão intracelular  IL - Interleucina  IL-1RA - Antagonista endógeno do receptor da IL-1  IFN- - Interferon Gamma  I/R - Isquemia e reperfusão  K+ - Potássio  Kg - Quilograma  LOX - Lipoxigenase  LPS - Lipopolissacarídeo  LT - Leucotrieno  LTs - Leucotrienos

 CD4+ - Grupo de linfócitos diferenciados 4  CD8+ - Grupo de linfócitos diferenciados 8  M - Molar  MCAO - Middle cerebral artery occlusion (oclusão da artéria cerebral média)  mg - Miligrama  MHC - Major Histocompability Complex (Complexo Maior de Histocompatibilidade)  l - Microlitro  ml - Mililitro  MMP - Metaloproteinase  MPO - Mieloperoxidase  MRI - Ressonância Magnética  Na+ - Sódio  NaCl - Cloreto de sódio  NFkB - Factor Nuclear Kappa B – fator nuclear kappa B  NK - Natural Killer  NMDA - N-Metil-D-Aspartato  NO - Nitric Oxide (Óxido Nítrico)  iNOS - óxido nítrico sintetase induzida  nNOS - óxido nítrico sintetase constitutiva  OH• - Radical hidroxila  OMS - Organização Mundial de Saúde  ONOO- - Peroxinitrito  PAF - Fator ativador plaquetário  PARP - Poli (ADP-ribose) polimerase  PBS - Phosphate Buffered Saline (Solução de Fosfato Tamponada)  PG - Prostaglandina  PGs - Prostaglandinas  PLA2 - Fosfolipase A2 citosólica  RNAm - Ácido ribonucléico mensageiro

 SNC - Sistema Nervoso Central  SOD - Superóxido dismutase  TGF- - Transforming Growth Factor Beta (Fator de Crescimento Transformante Beta)  TNF- - Tumor Necrosis Factor alfa (Fator de Necrose Tumoral alfa)  TTC - Cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazol  TC - Tomografia computadorizada  TX - Tromboxano  UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais  XD - Xantina desidrogenase  XO - Xantina oxidase  WHO - World Health Organization

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................22 2. REVISÃO .....................................................................................................24 2.1 AVE Isquêmico ..........................................................................................24 2.2 Fatores de Risco ........................................................................................24 2.3 Epidemiologia e Importância do AVE ........................................................25 2.4 Suprimento sanguíneo para o Encéfalo ....................................................26 2.5 Modelos experimentais de isquemia e reperfusão ....................................27 2.6 Fisiopatologia do AVE isquêmico ..............................................................29 2.6.1 Mecanismos de dano neuronal induzidos pela I/R ............................29 2.6.2 Área central de isquemia e penumbra ...............................................31 2.6.3 Excitotoxicidade .................................................................................33 2.6.4 Estresse Oxidativo e Peroxidação Lipídica ...................................,....35 2.6.5 Apoptose ............................................................................................37 2.6.6 Processo inflamatório na I/R cerebral ................................................38 2.7 Papel das micróglias e dos astrócitos na I/R .............................................39 2.8 Mediadores Inflamatórios ...........................................................................41 2.9 Papel dos neutrófilos na I/R cerebral .........................................................43 2.10 Mediadores lipídicos na I/R cerebral ........................................................44 2.10.1 Leucotrienos ....................................................................................45 2.11 Papel da 5-Lipoxigenase na I/R cerebral .................................................48 2.12 Zileuton .....................................................................................................50 3. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ...............................................................52 4. CAPÍTULO 1 (Artigo)...................................................................................53 4.1 Long term memory deficit and brain inflammatory response to acute transient ischemic stroke and reperfusion in mice.............................................54 5. CAPÍTULO 2 ................................................................................................68 5.1 OBJETIVOS ...............................................................................................69 5.1.1 Objetivo geral ...................................................................................69

5.1.2 Objetivos específicos .......................................................................69 5.2 MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................69 5.2.1 Animais .................................................................................................69 5.2.2 Pré-tratamento com Zileuton ................................................................69 5.2.3 Indução da isquemia e reperfusão .......................................................71 5.2.4 Imagem de Perfusão por Laser Doppler ...............................................72 5.2.5 Análise do déficit neurológico e sobrevivência .....................................72 5.2.6 Ressonância Magnética (MRI) ..............................................................73 5.2.7 Histologia e TTC ...................................................................................73 5.2.8 Determinação das concentrações de citocinas/quimiocinas (ensaio imunoenzimático - ELISA) ...................................................................74 5.2.9 Análise estatística .................................................................................75 5.3 RESULTADOS ...........................................................................................76 5.3.1 Avaliação de fluxo sanguíneo por Imagem de perfusão pelo Laser Doppler .............................................................................................................76 5.3.2 Déficit neurológico e sobrevivência.......................................................77 5.3.3 Ressonância magnética (MRI) ..............................................................78 5.3.4 Avaliação da isquemia pela coloração com TTC...................................80 5.3.5 Avaliação Histopatológica .....................................................................81 5.3.6 Análise da expressão das citocinas / quimiocinas ................................83 6. DISCUSSÃO .................................................................................................85 7. CONCLUSÃO ...............................................................................................95 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................96 ANEXOS

INTRODUÇÃO

22 1. INTRODUÇÃO

Os acidentes vasculares encefálicos (AVEs) são definidos como síndromes neurológicas com progressão rápida dos sintomas e sinais de perda de função cerebral resultantes da interrupção do fornecimento de sangue ao encéfalo por processo isquêmico ou hemorrágico (Feuerstein e Wang, 2000). O AVE

isquêmico

é mais prevalente

que

o

hemorrágico,

acometendo

aproximadamente 87% dos casos, e sendo o alvo da maioria dos testes com fármacos (Gilgun-Sherki et al., 2002). Mais do que qualquer outro órgão do corpo humano, a integridade do cérebro é dependente de um contínuo fornecimento de sangue e glicose para a manutenção de suas funções (Maeda et al., 1998). Anualmente ocorrem cerca de cinco milhões de mortes por AVE. Cerca de 90% dos sobreviventes desenvolvem algum tipo de deficiência, conduzindo à incapacidade, dependência funcional e, consequentemente, perda da qualidade de vida (Bamford et al., 1990; Brainin et al., 2004). Durante a fase de isquemia, ocorre diminuição do aporte de oxigênio para o tecido cerebral, levando à inibição de fosforilação oxidativa mitocondrial e à queda da produção energética celular. Uma das consequências da isquemia é a degradação dos fosfolípides da membrana celular, por ação das fosfolipases A, liberando grande quantidade de ácidos graxos livres (AGL). Na fase da reperfusão, os AGL acumulados no tecido cerebral durante a isquemia são metabolizados pelas vias da lipoxigenase e cicloxigenase, formando tromboxanos, prostaglandinas, leucotrienos e superóxidos, sendo estes últimos radicais livres. Uma importante consequência da formação de radicais livres é a peroxidação lipídica, que se propaga na forma de uma reação em cadeia autocatalítica. Os ácidos graxos livres insaturados são bastante susceptíveis a esse processo de lipoperoxidação (White et al., 2000; Witko-Sarsat et al., 2000). A inflamação, em resposta à isquemia cerebral, envolve o recrutamento e influxo de leucócitos para a lesão, principalmente de neutrófilos no estágio pós-isquêmico e de monócitos/macrófagos em fases subsequentes. A micróglia contribui para a inflamação pós-isquêmica pela produção de fator de necrose

23 tumoral- (TNF-), interleucina-1 (IL-1), espécies reativas de oxigênio (EROS) e outros mediadores pró-inflamatórios. Entretanto, estas células também participam do processo de reparo pela produção de interleucina-10 (IL10) e fator de transformação de crescimento- (TGF-). Os neutrófilos liberam EROS, enzimas proteolíticas e citocinas que, durante a reperfusão, podem desempenhar um papel negativo, contribuindo para a expansão da lesão tecidual (Witko-Sarsat et al., 2000). A inibição de neutrófilos tem sido utilizada como estratégia terapêutica, por reduzir os efeitos secundários e promover neuroproteção (Prestigiacomo et al., 1999; Beray-Berthat et al., 2003). A infiltração de neutrófilos na área isquêmica é amplificada por vários fatores, dentre eles a produção de leucotrieno B4 (LTB4), que é quimioatrativo para neutrófilos (Royo et al., 1999). Os leucotrienos podem ser formados a partir da metabolização do ácido araquidônico (AA) pelas enzimas lipoxigenases (LOX), entre

elas

a

5-lipoxigenase

(5-LOX).

Zhou

e

colaboradores

(2006)

demonstraram que a isquemia cerebral leva ao aumento da expressão da 5LOX e que isto poderia resultar em expansão da lesão isquêmica. Alguns inibidores seletivos da 5-LOX demonstraram proteção ao dano isquêmico em ratos com isquemia cerebral focal. Esta enzima participa da produção de EROS, que por sua vez ativam o fator nuclear kappa-B (NF-kB). Este fator de transcrição participa da expressão de mediadores próinflamatórios envolvidos com o dano tecidual, tais como TNF-α e IL-1β (Christman et al., 2000). Trabalhos realizados anteriormente demonstraram que o Zileuton, um inibidor seletivo da 5-LOX, atenuou os danos cerebrais isquêmicos em ratos com isquemia cerebral focal permanente (Tu et al., 2009; Tu et al., 2010). No entanto, não existem estudos avaliando o efeito do Zileuton sobre o processo inflamatório em camundongos submetidos à isquemia e reperfusão (I/R) cerebral global. Sugere-se que a inibição da 5-LOX pelo Zileuton possa promover neuroproteção. Assim, torna-se imprescindível estudar o efeito neuroprotetor do Zileuton na I/R cerebral.

24 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.5 AVE Isquêmico O AVE isquêmico (AVEi), pode ocorrer por isquemia focal ou global. O tipo mais frequente de isquemia em seres humanos é a isquemia focal, causada por oclusão vascular localizada levando a interrupção do fluxo sanguíneo para uma parte do cérebro. Já a isquemia global, que resulta da interrupção transitória do fluxo sanguíneo para todo o cérebro é causada por uma perfusão sistêmica baixa, como resultado de insuficiência cardíaca ou perda importante de sangue com consequente hipotensão sistêmica que leva a uma redução global no fluxo sanguíneo. Além dos danos causados pela falta de oxigênio e metabólitos durante a isquemia, a volta da circulação sanguínea pode aumentar ainda mais a morte neuronal, especificamente nas áreas mais vulneráveis do cérebro (Taylor et al., 1996; Colli et al.,1998). A etiologia mais comum da isquemia cerebral decorre de doenças cardiovasculares como: doença valvular, infarto do miocárdio, arritmias, doença cardíaca congênita; doenças sistêmicas com formação de êmbolos sépticos, gordurosos ou de ar, que afetam a circulação cerebral. Os subtipos isquêmicos são os ateroscleróticos, embólicos e lacunares (Colli et al.,1998). A aterosclerose

é

um

importante

fator

que

contribui

para

a

doença

cerebrovascular. Em 90% dos casos, as lesões vasculares são de origem aterosclerótica, sendo a região da bifurcação carotídea a mais comumente acometida (Moore, 1995). Dessa forma o Sistema Nervoso Central (SNC) pode apresentar lesões isquêmicas globais e focais e para ambas as situações existem modelos experimentais, sendo a isquemia global encontrada durante situações como parada cardíaca e a isquemia focal durante a falência do suprimento sanguíneo a uma parte restrita do cérebro (Colli et al., 1998). 2.6 Fatores de Risco Existem condições que podem aumentar o risco para o desenvolvimento do AVE, como hipertensão arterial, doença arterial periférica, diabetes, fibrilação atrial, tabagismo, sedentarismo e obesidade (Leys et al., 2004).

25 A aterotrombose ocorre nas artérias cervicais e intracranianas. Nesta condição o trombo é formado em um estreitamento arterial aterosclerótico que impede o fluxo sanguíneo distal e causa isquemia e consequentemente infarto do tecido cerebral suprido pelo vaso ocluído. Na embolia cerebral, a artéria cerebral é subitamente bloqueada pelo material embólico que é geralmente um trombo originado do coração e grandes vasos (aorta e carótidas) (Kaposzta et al., 1999). A embolia, geralmente ocorre devido a alterações cardíacas (sendo as mais comuns as valvulopatias cardíacas, aneurisma ventricular e as miocardiopatias) (Rowland e Merri, 2002). A hipertensão arterial sistêmica é o principal fator de risco preditivo para AVEi, pois está presente em cerca de 70% dos casos de doenças cardiovasculares (DCV). As cardiopatias são consideradas o segundo fator de risco mais importante para AVE, cuja frequência é 41,9% para AVEi (contra cerca de 2,0% para AVE hemorrágico). Diabetes mellitus é fator de risco independente para a DCV, uma vez que acelera o processo aterosclerótico (Goldstein et al., 2001; Pires et al., 2004). Entre as várias causas cardíacas relacionadas com o risco de AVEi de origem embólica, a fibrilação atrial (FA) é uma das mais importantes. A presença de FA aumenta o risco de AVE

em 4 a 5 vezes (Kannel et al., 1998; Pires et al., 2004).

2.3 Epidemiologias do AVE Em 2010, no dia Mundial do AVE, a World Stroke Organization (WSO) e seus membros lançaram a campanha “um em seis”. O tema da campanha foi identificado para refletir a realidade atual de que uma em seis pessoas mundialmente terá um AVE no decorrer de sua vida (WSO 2010). O AVE é um importante problema de saúde pública, com acometimento de mais de 15 milhões de pessoas em todo o mundo. A cada ano ocorrem no mundo cerca de 5,7 milhões de mortes, representando a terceira maior causa de morte depois das doenças coronárias (7,2 milhões) e câncer (7,1 milhões) (WHO 2004). Os gastos nacionais agregados com atendimento médico na primeira hospitalização de um paciente com AVE foram calculados em US$ 449,3 milhões no Brasil e US$ 434,1 milhões na Argentina (Christensen et al., 2009; Christensen et al., 2009a). Entre os países da América Latina, o Brasil e o México possuem as maiores populações e os índices mais elevados de mortes

26 por AVE, com 129.200 e 33.000 respectivamente (WHO, 2004a). No Brasil, foram registradas 160.621 internações por doenças cerebrovasculares em 2009, segundo dados de domínio público do Sistema Único de Saúde (DataSUS), do Ministério da Saúde. A taxa de mortalidade foi de 51,8 a cada grupo de 100.000 habitantes. O grupo acima de 80 anos representou quase 35% dos 99.174 óbitos. A alta incidência está diretamente relacionada com as mudanças recentes no estilo de vida das pessoas, como consumo de alimentos ricos em gordura, tabagismo, alcoolismo, sedentarismo e o estresse diário excessivo (Ohtaki et al., 2005). O surgimento do AVE é muito repentino, ou seja, as pessoas afetadas e seus familiares não estão preparados para lidar com o ônus físico, psicológico e financeiro. Os efeitos devastadores do AVE não são apenas sentidos pelo paciente, mas impõe um grande ônus para os cuidadores, familiares e serviços sociais e da saúde (Kappelle et al.,1994; Mayo, 1999). Cerca de 90% dos sobreviventes

desenvolvem

algum

tipo

incapacidade,

dependência

funcional

de

e,

deficiência,

conduzindo

consequentemente,

perda

à da

qualidade de vida (Kimura et al., 2000; Carmichael, 2003).

2.4 Suprimentos sanguíneo para o Encéfalo O sangue chega ao encéfalo através das artérias vertebrais e das artérias carótidas internas, que se comunicam através do polígono do Willis. O tronco braquiocefálico origina-se na aorta e divide-se em artéria carótida comum e artéria subclávia. A artéria carótida comum direita (ACCD) origina-se do tronco braquiocefálico, enquanto que a artéria carótida comum esquerda (ACCE) origina-se diretamente da aorta. As artérias vertebrais ascendem uma de cada lado, pelos forames vertebrais, a partir da sexta vértebra cervical e após entrarem na caixa craniana, unem-se formando a artéria basilar, a qual tem trajeto ascendente na porção rostral do tronco encefálico e termina dando origem às artérias cerebelares superiores (Soares et al., 1988; Zea Longa et al., 1989). As artérias carótidas comuns (ACC) bifurcam-se em artérias carótidas externas (ACE) e artérias carótidas internas (ACI). A ACE é mais calibrosa e localiza-se inicialmente medial e anterior em relação à artéria carótida interna

27 ACI (Colli et al., 1998). As ACIs juntamente com as artérias comunicantes anteriores (ACA) e artérias comunicantes posteriores (ACP), anastomosam-se com as artérias cerebelares superiores através das artérias comunicantes posteriores (ACoP), constituindo o círculo arterial da base do cérebro (polígono de Willis) (Figura 1). Este círculo arterial é muito semelhante ao encontrado no cérebro humano (Greene, 1968; Zea Longa et al., 1989). O polígono de Willis tem sido estudado numa variedade de mamíferos incluindo o cão (Miller et al., 1964), gatos (McClure et al, 1973), ratos (Brown, 1966; Greene,1968), camundongos (Cook, 1965; Firbas et al, 1973; Wiland, 1974), cobaias (Ocal e Ozer, 1992) e coelhos (Brehmer e Beleites, 1988).

Figura1: Esquema mostrando as artérias cerebrais artérias

anteriores comunicantes

e

posteriores, anteriores

e

posteriores e carótida interna que em conjunto formam o Polígono de Willis. Fonte: Wikipedia, 2013.

2.5 Modelos experimentais de isquemia e reperfusão Os modelos experimentais de isquemia cerebral foram desenvolvidos com o objetivo de identificar os possíveis mecanismos envolvidos nas lesões cerebrais, bem como, para fornecer a base para o desenvolvimento de novas terapias para o AVE (Bacigaluppi; Comi; Hermann, 2010). Atualmente, o estudo experimental da isquemia cerebral em animais leva em conta três aspectos: a) a extensão do cérebro que é submetida a isquemia, a qual pode ser focal ou global; b) o intervalo de tempo da isquemia cerebral podendo ser permanente ou transitória e, na transitória, podendo ocorrer reperfusão pós-isquêmica; e c) a intensidade da isquemia, podendo ser classificada em parcial ou completa.

28 Para isso, existem vários modelos onde podem ser combinados estes diferentes aspectos (Colli et al., 1998). Diversas espécies de animais podem ser utilizadas, como macacos, coelhos,

ovelhas,

suínos,

gatos,

cães e

roedores

(gerbils,

ratos e

camundongos). Os ratos e camundongos são os animais mais comumente utilizados para estudos com isquemia cerebral através de modelos de isquemia focal e global (Colli et al., 1998; Ohtaki et al., 2005). (Figura 2).

Figura 2: Modelos animais de isquemia cerebral para estudo da fisiopatologia e terapia do AVEi. Adaptado de Bacigaluppi, Comi e Hermann, 2010.

Segundo Hossmann (1998), o modelo ideal deve atender aos seguintes princípios:

reproduzir

condições

de

relevância

clínica;

ser

facilmente

reprodutível; ser facilmente executável e evitar efeitos colaterais não relacionados à isquemia. Os três modelos principais utilizados para estudos in vivo são os seguintes: (a) a isquemia focal, (b) isquemia hipóxica e (c) isquemia global.

29 A isquemia cerebral global caracteriza-se por redução crítica do fluxo sanguíneo em todo o cérebro, induzindo lesão neuronal seletiva na região CA1 do hipocampo desde que a duração da isquemia seja limitada. Os principais modelos de oclusão global podem ser por oclusão das artérias carótidas comuns e o modelo de sequestro cardíaco que consiste na compressão temporária da parte superior da artéria aorta (Ohtaki et al., 2005). Os modelos de isquemia cerebral global são normalmente utilizados para estudo de danos cerebrais que ocorrem em situações de ressuscitação cardiocirculatória. A isquemia global pode ser induzida por diferentes métodos (Pulsinelli e Brierley, 1979). Os modelos de isquemia global mais utilizados são: oclusão de 4 vasos (4VO) e oclusão de 2 vasos (2VO) (Kitagawa et al., 1998; Strijbos et al., 1996). O modelo 4VO consiste de uma oclusão temporária de ambas as artérias carótidas comuns combinadas com a interrupção permanente das artérias vertebrais através de eletro-cauterização, resultando em isquemia altamente previsível no tronco cerebral, hipocampo, estriato e neocórtex, além de reduzir o fluxo sanguíneo de forma eficaz (Pulsinelli e Brierley, 1979; Pulsinelli et al., 1982). O modelo 2VO consiste na oclusão de ambas as artérias carótidas comuns, junto com a indução de hipotensão durante um período de tempo limitado. Neste modelo de isquemia ocorre lesão seletiva na região CA1 do hipocampo, putâmen caudado e neocórtex (Smith et al., 1984; Kirino et al., 1985). Modelos de isquemia cerebral global em camundongos têm sido desenvolvidos através de oclusão bilateral das artérias carótidas comuns (Wu et al., 2001; Traystman, 2003; Chen et al., 2010; Onken et al., 2012). Os modelos de isquemia cerebral em camundongos são atualmente interessantes devido a disponibilidade do uso de linhagens knockout, afim de identificar mecanismos celulares do dano isquêmico (Cervantes et al., 2006). 2.6 Fisiopatologias do AVE isquêmico

2.6.1 Mecanismos de dano neuronal induzidos pela I/R

Isquemia é a perda do suprimento sanguíneo por redução do fluxo arterial de um tecido, resultando em comprometimento da oferta de substratos

30 metabólicos, incluindo a glicose e oxigênio (Evora et al.,1996; Cotran et al., 2000). O encéfalo é altamente vulnerável à isquemia. O que reflete em parte, a suas altas demandas metabólicas. O cérebro tem uma demanda relativamente alta para produção de energia e, para isso, depende quase exclusivamente da fosforilação oxidativa para a produção de energia. Apesar do encéfalo humano representar apenas 2% do peso corporal total, nele ocorre cerca de 20% do metabolismo basal, com utilização de cerca de 20% de oxigênio e 25% de glicose consumida por todo o corpo, uma taxa metabólica cerca de 3,5 vezes maior do que a encontrada em outras espécies de primatas (Lee et al., 2000; Zauner et al., 2002). Assim, a redução do fluxo sanguíneo cerebral em 20% a 30% abaixo do normal é suficiente para iniciar uma série de eventos fisiopatológicos que culminarão na morte de neurônios (Ohtaki et al., 2005). A hipóxia gerada pela diminuição do aporte de oxigênio para o tecido cerebral acarreta inibição da fosforilação oxidativa mitocondrial e a queda da produção de trifosfato de adenosina (ATP) (Yoshida, 2002). A falta de energia celular causa a falência da bomba sódio-potássio (Na+/K+) gerando edema citotóxico (Dirnagl et al., 1999; Harukuni e Bhardwaj, 2006). Além disso, ocorre aumento do influxo de cálcio (Ca+2) na célula, levando a ativação de uma série de proteases, quinases, lipases e endonucleases, com consequente morte celular por necrose e apoptose (Lipton, 1999; Mattson et al., 2000). A perda da atividade neural é induzida pela saída de K + dos neurônios, levando a uma hiperpolarização transitória da membrana plasmática. Poucos minutos após, uma abrupta redistribuição iônica ocorre através da membrana plasmática, associada com despolarização (efluxo de K+ e influxo de Na+, Cl- e Ca+2). Esta despolarização anóxica resulta na liberação excessiva de neurotransmissores, em particular glutamato, promovendo maior propagação da despolarização celular, depleção dos estoques energéticos e continuidade da cascata de lesões. O metabolismo anaeróbico da glicose gera a produção de lactato e aumento da concentração de H+ dentro da célula e, consequentemente, acidose e ativação de proteases intracelulares (Plum, 1993; Lee et al., 2000) (Figura 3). A lesão por reperfusão é um termo utilizado para descrever as alterações, funcionais e estruturais, que se tornam aparentes durante o

31 restabelecimento do fluxo após um período de isquemia (Evora et al.,1996; Cotran et al., 2000). No instante em que a artéria ocluída é liberada, o fluxo sanguíneo é restabelecido ao território isquêmico e, como resultado da reperfusão, ocorre alteração na transdução de sinais. As enzimas como quinases e fosfatases ativadas pelo Ca+2, óxido nítrico (NO) e EROs ativam a expressão gênica e a síntese de proteínas, levando, de forma gradativa, a morte celular por apoptose e inflamação. Embora a reperfusão promova retorno do fluxo sanguíneo cerebral, lesões cerebrais secundárias também são formadas devido ao influxo de neutrófilos, aumento de radicais livres, edema e hemorragia (Danton e Dietrich, 2003; Harukuni e Bhardwaj, 2006).

Figura 3: Sequência de eventos relacionados a isquemia e reperfusão cerebral. Fonte: Adaptado de Fisher e Schaebitz, 2000 e Yoshida, 2002.

2.6.2 Área central de isquemia e penumbra Na isquemia cerebral é possível observar que a redução do fluxo sanguíneo não é homogênea, mas é maior no centro da lesão, região denominada zona central isquêmica. Normalmente reduções do fluxo abaixo de

32 50% das taxas normais afetam a habilidade dos neurônios para disparar potenciais de ação e reter neurotransmissores. Na região de core isquêmico o fluxo sanguíneo cerebral é intensamente reduzido, podendo chegar de zero a 20% em relação ao valor normal (Belayev et al., 1997; Iadecola, 1999). A redução do fluxo em para menos de 20% do normal resulta em perda de gradientes iônicos e elétricos (despolarização anóxica) culminando na morte neuronal. Assim, a zona central de isquemia apresenta rápida despolarização anóxica com consequente falência da membrana associada à perda da homeostase do Ca+2 e glutamato. A isquemia torna-se progressivamente menos intensa quanto mais distante do core isquêmico, até que o fluxo retorne ao normal em regiões supridas por artérias adjacentes que não estão ocluídas. Esta região na periferia do território isquêmico é assim chamada penumbra isquêmica (Iadecola, 1999). A penumbra isquêmica é uma região eletrofisiologicamente dinâmica e metabolicamente instável, porque apesar de ocorrer declínio crítico da perfusão nessa área, o nível de metabolismo de glicose tende a ser mantido em níveis normais (Belayev et al., 1997). Nessa região a morte celular ocorre menos rapidamente via mecanismos como apoptose e inflamação (Gonzalez et al., 2006). A manutenção da taxa de fosforilação oxidativa normal na penumbra durante a perfusão sanguínea criticamente diminuída acaba por levar a um estresse metabólico intenso para o tecido. As depolarizações celulares estão associadas com efluxo de íons K+ e influxo de Na+ e Ca+2 e, para restaurar esses gradientes iônicos, energia é consumida (Siesjö e Siesjö, 1996). Os neurônios na zona de penumbra são os mais susceptíveis e com o tempo a zona de infarto amplia-se, com mais neurônios da penumbra sendo recrutados para a zona central (Dohmen et al., 2008). Assim, o conceito de penumbra é particularmente importante, porque, diferente da lesão central que apresenta processo de necrose irreversível, esta é potencialmente recuperável. A zona de penumbra pode progredir para zona de lesão irreversível em poucas horas a menos que seja restaurada a reperfusão associada a terapia neuroprotetora (Heiss, 2010).

33 2.6.3 Excitotoxicidade O termo excitotoxicidade refere-se à toxidade causada pelo aumento da concentração de glutamato durante a transmissão sináptica e consequente morte neuronal (Meldrum, 2000). O glutamato é o neurotransmissor da maioria das sinapses excitatórias do SNC (Watkins e Jane, 2006). Apesar do glutamato ser o neurotransmissor responsável pela maioria das sinapses no cérebro e medula espinhal, uma exposição intensamente anormal ao glutamato pode ser letal aos neurônios (Choi, 1992). Estudos farmacológicos, moleculares e eletrofisiológicos revelaram que os receptores de glutamato podem ser divididos em dois grupos: receptores ionotrópicos (receptores NMDA e AMPA) e os metabotrópicos. Os receptores ionotrópicos são específicos para cátions, sendo capazes de gerar respostas sinápticas rápidas (Meldrum, 2000). O receptor NMDA é encontrado em todo o cérebro, sendo localizado principalmente no cérebro anterior e na região CA1 do hipocampo. A ativação de receptores NMDA permite o influxo de grandes quantidades de Ca +2 extracelular para o interior da célula. O receptor AMPA é distribuído igualmente pelo SNC sendo altamente expresso no hipocampo, e é permeável aos íons Na+. Porém, quando a subunidade GluR2 está ausente na conformação do receptor AMPA, ele se torna permeável a íons Ca +2 (Ozawa et al., 1998). A liberação de glutamato das vesículas sinápticas produz um potencial de ação pós-sináptico excitatório por ativar inicialmente os receptores AMPA. A ligação de glutamato aos receptores AMPA medeia a entrada de Na + para o interior do neurônio, despolarizando-o. Esta despolarização permite a liberação do magnésio e o desbloqueio de receptores NMDA. Uma vez que o receptor NMDA foi desbloqueado e com a união do glutamato, permite a entrada de íons Ca+2 (Hara e Snider, 2007). Segundo White e colaboradores (2000), o Ca+2 livre no citosol é mantido em concentrações baixíssimas em comparação aos níveis extracelulares (1/10.000). No interior da célula, a maior parte do Ca +2 está sequestrado nas mitocôndrias e retículo endoplasmático. Durante a isquemia, inicialmente, ocorre o aumento da concentração citosólica de Ca +2 devido ao influxo através da membrana plasmática e por sua liberação das mitocôndrias e retículo endoplasmático.

34 Em situações em que ocorre desequilíbrio iônico e diminuição nos níveis de ATP intracelular, ocorre ativação dos receptores NMDA e AMPA, permitindo que ocorra um grande aumento das concentrações desse íon no interior da célula. O excesso de Ca+2 citoplasmático decorrente da ativação de receptores NMDA é captado pela mitocôndria, causando elevação do Ca+2 mitocondrial e assim depleção relativa nos estoques de ATP, inibição da fosforilação oxidativa, formação de poros de permeabilidade transitória, ativação de enzimas (ex. quinases C, calmodulina, calpaínas, caspases e fosfolipases) e, por fim, colapso bioenergético. O colapso bioenergético mitocondrial pode acarretar na superprodução de EROs, liberação do Ca +2 da mitocôndria e morte celular (Mattson, 2007; Ryter et al., 2007; Nicholls, 2008). A abertura desses canais leva a mais despolarização da membrana e um aumento ainda maior do influxo de Ca+2, exacerbando a sobrecarga intracelular do mesmo (excitotoxicidade) (Ohtaki et al., 2005). Assim a ação neurotóxica do glutamato está intimamente ligada a um aumento de íons Ca +2 (Stone e Addae, 2002) (Figura 4).

Figura 4: Mecanismos envolvidos no processo de excitotoxicidade. Adaptado de Fisher e Schaebitz, 2000.

35 A morte excitotóxica pode ocorrer por necrose ou apoptose. A excitotoxicidade

pode

ser

o

iniciador

dos

eventos

moleculares

que

desencadeiam a apoptose e inflamação nas áreas de penumbra cerebral, ou seja, local onde a necrose não ocorre rapidamente (Gilgun-Sherki et al., 2002; Kunz et al., 2010). Ainda, o efluxo de glutamato dos neurônios isquêmicos pode contribuir para a amplificar a propagação adicional do dano excitotóxico com o envolvimento de outros neurônios adjacentes (Harukuni e Bhardwaj, 2006) (Figura 8). 2.6.4 Estresse Oxidativo e Peroxidação Lipídica As consequências da isquemia, em diferentes tecidos, dependem de sua duração e muitas lesões ocorrem durante a reperfusão tecidual devido ao estresse oxidativo. O excesso de produção de substâncias reativas, como espécies reativas de oxigênio (EROs), dificulta ou impede a neutralização por agentes antioxidantes endógenos, como glutationa e superóxido dismutase, resultando em estresse oxidativo (Gilgun-Sherki et al., 2002; Silva Jr. et al., 2002). O cérebro é extremamente sensível ao estresse oxidativo devido a presença de grande quantidade de ácidos graxos insaturados, grande reserva de ferro, alta taxa de metabolismo de oxigênio e por apresentar sistema de defesa vulnerável e ineficiente contra EROs (Tardini e Yoshida, 2003). A produção de radicais livres parece estar associada à perda da homeostase celular de Ca+2 que leva a uma série de reações. O primeiro ponto de ataque da hipóxia é a respiração celular aeróbia. À medida que a tensão de O2 dentro da célula reduz, há perda da fosforilação oxidativa e diminuição da geração de ATP. O consumo do estoque de ATP continua e é degradado a adenosina difosfato (ADP) e adenosina monofosfato (AMP) e, posteriormente, a adenosina, inosina e hipoxantina (Yoshida, 2002). O acúmulo de Ca+2 no citossol provoca a ativação da protease calpaína, que, por sua vez, promove a quebra de uma ponte peptídica da enzima xantina desidrogenase (XD), levando à formação da enzima xantina oxidase (XO). Diferentemente da XD, a XO necessita de oxigênio para realizar a conversão de hipoxantina em xantina. Na fase da isquemia, portanto, ocorre acúmulo dessas duas substâncias. Com a reperfusão, a hipoxantina é, então, oxidada em xantina e assim, como subproduto dessa reação, ocorre a formação do ânion superóxido (Traystman

36 et al., 1991; Beetsch et al., 1998; Kontos, 2001). O superóxido é um oxidante fraco e sua ação tóxica ocorre mais em função dos produtos de sua redução, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), o radical peroxila (HO2•) e o radical hidroxila (OH•), este último um potente agente oxidante. Esses radicais livres são as espécies reativas do oxigênio (Chan, 1996). Outra origem das EROs é a produção de radicais superóxidos pela quebra de elétrons do sistema de transporte de elétrons dentro da mitocôndria ou pela via da cicloxigenase do metabolismo do ácido araquidônico (AA) (White et al., 2000; Kunz et al. 2010). Por esse último mecanismo, há a ativação de proteases e fosfolipases inespecíficas induzida pelo acúmulo de Ca+2 intracelular no período de reperfusão. O AA acumulado durante a isquemia é então metabolizado pelas vias da lipoxigenase e da cicloxigenase, levando a formação de mediadores pró-inflamatórios como o fator ativador plaquetário (PAF), compostos eicosanoides e superóxido (Gutteridge e Haliwell, 1990; Traystman et al., 1991; Campos e Yoshida, 2004). Outro radical livre intimamente envolvido com a lesão de I/R é o óxido nítrico (NO), produzido a partir do aminoácido L-arginina. O NO é formado pela iNOS encontrada nos macrófagos e micróglias no processo inflamatório. A superprodução de NO induzido pela isquemia é em parte causada pelo aumento de Ca+2 intracelular mediada pelo glutamato (Dawson et al., 1994). Um importante mecanismo de regulação da concentração de NO é sua reação com o íon superóxido formando peroxinitrito (ONOO-) que é altamente reativo e citotóxico, com potencial para reagir e danificar a maioria dos alvos celulares, incluindo lipídeos, proteínas e DNA (Kunz et al., 2010; Campos e Yoshida, 2004). Assim, os radicais livres promovem um ciclo vicioso na mitocôndria, com a inibição de mecanismos de transporte de elétrons e despolarização da membrana, levando a produção excessiva de superóxido. Além disso, o aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial leva a tumefação dessa organela e à liberação de moléculas pró-apoptóticas. O estresse oxidativo está intimamente relacionado à excitotoxicidade, perda de energia e desequilíbrio iônico, além da indução do processo inflamatório, sendo todos esses eventos promotores de lesão tecidual (Kunz et al., 2010).

37

2.6.5 Apoptose Nos últimos anos, vários estudos têm apontado o papel da apoptose no SNC

e

a

possibilidade

deste

processo

ser

relevante

em

doenças

neurodegenerativas, como nas desordens cerebrovasculares, Alzheimer, Parkinson e esclerose múltipla (Martin et al., 1998; Sastry e Rao, 2000). A maioria dos trabalhos sobre a isquemia cerebral atribuíam a morte dos neurônios pelo processo de necrose. Porém, nos últimos anos, vários trabalhos descrevem o papel da apoptose na contribuição para morte de neurónios após a isquemia global (Héron et al., 1993; MacManus et al., 1993) e focal (Linnik et al.,1993; MacManus et al., 1994). Modelos de isquemia in vivo demonstram a ocorrência de necrose na zona isquêmica, enquanto que na região de penumbra as células inicialmente sobrevivem para posteriormente morrerem por apoptose (Irving et al., 2000). Como na penumbra isquêmica a lesão é menos intensa e há uma preservação de ATP, a apoptose predomina nessa região (Love, 2003; Gonzalez et al., 2006). Além disso, Charriaut-Marlangue e colaboradores (1996) observaram que a razão entre células apoptóticas e necróticas é de 9:1 na região de penumbra versus 1:1 na área isquêmica, seis horas após a isquemia (Dirnagl et al., 1999; Devarajan, 2006). No processo de I/R, a apoptose pode ocorrer tanto pela via intrínseca, através da participação da mitocôndria e posteriormente da ativação da caspase 3, quanto pela via extrínseca pela ativação do domínio de morte (FADD) e consequente ativação das caspases 8 e 3. A caspase 3 tem sido identificada como um mediador chave de apoptose em modelos de isquemia cerebral em animais, a qual é ativada precocemente após a isquemia, principalmente em regiões próximas ao infarto (Namura et al., 1998). Portanto, essas vias (extrínseca e intrínseca), uma vez iniciadas, se unem e participam da cascata de caspases como via comum (Brad et al., 2009). Mais recentemente, foi descrita a participação, na via mitocondrial, de uma flavoproteína conhecida por Fator Indutor de Apoptose (AIF). Após a isquemia, AIF migra da mitocôndria para o núcleo após um estímulo de apoptose e induz a condensação da cromatina e fragmentação do DNA em

38 grande escala, independente da ativação das caspases (Bröker et al., 2005). Além disso, a I/R cerebral gera ânions superóxido (O2-), o que provoca danos direto no DNA (Brad et al., 2009). É sabido também que as EROs induzem a ativação das caspases 9 e 3 (Gottlieb, 2001) (Figura 5).

Figura 5: Cascata de sinalização das vias intrínseca, extrínseca e independente de caspase após a isquemia e reperfusão cerebral. Fonte: Adaptado de Miguel, 2011 e Brad et al., 2009.

2.6.6 Processo inflamatório na I/R cerebral O

SNC

tem

sido

muitas

vezes

considerado

como

um

sítio

imunologicamente privilegiado devido a presença da barreira hematoencefálica (BHE). A BHE é uma barreira física e metabólica localizada na interface entre o tecido cerebral e o sangue (Fabry et al., 1994). A BHE é uma estrutura morfológica constituída por células endoteliais vasculares, formada por outros componentes celulares como os pericitos, matriz extracelular, formando a lâmina basal, astrócitos e a micróglia, formando assim uma unidade neurovascular (Rüffer et al., 2004).

39 No

processo

de

I/R,

essa

unidade

neurovascular

pode

ser

comprometida, interferindo nas suas funções de proteção e permeabilidade seletiva. Várias neuropatologias frequentemente resultam em ruptura da BHE e recrutamento de células infamatórias para o encéfalo (Weiss et al., 2009). A resposta inflamatória no cérebro pós-isquemia é caracterizada por uma rápida ativação das células residentes, principalmente micróglia, seguida da infiltração de células inflamatórias periféricas, como neutrófilos, monócitos/macrófagos e linfócitos T, como demonstrado em animais (Tanaka et al., 2003; Amantea et al., 2009) e em humanos com AVE (Lindsberg et al., 1996; Buck et al., 2008). Na fase aguda do AVEi, EROs podem estimular células isquêmicas, induzindo neurônios a secretar mediadores pró-inflamatórios (citocinas e quimiocinas) que promovem a expressão de moléculas de adesão em células endoteliais cerebrais e recrutamento de leucócitos (Amantea et al., 2009). Na fase subaguda, os leucócitos ativados liberam uma variedade de agentes citotóxicos,

incluindo

mais

citocinas,

produção

excessiva

de

EROs,

indução/ativação de metaloproteinases, principalmente MMP-9, e NO que amplificam a resposta inflamatória no cérebro. Estas substâncias promovem alterações na estrutura da BHE e na matriz extracelular (Emsley e Tyrrell, 2002; Danton e Dietrich, 2003). Assim, em adição aos eventos excitotóxicos que ocorrem durante a I/R, reações inflamatórias agudas que iniciam horas e persistem por dias após a isquemia, levam à ativação de células residentes, migração de leucócitos, hemorragias, edema e a extensão da lesão neuronal (Kriz, 2006).

2.7 Papel das micróglias e dos astrócitos na I/R

As micróglias são células gliais do SNC que se originam de células do sangue, os monócitos, e correspondem aos macrófagos do parênquima neural. As micróglias ativadas desempenham um papel importante no AVEi (Aloisi, 2001). Estas células são ativadas dentro de minutos após o início da isquemia, passando então a produzir uma infinidade de substâncias citotóxicas, como mediadores pró-inflamatórios, tais como EROs, citocinas (IL-1, IL- 6, TNF-IL8, CCL2, CCL3) e MMP-9 (Aloisi, 2001; Nakaijima e Kohsaka, 2000; del Zoppo et al., 2007; Pun et al., 2009). Estes eventos levam ao aumento inicial da

40 permeabilidade da BHE e a infiltração precoce de leucócitos circulantes para o cérebro (Banati et al., 1993; Yenari et al., 2006; Pun et al., 2009) (Figura 8). Os astrócitos também são importantes no processo de I/R cerebral. Essas células envolvem com seus prolongamentos os pericitos, além de interconectar as células endoteliais com os neurônios circunjacentes. Em vista da

associação

anatômica

com

as

células

endoteliais,

os

astrócitos

desempenham um papel proeminente no desenvolvimento, manutenção e quebra da BHE (Janzer e Raff, 1997; Kuchler-Bopp et al., 1999). Sabe-se que os astrócitos participam da síntese e secreção de fatores tróficos, reparação e regeneração de lesões. Além disso, estas células secretam citocinas próinflamatórias (IL-1, IL-6, IFN-, TNF-), quimiocinas e iNOS (Dong e Benveniste, 2001; Chen e Swanson, 2003). Após 10 minutos de isquemia global transitória, a expressão de iNOS foi encontrado nos astrócitos reativos no hipocampo, mas não nos astrócitos do hipocampo não lesionados (Endoh et al., 1994). Além disso, iNOS nos astrócitos demonstrou potencializar a lesão de isquemia nos neurónios (Hewett et al., 1996) (Figura 6).

Figura 6: Mecanismos de ativação das células da glia e leucócitos após a isquemia e reperfusão. Fonte: Bruno Costa Silva.

41 2.8 Mediadores Inflamatórios Citocinas são glicoproteínas que agem como mensageiros intercelulares e são produzidas por diversos tipos celulares: células gliais, neurônios, macrófagos, linfócitos, células endoteliais, plaquetas, fibroblastos entre outros (Sairanen et al., 2001). As citocinas mais estudadas durante a isquemia e reperfusão cerebral são a IL-1, TNF-α, IL-6, INF-, IL-10 e TGF-β (Han e Yenari, 2003). TNF-α, IL-1 e IL-6 estão envolvidas com lesão cerebral, enquanto, IL-10 e TGF-β são neuroprotetoras (Allan e Rothwell, 2001). Assim, o balanço destas citocinas pró e antiinflamatórias determina a gravidade da lesão. A IL-1 é a citocina mais bem estudada na isquemia experimental. Diversos trabalhos mostraram o aumento de IL-1 durante a I/R cerebral, tanto em modelos de isquemia focal quanto global. Os possíveis mecanismos prejudiciais induzidos ou ativados pela IL-1 na isquemia cerebral incluem aumento da lesão mediada por NMDA, proliferação de micróglias, liberação de AA e síntese de NO (Liu et al., 1993; Yamasaki et al., 1995). Assim como IL-1, a síntese aumentada de TNF- tem sido demonstrada no processo isquêmico. Seus efeitos são mediados através da ligação a receptores específicos, seguida da ativação de quinases e fosfolipase A2. Uma segunda forma na via de transdução de sinal do TNF- é intracelular, com consequente ativação de vários fatores transcricionais como o NF-B que induz genes para moléculas de adesão e outras citocinas, favorecendo assim a aderência e acúmulo de neutrófilos nos microvasos (Kolesnick e Golde, 1994). O papel da IL-6 não foi completamente elucidado. Seu efeito antiinflamatório parece depender da inibição da produção de IL-1 e TNF- via um mecanismo de feedback negativo e estímulo para produção de antagonistas de receptor de IL-1 e TNF-. Entretanto, tem sido documentado que a IL-6 pode induzir a expressão do gene da fosfolipase A2 e como consequência, a produção de eicosanoides que estão diretamente envolvidos no dano isquêmico (Crowl et al., 1991). O IFN- é uma proteína produzida por linfócitos T ativados que induz a expressão de uma variedade de citocinas (Rose et al., 1997). Outro possível

42 papel do INF- na isquemia cerebral, é a produção de NO através da indução da expressão do RNAm para a enzima iNOS (Kamijo et al., 1994). IL-10 é uma citocina antiinflamatória que atua através da inibição da IL1 e TNF-α e também pela supressão da expressão dos receptores de citocinas. É sintetizada no SNC e regulada positivamente na isquemia experimental (Strle et al., 2001). Pacientes com AVEi agudo tem um número elevado de células mononucleares do sangue periférico secretoras de IL-10 (Pelidou et al., 1999) e elevadas concentrações no líquido cefalorraquidiano (Tarkowski et al., 1997). Indivíduos com baixos níveis de IL- 10 tem maior risco de desenvolver AVE (van Exel et al., 2002). As

quimiocinas

constituem

uma

grande

família

de

citocinas

estruturalmente homólogas responsáveis pela movimentação dos leucócitos. As duas principais famílias são as quimiocinas CC e a família CXC. As quimiocinas CXC tendem a atrair neutrófilos enquanto as quimiocinas CC agem, preferencialmente, em monócitos/macrófagos (Stanimirovic e Satoh, 2000). A produção e secreção das quimiocinas são estimuladas pelas citocinas IL-1 e TNF- que têm pouca capacidade de atrair leucócitos, necessitando assim da ação desses fatores quimiotáticos. Níveis aumentados de quimiocinas têm sido detectadas no cérebro de ratos submetidos a isquemia. Além disso, a administração sistêmica de anticorpos anti-IL-8 mostrou diminuição do edema cerebral, da permeabilidade da BHE e do tamanho do infarto (Matsumoto et al., 1997). Foi demonstrado que células endoteliais do cérebro e astrócitos humanos expressam e liberam maiores quantidades de IL-8 e CCL2, bem como outros quimioatrativos para neutrófilos quando são submetidos a privação de oxigênio/glicose in vitro (Zhang et al., 1999). As quimiocinas CCL3 e CCL5 atuam, preferencialmente, nos monócitos/macrófagos. No SNC, células da glia e neurônios são capazes de expressar receptores funcionais de quimiocinas, entretanto, essa expressão é, preferencialmente, induzida por um estímulo inflamatório (Che et al., 2001; Biber et al., 2002). Alguns trabalhos têm mostrado que as quimiocinas CCL2, CCL3 e CCL5 desempenham um papel importante na inflamação do SNC (Minami et al., 2003; Banisor et al., 2005; Chui e Dorovini-Zis, 2010). O aumento da expressão de RNAm CCL3 foi demonstrado em ratos submetidos a I/R cerebral (Takarmi et al., 1997;

43 Yamagami et al 1999). Além disso, a expressão de quimiocinas tem sido associada ao volume do infarto (Chen et al., 2003). 2.9 Papel dos neutrófilos na I/R cerebral A inflamação, em resposta à isquemia cerebral, envolve o recrutamento e influxo de leucócitos, principalmente neutrófilos no estágio pós-isquêmico e monócitos/macrófagos, em fases subsequentes para a área de lesão (Garau et al., 2004). Na fase aguda de isquemia, EROs e mediadores pró-inflamatórios são liberados rapidamente do tecido lesado. Esses mediadores induzem a expressão da adesão de moléculas nas células endoteliais do cérebro e em leucócitos, e assim promovem a adesão e migração transendotelial de leucócitos circulantes (Kriz, 2006; Amantea et al., 2009). Dos vários tipos de leucócitos, os neutrófilos são os primeiros a infiltrar no cérebro isquêmico. Para iniciar este processo de transmigração, é necessária ativação do endotélio vascular cerebral, bem como dos próprios leucócitos. A ativação das integrinas é necessária para a aderência dos leucócitos. Após a I/R, o endotélio vascular ativado produz substâncias quimioatrativas tais como PAF, LTB4 e várias quimiocinas (Premack e Schall, 1996; Rollins, 1997). A adesão firme dos neutrófilos às células endoteliais parece envolver a interação das integrinas de leucócitos da subfamília 2 (CD11a, CD11b, CD11c/CD18) com ICAM-1. Entre todas as imunoglobulinas, ICAM-1 e VCAM-1 têm sido as mais investigadas na isquemia cerebral. Alguns trabalhos demonstraram um aumento da expressão de ICAM-1 no cérebro isquêmico dentro de horas após o início do AVEi, atingindo expressão máxima cerca de 12-24 horas, e antecedendo a infiltração de leucócitos (Wang et al., 1994; Wang e Feuerstein, 1995). Entre os vários agentes quimiotáticos conhecidos que regulam este processo, o LTB4 estimula a adesão, induzindo uma alteração conformacional das integrinas CD11b/CD18 na superfície de neutrófilos (van Pelt et al., 1997) e estimulando a expressão aumentada de receptores nas células endoteliais (Harlan et al.,1986). Os neutrófilos exibem vários receptores estruturalmente relacionados para quimiocinas que podem desencadear adesão, migração celular direta e promover degranulação e respostas oxidativas. Estes receptores acoplados à proteína G, incluem receptores para complemento C5a, PAF, LTB4 (Yokomizo

44 et al., 1997), e receptores para CXC (principalmente receptores CXCR1 e CXCR2 para IL-8). Entre estas quimiocinas, a IL-8 atrai especificamente neutrófilos, não tendo qualquer efeito sobre os monócitos (Premack e Schall,1996). A IL-8 é um importante quimioatrativo de neutrófilos, como demonstrado pela inibição completa de recrutamento de neutrófilos em locais de inflamação por anticorpos monoclonais anti-IL-8 em modelos animais (Yang et al., 1999). Curiosamente, a IL-8 é a mais abundante citocina secretada por neutrófilos, e por outro lado os neutrófilos são o alvo celular primário da IL-8 (Gainet et al, 1998). Os neutrófilos secretam metaloproteinases, tais como a MMP-8 e MMP9, responsáveis pela ruptura da matriz extracelular após a degradação de colágeno, fibronectina e elastina, favorecendo sua infiltração até o parênquima cerebral. A migração de neutrófilos é uma fonte potencial de EROs, enzimas proteolíticas e citocinas, que durante a reperfusão podem desempenhar um papel negativo, contribuindo para a expansão da lesão cerebral. Após estimulação, os neutrófilos são capazes de produzir um metabolismo oxidativo, não mitocondrial, chamado de “explosão oxidativa”. A explosão oxidativa é caracterizada pela produção de EROs, que são geradas por mecanismos dependentes da mieloperoxidase (MPO) liberada dos grânulos e, por mecanismos independentes da MPO. Uma vez no parênquima cerebral, os neutrófilos secretam mieloperoxidase, defensinas, elastase, catepsinas G e gelatinases, que juntamente com as EROs são responsáveis pelo aumento da área isquêmica (Witko-Sarsat et al., 2000) (Figura 8).

2.10 Mediadores lipídicos na I/R cerebral O ácido araquidônico (AA) é um ácido graxo poliinsaturado de 20 carbonos (ácido 5,8,11,14-eicosatetranóico) que é derivado diretamente da dieta ou pela conversão do ácido graxo essencial (ácido linoleico). Não ocorre livre na célula mas é normalmente esterificado em fosfolipídios de membrana. É liberado dos fosfolipídios de membrana pela ação de fosfatases celulares como a fosfolipase A2 que é ativada pela ação do Ca+2 e de outros mediadores na cascata isquêmica. O AA livre pode gerar diversos metabólitos biologicamente ativos, chamados eicosanoides, em reação catalisada pela

45 ação de dois tipos de enzimas, as cicloxigenases (COX), liberando prostaglandinas (PGs) e tromboxanos (TXs) e as lipoxigenases (LOX) liberando leucotrienos (LTs) e lipoxinas (Matsuo et al., 1996; Rocha et al., 2003). Os metabólitos dessas reações influenciam cada passo do processo inflamatório. A via da cicloxigenase é mediada por duas diferentes enzimas: a COX-1 e a COX-2. A COX-1 é expressa em muitas células e tem papel na agregação plaquetária, secreção gástrica e função renal. A enzima COX-2 é expressa em células inflamatórias e neurônios excitatórios e sua expressão é regulada por muitos estímulos, tais como, os mediadores inflamatórios. O AA é convertido a prostaglandina PGH2 pela COX-1 ou COX-2. As isoenzimas catalisam dois passos de reação, primeiro agem no AA para formar PGG 2 e, então, reduzindo a forma PGH2. Estas PGs primárias, por assim dizer, têm pouca atividade, mas são substrato para formação das diversas PGs com atividade, como PGD2, PGE2, PGF2α, prostaciclinas (PGI2) e também dos tromboxanos (TX). As PGs e TXs liberados por essas enzimas estão envolvidos na inflamação. As PGs têm ação vasodilatadora, enquanto os TXs (predominante nas plaquetas), causam efeitos contrários como vasoconstrição e agregação plaquetária (Rocca e Fitzgeral, 2002; Rocha et al., 2003) (Figura 7). 2.10.1 Leucotrienos Os LTs, assim como outros eicosanoides, são produzidos rapidamente a partir do metabolismo do AA pela via da enzima 5-lipoxigenase (5-LOX) após ativação celular. As lipoxigenases (5-LOX, 12-LOX e 15-LOX) constituem uma família de enzimas citoplasmáticas, classificadas de acordo com a posição na qual oxidam o AA (Flamand et al., 2007). Na ausência de sinais inflamatórios, a 5-LOX localiza-se no citoplasma ou no nucleoplasma, e mediante estímulo, ela transloca-se para a membrana nuclear, na qual se liga e inicia a metabolização do AA (Brock et al., 1994; Woods et al., 1995). O AA liberado da membrana nuclear por ação da cPLA 2 é quimicamente modificado pela 5-LOX, a qual é auxiliada pela proteína ativadora da 5-LOX chamada FLAP (5-LOX activating protein). A 5-LOX catalisa a inserção de oxigênio molecular na molécula do AA, levando à formação do ácido 5-

46 hidroperoxieicosatetraenóico

(5-HPETE),

assim

como

subsequente

desidratação e formação de LTA4 (Needleman et al., 1986). O LTDA4 pode ser hidrolisado pela enzima LTDA4 hidrolase para formar LTB4 ou ser conjugado com glutationa pela enzima LTC4 sintase para produzir LTC4. O LTC4 intracelular é transportado através da membrana e convertido em LTD4 e LTE4 (Flamand et al., 2007; Lewis e Austen, 1984). LTC4, LTD4 e LTE4 apresentam um resíduo de cisteína em comum e efeitos similares e são chamados coletivamente de cisteinil LT (CysLT). Alternativamente, o LTA 4 pode ser metabolizado pela enzima 15-LOX, originando a lipoxina A4 (LXA4) (Flamand et al., 2007) (Figura 7).

Figura 7: Síntese e função dos eicosanóides na inflamação. Fonte: Gil, 2010.

Desde 1980, quando foi descrito pela primeira vez que o LTB 4 era capaz de induzir a migração de neutrófilos in vitro, os LTs vêm ganhando importante reconhecimento nos processos inflamatórios (Ford-Hutchinson et al., 1980; Genis et al., 1992; Sakid e Luster, 2012). Os LTs são produzidos principalmente

por

granulócitos

e

células

mononucleares.

Neutrófilos,

monócitos, macrófagos, células dendríticas e linfócitos B humanos produzem

47 principalmente LTB4, enquanto eosinófilos e mastócitos produzem LTC4 (Flamand et al., 2007a). O LTB4 interage especificamente com os receptores BLT 1 e BLT2. A expressão do receptor BLT1 é restrita a neutrófilos, macrófagos, esosinófilos, mastócitos e células dendríticas (Luster e Tager, 1984; Tager e Bromley, 2003; Tager e Luster, 2003), enquanto o receptor BLT 2 é expresso constitutivamente na maioria dos tecidos do organismo (Luster e Tager, 1984). Ativação de BLT 1 induz a quimiotaxia e adesão firme dos leucócitos. Em neutrófilos, LTB 4 induz a degranulação e a produção de EROs e inibe a apoptose, enquanto que, em monócitos/ macrófagos, induz fagocitose expressão de CCL-2 (Showell et al., 1995; Huang et al., 2004). Além destes dois receptores, o LTB4 também pode interagir com o fator de transcrição nuclear NF-B induzindo resposta inflamatória (Bäck et al., 2005; Serezani et al., 2011). Além de neutrófilos e macrófagos, o LTB4 também pode ativar as funções dos linfócitosT CD4 + e CD8+ e das células NK (Rola-Pleszczynski et al., 1983; Stankova et al., 1992; Marcinkiewicz et al.,1997).

Figura 8: Resumo geral dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na isquemia e reperfusão cerebral. Fonte: Bruno Costa Silva.

48 2.11 Papel da 5-Lipoxigenase na I/R cerebral A 5-LOX, uma enzima chave na biossíntese de LTs, está implicada em várias doenças inflamatórias, incluindo AVEi e Alzheimer (Manev, et al., 2011; Shi et al., 2013). Por volta dos anos 80 apareceram os primeiros trabalhos em roedores demonstrando a presença dos leucotrienos na I/R cerebral (Moskowitz et al., 1984), bem como o papel desses no processo patológico (Rao et al., 1999). Estudos em ratos, mostraram o aumento da expressão de receptores para leucócitos tanto na isquemia focal permanente quanto na isquemia global transitória. A expressão desses receptores aumentava o dano cerebral, enquanto uso de antagonistas promoviam neuroproteção (Zhang e Wei, 2003; Fang et al., 2006). Na isquemia cerebral transitória ocorre uma série de eventos metabólicos que conduzem finalmente à morte neuronal. Um evento crítico é a degradação dos lipídios da membrana e consequente acúmulo de ácidos graxos poliinsaturados, em particular o AA (Rao et al., 1999). Seu acúmulo é maior nas regiões cerebrais mais susceptíveis a I/R (Westerberg et al., 1987; Katsuki e Okuda, 1995; Kubota et al., 1998). Os danos cerebrais causados pela I/R são devidos, em parte, pela lesão secundária da inflamação (del Zoppo et al., 2000; Jatana et al., 2006) e pela exacerbação da inflamação pelo aumento da peroxidação lipídica, o que finalmente, aumenta a morte neuronal (Juurlink e Paterson, 1998). A importância da 5-LOX no curso da I/R tem sido comprovada por diversos trabalhos (Baskaya et al., 1996; Helgadottir et al., 2004; Helgadottir et al., 2005; Zhou et al., 2006) que demonstraram que a expressão da 5-LOX, bem como os níveis de leucotrienos estão elevados no cérebro isquêmico (Ohtsuki et al., 1995; Ciceri et al., 2001; Zhan et al., 2003). A 5-LOX também foi documentada em cérebros isquêmicos de seres humanos, sendo expressa em monócitos perivasculares (Tomimoto et al., 2002). Um estudo imuno-histoquímico demonstrou aumento da expressão de 5LOX nos neurônios e micróglias de ratos submetidos a I/R (Jatana et al., 2006). A 5-LOX medeia a geração de espécies reativas de oxigênio, que estão implicadas na ativação do NF-B (Bonizzi et al., 1999). NF-B é um fator de

49 transcrição

chave

envolvido

na

expressão

induzível

de

mediadores

inflamatórios, tais como a iNOS, TNF-α e IL-1β, os quais são os principais mecanismos pelo qual a inflamação contribui para lesão isquêmica cerebral (Saito et al., 1996; Ridder e Schwaninger, 2009). (Figura 6). A atenuação da expressão de iNOS e da produção de NO apresenta efeito neuroprotetor (Tu et al., 2009). A inibição de NF-B resulta em uma redução significativa de danos cerebrais nos modelos de isquemia cerebral transitória ou permanente, o que sugere que o NF-B desempenha um papel nocivo no AVEi (Schneider et al., 1999; Nurmi et al., 2004). Zhou e colaboradores (2006) demonstraram que a expressão da 5-LOX, tanto a proteína quanto o RNAm, estão aumentados na área isquêmica de 12 a 24 horas após a reperfusão, enquanto que, na região de penumbra, o aumento foi observado de sete a 14 dias após. Em um modelo de isquemia transitório em gerbil foi demonstrado que, durante a fase de reperfusão, os neurônios apresentaram imunorreatividade da 5-LOX e redistribuição da enzima no citosol depois de três minutos de reperfusão. Além disso, os níveis de LTC 4 foram aumentados em todas as regiões do prosencéfalo durante a reperfusão, e esses aumentos pós-isquêmicos não foram homogêneos, um maior aumento foi observado no hipocampo em relação ao córtex cerebral. Assim Ohtsuki e colaboradores (1995) sugeriram que na fase de reperfusão com a translocação citosólica da 5-LOX para a membrana dos neurônios induzindo a biossíntese de LTC4 poderia estar relacionada com as lesões por reperfusão irreversíveis nos neurônios do hipocampo. Inibidores seletivos da 5-LOX como o AA-861 e BW-B70C foram demonstrados como protetores da lesão isquêmica em modelo de isquemia cerebral focal (Baskaya et al., 1996; Jatana et al., 2006). Uma vez que os LTs dispõem de uma grande variedade de efeitos biológicos, não é surpreendente que a sua biossíntese celular seja finamente regulada. Baseado nesses conhecimentos acerca da regulação da via 5-LOX, torna-se evidente que a biossíntese de LTs é modulada por múltiplos mecanismos, incluindo expressão de genes, efeitos de citocinas, movimento de enzimas e compartimentalização da via 5-LOX.

50 2.12 Zileuton Zileuton é uma molécula categorizada como inibidor da 5-lipoxigenase pertencente à classe dos benzotiofenos (Figura 9). É comercializado desde 1996 e é um inibidor seletivo da 5-LOX usado no tratamento crônico e profilático da asma (Berger et al., 2007).

Figura 9: Estrutura química do Zileuton (Fonte: DrugBank).

Por sua ação seletiva na 5-LOX, Zileuton já foi investigado em outros modelos de inflamação. Seu uso reduziu a migração celular na cavidade pleural induzida por LPS (Costa et al., 2010). Apresentou efeitos protetores contra estresse oxidativo cerebral e antiinflamatório em ratos submetidos a isquemia cerebral (Czubowicz et al., 2010; Tu et al., 2010). Patel e colaboradores (2004) demonstraram que Zileuton reduziu a disfunção e inflamação em camundongos submetidos a I/R bilateral renal. Nesse trabalho houve diminuição da expressão de ICAM-1 e da atividade da MPO, bem como redução do infiltrado de neutrófilos. Em modelos de I/R na pele, Zileuton reduz a expressão de CD18 e 2-integrinas entretanto (Dolan et al., 1998). Doses orais de Zileuton inibiram a biossíntese LTB4 em ratos, cães, macacos e ovelhas. Nos cães, uma dose oral de 5mg/Kg promoveu inibição completa da formação de leucotrienos durante pelo menos 24 horas (Bell et al., 1992). Vários estudos sugerem que LTs desempenham um papel importante na doença atópica tanto em seres humanos quanto nos cães (Kietzmann et al., 1990; Shichijo et al., 1995). Zileuton, administrado por via oral, na dose de 2mg/kg, três vezes ao dia durante quatro semanas promoveu diminuição significativa do eritema em cães com dermatite atópica. Entretanto, o tratamento não teve nenhum efeito sobre o prurido. Zileuton foi bem tolerado

51 por esses animais e não foram observados efeitos adversos (Crow et al., 2001). Um estudo recente demonstrou que Zileuton protegeu a lesão da medula espinhal em ratos por meio da atenuação da expressão de TNF-α, COX-2, PGE2 e LTB4, além da redução da infiltração de neutrófilos e da apoptose (Genovese et al., 2008). Trabalhos recentes demonstraram que Zileuton atenua o dano cerebral isquêmico no modelo de isquemia cerebral focal permanente em ratos. Nesse trabalho, Zileuton reduziu o edema cerebral e o volume de infarto 24 horas após a oclusão permanente da artéria cerebral média (MCAO) e também diminuiu a expressão da 5-LOX e MMP9 (Tu et al., 2009). Nesse mesmo estudo, demostraram que ele inibiu a atividade enzimática da MPO em ratos. A MPO, uma enzima exclusiva para os neutrófilos, normalmente é utilizada para indicação quantitativa da presença da reação inflamatória no cérebro isquêmico (Lerouet et al., 2002). Foi demonstrado também que Zileuton foi capaz de reduzir o processo inflamatório e a apoptose neuronal em ratos submetidos a isquemia focal permanente (Tu et al., 2010; Shi et al., 2013).

52 3 Relevância e Justificativa O AVE é a terceira principal causa de morte e mais frequente causa de incapacidade permanente em todo o mundo e a inflamação parece desempenhar um papel importante na patogênese da I/R. Na maioria dos pacientes com AVE, apenas uma área do tecido cerebral é irreversivelmente danificada no aparecimento inicial da isquemia. O tecido cerebral circundante ao núcleo isquêmico tem o potencial de recuperar a maior parte das suas funções em condições favoráveis fornecidas por intervenção terapêutica. Assim, o resultado final do curso não é determinado apenas pelo volume da área isquêmica, mas também pela extensão do dano cerebral secundário causados pela apoptose e inflamação (Olsen; Bruhn; Oberg, 1985). Embora os mecanismos

fisiopatológicos

da

I/R

cerebral

não

são

totalmente

compreendidos, estudos recentes implicam a inflamação do cérebro como um componente importante desse processo (del Zoppo, 1994; del Zoppo et al., 1997; Feuerstein et al., 1994; Feuerstein et al., 1998). Trabalhos realizados anteriormente demonstraram que Zileuton, um inibidor seletivo da 5-LOX, atenuou os danos cerebrais isquêmicos em ratos com isquemia cerebral focal permanente (Tu et al., 2009; Tu et al., 2010; Shi et al., 2013) e global (Zheng et al., 2011; Chen et al., 2013). No entanto, não existem estudos avaliando o efeito do Zileuton sobre o processo inflamatório em camundongos submetidos à I/R cerebral global transitória. Sugere-se que a inibição da 5-LOX pelo Zileuton possa promover neuroproteção, minimizando os efeitos deletérios encontrados na I/R cerebral em camundongos. Assim torna-se importante conhecer os mecanismos envolvidos na lesão e reparação cerebral com o objetivo de diminuir os danos e suas consequências, bem como procurar terapias mais efetivas. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos. No capítulo 1, objetivou-se a padronização do modelo de isquemia global transitória unilateral e reperfusão, com a descrição dos parâmetros comportamentais, patológicos e inflamatórios. No capítulo 2 avaliamos a inibição da 5-LOX (Zileuton) na isquemia global bilateral e transitória.