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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 063 411 kInt. Cl. : A61K 35/78

11 N.◦ de publicaci´ on: 5

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˜ ESPANA

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A61K 7/48

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 91110927.0 kFecha de presentaci´on : 03.05.89 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 450 669 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 09.10.91

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Composici´ on cosm´ etica o dermatol´ ogica particularmente de acci´ on adelgazante o anti -

celul´ıtica conteniendo extractos de cola en forma liposomal.

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73 Titular/es: Parfums Christian Dior

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72 Inventor/es: Andr´ e, Patrice;

30 Prioridad: 10.05.88 FR 8806306

33, avenue Hoche F-75008 Paris, FR

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.01.95

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.01.95

Aviso:

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Dominice, Jocelyne; Perrier, Pierre y Redziniak, G´ erard

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74 Agente: Ungr´ıa Goiburu, Bernardo

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 063 411 T3 DESCRIPCION La presente invenci´on se refiere esencialmente a una composici´on cosm´etica o dermatol´ogica, particularmente de acci´on adelgazante o anticelul´ıtica, conteniendo extractos de cola en forma liposomal. 5

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Un numero bastante importante de preparados cosm´eticos destinados para el adelgazamiento de las partes superficiales del cuerpo humano existen actualmente en el mercado. Estos contienen a menudo productos de origen natural, en particular de origen vegetal, tales como: extracto de hiedra, cafe´ına, escina, etc. La literatura menciona por otro lado un gran numero de formulas adelgazantes de las cuales se pueden citar a titulo de ejemplos la patente US-A-4.525.359 a nombre de Greenway III y col., que propone utilizar como principio activo β-estimulantes adren´ergicos, preferentemente teofilina, isoproterenol, forskolina, y epinefrina. De igual modo, anteriormente, se hab´ıa preconizado en el documento US-A -4.288.433 a nombre de Koulbanis y col., la utilizaci´on de metilxantinas, en particular la cafe´ına, en la preparaci´ on de productos adelgazantes destinados para la aplicaci´ on local sobre las zonas a tratar. Ahora bien, hasta ahora, ninguna de las formulaciones puestas en el mercado para el adelgazamiento del cuerpo ha sido reconocida que sea muy eficaz. Es por lo que y se recomienda bastante a menudo utilizar estas formulaciones en combinaci´ on con un “programa” o r´egimen de adelgazamiento. Es en particular el caso para este documento US-A-4.525.359 de modo que no se est´a nunca seguro de saber, en caso de adelgazamiento real, si este se debe al programa o al r´egimen de adelgazamiento, o a la formulaci´on adelgazante. Sucede que un gran n´ umero de principios activos para el adelgazamiento ha sido propuesto por los preparadores de las f´ ormulas o los suministradores.

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En particular, en el documento FR-A-2.499.405, se describe una composici´ on cosm´etica adelgazante y anticelul´ıtica a base de un extracto de planta que contiene saponinas, un extracto de Arnica Montana L. y un extracto de nuez de cola, as´ı como su procedimiento de aplicaci´ on. Igualmente, en el documento FR-A-2.554.344, se describe tambi´en una composici´on cosm´etica de acci´on adelgazante y anticelul´ıtica que comprende de 0,5 a 10% en peso de una base purica de origen natural o sint´etico, seleccionada ventajosamente entre los extractos de caf´e, de t´e, de cola y de mate, la cafe´ına y la teofilina, as´ı como sus derivados tales como sus sales y sus complejos; 0,5 a 10% en peso de un extracto de Hereda Helix y 0,1 a 10% en peso de un extracto de Ruscus aculeatus. De igual modo, la sociedad italiana Inverni Della Beffa propone extractos de semillas de cola que contienen en particular metilxantinas que comprenden cafe´ına, teobromina, teofilina, etc y taninos, por sus propiedades de astringencia, de aromatizaci´ on y de activaci´ on de la lipasa. Esta sociedad propone dos extractos particulares, a saber la cola extracto seco, designado tambi´en como “extracto 14” debido a la titulaci´on de un 14% en alcaloides expresada en cafe´ına cuya proporci´ on de adici´ on aconsejada es de hasta un 1%. El segundo extracto consiste en la cola extracto fluido Lipa, tambi´en denominada “extracto Lipa” cuya titulaci´ on en alcaloides expresada en cafe´ına es inferior o igual al 0,5%.

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Dado que el extracto Lipa esta pr´acticamente exento de alcaloides, y que la propiedad adelgazante era hasta ahora atribuida a las metilxantinas, en particular a la cafe´ına, este extracto Lipa se preconiza exclusivamente para la preparaci´ on de composiciones astringentes a raz´on de una proporci´on de hasta un 5%.

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Las investigaciones intensivas que han sido realizadas por los presentes inventores han permitido descubrir de forma totalmente inesperada, estudiando la acci´ on de estos dos extractos, respectivamente el extracto 14 y el extracto Lipa, sobre la actividad de los adipocitos en cultivo, que estos extractos, cuando se encapsulaban en liposomas, presentaban una actividad radicalmente superior a los extractos libres, es decir no encapsulados en liposomas.

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As´ı, seg´ un un primer aspecto, la presente invenci´ on proporciona un composici´on cosm´etica o dermatol´ ogica, particularmente de actividad adelgazante o anticelul´ıtica, caracterizada porque comprende fases laminares lip´ıdicas hidratadas o liposomas que contienen extractos totales o parciales de semillas de cola. 60

Seg´ un un modo de realizaci´ on particular de la invenci´ on, los extractos parciales de semillas de cola son extractos sensiblemente exentos de metilxantinas con un contenido en metilxantina inferior a aproximadamente 0,5%, mientras que los extractos totales son extractos secos con contenido en metilxantina 2

ES 2 063 411 T3 comprendido entre aproximadamente un 10 y un 14%. Seg´ un otro medio de realizaci´on particular, la cola a partir del cual los extractos seg´ un la invenci´ on son obtenidos es la planta, Cola Nitida o la planta Cola Vera Shum. 5

Los procedimientos de extracci´on utilizables seg´ un la invenci´ on son procedimientos conocidos del experto en la materia, utilizando por ejemplo disolventes org´anicos o mezclas de disolventes, tales como una mezcla hidroalcoh´ olica. 10

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Se pueden por ejemplo obtener extractos totales de semillas de cola seg´ un la invenci´ on inspir´ andose en el procedimiento descrito por el documento FR A-2.586.532 ligeramente modificado como sigue. Las semillas o nuez de cola se trituran y seguidamente se someten a un procedimiento de extracci´ on por medio de una mezcla de metanol:agua o etanol:agua al 40-50%. El extracto hidroalcoh´ olico es recogido y el alcohol es eliminado seguidamente por evaporaci´on. La soluci´on acuosa as´ı obtenida se seca entonces por atomizaci´on o liofilizaci´on, luego se tritura para obtener un extracto total estable. Este extracto total puede ser utilizado tal cual como extracto total seg´ un la invenci´ on.

20

De acuerdo con otro modo de realizaci´on particular de la invenci´ on, los extractos de semillas de cola seg´ un la invenci´on, sensiblemente exentos de metilxantinas, son obtenidos por cualquier procedimiento de extracci´on capaz de eliminar sensiblemente de forma completa las metilxantinas. 25

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As´ı, es posible, a partir de la soluci´ on acuosa obtenida durante la realizaci´ on del procedimiento descrito anteriormente, preparar un extracto sensiblemente exento de metilxantinas, y en particular sensiblemente exento de cafe´ına, seg´ un la invenci´ on, mediante un tratamiento por medio de un disolvente selectivo de la cafe´ına, tal como un disolvente clorado como el diclorometano, el cloroformo o el tricloroetano, o bien otro disolvente solo o una combinaci´ on como se ha indicado en el documento US-A-4.279.937 o EP-B-101.135, a saber; el alcohol bencilico, la metiletilcetona o el acetato de metilo. Se puede igualmente utilizar el procedimiento descrito en el documento US-A-4.279.937 de Procter, aplicable a la nuez de cola, que utiliza una mezcla de alcohol bencilico con otro disolvente, tal como xileno, acetato de etilo, ciclopentano, ciclohexano.

35

Seg´ un una variante de realizaci´ on, las metilxantinas, y en particular la cafe´ına, se extraen solas, en una primera fase, a partir de las semillas de cola, habiendo sido estas semillas preferentemente trituradas previamente. Seguidamente se procede a la extracci´on de las semillas de cola descafeinadas seg´ un un procedimiento cl´ asico tal como el descrito m´as arriba para la obtenci´ on del extracto total. 40

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Diversos procedimientos de extracci´on de cafe´ına, por consiguiente de metilxantinas se describen en la literatura. Por ejemplo, en el Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, (1985), 59, n◦ 9, p´ aginas 917-919, se describe un procedimiento de extracci´ on selectivo de cafe´ına mediante agua caliente de hoja de t´e intacta, que se puede utilizar directamente para la extracci´ on de las metilxantinas en agua. Este procedimiento, aplicado a las semillas de nuez de cola molidas permite obtener semillas de cola descafeinadas. Se pueden tambi´en eliminar las metilxantinas utilizando un procedimiento de extracci´ on con la ayuda de un gas en estado supercr´ıtico, tal como el di´oxido de carbono, como se ha descrito en el documento aginas 57-64, as´ı como el documento Journal of Food Food Technology (Chicago) (1986), 40, n◦ 7, p´ aginas 326-328. Sciences and Technology, (1986), 23, n◦ 6, p´ En las composiciones seg´ un la invenci´ on, la proporci´ on en peso de extractos de cola, con relaci´on al peso total de la composici´on puede variar en amplios limites. Las proporciones preferidas son proporciones en peso comprendidas entre 0,01 y 10% en peso con relaci´on al peso total de la composici´on cosm´etica o dermatol´ ogica. La incorporaci´ on de los extractos de semillas de cola totales o parciales en fases laminares lip´ıdicas hidratadas o en liposomas puede ser realizada de acuerdo con cualquier procedimiento conocido. Estos son elegidos m´as particularmente en funci´ on de las caracter´ısticas m´as o menos lip´ofilas o m´as o menos hidr´ ofilas de los extractos a incorporar.

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ES 2 063 411 T3 Seg´ un un modo preferido de incorporaci´ on, se elige una t´ecnica de preparaci´ on descrita en el documento EP-B1-0087. 993, eventualmente en combinaci´ on con una t´ecnica descrita en el documento EP-B1-0107.159. 5

As´ı, es posible por ejemplo incluir los extractos de semillas de cola totales o parciales en las fases laminares lip´ıdicas hidratadas o liposomas.

10

En la presente descripci´on y las reivindicaciones, el termino “lip´ıdico” en el ejemplo “fase laminar lip´ıdica” cubre todas las sustancias que comprenden una cadena carbonada denominada grasa, generalmente superior a 5 ´atomos de carbono, siendo esta sustancia habitualmente denominada “l´ıpido”.

15

Seg´ un la invenci´ on, se utilizan a titulo de l´ıpidos para formar bien sea el liposoma anteriormente citado, o las fases laminares lip´ıdicas, l´ıpidos anfifilos, es decir constituidos por mol´eculas que tienen un grupo hidr´ ofilo indistintamente i´ onico o no i´onico y un grupo lipofilo, siendo estos l´ıpidos anfifilos susceptibles de formar fases laminares lip´ıdicas en presencia de una fase acuosa.

20

En particular, se pueden citar entre estos l´ıpidos: los fosfol´ıpidos, los fosfoaminol´ıpidos, los glicol´ıpidos, los alcoholes grasos polioxietilenados, los esteres de polioles eventualmente polioxietilenados. Tales substancias est´an por ejemplo constituidas por una lecitina de huevo o de soja, una fosfatidilserina, una esfingomielina, una cerebrosida o un estearato de poliglicerol oxietilenado. Se pueden preparar estas fases laminares lip´ıdicas hidratadas o los liposomas de la forma siguiente: Etapa 1

25

Se disuelve en un disolvente org´ anico con punto de ebullici´on relativamente bajo, por ejemplo inferior on atmosf´erica, tal como diclorometano o metanol, un l´ıpido anfifilo, como por ejemplo a 100◦ C, a la presi´ la lecitina de soja, hidrogenada o no. Se puede, adem´ as, disolver un l´ıpido hidr´ ofobo tal como un esterol, como el colesterol o el β-sitoesterol, y ventajosamente un antioxidante como el α-tocoferol.

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La cantidad de l´ıpidos hidr´ ofobos no debe generalmente ser superior en peso a 0,2 veces la cantidad de l´ıpidos anfifilo. Etapa 2

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Si se desea que los extractos totales o parciales de semillas de cola sean incorporados a la fase lip´ıdica, se puede disolver en la soluci´on obtenida en la etapa 1, de tales extractos. En el caso en que una fracci´ on de extractos no sea solubilizada, esta fracci´on insoluble se elimina por filtraci´on. Las proporciones relativas de l´ıpidos por una parte y de extractos por otra parte como principios activos pueden por ejemplo estar comprendidas, en peso, entre 8: 2 y 9,9: 0,1. Preferentemente, la mezcla se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. Etapa 2 bis

45

En el caso en que se desee encapsular los extractos totales o parciales de semillas de cola en la fase acuosa en el interior de fases laminares lip´ıdicas hidratadas, en lugar de proceder a la etapa 2 indicada anteriormente, los extractos anteriormente citados se disolver´an en agua y preferentemente en una soluci´on acuosa apropiada tal como una soluci´ on tamp´ on tipo “tamp´ on fosfato PBS”. Etapa 3-A

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La mezcla obtenida al final de la etapa 1 o de la etapa 2 se introduce en un matraz rotativo, y se evapora por calentamiento al ba˜ no mar´ıa, eventualmente bajo presi´ on reducida.

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Despu´es de la evaporaci´on del disolvente org´ anico, la pel´ıcula lip´ıdica depositada sobre las paredes se recupera bajo agitaci´ on mediante agua o mediante una soluci´ on acuosa apropiada tal como una soluci´ on tamp´ on tipo “tamp´ on fosfato PBS”. Cuando se utiliza la mezcla directamente obtenida en la etapa 1, sin pasar por la etapa 2, se utiliza la soluci´on acuosa obtenida al final de la etapa 2 bis.

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Preferentemente, la cantidad de agua o de soluci´on acuosa es al menos igual, en peso, a 8 veces la cantidad de l´ıpidos contenida en el matraz. 4

ES 2 063 411 T3

Se obtiene as´ı una suspensi´ on de liposomas, que puede ser seguidamente homogeneizada mediante un medio apropiado tal, como por ejemplo los ultrasonidos. 5

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Etapa 3-B De acuerdo con una variante del procedimiento de preparaci´ on de las composiciones de la invenci´ on que contienen los extractos anteriormente citados incorporados en fases laminares lip´ıdicas hidratadas o liposomas, se utiliza el procedimiento descrito en el documento EP-B1-0087.993, incluyendo la atomizaci´on de la mezcla obtenida al final de la etapa 1 o de la etapa 2, seguida de la dispersi´ on del polvo lip´ıdico as´ı obtenido en una cantidad predeterminada de agua o de soluci´ on acuosa de sustancias a encapsular, en particular la obtenida en la etapa 2 bis. Se obtienen as´ı fases laminares lip´ıdicas poco hidratadas o una suspensi´ on de liposomas, seg´ un se haya elegido dispersar el polvo lip´ıdico en poco o mucho medio acuoso, as´ı como se ha expuesto en el documento europeo anteriormente citado. La dispersi´on de fases laminares hidratadas o de liposomas puede seguidamente homogeneizarse, por ejemplo seg´ un el procedimiento descrito en el documento EP-B1-0 107.559.

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Etapa 4 eventual

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Eventualmente, la dispersi´ on de las fases laminares lip´ıdicas hidratadas o las suspensiones de liposomas obtenidas en la etapa 3-A o 3-B indicadas anteriormente, pueden gelificarse, por ejemplo mezcl´andolas con un gel preparado por separado, como un gel de pol´ımero vin´ılico.

30

Otros fines, caracter´ısticas y ventajas de la invenci´on aparecer´an claramente a la luz de la descripci´on explicativa que sigue realizada con referencia a varios ejemplos ilustrativos que en modo alguno limitar´ıan el alcance de la invenci´on. En estos ejemplos, los porcentajes se facilitan en peso, salvo indicaci´on contraria. Ejemplo 1 Preparaci´ on de una composici´ on simple a base de extractos de semillas de cola

35

Se utiliza como materia prima de partida, los extractos de semillas de cola comercializados por la sociedad italiana Inverni Della Beffa bajo la denominaci´on cola extracto fluido Lipa con un contenido inferior o igual al 0,5% en alcaloides expresada en cafe´ına, a continuaci´ on denominada cola Lipa. 40

A partir de este extracto, se preparan composiciones seg´ un la invenci´on con diferentes proporciones de cola Lipa de 0,1%, 0,5% y 2% mediante disoluci´ on de este extracto en una soluci´ on acuosa tamp´on fosfato o PBS. Despu´es de la disoluci´on, se filtra la soluci´ on obtenida sobre filtro de 0,8µm para eliminar la sustancia insoluble.

45

Se obtienen as´ı composiciones seg´ un la invenci´ on que pueden ser utilizadas tal cual y particularmente para los ensayos de actividad que se describir´ an m´ as adelante.

50

A titulo de comparaci´ on, se preparan igualmente composiciones comparativas a base del producto comercializado por la misma sociedad italiana Inverni, denominado cola extracto seco y con un contenido igual a aproximadamente un 14% en alcaloides expresado en cafe´ına, a continuaci´ on llamado cola 14. Se procede del mismo modo con este extracto cola 14 para preparar soluciones de 0,1%, 0,5% y 2%. Ejemplo 2

55

Composici´ on liposomal seg´ un la invenci´ on conteniendo un extracto de semillas de cola sensiblemente exentos de metilxantina

60

Para realizar esta composici´on, se pueden preparar igualmente diversas composiciones con diversos contenidos de extractos de 0,1%, 0,5% y 2%, en forma liposomal, de la forma siguiente: Se puede partir de soluciones que contienen cola Lipa en soluci´ on acuosa preparada en el ejemplo 5

ES 2 063 411 T3 1 a las cuales se a˜ nade un 1% de polvo lip´ıdico obtenido por el procedimiento de atomizaci´ on descrito en el documento EP-B1-0.087.993, descrito sucintamente en la etapa 3-B anteriormente citada, y que comprende 9 partes de lecitina de soja natural hidrogenada por una parte de β-sitoesterol. 5

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Se dispersa el polvo lip´ıdico bajo agitaci´ on magn´etica en la soluci´on acuosa hasta la obtenci´ on de una suspensi´on en estado homog´eneo. Se procede seguidamente a una ultrasonicaci´ on de estas soluciones, por ejemplo con un aparato de ultrasonicaci´ on denominado LABSONIC 1510, durante 7 min a 200 W y a 4◦ C, con el fin de obtener liposomas cuyo tama˜ no se encuentra comprendido entre 100 y 150 nm tal como se ha determinado en el aparato NanosaizerR de (Coultronic). Mediante este procedimiento, se obtienen as´ı composiciones liposomales que contienen respectivamente 0,1%, 0,5% y 2% en peso de cola Lipa, conforme a la invenci´ on, que pueden ser utilizadas tal cual para constituir composiciones cosm´eticas o dermatol´ogicas, o en combinaci´on con otros agentes activos y/o excipientes como se ejemplificar´a m´as adelante. Estas composiciones se utilizan igualmente m´as adelante para probar su actividad. Ejemplo 3

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Composici´ on liposomal que contiene extractos totales de semillas de cola Se procede como en el ejemplo 2 solo que se utiliza al comienzo las soluciones acuosas preparadas en el ejemplo 1-B que contienen el extracto de cola 14 en lugar de la cola Lipa. 25

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Se obtienen as´ı composiciones liposomales respectivamente de 0,1%, 0,5% y 2% de cola 14. Estas composiciones pueden igualmente ser utilizadas tal cual para la preparaci´on de composici´on cosm´etica o farmac´eutica, particularmente dermatol´ ogica, o completarse mediante otros agentes activos y/o excipientes, como se describir´a m´as adelante. Estas composiciones son adem´as utilizadas tal cual para probar su actividad. Ejemplo 4 Evidencia de la actividad lipol´ıtica de las composiciones de acuerdo con la invenci´ on

35

- Evaluaci´ on de la acci´ on de las composiciones seg´ un la invenci´ on sobre los adipocitos en cultivo.

40

Se ha elegido evaluar la eficacia de las composiciones seg´ un la invenci´ on como agentes lipol´ıticos sobre una l´ınea de pre-adipocitos murinos, tal como una l´ınea 3T3 L1 disponible en el comercio por la Sociedad Flow Laboratories, que han sido seleccionados por su capacidad en convertirse en adipocitos si las condiciones de cultivo lo permiten. (Conforme al m´etodo de Green, H & Kehinde, C, Cell 1 (1974) 113).

45

Esta l´ınea constituye en efecto un modelo de estudio de la diferenciaci´on adipocitaria in vitro ofreciendo la posibilidad cuando el fenotipo adipocitario esta encargado de estudiar las regulaciones del funcionamiento celular seg´ un el medio ambiente extra-celular. Esta diferenciaci´ on y su modulaci´ on van acompa˜ nadas de un cierto numero de modificaciones morfol´ ogicas y bioqu´ımicas y en particular, las modificaciones bioqu´ımicas se refieren a la liberaci´on del glicerol.

50

Resulta pues c´omodo comprobar la eficacia lipol´ıtica de los compuestos a ensayar mediante un dosificado del glicerol liberado en el medio de cultivo despu´es de varios d´ıas de tratamiento. Estos experimentos se realizaron como sigue 55

1) Condiciones de cultivo

60

Los preadipocitos se sembraron en cajas de Petri de 35 mm de di´ ametro (20.000 c´elulas/caja), en presencia de DMEM (“Dulbecco’s Modified Eagle Medium”) que contienen un 10% de suero de ternero fetal y antibi´ oticos (penicilina, estreptomicina). El medio se renueva cada 2-3 d´ıas. 6

ES 2 063 411 T3

En estas condiciones, el cultivo alcanza la confluencia en una semana (D = Do), en esta fase, la diferenciaci´on adipocitaria es activada por la adicci´on de insulina a la concentraci´on de 5 µg/ml del medio de cultivo. 5

Estas c´elulas presentan un estado diferenciado avanzado una semana despu´es de la confluencia (D = DI) 2) Tratamiento - viabilidad 10

Las c´elulas se trataron mediante los productos a ensayar en las fase D7 . Este tratamiento consiste en substituir el medio de cultivo bien sea por el medio completo para el testigo, o por este mismo medio conteniendo el producto a ensayar en diferentes concentraciones. 15

Para el dosificado del glicerol liberado, el medio de cultivo se recuper´ o 24 horas en 7 d´ıas despu´es del tratamiento. El medio que contiene o no el producto a ensayar se renov´ o cada 2-3 d´ıas. 20

25

Se asegur´ o la no toxicidad de los productos sobre las c´elulas en cultivo determinando el porcentaje de prote´ına total seg´ un el m´etodo de Bradford descrito por M.M. Bradford (Analytical Biochemistry (1976), on con sosa 0,5 N, y una coloraci´on en azul de Coomassie. 72, 248-54, y que consiste en realizar una digesti´ Se midi´ o entonces la importancia de la lipolisis realizando un dosificado por bioluminiscencia del glicerol liberado en el medio de cultivo. 3) Dosificado mediante bioluminiscencia del glicerol liberado en el medio de cultivo

30

Los medios de cultivo de los testigos o de los tratados se recuperaron 2 d´ıas en 7 d´ıas despu´es del tratamiento. Los sobrenadantes pueden ser almacenados a -20◦C antes del dosificado. El m´etodo de dosificado del glicerol es el siguiente

35

Se dosifica el glicerol mediante la reacci´on de este con el ATP en presencia del enzima glicerolquinasa seg´ un la reacci´on siguiente: glicerol + ATP glicerolquinasa glicerol 3 fosfato + ADP. 40

El exceso de ATP se dosific´ o instant´ aneamente por bioluminiscencia, una vez que este se puso en presencia del complejo luciferina-luciferasa, seg´ un la reacci´on siguiente: Luciferina + luciferasa + ATP Mg2+ luciferina-luciferasa-AMP → + pirofosfato 45

Luciferina-luciferasa-AMP O2 oxiluciferina + luciferasa → + AMP + CO2 + emisi´on luminosa. La emisi´on luminosa se capt´o mediante fotomultiplicador, por ejemplo un biocontador LumacR 3 M.

50

Durante el mezclado de los reactivos, el m´ aximo de emisi´on luminosa es instant´ aneo. El dosificado propiamente dicho tiene lugar de la forma siguiente a) Preparaci´ on del ATP

55

Se prepar´ o una soluci´ on de ATP procedente de Sigma a 50 µM en una soluci´ on de MgSO4 , 7H2 O a 0,2 mM. on suave y se El ATP se congel´ o a -20◦ C y durante la utilizaci´on experimentar´a una descongelaci´ ◦ conservar´a a 0 C (en hielo) y en la oscuridad.

60

7

ES 2 063 411 T3 b) Preparaci´ on de muestras Se prepar´ o una gama de contrastado de glicerol de 0,25, 0,50, 0,75, 1 mM en el tamp´on ´acido c´ıtrico/NaOH 0,1 M a un pH de 7. 5

El dosificado del glicerol presente en el medio de cultivo se realiz´o despu´es de la congelaci´on y descongelaci´on suave del medio. Se eligi´ o la diluci´ on con el fin de encontrarse entre las concentraciones de 0,20 a 0,90 nanomoles por ml de volumen de reacci´ on. 10

Se realizaron 3 ensayos por muestra. c) M´etodo de dosificado

15

Se pusieron en una cuba de medici´on 10 µl de ATP 50 µM y luego 20 µl de glicerolquinasa disponible por Boehringer, Mannheim, preferentemente purificada y 770 µl de tamp´ on a´cido c´ıtrico/NaOH 0,1 M a un pH de 7. Se a˜ nadieron 100 µl de soluci´ on de glicerol (gama de contraste) o de medio de cultivo convenientemente diluido.

20

Se agit´ o vigorosamente durante 10 s. Se incub´ o 4 min a 20-22◦C en la oscuridad. 25

Se inyectaron 100 µl de luciferina-luciferasa (NRB/lumi PM Kit de Lumac 3 M) con la ayuda de la bomba del biocontador Lumac 3 M. Se integr´ o en 60 s.

30

Se realizaron tres ensayos por muestra. d) Expresi´ on matem´ atica de los resultados

35

un el m´etodo de Entre la luz emitida y y la concentraci´on x en glicerol, se opero por regresi´on seg´ menos cuadrados. Se basa sobre dos criterios para seleccionar la ecuaci´ on: el coeficiente de determinaci´on R2 y el error convencional de la regresi´on (equivalente del ruido de fondo del experimento). La forma polinomial traduce mejor el fen´ omeno. Solo los dos primeros grados aportan una informaci´ on real.

40

En la ecuaci´on, solo se retiene la ecuaci´on del segundo grado que representa la variaci´ on de y de luz emitida en funci´ on de la concentraci´ on de x en glicerol de la forma siguiente: y = a - bx + cx2 45

El coeficiente de determinaci´ on de la curva de contraste debe ser superior al 90% para considerar la gama como valedera. 50

El coeficiente de variaci´on para cada una de las concentraciones de la gama de contraste obtenida por bioluminiscencia es inferior a 5%. e) Resultados

55

Se someti´o al ensayo el dosificado por bioluminiscencia del glicerol en el medio de cultivo despu´es de 2 d´ıas y 7 d´ıas de tratamiento mediante los extractos de cola 14 y cola Lipa a una concentraci´on de 1 mg/l en estado libre como se ha descrito en el ejemplo 1 y bajo forma liposomal como se ha descrito en los ejemplos 2 y 3. Se realizaron tres ensayos por muestra extra´ıda de tres cultivos realizados en las mismas condiciones.

60

Se obtuvieron los resultados siguientes:

8

ES 2 063 411 T3 Resultados Despu´es de 2 d´ıas de tratamiento 5

Activos solos

10

15

20

µ mol de glicerol/ml del medio de cultivo Medio en µ mol/ml % relativo en glicerol

Activos en liposomas

Testigo

Cola 14%

Cola Lipa

Liposoma blanco (testigo)

Liposoma cola 14%

Liposoma cola Lipa

0,79 0,59 0,96 0,78 0,19 100

1,34 1,19 0,71 1,08 0,33 138

1,62 0,81 1,25 1,23 0,41 158

1,80 1,04 0,52 1,12 0,64 100

2,70 3,80 0,90 2,46 1,46 220

3,90 6,37 1,24 3,83 2,57 342

Despu´es de 7 d´ıas de tratamiento 25

Activos solos

Activos en liposomas

30

35

µ mol de glicerol/ml del medio de cultivo Medio de µ en mol/ml

40

% relativo en glicerol

45

50

Testigo

Cola 14%

Cola Lipa

Liposoma blanco (testigo)

Liposoma cola 14%

Liposoma cola Lipa

1,36 0,88 0,75 1,00 0,32 100

1,48 1,18 0,94 1,20 0,27 120

1,20 1,34 1,48 1,34 0,4 134

1,76 1,65 0,76 1,39 0,55 100

3,45 4,80 4,20 4,15 0,68 299

4,20 5,90 4,90 5,00 0,85 360

Se puede as´ı observar, de forma totalmente inesperada, que los extractos de cola Lipa o de cola 14 libres, es decir no incorporados a los liposomas tienen una actividad lipol´ıtica relativamente baja, mientras que en forma liposomal, esta actividad se incrementa radicalmente, siendo este aumento de actividad a´ un mucho m´ as significativo y radical para el extracto de cola Lipa sensiblemente exento de metilxantinas, lo cual resulta totalmente sorprendente, incluso con relaci´on a la forma no liposomal. Diversos ejemplos de formulaciones de composiciones cosm´eticas o farmac´euticas, particularmente dermatol´ogicas, se describen ahora. Ejemplo 5

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Gel dermatol´ ogico adelgazante de liposomas Se prepar´ o una suspensi´on de liposomas seg´ un el ejemplo 2, encapsulando el extracto de cola fluida Lipa. Esta suspensi´on se mezcl´o seguidamente con un gel Carbopol 940R neutralizado preparado por separado. Se obtuvo as´ı la composici´on gelificada siguiente:

9

ES 2 063 411 T3 Lecitina de soja β-sitoesterol Extracto de cola fluida Lipa Carbopol 940R Excipientes acuosos estabilizados por conservantes y antioxidantes csp

5

10

1,0 0,1 1,0 0,4

g g g g

100 g

Este preparado, aplicado diariamente a la cintura, a los muslos y a las caderas permite obtener una disminuci´on sensible de la celulitis en el espacio de una a tres semanas. Ejemplo 6 Emulsi´ on adelgazante de liposomas

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25

30

Composici´ on: Lecitina de soja Extracto de cola 14 Escualeno Conservantes Excipiente acuosos gelificados y perfumados

1,5 2,0 8,5 0,15

g g g g

100,0 g

Para obtener esta composici´on, se realiz´o primeramente una suspensi´ on de liposomas seg´ un el m´etodo del ejemplo 3, encapsulando el extracto de cola 14. Esta suspensi´on se gelific´o seguidamente mediante un gel Carbopol 940R se neutraliz´o a 1,25% preparado por separado. El gel obtenido se emulsion´ o con una fase aceitosa a base de escualeno. La emulsi´on obtenida, de consistencia agradable puede ser aplicada diariamente sobre las partes del cuerpo a tratar para una cura de dos a tres semanas.

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ES 2 063 411 T3 REIVINDICACIONES

5

1. Utilizaci´on de fases laminares lip´ıdicas hidratadas o de liposomas que contienen extractos totales o parciales de semillas de cola, que contienen metilxantinas, para la preparaci´on de una composici´ on cosm´etica o dermatol´ ogica, particularmente de actividad adelgazante o anti-celul´ıtica.

10

2. Procedimiento de preparaci´ on de una composici´ on cosm´etica o dermatol´ogica, particularmente de actividad adelgazante o anti-celul´ıtica, caracterizado porque comprende la incorporaci´ on de fases laminares lip´ıdicas hidratadas o de liposomas que contienen extractos totales o parciales de semillas de cola, que contienen metilxantinas, en un excipiente cosm´etica o dermatol´ ogicamente aceptable. 3. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 2, caracterizado porque los extractos totales son extractos secos con contenido en metilxantina comprendida entre aproximadamente un 10 y aproximadamente un 14% en peso.

15

20

4. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque la cola a partir de la cual se obtienen los extractos de la invenci´ on es la planta Cola Nitida o la planta Cola Vera Schum. 5. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la proporci´ on en peso del extracto se encuentra comprendida entre 0,01 y 10% en peso con relaci´on al peso total de la composici´ on.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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