Aus dem Institut für Tierzucht und Tierhaltung der Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

CAMPYLOBACTER SPP., YERSINIA SPP. AND SALMONELLA SPP. AS ZOONOTIC PATHOGENS IN PIG PRODUCTION

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

vorgelegt von Master of Science TANJA WEHEBRINK aus Rahden, Nordrhein-Westfalen

Dekan: Prof. Dr. Joachim Krieter Erster Berichterstatter: Prof. Dr. Joachim Krieter Zweiter Berichterstatter: Prof. Dr. Edgar Schallenberger Tag der mündlichen Prüfung: 3. Mai 2007 Die Dissertation wurde mit dankenswerter finanzieller Unterstützung der H. Wilhelm Schaumann Stiftung, dem Ministerium für Soziales, Gesundheit, Familie, Jugend und Senioren des Landes Schleswig-Holstein und der Arbeitsgruppe Lebensmittelqualität und -sicherheit (QUASI) der Agrar- und Ernährungswissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel angefertigt

TABLE OF CONTENTS

GENERAL INTRODUCTION ………………………………………………………………………………………………… 1 CHAPTER ONE Campylobacter spp. und Yersinia spp. beim Schwein: ein Überblick ………………………………………………………………………………………………… 3 CHAPTER TWO Prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. in the pig production ………………………………………………………………………………………………. 19 CHAPTER THREE Campylobacter spp.: Risk factor analysis in fattening farms ………………………………………………………………………………………………. 37 CHAPTER FOUR Simulation study on the epidemiology of Salmonella spp. in the pork supply chain ………………………………………………………………………………………………. 53 GENERAL DISCUSSION ………………………………………………………………………………………………. 73 GENERAL SUMMARY ………………………………………………………………………………………………. 85 ZUSAMMENFASSUNG ………………………………………………………………………………………………. 89

GENERAL INTRODUCTION Any disease and/or infection which is naturally "transmissible from vertebrate animals to man" is classified as a zooanthroponosis according to EU-directive 92/117 (1992). To date, over 200 zooanthroponoses have been described, involving all types of agents bacteria, parasites and viruses (Krauss et al., 2004). The main part of zoonotic agents is represented by bacterial pathogens. Every year millions of people become sick because of food-borne zoonoses such as salmonellosis, campylobacteriosis or yersiniosis causing fever, diarrhoea, abdominal pain, malaise and nausea. Other bacterial zoonoses are: anthrax, brucellosis, E. coli-infections, leptospirosis, plague, shigellosis and tularaemia. The second group of zooanthroponoses causing pathogens are parasites. In Latin America for example, 100 out of 100,000 inhabitants are estimated to suffer from cysticercosis (World Health Organisation, 2007). Other parasitical zoonoses are echinococcosis/hydatidosis, toxoplasmosis and trematodosis (Heeschen, 2005). The third class of zoonotic pathogens are viruses. Rabies is a disease of carnivores and bats mainly transmitted to humans by bites. Almost all persons severely exposed to rabid animals will die if left untreated. An estimated number of 55,000 persons, mainly children, die of this disease in the world every year (World Health Organisation, 2007). Other viral zoonoses are avian influenza, Crimean-Congo haemorrhagic fever, ebola and Rift Valley fever (Krauss et al., 2004). As bacterial pathogens are mainly responsible for zoonoses the following thesis concentrates on this important group, especially gram-negative enterobacteriaceae. Zooanthroponoses even though the estimated number of unreported cases is much higher than of the reported ones. These zooanthroponoses affect hundred thousands of people especially in developing countries, although most of them can be prevented. The aim of the present thesis was to contribute to a better understanding of the bacterial zoonotic pathogens Campylobacter spp., Yersinia spp. and Salmonella spp. causing disease in humans and animals and to use this information to assess and manage the risk to animals and humans. CHAPTER ONE summarises several studies emphasising the importance of Campylobacter spp. and Yersinia spp. as widespread pathogens in the pig production chain. First, the taxonomy and the pathogen character are described, and second, prevalence in the pig production is reported.

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The objective of CHAPTER TWO was to gather further information about the prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. at different stages of the pig production chain via cultural isolation. Samples were taken from sows, suckling piglets, growing and finishing pigs, carcasses, raw meat, forage and their environment (separating plate, feeding trough). A further purpose in CHAPTER THREE was to increase the knowledge about the sources of infection from Campylobacter spp. and their qualitative and quantitative importance in pig production. Analysis of the data from questionnaires from the corresponding pig farms provided first indications of factors which may influence the prevalence of Campylobacter spp. in herds. CHAPTER FOUR includes an exploration of possible measures that can be implemented in farrowing and fattening units to control the introduction and reduce the prevalence of Salmonella in finishing pigs. A stochastic state-transition simulation model was established to gather further information about the influence of the risk factors in the different pig production stages on the Salmonella spp. prevalence in fattening pigs. Furthermore, the influence of preventive arrangements of the immunisation of sows, and additionally, of pathogen-free purchased gilts on the Salmonella spp. prevalence in the farrowing and fattening unit were determined. References EU-directive 92/117 EWG des Rates vom 17. Dezember 1992 über Maßnahmen zum Schutz gegen bestimmte Zoonosen bzw. ihre Erreger bei Tieren und Erzeugnissen tierischen Ursprungs zur Verhütung lebensmittelbedingter Infektionen und Vergiftungen. Amtsblatt L62 vom 15.3.1993. Heeschen, W.H., 2005. Zoonosen und lebensmittelbedingte Erkrankungen. Systematische Übersicht der wichtigsten Bakterien, Viren und Parasiten. Behr’s Verlag, Hamburg. Krauss, H., Weber, A., Appel, M., Enders, B., Graevenitz, v.A., Isenberg, H.D., Schiefer, H.G., Slenczka, W., Zahner, H., 2004. Zoonosen. Von Tier zu Mensch übertragbare Infektionskrankheiten. 3. Auflage, Deutscher Ärzte-Verlag GmbH, Köln. WHO, 2007. World Health Organisation, http://www.who.int/en.

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Chapter One

Campylobacter spp. und Yersinia spp. beim Schwein: ein Überblick

TANJA WEHEBRINK1, NICOLE KEMPER1, ELISABETH GROSSE BEILAGE2 and JOACHIM KRIETER1

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Institute of Animal Breeding and Husbandry Christian-Albrechts-University D-24118 Kiel, Germany

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University of Veterinary Medicine Hannover Fieldstation for Epidemiology D-49456 Bakum, Germany

Accepted for publication in Züchtungskunde

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1.

Einleitung

Campylobacter spp.- und Yersinia enterocolitica- Infektionen zählen neben den Salmonella spp.- Infektionen zu den häufigsten gemeldeten Infektionskrankheiten des Menschen, die durch Lebensmittel übertragbar sind und Darminfektionen hervorrufen können. Im Jahr 2006 führten laut Robert Koch-Institut (2007) Infektionen durch Campylobacter spp. zu 51.764 Erkrankungsfällen in Deutschland. Bei Yersinia spp. lag die Höhe der Erkrankungsfälle im gleichem Jahr bei 5.135. Besondere Bedeutung kommt hier vor allem den thermophilen Spezies Campylobacter (C.) jejuni und C. coli zu, welche am häufigsten von an Enteritis erkrankten Personen isoliert wurden. Yersinia (Y.) enterocolitica ist neben Y. pestis und Y. pseudotuberculosis eine der drei humanpathogenen Yersinia-Spezies. Hier ist das Bioserovar 4/O:3 von besonderer Bedeutung, da dieses die Hauptursache humaner Yersiniosen im europäischen Raum ist. Beide Erkrankungen sind vor allem Kleinkindererkrankungen, bei der Campylobacteriose ist eine zweite Erkrankungshäufung im frühen Erwachsenenalter zu erkennen. Hauptsächlich äußern sich die Erkrankungen mit Durchfällen, aber auch schwere oder klinisch inapparente Verläufe sind zu beobachten. Ebenso sind Spätfolgen, wie beispielsweise das Erythema nodosum (Neubauer et al., 2001a), möglich. Bei Campylobacter spp. ist die geringe Infektionsdosis von 500-800 Keimen noch hervorzuheben (Black et al., 1988). Für beide Keime besteht seit Inkrafttreten des Infektionsschutzgesetzes im Jahr 2001 Meldepflicht. Da beide Infektionen beim Schwein in der Regel symptomlos verlaufen (Bätza, 1996) und somit weder im Bestand noch auf dem Schlachthof bei der Schlachttier- und Fleischuntersuchung erkannt werden, ist es möglich, dass diese Zooanthroponosenerreger in die Lebensmittelkette gelangen. Der vorliegende Artikel liefert eine Literaturzusammenfassung über diese zwei wichtigen Zooanthroponosenerreger, verdeutlicht die Erregereigenschaften und liefert einen Überblick über die Prävalenzen in der Schweineproduktion.

2.

Geschichte und Taxonomie

2.2

Campylobacter-Spezies

Der Kinderarzt Theodor Escherich beschrieb 1886 spiralig gewundene Bakterien, welche er aus dem Darminhalt von Säuglingen mit Diarrhoe isoliert hatte. Zwei Jahre später gelang ihm die Isolierung von ebenfalls spiralförmigen Darmbakterien von an Durchfall erkrankten Katzen, welche er Vibrio felinus nannte (Escherich, 1886). Im Jahre 1919 wurden diese 4

Bakterien auch bei abortierten Rinderfeten nachgewiesen und als Vibrio fetus bezeichnet (Smith und Taylor, 1919). Jones et al. (1931) fanden Vibrionen bei an Winterdysenterie erkrankten Kälbern und nannten sie aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu Vibrio fetus, aber dem Vorhandensein von andere Antigeneigenschaften, Vibrio jejuni. Weitere mikroaerophile Mikroorganismen wurden im Colon von dysenterischen Schweinen gefunden und wegen ihrer Vibrionenähnlichkeit mit der Bezeichnung Vibrio coli versehen (Doyle, 1944). King fand 1957 zwei Gruppen von Vibrionen in Blutkulturen von Patienten, die an einer hämorrhagischen Darmentzündung erkrankt waren. Die eine Gruppe war Vibrio fetus sehr ähnlich, die andere Gruppe beschrieb er als „related Vibrios“. Sebald und Veron (1963) stellten fest, dass sich die DNA dieser beiden Gruppen von der DNA der Gattung Vibrio im Guanin- und Cytosingehalt unterschied. Aufgrund dieser Erkenntnis wurde dieser neuen Spezies der Genusname Campylobacter gegeben, der aus dem Griechischen stammt und „gebogener Stab“ bedeutet. Die ersten Isolierungen aus Stuhlproben von an Durchfall erkrankten Patienten gelangen Anfang der siebziger Jahre (Butzler et al., 1973). Die Entwicklung verbesserter Nachweisverfahren für Campylobacter spp. führte zunehmend zu einer weltweiten Wahrnehmung insbesondere von C. coli und C. jejuni als bakterielle Enteritiserreger beim Menschen (Kist, 2002).

2.3

Yersinia-Spezies

Im Jahre 1934 wurde die erste anerkannte Beschreibung von Yersinia enterocolitica in den USA durch MCiver und Pike (1934) verfasst. Sie berichteten unter den Namen Flavobacterium pseudomallei über einen kleinen gramnegativen Kokkobazillus, welcher aus zwei Gesichtsabzessen einer Farmbewohnerin isoliert worden war. Sie hielten es aber für wahrscheinlicher, es mit einer atypischen Form eines bereits bekannten Erregers zu tun zu haben als mit einer neuen Spezies. Fünf Jahre später schenkten Schleifstein und Coleman (1939) der Beschreibung von MCiver und Pike Beachtung, als sie einen Keim untersuchten, der Ähnlichkeit mit Actinobacillus lignieresii und Pasteurella pseudotuberculosis hatte. Der Keim wurde aus dem Darminhalt isoliert, deshalb schlugen sie den Name Bacterium enterocoliticum vor. Der Gattungsname Yersinia wurde im Jahre 1944 durch Van Loghem zu Ehren von Alexandre Yersin, welcher 1894 in Hongkong während einer Pestepidemie den Erreger der Pest (ehemals Pasteurella pestis, heute Yersinia pestis) entdeckte, begründet. Im Jahre 1964 wurde das Bacterium enterocoliticum in Y. enterocolitica umbenannt und in die Familie der Enterobacteriaceae eingegliedert (Fredriksen, 1964). Im Jahr 1980 wurden vier Yersinia-Spezies etabliert: Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. frederiksenii und Y. kristensinii 5

(Brenner et al., 1980). Um eine Einteilung hinsichtlich Pathogenität und Epidemiologie der Y. enterocolitica-Isolate zu erhalten, wurde eine Zuordnung zu Biovaren geschaffen. Wauters et al. (1987) nahmen, aufgrund unterschiedlicher Substratverwertung, die Einteilung in sechs Biovare vor: 1A, 1B, sowie Biovar 2 bis 5. Biovar 1A fasst den überwiegenden Teil der bis dahin als apathogenen eingeschätzten Isolate zusammen. Die Biovare 2, 3, 4 und 5 enthalten die pathogenen europäischen, die Biovare 1B die pathogenen in Amerika isolierten Stämme. Die tierpathogenen Stämme gehören stets zu den Biotypen 3 oder 5 (Aleksic und Bockemühl, 1990). Zusätzlich zur Einteilung in Biovare wird in der Routinediagnostik eine Einteilung in Serovare vorgenommen. Die Serotypisierung basiert überwiegend auf O-Antigenen (Oberflächenantigen), seltener auf den H- (Geißel-) oder F- (Fimbrien) Antigen. Für YersiniaSpezies wurden bis heute 60 O- Gruppen gefunden, wovon 28 auf Y. enterocolitica entfallen (Aleksic und Bockemühl, 1990). Während bestimmte O- Antigene bei verschiedenen Spezies vorkommen, sind die H- Antigene Spezies-spezifisch und können daher auch zur direkten Identifizierung der Yersinia - Arten herangezogen werden. Bislang wurden 18 H- Faktoren bei Y. enterocolitica definiert. Hier sind bestimmte Kombinationen von H- Antigenfaktoren signifikant für pathogene Serotypen und können bei der Unterscheidung pathogener und apathogener Stämme hilfreich sein. Nach Befunden von Aleksic und Bockemühl (1990) sind die pathogenen Serotypen O:3, O:9 und O:5,27 von Y. enterocolitica stets mit den HAntigenen a,b; a,b,c; a,b,c,v; a,c; c oder b,c kombiniert. Der H- Antigenkomplex H: b,e,f,i kommt hingegen bei den fast ausschließlich in den USA auftretenden pathogenen Serovaren O:8; O:4,32; O:18; O:20 und O:21 von Y. enterocolitica vor (Aleksic und Bockemühl, 1990).

3.

Spezifische Eigenschaften

3.1

Campylobacter-Spezies

Nach Garrity et al. (2002) untergliedert sich die Familie der Campylobacteriaceae in Gattung I Campylobacter, Gattung II Arcobacter und Gattung III Sulfurospirillum. Zur Zeit sind 16 Spezies und 6 Subspezies von Campylobacter spp. anerkannt (On et al., 2001). Die humanpathogenen Campylobacter können in zwei Hauptgruppen eingeteilt werden: in die Durchfallerreger wie C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis und in die Erreger extraintestinaler Infektionen wie C. fetus (Hu und Kopecko, 2003). Bakterien der Gattung Campylobacter sind gramnegative, schlanke, kommaförmige, sporenlose Stäbchenbakterien, die ca. 0,2-0,5 µm breit und 0,5-5 µm lang sind (Rolle und Mayr, 2002). Sie können eine oder mehrere helikale Windungen besitzen und maximal bis zu 6

acht µm Länge erreichen. Die Bildung kurzer Ketten ist ebenfalls möglich. Sie erscheinen auch s-förmig und in älteren Kolonien können kokkoide Zellen auftreten. Charakteristisch ist die korkenzieherartige Bewegung, die durch die polare monotriche Begeißelung entsteht. Campylobacter spp. haben einen respiratorischen Stoffwechsel, verwerten Kohlenhydrate weder fermentativ noch oxidativ (d.h. sie sind „asaccharolytisch“) und ernähren sich von Zwischenprodukten aus dem Tricarbonsäurezyklus und von Aminosäuren (Anonymus, 1994). Eisen wird ebenfalls von Campylobacter spp. als essentieller Nährstoff benötigt (PARK, 2002). Die Vermehrung findet in Temperaturbereichen von 32°C bis 46°C bei mikroaerophilem Klima mit ca. 5% O2, 10% CO2 und 85% N2 statt (Hunt et al., 2001). Vermutlich ist die Mikroaerophilie auch ein Resultat der Adaption von Campylobacter spp. an die atmosphärische Zustände im Darm von warmblütigen Tieren und Vögeln (Park, 2002). Die minimale Wachstumstemperatur liegt bei thermophilen Campylobacter spp. bei 31°C bis 32°C. Unter 30°C sind die Keime nicht mehr wachstumsfähig. Somit ist eine Multiplikation während der Handhabung oder Lagerung von Lebensmitteln bei Zimmertemperatur ausgeschlossen (Jacobs-Reitsma, 2000). Die Ursache für die fehlende Vermehrung außerhalb des Tierkörpers und unterhalb von 30°C kann möglicherweise an der fehlenden Produktion von Kälteschockproteinen liegen (Parkhill et al., 2000). In kontaminierten Substraten haben thermophile Campylobacter spp. bei niedrigen Temperaturen eine höhere Überlebensfähigkeit als bei höheren Temperaturen. Während sie bei 4°C mehrere Wochen lebensfähig sind, sterben sie bei Temperaturen von 55°C ab (Wundt und Kasper, 1982). Die Keime sind sehr empfindlich gegenüber Trockenheit. Sie überleben nur kurze Zeit in trockener Atmosphäre. Bei aW-Werten kleiner als 0,97 sterben die Keime schnell ab. Lebensfähige Keime können nur von feuchten Oberflächen isoliert werden. Die Kombination aus Temperatur und Luftfeuchtigkeit scheint eine essentielle Rolle für das Überleben der Keime zu spielen (Doyle und Roman, 1982). Der pH-Wert des umgebenden Milieus beeinflusst das Überleben von Campylobacter spp. in Abhängigkeit von der Zeit und der Temperatur. Das pH-Optimum liegt bei Werten zwischen 6,5 und 7,5, das Maximum bei pH 9. Werte von über pH 9 und unter pH 4 führen zum raschen Absterben, besonders bei höheren Temperaturen (Gill und Harris, 1983). Campylobacter spp. lassen sich leicht durch ultraviolette Strahlen und Röntgenstrahlen abtöten. Gegen UV-Strahlen ist C. jejuni empfindlicher als Escherichia coli und Y. enterocolitica (Butler et al., 1987). Thermophile Campylobacter spp. können unter schwierigen Umgebungsbedingungen einen besonderen Zustand einnehmen, in dem sie lebensfähig aber nicht kultivierbar sind. Dieses 7

viable-but-nonculturable-Stadium (VBNC) ist auch bei anderen humanpathogenen Erregern wie z.B. Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Vibrio cholerae und Legionella pneumophila bekannt (Tholozan et al., 1999). Einige Autoren beschreiben diese Form als eine Art Schutzzustand, bei dem sich die Keime in einem Ruhestadium befinden und später, unter besseren Bedingungen, wieder wachsen können. Andere Verfasser bezeichnen dieses Stadium als eine degenerative Form des beginnenden Zelltodes. Die Bakterien bleiben in diesem Zustand aber infektionsfähig. Bei der Identifizierung der unterschiedlichen Campylobacter-Spezies wird zwischen genotypischen und phänotypischen Methoden unterschieden (Nachamkin et al., 2000). Bei den phänotypischen Methoden handelt es sich um relativ einfache, oft angewandte Tests, die auf dem Nachweis von biochemischen Reaktionen, verschiedenen Wachstumsparametern, Resistenzprofilen gegenüber Antibiotika und serologischen Verfahren beruhen. Jedoch verhalten sich Campylobacter spp. biochemisch inert, was die Differenzierung und Unterscheidung der Spezies erschwert. Die einzige Reaktion zur biochemischen Reaktion der beiden Spezies C. jejuni und C. coli ist die Hippurathydrolyse. Genotypische Methoden basieren auf dem Nachweis stabiler chromosonaler Unterschiede, die reproduzierbar und stark diskriminierend sind. Vor allem für die Typisierung von Stämmen und für die epidemiologische Fragestellung eignen sich diese Methoden gut.

3.2

Yersinia-Spezies

Yersinia ist eine Gattung innerhalb der Familie der Enterobacteriaceae und umfasst derzeit elf verschiedene Spezies. Yersinia pestis, der Erreger des „schwarzen Todes", einer Infektion, die im Mittelalter epidemisch auftrat, ist heute aus unseren Breitengraden verschwunden (Kayser et al., 1993), während Y. pseudotuberculosis und vor allem Y. enterocolitica als Erreger der menschlichen Yersiniose in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen hat (Bottone, 1999). Yersinia enterocolitica ist jedoch nicht ausschließlich als humanpathogener Erreger einzustufen. Neben pathogenen Vertretern dieser Spezies existieren noch eine Reihe von apathogenen Umweltisolaten, die diagnostisch abgegrenzt werden müssen (Neubauer et al., 2001b). Yersinia enterocolitica ist ein gramnegatives, fakultativ anaerobes, pleomorphes, peritrich begeißeltes Stäbchenbakterium, das eine Länge von 1,0-5,0 µm erreicht. Yersinien sind oxidasenegativ, katalasepositiv und reduzieren Nitrat und Nitrit (Aleksic und Bockemühl, 1990). Sie kommen ubiquitär vor und bilden keine Kapseln oder Sporen (Knapp, 1988).

8

Bei unter 28°C sind sie beweglich, darüber jedoch nicht, da die Geißeln in der Regel nur bei Temperaturen unter 30°C gebildet werden (Rolle und Mayr, 2002). Yersinia enterocolitica ist psychrotrop, das bedeutet, dass eine Vermehrung bei Kühlungstemperaturen bis 0°C möglich ist. Die optimale Wachstumstemperatur beträgt +30°C, wobei die Obergrenze der Vermehrungsfähigkeit bei +43°C liegt. Zur Bestimmung des Serotys sind zwischenzeitlich kommerzielle Test erhältlich, die auf einer Agglutinationsreaktion beruhen. In der Diagnostik des weltweit am häufigsten beim Menschen isolierten Serovars Y. enterocolitica Serotyp O:3 ist eine biochemische Charakterisierung zusätzlich zur Serotypisierung unumgänglich, um eine sichere Aussage über die klinische Relevanz eines Isolates (insbesondere bei klinischem Material und Umweltproben) treffen zu können, da dieses Serovar auch bei anderen verwandten YersinienSpezies oder Stämme des Biotyps 1A anzutreffen ist (Hoofar und Holmvig, 1999). Die bakteriologische Diagnostik pathogener Y. enterocolitica-Isolate ist bis heute mit hohem zeitlichen Aufwand verbunden, und mögliche Diagnosen können aufgrund mangelnder Spezifität und Sensitivität der zur Zeit verfügbaren Testsysteme immer nur unter Vorbehalt gestellt werden oder bedürfen in ihrer Interpretation eines hohen Maßes an Expertise. Bis heute ist trotz der hohen zoonotischen Bedeutung des Erregers keine einheitliche Methode zum

bakteriologischen

Nachweis

pathogener

Y.

enterocolitica-Isolate

beschrieben.

Erschwerend kommt hinzu, dass allein die Vielzahl der bis heute beschriebenen Untersuchungen zu widersprüchlichen Ergebnissen führt (Arnold, 2002).

4.

Prävalenzen und epidemiologische Aspekte in der Schweineproduktion

4.1

Campylobacter spp. und Yersinia spp. beim Schwein

Thermophile Campylobacter spp. scheinen keine Bedeutung für Erkrankungen bei Schweinen zu haben (Altekruse und Swerdlow, 2002). Der Keim ist wahrscheinlich der normalen Darmflora zuzurechnen (Görgen et al., 1983). Beim Schwein ist C. coli die verbreitetste Spezies mit Nachweisraten von bis zu 100%. Einzelne Untersuchungen zeigen aber auch, dass C. jejuni in bestimmten Beständen sehr häufig isoliert werden kann (Young et al., 2000). Viele Untersuchungen belegen, dass sich Campylobacter spp. häufig aus dem Kot gesunder Schweine isolieren lassen. Zu diesem Ergebnis kam auch Gaull (2002), der bei der Beprobung von Mast- und Schlachtschweinen Nachweisraten zwischen 70% und 93% ermittelten. Ähnliche Prävalenzen stellte auch Weijtens (1996) in einer Studie fest, in der er Mastschweine im Verlauf einer Mastperiode auf Campylobacter spp. untersuchte. Dabei 9

wurde bei 98% der elf Wochen alten Schweine Campylobacter spp. aus dem Kot isoliert, wobei ein Rückgang auf 85% zum Zeitpunkt der Schlachtung zu verzeichnen war. Die Ursache für den Rückgang liegt möglicherweise in der stabileren Darmflora älterer Tiere, die das Wachstum von Campylobacter spp. behindert. Aber auch ein Futterwechsel während der Mast könnte als Erklärung hierfür angeführt werden. Es konnte beobachtet werden, dass einzelne

Tiere

an

aufeinander

folgenden

Beprobungsterminen

unterschiedliche

Untersuchungsergebnisse aufwiesen. Dass Schweine während der Mast eine CampylobacterFreiheit erlangen und sich anschließend reinfizieren, scheint jedoch unwahrscheinlich. Vielmehr ist von einer intermittierenden Ausscheidung auszugehen, die auf einer heterogenen Verteilung des Erregers infolge chemischer Anziehungskräfte beruht. Da sowohl Untersuchungen von Weijtens (1996) und Gaull (2002) gezeigt haben, dass Schweine schon zu Beginn der Mastperiode Campylobacter spp. im Kot aufweisen, ist der primäre Infektionszeitpunkt bereits im Ferkelalter zu suchen. Sauen in Ferkelerzeugerbetrieben weisen häufig hohe Infektionsraten von bis zu 100% auf und können durch erregerhaltige Ausscheidung einen massiven Infektionsdruck in ihrer Umwelt aufbauen (Weijtens, 1996). Während die Ferkel zum Zeitpunkt der Geburt noch Campylobacter-frei sind, steigen die Prävalenzen schon in den ersten Lebenswochen erheblich an. Wenn auch die Aufstallung der Ferkel zunächst einen Einfluss auf die Höhe der Prävalenz in den ersten Lebenswochen zu haben scheint (Ferkel in Ställen mit Fußbodenheizung weisen geringere Belastungen auf), relativieren sich die Unterschiede am Ende der Aufzuchtphase und erreichen Nachweisraten von 90% und mehr (Gaull, 2002). Das Schwein ist seit langem als Reservoir von humanpathogenen Yersinia enterocolitica der Serovare O.3, O:9 und O:5,27 bekannt (Johannessen et al., 2000). Beim Schwein selbst tritt die Yersiniose überwiegend bei Jungtieren klinisch apparent auf. Ältere Tiere gelten als asymptomatische Träger des Keims (Neubauer et al., 2001b). Serologische Untersuchungen in Norwegen zeigen, dass 86% der untersuchten reinen Mastbestände positiv waren, wohingegen die Herdenprävalenz bei geschlossenem System mit 53,1% erheblich niedriger lag (Skjerve et al., 1998). Die Yersinia spp.-Infektion wird durch Zukauf und anschließender fäkal-orale Kontamination sowie durch infiziertes Sperma oder Abortmaterial nach intrauteriner Infektion verbreitet. Nach Ansicht der Autoren ist das Transportfahrzeug eine wichtige Kontaminationsquelle. Auch der Einsatz von Stroheinstreu birgt nach ihrer Auffassung ein erhöhtes Risiko. Dagegen konnte nach ihrer Auswertung die Herdenprävalenz durch den Einsatz einer Unterdruckventilation sowie einer manuellen Fütterung gesenkt werden. Skjerve et al. (1998) kamen zu dem Schluss, dass die Risikominimierung für eine Y. 10

enterocolitica-Infektion durch die strikte Trennung von infizierten und nicht-infizierten Beständen zu erreichen ist. Bottone (1997) isolierte von klinisch gesunden Schweinen pathogene Y. enterocolitica. Dabei lag die Isolationsrate aus dem Rachen weit höher als jene aus dem Kot. Im Jahr 2000 wurden in Süddeutschland an einem Schlachthof 50 Schlachtschweine untersucht, hierbei konnten in 60% der Tonsillen und 10% der Kotproben Y. enterocolitica 4/O:3 nachgewiesen werden (Fredriksson-Ahomaa et al., 2000). Weitere Daten, die aus Deutschland stammten, wurden 2004 erfasst. Dabei waren 45,5% der untersuchten Schweinemastbestände in Bayern serologisch positiv (Hensel et al., 2004). Verlaufsuntersuchungen vom Ferkel bis zum adulten Tier liegen bislang noch nicht vor, aber es ist bekannt, dass bei Sauen viel seltener Y. enterocolitica aus den Tonsillen zu isolieren ist. So untersuchten Korte et al. (2004) Tonsillen von Mastschweinen und Sauen von sieben verschiedenen Schlachthöfen. Während bei den Mastschweinen 56% positiv waren, konnte bei den Sauenproben nur bei 14% der Erreger nachgewiesen werden.

4.2

Campylobacter spp. und Yersinia spp. im Schweinefleisch

In Lebensmittelproben wurden in Deutschland im Jahr 2001 nach Mitteilung von elf Bundesländern

in

einer

von

insgesamt

159

untersuchten

Schweinefleischproben

Campylobacter spp. nachgewiesen. Von 16 Anlassproben wies keine ein positives Ergebnis auf (Hartung, 2002). In den USA untersuchten Zhao et al. (2001) Fleischprodukte aus 59 Fleischtheken verschiedener Supermarktketten auf das Vorkommen von Campylobacter spp.. Dabei war in 1,7% der Proben vom Schwein der Erreger nachweisbar. Oosterom et al. (1985) gehen davon aus, dass positive Campylobacter-Nachweise am Schlachtkörper weniger durch den ursprünglichen Keimgehalt im Darm der Tiere hervorgerufen werden, sondern vielmehr Kreuzkontaminationen durch Oberflächen und Arbeitsgeräte in der Schlachthalle darstellen. Deutlich stärker als das Fleisch dieser Tierart sind ihre Lebern belastet. So konnten Kramer et al. (2000) in 71,1% der Schweinelebern thermophile Campylobacter nachweisen. Als Ursache für diese hohe Prävalenz vermuteten sie eine Kreuzkontamination, da die Lebern zu mehreren Kilogramm in jeweils einem Paket unter Luftabschluss verpackt wurden. Die Nachweisrate von Y. enterocolitica in rohem Schweinefleisch ist mit Ausnahme von Schweinezungen und –innereien gering (Beer, 1995), die Prävalenz im Hackfleisch, für welches in manchen Regionen Kopffleisch und Tonsillen verwendet werden, ist jedoch hoch (Tauxe et al. 1987). Über das Vorkommen von Y. enterocolitica in hitzebehandelten Schweinefleischprodukten liegen nur wenige Studien vor (Hank, 2003). Bisher wurden keine pathogenen Stämme aus hitzebehandelten Produkten isoliert. Dennoch wurden apathogene Y. 11

enterocolitica Stämme nachgewiesen. Dies zeigt, dass bei mangelhafter Hygiene eine Kreuzkontamination von rohen zu hitzebehandelten Produkten möglich ist.

5.

Schlussfolgerung

Wie die gezeigten Studien verdeutlichen, sind Campylobacter spp. und Yersinia spp. Keime, die in Schweinebeständen in Europa weit verbreitet sind und daher ein Risiko für die Gesundheit des Menschen darstellen. Daher sind weitere infektionsepidemiologische Studien notwendig, um das vom Schwein ausgehende Gefahrenpotential für die menschliche Campylobacter spp.- und Yersinia spp. -Infektion abschätzen zu können. Hierbei sind Langzeitstudien erforderlich, um offene Fragen bezüglich der Epidemiologie und der Eintragsquellen beider Erreger zu klären.

Auch

fehlen

Informationen über die

Erregerprävalenz in der gesamten Produktionskette beim Schwein. Diese sind notwendig, um festzustellen, auf welcher Produktionsstufe eine Erregerbekämpfung sinnvoll ist, um den Eintrag zu minimieren. Es sollte geklärt werden ob der Einsatz einer Impfung zur Erregerreduktion auf Bestandsebene praktikabel ist, oder eine Änderung der Schlachttechnik einen positiven Einfluss hat. Da Campylobacter-Keime in der Lage sind, den VBNC-Status einzunehmen,

kann

die

Frage

des

Überlebens

des

Erregers

auf

der

Schlachttierkörperoberfläche nicht völlig geklärt werden. Über die Mechanismen und Bedeutung des VBNC-Status bei Campylobacter spp. sollten weitere Untersuchungen vorgenommen werden. Zur Zeit gibt es weder für Campylobacter spp. noch für Yersinia spp. einen „Gold Standard“ in der Analysetechnik. Dies erschwert die Vergleichbarkeit der verschiedenen Studien untereinander. Somit ist zusätzlich die Entwicklung für eine sichere, schnelle, einfach durchführbare und kostengünstige Erregerdiagnostik unabdingbar.

Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit diente als Literaturübersicht über Campylobacter spp. und Yersinia spp. in der Schweineproduktionskette. Es wurde zum einen die Systematik und die Erregereigenschaften dieser zwei weltweit bedeutenden Zooanthroponoserreger dargestellt. Zum anderen wurde über die herrschende Prävalenzen in der Produktionskette beim Schwein berichtet. Es wird deutlich, dass Schweine häufig Träger humanpathogener Campylobacter spp. und Yersinia spp. sind und eine Kontamination ihres Fleisches während des Schlachtprozesses möglich ist. Allerdings sind humanpathogene Campylobacter spp. und Yersinien spp. relativ selten im Fleisch nachweisbar. Eine größere Gefahr stellen Innereien 12

dar. Um Schweinefleisch noch sicherer zu machen, sollte in Zukunft versucht werden, die Epidemiologie

des

Erregers

genauer

aufzuklären,

um

somit

die

Ursache

der

Erregerausbreitung zu erkennen und geeignete Gegenmaßnahmen ergreifen zu können. Schlüsselwörter: Campylobacter spp., Yersinia spp., Schwein, Literaturübersicht

Abstract This review summarises several studies emphasising the importance of Campylobacter spp. and Yersinia spp. in the pig production chain as widespread pathogens. First, taxonomy and pathogen character of these world-wide important pathogens were described, and second, prevalence in the pig production was reported. Obviously, pigs are often carriers of Campylobacter spp. and Yersinia spp. causing infections in humans. Contamination during the slaughtering process is possible. However, pathogenic Campylobacter spp. and Yersinia spp. are comparatively infrequently isolated from meat. A bigger health risk is represented by entrails. Concluding, to increase pork safety, further epidemiological studies are urgently needed to determine the origin of pathogens and to take counteractive measures. keywords: Campylobacter spp., Yersinia spp., pigs, review article

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18

CHAPTER TWO

Prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. in the pig production

TANJA WEHEBRINK1, NICOLE KEMPER1, ELISABETH GROSSE BEILAGE2 JOACHIM KRIETER1

1

Institute of Animal Breeding and Husbandry Christian-Albrechts-University D-24118 Kiel, Germany

2

University of Veterinary Medicine Hannover Fieldstation for Epidemiology D-49456 Bakum, Germany

Submitted for publication in Berliner und Münchner Tierärztliche Wochenschrift

19

Abstract The aim of this study was to determine the prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. in a total of 1,040 faecal samples taken from animals at different ages from four farrowing and twelve fattening herds. In the farrowing unit, faeces were collected from 68 sows (faecal samples) and 256 suckling piglets (rectal swab samples). Further samples were collected from 362 growing and 354 finishing pigs (rectal swab samples). Additionally, 56 feed and environmental samples were collected. During the slaughtering process, 122 pigs and their carcasses respectively, were sampled three times. First, rectal samples were taken with swabs during the lairage. Second, the samples were taken from the carcass before entering the chilling room. The same method was repeated in the chilling room twelve hours after starting the chilling. Finally, 86 raw meat samples were taken from 34 retail stores. Campylobacter spp. were isolated in sows (33.8%), piglets (80.9%), growing (89.2%) and finishing (64.7%) pigs. Yersinia spp. were detected in growing (15.2%) and finishing (13.3%) pigs only. During lairage, Campylobacter spp. were identified from pig faeces from all farms whereas Yersinia spp. were detected in pigs from just two herds. After twelve hours of chilling neither Campylobacter spp. nor Yersinia spp. were detected. In raw meat samples, Campylobacter spp. were isolated from one liver sample and Yersinia enterocolitica from two meat samples (mince and cutlet). Common slaughter techniques and hygiene procedures may be effective tools to reduce the risk of contamination and recontamination of meat products since Campylobacter spp. and Yersinia spp. were found only sporadically in raw meat samples. keywords: Campylobacter spp., Yersinia spp., cultural isolation, pig production chain, zoonotic pathogens

20

1.

Introduction

Campylobacter (C.) spp. are among the most common bacterial causes of enteric diseases worldwide. Members of the genus Campylobacter colonize the gastrointestinal tract of a broad range of animals as commensals. In contrast, they are associated with disease in humans. In Germany, the Robert Koch-Institute registered 61,823 cases of people suffering from campylobacteriosis in 2005 (Robert Koch-Institut, 2006). Out of the 16 species within the genus Campylobacter, the thermophilic species C. jejuni and C. coli are of special importance as zoonotic agents with regard to human health. Infections with C. spp. in humans are mainly related to consumption of contaminated food, especially chicken products. Another important source of food-borne infections is raw or insufficiently cooked pork. Furthermore, surface water used for drinking purposes can serve as a source of infection. Besides Salmonella spp. and Campylobacter spp., Yersinia (Y.) spp. is another important zoonotic pathogen from the list of human diseases (Aleksic and Bockemühl, 1990) with 5,600 registered infections in Germany in 2005 (Robert Koch-Institut, 2006). Together with Y. pestis and Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica represents pathogenic Yersinia species with a certain risk to human health. Most cases of yersiniosis in Europe are related to bioserovar 4/O:3 Y. enterocolitica is thought to be a significant food-borne pathogen, although pathogenic isolates have been isolated from food infrequently, except from edible pig offal (De Boer, 1995). In case-control studies, a correlation has been demonstrated between the consumption of raw or undercooked pork and yersiniosis (Satterthwaite et al., 1999). The main infection source for Y. enterocolitica bioserovar 4/O:3 is raw pig meat, for pigs serving as natural carriers of this bioserovar (Fredriksson-Ahomaa et al., 2001). Both infections are infant diseases with a clear infection peak in children up to two years and a second incidence peak for campylobacteriosis in early adulthood. Diarrhoea is symptomatic for both campylobacteriosis and yersiniosis, but severe or clinically unapparent courses of disease are possible as well. In contrast to its importance as a human pathogen, the understanding of the pathomechanisms of Campylobacter spp.-associated diseases is still relatively poor (Vlient and Ketley, 2001). In the same way, this applies for the epidemiology of Y. enterocolitica infections, as it is complex and poorly understood (Fredriksson-Ahomaa and Korkeala, 2003). The objective of this study was to gather further information about the prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. at different stages of the pig production chain via cultural isolation. Samples were taken from sows, suckling piglets, growing and finishing pigs, carcasses, raw meat, forage and their environment (separating plate, feeding trough). 21

2.

Materials and Methods

2.1

Materials

Table 1 shows the number of herds at every stage of the production chain and the number of samples taken. Table 1 Study design production stage number

farrowing units

fattening units

slaughterhouse

retail

4 herds

12 herds

4 herds

34 retail stores

of samples

sows

68

-

-

-

256

-

-

-

pigs

-

716

366

-

forage

8

26

-

-

10

12

6

-

-

-

-

86

piglets

environment raw meat samples

2.1.1 Farrowing and fattening units During the period from November 2004 till June 2005 data were collected from four farrowing and twelve fattening herds. The ZNVG (Vermarktungsgemeinschaft für Zucht- und Nutzvieh, Neumünster) supplied a list of several farms. The herds for the present study were selected based on the herd size and the relationships between farrowing and fattening. Due to practical limitations, the study design was arranged in the following way: The number of sows in the farrowing herds was between 150 to 650 sows and the fattening herds had fattening places for 350 to 2000 animals. In three cases, a supply relationship between farrowing and fattening unit existed. In all herds, pigs were kept under conventional conditions. The sampling size for each herd was calculated on the herd size and expected prevalence according to the formula from Noordhuizen et al. (1997). The expected prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp., taken from literature, was appointed by the sows and 22

fattening pigs with 80% and 60% respectively and in the retails with 0.2% or rather 2%. The absolute accuracy was 14% and the probability of error was 5%. In the farrowing unit, faeces were collected in the farrowing house from 68 sows (faecal samples) and 256 suckling piglets (rectal swab samples). In three herds, 17 sows and additionally 85 or 86 suckling piglets (five or six piglets per litter) per herd were sampled and in one herd only 17 sows. The selection of piglets was random and the time of sampling the piglets was before weaning. Every pig was given a numbered ear tag enabling individual identification at all times. In the fattening unit, samples (rectal swab samples) were collected from 362 growing and 354 finishing pigs. In twelve herds, between 29 and 31 animals were sampled per herd. Eight pigs died during the fattening period. The observation of 91 pigs from the farrowing unit could be continued over the whole fattening period. Additionally, 56 environmental and feed samples were collected in both production stages. The environmental samples were taken from the separating plate and the feeding trough. Feed samples consisted of forage for piglets, for sows in early and late pregnancy, and for pigs at the beginning or end of fattening, respectively.

2.1.2 Slaughterhouse All investigations concerning slaughter pigs and carcasses were carried out at a commercial abattoir. The slaughterhouse was visited four times for samplings in the period from April until June 2005. Four herds, sampled at different times, were the origin of the pigs investigated at the slaughterhouse. Altogether, 122 pigs were sampled three times during the slaughtering process. First, rectal samples were taken with swabs during the lairage. Second, for the carcass surface, swabs moistened with a 0.9% NaCl dilution were used to sample an at least 100cm2 large sampling field on the belly by rubbing with the necessary compression. The samples were taken from the carcass before entering the chilling room. Third, the same method was repeated in the chilling room twelve hours after beginning the chilling process. During the slaughter process environmental samples were taken from diverse equipment (knives, saws etc.). Twenty-nine out of the 122 pigs at slaughterhouse level had also been sampled as piglets and as fatting pigs representing a complete sampling passage at every step of the production chain.

23

2.1.3 Retail From June till July 2005, 86 raw meat samples were taken from 34 retail stores in two different towns. In 13 butcher’s shops, twelve mince 13 escalope and two liver samples were bought. In 21 discount shops, the sample material composed on the one hand of 16 mince, 19 escalope, one liver and one kidney portion from the self-service counter, and on the other hand of eleven mince and eleven escalope samples from the sales counter.

2.2

Methods

After collection, samples were stored at 4°C and taken to the laboratory (Zentrale Einrichtung Medizinaluntersuchungsamt und Krankenhaushygiene, Hygiene-Institut, Kiel) within four hours and processed directly after arrival. Cultural methods were used to test all samples for Campylobacter spp. and Yersinia spp., including differentiation of subspecies.

2.2.1 Detection of Campylobacter spp. To isolate Campylobacter species, 1g of faeces or the swab sample was inoculated in 9ml Preston broth (Oxoid). After incubation for 24 hours in a microaerophilic atmosphere (5% oxygen, 10% carbon dioxide, 3% hydrogen and 82% nitrogen) at 37°C, a loop of the enriched suspension was plated on Preston agar (Oxoid) and incubated for 48 hours under the abovementioned microaerobic conditions at 37°C. Campylobacter-like colonies were analysed by Gram staining and catalase and oxidase tests (Hippurathydrolysis: ISO 10272, 1995, modified), and biochemical reactions were assessed (ApiCampy; bioMerieux).

2.2.2 Detection of Yersinia spp. Cultural isolation of Yersinia spp. was performed by adding 1g of faeces or the swab sample to 9ml of Gram-negative broth (Becton & Dickinson) and incubating for 48 hours at 21°C. One loop of broth was then plated on Yersinia-selective agar (Difco, CIN-Agar; CIN = Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin) and incubated for another 48 hours at 21°C. Colonies with the typical bull’s eye appearance were subcultured on blood agar and Gram-stained and biochemical tests were subsequently carried out by using API 20E (bioMerieux). Serum agglutination was performed with isolates identified as Y. enterocolitica to detect serovars O:3 and O:9 (ISO 10273, 1994, modified).

24

2.2.3 Statistical evaluation Calculation of the animal prevalence and the 95% confidence intervals within the production stage was performed with the PROC SURVEYMEANS procedure from the software package SAS® (2002).

3.

Results

3.1

Farrowing unit

In three of the four herds at the farrowing level, Campylobacter spp. was isolated from the sow samples. Overall, Campylobacter spp. (total) were isolated in 33.8% (n = 23) of the sows and in 80.9% (n = 207) of the piglets (Table 2). In six cases (2.3%), both pathogens, C. coli and C. jejuni, were simultaneously isolated from the piglet samples and one sow (1.5%) was infected with both subspecies too. No Yersinia spp. were detected in any of these samples in the farrowing unit. Table 2 Prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. in sows and suckling piglets sows (n = 68)

Campylobacter coli Campylobacter jejuni Campylobacter total

2

Yersinia spp. 1

95% Confidence Interval

suckling piglets (n = 256)

%

95% C.I.1

%

30.9

19.6-42.1

71.1

65.5-76.7

4.4

0-9.4

12.1

8.1-16.1

33.8

22.3-45.4

80.9

76.0-85.7

0

2

0

95% C.I.

-

Campylobacter total = C. coli and/or C. jejuni

Regarding the risks of vertical infection, Figure 1 points out that an infected sow does not necessarily lead to infected piglets or that an uninfected sow automatically means a pathogenfree piglet. For example, in herd ‘3’ sows (n = 17) were free from Campylobacter spp. and Yersinia spp., but in the piglets (n = 85) C. coli was isolated in 21.2% (n = 18) and C. jejuni in 36.5% (n = 31) of cases.

25

C. coli

prevalence (%)

100

C. jejuni

C. total¹

80 60 40 20 0 sow

piglet

sow

herd 1

piglet

sow

herd 2

piglet

herd 3

sow herd 4

farrowing unit 1

C. total = C. coli and/or C. jejuni

Figure 1 Prevalence of the different pathogens in farrowing unit section (total sampled: 17 sows and 85 piglets per farm) Additionally, Figure 2 shows the relationship between infected or non-infected sows and their piglets in detail on the basis of the litters. Out of the 68 regarded litters, in 1.5% of the cases neither sows nor piglets were infected. In 23.5%, Campylobacter spp. was detected in sows and the whole tested piglets per litter. Notable is the fact that non- infected sows have nevertheless infected piglets so piglets from non-infected sows were positive for Campylobacter spp..

rel. frequency (%)

35 30

infected sow

25

not infected sow

20 15 10 5 0 0

1

2

3

4

5

6

number of infected piglets Figure 2 Relationship between Campylobacter total (C. coli and/or C. jejuni) infected sows and infected piglets (n = 68 litters) 26

Campylobacter spp. and Yersinia spp. were not isolated neither in feed nor in environmental samples.

3.2

Fattening unit

Campylobacter spp. were detected in all herds in growing and finishing pigs. Yersinia enterocolitica O:3 were detected in the faeces of growing pigs in three of the twelve herds only. Yersinia spp. were isolated in finishing pigs in six of the twelve herds. The prevalence of Campylobacter spp. (total) and Yersinia spp. (total) in growing pigs were 89.2% (n = 323) and 15.2% (n = 55), respectively (Table 3). While the prevalence of Campylobacter spp. was slightly lower (64.7%; n = 229) in finishing pigs, that of Yersinia spp. was nearly the same (13.3%; n = 47) as in growing pigs. Table 3 shows the decrease in prevalence of C. coli and C. jejuni and Yersinia spp. during the fattening period. Furthermore, it illustrates the minor role of Yersinia spp. in fattening herds. Table 3 Prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. in growing and fattening pigs growing pigs (n = 362)

finishing pigs (n = 354)

%

95% C.I.1

%

71.3

66.6-76.0

28.0

23.3-32.7

Campylobacter jejuni

25.7

21.2-30.2

42.1

36.9-47.3

2

89.2

86.0-92.4

64.7

59.4-69.4

Yersinia enterocolitica O:3

11.1

7.8-14.3

12.2

8.7-15.6

Yersinia enterocolitica O:9

0.3

0-0.8

0

-

0

-

1.1

0-2.2

3.9

1.9-5.9

0

-

15.2

11.5-18.9

13.3

9.7-16.8

Campylobacter coli Campylobacter total

Yersinia paratuberculosis Yersinia enterocolitica Yersinia total3

95% C.I.

1

2 95% Confidence Interval Campylobacter total = C. coli and/or C. jejuni Yersinia total = Y. enterocolitica O:3 and/or Y. enterocolitica O:9 and/or Y. paratuberculosis and/or Y. enterocolitica

3

In 28 cases (7.7%), both pathogens, C. coli and C. jejuni, were simultaneously isolated from the piglet samples at the beginning of the fattening period. Twenty finishing pigs (5.6%) were infected with both subspecies, too. 27

Campylobacter spp. total (C. coli and/or C. jejuni) was detected at both sampling times from 206 (28.8%) pigs and Yersinia spp. total (Y. enterocolitica O:3 and/or Y. enterocolitica O:9 and/or Y. paratuberculosis and/or Y. enterocolitica) from two pigs (0.3%) during the whole fattening period. Campylobacter spp. and Yersinia spp. were not isolated neither in feed nor in environmental samples.

3.3

Slaughterhouse

During lairage, Campylobacter spp. were isolated from faeces of pigs (n = 68) from all farms but Yersinia spp. were detected in pigs (n = 7) from two herds only. Before chilling Campylobacter spp. were isolated from swabs taken from the carcass surface of pigs (n = 24) from three farms. Yersinia spp. were detected in pigs (n = 1) from only one herd. After twelve hours of chilling, neither Campylobacter spp. nor Yersinia spp. were isolated from swabs. The prevalence of Campylobacter spp. (total) decreased during the three sampling phases from 55.7% (lairage) to 19.7% (before chilling) to 0% (after 12 h chilling), and those of Yersinia (total) fell from 5.7% to 0.8% to 0% (Table 4). Table 4 Prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. in the slaughterhouse lairage

n = 122

before chilling

after chilling

%

95% C.I.1

%

95% C.I.

%

95% C.I.

Campylobacter coli

27.9

19.8-35.9

10.7

5.1-16.2

0

-

Campylobacter jejuni

36.9

28.2-45.6

9.8

4.5-15.2

0

-

Campylobacter total2

55.7

46.8-64.7

19.7

12.5-26.8

0

-

Yersinia enterocolitica O:3

5.7

1.6-9.9

0.8

0-2.4

0

-

Yersinia total3

5.7

1.6-9.9

0.8

0-2.4

0

-

1

2 95% Confidence Interval Campylobacter total = C. coli and/or C. jejuni Yersinia total = Y. enterocolitica O:3 and/or Y. enterocolitica O:9 and/or Y. paratuberculosis and/or Y. enterocolitica

3

In lairage, eleven pigs (9.0%) were carriers of C. coli and C. jejuni and before chilling one animal (0.8%). During both sampling times (lairage and before chilling), Campylobacter total

28

was detected in 13 pigs (5.3%). Campylobacter spp. and Yersinia spp. were not isolated in equipment samples.

3.4

The production chain from the piglet to the carcass after chilling

From 91 pigs, it was possible to obtain information from the farrowing to the fattening unit. Out of these, data from 29 animals were acquired at the different stages of the pig production chain. Figure 3 illustrates the declining tendency of Campylobacter spp. in the whole production chain and the low prevalence of Yersinia spp. in fattening herds.

prevalence (%)

100 80 C. total¹

60

Y. total²

40 20 0 piglets

growing pigs

finishing pigs

lairage³

before chilling³

after chilling³

production chain 1

C. total = C. coli and/or C. jejuni Y. total = Y. enterocolitica O:3 and/or Y. enterocolitica O:9 and/or Y. paratuberculosis and/or Y. enterocolitica 3 n = 29 2

Figure 3 Prevalence of the different pathogens in the whole pig production chain (n = 91) In the farrowing unit, C. coli was detected in 69.2% (n = 63) and C. jejuni in 12.1% (n = 11) of cases. During the fattening period, the prevalence of C. coli decreased from 54 growing pigs (59.3%) to eleven finishing pigs (12.4%). The prevalence of C. jejuni rose from 15 growing pigs (16.5%) to 43 finishing pigs (48.3%). In the same period, three growing pigs (3.3%) were carriers of Y. enterocolitica and four finishing pigs (4.5%) were carriers of Y. enterocolitica O:3. 29

In lairage, eleven pigs (37.9%) were infected with C. coli and five pigs (17.2%) with C. jejuni. Additionally C. coli was detected on two carcasses before chilling (6.9%). Only in four piglets (4.4%), four growing (4.4%) and five finishing pigs (5.5%) were both pathogens C. coli and C. jejuni detected simultaneously. From the 91 pigs, Campylobacter spp. total could be identified in 33 (36.3%) animals during the farrowing and fattening unit. Seven pigs (24.1%) were carriers of Campylobacter spp. total as piglet, growing and finishing pigs and as living pigs in lairage. From only one pig could Campylobacter spp. be isolated in all steps of the production chain from piglet to carcass before chilling.

3.5

Retail

Campylobacter coli was isolated from only one liver sample, and Y. enterocolitica, from two meat samples (mince and cutlet). The pathogens could not be detected in the other 83 samples.

4.

Discussion

The aim of this study was to gather further information about the prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. at the different stages of the pig production chain by using culture isolation methods. The results from the farrowing unit point out that compared with sows (33.8%) the prevalence of their piglets is very high (80.9%). Alter et al. (2005) did not find such a high detection rate. Whereas no Campylobacter spp. was detectable in the faeces of piglets on the day of birth, Campylobacter spp. incidence rose within seven days to 32.8%. After transfer to the nursery unit, the prevalence increased to 56.6%. Jensen et al. (2006) detected high prevalence of Campylobacter spp. in organic outdoor pigs. All pigs (n = 47) shed Campylobacter (103-107 CFUg-1 faeces) from the age of 8-13 weeks. C. jejuni was found in 29% of pigs in three consecutive trails and always in minority to C. coli (0.3%-46%). On the basis of the results from the present project, it becomes obvious that there is no relationship between infected sows and the infection of their piglets with Campylobacter spp.. This fact clarifies that sampling of sows alone is useless without taking the piglets into account. Yersinia spp. seems to play a negligible role in farrowing herds. This is in accordance with another study detecting Yersinia spp. only during the fattening period but not in sows and piglets (Kasimir, 2005). The fact that Y. enterocolitica was not isolated in the farrowing unit but first at the beginning 30

of the fattening period is evidence that the cause of infection has to be looked for in the fattening unit. On the basis of the results in the fattening unit, it becomes obvious that a stable gut flora from older pigs can cause a decrease in prevalence. Other studies e.g. from Weijtens et al. (1993; 1999) approve this effect. In this study, the amount of Campylobacter was at 104 cfu/g excrement at the beginning of the fattening period and about 102 cfu/g excrement at the end of the fattening period. Also Young et al. (2000) detected a higher prevalence in 14-day-old piglets compared to gilts. In the present project, the detection rates from Y. enterocolitica in growing and finishing pigs are moderate (15.2% vs. 13.3%). The low Yersinia-prevalence in this production stage can be attributed to the persistence of Yersinia spp. in the palatine tonsil and intermittent shedding. A robust gut flora in older pigs might be the reason for lower pathogen prevalence due to competition. Pilon et al. (2000) sampled faeces from 20 different farms. The prevalence of Y. enterocolitica were between 0% and 46.9%. Bush et al. (2003) detected 12.8% Y. enterocolitica in 2664 faecal samples and Kasimir (2005) described isolation rates between 0% and 65.4%. However, factors influencing the shedding of pathogens can rarely be determined definitely, but pigs carrying certain pathogens are consequently an infection source. Neither in the environmental nor in the feed samples were Campylobacter spp. and Yersinia spp. isolated. One reason therefore can be found in the method of detection. Especially for environmental and animal feed samples, the cultivation method seems to be inferior compared to Polymerase-Chain-Reaction (PCR), because the low numbers of pathogenic strains in these samples can often be suppressed by a distinct satellite flora (Fredriksson-Ahomaa and Korkeala, 2003). Despite the high prevalence in lairage (Campylobacter total: 55.7%) at the slaughterhouse, none of the examined pathogens was detected after chilling. Apparently, the chilling of carcasses and the associated dehydration of the surface area reduce the number of Campylobacter spp. In this way, an effective minimisation of the infection risk via the food store chains is possible. But a residual risk attributed to the VBNC status (viable but non culturable) status could not be denied, enabling certain strains to be still viable without being identifiable through cultivation. Malakauskas et al. (2006) showed that 28 (63.6%) of the 44 samples collected at the slaughterhouse were contaminated by Campylobacter spp. 23.4% (28 of 120) isolates were identified as C. jejuni (19 from carcasses and nine from slaughter line surface) and 76.6% (92 of 120) isolates as C. coli (28 from faeces, 47 from carcasses and 17 from slaughter line surfaces). The results suggest that cross-contamination originated in the 31

gastro-intestinal tract of the slaughtered pigs and that the cross-contamination happened during the slaughter process (Malakauskas et al., 2006). The prevalence of Yersinia spp. in the slaughterhouse were low (lairage: 5.7% vs. before chilling: 0.8%). One reason for this effect is that Yersinia spp. persists in the tonsils and will be shed with the faeces discontinuously. For consumer protection purposes it is noteworthy that in the present project C. coli was isolated from one liver sample only. The prevalence of Yersinia spp. in raw meat samples were very low, too. Further studies confirm this result. For example, Arnold et al. (2004) detected the pathogen in 0.5% of mince samples and Fredriksson-Ahomaa et al. (2001) in 12%. A higher rate was detected only in samples from offal, tongues and palatine tonsils (Fredriksson-Ahomaa et al., 2001). The low detection rate of Yersinia spp. in raw meat can also be due to methodological difficulties. In food samples, analysed by cultivation methods and PCR, the PCR technology recorded a higher prevalence (Fredriksson-Ahomaa and Kokkeala 2003). Other detection methods are for example DNA hybridisation, immunofluorescence tests and serotyping. In conclusion, it has to be stated that none of the methodologies published hitherto is sufficient regarding the reliable detection of pathogenic Yersinia spp. strains. Therefore, only conditionally fast and safe enrichment and cultivation methods are available at the moment to detect yersiniosis. With regard to hygiene, one major point of concern is the ability of Yersinia spp. to survive in raw meat for a long time because they are viable at temperatures of 4°C. Lack of reasonable care in kitchen hygiene, especially in private households, can easily lead to cross-contaminations. Besides C. coli, C. jejuni was laboratory-confirmed in this examination. The isolation of C. jejuni from pig samples was described by other studies as well. For example, Stich-Groh (1982) and Young et al. (2000) identified 23.4% and 76.3% respectively, Campylobacter spp. as C. jejuni. In these assays, hippurathydrolysis served as a confirmation method. This technique is based on the ability of C. jejuni to hydrolyse hippurat, a biochemical reaction C. coli is not capable of. One major problem of this method is the possible loss of this ability during the life span of C. jejuni, causing false positive results with regard to C. coli. But it can be possible that in some farms or in geographical regions C. jejuni is described as common in pigs (Kasimir, 2005).

5.

Conclusion

The aim of this study was to analyse the prevalence of Campylobacter spp. and Yersinia spp. at the different stages of the pig production chain via cultural examination. Samples were

32

taken from sows, suckling piglets, growing and finishing pigs, carcasses, raw meat, forage and their environment (separating plate, feeding trough). High prevalence of Campylobacter spp. were found in suckling, growing and finishing pigs. The observed prevalence from the farrowing unit confirm the conclusion that a pathogen-free sow does not necessarily mean pathogen-free piglets. Yersinia spp. infections in farrowing units can be neglected. Additionally it can be pointed out that the prevalence of both pathogens decrease with the increasing age of animals in the fattening unit. The fact that both examined pathogens were found only sporadically in food indicates that common slaughter techniques and hygiene procedures are effective tools to reduce the risks for contamination or recontamination of meat products. The most important risk factors responsible for the spread of Campylobacter spp. and Yersinia spp. in the farrowing and fattening unit should be identified in further studies.

Acknowledgements This research was financially supported by the H. Wilhelm Schaumann Stiftung, the Ministerium für Soziales, Gesundheit, Familie, Jugend und Senioren des Landes SchleswigHolstein and the Arbeitsgruppe Lebensmittelqualität und -sicherheit (QUASI) from the Faculty of Agricultural and Nutritional Science, Christian-Albrechts-University, Kiel.

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35

36

CHAPTER THREE

Campylobacter spp.: Risk factor analysis in fattening pig farms

TANJA WEHEBRINK1, NICOLE KEMPER1, ELISABETH GROSSE BEILAGE2 and JOACHIM KRIETER1

1

Institute of Animal Breeding and Husbandry Christian-Albrechts-University D-24118 Kiel, Germany

2

University of Veterinary Medicine Hannover Fieldstation for Epidemiology D-49456 Bakum, Germany

Accepted for publication in Archives of Animal Breeding

37

Abstract There is a lack of information about the prevalence and origins of the important zoonotic pathogen Campylobacter spp. in the different stages of the pig production chain. The aim of this study was to gather further information about the sources of infection with Campylobacter spp. and their qualitative and quantitative importance in pig production. For statistical analysis, 1,040 results from the bacteriological examination for Campylobacter spp. were evaluated with questionnaires from four farrowing and twelve fattening units. The prevalence was determined via faeces and swab samples with regard to certain farm production parameters. Thereby 30.8% of the sows and 80.9% of their piglets were carriers of Campylobacter spp.. In the fattening unit, the prevalence at the beginning of the fattening period was 89.2% and at the end 64.7%. As a result of the small sample size in the farrowing unit it was not possible to perform a risk analysis which yielded significant conclusions. In the fattening stage, the following risk factors had a significant effect (p≤0.05) on Campylobacter spp. prevalence: sampling time, number of fattening places per herd, mixed farming, floor space design, feed origin, antibacterial and anthelmintic treatment. These results show that housing and management have a possible influence on the Campylobacter spp. prevalence and should be investigated further. keywords: Campylobacter coli / jejuni, pig, fattening units, risk analysis, odds ratio Zusammenfassung Titel der Arbeit: Campylobacter spp.: Risikoanalyse in Schweinemastbetrieben Über die Prävalenzen und Eintragsquellen des Zoonosenerregers Campylobacter spp. in den verschiedenen Produktionsstufen der Schweineerzeugung existieren bisher nur wenige Informationen. Die vorliegende Studie soll zur Aufdeckung produktionsspezifischer Risikofaktoren und ihrer Analyse hinsichtlich der qualitativen und quantitativen Bedeutung beitragen. Für die statistische Analyse wurden 1.040 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung auf Campylobacter spp. im Zusammenhang mit den Informationen aus einem Fragebogen aus vier Ferkelerzeuger- und zwölf Mastbetrieben ausgewertet. Die Prävalenzen des Erregers wurden mit Hilfe von Kot- und Abstrichtupferproben vor dem Hintergrund verschiedener Betriebsbedingungen ermittelt. Dabei wurden bei 33,8% der Sauen und bei 80,9% der Ferkel Campylobacter spp. nachgewiesen. In der Produktionsstufe Mast betrug die Prävalenz am Mastanfang 89,2% und am Mastende 64,7%. Aufgrund des geringen Datenmaterials konnte auf der Produktionsstufe Ferkelerzeugung keine Risikoanalyse durchgeführt werden. Folgende Faktoren hatten auf den Mastbetrieben einen signifikanten 38

Einfluss (p≤0,05) auf die Campylobacter Prävalenz: Zeitpunkt der Probeentnahme, Anzahl Mastplätze,

Mischbetrieb,

Bodengestaltung,

Futterherkunft,

Einstallbehandlung

und

anthelminthische Behandlung. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass eine Reduzierung der Campylobacter spp. Prävalenz durch betriebliche Haltungs- und Managementfaktoren möglich ist. Dieses Phänomen sollte weiter untersucht werden. Schlüsselwörter: Campylobacter coli / jejuni, Schwein, Mastbetriebe, Risikoanalyse, Odds Ratio

1.

Introduction

Infections caused by Campylobacter spp. (C.) are prevalent worldwide. Campylobacter jejuni and C. coli are by far the most common Campylobacter species infecting humans. Both species are associated with clinically indistinguishable diarrhoea in humans (Nachamkin, 2003). In Germany, the Robert Koch-Institute registered 61,823 cases of humans suffering from such an infection in 2005. However, C. jejuni is implicated in about 85% of the cases of human campylobacteriosis, with the remaining cases being primarily caused by C. coli (Friedman et al., 2000). Campylobacter spp. are part of the normal gut microflora in many food-producing animal species, including chickens, turkeys, swine, cattle and sheep (Blaser, 1997). For instance, C. jejuni is more commonly isolated from chickens and cattle, while C. coli is more common among swine (Young et al., 2000). Transmission to humans appears to occur primarily through the consumption of contaminated poultry products, unpasteurised milk products and meat products (Effler et al., 2001; Friedman et al., 2004). In addition to the consumption of undercooked meat, cross-contamination to other food products may play a significant role in the number of illnesses observed. The infective dose (number of organisms sufficient to cause infection) in humans can be very low. Only 800 colony-forming units of specific strains can lead to Campylobacter infection (Black, 1988). According to the regulations of the “White Paper on Food Safety” (Europäisches Weissbuch zur Lebensmittelsicherheit, 2000), the farmer and the participating manufacturing industry in the food production should have the main responsibility for food safety. Now and in future, this adds up to the demand for preventive measures in primary production following the principle “from the producer to the consumer”. This leads to a consolidated need for the detection of relations between pathogen prevalence in the herds and the herd management and husbandry. Determination of various important entry routes and spreading factors provides useful decision guidance for all production units in the meat production chain to minimise the 39

transmission of zoonotic pathogens. For these reasons, this study was conducted with the aim to determine the prevalence of Campylobacter spp. in farrowing and fattening units by the collection of faeces and rectal swabs. Further risk factors for the occurrence of Campylobacter spp. in farrowing and fattening units should be observed via environmental and feed samples from the checked herds and questionnaires in the corresponding pig farms.

2.

Material and Methods

Four farrowing and twelve fattening farms provided the basis for the present study. The sampling size on every farm was calculated according to the formula from Noordhuizen et al. (1997). In total, 1.040 faecal or swab samples respectively from pigs of all ages from farrowing and fattening units were analysed. Additionally, 56 environmental and feed samples were collected. Cultural methods were used to test all samples for Campylobacter spp., including the differentiation of subspecies. The bacterial detection of Campylobacter spp. proceeds from ISO 10272 (1995) with following biochemical differentiation of C. coli and C. jejuni. Calculation of the intraherd and animal prevalence and the 95%-confidence intervals within the production stage was performed with the PROC SURVEYMEANS procedure from SAS® (2002). On every farrowing and fattening farm, data collection was carried out with the aid of a questionnaire. Besides the general farm information, detailed data about the housing system, management, state of health and aspects of disease surveillance were acquired. In consideration of the bacteriological results, these data contributed to a hazard analysis to detect the origin and spread of Campylobacter spp. infections. The statistical analysis was performed with a generalised linear model. At first the management-specific parameters were tested respectively with the χ2-test regarding the influence on the pathogen prevalence. Every parameter having a value p10 days