INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis 1

EINLEITUNG ............................................................................................. 1

1.1

Epilepsie ............................................................................................................................ 1

1.2

Fokale Epilepsie und Temporallappen-Epilepsie .......................................................... 2

1.3

Neuropathologie der Fokalen Epilepsie ......................................................................... 3

1.3.1

Ammonshornsklerose....................................................................................................4

1.3.2

Glioneuronale Läsionen.................................................................................................4

1.3.2.1

Glioneuronale Tumoren: Gangliogliome ............................................................. 4

1.3.2.2

Glioneuronale Malformationen: Fokale kortikale Dysplasien.............................. 6

1.3.2.2.1

Fokale kortikale Dysplasien mit Ballonzellen (FCDIIb) ................................... 7

1.3.2.2.2

Fokale kortikale Dysplasien ohne Ballonzellen (FCDIIa) ................................ 8

1.4

Pathomechanismen Epilepsie-assoziierter glioneuronaler Läsionen......................... 8

1.5

Mikrosatelliteninstabilitäten in Gangliogliomen .......................................................... 10

1.6

Evaluierungsstrategien differenzieller Genexpression in Gangliogliomen.............. 13

1.7

In situ-RT und Immuno-Lasermikrodissektion für die Zellexpressionsanalyse von Gangliogliomen ............................................................................................................... 15

1.8

Zielsetzung der Arbeit .................................................................................................... 16

2

MATERIAL .............................................................................................. 19

2.1

Stammlösungen und Puffer ........................................................................................... 19

2.2

Lösungen und Puffer für die Gelelektrophorese ......................................................... 19

2.3

Lösungen und Puffer für die SDS-Page ....................................................................... 20

2.4

Lösungen und Puffer für die in situ-Hybridisierung mit

35

S-markierten

Oligonukleotidsonden .................................................................................................... 20 2.5

Puffer und Färbelösungen für die Oligonukleotid-Microarrays ................................. 21

2.6

DNA Größenmarker ........................................................................................................ 21

2.7

Bakterienstamm .............................................................................................................. 22

2.8

Medien für die Bakterienkultur und Medienzusätze .................................................... 22

I

INHALTSVERZEICHNIS 2.9

Kits, Chemikalien ............................................................................................................ 23

2.9.1

Kits...............................................................................................................................23

2.9.2

Chemikalien.................................................................................................................24

2.10 Biologische Materialien.................................................................................................. 25 2.10.1 Zelllinien ......................................................................................................................25 2.10.2 Tiermodell....................................................................................................................26 2.10.3 Patientenmaterial.........................................................................................................26 2.11 Medien für die Zellkultur und Medienzusätze .............................................................. 28 2.12 Antikörper und Antiseren............................................................................................... 28 2.12.1 Primär-Antikörper ........................................................................................................28 2.12.2 Konjugierte Sekundär-Antikörper ................................................................................29 2.13 Entwicklungsreagenzien ................................................................................................ 29 2.14 Oligonukleotide ............................................................................................................... 30 2.15 Vektoren........................................................................................................................... 34

3

METHODEN ............................................................................................ 37

3.1

Arbeiten mit Nukleinsäuren ........................................................................................... 37

3.1.1

Midi-Präparation von Plasmid-DNA durch Bindung an eine AnionenaustauscherSäule ..........................................................................................................................37

3.1.2

Isolierung von Gesamt-RNA aus Gewebe ..................................................................37

3.1.3

Isolierung von mRNA aus Gesamt-RNA .....................................................................38

3.1.4

Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren................................38

3.1.5

Mengenabschätzung im Agarose-Gel gegen Markerbanden......................................39

3.1.6

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ..............................................................................39

3.1.7

Reverse Transkription (RT) .........................................................................................40

3.1.8

Erst- und Zweitstrang cDNA-Synthese für Oligonukleotid-Microarrays ......................40

3.1.9

In vitro Transkription und Markierung der cRNA für Microarrays ................................41

3.1.10 Native Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................42 3.1.11 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose durch Bindung an Siliziumpartikel .....42 3.1.12 Enzymatischer Verdau von DNA-Doppelsträngen durch Restriktionsendonukleasen43 3.1.13 Dephosphorylierung des Vektors ................................................................................43 3.1.14 Ligation von DNA-Doppelsträngen durch T4-DNA-Ligase..........................................43 3.1.15 Plasmid-Sequenzierung nach der Kettenabbruch-Methode .......................................44 3.1.16 Die Fragmentlängenanalyse .......................................................................................44 3.2

In situ-RT.......................................................................................................................... 45

II

INHALTSVERZEICHNIS 3.3

Mikrobiologische Methoden .......................................................................................... 46

3.3.1

Herstellung kompetenter E.coli DH5α Bakterien.........................................................46

3.3.2

Kultivierung von Bakterien...........................................................................................47

3.3.3

Transformation kompetenter E.coli DH5α Bakterien...................................................47

3.4

Oligonukleotid-Microarrays ........................................................................................... 47

3.4.1

Hybridisierung der Proben...........................................................................................47

3.4.2

Waschen und Färben der Oligonukleotid-Microarrays................................................48

3.4.3

Beschreibung der Oligonukleotid-Microarrays und deren Auswertung.......................48

3.5

Real-time-PCR ................................................................................................................. 50

3.6

Zellbiologische Methoden.............................................................................................. 51

3.6.1

Allgemeine Kulturbedingungen ...................................................................................51

3.6.2

Trypsinierung und Resuspendierung adhärenter Zellen .............................................51

3.6.3

Einfrieren und Auftauen von Zellen .............................................................................51

3.6.4

Bestimmung der Zellzahl .............................................................................................52

3.6.5

Transiente Transfektion adhärenter Zellen mit Lipofectamin 2000.............................52

3.6.6

Hippokampale Primärzellkulturen der Maus................................................................52

3.6.7

Analyse der Primärzellkulturen....................................................................................53

3.7

Histologische Methoden ................................................................................................ 53

3.7.1

Hämatoxylin-Eosin Färbung ........................................................................................53

3.7.2

TESPA-Beschichtung ..................................................................................................54

3.7.3

Anfertigung von membranbeschichteten Objektträgern..............................................54

3.7.4

Anfertigung von Kryoschnitten und Raspeln von Gewebe..........................................54

3.8

Laser Mikrodissektion (LMPC-Laser Microdissection and Pressure Catapulting) .. 55

3.9

In situ-Hybridisierung mit 35S-markierten Oligonukleotid-sonden ............................ 55

3.9.1

Markierung der Oligonukleotidsonden mit 35S-dATP durch terminale Transferase ....56

3.9.2

Hybridisierung der 35S-dATP-markierten Sonden .......................................................57

3.9.3

Beschichtung der 35S-dATP-markierten Objektträger mit Foto-emulsion ...................57

3.9.4

Entwicklung der beschichteten Objektträger mit Fotoemulsion ..................................57

3.10 Arbeiten mit Proteinen ................................................................................................... 58 3.10.1 Proteingewinnung........................................................................................................58 3.10.2 Proteinkonzentrationsbestimmung ..............................................................................58 3.10.3 Polyacrylamidgelelektrophorese .................................................................................58 3.10.4 Western-Blot................................................................................................................59 3.10.5 Ponceau-Färbung von Proteinen ................................................................................59 3.10.6 Immundetektion mittels Chemilumineszenz ................................................................60 3.11 Geräte............................................................................................................................... 60

III

INHALTSVERZEICHNIS 4

ERGEBNISSE ......................................................................................... 62

4.1

Mikrosatelliteninstabilitäten in fokalen kortikalen Dyspla-sien des Typs IIb (FCDIIb) .......................................................................................................................................... 62

4.1.1

Allelische Mikrosatellitenmarker-Analyse von Patientenmaterial von fokalen kortikalen Dysplasien des Typs IIb (FCDIIb)................................................................................62

4.1.2 4.2

Immunhistologische Analyse von MSH2 und MLH1 an FCDIIb-Patientenmaterial......64

Analyse der CD34-exprimierenden Zellen in Gangliogliomen ................................... 66

4.2.1

Real-time-PCR-Analyse von cDNA nach Kurzzeit-Immunhisto-chemie versus Langzeit-Immunhistochemie von Schnittpräparaten nach in situ-RT ........................66

4.2.2

Prüfung der zellulären Spezifität von CD34-positiven Zellen in Gangliogliomen ........68

4.2.3

Linie-Charakterisierung von CD34-positiven Zellen in Gangliogliomen......................68

4.3

Oligonukleotid-Microarray-Analyse von Gangliogliomen .......................................... 70

4.3.1

Differenziell exprimierte Gene in Gangliogliomen .......................................................70

4.3.2

Differenziell exprimierte Gene der Oligonukleotid-Microarray-Analyse sortiert nach biologischer Funktion .................................................................................................79

4.3.3

Verifizierung ausgewählter Kandidatengene mittels real-time-PCR ...........................83

4.3.4

Lokalisation von LDB2, NELL2 und PRKCB1 in Gangliogliomgewebe mittels radioaktiver in situ-Hybridisierung ..............................................................................85

4.3.5

Funktionelle Charakterisierung von shRNA-Vektoren für LDB2 .................................89

4.3.6

Titration der shRNA und des Überexpressionsplasmids.............................................90

4.3.7

Zeitkurs der Effizienz der shRNA ................................................................................91

4.3.8

Analyse der shRNA-Kontrollvektoren..........................................................................93

4.3.9

Analyse veränderter neuronaler Arborisierung von hippokampalen Primärzellen bei Exposition von shRNA-mLDB2 ..................................................................................95

5

DISKUSSION .........................................................................................101

5.1

Allelische Mikrosatellitenmarker-Analyse in FCDIIb .................................................. 101

5.2

Analyse der zellulären Natur von CD34-positiven Zellelementen in Gangliogliomen ........................................................................................................................................ 104

5.3

Oligonukleotid-Microarray-Analyse in Gangliogliomen ........................................... 107

5.3.1

Wahl des Array-Designs........................................................................................... 107

5.3.2

Minimierung von kovariablen Störfaktoren in humanen Gewebe-proben ................ 109

5.3.3

Differenziell exprimierte Gene und deren Verifizierung............................................ 110

5.3.4

Regulierung des Chromatinstatus und Transkriptionsfaktoren ................................ 112

5.3.5

Intrazelluläre Signaltransduktion .............................................................................. 113

5.3.6

Transduktion von extrazellulären Signalen und Zelladhäsion.................................. 116

5.3.7

Kontrolle des Zellzyklus und der Proliferation .......................................................... 117

IV

INHALTSVERZEICHNIS 5.3.8

Entwicklung und Differenzierung.............................................................................. 119

6

ZUSAMMENFASSUNG .........................................................................128

7

ABBILDUNGSVERZEICHNIS................................................................131

8

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..............................................................133

9

PUBLIKATIONEN ..................................................................................137

10

LITERATURVERZEICHNIS ...................................................................138

11

DANKE...................................................................................................154

V