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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 187 516 kInt. Cl. : C12N 15/12, C12N 15/62

11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

C12N 15/85, C07K 14/52 C07K 16/24, C12Q 1/68 A61K 38/19

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 94300267.5 kFecha de presentaci´on: 14.01.1994 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 607 054 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 20.07.1994

T3

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54 T´ıtulo: Quimioquina novedosa producida por las c´ elulas hematopoyeticas y ADN que codifica dicha

quimioquina.

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73 Titular/es: Tasuku Honjo

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72 Inventor/es: Honjo, Tasuku;

30 Prioridad: 14.01.1993 JP 22098/93

Kanyu-chi, Oiwake-cho Kita-Shirakawa, Sakyo-ku, Kyoto, JP ONO PHARMACEUTICAL CO., LTD.

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.06.2003

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 187 516 T3

16.06.2003

Aviso:

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Tashiro, Kei y Tade, Hideaki

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74 Agente: Ungr´ıa L´ opez, Javier

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 187 516 T3 DESCRIPCION Quimioquina novedosa producida por las c´elulas hematopoyeticas y ADN que codifica dicha quimioquina. 5

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Esta invenci´on se refiere a un polip´eptido novedoso y a un ADN que codifica el mismo. M´ as concretamente, se refiere a un polip´eptido novedoso producido por una l´ınea celular estrom´atica espec´ıfica y a un ADN que codifica dicho polip´eptido. Con el fin de obtener polip´eptidos espec´ıficos (por ejemplo, factores de proliferaci´ on y/o diferenciaci´on) o un ADN que codifique los mismos, se han empleado generalmente m´etodos que comprenden confirmar la actividad biol´ ogica diana en un tejido o un medio de cultivo celular y clonar despu´es un gen a trav´es del aislamiento y la purificaci´ on de un polip´eptido y m´etodos adicionales que comprenden la clonaci´on de la expresi´ on de un gen con las pautas de la actividad biol´ ogica. No obstante, frecuentemente se observa que un gen, que ha sido clonado con las pautas de una cierta actividad, codifica un polip´eptido conocido puesto que muchos polip´eptidos fisiol´ ogicamente activos que existen in vivo tienen diferentes actividades biol´ ogicas. Adicionalmente, la mayor´ıa de los p´eptidos fisiol´ogicamente activos intravitales son secretados solamente en cantidades vestigiales, lo que hace dif´ıcil su aislamiento y purificaci´ on y la confirmaci´ on de la actividad biol´ ogica. Los r´ apidos desarrollos recientes en las t´ecnicas para construir ADNc y en las t´ecnicas de secuenciaci´on han hecho posible secuenciar r´ apidamente una gran cantidad de ADNc. Utilizando estas t´ecnicas, se emplea ahora un procedimiento, que comprende construir bancos de ADNc a partir de diferentes c´elulas y tejidos, clonar los ADNc al azar, identificar las secuencias de nucle´otidos de los mismos, expresar el polip´eptido correspondiente y analizar despu´es sus funciones fisiol´ogicas. Aunque este procedimiento es ventajoso ya que se puede clonar un gen y se puede obtener la informaci´ on de su secuencia de nucle´otidos sin an´ alisis bioqu´ımico o gen´etico, el gen diana puede a menudo ser identificado s´ olo por casualidad. Los autores de la presente invenci´on han estudiado la clonaci´ on de genes para factores de proliferaci´on y diferenciaci´on en los sistemas hematopoy´etico e inmune. Han prestado atenci´ on al hecho de que la mayor parte de las prote´ınas secretoras tales como los factores de proliferaci´ on y/o diferenciaci´on (por ejemplo diferentes citoquinas) y prote´ınas de membrana tales como los receptores de la misma (m´as adelante estas prote´ınas ser´ an referidas generalmente como prote´ınas secretoras y similares) tienen secuencias denominadas p´eptidos se˜ nal en los extremos N. Se han realizado estudios extensos para proporcionar un procedimiento para clonar eficaz y selectivamente genes que codifican p´eptidos se˜ nal. Como resultado, se ha ideado ahora un procedimiento por medio del cual un fragmento N-terminal puede ser amplificado eficazmente y se puede examinar f´ acilmente la existencia de un p´eptido se˜ nal. Seg´ un este procedimiento, los ADNc con una elevada probabilidad de contener un p´eptido se˜ nal son ligados en ambos extremos a ligadores que contienen sitios para enzimas de restricci´on que son diferentes entre s´ı. Estos fragmentos son producidos r´ apidamente en una gran cantidad mediante el m´etodo de reacci´on en cadena de la polimerasa (PCR) con el fin de elevar el contenido de los fragmentos con una alta probabilidad de contener un p´eptido se˜ nal. A continuaci´ on, el fragmento anteriormente mencionado es introducido en un vector de expresi´on que contiene el ADN que codifica una prote´ına secretora conocida o similar pero que carece del ADN que codifica el correspondiente p´eptido se˜ nal. Muchas prote´ınas secretoras y similares son secretadas o expresadas sobre la membrana celular incluso si el p´eptido se˜ nal ha sido sustituido por un p´eptido se˜ nal de otra prote´ına. Por lo tanto, si la prote´ına secretora conocida o similar es expresada sobre la membrana celular o fuera de las c´elulas, esto confirma que un fragmento de ADNc correspondiente a un p´eptido se˜ nal ha sido introducido en el vector de expresi´ on. De este modo los autores de la presente invenci´ on han ideado un m´etodo conveniente para la detecci´ on de la inserci´ on de ADNc que codifica un p´eptido se˜ nal. La reacci´on en cadena de la polimerasa es conocida como un m´etodo para amplificar los fragmentos de ADN espec´ıficos en una gran cantidad. Asimismo se sabe que muchas prote´ınas secretoras y similares pueden ser expresadas incluso si el p´eptido se˜ nal de las mismas es sustituido por el de otra prote´ına secretora o similar. No obstante, se cree que no ha habido sugerencia de que estas t´ecnicas sean utilizadas como han hecho los autores de la invenci´ on para proporcionar un procedimiento para clonar selectivamente un p´eptido se˜ nal. Se sabe que las c´elulas hematopoy´eticas secretan diversos factores de proliferaci´on y/o diferenciaci´on ejemplificados por la interleuquina. Utilizando el procedimiento que han ideado, los autores de la presente invenci´on han buscado un factor novedoso (polip´eptido) producido por las c´elulas hematopoy´eticas. 2

ES 2 187 516 T3 Como resultado, han identificado un polip´eptido novedoso y un ADN que codifica el mismo.

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Las b´ usquedas con ordenador para identificar polip´eptidos que tengan secuencias id´enticas o altamente hom´ ologas a la del polip´eptido de la presente invenci´ on y los ADN que codifican el mismo no han identificado ninguna de tales secuencias. De este modo, se cree que el polip´eptido de la presente invenci´ on y el ADN que codifica el mismo son novedosos. Adicionalmente, el an´alisis de homolog´ıa ha revelado que el polip´eptido de la presente invenci´ on es un miembro de la familia de las quimioquinas ya que tiene el patr´ on Cys-X-Cys (X es un amino´ acido opcional). Por consiguiente, la presente invenci´on proporciona un polip´eptido en forma sustancialmente purificada que tiene el amino´acido mostrado en la SEC ID NUM: 1, la secuencia de amino´ acidos de los restos 1 a 70 mostrada en la SEC ID NUM: 1 o una secuencia de amino´ acidos que tenga una homolog´ıa del al menos el 90 % con la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID NUM: 1 en toda su longitud o con la secuencia de amino´acidos de los restos 1 a 70 mostrada en la SEC ID NUM: 1. Asimismo se proporciona el ADN que codifica semejante polip´eptido. El polip´eptido que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NUM: 1 ha sido identificado utilizando el procedimiento ideado por los autores de la presente invenci´ on. La invenci´on proporciona adicionalmente:

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– un vector de replicaci´on y expresi´ on que comprende el ADN de la invenci´ on; – una c´elula hu´esped transformada o transfectada con un vector de la invenci´ on;

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– un m´etodo para producir un polip´eptido cuyo m´etodo comprende cultivar c´elulas hu´esped de la invenci´on en condiciones eficaces para expresar un polip´eptido de la invenci´on; – un anticuerpo monoclonal o policlonal para un polip´eptido de la invenci´on; y – una composici´ on farmac´eutica que contiene un polip´eptido o anticuerpo de la invenci´on asociado con un diluyente o portador farmac´euticamente aceptable.

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La Fig. 1 es una vista conceptual del procedimiento para construir un banco de ADNc seg´ un el procedimiento ideado por los autores de la presente invenci´ on. La Fig. 2 es un diagrama de flujo para la construcci´ on de un vector plasm´ıdico pcDL-SRα. 35

La Fig. 3 es una vista conceptual del procedimiento para construir un fragmento EcoRI-SacI de hG-CSF. La Fig. 4 es una vista conceptual del procedimiento para construir un fragmento SacI-KpnI de ADNc de hTAC.

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La Fig. 5 es un diagrama de flujo para la construcci´ on de pSGT y pSRT. La Fig. 6 es una vista conceptual del procedimiento para construir un fragmento EcoRI-SacI de hRARα.

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La Fig. 7 es un histograma FACS que muestra la expresi´ on de una prote´ına de fusi´ on hG-CSF-hTac sobre la membrana. La Fig. 8 es un histograma FACS que muestra la expresi´ on de una prote´ına de fusi´ on hRAR-hTac sobre la membrana.

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La Fig. 9 es una vista conceptual de la primera mitad del procedimiento para construir el banco de ADNc del Ejemplo. La Fig. 10 es una vista conceptual de la segunda mitad del procedimiento para construir el banco de ADNc del Ejemplo.

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La Fig. 11 es un perfil de car´ acter hidr´ ofobo del (una parte de) polip´eptido seg´ un la presente invenci´ on. La presente invenci´on se refiere de este modo a un polip´eptido novedoso que ha sido identificado utilizando el procedimiento ideado por los autores de la presente invenci´on para construir un banco de ADNc. En particular, se refiere a:

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(1) un polip´eptido que consta de una secuencia de amino´acidos representada por la SEC ID NUM: 1, (2) un ADN que codifica el polip´eptido (1); 3

ES 2 187 516 T3 (3) un ADN que tiene una secuencia de nucle´otidos representada por la SEC ID NUM: 4; y (4) un ADN que tiene una secuencia de nucle´otidos representada por las SEC ID NUM: 3. 5

Un polip´eptido de la Sec ID N´ um. 1 en forma sustancialmente purificada comprender´ a generalmente el polip´eptido en una preparaci´ on en la cual m´ as del 90 %, v.g. el 95 %, el 98 % o el 99 % del polip´eptido de la preparaci´ on es aqu´el de la Sec ID N´ um. 1.

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Un hom´ ologo polipept´ıdico de la Sec. ID N´ um. 1 ser´a hom´ ologo al menos en un 90 % y m´as preferiblemente al menos en un 95 % al polip´eptido de la Sec. ID N´ um. 1 a lo largo de una regi´ on de al menos 30, por ejemplo 40, 60 o 100 o m´ as amino´ acidos contiguos. Tales hom´ologos polipept´ıdicos ser´an referidos m´ as abajo como polip´eptido seg´ un la invenci´ on.

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Generalmente, los fragmentos de la Sec. ID N´ um. 1 o sus hom´ ologos tendr´ an al menos 30, por ejemplo 40, 50 o 60 amino´ acidos de longitud, y tambi´en est´an abarcados por el t´ermino “un polip´eptido seg´ un la invenci´on” utilizado aqu´ı. Los fragmentos concretos de los polip´eptidos de la invenci´ on son fragmentos que incluyen los restos amino´acido numerados como 1-70 en la Sec. ID N´ um. 1 o un hom´ ologo de la misma.

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Un ADN susceptible de hibridar selectivamente con el ADN de la Sec ID N´ um. 3 o 4 ser´a hom´ ologo generalmente al menos en un 90 % y m´as preferiblemente al menos en un 95 % al ADN de la Sec ID N´ um. 3 o 4 a lo largo de una regi´ on de al menos 20, preferiblemente al menos 30, por ejemplo 40, 60 o 100 o m´as nucle´otidos contiguos. Semejante ADN estar´ a abarcado por el t´ermino “ADN seg´ un la invenci´ on”. Un ADN concreto susceptible de hibridar selectivamente con el ADN de la Sec ID N´ um. 3 o 4 es el nucle´otido de restos numerados como 139-348 en la Sec ID N´ um. 1 o un fragmento del mismo. El ADN seg´ un la invenci´on puede ser utilizado para producir un cebador, v.g. un cebador para la PCR, una sonda v.g., marcada mediante medios convencionales utilizando marcas radiactivas o no radiactivas, o el ADN puede ser clonado en un vector. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos del ADN de la Sec ID N´ um. 3 o 4 tendr´ an una longitud de al menos 15, preferiblemente al menos 20, por ejemplo 25, 30 o 40 nucle´ otidos. El ADN seg´ un la invenci´ on puede ser producido recombinantemente, sint´eticamente, o mediante cualquiera de los m´etodos asequibles para los expertos en la t´ecnica. Una realizaci´on adicional de la invenci´ on proporciona vectores de replicaci´on y expresi´ on que comprenden el ADN seg´ un la invenci´ on. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de pl´asmidos, de virus o de fagos proporcionados con un origen de replicaci´ on, opcionalmente un promotor para la expresi´ on de dicho ADN y opcionalmente un regulador del promotor. El vector puede contener uno o m´ as genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina. El vector puede ser utilizado in vitro, por ejemplo para la producci´ on del ARN correspondiente al ADN, o utilizado para transformar una c´elula hu´esped. Una realizaci´on adicional de la invenci´ on proporciona c´elulas hu´esped transformadas o transfectadas con los vectores para la replicaci´on y la expresi´on del ADN seg´ un la invenci´on, incluyendo el ADN de Sec ID N´ um. 3 o 4 o el marco de lectura abierto del mismo. Las c´elulas ser´an elegidas para que sean compatibles con el vector y pueden ser por ejemplo bacterianas, de levadura, de insecto o de mam´ıfero. El ADN seg´ un la invenci´ on tambi´en puede ser insertado en los vectores descritos antes en una orientaci´ on antisentido con el fin de proporcionar la producci´ on de ARN (ADN) antisentido. El ARN (ADN) antisentido tambi´en puede ser producido mediante m´etodos sint´eticos. Semejante ARN (ADN) antisentido puede ser utilizado en un m´etodo para controlar los niveles de un polip´eptido de la invenci´on en una c´elula.

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Una realizaci´on adicional de la invenci´ on proporciona un m´etodo para producir un polip´eptido que comprende cultivar c´elulas hu´esped de la presente invenci´on en condiciones eficaces para expresar un polip´eptido de la invenci´on. Preferiblemente, adem´ as, semejante m´etodo se lleva a cabo en condiciones en las que el polip´eptido de la invenci´on es expresado y despu´es secretado a partir de las c´elulas hu´esped.

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Asimismo la invenci´on proporciona anticuerpos monoclonales o policlonales para un polip´eptido seg´ un la invenci´on. La invenci´on proporciona adicionalmente un procedimiento para la producci´ on de anticuerpos monoclonales o policlonales para los polip´eptidos de la invenci´ on. Los anticuerpos monoclonales 4

ES 2 187 516 T3 pueden ser preparados mediante la tecnolog´ıa de hibridomas convencional utilizando un polip´eptido de la invenci´on o un fragmento del mismo, como inmun´ ogeno. Los anticuerpos policlonales tambi´en pueden ser preparados mediante medios convencionales que comprenden inocular en un animal hu´esped, por ejemplo una rata o conejo, un polip´eptido de la invenci´on y recuperar el suero inmune. 5

La presente invenci´on tambi´en proporciona composiciones farmac´euticas que contienen un polip´eptido de la invenci´on, o un anticuerpo del mismo, asociado con un diluyente o portador farmac´euticamente aceptable. 10

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La invenci´on proporciona asimismo un polip´eptido seg´ un la invenci´ on o un anticuerpo para su uso en un m´etodo de terapia o diagnosis en el organismo humano o animal. Entre los polip´eptidos de la presente invenci´ on se incluyen no solo aquellos que tienen la secuencia de amino´ acidos representada por la SEC ID NUM. 1 sino tambi´en aquellos con una deleci´on parcial de la misma (por ejemplo, un polip´eptido que consta de la parte de prote´ına madura sola, o que consta de una parte de la prote´ına madura esencialmente requerida para la expresi´ on de la actividad biol´ ogica), aquellos con una reposici´ on parcial con otro u otros amino´acidos (por ejemplo, un polip´eptido en el que algunos de los amino´ acidos son repuestos con aquellos que tienen propiedades similares) y aquellos con adici´on o inserci´on parcial de uno o varios amino´ acidos.

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Es bien sabido que existen hasta seis codones diferentes que pueden codificar un u ´nico amino´acido (por ejemplo, un tipo de cod´ on para Met a la vez que seis tipos de cod´ on para Leu). Por consiguiente, la secuencia de nucle´otidos del ADN puede ser cambiada sin alterar la secuencia de amino´ acidos del polip´eptido. 25

En el ADN especificado en (2) se incluyen todas las secuencias de nucle´ otidos que codifican el polip´eptido representado por la SEC ID NUM. 1. Los cambios en la secuencia de nucle´ otidos ocasionan a veces un incremento en la productividad de polip´eptido. 30

El ADN especificado en (3) es una realizaci´on del ADN especificado en (2) y representa una secuencia natural. El ADN especificado en (4) representa una secuencia en la que una regi´on no traduccional natural es a˜ nadida al ADN especificado en (3).

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Un p´eptido se˜ nal es una regi´ on altamente hidr´ ofoba localizada inmediatamente aguas abajo del amino´acido Met de inicio de la traducci´ on. Se supone que el p´eptido se˜ nal del polip´eptido de la presente invenci´on reside en una regi´ on que oscila entre la Met de la posici´on 1 y la Ser de la posici´on 19 de la secuencia de amino´acidos representada por la SEC ID NUM. 1. La regi´ on esencialmente responsable de la expresi´ on de la actividad biol´ ogica corresponde a la parte de la secuencia de amino´acidos de la SEC ID NUM. 1 que carece del p´eptido se˜ nal, es decir, la parte de prote´ına madura. De este modo el p´eptido se˜ nal nunca tiene que ver con la actividad. Una vez que se han determinado las secuencias de nucle´ otidos representadas por la SEC ID NUM. 3 y N´ um. 4, el ADN de la presente invenci´ on puede ser sintetizado qu´ımicamente. Por otra parte, el ADN de la presente invenci´ on puede ser obtenido sintetizando qu´ımicamente fragmentos de dicha secuencia de nucle´otidos e hibridando mediante el uso de los fragmentos como sonda. Adicionalmente, el ADN diana puede ser producido en una cantidad deseada introduciendo un ADN vector que contenga dicho ADN en un hu´esped apropiado e incubando despu´es el hu´esped.

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Entre los ejemplos de los m´etodos para obtener el polip´eptido de la presente invenci´ on se incluyen: (1) aislamiento y purificaci´ on a partir de tejidos vitales o c´elulas cultivadas; 55

(2) s´ıntesis qu´ımica de p´eptidos; y (3) producci´ on mediante el uso de t´ecnicas de recombinaci´on g´enica. Desde el punto de vista industrial, es preferible el m´etodo descrito en (3).

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Entre los ejemplos del sistema de expresi´ on (hu´esped-sistema vector) para producir el polip´eptido mediante el uso de las t´ecnicas de recombinaci´on g´enica se incluyen los de bacterias, levaduras, c´elulas de insectos y c´elulas de mam´ıferos.

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Con el fin de expresar en E. coli, por ejemplo, se a˜ nade un cod´ on iniciador (ATG) al extremo 5’ del ADN que codifica la regi´on de la prote´ına madura. El ADN obtenido de este modo es ligado despu´ es aguas abajo de un promotor apropiado (por ejemplo, promotor trp, promotor lac, promotor λpL, promotor T7, etc.) e insertado en un vector susceptible de funcionar en E. coli (por ejemplo, pBR322, pUC18, pUC19, etc.), construyendo de este modo un vector de expresi´ on. A continuaci´ on, la cepa de E. coli (por ejemplo E. coli DH1, E coli JM109, E. coli HB101, etc.) transformada con este vector de expresi´ on es incubada en un medio apropiado. De este modo se puede obtener el polip´eptido diana a partir de las c´elulas incubadas. Por otra parte, se puede utilizar un p´eptido se˜ nal bacteriano (por ejemplo, un p´eptido se˜ nal de pelB) y de este modo el polip´eptido puede ser secretado en el periplasma. Adem´as, se puede producir una prote´ına de fusi´ on junto con otro polip´eptido. La expresi´on en c´elulas de mam´ıfero puede ser efectuada, por ejemplo, de la siguiente manera. Es decir, se inserta un ADN que codifica la secuencia de nucle´otidos representada por la SEC ID NUM: 3 aguas abajo de un promotor apropiado (por ejemplo, promotor SV40, promotor LTR, promotor de la metalotione´ına, etc.) en un vector apropiado (por ejemplo, vector de retrovirus, vector del virus del papiloma, vector del virus vaccinia, vector de la serie SV40, etc.), construyendo de este modo un vector de expresi´on. A continuaci´ on, se transforman c´elulas de mam´ıfero apropiadas (por ejemplo, c´elulas COS-7 de mono, c´elulas CHO de h´ amster Chino, c´elulas L de rat´ on, etc.) con el vector de expresi´on obtenido antes y el transformante es incubado en un medio apropiado. El polip´eptido diana obtenido de este modo puede ser secretado al medio de cultivo. El polip´eptido as´ı obtenido puede ser aislado y purificado mediante m´etodos bioqu´ımicos convencionales. El polip´eptido novedoso que es sujeto de la presente invenci´on es producido y secretado a partir de una l´ınea celular estrom´atica. Por lo tanto, el polip´eptido tiene actividades biol´ ogicas referentes a la supervivencia y proliferaci´on de las c´elulas pluripotenciales hematopoy´eticas y la proliferaci´on y diferenciaci´on de c´elulas B y de c´elulas mieloides, y actividad quimioatrayente de neutr´ ofilos. Por consiguiente, el polip´eptido de la presente invenci´ on es utilizable per se como agente para prevenir o tratar, por ejemplo, la anemia o la leucopenia, las infecciones, etc. Adem´as, el polip´eptido anteriormente mencionado existente in vivo puede ser analizado utilizando un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal para dicho polip´eptido, que es aplicable a los estudios sobre la relaci´on entre dicho polip´eptido y las enfermedades o a la diagnosis de enfermedades y similares. El anticuerpo policlonal y el anticuerpo monoclonal pueden ser preparados mediante un m´etodo convencional con el uso de dicho polip´eptido o un fragmento del mismo como ant´ıgeno.

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El ADN seg´ un la presente invenci´ on sirve como molde importante y esencial en la producci´on del polip´eptido de la presente invenci´ on que se espera sea muy u ´ til. Adicionalmente, el ADN de la presente invenci´on es aplicable a la diagnosis y el tratamiento de las enfermedades hereditarias, es decir, la terapia g´enica, y la terapia con el cese de la expresi´on del polip´eptido utilizando ADN (ARN) antisentido. Adem´as, se puede aislar el ADN gen´omico utilizando el ADN de la presente invenci´ on como sonda. De un modo similar, se pueden aislar un gen humano para un polip´eptido relacionado que sea altamente hom´ ologo al ADN de la presente invenci´ on y un gen de un organismo distinto del humano para un polip´eptido que sea altamente hom´ ologo al polip´eptido de la presente invenci´ on. Ejemplos Se ilustran los siguientes Ejemplos y Ejemplo de Referencia, pero no limitan la presente invenci´on. Ejemplo de Referencia 1

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Construcci´ on y expresi´ on del pl´ asmido pcDL-SRα-h-G-CSF-hTac (pSGT) y del pl´ asmido pcDL-SRαhRARα-hTac (pSRT)

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Se construy´o un pl´ asmido, en el que un ADNc que codifica una prote´ına de fusi´ on de hG-CSF (factor estimulador de las colonias de granulocitos humano, un ejemplo t´ıpico de una prote´ına que tiene un p´eptido se˜ nal) o hRARα (receptor de a´cido retin´oico humano α, un ejemplo t´ıpico de una prote´ına que no tiene p´eptido se˜ nal), con hTac (receptor de IL-2 humano α, utilizado como gen informador) estaba integrado en un vector plasm´ıdico de expresi´on en c´elulas eucariotas pcDL-SRα que ten´ıa un promotor SRα [descrito en Mol. Cell. Biol., 8, 466 (1.988), proporcionado por Dr. Yutaka Takebe, National Institute of Health]. Tras la transformaci´on, se examin´ o la expresi´on de la prote´ına informadora sobre la membrana.

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ES 2 187 516 T3 (1) Empleando el pl´ asmido pSP72-hG-CSF, en el que el ADNc de hGCSF hab´ıa sido integrado en el sitio EcoRI de un pl´ asmido pSP72 (adquirido de Promega), como molde y utilizando un cebador con el promotor SP6 (adquirido de Takara Shuzo Co., Ltd.) y a esto se a˜ nadi´ o un cebador espec´ıfico de hG-CSF que ten´ıa un sitio SacI. (SEC ID NUM. 5): 5

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Se realizaron 25 ciclos de la PCR (a 95◦ C durante un minuto, a 48◦ C durante dos minutos y a 72◦C durante dos minutos). El fragmento de ADN amplificado fue digerido con SacI-EcoRI y subclonado de una vez en un pl´ asmido pBlue script SK(+)(pBS). Tras digerir con SacI-EcoRI de nuevo, se obtuvo un fragmento EcoRI-SacI de hG-CSF. Por otra parte, un pl´asmido pBS-hTac, en el que el ADNc de hTac hab´ıa sido integrado en el sitio HindIII de pBS, fue digerido con SacI-KpnI para de ese modo dar un fragmento SacI-KpnI de ADNc de hTac con la deleci´ on de la secuencia se˜ nal. Estos fragmentos fueron integrados en el sitio EcoRI-KpnI de pcDL-SRα con una deleci´on de desechos (Fig. 2) para dar de ese modo un pl´ asmido pcDL-SRα-hG-CSF-hTac (pSGT) (Figs. 3, 4 y 5). A continuaci´ on, empleando un pl´ asmido pGEM3-hRARα, donde el ADNc de hRARα ha sido integrado en el sitio EcoRI de un pl´ asmido pGEM3, como molde y utilizando un cebador con un promotor SP6 y un cebador espec´ıfico hRARα que ten´ıa un sitio SacI a˜ nadido. (SEC ID NUM. 6):

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Se realiz´ o la PCR. Con posterioridad, se repiti´ o el procedimiento empleado en el caso de G-CSF anteriormente mencionado para dar de ese modo un pl´ asmido pcDL-SRα-hRARα-hTac (pSRT) (Figs. 6, 4 y 5). (2) El pSGT o el pSRT obtenidos en el apartado (1) anterior fueron transfectados en c´elulas COS-7 mediante el m´etodo del DEAE-dextrano [descrito con detalle en Current Protocol in Molecular Biology, cap´ıtulo 9.2.1]. Al cabo de 48 horas, las c´elulas fueron cosechadas de una bandeja e incubadas junto con anticuerpo IgG anti-Tac de rat´ on durante 20 minutos sobre hielo. Tras eliminar los anticuerpos libres, la mezcla fue incubada junto con anticuerpo IgG anti-rat´ on de cabra marcado con isotiocianato de fluoresce´ına (FITC) durante 20 minutos sobre hielo. Tras eliminar de nuevo los anticuerpos, se examin´o la expresi´on de una prote´ına de fusi´ on G-CSF-Tac o RARα-Tac sobre la membrana con un clasificador de c´elulas activadas por fluorescencia (Modelo FACS Can, fabricado por BECTON DICKINSON, referido m´as adelante simplemente como FACS). Las Figs. 7 y 8 muestran los resultados de la evaluaci´on. Como se muestra en la Fig. 7, G-CSF-Tac era expresado sobre la membrana as´ı como Tac. Como se muestra en la Fig. 8, por otra parte, RARα-Tac no era detectada sobre la membrana sino que permanec´ıa dentro de las c´elulas. Ejemplo 1

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Construcci´ on de un banco de ADNc que tiene selectividad para los p´eptidos se˜ nal (Figs. 9 y 10)

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Se extrajo el ARN total de la l´ınea celular estrom´atica de rat´ on ST2 [c´elulas que apoyan la supervivencia y la proliferaci´ on de las c´elulas del tallo hemetopoy´etico y la proliferaci´ on y diferenciaci´on de las c´elulas B y de las c´elulas mieloides; referencia EMBO J., 7, 1337 (1.988)] mediante el m´etodo de la guanidina a´cida-fenol-cloroformo (AGPC) [descrito con detalle en “Saibo Kogaku Jikken Protokoru (Protocol in Cellular Engineering Experiments)”, publicado por Shujun-sha, 28 - 31]. Despu´es el ADN R , comercializado por Takara Shuzo poli A fue purificado utilizando l´ atex oligo (dT) (Oligotex-dT30 7

ES 2 187 516 T3 Co., Ltd.). Utilizando un hex´ amero al azar como cebador, se sintetiz´o un ADNc de hebra sencilla con la transcriptasa inversa y se a˜ nadi´ o dT al extremo 3’ del mismo mediante el uso de desoxitransferasa terminal. Un 17 mero dA ligado a un sitio para una enzima de restricci´ on que conten´ıa EcoRI (SEC ID NUM. 7): 5

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fue recocido y se sintetiz´o un ADNc de doble hebra utilizando el mismo como cebador. Despu´es el ADNc fue fragmentado mediante ultrasonicaci´ on con el fin de proporcionar una longitud media de 300 pb y los ADNc de 200 a 500 pb fueron fraccionados mediante electroforesis en gel de agarosa. Tras volver romos los extremos con ADN polimerasa de T4, se lig´o un ligador solitario que conten´ıa un sitio SacI

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[ver Nucleic Acids Res., 18, 4293 (1.990)] y los ADNc de 200 a 500 pb fueron fraccionados de nuevo mediante electroforesis en gel. Utilizando un cebador (NLC) que contiene un sitio EcoRI (SEC ID NUM. 10):

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y otro cebador (LLHES) que contiene un sitio SacI (SEC ID NUM. 11)

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Se realizaron 25 ciclos de PCR (a 94◦C durante un minuto, a 50◦ C durante dos minutos y a 72◦C durante dos minutos). El ADNc amplificado fue digerido con SacI y EcoRI y los ADNc de 250 a 500 pb fueron fraccionados mediante electroforesis en gel de agarosa. El ADNc fue ligado a un pl´ asmido obtenido digiriendo pSRT (preparado en el Ejemplo de Referencia 1) con SacI y EcoRI utilizando ADN ligasa de T4. Tras la transformaci´on de una cepa DH5α de E. coli, se obtuvo un banco de ADNc que ten´ıa selectividad para los p´eptidos se˜ nal. Ejemplo 2 Rastreo y an´ alisis de ADNc que codifica el p´eptido se˜ nal

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Aproximadamente 1.200 colonias del banco obtenido en el Ejemplo 1 fueron divididas en 24 reservas (aproximadamente 50 colonias/reserva). Los pl´asmidos de cada una de las reservas fueron aislados mediante el m´etodo miniprep y transfectados en c´elulas COS-7 mediante el m´etodo del DEAE-dextrano. Al cabo de 48 a 72 horas, se llev´o a cabo la tinci´on de la superficie celular para Tac del transfectante de la misma manera que se describe en el Ejemplo de Referencia 1 y se seleccionaron 6 reservas positivas bajo el microscopio de fluorescencia. Las colonias de una reserva de entre las 6 reservas positivas fueron divididas adicionalmente y se repiti´ o el mismo procedimiento descrito antes hasta que se obtuvo un clon individual. De este modo se obtuvo un clon positivo (pS-TT3), Con posterioridad, utilizando dos cebadores sint´eticos (SEC ID NUM: 12): 8

ES 2 187 516 T3 5’ TTTACTTCTAGGCCTGTACG 3’ (20 bases aguas arriba del sitio de clonaci´ on EcoRI, para el sentido) 5

y (SEC ID NUM. 13): 5’ CCATGGCTTTGAATGTGGCG 3’ (20 bases aguas abajo del sitio de clonaci´on SacI, para el antisentido)

10

15

que eran espec´ıficos para el vector pcDL-SRα-Tac, se determin´o la secuencia de nucle´otidos del inserto TT3. Se busc´ o un marco de lectura abierto tras el ADNc de Tac con la deleci´on de la secuencia se˜ nal en marco y se convirti´o en la secuencia de amino´acidos deducida. Tras realizar un perfil del car´ acter hidr´ ofobo, se confirm´ o que una regi´ on hidr´ ofoba caracter´ıstica para un p´eptido se˜ nal estaba contenida all´ı (Fig. 11). Adicionalmente, se examin´ o la homolog´ıa con la base de datos sobre el ADN y los niveles de amino´acidos. Como resultado, se ha encontrado que el clon TT3 codifica una prote´ına desconocida. Ejemplo 3 Rastreo del ADNc con toda su longitud y determinaci´ on de la secuencia de nucle´ otidos

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R Ramda System (comercializado por BRL). Se construy´o un banco de ADNc utilizando Super Script A continuaci´ on se digiri´o pS-TT3 con SacI y EcoRI y se prepar´ o un fragmento de ADNc de TT3 mediante electroforesis en gel de agarosa. El banco fue rastreado utilizando un fragmento de ADNc de TT3 oligo-marcado como sonda y de este modo se obtuvo un n´ umero positivo de clones. Entre estos clones, se seleccion´o un clon TT3-1-6 que mostraba el inserto m´ as largo y se subclon´ o el fragmento SalI-NotI escindido del vector λgt22A en pBS para dar de ese modo un pl´ asmido pBS-TT316. Utilizando un cebador T7, se determin´ o la secuencia de nucle´otidos de 300 pb en el 5’-terminal del ADNc de TT3-1-6. As´ı se confirm´o que exist´ıa una secuencia id´entica a TT3 de la sonda en la mayor parte del extremo 5’ de TT3-1-6.

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A continuaci´ on, se construyeron numerosos pl´ asmidos variantes de pBS-TT316 que carec´ıan del extremo 5’ o del extremo 3’ del ADNc de TT3-1-6 utilizando un ExoI/Mung Bean Deletion Kit (fabricado por Stratagene). Utilizando estos pl´ asmidos variantes, se determin´o la secuencia de nucle´otidos del ADNc en toda su longitud (SEC ID NUM. 3). A partir de los datos de la secuencia del ADNc en toda su longitud, se determin´o un marco de lectura abierto y adicionalmente se tradujo en una secuencia de amino´ acidos. De este modo, se obtuvo la secuencia representada la SEC ID NUM. 1. La secuencia de amino´ acidos de las posiciones 30-40 del N-terminal de la secuencia de amino´acidos as´ı obtenida fue comparada con p´eptidos se˜ nal conocidos. As´ı se dedujo la parte del p´eptido se˜ nal de este polip´eptido para dar de ese modo la secuencia representada por la SEC ID NUM. 1

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ES 2 187 516 T3 REIVINDICACIONES

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1. Un polip´eptido en forma sustancialmente purificada que tiene la secuencia de amino´ acidos mostrada en la SEC ID NUM. 1, la secuencia de amino´ acidos de restos 1 a 70 mostrada en la SEC ID NUM. 1 o una secuencia de amino´acidos que tiene una homolog´ıa de al menos el 90 % con la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID NUM. 1 a lo largo de toda su longitud o con la secuencia de amino´ acidos de restos 1 a 70 mostrada en la SEC ID NUM. 1. 2. Un polip´eptido seg´ un la reivindicaci´ on 1, que tiene la secuencia de amino´acidos mostrada en la SEC ID NUM. 1. 3. Un polip´eptido seg´ un la reivindicaci´ on 1, que tiene la secuencia de amino´acidos de restos 1 a 70 mostrada en la SEC ID NUM. 1.

15

4. El ADN que codifica un polip´eptido seg´ un una cualquiera de la reivindicaciones anteriores. 5. El ADN seg´ un la reivindicaci´ on 4, que tiene la secuencia de nucle´otidos mostrada en la SEC ID NUM. 4.

20

6. El ADN seg´ un la reivindicaci´ on 4, que tiene la secuencia de nucle´otidos mostrada en la SEC ID NUM. 3. 7. El ADN seg´ un la reivindicaci´ on 4, que tiene la secuencia de nucle´otidos de restos 139 a 348 mostrada en la SEC ID NUM. 1.

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8. Un vector de replicaci´on y expresi´on que comprende el ADN seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7. 9. Una c´elula hu´esped transformada o transfectada con un vector de replicaci´ on y expresi´on seg´ un la reivindicaci´on 8. 10. Un m´etodo para producir un polip´eptido que comprende cultivar c´elulas hu´esped seg´ un la reivindicaci´on 9 en condiciones eficaces para expresar un polip´eptido seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

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40

11. Un anticuerpo monoclonal o policlonal para un polip´eptido seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 12. Una composici´ on farmac´eutica que contiene un polip´eptido seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un anticuerpo seg´ un la reivindicaci´ on 11 asociado con un diluyente o portador farmac´euticamente aceptable.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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ES 2 187 516 T3 LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACION GENERAL: 5

(i) SOLICITANTE: (B) NOMBRE: HONJO TASUKU (C) CALLE: KANYU-CHI, OIWAKE-CHO, KITA-SHIRAKAWA AKYO-KU

10

(D) CIUDAD: KYOTO (E) PAIS: JAPON

15

(F) CODIGO POSTAL (CP): ninguno (A) NOMBRE: ONO PHARMACEUTICAL Co. LTD (B) CALLE: 1-5 DOSHOMACHI 2-CHOME, CHUOKU

20

(C) CIUDAD: OSAKA (E) PAIS: JAPON 25

(F) CODIGO POSTAL (ZIP): 541 (ii) TITULO DE LA INVENCION: PROCEDIMIENTO PARA CONSTRUIR UN BANCO DE ADNc ´ Y UN POLIPEPTIDO NOVEDOSO Y ADN QUE CODIFICA EL MISMO

30

(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 13 (iv) FORMA LEGIBLE CON EL ORDENADOR:

35

(A) TIPO MEDIO: Disco Flexible (B) ORDENADOR: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

40

(D) SOPORTE LOGICO: PatentIn Release #1.0, Versi´on #1.25 (EPO) (v) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

45

NUMERO DE SOLICITUD: EP 94300267.5 (2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 1: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

50

(A) LONGITUD: 1797 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

55

(C) CUALIDAD DE LA HEBRA: doble (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc

60

(ix) RASGOS: (A) NOMBRE/CLAVE: sig p´eptido 1

ES 2 187 516 T3

(B) LOCALIZACION: 82..138 (ix) RASGOS: 5

(A) NOMBRE/CLAVE: mat p´eptido (B) LOCALIZACION: 139..348 10

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 1:

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ES 2 187 516 T3

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(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 2: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 40

(A) LONGITUD: 89 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

45

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 2:

50

55

60

3

ES 2 187 516 T3

5

10

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 3: 15

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1797 pares de bases

20

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) CUALIDAD DE LA HEBRA: doble (D) TOPOLOGIA: lineal

25

(ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 3: 30

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60

4

ES 2 187 516 T3

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(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 4: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 267 pares de bases

40

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) CUALIDAD DE LA HEBRA: doble 45

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADNc

50

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 4:

55

60

5

ES 2 187 516 T3 (2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 5: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

10

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (gen´ omico) 15

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 5:

20

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 6: 25

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases

30

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal

35

(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (gen´ omico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 6: 40

45

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 7: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 50

(A) LONGITUD: 40 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

55

(C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (gen´ omico)

60

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 7:

6

ES 2 187 516 T3

5

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 8: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 10

(A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico 15

(C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal

20

(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (gen´ omico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 8:

25

30

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 9: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases

35

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

40

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (gen´ omico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 9:

45

50

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 10: 55

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

60

(C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal 7

ES 2 187 516 T3

(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (gen´ omico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 10: 5

10

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 11: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: 15

(A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico 20

(C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal

25

(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (gen´ omico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 11:

30

35

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 12: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases

40

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

45

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (gen´ omico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 12:

50

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(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 13: 60

(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases

8

ES 2 187 516 T3 (B) TIPO: ´acido nucleico (C) CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla 5

(D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (gen´ omico)

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(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 13:

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