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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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11 N´ umero de publicaci´on:

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 94900873.4 kFecha de presentaci´on : 24.11.1993 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 623 019 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 09.11.1994

T3

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54 T´ıtulo: Medicamentos a base de ´ acido docosahexaenoico como antiagregantes plaquetarios y contra

las carencias cerebrales en ´ acidos grasos esenciales y procedimientos de preparaci´ on.

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73 Titular/es:

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72 Inventor/es: Bayon, Yves;

30 Prioridad: 24.11.1992 FR 92 14078

INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) 101, rue de Tolbiac 75654 Paris C´ edex 13, FR IMEDEX

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.11.2000

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 149 253 T3

01.11.2000

Aviso:

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Croset, Martine; Lagarde, Michel; Lecerf, Jean; Thies, Frank; Tayot, Jean-Louis y Chirouze, V´ eronique

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74 Agente: Tavira Montes-Jovellar, Antonio

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 149 253 T3 DESCRIPCION Medicamentos a base de ´acido docosahexaenoico como antigregantes plaquetarios y contra las carencias cerebrales en ´acidos grasos esenciales y procedimientos de preparaci´on. 5

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La presente invenci´on se refiere a nuevos medicamentos a base de ´acidos grasos poliinsaturados, y m´as precisamente a base de ´ acido docosahexaenoico (tambi´en denominado DHA o 22:6n-3). Se sabe que los tejidos nerviosos son muy ricos en ´acidos grasos poliinsaturados esenciales (1,2), principalmente en DHA que puede representar 24 % de los a´cidos grasos de las fosfatidiletanolaminas (PE) de la materia gris (3). Los a´cidos grasos poliinsaturados desempe˜ nan un papel primordial en el desarrollo normal del cerebro (4). As´ı, la carencia alimentaria en ´acidos grasos insaturados esenciales o la perturbaci´ on de su metabolismo durante el periodo del desarrollo cerebral, afectar´ıa a la mielinizaci´on en el hombre (1,5). En lo que se refiere m´as particularmente a los a´cidos grasos de la familia n-3, se ha demostrado que una carencia alimentaria en estos a´cidos implica un desarrollo prenatal y postnatal incorrecto de la retina y del cerebro en el mono Rhesus (6,7) y en otros animales (8). Parece adem´as que estos ´acidos grasos est´an implicados en la capacidad de aprendizaje de ratas j´ ovenes (9,10). El cerebro no acumula el 18:3n-3, precursor del 22:6n-3 o DHA, por una parte porque posee las enzimas de prolongaci´ on y de des-saturaci´ on necesarias para la transformaci´ on del 18:3n-3 en 22:6n-3 (11) y por otra parte, porque pueden captar el 22:6n-3 fijado sobre la alb´ umina plasm´ atica fabricada por el h´ıgado (12,13) porque el cerebro capta mejor los ´acidos grasos no esterificados que son insaturados (14,15). Sobre la base de los trabajos m´ as antiguos ya se ha propuesto aportar al organismo los a´cido grasos poliinsaturados esenciales, en forma de nutrientes o de preparaciones administrables por otras v´ıas. En particular varios documentos han insistido en el inter´es de aportar de este modo a´cidos poliinsaturados esenciales tales como el 18:3n-3, el a´cido araquid´ onico y el 22:6n-3. En las preparaciones consideradas, estos ´acido grasos se presentan en formas diversas, en general mezcladas y principalmente en forma de triglic´eridos, de fosfol´ıpidos e igualmente en forma no esterificada. Algunos de estos documentos resaltan el inter´es de administrar estos ´acidos grasos esenciales en forma de componentes de fosfol´ıpidos. Por otra parte se ha demostrado que los reg´ımenes ricos en ´acido eicosapentaenoico (20:5n-3) y en a´cido 22:6n-3 disminuyen la incidencia de enfermedades cardiovasculares (16). Los mecanismos responsables de los efectos beneficiosos de estos ´acidos est´an a´ un por precisar. Se han realizado numerosos estudios sobre los efectos de estos ´acidos grasos poliinsaturados sobre las funciones plaquetarias. Se ha demostrado que esto a´cidos grasos, como otros ´acidos grasos cis-insaturados, inhiben la agregaci´ on de las plaquetas inducida por una gran variedad de activadores plaquetarios de los cuales el U 46,619, agonista del receptor del tromboxano (TXA2 ) y de la prostaglandina H2 (PGH2 )(17-23). Los efectos inhibidores del 20:5n-3 y del 22:6n-3 se ejercer´ıan en varios niveles (17-19, 24-27). Por otra parte se ha demostrado que los 20:5n-3 y 22:6n-3 no esterificados inhiben de forma competitiva la agregaci´ on plaquetaria inducida por U 46,619 as´ı como la uni´ on espec´ıfica de este u ´ ltimo a las plaquetas lavadas (28). La incorporaci´ on in vitro del 20:5n-3 y del 22:6n-3 en las reservas de l´ıquidos plaquetarios, gracias a la alb´ umina, implica igualmente la p´erdida de agregabilidad de las plaquetas en respuesta a la U 46,619 y la disminuci´on de la afinidad del agonista por su receptor (29). En este estudio, si el 20:5n-3 y el 22:6n-3 han sido esterificados mayoritariamente en los fosfol´ıpidos, los efectos observados tambi´en pueden atribuirse al enriquecimiento de otras fracciones lip´ıdicas en estos ´acidos grasos. El 20:5n-3 y el 22:6n-3 presentan una cierta selectividad de acci´on sobre el receptor TXA2 /PGH2 puesto que ninguno de estos a´cidos grasos afecta a la agregaci´on de las plaquetas inducida por la trombina y por el ion´ oforo A 23187, utilizados en las concentraciones que no hacen intervenir a este receptor (29). Adem´ as, no modifican la uni´ on de la yohimbina al receptor alfa-2-adren´ergico de las membranas plaquetarias (30) que presenta una cierta homolog´ıa estructural. Entre el conjunto de los a´cidos grasos ensayados s´olo el 20:5n-3 y el 22:6n-3 alteran de forma espec´ıfica el receptor THA2 /PGH2 de las plaquetas enteras (29) o de las membranas plaquetarias solubilizadas (30). El 22:6n-3 parece presentar una eficacia superior a la del 20:5n-3. La utilizaci´on de fosfatidilcolinas “naturales” obtenidas a partir de peces, que contienen a´cido docosahexaenoico en posici´on sn-2 (PCDHAn) como anticolesterol´emicos, antitromb´oticos y antiagregantes plaquetarios ha sido descrita en la solicitud de patente japonesa JP-A-6450890 de Nishizawa et al. (31). La utilizaci´on de los PCDHAn como agentes antitumorales ha sido descrita en la solicitud de patente japonesa JP-A-1160989 de Hibino et al. (32).

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Por otra parte la utilizaci´on del DHA-lisofosfatidilcolina en posici´ on sn-1 como agente antitumoral ha sido descrita por Sakurai et al., en la solicitud de patente japonesa JP-A-1203330 (33).

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ES 2 149 253 T3 La presente invenci´on se propone proporcionar nuevos medicamentos a base de a´cidos grasos poliinsaturados esenciales que presentan una gran eficacia. Uno de los objetivos es por tanto aportar un nuevo medicamento con efecto anti-tromboxano A2 extremadamente eficaz. 5

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Otro objetivo de la invenci´ on es preparar un nuevo medicamento que permita aportar al cerebro un ´acido graso esencial con una eficacia particularmente elevada. La invenci´on ha permitido descubrir, de modo sorprendente, que la eficacia, en las aplicaciones antes citadas, del 22:6n-3 o DHA debe atribuirse a su esterificaci´ on en las fosfatidilcolinas (PC) con exclusi´on de otras formas de fosfol´ıpidos y principalmente de las fosfatidiletanolaminas (PE), y esto tanto en la aplicaci´on como anti-tromboxano A2 como fuente de a´cido graso poliinsaturado esencial aportado al cerebro. Adem´as, la eficacia del DHA bajo esta forma es particularmente elevada con relaci´on a la eficacia de otros a´cidos grasos esenciales tales como el ´acido linoleico (18:2n-6), comprendido bajo la forma de fosfatidilcolina (PC).

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La administraci´on por v´ıa oral de fosfatidilcolinas naturales que contienen a´cidos grasos de cadenas largas tiene sin embargo el inconveniente de la lentitud de su digesti´ on. En otros numerosos casos, no es deseable la administraci´on por v´ıa intravenosa. 20

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La invenci´on tiene por tanto por objeto principal proporcionar medicamentos que responden a los objetivos antes citados que pueden administrarse de manera muy eficaz, por v´ıa oral, y que, adem´ as, se distribuyen con una eficacia acrecentada a las c´elulas receptoras. La invenci´on tiene por objeto nuevos medicamentos a base de ´acidos grasos esenciales, caracterizados porque comprenden, en una cantidad terap´euticamente eficaz, al menos un compuesto elegido en el grupo formado por: - el DHA esterificado en forma de lisofosfatidilcolina (liso-PCDHA) en posici´on sn-2;

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- las DHA-fosfatidilcolinas en las cuales el DHA est´ a esterificado en posici´on sn-2 y que presentan un grupo acilo de muy peque˜ na longitud en la posici´ on sn-1; estos compuestos se denominan en la presente memoria PCDHA; y - los triglic´eridos en los cuales el DHA est´a esterificado en la posici´on sn-2 y que presentan grupos acilo de muy peque˜ na longitud en las posiciones sn-1 y sn-3. Por grupo acilo de muy peque˜ na longitud, se entiende un grupo acilo que puede contener 2 a 6 a´tomos de carbono, principalmente acetilo, y eventualmente propionilo y butinilo.

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Los compuestos utilizados en los medicamentos seg´ un la invenci´ on est´an acilados en la posici´on sn-1 (y sn-3 en el caso de los triglic´eridos) por s´ıntesis. Preferentemente, los medicamentos comprenden al menos 70 % de DHA en la clase de ´acidos grasos esterificados en la posici´ on sn-2 de las fosfatidilcolinas, o triglic´eridos en cantidad terap´euticamente eficaz, y preferentemente m´ as del 10 %. En una forma de realizaci´ on preferida, la composici´ on medicamentosa puede ser pura, es decir no comprender pr´ acticamente m´as que el o los compuestos antes citados en calidad de fuente de ´acido graso esencial poliinsaturado.

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En una forma de realizaci´ on ventajosa para la fijaci´on intracerebral, el medicamento contiene, como principio activo, el DHA esterificado en forma de lisofosfatidilcolina (liso-PCDHA) con, preferentemente, al menos 70 % de DHA en la clase de ´acidos grasos esenciales poliinsaturados en posici´on sn-2 de las liso-PCDHA, y particularmente superior a 10 %.

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Cada dosis de medicamento seg´ un la invenci´ on comprende una cantidad terap´euticamente eficaz de PCDHA o de liso-PCDHA.

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La invenci´on tiene igualmente por objeto la utilizaci´on de los compuestos antes citados para la preparaci´on de un medicamento con efecto anti-agregante plaquetario, utilizable principalmente para el tratamiento preventivo o curativo de enfermedades caridovasculares, comprendida la enfermedad ateromatosa.

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ES 2 149 253 T3 La invenci´on tiene igualmente por objeto la utilizaci´on de los compuestos antes citados para la preparaci´on de un medicamento destinado al tratamiento de las insuficiencias o carencias cerebrales en a´cidos grasos esenciales, principalmente en las etapas prematuras, en la nutrici´on, en la desnutrici´on y en el envejecimiento. 5

Los medicamentos seg´ un la invenci´ on pueden prepararse para administraci´ on oral o parenteral y principalmente intravenosa, o por v´ıa rectal o cualquier otra v´ıa de administraci´on y principalmente en forma de colirio para uso oft´ almico. 10

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Las preparaciones para administraci´ on oral pueden comprender cualquier excipiente o veh´ıculo usual, por ejemplo los ya utilizados para la administraci´ on de a´cidos grasos esenciales. Pueden consistir en polvos, granulados, soluciones u otros y, eventualmente, incorporar otros principios activos. Para una administraci´ on parenteral, se prefiere preparar el medicamento en forma de un soluto para perfusi´ on que tiene la composici´on habitual de estos solutos y en la cual la concentraci´on de los PCDHA (preferentemente en forma de liposomas o unidos a alb´ umina) o de liso-PCDHA (unido a alb´ umina) o de triglic´eridos-DHA es preferiblemente del orden de 1 a 100 mg/litro de una u otra de las formas lip´ıdicas del DHA. La administraci´on oral puede ser puntual, para cura de varios d´ıas o varias semanas, o puede ser cr´onica. La posolog´ıa es preferiblemente del orden de 1 a 100 mg por kg por d´ıa. Los PCDHA y la liso-PCDHA pueden obtenerse por s´ıntesis qu´ımica y/o por bios´ıntesis principalmente a partir de los productos de partida (´ acidos grasos, fosfol´ıpidos, triglic´eridos) extractos y purificados a partir de fuentes usuales como placenta, algas, huevos, pescados, o´rganos de animales y vegetales como soja. Los PCDHA pueden pasar m´as f´acilmente la barrera intestinal sin ser degradados. Si se hidrolizan por actividades de lipasa que act´ uan tanto en posici´ on sn-1 como en posici´on sn-2, los a´cidos ac´etico, propi´ onico, but´ılico y caproico ser´an preferentemente hidrolizados con relaci´on a los a´cidos grasos de cadena larga en posici´ on sn-2 y, m´ as particularmente, con relaci´on al DHA, del que se sabe que es dif´ıcilmente hidrolizable por las lipasas humanas. Por ejemplo si los PCDHA son hidrolizados por la lipasa pancre´atica, pasaran exclusiva o casi exclusivamente la barrera intestinal en la forma de 1-liso-2DHA-glicerofosfocolina (designada en lo sucesivo liso-PCDHA) cuya re-esterificaci´on en PCDHAn est´a favorecida en los enterocitos. Las PCDHA son tambi´en f´ acilmente hidrolizables por las lipasas espec´ıficas de la posici´ on sn-1. De lo que antecede resulta que una proporci´ on nula o peque˜ na del DHA de las PCDHA estar´ a en forma no esterificada despu´es de la administraci´ on de las PCDHA. En consecuencia, como se sabe que la transformaci´on del DHA en a´cido eicosapentaenoico (EPA) puede hacerse con a´cido graso no esterificado puede ser total o casi totalmente suprimida in vivo. Debe evitarse la formaci´on de EPA a partir de las PCDHA administradas porque el EPA tiene actividades distintas a las del DHA (Von Schacky y Weber, 1985 (34); Triggiani et al., 1990 (35); Robinson, 1993 (36); Salem y Ward, 1993 (37)) y contribuyen a reducir la actividad del DHA en ciertos casos (Carlson et al., 1992 (38); Carlson, 1993 (39)). Tras la administraci´on de las PCDHA (por v´ıa intravenosa u oral) una proporci´ on significativa de las PCDHA se transforma en liso-PCDHA que puede ser reacilada con a´cidos grasos de cadena larga para dar PC equivalentes a las PCDHAn o asociarse a transportadores como la alb´ umina. Permaneciendo intactas las PCDHA con relaci´on a las PCDHAn presentan igualmente la ventaja de fijarse mejor in vitro sobre la alb´ umina o de ser mejor transportadas in vivo por la alb´ umina. En comparaci´on con las PCDHAn, las PCDHA pueden tener as´ı un porvenir m´ as parecido al de la liso-PCDHA que ha sido descrita anteriormente como una forma privilegiada de aporte de DHA al cerebro. De la alb´ umina se sabe igualmente que transporta de modo eficaz a´cidos grasos como tales o en forma de lisofofol´ıpidos a las c´elulas, principalmente las plaquetas. Por el contrario, las PCDHA como las PCDHAn pueden asociarse a diferentes lipoprote´ınas como las HDL. En consecuencia, presentan igualmente un metabolismo parecido al de las PCDHAn. Pueden as´ı reducir la concentraci´ on plasm´atica de colesterol proater´ ogeno asociado a las LDL, facilitando la transferencia del colesterol desde las LDL a las HDL, como ha sido observado con las PC que contiene a´cidos grasos de cadena larga de los cuales uno al menos de ellos es poliinsaturado (Kirsten, et al., 1989 (40); O’Brien et al., 1993 (41)). Esta propiedad de las PCDHA puede por tanto contribuir a disminuir la incidencia de las enfermedades cardio-vasculares.

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Las PCDHA presentan pues propiedades originales con respecto a las PCDHAn preparadas a partir de pescados (Hibino et al., (32); Nishizawa et al. (31)) y que se sabe que no tienen en posici´on sn-1 ´acidos grasos de cadena corta (´ acidos grasos que contienen hasta 6 ´atomos de carbono)(Sargent et al., 1990 (42)). Adem´ as de sus actividades propias se pueden comportar a la vez como las liso-PCDHA y las PCDHAn. Principalmente como las PCDHAn presentan la ventaja de poder ser administrables en forma de liposomas, en principio para todas las v´ıas disponibles comprendiendo la v´ıa intravenosa, conocida para facilitar el aporte de f´ armacos al cerebro. En cierta medida, constituyen igualmente una forma gal´enica estable de las liso-PCDHA. En efecto, las PCDHA se hidrolizan parcialmente a liso-PCDHA in vivo. Por otra parte la acilaci´on de la posici´ on sn-1 de las liso-PCDHA evita la formaci´on de 1-DHA2-liso-glicerofosfocolina en el curso del almacenamiento de las liso-PCDHA antes de su administraci´on, incluso despu´es de su administraci´ on. La 1-DHA-2-liso-glicerofosfocolina es un fosfol´ıpido del que se ha descrito su utilizaci´on como agente anti-tumoral (Sakurai et al., (33)). Su formaci´ on debe evitarse porque este compuesto tiene un metabolismo potencialmente diferente del de las liso-PCDHA (Morash et al., 1989 (43)).

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Otras caracter´ısticas y ventajas de la invenci´on aparecer´an a lo largo de la siguiente descripci´on, que se da s´olo a modo de ejemplo no limitativo, y haciendo referencia a los dibujos anexos, en los cuales:

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La Figura 1 representa la composici´on en a´cidos grasos de las diacil-glicerofosfocolinas de las membranas plaquetarias despu´es de la transferencia de 1-palmitoil-2-docosahexaenoil-glicerofosfocolina (PC-22:6) y 1-palmitoil-2-linoleoil-glicerofosfocolina (PC-18:2). Las diacil-glicerofosfocolinas de las membranas plaquetarias han sido reemplazadas bien sea por la 1palmitoil-2-docosahexaenoil-glicerofosfocolina (barras rayadas verticalmente, “22:6n-3”), o bien por la 1palmitoil-2-linoleoil-glicerofosfocolina (barras rayadas horizontalmente, “18:2n-6”), utilizando la prote´ına de transferencia end´ogena de las plaquetas, espec´ıfica de los fosfatidilinositoles y de las fosfatidilcolinas. Las membranas plaquetarias testigo (barras negras, de control) se obtienen por incubaci´ on sin adici´ on de fosfol´ıpidos. Los datos del gr´ afico representan la media ± la desviaci´ on t´ıpica de tres ensayos independientes.

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La Figura 2 representa la composici´on en ´acidos grasos de las diacil-glicerofosfoetanolaminas de las membranas plaquetarias despu´es de la transferencia de la 1-palmitoil-2-docosahexaenoil-glicerofosfocolina (PE-22:6) y de la 1-palmitoil-2-linoleoil-glicerofosfocolina (PE-18:2). 35

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Las diacil-glicerofosfoetanolaminas de las membranas plaquetarias han sido reemplazadas bien sea por la 1-palmitoil-2-docosahexaenoil-glicerofosfoetanolamina (barras rayadas verticalmente, “22:6n-3”), o bien por la 1-palmitoil-2-linoleoil-glicerofosfoetanolamina (barras rayadas horizontalmente, “18:2n-6”) utilizando la prote´ına de transferencia de l´ıquidos purificada a partir de ma´ız. Las membranas plaquetarias testigo (barras negras, “de control”) se obtienen por incubaci´ on sin adici´ on de fosfol´ıpidos. Los datos R la desviaci´ on t´ıpica de tres ensayos independientes. del gr´ afico representan la media La Figura 3 representa la evoluci´ on de la radiactividad recuperada en los l´ıpidos totales: A del cerebro, B del ri˜ no´n, C del coraz´ on y D del h´ıgado, despu´es de la inyecci´on de DHA tritiado en forma libre (c´ırculo negro) o en forma de 2-DHA-1-liso-PC (tri´ angulo negro).

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Ejemplo 1 Preparaci´ on de una composici´ on purificada en liso-PCDHA y en PCDHA a partir de fosfatidilcolinas (PC) de algas 50

a) Cultivo de microalgas que producen PCDHA

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otrofa, Crypthecodinium cohnii. Los Se cultiva en medio AXM a 25◦C un alga dinoflagelada heter´ cultivos se airean y agitan en las condiciones descritas por BEACH y HOLZ (44). Despu´es de 4 d´ıas de cultivo se recuperan las c´elulas por centrifugaci´ on y se liofiliza la biomasa h´ umeda. Un fermentador que contiene 10 litros de medio permite obtener en estas condiciones aproximadamente 3 g de biomasa liofilizada. b) Extracci´ on de los l´ıpidos

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En una primera etapa los l´ıpidos neutros se extraen de la biomasa liofilizada con hexano seg´un el procedimiento utilizado cl´asicamente para los aceites vegetales. 5

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En una segunda etapa, la biomasa se recoge en un disolvente alcoh´olico (metanol o etanol) para la extracci´on de l´ıpidos polares y en particular fosfol´ıpidos seg´ un el protocolo descrito en la patente europea 0298787. 5

Este procedimiento permite extraer alrededor del 18 % de los l´ıpidos neutros y del 12 % de l´ıpidos polares (contenidos expresados en peso y referidos a la biomasa liofilizada). c) Purificaci´ on de las fosfatidilcolinas que contiene el DHA en la posici´on sn-2 10

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La fosfatidilcolina que contiene el DHA se a´ısla de los l´ıpidos polares por cromatograf´ıa l´ıquida de alta resoluci´on (HPLC) seg´ un el protocolo descrito por CHRISTIE et al. (45). El tratamiento de la totalidad de los l´ıpidos polares obtenidos a partir de 10 litros de cultivo (aproximadamente 360 mg) permite purificar aproximadamente 180 mg de PCDHA. La fosfatidilcolina obtenida contiene 66 % de DHA (contenido expresado en peso de a´cidos grasos totales esterificados referidos a PC). d) Preparaci´ on de liso-PCDHA

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Las cadenas ac´ılicas en posici´on sn-1 de las fosfatidilcolinas purificadas como se ha indicado anteriormente se hidrolizan por cualquier lipasa que tenga una actividad fosfolipasa A1 . La liso-PCDHA obtenida se purifica por cromatograf´ıa. e) Preparaci´ on de PCDHA

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La liso-PCDHA descrita anteriormente puede ser reacilada por s´ıntesis org´anica para obtener las PCDHA aciladas con los ´acidos ac´etico, propi´ onico, but´ırico o caproico en la posici´ on sn-1 (Delfino et al., 1987, (46)). Las PCDHA obtenidas se purifican a continuaci´ on por cromatograf´ıa. Ejemplo 2

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Preparaci´ on de una composici´ on purificada en PCDHA por semis´ıntesis a partir de glicerofosforilcolina o de glicerofosfato

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a) Diacilaci´ on de la glicerofosfocolina y del glicerofosfato con los a ´cidos ac´etico, propi´ onico, but´ırico, caproico o docosahexaenoico

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El glicerofosfato se acila con derivados de los ´acidos ac´etico, propi´ onico, but´ırico, caproico o docosahexaenoico (anh´ıdrido de acilo, cloruro de acilo, imidazoliduro de acilo ...) para dar un a´cido diacilfosfat´ıdico (PA). El PA formado se convierte a continuaci´ on en PC utilizando el cloruro de colina (Schena y Davis, 1989 (47); Walts et al., 1992 (48)). Las PC pueden obtenerse de un modo m´ as directo acilando la glicerofosforilcolina con los derivados de ´acidos ac´etico, propi´ onico, but´ırico, caproico o docosahexaenoico, como se ha descrito anteriormente.

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b) Preparaci´ on de los PCDHA a partir de las PC que contienen los residuos ac´etico, propi´ onico, but´ırico o caproico en las posiciones sn-1 y sn-2 Las PC que contienen los residuos ac´etico, propi´ onico, but´ırico o caproico se hidrolizan selectivamente en la posici´ on sn-2 por cualquier lipasa que tenga una actividad de fosfolipasa A2 . Las liso-PC formadas se reacilan con derivados del DHA (anh´ıdrido de acilo, cloruro de acilo, imidazoliduro de acilo ...) para dar las PCDHA. c) Preparaci´ on de los PCDHA a partir de las PC que contienen el residuo docosahexaenoico en las posiciones sn-1 y sn-2

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Las PC que contienen el residuo de DHA se hidroliza selectivamente en la posici´on sn-1 por cualquier lipasa que tenga una actividad de fosfolipasa A1 . Las liso-PC formadas se reacilan con derivados de los ´acidos ac´etico, propi´ onico, but´ırico o caproico (de preferencia anh´ıdrido de acilo o cloruro de acilo) para dar las PCDHA. 60

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ES 2 149 253 T3 Ejemplo 3 Estudio del efecto anti-tromboxano A2 de las 1-acil-2-docosahexanoil-glicerofosfocolina 5

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Se llevaron a cabo preparaciones de DHA esterificado en diferentes clases de fosfol´ıpidos utilizando prote´ınas de transferencia de fosfol´ıpidos para enriquecer de modo espec´ıfico, las fosfatidilcolinas (PC) y las fosfatidiletanolaminas (PE) de las membranas plaquetarias en a´cido linoleico (18:2n-6) y en DHA (49). Se ha empleado principalmente la prote´ına de transferencia (PT), espec´ıfica de las PC, purificada a partir de h´ıgado de vaca para modificar la composici´ on en especies moleculares de las PC de eritrocitos (49). En el procedimiento utilizado en el presente ejemplo la cantidad end´ ogena de fosfol´ıpidos plaquetarios no es alterada por la transferencia efectuada con la ayuda de la PT de ma´ız o de plaquetas; sin embargo, los fosfol´ıpidos se enriquecieron en 18:2n-6 o en DHA.

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on esLa influencia de los ´acidos grasos sobre el receptor TXA2 /PGH2 se estableci´o midiendo la uni´ pec´ıfica del SQ29,548 tritiado, un antagonista competitivo del receptor TXA2 /PGH2 , a las membranas plaquetarias cuyas PC o PE est´en enriquecidas en 18:2n-6 o en DHA. 20

S´ olo las membranas plaquetarias que contienen PC enriquecidas en DHA alteran el receptor TXA2 /PGH2 aumentando de modo significativo la constante de disociaci´on del SQ29,548. El enriquecimiento de las PC de las membranas plaquetarias en 18:2n-6 y de las PE en 18:2n-6 o en DHA no tiene efecto sobre el receptor (Tabla I).

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Estas propiedades permiten considerar a las PCDHA, a una concentraci´ on terap´euticamente activa, como un medicamento que posee una actividad anti-agregante y anti-hipertensora por su efecto antitromboxano A2 . TABLA IA

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Uni´ on de SQ 29,548 al receptor TXA2 /PGH2 de las membranas plaquetarias que contienen PC enriquecidas en DHA (22:6n-3) y en 18:2n-6

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Testigo 40

PC 22:6n-3

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PC 18:2n-6

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Kd (nM)

Bmax (pmol/mg prot.)

Coeficiente de Hill

4,17 6,10 3,24 4,50 ± 1,46 5,69 8,56 7,05 7,10 ± 1,44 (a) 4,05 4,64 3,16 3,95 ± 0,75

2,57 1,84 2,03 2,15 ± 0,38 2,94 2,09 2,40 2,48 ± 0,43 2,41 1,83 1,91 2,05 ± 0,31

0,82 1,01 0,94 0,92 ± 0,10 0,91 1,00 0,94 0,95 ± 0,05 0,90 1,00 0,94 0,95 ± 0,05

(a) p < 0,05 con relaci´on al testigo y a la PC 18:2n-6 55

60

7

ES 2 149 253 T3 TABLA IB Uni´ on de SQ 29,548 al receptor TXA2 /PGH2 de las membranas plaquetarias que contienen PE enriquecidas en DHA(22:6n-3) y en 18:2n-6 5

Testigo 0,93 10

PE 22:6n-3 15

PE 18:2n-6 20

Kd (nM)

Bmax (pmol/mg prot.)

Coeficiente de Hill

3,36 4,43 4,63 4,14 ± 0,68 2,92 4,61 4,63 4,05 ± 0,98 3,11 4,31 4,92 4,11 ± 0,92

1,86 2,37 1,17 2,13 ± 0,26 1,67 1,99 1,91 1,86 ± 0,17 1,89 2,26 2,07 24,07 ± 0,19

0,93 1,05 1,04 1,01 ± 0,07 0,95 1,02 1,02 1,00 ± 0,04 0,94 1,00 1,05 1,00 ± 0,06

Ejemplo 4 25

Estudio de la captaci´ on por el cerebro en la rata, de las 2-acil-1-lisofosfatidilcolina (liso-PC) El animal estudiado fue la rata de 20 d´ıas en la cual est´ a en su apogeo el metabolismo lip´ıdico cerebral.

30

35

40

Las liso-PC se marcaron en el a´cido graso y la colina, se fijaron en alb´ umina y se administraron por v´ıa intravenosa (50). Los resultados muestran que para la DHA (22:6n-3), las liso-PC que lo contienen son particularmente bien captadas por el cerebro y ello mejor que las liso-PC que contienen otros ´acidos grasos tales como 18:1, 18:2 y 20:4. S´ olo el cerebro muestra dicha preferencia como se ve en la Figura 3, puesto que a excepci´on del ri˜ no´n que capta sensiblemente del mismo modo las dos formas de aporte, a saber, la liso-PCDHA y el DHA en forma no esterificada, el h´ıgado y el coraz´on captan peor las liso-PCDHA que el DHA no esterificado. Parece que la reacilaci´on del DHA en las fosfatidilcolinas es peque˜ na y no es visible m´ as que en los primeros momentos despu´es de la inyecci´on (Tabla II) porque muy r´ apidamente se forma una esterificaci´on diferencial en las fosfatidil-etanolaminas. Parecer´ıa pues que las liso-PCDHA fijadas en la alb´ umina constituyen una forma de aporte del DHA particularmente preferible al cerebro en desarrollo. TABLA II Reparto de la radiactividad entre las clases lip´ıdicas del cerebro (en % de la radiactividad de los l´ıpidos totales)

45

A. Inyecciones de liso-PCDHA

50

55

60

2,5 min

5 min

6,5 min

15 min

30 min

60 min

Liso-PC Pi PS PC PE OTROS LN

4,1 8,9 3,9 25,6 28,2 0 29,3

0,4 3,4 5,3 17,8 26,3 11,4 35,3

1,2 3,7 5,3 26,2 28,1 3,7 31,6

0,2 3,2 4,6 26,8 38,9 2,6 23,7

0 2,6 5,0 24,1 46,4 3,8 17,8

0 2,6 3,9 24,9 49,2 5,3 16,7

MG DG AG TG

2,2 10,8 15,3 1,0

2,3 9,3 21,2 2,5

2,7 9,4 17,2 2,3

1,3 5,8 13,9 2,3

0,7 4 11 2,1

0,4 2,6 10,0 1,4

8

ES 2 149 253 T3 TABLA II (continuaci´on) B. Inyecciones de DHA no esterificado 5

10

15

PI PC PS PE LN+AG

2,5 min

5 min

7,5min

8 min

15 min

30 min

60 min

2,7 18,8 4,0 37,5 36,7

5,1 23,2 4,6 48,1 19,0

2,6 21,1 1,8 44,4 30,0

3,8 19,6 4,3 40,7 31,6

3 25,7 2,9 49,1 20,8

3,4 24,8 2,9 48,3 20,4

2,8 24,3 6,3 54,1 12,5

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60

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ES 2 149 253 T3 REIVINDICACIONES 1. Medicamentos a base de a´cidos grasos esenciales, caracterizados porque comprenden, en una cantidad terap´euticamente eficaz, al menos un compuesto elegido en el grupo formado por: 5

- el DHA esterificado en forma de lisofosfatidilcolina (liso-PCDHA) en posici´on sn-2; - las DHA-fosfatidilcolinas (PCDHA) en las cuales el DHA est´ a esterificado en posici´on sn-2 y que presentan un grupo acilo de muy peque˜ na longitud en la posici´ on sn-1; y

10

- los triglic´eridos en los cuales el DHA est´a esterificado en la posici´on sn-2 y que presentan grupos acilo que contienen de 2 a 6 ´atomos de carbono en las posiciones sn-1 y sn-3. 2. Medicamentos seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizados porque el grupo acilo es acetilo, propanoilo o butirilo.

15

3. Medicamentos seg´ un una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizados porque comprenden al menos 70 % de a´cido docosahexaenoico (DHA) en la clase de ´acidos grasos esterificados en la posici´on sn-2.

20

25

4. Medicamentos seg´ un una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizados porque comprenden como principio activo, al menos 10 % de a´cido docosahexaenoico (DHA) en la clase de a´cidos grasos esterificados en la posici´on sn-2 de las lisofosfatidilcolinas. 5. Utilizaci´on de los compuestos definidos en una de las reivindicaciones 1 y 2, para la preparaci´ on de un medicamento con efecto anti-agregante plaquetario, principalmente para el tratamiento preventivo o curativo de las enfermedades cardiovasculares. 6. Utilizaci´on de los compuestos definidos en una de las reivindicaciones 1 y 2, para la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de las insuficiencias o carencias cerebrales en ´acidos grasos.

30

7. Medicamentos seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizados porque contienen la cantidad de principio activo necesaria para una posolog´ıa de 1 a 100 mg/kg/d´ıa. 8. Medicamentos seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 7, acondicionados para la administraci´ on por v´ıa oral.

35

40

9. Procedimiento de preparaci´ on de una composici´ on enriquecida o purificada en PCDHA o en lisoPCDHA, en el cual se extraen los fosfol´ıpidos de una biomasa por un disolvente alcoh´ olico, y se a´ıslan la fosfatidilcolina que contiene el DHA por cromatograf´ıa de l´ıquidos de alta resoluci´ on, despu´es se hidroliza andose por cromatograf´ıa la el DHA por cualquier lipasa que tenga una actividad fosfolipasa A1 , purific´ liso-PCDHA obtenida. 10. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 9, caracterizado porque se reacila la posici´on sn-1 por un ´acido elegido en el grupo constituido por a´cidos ac´etico, propi´ onico, but´ırico y caproico.

45

11. Procedimiento de preparaci´ on de una composici´ on enriquecida o purificada en PCDHA, caracterizado porque se procede a una diacilaci´ on de la glicerofosfocolina o del glicerofosfato con ayuda de los ´acidos ac´etico, propi´ onico, but´ırico y caproico o de sus derivados, despu´es se hidrolizan selectivamente las posiciones sn-2 por una fosfolipasa A2 , despu´es de lo cual se reacilan las liso-PC formados con un derivado del DHA.

50

12. Procedimiento de preparaci´ on de una composici´ on enriquecida o purificada en PCDHA, caracterizado porque se procede a una diacilaci´ on de la glicerofosfocolina o del glicerofosfato con ayuda de

55

60

11

ES 2 149 253 T3 los ´acido DHA, porque se hidrolizan selectivamente las posiciones sn-1 por una fosfolipasa A1 , despu´es de lo cual se reacilan los liso-PCDHA formados con ayuda de los a´cidos ac´etico, propi´ onico, but´ırico y caproico o uno de sus derivados. 5

10

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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