Jahrbuch 2010/2011 | Höbartner, Claudia | DNA-Enzyme als W erkzeuge für die Herstellung chemisch modifizierter RNA

DNA-Enzyme als Werkzeuge für die Herstellung chemisch modifizierter RNA DNA enzymes as tools for the synthesis of chemically modified RNA Höbartner, Claudia Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen Korrespondierender Autor E-Mail: [email protected]

Zusammenfassung Die Synthese chemisch markierter RNA ist häufig Voraussetzung für biophysikalische Untersuchungen von RNA und

RNA-Protein-Interaktionen.

Die

Festphasensynthese

ermöglicht

den

positionsspezifischen

Einbau

modifizierter Nukleotide in relativ kurze RNAs. Längere modifizierte RNAs sind durch kombinierte chemische und enzymatische Verfahren zugänglich. DNA-Enzyme sind katalytisch aktive DNAs, die durch In-vitro-Selektion aus Zufallsbibliotheken isoliert w erden. DNA-Enzyme können für die Ligation von RNA-Fragmenten eingesetzt w erden und w erden für die direkte Modifikation von RNA entw ickelt.

Summary The synthesis of chemically modified RNA is often a prerequisite for biophysical investigations of RNA and RNAprotein

interactions. Solid-phase

synthesis

enables

site-specific modification

of relatively short

RNA

oligonucleotides. Larger modified RNA targets are accessible by a combination of chemical and enzymatic approaches. DNA enzymes are artificial catalytically active DNA molecules that have been identified by in vitro selection from random DNA pools. DNA enyzmes can be used for the ligation of RNA fragments and are currently developed into tools for the direct modification of RNA.

Über die Bedeutung chemisch modifizierter RNA Die Nukleinsäuren DNA und RNA sind von zentraler Bedeutung für alle lebenden Organismen. Die w ichtige Rolle von DNA als Speicher der Erbinformation ist allgemein bekannt. RNA hat die Aufgabe der korrekten Übertragung der Information von der DNA zu den Proteinen. Seit der Entdeckung der katalytischen Aktivität von

RNA

in

den

1980er-Jahren

w urde

eine

Vielzahl

neuer

biologischer

Aufgaben

von

strukturell

unterschiedlichen RNAs erkannt. Diese reichen von der Katalyse von RNA-Reifungsprozessen über die Erkennung von spezifischen Stoffw echselprodukten bis zur gezielten Regulation der Genexpression. Die Grundlage für diese vielfältigen Aufgaben liegt in der Fähigkeit der RNA, unterschiedlichste Strukturen einnehmen und schnell zw ischen alternativen Faltungen w echseln zu können. W ie diese Strukturänderungen auf

molekularer

Ebene

verlaufen,

ist

unzureichend

bekannt.

Unterschiedliche

biochemische

und

biophysikalische Methoden stehen zur Aufklärung von RNA-Faltungs- und Erkennungsmechanismen zur © 2011 Max-Planck-Gesellschaft

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Verfügung. Viele dieser Techniken sind jedoch abhängig von der Anw esenheit bestimmter chemischer Markierungen für die Signaldetektion. Beispiele dafür sind spezielle chromophore Markierungen für die Fluoreszenzspektroskopie, schw ere Isotope für die NMR-Spektroskopie, paramagnetische Gruppen für die EPR-Spektroskopie oder auch schw ere Atome für die Lösung des Phasenproblems in der Kristallographie. Die chemische Synthese von Nukleinsäuren bietet die Möglichkeit, solche Markierungen positionsspezifisch in RNA und DNA einzubringen [1].

Chemische Synthese modifizierter RNA Funktionalisierte Nukleotide w erden meistens über chemische Synthese oder eine Kombination aus chemischer und enzymatischer Synthese eingebaut. Dabei können modifizierte Nukleoside bereits die gew ünschte Markierung tragen. Falls das nicht möglich ist, w erden Nukleosidanaloga verw endet, die mit reaktiven funktionellen Gruppen ausgestattet sind, an die biophysikalische Markierungen in einem postsynthetischen Schritt konjugiert w erden. Als Beispiel sei hier die Synthese von paramagnetisch markierter RNA erw ähnt, die in der EPR-Spektroskopie eingesetzt w ird. Mehrere Methoden zur Spinmarkierung von RNA w urden bereits beschrieben. Dennoch ist die einfache Herstellung von spinmarkierter RNA immer noch eine der großen Herausforderungen für die universelle Anw endung moderner EPR-Techniken.

Abb. 1: Spinmarkierte RNA für die EPR-Spektroskopie mit Nitroxylradikal-haltigen Nukleosiden AT, CT, G T. Die rot gekennzeichneten Spinmarkierungen wurden durch Substitution geeigneter Abgangsgruppen an „konvertierbaren Nukleosiden“ eingeführt. © Ma x -P la nck -Institut für biophysik a lische C he m ie

In der Arbeitsgruppe Nukleinsäurechemie w urde eine experimentell einfache und sehr effiziente Methode zur Herstellung von qualitativ hochw ertiger paramagnetischer RNA entw ickelt [2]. Dazu w urde ein Verfahren angew endet, das auf der postsynthetischen Substitution vorfunktionalisierter Nukleoside beruht (Abb. 1). In Zusammenarbeit mit der Forschungsgruppe Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (unter der Leitung von Marina Bennati) w urden die spinmarkierten RNAs charakterisiert. Die einfache Zugänglichkeit und die gute Qualität der RNA sow ie

der EPR-spektroskopischen Daten bieten eine

gute

Voraussetzung für die

Untersuchung komplexer RNA-Strukturen und RNA-Protein-Komplexe. Die Festphasensynthese erlaubt die verlässliche Bereitstellung von kurzen modifizierten RNA-Strängen bis zu einer Länge von ca. 50 Nukleotiden. Für längere RNA-Zielmoleküle ist die Kombination von chemischer Synthese und enzymatischer Ligation notw endig. Häufig w erden dafür die Proteinenzyme T4 RNA und T4 DNALigase eingesetzt. Eine vielversprechende Alternative ist die Anw endung von DNA-Enzymen, sogenannten Desoxyribozymen, die die Verknüpfung von RNA-Fragmenten ermöglichen.

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Jahrbuch 2010/2011 | Höbartner, Claudia | DNA-Enzyme als W erkzeuge für die Herstellung chemisch modifizierter RNA Katalytisch aktive Nukleinsäuren: Ribozyme und Desoxyribozyme

Abb.2: Schematische Darstellung der In-vitro-Selektion. In einem katalytischen Prozess werden Nukleinsäuren aus einer Zufallsbibliothek so lange sortiert und vervielfältigt, bis die gewünschte Aktivität erhalten wird. © Ma x -P la nck -Institut für biophysik a lische C he m ie

Aus chemischer Sicht haben RNA und DNA viele Gemeinsamkeiten und teilen auch so manche unerw artete Funktion. Die offensichtlichste Gemeinsamkeit ist die Fähigkeit zur Watson-Crick-Basenpaarung, aber auch so komplexe Aufgaben w ie spezielle chemische Katalyse können von RNA und DNA gleichermaßen bew erkstelligt w erden. In der Natur kommen katalytische Nukleinsäuren als Ribozyme (=katalytische RNA) vor und ermöglichen lebensw ichtige Reaktionen der RNA-Reifung und der Proteinbiosynthese. Katalytische DNA (= DNA- Enzyme oder Desoxyribozyme) hingegen w urden in der Natur bisher nicht gefunden. Es handelt sich um synthetische, einzelsträngige DNAs, die im Labor mittels In-vitro-Selektion identifiziert w erden. Dabei w erden in einem zyklischen Prozess DNA-Moleküle aus einer Zufallsbibliothek so lange sortiert und vervielfältigt, bis man Kandidaten mit den gew ünschten Eigenschaften erhält (Abb. 2). Seit dem Bericht über DNA-katalysierte Spaltung von RNA-Phosphodiesterbindungen w urde

eine

Vielzahl von Desoxyribozymen bekannt, die

chemische Transformationen mit hoher Selektivität katalysieren. Praktische Anw end ungen von DNA-Enzymen reichen von der Verw endung als analytische und syn thetische Werkzeuge

bis zu ihrer Entw icklung als

molekulare Schaltelemente und therapeutische W irkstoffe[3].

DNA-katalysierte RNA-Ligation Eine Klasse von DNA-Enyzmen katalysiert die lineare Ligation zw eier RNA-Substrate unter Ausbildung der nativen 3’-5’-Phosphodiesterbindung (Abb. 3), [4]. Diese DNAs stellen eine experimentell attraktive Alternative zu RNA-ligierenden Proteinenzymen dar, die bisher zur Verknüpfung kurzer modifizierter RNA-Fragmente verw endet w erden. Diese Metallionen-abhängigen DNA- Enzyme w urden durch In-vitro-Selektion erhalten, jedoch nicht im Detail charakterisiert oder optimiert. DNA-Enzyme bevorzugen gew isse RNA-Ligationsstellen, w as die allgemeine Anw endbarkeit derzeit auf eine Untergruppe der 16 möglichen Dinukleotidverknüpfungen beschränkt. Die molekularen Gründe dafür sind noch nicht bekannt, jedoch sollte ein besseres Verständnis des Reaktionsmechanismus nützliche Hinw eise zur rationalen Optimierung liefern.

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Abb. 3. a) Schematische Darstellung eines DNA-Enzyms. Die Substrate (rot und blau) bilden mit den Bindungsarmen (grau) Watson-Crick-Basenpaare aus. Der katalytisch aktive Bereich aus einzelsträngiger DNA ist grün dargestellt. b) DNA-katalysierte Ligation von RNA. Das 9DB1-Desoxyribozym verknüpft zwei RNAFragmente über eine natürliche 3’-5’-Phosphodiesterbindung. c) Die 7S11-DNA katalysiert die Bildung von 2’,5’-verzweiger RNA. d) Detailliertes Schema der 7S11-katalysierten Reaktion in Anwesenheit von Mg2+ . © Ma x -P la nck -Institut für biophysik a lische C he m ie

Eine w eitere Klasse von Desoxyribozymen kann 2’,5’-verzw eigte RNA herstellen, indem eine 2’-OH Gruppe innerhalb des RNA-Substrats für den nukleophilen Angriff auf eine 5’-Triphosphat Gruppe aktiviert w ird ( Abb. 3), [5]. Das 2’,5’-verzw eigte RNA-Produkt entspricht dem zentralen Kern der Lariat-RNA, einem w ichtigen Intermediat der mRNA-Reifung w ährend des RNA-Spleißens. Ausgehend von diesen verzw eigenden DNAEnzymen konnte gezeigt w erden, dass DNA auch kleine Moleküle als Substrate für die Bindungsknüpfung verw enden kann [6]. Das ist der Ausgangspunkt für die Entw icklung von DNA-Katalysatoren für die gezielte chemische Modifikation von RNA.

Mechanismen DNA-katalysierter Reaktionen Von keinem einzigen DNA-Enzym konnte bisher die dreidimensionale Struktur in einer aktiven Konformation aufgeklärt w erden, und der genaue chemische Mechanismus DNA-katalysierter Reaktionen ist nicht bekannt. Ein w ichtiger Schritt zum Verständnis des Mechanismus ist die Identifizierung der aktiven Nukleotide und die Bestimmung der an der Katalyse beteiligten funktionellen Gruppen. Traditionelle Methoden basieren auf dem Austausch einzelner Nukleotide und der zeit- und arbeitsintensiven Charakterisierung der Reaktionskinetik einzelner Mutanten. Alternative Methoden, die schnell und verlässlich die an der Katalyse beteiligten Nukleotide und funktionellen Gruppen identifizieren können, leisten daher einen w esentlichen Beitrag zur Aufklärung der Ligationsmechanismen.

Kombinatorische Mutationsinterferenz-Analyse (CoMA) In der Arbeitsgruppe Nukleinsäurechemie w urde eine Methode entw ickelt, die eine schnelle und umfassende Untersuchung

der

an

der

DNA-Katalyse

beteiligten

Nukleotide

erlaubt

[7].

Diese

kombinatorische

Mutationsinterferenz-Analyse (CoMA) basiert auf der chemischen Synthese von Mutationsbibliotheken mit statistisch verteilten Basenmutationen. Dabei entstehen inaktive DNA-Enzym-Derivate, die von den aktiven Mutanten abgetrennt w erden. Anschließend w erden die Nukleotidpositionen bestimmt, an denen die Mutation

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Jahrbuch 2010/2011 | Höbartner, Claudia | DNA-Enzyme als W erkzeuge für die Herstellung chemisch modifizierter RNA einen negativen Effekt auf die Aktivität hatte. Dabei macht man sich zunutze, dass die DNA keine 2’Hydroxygruppe besitzt. Die Mutationen w erden nämlich als Ribonukleotide eingebaut, und durch spezifische Spaltung des DNA-Strangs an den mutierten Positionen kann dann das Interferenzmuster auf einem Sequenziergel abgelesen w erden. Diese Methode liefert verlässliche Informationen über den Beitrag jedes einzelnen Nukleotids und trägt damit erheblich zur vereinfachten Auffindung der minimalen katalytischen Einheit bei. Im Fall der RNA-ligierenden Desoxyribozyme konnte eine Gruppe von funktionellen Nukleotiden identifiziert w erden, die für die Ausbildung von RNA-Phosphodiesterbindungen essentiell sind. Diese kombinatorische Analysenmethode w urde auch für die Analyse w eiterer DNA-Enzyme verw endet und verspricht großes Potenzial als allgemein anw endbare Technik für die Untersuchung von einzelsträngiger funktionaler DNA. DNA ist ein attraktives chemisches Werkzeug zur posttranskript ionalen Manipulation von RNA. In der Form von Desoxyribozymen vereint sie die Fähigkeiten von spezifischer Basenpaarung und katalytischer Aktivität in einem DNA-Molekül. Die praktischen Vorteile von DNA als molekulares Werkzeug sind die einfache und billige chemische Synthese beliebiger Sequenzen, die gute chemische Stabilität, die einfache W iedergew innung sow ie die unkomplizierte Entfaltung und Renaturierung der DNA-Enzyme. Da viele biochemische und biophysikalische Methoden auf der Verw endung positions spezifisch markierter RNA und RNA-Protein-Komplexe basieren, w ird die Optimierung der DNA-basierten Technologien w ertvolle Beiträge zur Aufklärung der vielfältigen Funktionen und komplexen Strukturen natürlicher RNAs liefern. [1] F. Wachowius, C. Höbartner: Chemical RNA modifications for studies of RNA structures and dynamics. ChemBioChem 11, 469-480 (2010). [2] G. Sicoli, F. Wachowius, M. Bennati, C. Höbartner: Probing secondary structures of spin-labeled RNA by pulsed EPR spectroscopy. Angew andte Chemie International Edition 49, 6443-6447 (2010). [3] K. Schlosser, Y . Li: Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chemistry & Biology 16, 311-322 (2009). [4] W. E. Purtha, R. L. Coppins, M. K. Smalley, S. K. Silverman: General deoxyribozyme-catalyzed synthesis of native 3'-5' RNA linkages. Journal of the American Chemical Society 127, 13124-13125 (2005). [5] S. K. Silverman: Deoxyribozymes: Selection design and serendipity in the development of DNA catalysts. Accounts of Chemical Research 42, 1521-1531 (2009). [6] C. Höbartner, S. K. Silverman: Engineering a selective small-molecule substrate binding site into a deoxyribozyme. Angew andte Chemie International Edition 46, 7420-7424 (2007). [7] F. Wachowius, F. JavadiZarnaghi, C. Höbartner: Combinatorial mutation interference analysis reveals functional nucleotides required for DNA catalysis. Angew andte Chemie International Edition 49, 8504-8508 (2010).

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