Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover, angefertigt im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Funktion der Arginindeiminase bei Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG in vitro

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Claudia Röhker aus Walsrode

Hannover 2003

II

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. Achim Gruber PD Dr. Franz-Christoph Bange

1. Gutachter: Prof. Dr. Achim Gruber 2. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz

Tag der mündlichen Prüfung: 24. November 2003

III

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis

III

Abbildungsverzeichnis

VII

Abkürzungsverzeichnis

IX

1

Einleitung

1

2

Literaturübersicht

2

2.1 Taxonomie und Beschreibung

2

2.2 Tuberkulose bei Tieren

4

2.3 Geschichte der humanen Tuberkulose

7

2.4 Epidemiologie

8

2.5 Pathogenese

10

2.6 Klinisches Bild

12

2.7 Diagnostik

13

2.8 Immungeschehen

14

2.9 Impfung

19

2.10 Therapie

21

2.11 Mykobakterien im mikroaerophilen und anaeroben Milieu

22

2.12 L-Argininkatabolismus bei Bakterien und der Argininedeiminase-Weg bei Pseudomonas aeruginosa 3

22

2.13 Zielsetzung der Arbeit

25

Material und Methoden

26

3.1 Material

26

3.1.1 Plasmide, Cosmide und Cosmid-Bibliotheken

26

3.1.2 Bakterienstämme

27

3.1.3 Primer

28

IV

3.1.4 Nährmedien und Zusätze

28

3.2 Methoden

30

3.2.1 Anzucht von Bakterien

30

3.2.2 Herstellung elektrokompetenter Zellen

30

3.2.3 Transformation in elektrokompetente E. coli

31

3.2.4 Herstellung CaCl2-kompetenter Zellen

31

3.2.5 Transformation in CaCl2-kompetente E. coli

32

3.2.6 Herstellung elektrokompetenter M. bovis BCG und M. tuberculosis

32

3.2.7 Transformation in elektrokompetente M. bovis BCG und M. tuberculosis

33

3.2.8 Präparation von Plasmid-DNA (Plasmid Mini-Prep)

33

3.2.9 Präparation von genomischer DNA

33

3.2.10 Restriktionsspaltung von DNA

34

3.2.11 Agarosegelelektrophorese

35

3.2.12 Aufreinigung von DNA

35

3.2.12.1 Aufreinigung von DNA aus Agarosegel

35

3.2.12.2 Aufreinigung von DNA aus Lösung

36

3.2.13 Verwendung der T4-Polymerase

36

3.2.14 Verwendung des Klenow-Fill-In

36

3.2.15 Dephosphorylierung von Vektor-DNA

37

3.2.16 Bestimmung des DNA-Gehaltes

37

3.2.17 Ligation

37

3.2.18 Glykogenfällung

38

3.2.19 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

39

3.2.20 Site-directed-mutagenesis

40

3.2.21 Erstellung der Konstrukte und Mutanten

41

3.2.22 Ansatz zur Messung des Ammoniakgehaltes

41

3.2.23 Ammoniakmessung (Roche Ammoniak Test)

42

3.2.24 Southern und Colony Blot-Hybridisierung

42

V

4

Ergebnisse

45

4.1 Etablierung des Ammoniaktest

46

4.2 Erstellung von Deletionsmutanten

56

4.2.1 Erstellung einer Gensonde

56

4.2.2 Colony Blot-Hybridisierung einer Cosmidbibliothek von M. tuberculosis H37Rv zum Auffinden des arcA-Gens

57

4.2.3 Southern Blot-Hybridisierung zur Bestätigung der Cosmide

58

4.2.4 Isolierung des arcA-Gen

62

4.2.5 Deletion mittels Site-directed-mutagenesis

62

4.2.6 Deletion im Arginindeiminase-Gen mittels Klonierung

66

4.2.7 Positive Selektion für das Insert

74

4.2.8 Überprüfung auf homologe Rekombination

76

4.2.9 Entfernung des Wildtypgens mittels „Ausloopen“

77

4.2.10 Ausplattieren zur Bestätigung der Elimination des Wildtypgens

77

4.2.11 Überprüfung der Mutanten in der Southern Blot-Hybridisierung

78

4.3 Funktionsassay der Mutanten

80

4.4 Komplementatierung der ∆arcA-Mutanten von Mycobacterium tuberculosis 83 5

Diskussion

85

6

Zusammenfassung/Summary

7

Literaturverzeichnis

95

8

Anhang

107

8.1 Geräte

107

8.2 Enzyme

107

93/

94

8.2.1 Restriktionsenzyme

107

8.2.2 Enzymsysteme

108

8.3 Chemikalien

109

8.4 Puffer, Lösungen und Medien

110

VI

8.5 Verbrauchsgegenstände

111

8.6 Geräte

112

8.7 EDV-Software

113

VII

Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Tabelle 1

Wirksamkeit der BCG-Impfung

20

Abbildung 1 Arginindeiminase-Stoffwechselweg

24

Abbildung 2 Reaktionsgleichung des Roche Ammoniak Test

46

Abbildung 3 Linearität der Ammoniakmessung bei v = 1 ml

47

Abbildung 4 Linearität der Ammoniakmessung bei v = 2 ml

48

Abbildung 5 Linearität der Ammoniakmessung bei v = 0,1 ml

49

Abbildung 6 Ammoniakbildung von M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen mit verschiedenen Aminosäurezusätzen

51

Abbildung 7 Ammoniakbildung aus ausgewählten Aminosäuren durch M. bovis BCG, anaerobe Bebrütung

52

Abbildung 8 Ammoniakbildung aus ausgewählten Aminosäuren durch M. bovis BCG, aerobe Bebrütung

53

Abbildung 9 gemessene Ammoniakbildung der Wildtypen, anaerob

54

Abbildung 10 gemessene Ammoniakbildung der Wildtypen, aerob

55

Abbildung 11 Lage der Sonde im Genbereich und Lage der verwendeten Enzyme

56

Abbildung 12 Agarosegel der PCR-Produkte zur Sondenerstellung

57

Abbildung 13 Colony Blot-Hybridisierungsmembranen

58

Abbildung 14 Southern Blot-Hybridisierung der Cosmide (NotI)

59

Abbildung 15 Lage der Enzymschnittstellen für die Southern Blot-Hybridisierungen

60

Abbildung 16 Southern Blot-Hybridisierung der Colony Blot-positiven Cosmide (HpaI-/XmnI)

61

Abbildung 17 Southern Blot-Hybridisierung der Cosmide (NotI und SphI)

61

Abbildung 18 Clonemanager-Programm-Darstellung der Site-directed-mutagenesis

64

Abbildung 19 Amplifikate der Site-directed-mutagenesis

65

Abbildung 20 Konstrukterstellung der Suicide-Plasmide Abbildung 21 PCR zur Überprüfung der Rekombination

67-

73 75

VIII

Abbildung 22 Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung auf homologe Rekombination (EcoNI)

76

Abbildung 23 Lage der Enzymschnittstellen für die Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung der Mutanten

78

Abbildung 24 Southern Blot-Hybridisierung der Mutanten (PvuI)

79

Abbildung 25 Southern Blot-Hybridisierung der Mutanten (EcoRI)

80

Abbildung 26 Ammoniakbildung von Mutanten und Wildtyp, anaerob

81

Abbildung 27 Ammoniakbildung von Mutanten und Wildtyp, aerob

82

Abbildung 28 Plasmid, mit dem die Mutanten komplementiert wurden

83

Abbildung 29 Ammoniakbildung von Wildtypen und komplementierten Mutanten im Vergleich Abbildung 30 NO-Zyklus

84 89

IX

Abkürzungsverzeichnis Abb. ADI ADS AIDS AS ATCC BCG bidest. bp BSA bzw. C ca. dest. DNA dNTP DOTS E. coli EDTA Fa. xg G G.T. h H. HIV i.E. IFN IL IWGMT kb L. LB-Medium M. MHC

Abbildung Arginindeiminase Albumin Dextrose Natriumchlorid Acquired Immune Deficiency Syndrome (erworbenes Immundefizienz Syndrom) Aminosäure American Type Culture Collection (Amerikanische Kulturensammlung) Bacille Calmette Guerin zweifach destilliert Basenpaar bovines Serumalbumin beziehungsweise Base Cytosin circa destilliert Deoxyribonucleic Acid (Desoxyribonukleinsäure) Desoxynukleotidtriphosphat Directly Observed Treatments Short Course (Tuberkulosebekämpfungsprogramm der WHO) Escherichia coli Ethylendiamintetraessigsäure Firma Gravitationskonstante Base Guanin gereinigtes Tuberkulin hours (Stunden) Haemophilus Humanes Immundefizienzvirus internationale Einheiten Interferon Interleukin International Working Group on Mycobacterial Taxonomy (internationale Arbeitsgruppe der mykobakteriellen Taxonomie) kilo Basenpaare Lactococcus Luria-Bertani-Medium Mycobacterium Major histocompatibility complex

X

MHH min MOTT NAD NCBI NK NO OD Ori OTC PCR pH Ps. rpm RT s. SDS sec SSC ssp. St. TAE Taq tb. TB TBC TE TGF Tm TNF U USA UV v. Chr. v WHO

Medizinische Hochschule Hannover minutes (Minuten) Mycobacteria other than tubercle bacilli (andere Mykobakterien als M. tuberculosis) Nicotinamidadenindinukleotid National Center for Biotechnical Information (nationales Zentrum für biotechnologische Information) Natürliche Killerzellen Stickoxid optische Dichte Origin of Replication Ornithin-Carbamoyl-Transferase Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion) negativer, dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration Pseudomonas rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) Raumtemperatur siehe Sodiumdodecylsulfat seconds (Sekunden) Sodiumchlorid/Sodiumcitrat Subspezies Staphylococcus Trisacetat-EDTA Thermus aquaticus tuberculosis Tuberkulose M. tuberculosis-Komplex Tris-EDTA Transforming Growth Factor Schmelztemperatur (melting temperature) Tumor Necrosis Factor units (Einheiten) United States of America (Vereinigte Staaten von Amerika) ultraviolett vor Christi Geburt Volumen World Health Organisation (Weltgesundheitsorganisation)

XI

z.B. ZNS

zum Beispiel Zentralnervensystem

1

1

Einleitung

Die Tuberkulose bei Mensch und Tier ist eine der am längsten bekannten Krankheiten und entstand vermutlich, als der Mensch begann, Tiere zu domestizieren (BROSCH et al., 2002). Seitdem sind viele Anstrengungen unternommen worden, um die Tuberkulose zu tilgen. Noch vor 20 Jahren, nach signifikantem Rückgang der Rindertuberkulose durch entsprechende Maßnahmen in weiten Teilen der Welt, war man zuversichtlich, auch in Bezug auf die Tuberkulose des Menschen ähnliche Erfolge verzeichnen zu können. Ein sukzessiver Rückgang der Fallzahlen, Therapieerfolge durch wirksame Antibiotika und ein Impfstamm ließen darauf hoffen, der Tuberkulose in naher Zukunft nur noch geschichtliche Bedeutung beimessen zu müssen (HAHN et al., 2001). Diese Hoffnungen wurden in den letzten Jahren zunehmend zerstreut. Die Wirksamkeit des Impfstoffes schwankt zwischen 0-80 %, es treten zunehmend multiresistente Erregerstämme von Mycobacterium tuberculosis auf und die Fallzahlen steigen wieder an. Zur Zeit sterben jährlich ca. 2 Millionen Menschen an Tuberkulose. Diesen hohen Opferzahlen versucht man, durch neue, zusätzliche Bekämpfungsstrategien zu begegnen (BLOOM und FINE, 1994; WHO, 2002). Ein Ansatz ist hierbei, durch Gendeletion veränderte Stämme zu erzeugen, deren Virulenz so weit herabgesetzt ist, dass sie als Impfstamm Verwendung finden können. Ziel dieser Arbeit war, festzustellen, ob Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis

BCG

über

einen

bei

Pseudomonas

aeruginosa

vollständig

vorhandenen

Stoffwechselweg, den sogenannten Arginindeiminase-Weg verfügen. Dieser Stoffwechselweg ermöglicht es dem obligat aeroben Pseudomonas aeruginosa, in vitro unter anaeroben Bedingungen zu wachsen und aus der Aminosäure Arginin in mehreren Schritten Energie zu gewinnen. Eine Vorgehensweise, die auch dem ebenfalls obligat aeroben Mycobacterium tuberculosis im sauerstoffarmen Milieu des Makrophagen von Nutzen sein könnte und dessen Verlust durch Gendeletion eine Attenuierung des Erregers zur Folge haben könnte. Ein derart attenuierter Stamm könnte zur Erstellung eines neuen Impfstammes Verwendung finden.

2

2

Literaturübersicht

2.1

Taxonomie und Beschreibung

Die Mykobakterien, die einzige Gattung aus der Familie der Mycobacteriaceae (Ordnung Actinomycetales),

zeichnen

sich

gegenüber

anderen

Bakterien

durch

ihre

Zellwandbeschaffenheit aus. Aufgrund ihres hohen Gehaltes an Wachsen sind sie ungewöhnlich beständig gegenüber Säuren und Basen. In der Gramfärbung zeigen sich die unbeweglichen, 0,2-0,7 x 1,0-10,0 µm großen, nichtsporenbildenden, obligat aeroben Stäbchen aufgrund ihrer Zellwandbestandteile schwach positiv und ihre charakteristische Ausprägung entfaltet sich in der Ziehl-Neelsen-Färbung (spezifisch für Säurefestigkeit) und in der Färbung mit Auramin (Fluoreszenz, der Farbstoff wird ebenfalls durch Säure nicht entfernt; HAHN et al., 2001). Diese beruht auf dem Gehalt von Arabinogalaktan in der Zellwand, an das Mykolsäuren (Lipide) gebunden sind. Etwa 60 % des Zellwandtrockengewichtes bilden die Lipide (Mykolsäuren und Mykoside). Diese bewirken die Hydrophobie und die Säurefestigkeit der Bakterien. Aufgrund der Säurefestigkeit kann gebundener Farbstoff (Karbolfuchsin) selbst mit Salzsäurealkohol nicht aus den Bakterien gelöst werden (PETZOLDT und KIRCHHOFF, 1986). In

der

Gattung

Mycobacterium

Mykobakterieninfektionen

wird

hervorrufenden

unterschieden Erregern

wie

zwischen M.

den

klassischen,

tuberculosis-Komplex

(M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. africanum und M. microti) und M. leprae und den „atypischen“ Mykobakterien (Mycobacteria other than tuberculosis, MOTT), die meist fakultativ pathogen sind und ubiquitär vorkommen (FRY et al., 1986). Des Weiteren wird unterschieden zwischen schnellwachsenden und langsamwachsenden Mykobakterien. Um zu den langsamwachsenden Mykobakterien gezählt zu werden, muss ein Bakterium säurefest sein. Außerdem muss es Mykolsäuren enthalten (bestehend aus 60-90 Kohlenstoffatomen, die durch Pyrolyse in 22-26 C-Atome gespalten werden können) und einen G/C-Gehalt der DNA von 61-71 mol% aufweisen (LEVY-FREBAULT und PORTAELS, 1992). Für schnellwachsende Mykobakterien sind keine Anforderungen

3

formuliert. Als langsam wachsend bezeichnet man diejenigen Mykobakterien, die in 21 Tagen ein den schnell wachsenden Mykobakterien nach 3-7 Tagen Inkubation vergleichbares Wachstum aufweisen. Die „International Working Group on Mycobacterial Taxonomy“ (IWGMT) begründete die Einteilung der Mykobakterien anhand von morphologischen, physiologischen und biochemischen Eigenschaften. Eine weitere mögliche Einteilung erfolgt anhand der Pigmentation von angezüchteten Kolonien. Nach RUNYON (1959) unterteilt man die langsamwachsenden Mykobakterien nach ihrer Pigmentierung in Kultur in photochrome (Gruppe 1), skotochromogene (Gruppe 2) und pigmentfreie (Gruppe 3) Spezies. Die schnellwachsenden Mykobakterien bilden die Gruppe 4. Hierbei nehmen einige Mykobakterien Zwischenpositionen ein. Eine Sonderstellung nimmt M. leprae ein. M. leprae ist bisher nicht in vitro anzüchtbar. Heute wird die Einteilung der Mykobakterien anhand der Ergebnisse der vergleichenden Sequenzanalyse vorgenommen (PITULLE et al., 1992; ROGALL et al., 1990). Eine weitere, klinisch oft verwendete Einteilung findet nach Risikogruppen statt (BÖTTGER, 1991): In der Risikogruppe I befinden sich die apathogenen, saprophytären Mykobakterien, deren Infektionen nur selten bei immunsupprimierten Patienten Bedeutung erlangen (z.B. M. gordonae). Die Risikogruppe II bilden die fakultativ pathogenen, opportunistischen Mykobakterien (z.B. M. avium). In die Risikogruppe III werden obligat pathogene Mykobakterien eingeteilt (z.B. M. tuberculosis). Ethymologisch erhielten die Mykobakterien ihren Namen von den Pilzen (mykes, gr. Pilz) weil M. tuberculosis aufgrund seiner Zellwandbeschaffenheit, die zur Hydrophobie führt, an der Oberfläche flüssiger Nährmedien wächst, was zur Verwechslung mit Schimmelpilzen führt. Diese Bezeichnung wurde für alle Mykobakterien übernommen, auch wenn andere Gattungszugehörige anderes Wachstum in Flüssigkultur zeigen (HAHN et al., 2001).

4

2.2

Tuberkulose bei Tieren

Mykobakterien gehören als Erreger der Tuberkulose bei Menschen und Tieren, der Paratuberkulose der Tiere und der Lepra des Menschen zu den wichtigsten pathogenen Bakterien. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf den Erkrankungen durch M. tuberculosis und M. bovis, bzw. M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), weshalb hier auch nur die in Bezug auf diese Erreger wesentlichen Erkrankungen behandelt sind. Viele Säugetiere sind für M. tuberculosis und M. bovis empfänglich. Eine Ansteckung vom Tier auf den Menschen (Zooanthroponose) ist jedoch von der Rindertuberkulose abgesehen die Ausnahme. Wesentlich häufiger ist die Ansteckung des Tieres durch den Menschen (Anthropozoonose; ROLLE und MAYR, 2002). Es wird angenommen, dass sich M. tuberculosis aus M. bovis entwickelt hat, was erklärt, warum M. bovis unter den Säugetieren über ein relativ breites Wirtsspektrum verfügt, während die Empfänglichkeit für M. tuberculosis sehr begrenzt ist (BROSCH et al., 2002). Beim Rind führt M. bovis zur anzeigepflichtigen Rindertuberkulose. Das klinische Bild ist ähnlich dem der menschlichen Tuberkulose. Die Infektion erfolgt vor allen aerogen, selten oral. Sie kann bei Kälbern auch omphalogen erfolgen. Da die Rindertuberkulose in weiten Teilen der Welt als getilgt gilt, ist als wichtigste Ansteckungsquelle der an M. bovis erkrankte Mensch zu berücksichtigen. Rinder sind allerdings in geringerem Maße auch für M. tuberculosis und M. africanum empfänglich. Nach der Infektion mit M. bovis kommt es typischerweise zu einer von der Infektionspforte abhängigen, lokalisierten Ausbildung eines Primärherdes, der mit der nachfolgenden Einbeziehung des entsprechenden Lymphknotens den Primärkomplex bildet (Cornet´sche Verteilung). An dieser Stelle endet der Prozess für gewöhnlich und erzeugt ein lokales Granulom, begleitet von der Ausbildung einer zellulären Immunität, die eine Diagnose mittels Tuberkulintest ermöglicht. In seltenen Fällen kann auch eine Frühgeneralisation auftreten, die in Form einer Miliartuberkulose oder protrahierter Generalisation in Erscheinung tritt. Postprimär ist auch eine chronische Organtuberkulose (Lunge, Niere, Euter) möglich. Bei Anschluss der sich bildenden Kavernen an ein kanalikuläres System bildet sich eine „offene Tuberkulose“ aus. Die häufigste Organmanifestation befindet sich wie beim Menschen in der Lunge. In diesem Fall tritt

5

progredienter Husten und zunehmender Verfall des Tieres auf. Sowohl Früh- als auch Spätgeneralisation sind durch Fieberschübe und Allgemeinstörungen mit letalem Ausgang gekennzeichnet (ROSENBERGER, 2002; DAHME und WEISS, 1999; ROLLE und MAYR, 2002). Die Tuberkulose von Schaf und Ziege ähnelt dem Krankheitsbild des Rindes. Es tritt vor allem die Lungentuberkulose in Erscheinung. Als weitere Organmanifestation, hauptsächlich bei Ziegen, wurde die Eutertuberkulose dokumentiert. Als Erreger wurde bei Ziegen in Spanien der bei uns unbekannte Erreger M. tuberculosis spp. caprae isoliert. Ebenfalls ähnlich ist das Krankheitsbild bei Cerviden. So sind auf Hirschfarmen ähnliche Verhältnisse wie in mit M. bovis infizierten Rinderbeständen vorgefunden worden (DAHME und WEISS, 1999; ROLLE und MAYR, 2002). Schweine infizieren sich vor allem oral, jedoch hauptsächlich mit M. avium ssp. avium, worauf hier nicht weiter eingegangen werden soll. Infektionsherde befinden sich vor allem im Darm und im Bereich des lymphatischen Rachenringes. Chronische Organtuberkulose ist aufgrund der kurzen Lebensdauer zumindest bei Mastschweinen selten. Bei Rind, kleinen Wiederkäuern und dem Schwein kann mittels Tuberkulintest auf Tuberkulose untersucht werden. Lediglich bei Hund und Katze ist der Test wenig zuverlässig. Die Pferde-Tuberkulose hat proliferativen Charakter. Die Infektion mit M. bovis (80-90 %), selten mit M. tuberculosis, erfolgt in der Regel hämatogen, nach enteraler Infektion. Darm, Lunge, Tonsillen, Kehlgangs- und Retropharyngeallymphknoten sind betroffen. In Schlachtstatistiken weisen ca. 1 % der untersuchten Tiere Tuberkulosesymptome auf. Interessant ist die Tuberkulose des Pferdes hauptsächlich differentialdiagnostisch, da meist die Lunge betroffen ist, was zur Verwechslung mit der Dämpfigkeit (chronisch obstruktive Bronchitis) führen kann (DAHME und WEISS, 1999; ROLLE und MAYR, 2002; DIETZ und HUSKAMP, 1999). Die Erkrankungen bei Hund und Katze haben sich als abhängig von der Verbreitung der Rindertuberkulose erwiesen. Als Hauptquelle für die früher weitverbreitete Infektion der Katzen mit M. bovis gilt unpasteurisierte Milch von an Eutertuberkulose erkrankten Rindern. Eine Betrachtung der Sektionsergebnisse von Katzen von 1939-1956, die eine Tuberkulose bei ca. 7 % der sezierten Tiere feststellte (95 % M. bovis) zeigt, wie verbreitet die Rindertuberkulose zu diesem Zeitpunkt noch war. Aus neuerer Zeit liegen keine Daten vor, es

6

ist jedoch anzunehmen, dass die noch auftretenden Fälle von Tuberkulose bei Katzen auf die Ansteckung durch den Menschen zurückzuführen sind. Katzen sind für M. tuberculosis relativ wenig empfänglich, weniger als Hunde. Sie sind jedoch in der Lage, wenn sie in der Umgebung offen tuberkulöser Menschen gehalten werden, ohne selbst zu erkranken, zu temporären Mykobakterienträgern und -ausscheidern (Speichel, Kot) zu werden (KRAFT und DÜRR, 2003; DAHME und WEISS 1999; ROLLE und MAYR, 2002). Beim Hund handelt es sich bei der Tuberkulose ausschließlich um eine inverse Zoonose. Die Ansteckung mit M. tuberculosis erfolgt durch das Sputum des Besitzers. Das Krankheitsbild ähnelt dem des Menschen (NIEMAND und SUTER, 2003). Heimtiere seien hier nur der Vollständigkeit halber erwähnt. Bei ihnen wird Tuberkulose nur selten diagnostiziert. Die Übertragung auf den Menschen wurde bisher nicht beschrieben, es handelt sich auch hier eher um eine Anthropozoonose. Hochempfänglich für M. tuberculosis sind Meerschweinchen, was zu ihrer Nutzung als Versuchstier in der Tuberkuloseforschung führte. Kaninchen sind relativ empfänglich für M. bovis-Infektionen. Extrem selten ist die Übertragung von Tuberkulose auf den Menschen durch Zierfische, Singvögel, Psittaziden und Schildkröten nachgewiesen (GABRISCH und ZWART, 2001). Wildtiere sind als Erregerreservoir von Bedeutung. Dachse in der Schweiz und in England wurden als Träger von M. bovis identifiziert. Meist sind lediglich die Lymphknoten verändert, selten tritt eine Lungentuberkulose oder gar eine Generalisation auf. Der Tierkontakt mit einer eventuell durchseuchten Population muss jedoch in der Therapieplanung berücksichtigt werden. Auch Exoten sind für die Verbreitung der Tuberkulose verantwortlich. In Neuseeland wurden kleine Beuteltiere (Fuchskusu-Trichosurus vulpecula) als Wirte von M. bovis ausgemacht (DAHME und WEISS 1999; ROLLE und MAYR, 2002). Besonders in Zoos sollte die Empfänglichkeit von Affen, Rindern, Antilopen und Katzenartigen für M. bovis und von Affen, Elefanten und Papageien für M. tuberculosis berücksichtigt werden. Eine BCG-Impfung ist erwiesenermaßen erfolgreich bei jungen Affen und Feliden. Bei jedem einzelnen Fall sollte jedoch die Therapie sorgfältig gegen das Risiko einer möglichen Weiterverbreitung der Tuberkulose abgewogen werden (ROLLE und MAYR, 2002). Die meldepflichtige Tuberkulose des Geflügels beruht auf einer Infektion mit M. avium ssp.

7

avium und soll hier nicht weiter ausgeführt werden. Die Dokumentation der Infektionen mit M. tuberculosis beschränkt sich auf Einzelfälle, vor allem bei Papageien (GABRISCH und ZWART, 2001). Im weiteren Verlauf werden nur die Erscheinungen der Tuberkulose beim Menschen behandelt.

2.3

Geschichte der humanen Tuberkulose

Die Tuberkulose ist eine der am längsten bekannten Krankheitsbilder. Bereits Skelette aus dem Neolithikum (ca. 4000 v. Chr.) und ägyptische Mumien (3700-1000 v. Chr.) lassen charakteristische Veränderungen erkennen, die auf spinale Tuberkulose schließen lassen. Erstmalig schriftlich erwähnt wird die Tuberkulose in der Rig Veda (verfasst zwischen 2000 und 1500 v. Chr.), dem ersten Buch der Veda, der ältesten, indischen religiösen Literatursammlung (GRANGE, 1998). Auch das Krankheitsbild der Rindertuberkulose ist schon lange bekannt und wird bereits in der Bibel (5. Buch Mose) erwähnt (SELBITZ und BISPING, 1995). Im Laufe der Jahre wurde die Tuberkulose mit vielen Namen bedacht. Im 16. Jahrhundert wurde die „Perlsucht“ des Rindes vorübergehend gar als Form der Syphilis (Franzosenkrankheit) fehlinterpretiert (ROSENBERGER, 2002). Der Begriff der „Phthisis“ (Schwindsucht) wurde von Hippokrates (um 400 v. Chr.) geprägt. Der von Thomas G. Morton geprägte Ausdruck „Tuberkel“ für die durch die Lungenform der Tuberkulose entstandenen

Läsionen

(1689)

wurde

von

Johann

Lucas

Schönlein

1832

zum

Krankheitsbegriff „Tuberkulose“ abgeleitet (HAHN et al., 2001). Als „Scrofula“ oder „Krankheit der Könige“ (da man Königen die Fähigkeit zur Heilung dieser Form durch Handauflegen nachsagte) wurde die tuberkulöse Lymphadenitis bezeichnet. Als „weiße Pest“ verursachte die Tuberkulose im 16./17. Jahrhundert in Europa ein Viertel aller Todesfälle bei Erwachsenen und die Zahl der Todesfälle stieg weiter an. Im 19. Jahrhundert verstarben in Europa ca. 30 % der Erwachsenen an Tuberkulose. Mythen begannen sich um das rätselhafte Siechtum und um dessen Therapie zu ranken. Die Überzeugung, dass es sich um ein ererbtes, von der körperlichen Beschaffenheit abhängiges Schicksal handele, verbreitete sich. Bizarre Anstrengungen wurden unternommen, um dieses

8

Schicksal abzuwenden. Die von Buchan (1782) empfohlene Aufnahme von Muttermilch, möglichst direkt aus der Brust, stellt noch eine der am wenigsten abschreckenden Therapieformen dar und ist zumindest eine Weiterentwicklung der von John of Gaddesden (1280-1361) in seiner „Curatio scrofulorum“ empfohlenen Mixtur aus Taubenkot und Wieselblut (GRANGE, 1998). Im 18. und 19. Jahrhundert verbreitete sich im Nordosten der USA gar das Gerücht, Vampire würden

die

Menschen

schwächen.

Angeblich

würde

ein

kürzlich

verstorbenes

Familienmitglied als Vampir weitere Verwandte „aussaugen“. Die Folge hiervon war, dass Verstorbene exhumiert wurden. Fand man bei ihnen „Blut im Herzen“, so wurde dies als Beweis des Vampirismus angesehen. Das Herz des Verstorbenen wurde daraufhin verbrannt, der Schädel abgetrennt und auf die Brust gelegt und die Beinknochen darunter gekreuzt. Hiervon versprach man sich die Prävention weiterer Tuberkuloseerkrankungen (SLEDZIK, 1998). Eine Eindämmung der Tuberkulose war auch nach der Entdeckung der Erregers (Robert Koch, 1882) nicht absehbar. Erst die Entwicklung von Antibiotika (Thiosemikarbazon, 1943, und Isoniazid, 1952, durch Gerhard Domagk und Streptomycin durch Selman A. Waksman, 1946) machte den oft kuriosen Therapieversuchen ein Ende, ermöglichte eine Therapie der Tuberkulose und reduzierte die Fallzahlen in den Industrieländern (ROLLE und MAYR, 2002).

2.4

Epidemiologie

Die Tuberkulose fordert zwei Millionen Todesopfer pro Jahr. Jedes Jahr infiziert sich ein Prozent der Weltbevölkerung mit M. tuberculosis. Etwa ein Drittel der Menschheit ist zur Zeit mit Tuberkulose infiziert. Die Verbreitung von humanem Immundefizienzvirus/ acquired immuno deficiency syndrome (HIV/AIDS; 11 % aller Aidstoten weltweit versterben an Tuberkulose) und die wachsende Anzahl an multiresistenten Stämmen führten 1993 zur Ausrufung des gesundheitlichen Notstandes in Bezug auf die Tuberkulose durch die Weltgesundheitsorganisation (world health organisation, WHO; WHO, 2002). Trotz der Entwicklung von wirksamen Antibiotika und eines Impfstoffes (M. bovis BCG) und

9

40 Jahre lang sinkenden Fallzahlen sterben nun jedes Jahr mehr Menschen an Tuberkulose (HAHN et al., 2001). Ein Problem ist die zunehmende Unwirksamkeit der BCG-Impfung. Ein weiteres Problem stellt die wachsende Zahl multiresistenter Stämme dar (sowohl gegen Isoniazid, als auch gegen Rifampicin resistent), die hauptsächlich auf unsachgemäße Verordnung und unsachgemäße Einnahme der Medikamente zurückzuführen ist. Die WHO versucht, dieser Zunahme multiresistenter Stämme als Folge unsachgemäßer Therapie entgegenzuwirken. DOTS (directly observed treatments short course) ist ein System der WHO, das mittels geschulter Diagnostik, fachgerechter Dosierung bereitgestellter Medikamente, Kontrolle der Patientencompliance und des Therapieerfolges ermöglichen soll, die Heilungschancen zu erhöhen und die Rate der Neuinfektionen zu senken (WHO, 2002). Mittels DOTS gelingt es, Heilungsraten von bis zu 95 % selbst in Dritte-Welt-Ländern zu erreichen, was zu einem signifikanten Abfall der Neuerkrankungen führt. Ziel des Programms ist es, 70 % aller Neuinfektionen zu detektieren und 85 % der Detektierten zu heilen. Seit 1991 existiert dieses Programm. Im Jahre 2000 gelang es bereits 10 Ländern, dieses Ziel zu erreichen (WHO, 2002; FRIEDEN, 2002). In Deutschland wurden im Jahre 2001 7.866 Neuerkrankungen von Tuberkulose gemeldet. Die Inzidenz liegt somit bei 9,57 pro 100.000 Einwohner. Dies entspricht einem Rückgang gegenüber dem Jahr 2000 (9064 erfasste Fälle) von 13,2 % (RKI, 2003). Trotzdem ist Deutschland weit von einer Vorreiterstellung bei der Tuberkulosebekämpfung entfernt. Die Erkrankungen durch M. bovis beim Menschen gingen aufgrund des RindertuberkuloseEradikationsprogramms und des Pasteurisierens der Milch stark zurück (0,1 % aller Tuberkulosefälle). 1896 initiierte Bernhard Bang in Dänemark ein Eradikationsprogramm, das auf dem Tuberkulintest fußte. Alle testpositiven Tiere wurden ausgemerzt. Soweit dies wirtschaftlich nicht vertretbar war, wurden testpositive Tiere von der Herde abgetrennt und deren Kälber in tuberkulosefreier Umgebung aufgezogen. In Deutschland beschränkte man sich auf das Ostertag´sche Verfahren, nach dem lediglich klinisch und bakteriologisch positive Tiere ausgemerzt wurden. Auf diese Weise wurden 40-50 % der offen tuberkulösen Rinder nicht erkannt. Demzufolge waren noch 1955 (MEYN, 1955) über 30 % aller Rinder und etwa 60 % aller Bestände befallen. Aufgrund der positiven Erfahrungen in den USA und Skandinavien

10

wurde auch in West-Deutschland 1952 ein freiwilliges Bekämpfungsprogramm gestartet, das auf dem Tuberkulintest beruhte. Das Programm wurde von Regierung und Industrie durch Beihilfen für die Ausmerzung tuberkulöser Rinder und Honorierung von Milch aus anerkannt tuberkulosefreien

Betrieben

vorangetrieben.

1961

betrug

der

Anteil

anerkannt

tuberkulosefreier Betriebe in Deutschland 99,7 %. Der Anteil der Tuberkulintest-positiven Tiere betrug seitdem jährlich ca. 1 %. Von diesen 1 % entfiel nur ein kleiner Anteil (10-20 %) auf Infektionen des bovinen Typs. Der Hauptanteil waren falschpositive Probanden, die mit atypischen Mykobakterien oder mit Paratuberkulose infiziert waren, was eine fragliche oder positive Tuberkulinreaktion verursachen kann (ROSENBERGER, 2002).

2.5

Pathogenese

Eine Infektion des Menschen mit M. tuberculosis hat nicht zwangsläufig eine Erkrankung zur Folge. Nur 5-10 % der infizierten Immunkompetenten erkranken im Laufe ihres Lebens an aktiver

Tuberkulose.

Bei

immunsupprimierten

HIV-positiven

Patienten

liegt

die

Wahrscheinlichkeit, nach einer Infektion mit M. tuberculosis an Tuberkulose zu erkranken, bei ca. 50 %. Es

wird

zwischen

der

Primärtuberkulose

und

der

Postprimärtuberkulose

(Reaktivierungskrankheit) unterschieden. Bei der Primärtuberkulose werden die erregerhaltigen Aerosoltröpfchen nach der Einatmung von Alveolarmakrophagen phagozytiert. M. tuberculosis ist in der Lage, sich im Makrophagen zu vermehren und dort zu persistieren, bis dieser abstirbt. Beim Zerfall des Makrophagen werden entzündungsfördernde Stoffe freigesetzt, die zur Entstehung von Läsionen, dem sogenannten Primäraffekt (PA) führen. Wenn die Infektion über die Atemwege erfolgte, wandern Tuberkulosebakterien über die ableitenden Lymphbahnen in den Hiluslymphknoten und verursachen dort eine regionale Immunantwort, die zur Anschwellung der Lymhknoten führen. Diese Einheit von Primäraffekt und lokalem Lymphknoten bezeichnet man als Primärkomplex oder Ghonscher Primärkomplex. Zu diesem Zeitpunkt besteht bereits eine Tuberkulinallergie und es wird eine Granulombildung und eine Aktivierung der Makrophagen induziert.

11

Bei über 90 % der Erkrankungen stagniert der Krankheitsverlauf an dieser Stelle. Der Primäraffekt und der Primärkomplex vernarben und verkalken und eine zelluläre Immunität entsteht. Es besteht kein akuter Krankheitsbestand, obwohl lebenslang Keime in diesem Herd enthalten sein können. In Einzelfällen treten progrediente Verläufe der Primärtuberkulose auf: Bei der progressiven Primärtuberkulose der Lunge kann sich ohne Ausbildung eines Primärkomplexes kurze Zeit nach der Infektion ein primär verkäsender, nekrotischer Prozess entwickeln. Ein solcher Verlauf tritt in Einzelfällen bei Kindern und Jugendlichen auf. Als Ursache wird eine verminderte zelluläre Immunantwort angenommen. Eine lymphogen-hämatogene Streuung kann bei abwehrschwachen Patienten auftreten. Befallene Organe weisen miliare Herde auf, die dem Krankheitsbild den Namen primäre Miliartuberkulose verliehen. Diese Herde finden sich oft auch in den Meningen, in der Leber und im Knochenmark. Der progressive, schwere Verlauf dieser Form führt unbehandelt zum Tode. Wenn das Immunsystem des Infizierten nahezu zusammengebrochen ist, kann sich eine septische Verlaufsform ohne Granulombildung entwickeln. Diese als Landouzy-Sepsis bezeichnete Verlaufsform wird gelegentlich bei AIDS-Patienten beobachtet. Vorwiegend bei Kleinkindern kann sich eine primäre tuberkulöse Meningitis entwickeln, die an der Schädelbasis lokalisiert ist. Diese wird durch hämatogene Infektion der Meningen verursacht und hat einen charakteristischen, langsamen Verlauf. Auch bei Erwachsenen ist eine hämatogene Streuung der Erreger möglich. Die Erreger gelangen mit dem Lymphfluss über den Milchbrustgang in die Blutbahn und werden in verschiedenen Organen abgelagert (Primäre Streuherdbildung). Besonders betroffen sind hierbei das Nierenparenchym, die Knochenepiphysen, Milz und apikale Lungenabschnitte. Die sich hierbei bildenden Herde (besonders die Simonschen Spitzenherde in der Lunge) können als Ausgangspunkt eines Postprimärstadiums fungieren. Die Reaktivierungskrankheit (Postprimärtuberkulose) tritt dann auf, wenn nach Ausbildung eines Primärkomplexes eine Schwächung des Immunsystems auftritt. Die verantwortlichen Faktoren für eine Schwächungen des Immunsystems sind vielseitig. Nicht nur eine HIVInfektion, Krankheit oder schlechte körperliche Verfassung, z.B. durch Unterernährung sind in Erwägung zu ziehen, auch Diabetes mellitus, eine Superinfektion oder der Eintritt der

12

Pubertät können eine Postprimärtuberkulose verursachen. Diese Postprimärtuberkulose zeichnet sich durch eine käsige Nekrotisierung der Granulome aus. Verflüssigt sich der Inhalt des Granuloms, nennt man die sich bildende flüssigkeitsgefüllte Höhle „Kaverne“. In dieser Kaverne vermehren sich die Erreger massenhaft. Findet der nekrotisierende Prozess Anschluss an einen Bronchus, werden die Erreger über die Lunge abgehustet. Man bezeichnet dies als „offene Lungentuberkulose“. Dehnt sich der Prozess auf ein Blutgefäß aus, so werden die Erreger hämatogen gestreut und es entsteht eine Organtuberkulose. Für das Infektionsgeschehen wichtig ist auch der Anschluss einer Kaverne an das kanalikuläre System der Niere. Im Urin können massenhaft Erreger ausgeschieden werden (HAHN et al., 2001; ROLLE und MAYR, 2002).

2.6

Klinisches Bild

Die klinischen Symptome der Tuberkulose sind im primären Stadium zunächst unspezifisch und im weiteren, postprimären Verlauf von den entstehenden Granulomen, der typischen Gewebereaktion bei Infektionen mit M. tuberculosis, geprägt. Die Lungentuberkulose ist mit 85 % die häufigste klinische Form der Postprimärtuberkulose. Ihre

klinischen

Erscheinungen

sind

zunächst

unspezifisch.

Chronisches

Fieber,

Gewichtsverlust, Nachtschweiß, Husten, eventuell mit blutigem Auswurf (wenn eine Kaverne Anschluss an ein Blutgefäß gefunden hat) weisen auf eine Lungentuberkulose hin. Nierentuberkulose wird meist erst durch Hämaturie bemerkt, wenn auch hier eine Kaverne Anschluss an das kanalikuläre System der Niere erlangt. Die Infektion des Zentralnervensystems (ZNS) kann zu einer subakuten basalen Meningitis oder einem Granulom im Gehirn führen und entsprechende neurologische Symptome hervorrufen. Bei einer Tuberkulose der Nebennierenrinde versagt die Hormonproduktion der Kortikosteroide und führt zum klinischen Bild des Morbus Addison. Außerdem gibt es Haut-, Augen-, Hirn-, Miliar- und Darmtuberkulose mit entsprechenden Symptomen und die oftmals Sterilität hinterlassende Tuberkulose des weiblichen Genitale (HAHN et al., 2001; McKINNEY, 1998).

13

2.7

Diagnostik

Robert Koch bemühte sich, einen Impfstoff durch Abtötung des Erregers zu entwickeln. Zu diesem Zweck filterte er den abgekochten, proteinhaltigen Überstand von Flüssigkulturen. Aus diesem sogenannten „Alttuberkulin“ wurden durch Fällung mit Ammoniumsulfat Proteine erhalten, die als „gereinigtes Tuberkulin“ (G.T.) bezeichnet werden. Wird dieses G.T. in die menschliche Haut verbracht, so verursacht es bei Patienten, die bereits einen Ghonschen Primärkomplex entwickelt haben (6-14 Wochen post infectionem), nach 24-72 Stunden eine allergische Reaktion vom Typ IV (verzögerter Typ), die sich in einer Rötung und Schwellung an der G.T.-exponierten Stelle äußert. Dieser Tuberkulintest wird auf mehrere Arten durchgeführt. Der Moro-Test bei Säuglingen und Kleinkindern wird mit tuberkulinhaltiger Salbe ausgeführt. Der bei Reihenuntersuchungen bei Erwachsenen durchgeführte Tine-Test appliziert mittels eines Nadelstempels mit vier Spitzen G.T. intrakutan. Der Mendel-Mantoux-Test verbringt ebenfalls G.T. intrakutan, allerdings festgelegt als 10 i.E. G.T. (10 internationale Einheiten gereinigten Tuberkulins). Dieser Test wird angewendet, wenn eine M. tuberculosis-Infektion mit Sicherheit ausgeschlossen werden muss. Bei negativem Ausfall wird der Mendel-Mantoux-Test mit 100 i.E. G.T. wiederholt. Hierbei ist keine Unterscheidung zwischen einer Tuberkulinallergie aufgrund einer M. tuberculosis-Infektion und einer erworbenen Immunität durch eine BCG-Impfung möglich. Der beweisende Nachweis im Labor erfolgt noch immer durch Erregeranzüchtung, vorausgesetzt, das Patientenmaterial wurde gekühlt versandt, so dass die Begleitflora eine Anzüchtung der ohnehin schwer kultivierbaren (große Erregermenge nötig), da zum Teil langsamwachsenden Mykobakterien, nicht erschwert. Zunächst wird jedoch ein Präparat des eingesandten Materials (z.B. Sputum) nach ZiehlNeelsen (nach Erhitzen Färbung) oder mit Auramin (ohne Erhitzen) gefärbt. Beide Färbungen identifizieren säurefeste Bakterien. Ein positiver Befund ist nicht beweisend für eine Tuberkuloseinfektion, da auch apathogene (MOTT) Mykobakterien säurefest sind. Bei massenhaftem Erregervorkommen, kann eine mikroskopisch sichtbare, zopfartige Anordnung aufgrund des Cordfaktors (Virulenzfaktor) zur Verdachtsdiagnose der M.

tuberculosis-

14

Infektion führen. Ein negativer Befund ist ebenfalls nicht beweisend, da erst ein relativ hoher Erregergehalt (105 Bakterien pro ml Untersuchungsmaterial) mikroskopisch feststellbar ist. Bei der Anzucht ist zu beachten, dass nach der Homogenisierung des Probenmaterials die Begleitflora

abgetötet

werden

muss.

Die

durch

Zentrifugation

angereicherte

Bakteriensuspension wird in speziellen Nährmedien (meist mit Eigelbzusatz) 2-3 Wochen bei 37°C bebrütet, bis ein positiver Befund erhoben werden kann. Wenn nach 6-8 Wochen kein Wachstum aufgetreten ist, gilt die Kultur als negativ. Ein Antibiogramm nimmt weitere 6 Wochen in Anspruch. Dieses zeitaufwendige, althergebrachte Diagnostikprogramm wird in den letzten Jahren durch Polymerase-Kettenreaktion- (Polymerase chain reaction, PCR)-Amplifikation unterstützt, die eine Diagnose einer Mykobakterieninfektion innerhalb von 2-3 Tagen zumindest ausschließen kann. Im positiven Fall ist es inzwischen möglich, mittels Lightcycler-PCR zum Teil die Mykobakterien zu differenzieren. Beweisend ist in diesem Fall allerdings immer noch der kulturelle Nachweis (LACHNIK et al., 2002). Wenn eine Tuberkulose diagnostiziert wird, so sind sowohl die Erkrankung als auch der Tod eines Patienten nach §3 des Infektionsschutzgesetzes meldepflichtig (HAHN et al., 2001; McKINNEY et al., 1998).

2.8

Immungeschehen

Bereits Robert Koch stellte 1882 fest, dass sich M. tuberculosis in Riesenzellen in granulomatösen Läsionen befindet (KOCH, 1882). Die Granulombildung ist kennzeichnend für das Krankheitsbild der Tuberkulose. Angelockte Makrophagen und vereinzelte T-Lymphozyten bilden einen lockeren Zellverbund, der sich zu einem Granulom verdichtet. In diesem Granulom verschmelzen Makrophagen zu Langhansschen Riesenzellen, bzw. entwickeln sich in der Randzone zu Epitheloidzellen (HAHN et al., 2001). Die Aktivierung von Makrophagen und die in ihnen ablaufenden Vorgänge sind sehr komplex.

Die

Adhärenz

von

Mykobakterien

an

Makrophagen

wird

von

15

Oberflächenmolekülen des Makrophagen vermittelt. Komplementrezeptor CR1 und CR3, Mannoserezeptoren, Lipopolysaccharid-(LPS-) Rezeptor (CD14), Fc-Rezeptoren und der Scavenger-Rezeptor nehmen daran teil. Die Mykobakterien befinden sich nach der Opsonierung in einem Endosomen oder Phagosomen, dessen zunehmende Ansäuerung (bis zu einem pH von 5,0-5,5) physiologischerweise in einer Fusion mit dem Lysosom endet. Normalerweise werden in dem entstandenen Phagolysosom ingestierte Bakterien durch saure Hydrolasen abgetötet. Mykobakterien sind im Phagosom jedoch in der Lage, die Ansäuerung und damit die Fusion mit dem Lysosom in der Mehrzahl der Fälle zu verhindern. Ein Effekt, der auf das Fehlen der vakuolären Protonenpumpe (STURGILL-KOSZYCKI et al., 1994), sowie auf eine fehlende Ansäuerung mittels Ammoniakakkumulation zurückgeführt wird (GORDON

et

al.,

1980).

Auch

die

Präsentation

von

Sulfatiden

auf

der

Mykobakterienoberfläche ist in vitro in der Lage, eine Fusion von Phagosom und Lysosom zu verhindern. Ein weiterer Mechanismus, um den sauren Hydrolasen zu entgehen, ist das Entkommen aus der Vakuole in das Zytoplasma. Ein Mechanismus zur Lysis der Vakuolenmembran wurde postuliert (KING et al., 1993). Ob dieser Mechanismus wirklich genutzt wird, konnte elektronenmikroskopisch nicht geklärt werden (XU et al., 1994), da im beobachteten Fall die Mykobakterien nur in membrangebundenen Vakuolen und nicht frei im Zytoplasma vorlagen. Ein weiterer Schachzug, dem Immunsystem seines Wirtes zu entgehen, besteht darin, dass M. tuberculosis die Präsentation seiner Antigene zu verhindern weiß (PANCHOLI et al., 1993). Die intrazellulären Vorgänge im Makrophagen sind aus vielerlei Gründen interessant. Zum einen, weil in der Vakuole weniger Nährstoffe als im Zytoplasma zum Wachstum zur Verfügung stehen. Es ist nicht bekannt, wieviel Nährstoffe vom Zytoplasma in die Vakuole übergehen können, aber die Attenuierung einer Leucin-auxotrophen Mutante ist ein Hinweis darauf, dass der Nährstoffgehalt in der Vakuole begrenzt ist (BANGE et al., 1996). Wäre der Gehalt an Leucin in der Vakuole dem Zytoplasmaspiegel ähnlich, wäre keine Attenuierung aufgetreten. Zum Anderen wird dadurch, dass MHC-I gebundene T-Zellen wichtig für die Immunantwort sind, gezeigt, dass Antigenpeptide einen Zugang zum Zytoplasma und endoplamatischen Retikulum erhalten haben müssen. Eine M. tuberculosis-Infektion erhöht die Präsentation von löslichen Antigenen von MHC-I-Molekülen (MAZZACCARO et al., 1996).

16

Die Immunantwort in murinen Makrophagen ist relativ ausführlich erforscht. Eine antimykobakterielle Funktion ist seit langem bewiesen (PATTERSON und YOUMANS, 1970). Später wurde IFN-γ als Trigger der murinen Makrophagenaktivierung entdeckt (ROOK et al., 1986) und der synergistische Effekt von TNF-α auf IFN-γ im murinen Makrophagen (FLESCH und KAUFMANN, 1990). TNF-α wird auch für die Granulombildung verantwortlich gemacht (KINDLER et al., 1989). TNF-α wird von infizierten Makrophagen sezerniert und akkumuliert in tuberkulösen Läsionen (BARNES et al., 1990). Die Freisetzung von TNF-α wird von den Zellwandbestandteilen der Mykobakterien (Muramyldipeptid und LAM) verursacht (MORANO et al., 1989). Die andauernde Sekretion und Akkumulation von TNF-α wird für die Begleiterscheinungen der Tuberkulose wie Fieber, Gewichtsverlust und Nachtschweiß verantwortlich gemacht. Auch Interleukine (IL) sind an der Makrophagenaktivierung beteiligt. In vitro sind Interleukin 4 (IL-4) und IL-6 in der Lage, Makrophagenaktivität zu stimulieren. In der menschlichen Myelomonocyten-Zellinie THP-1 führte eine Infektion mit M. tuberculosis zu einer Ausschüttung von IL-6 und IL-8 (FRIEDLAND et al., 1993). Von IL-8 wird ebenfalls angenommen, dass seine Fähigkeit, für T-Zellen als chemotaktisches Agens zu wirken, bei der Granulombildung eine Rolle spielt. Es ist nicht genau bekannt, welche Zytokine im menschlichen Organismus zusätzlich notwendig sind, um Makrophagen zum Abtöten von Mykobakterien zu befähigen. Eine alleinige Stimulation mittels IFN-γ und TNF-α wie bei der Maus reicht zumindest nicht aus. Auch durch Aktivierung von 1,25-dihydoxyvitamin-D wird lediglich eine Verlangsamung der intrazellulären Erregervermehrung erreicht (ROOK et al., 1986; CROWLE et al., 1987; CROWLE und ELKINS, 1990; DENIS, 1991). Die Wirkung von IFN-γ und TNF-α besteht darin, dass sie in der Lage sind, den Makrophagen zur Produktion von Sauerstoffradikalen (ROI) anzuregen. Die Ausschüttung von Wasserstoffperoxid und reaktiven Sauerstoffintermediaten während des „respiratory burst“ nach Aktivierung der Makrophagen durch Überstand von immunologisch stimulierten Lymphozyten (KLEBANOFF, 1980) wurden als Erzeuger des antimykobakteriellen Effekts identifiziert (WALKER und LOWRIE, 1981). Allerdings zeigten CHAN und Kollegen

17

(1992), dass M. tuberculosis relativ widerstandsfähig gegen Sauerstoffradikale und Wasserstoffperoxid (den sogenannten „respiratory burst“) ist. Zunehmend wird den Stickstoffintermediaten (RNI) wie NO (Stickoxid) eine Bedeutung beim Mikrobizid der Mykobakterien zugeschrieben. In murinen Makrophagen war es mit IFN-γ und TNF-α möglich, die induzierbare NO-Synthase (iNOS) hochzuregulieren (DENIS, 1991; FLESCH und KAUFMANN, 1991; CHAN et al., 1992) und somit vermehrt NO zu produzieren, was zur Abtötung von M. tuberculosis in vitro führte. Die Wechselwirkungen von IFN-γ und TNF-α mit den Interleukinen ist vielfältig. Die Ausschüttung von IFN-γ durch Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) wird z.B. durch die Interleukin-12-(Il-12-) Sekretion von mykobakterieninfizierten Makrophagen verursacht (FLESCH et al., 1995; FULTON et al., 1996). IFN-γ und TNF-α wiederum stimulieren die Sekretion von IL-12 aus infizierten Makrophagen. Die Akkumulation von IL-12sezernierenden Makrophagen in tuberkulösen Läsionen bei Patienten mit Lungentuberkulose unterstützt diese These (ZHANG et al., 1994; LIN et al., 1996). Die Schutzwirkung von IL-12 wurde bewiesen, indem mit M. tuberculosis infizierten Mäusen IL-12 verabreicht wurde, was zu verlängerter Lebenszeit und Abschwächung der Symptome führte (COOPER et al., 1995; FLYNN et al., 1995). Des Weiteren kann das IFN-γ zur Makrophagenaktivierung auch von γδ-T-Zellen stammen, die sich vermehrt in der Lunge befinden und nach Kontakt mit Mykobakterienantigen proliferieren. γδ-T-Zellen produzieren auch TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5 und IL-10, ähnlich den αβ-T-Zellen. Außerdem haben sie eine zytotoxische Aktivität gegenüber Mykobakterieninfizierten Monozyten (TSUKAGUCHI et al., 1995). Die erworbene Tuberkuloseresistenz wird den T-Lymphozyten zugeschrieben. Diese präsentieren den αβ-T-Zellrezeptor und entweder den CD4- oder CD8-Corezeptor. CD8-TZellen erkennen von MHC-I-Molekülen präsentierte Antigene überall im Körper. CD4-TZellen erkennen von MHC-II-Molekülen präsentierte Antigene. Diese MHC-II-Moleküle sind nicht ubiquitär im Körper vorhanden, sondern finden sich nur auf spezialisierten, antigenpräsentierenden Zellen wie Makrophagen. CD4- und CD8-Zellen können ebenfalls IFN-γ bilden, um Makrophagen zu aktivieren. Als Zusatz zu IFN-γ sezernieren T-Helferzellen Cytokine. TH1-Zellen bilden IFN-γ und IL-2, TH2-Zellen bilden IL-4.

18

Bei mit M. tuberculosis infizierten Menschen zeigen γδ-T-Zellen und MHC-II-assoziierte CD4+αβ-T-Zellen zytolytische Fähigkeiten gegenüber Mykobakterienantigen-präsentierenden Makrophagen (KUMARARATNE et al., 1990; BOOM et al., 1991; LORGAT et al., 1992; TSUKAGUCHI et al., 1995). Zusätzlich antwortet eine weitere Klasse menschlicher zytotoxischer T-Zellen auf die Präsentation von Mykolsäuren und LAM durch CD1b (PORCELLI et al., 1992). Diese TZellen tragen einen αβ-T-Zell-Rezeptor, zeigen aber weder einen CD4-, noch CD8-Rezeptor. Diese CD1b-abhängigen T-Zellen können M. tuberculosis in vitro abtöten (STENGER et al., 1997). Von Nutzen ist den Mykobakterien auch Transforming growth factor beta (TGF-β). Infizierte Makrophagen bilden TGF-β, das die MHC-II-Funktion abreguliert (HIRSCH et al., 1994, 1996). Bei Tuberkulosepatienten wurde TGF-β-Produktion in Blutmonozyten, Riesenzellen und Epithelzellen in pulmonären Läsionen nachgewiesen (TOOSSI et al., 1995). TGF-β hat mehrere immunsuppressive Fähigkeiten, die einer Mykobakterieninfektion zugute kommen können. Die T-Zellantwort auf Antigene wird durch TGF-β vermindert, ebenso die Funktionen von zytotoxischen T-Zellen und Natürlichen Killerzellen. Außerdem bremst es die Makrophagenproduktion von Sauerstoffradikalen und NO als Reaktion auf die Ausschüttung von IFN-γ und TNF-α (TSUNAWAKI et al., 1988; DING et al., 1990). Die Mykobakterien nutzen dies zu ihrem Vorteil und in Anwesenheit von TGF-β erhöht sich die Replikationsrate (HIRSCH et al., 1994). Andererseits bewahrt TGF-β den Wirtsorganismus vor weitgreifenden Gewebeschäden durch eine überschießende Immunantwort, was seine Rolle im Immunsystem erklärt.

19

2.9

Impfung

Bereits Antoine Bernard-Jean Marfan entdeckte 1886, dass Patienten mit überstandener Hauttuberkulose oder überstandener tuberkulöser Adenitis nicht an Lungentuberkulose erkranken (RICH, 1944). Um 1890 begann auch Robert Koch, sich mit erworbener Immunität zu beschäftigen. Er beobachtete, dass mit Tuberkulose infizierte Meerschweinchen bereits 2-3 Tage nach subkutaner Injektion von M. tuberculosis eine lokale Nekrose ausbildeten, während gesunde Meerschweinchen eine solche Nekrose erst nach 2-3 Wochen entwickelten. Derselbe Effekt konnte mit abgetöteten Tuberkuloseerregern oder zellfreiem Bakterienderivat (AltTuberkulin)

erzeugt

werden

(Koch´sches

Phänomen).

Es

wurden

Anstrengungen

unternommen, einen Impfstoff aus zellfreien Derivaten von M. tuberculosis herzustellen. Diese Bemühungen misslangen (HAHN et al., 2001). Am Institut Pasteur beschäftigten sich Albert Calmette und Camille Guerin mit der Nutzung attenuierter Stämme als Impfstoff. Sie gingen dabei von Louis Pasteurs Beobachtung aus, dass ein virulenter Organismus durch wiederholte Passagierung attenuiert werden kann (GEISON, 1995). 1902 wurde von Edmond Nocard ein virulenter Stamm von Mycobacterium bovis isoliert, den Calmette und Guerin als „souche lait nocard“ von 1908-1919 in 230 Passagierungen attenuierten. Der ihnen zu Ehren M. bovis BCG (Bacillus Calmette Guerin) genannte Stamm wurde in zahlreichen Versuchstieren und schließlich auch an Rindern getestet. Nachdem als erwiesen angesehen werden konnte, dass er in vivo nicht in die virulente Form zurückmutiert, wurde BCG ab 1921 zunächst oral, später subkutan (um einen positiven Tuberkulintest als Impfbestätigung zu erhalten) als Impfstoff angewandt. 1939 wurde die Impfmethode von S. R. Rosenthal modifiziert. Seine Applikationstechnik, die den Impfstoff auf mehrere Injektionsstellen verteilte, reduzierte die bis dato häufig aufgetretene Nekrosenbildung am Injektionsort (HAHN et al., 2001). Zunächst schien BCG ein idealer Impfstoff zu sein. Er ist relativ ungefährlich für den Impfling, günstig herzustellen, kann in jedem Lebensalter verabreicht werden und kann ohne die Notwendigkeit einer Kühlung in die entlegendsten Gebiete verbracht werden. Doch nach heutigen Erkenntnissen variiert die Effizienz (Immunantwort) einer BCG-Impfung zwischen 0-80% (BLOOM und FINE, 1994). Die Ergebnisse der Studie von BLOOM und FINE sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt.

20

Ort (Jahr)

Ungeimpfte

Geimpfte

Tuberkulosefälle Tuberkulosefälle

Probanden

Probanden bei Ungeimpften

Impfschutz Exposition

bei Geimpften

mit

atyp. Mykobakterien

Haiti (1973) 629

2545

15

25

80 %

unbekannt

Kanada

303

306

29

6

80 %

gering

1451

1541

372

108

75 %

gering

1665

1716

65

17

75 %

gering

17135

20623

74

48

37 %

unbekannt

Puerto Rico 27338

50634

141

186

31 %

hoch

5805

5069

56

28

31 %

hoch

USA (1969) 2341

2398

3

5

0%

hoch

USA (1976) 17854

16913

32

26

14 %

hoch

Indien

60000

93

192

0%

hoch

(1949) Nordamerikan. Indianer (1958) Chicago (1961) Südafrika (1968) (1974) Indien (1973)

30000

(1980) Tabelle 1

Wirksamkeit der BCG-Impfung (BLOOM u. FINE, 1994)

Mehrere Gründe wurden hierfür verantwortlich gemacht (Heterogenität des Impfstammes, genetische Unterschiede der Impflinge, etc.). Als Hauptursache wird die Exposition der Impflinge gegenüber atypischen Mykobakterien betrachtet (WILSON et al., 1995). Des Weiteren ist die Impfung nie zu 100 % erfolgreich. Dies ist auch von einem attenuierten Stamm nicht zu erwarten, da selbst eine erworbene Immunität nicht 100 %ig vor einer Reinfektion schützt. Zur Zeit stellt die BCG-Impfung in Ländern mit hoher Prävalenz immer noch die wichtigste

21

Methode dar, um einer Ausbreitung der Tuberkulose entgegenzuwirken. Eine Schwierigkeit stellen hierbei HIV-positive Impflinge dar, bei denen eine Impfung kontraindiziert ist und zur Ausbildung einer disseminerten BCGitis führen kann. Ein HIV-Test vor der Impfung ist vor diesem Hintergrund zu empfehlen (WHO, 2002). In Deutschland wird aufgrund der geringen Inzidenz zur Zeit keine Impfung für Kinder empfohlen (HAHN et al., 2001).

2.10

Therapie

Man unterscheidet zwei Therapieformen: die chirurgische Therapie und die Chemotherapie. Eine chirurgische Therapie besteht im Entfernen der Tuberkuloseherde im Körper. Sie ist grundsätzlich von einer chemotherapeutischen Maßnahme flankiert. Die

Chemotherapie

basiert

grundsätzlich

auf

mehreren

Antibiotika,

um

einer

Resistenzbildung vorzubeugen (Kombinationstherapie). In den ersten 2-3 Monaten nach Erkrankung (Initialphase) werden 3-4 Mittel (Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid und Streptomycin und /oder Ethambutol) verabreicht. In der Stabilisierungsphase (ab dem vierten Monat nach Erkrankung) reicht eine Applikation von Isoniazid und Rifampicin, sofern das Antibiogramm, das zu diesem Zeitpunkt vorliegen sollte, nicht dagegen spricht. Der Therapieerfolg wird regelmäßig kontrolliert. Eine „offene Tuberkulose“ gilt als auskuriert, wenn in drei nacheinander gewonnenen Sputumproben mikroskopisch und in Kultur keine Erreger mehr nachgewiesen werden können. Die Therapie der Tuberkulose muss nicht zwingend stationär erfolgen. Sofern der Patient zuverlässig in Bezug auf die Einnahme der Medikamente ist (Compliance) und keine offene Tuberkulose besteht, kann eine Behandlung außerhalb des Krankenhauses erfolgen (HAHN, et al., 2001).

22

2.11

Mykobakterien im mikroaerophilen und anaeroben Milieu

Da die Mykobakterien im Wirt in Makrophagen vorliegen, stellt sich die Frage, wie die angeblich obligat aeroben Erreger in diesem mikroaerophilen bis anaeroben Milieu (BARCLAY und WHEELER, 1989) zum Teil über einen sehr langen Zeitraum persistieren und sich sogar vermehren (MANABE und BISHAI, 2000). Um herauszufinden, welcher Mechanismen sich Mykobakterien zur Erlangung der Persistenz im anaeroben Milieu bedienen, lohnt sich ein Vergleich mit Pseudomonas (Ps.) aeruginosa. Ps. aeruginosa kann aus Patientenisolaten mit Cystischer Fibrose isoliert werden (HAHN et al., 2001). Unter den Bedingungen der Cystischen Fibrose (Schleimbildung im Respirationstrakt) ist der Sauerstoffgehalt stark bis völlig reduziert. Da Ps. aeruginosa ebenfalls ein angeblich obligat aerober Keim ist, stellt sich auch hier die Frage, wie es ihm möglich ist, unter diesen Bedingungen zu persistieren. Ein beschriebener Weg hierfür ist der Arginindeiminase-Weg (ADI-Weg).

2.12

L-Argininkatabolismus

bei

Bakterien

und

der

Arginindeiminase-Weg

bei

Pseudomonas aeruginosa Man unterscheidet bei Bakterien diverse Möglichkeiten, Arginin abzubauen: Die vier wichtigsten sind: • ADI-Weg:

L-Arginin

L-Ornithin, Bikarbonat und Ammoniak

• Arginin-Decarboxylase-Weg: L-Arginin

GABA

• Arginin-Succinyltransferase-Weg: L-Arginin • Arginase-Weg: L-Arginin

Glutamat und Succinat Glutamat

Die Sequenzierung von M. tuberculosis (COLE et al., 1998) zeigte mehrere Homologien zu Enzymen dieser Stoffwechselwege auf: Arginindeiminase (Rv1001), Arginindecarboxylase

23

(Rv2531c) und Genhomologien zum Arginase-Weg (Rv2321c, Rv2322c und Rv1187). PETEROY-KELLY und Kollegen (2003) fanden zudem eine Homologie zu dem L-ArgininTransporter RocE von Bacillus subtilis in den Genen Rv0522 und Rv2320c von M. tuberculosis und postulierten daraufhin eine wichtige Funktion des L-Arginin im Mykobakterien-Stoffwechsel. Der ADI-Weg ist nicht bei allen Bakterien komplett vorhanden. Einige besitzen nur einzelne Gene, anderen fehlt ein Enzym. So fehlt Haemophilus (H.) influenzae, Lactococcus (L.) lactis und Staphylococcus (S.) aureus das arcA-Gen, während Borrelia (B.) afzelii und B. burgdorferii das arcC und Mesorhizobium (M.) loti gar arcB und arcC fehlen (ZUNIGA et al., 2002). Beispielhaft angeführt sei hier der vollständig vorhandene ADI-Weg bei Ps. aeruginosa angeführt. Der ADI-Weg wird vermittelt durch die Enzyme Arginindeiminase (ADI), OrnithinCarbamoyltransferase (OTCase) und Carbamatkinase (CK). Reguliert wird der ADI-Weg durch arcR. Weitere Regulatoren werden vermutet. Dem arcABC-Cluster assoziiert ist ein Membranprotein (arcD), das die Aufnahme des Substrates Arginin reguliert. Im Verlauf des ADI-Stoffwechselweges wird L-Arginin über Citrullin zu Ornithin und Carbamoylphosphat, das zur Phosphorylierung von ADP zu ATP genutzt wird, abgebaut. Hierbei wird aus 1 mol L-Arginin 1 mol ATP generiert (THAUER et al., 1977). In der nachfolgenden Abbildung 1 ist der Verlauf des ADI-Weges schematisch dargestellt.

24

Arginin NH3 ADI

Citrullin Carbamoylphosphat Pi

ADP OTCase Carbamatkinase

Ornithin

ATP

NH3 + CO2 Abbildung 1

Argininedeiminase-Stoffwechselweg (abgewandelt nach ZUNIGA et al., 2002)

Dieser Stoffwechselweg wird unter mikroaerophilen (MERCENIER et al., 1980) bzw. anaeroben Bedingungen (GALIMAND et al., 1991) beschritten und ermöglicht bei Ps. aeruginosa sogar die Differenzierung gegenüber anderen gramnegativen Bakterien (SHERRIS und SHOESMITH, 1959). Die Depletion von Kohlenstoff- und Energiequellen verstärkt die Expression der Gene des ADI-Weges (MERCENIER et al., 1980). Mit Hilfe der Energiegewinnung durch den ADI-Weg ist es dem obligat aeroben Ps. aeruginosa möglich, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen (VANDER WAUVEN et al., 1984).

25

2.13

Zielsetzung der Arbeit

Die Ziele dieser Arbeit gliedern sich in zwei Teile: Zunächst war es erforderlich, ein geeignetes Nachweissystem für einen Phänotyp zu finden, das es ermöglicht, unter S2- und S3-Bedingungen, festzustellen, ob das als Arginindeiminase annotierte Gen in M. tuberculosis und M. bovis exprimiert wird. Hierauf sollten Deletionsmutanten im arcA-Gen bei M. tuberculosis H37Rv und Erdmann, sowie in M. bovis BCG erstellt werden.

26

3

Material und Methoden

3.1

Material

3.1.1

Plasmide, Cosmide und Cosmid-Bibliotheken

• pIW2: Cosmid-Bibliothek aus pYUB412::M.tb.H37Rv, erstellt von Isabell Weber, Genomgröße: 4,4 x 106 Basenpaare, ca. 40.000 bp Insertgröße • pCR1: durch Colony-Blot-Hybridisierung detektiertes arcA-Gen-haltiges Cosmid aus pIW2 • pCR2: durch Colony-Blot-Hybridisierung detektiertes arcA-Gen-haltiges Cosmid aus pIW2 • pCR3: durch Colony-Blot-Hybridisierung detektiertes arcA-Gen-haltiges Cosmid aus pIW2 • pCR4: durch Colony Blot-Hybridisierung detektiertes arcA-Gen-haltiges Cosmid aus pIW2 • pCR5: EcoRV-Fragment aus pCR7 (enthält arcA-Gen) in pMV306kanamycin kloniert • pCR6: wie pCR5, jedoch andere Ausrichtung • pCR7: HpaI-/XmnI-Fragment aus pCR4 (enthält arcA-Gen) in pBSK- kloniert • pCR8: wie pCR7, jedoch andere Ausrichtung • pCR9: XbaI-/AscI-Fragment aus pCR7 deletiert, um unerwünschte EcoRI-Schnittstelle zu entfernen • pCR10: EcoRI-Fragment aus pCR9 in pBSK- kloniert, um ein kleineres Konstrukt für die site-directed-mutagenesis herzustellen. • pCR11: pCR10 nach site-directed-mutagenesis (489 bp mittels PCR deletiert) • pCR12: EcoRI-Fragment aus pCR11 in pCR9 kloniert, dem das entsprechende Fragment fehlt • pCR14: NotI-Fragment aus pCR12 in pMP62 • pCR16: pCR10, kleines NsiI-/SphI-Fragment deletiert, großes Fragment religiert

27

• pCR17: pCR16-EcoRI-Fragment in pCR9 kloniert • pCR19a: EcoRV-/MluI-Fragment aus pCR17 in pMP62 (Konstrukt mit kleinen Flanken) • pCR19b: wie pCR19a, jedoch andere Ausrichtung • pCR20a: BclI-Fragment aus pCR17 in pMP62 (Konstrukt mit großen Flanken) • pCR20b: wie pCR20a, jedoch andere Ausrichtung • pCR21a: MluI-BclI-Fragment aus pCR17 in pMP62 (Konstrukt mit einer kleinen und einer großen Flanke) • pCR21b: wie pCR21a, jedoch andere Ausrichtung • pBSK-: Klonierungsvektor aus der Stammsammlung der AG Bange • pMP62: Klonierungsvektor aus der Stammsammlung der AG Bange • pMV306kan: Klonierungsvektor aus der Stammsammlung der AG Bange

3.1.2

Bakterienstämme

Stamm

Quelle

Mycobacterium smegmatis mc² 155

Labor W.R. Jacobs, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, USA

Mycobacterium bovis BCG

Pasteur Impfstamm, Statens Serum Institut, Kopenhagen, Dänemark

Mycobacterium tuberculosis H37Rv

ATCC 25618

Mycobacterium tuberculosis Erdmann

Labor W.R. Jacobs, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, USA

Escherichia coli, Stamm Ec²191

Firma Stratagene, LaJolla, California, USA

Escherichia coli, Stamm HB101

Firma Promega, Mannheim

Escherichia coli, Stamm DH5α

Labor PD Dr. Gunzer, Medizinische Hochschule Hannover

28

3.1.3

Primer

Alle Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg) synthetisiert. • Arg1: 5´-TAA GAG TGG TCA TCC TGC-3´ und Arg2: 5´-ATA CGC AAC CAC AAC GAC-3´ zur Amplifikation eines arcA-Gen-Stücks, um damit eine Sonde für eine Colony Blot- und folgende Southern Blot-Hybridisierungen zu konstruieren. • ArcA3: 5´-CAC TAC ATC ACA GCA TCG ACA AGC TGC G-3´ und ArcA4: 5´-CGC AGC TTG TCG ATG CTG TGA TGT AGT G-3´, um mittels Sitedirected-mutagenesis ein 720 bp-Fragment aus arcA-Gen in pCR10 zu deletieren. • ArcASeq1: 5´-CGA GGT CGA CGG TAT CG-3´ und ArcASeq2: 5´-GGC CGC TCT AGA ACT AG-3´ zum Sequenzieren des Produktes aus der Site-directed-mutagenesis. • Arg1: s.oben und ArcA7: 5´-ATC GTC GTC TGC TGC TAC-3´ zur Überprüfung auf Rekombination mittels PCR. • ArcASeq3: 5´-CCA ATC TCA CAA CAG AC-3´und ArcA8: 5´-GAT GGT CGA CAC CGA TAC-3´ zur Konstruktion einer Sonde für eine Southern Blot-Hybridisierung zur Prüfung auf homologe Rekombination.

3.1.4

Nährmedien und Zusätze

Weitere, hier nicht genannte Puffer, Lösungen, Nährmedien und Geräte sind im Anhang aufgeführt. Middlebrook 7H9 Medium 4,7 g Middlebrook 7H9 (Difco, über Becton-Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 0713-01-7) werden in 900 ml destilliertem Wasser gelöst und nach Zugabe von 100 ml ADS, 2,5 ml 20 % Tween 80® und 10 ml 50 % Glycerin sterilfiltriert.

29

Middlebrook 7H10 Agar 19 g Middlebrook 7H10 Agar (Difco, Best.-Nr. 0627-17-4) werden in 900 ml destilliertem Wasser gelöst und mit einem Rührfisch autoklaviert. Nach Zugabe von 10 ml Glycerin, 100 ml ADS und der gewünschten Antibiotikumkonzentration wird der mit dem Rührfisch gemischte Nährboden a` 25 ml in Petrischalen gegossen. ADS (Albumin Dextrose Natriumchlorid) 8,1 g NaCl werden mittels Rührfisch in 950 ml destilliertem Wasser gelöst, 22 g D-GlucoseMonohydrat werden zugegeben, komplett gelöst, 50 g Bovine Albumine Fraktion (Boehringer, Best.-Nr. 100021) werden dazugegeben, komplett gelöst und das ADS durch zwei Filtereinsätze für sterile Filtrationseinheiten sterilfiltriert. MB-Medium Zu vorgelegten 840 ml destilliertem Wasser werden 100 ml Basic-salt-Lösung (Zusammensetzung siehe unten, Verzicht auf Ammoniumchlorid beachten!) zugegeben, 2 ml Spurenelementlösung (siehe unten), 50 ml ADS (siehe oben), 4 ml 50 %iges Glycerol, 2,5 ml 20 %ige Tween 80, 0,5 ml 1 M MgCl2 und 0,5 ml 1M CaCl2. Die Bestandteile werden mit dem Rührfisch gemischt und sterilfiltriert. 10 x Basic salt für MB-Medium In 945 ml destilliertem Wasser werden 10 g KH2PO4, 25 g Na2HPO4 und 20 g K2SO4 einzeln zugegeben, mit dem Rührfisch jeweils vollständig gelöst und sterilfiltriert. Auf die Zugabe von 50 ml NH4Cl wurde verzichtet, da dieses die Ammoniakbestimmung im Versuch verfälscht hätte. 500 x Trace elements für MB-Medium 40 mg ZnCl2, 200 mg FeCl3x6H2O, 10 mg CuCl2 x 4H2O, 10 mg MnCl2 x 4H2O, 10 mg Na2B4O7 x 10H2O, 10 mg (NH4)6Mo7O24 x 4H2O werden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst und sterilfiltriert. Der NH4-Gehalt ist hierbei so minimal, dass er bei der Ammoniakmessung in den Versuchen vernachlässigt werden kann.

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LBB (LB-Bouillon) 20 g Lennox-Broth-Base (LBB; über Becton-Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 12780-052) werden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst und autoklaviert.

3.2

Methoden

3.2.1 Anzucht von Bakterien Die Anzucht von Bakterien richtete sich nach dem Erreger, der gewünschten Kulturmenge und dem eventuell erforderlichen Antibiotikumzusatz. Plasmide in E. coli wurden in LBB-Flüssigmedium angezüchtet. Hierzu wurden 5 µl einer aufgetauten Kultur bzw. eine von einer Platte gepickte Kolonie in 5 ml LBB beimpft und mit dem entsprechenden Antibiotikum über Nacht bei 37 °C im Schüttelinkubator inkubiert. Entsprechend wurde mit Mykobakterien in 7H9-Medium verfahren, lediglich die Inkubation war entsprechend verlängert und unter S3-Bedingungen konnten die Flüssigkulturen nicht in Reagenzgläsern angezüchtet werden, sondern wurden in ink-square-bottles inkubiert. Zum Erhalt größerer Flüssigkulturen wurden entsprechende Mengen Medium in Rollerbottles beimpft und bis zur gewünschten OD600 ebenfalls bei 37°C inkubiert.

3.2.2 Herstellung elektrokompetenter Zellen 10 µl E. coli HB 101 wurden über Nacht in 5 ml LBB im Schüttelinkubator bei 37°C bebrütet. Am nächsten Tag wurden 2-5 ml der Übernachtkultur in 500 ml LBB im 1000-ml-Kolben gegeben. Bei 37°C wurde die Kultur im Schüttelinkubator bebrütet, bis die OD600 0,5 betrug. Danach wurden die Zellen 15 min auf Eis gestellt und anschließend in einer vorgekühlten Zentrifuge (Biofuge) 20 min bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit eiskaltem Aqua dest. an. Die Sedimentation erfolgte jedes Mal bei 3000 x g, 4°C, 20 min. Beim dritten Waschschritt wurde das Pellet in 10 %igem Glycerol aufgenommen (ca. 100 ml), wiederholt abzentrifugiert und

31

das Pellet schließlich in 6 ml 10 %igem Glycerol aufgenommen. Die Zellen wurden a’ 300 µl aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei -70°C gelagert.

3.2.3

Transformation in elektrokompetente E. coli

Ein Aliquot der elektrokompetenten Zellen wurde auf Eis aufgetaut. 50 µl kompetente Zellen und 1 µl Plasmid-DNA, bzw. 2 µl glykogengefällter Ligationsansatz wurden auf Eis gemischt und in die vorgekühlten Elektroporationsküvetten überführt. Die Elektroporation erfolgte bei 2,5 kV, 25 µF und 400 Ω mit Hilfe des Biorad Gen Pulsers. Danach wurde der Elektroporationsansatz in

1 ml LBB überführt, bei 37°C eine Stunde lang im

Schüttelinkubator bebrütet und anschließend auf antibiotikahaltigen LBB-Nährböden ausplattiert.

3.2.4

Herstellung CaCl2-kompetenter Zellen

10 µl E. coli DH5α wurden über Nacht in 5 ml LBB im Schüttelinkubator bei 37°C bebrütet. Am nächsten Tag wurde 1 ml der Vorkultur in 100 ml LBB gegeben und im Schüttelinkubator bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,3 inkubiert. Danach wurden die Zellen 15 min auf Eis gestellt und anschließend in einer vorgekühlten Zentrifuge 12 min bei 4°C und 3750 x g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 10 ml eiskaltem 0,1 M CaCl2

x H2O aufgenommen. Es wurde nochmals 12 min bei 4°C, 3750 x g

abzentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch zwei Mal wiederholt. Das Pellet wurde in 10 ml CaCl2 aufgenommen und ruhte 30 min auf Eis. Der dritte Zentrifugationsschritt erfolgte 10 min bei 4°C, 1875 x g. Schließlich wurde das Pellet in 2 ml CaCl2 aufgenommen und mit 1 ml eiskaltem 60 %igem Glycerol gemischt. Diese 3 ml wurden a’ 200 µl aliquotiert, 1 h auf Eis gestellt und dann in flüssigem Stickstoff schockgefrostet. Die Lagerung erfolgte bei -70°C.

32

3.2.5

Transformation in CaCl2-kompetente E.coli

Ein Aliquot der kompetenten Zellen wurde auf Eis aufgetaut. 2 µl DNA (10 µl bei glykogengefällten Ligationsansätzen) wurden in 100 µl kompetenten Zellen 20 min auf Eis gestellt. Dann wurde der Ansatz im Wasserbad 90 sec einem Hitzeimpuls von 42°C ausgesetzt, wiederum 1 min auf Eis gekühlt und 1 h in 1 ml LBB bei 37°C im Schüttelinkubator bebrütet. Anschließend wurde auf antibiotikahaltigem LBB-Nährboden ausplattiert.

3.2.6

Herstellung elektrokompetenter M. bovis BCG und M. tuberculosis

50 ml einer in einer Rollerbottle angezüchteten Kultur mit einer OD600 von 0,8-1,0 wurden 10 min bei 2250 x g bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 ml 10 %igem Glycerol aufgenommen und wiederum 10 min bei 2250 x g/RT abzentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch zweimal wiederholt. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in 5 ml 10 %igem Glycerol aufgenommen und sofort für die Transformation verwendet.

3.2.7 Transformation in elektrokompetente M. bovis BCG und M. tuberculosis 400 µl Bakterien wurden mit 1 µl DNA gemischt und in bei 50°C vorgewärmte Küvetten überführt. Die Küvetten wurden nochmals 1 min 50°C gewärmt, dann wurde sofort die Transformation bei 2,5 kV, 25 µF und 1000 Ω durchgeführt. Der Transformationsansatz wurde in 1 ml 7H9-Medium überführt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach spätestens 24 Stunden wurde auf antibiotikahaltigem 7H10-Nährboden ausplattiert.

33

3.2.8

Präparation von Plasmid-DNA (Plasmid-Mini-Prep modifiziert nach BIRNBOIM und DOLY, 1979)

Der E. coli-Stamm mit dem Plasmid wurde in 5 ml LBB mit dem entsprechenden Antibiotikumzusatz über Nacht bei 37°C im Schüttelinkubator bebrütet. In einem Eppendorfgefäß wurden dann 1,5 ml der Kultur abpipettiert und 5 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 100 µl eisgekühltem Puffer 1 resuspendiert, dann mit 100 µl Puffer 2 durch Schwenken gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 100 µl eisgekühlter Puffer 3 dazupipettiert, der Ansatz geschwenkt und 15 min auf Eis gestellt. Daraufhin wurde der Ansatz 5 min bei 10.000 x g zentrifugiert und der klare Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Es wurden 300 µl Roti-Phenol® dazupipettiert, der Ansatz vorsichtig geschwenkt und 5 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Der plasmidhaltige Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt (die untere Phenolphase wurde verworfen) und mit 800 µl 96 %igem Ethanol 15 min auf Eis gekühlt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt bei 10.000 x g, 5 min, wurde das entstandene Pellet mit 1 ml 70 %igem Ethanol gewaschen und 3 min 10.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit der Pipette abgenommen, das Pellet an der Luft getrocknet und in 30-40 µl autoklaviertem Aqua dest. aufgenommen. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.9

Präparation von genomischer DNA

Der entsprechende Stamm M. bovis BCG oder M. tuberculosis wurde in 10-20 ml 7H9Medium bis zu einer OD600 von ca. 1,0 bei 37°C im Schüttelinkubator bebrütet. Die Bakterien wurden unter S3-Bedingungen (M. tuberculosis H37Rv und Erdmann, gilt nicht für M. bovis BCG im S2-Bereich) 10 min in kochendem Aqua dest. inaktiviert. 10 ml der Kultur wurden in einem 15 ml-Falcon 20 min bei 2250 x g/RT abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml Bug Lysis Solution resuspendiert und in ein 1,5-ml-Eppendorfgefäß überführt. In diesem wurde es 10 min bei 10.000 x g abzentrifugiert. Der Überstand wurde

34

wiederum verworfen und das Pellet in 450 µl Bug Lysis Solution resuspendiert. Es wurden 50 µl einer 10-mg/ml-Lysozymlösung dazupipettiert und der Ansatz über Nacht bei 37°C bebrütet. Am nächsten Tag wurde der Ansatz mit 100 µl 10 %igem SDS vorsichtig gemischt, es wurden 50 µl 10-mg/ml-Proteinase-K-Lösung dazugegeben und 30 min bei 55°C inkubiert. Nach einer Zugabe von 200 µl 5 M NaCl und 160 µl auf 65°C vorgewärmter Cetrimidelösung wurde der Ansatz für 10 min im 65°C-Wasserbad inkubiert. Daraufhin wurden 500 µl Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) dazupipettiert und nach vorsichtigem Schwenken 5 min bei 10.000 x g abzentrifugiert. Der DNA-haltige Überstand wurde mit einer 1000 µlEinwegpipettierhilfe abgenommen und wiederum mit 500 µl Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) versetzt. Nach einem erneuten Zentrifugationsschritt (5 min bei 10.000 x g) wurden 800 µl des gereinigten, DNA-haltigen Überstandes mit 560 µl Isopropanol vorsichtig gemischt und zwei Stunden bei –20°C kaltgestellt, bis die DNA präzipitierte. Dann wurde die DNA 15 min bei 11.250 x g in einer Kühlzentrifuge (4°C) abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 1 ml 70 %igem Ethanol gewaschen. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (5 min 10.000 x g) wurde der Überstand verworfen, das Pellet 15 min an der Luft getrocknet und mit 35 µl Aqua bidest. bedeckt. Bei 4°C wurde das Pellet über Nacht im Aqua bidest. gelöst und konnte am nächsten Tag als gelöste DNA verwendet werden.

3.2.10 Restriktionsspaltung von DNA Um eine Restriktionsspaltung der DNA herbeizuführen, wurden 3-5 µl der aus oben genannten Präparationen gewonnenen DNA mit der vom Hersteller angegebenen Einheitenmenge (units, U) des ausgewählten Enzyms, der entsprechenden Menge Puffer und der nötigen Menge Aqua dest. zu einem Gesamtansatz von 10 µl zusammenpipettiert. Der Restriktionsverdau wurde 1 h bei 37°C (soweit der Hersteller keine andere Inkubation empfiehlt) im Heizblock inkubiert. Für präparative Verfahren und genomische DNA für Southern Blot-Hybridisierungen wurden 5-10 µl DNA eingesetzt und der Verdau wurde über Nacht inkubiert.

35

3.2.11 Agarosegelelektrophorese Zur Agarosegelelektrophorese wurde 1 g Agarose abgewogen, mit 2 ml 50 x TAE-Puffer versetzt, mit 100 ml Aqua dest. aufgekocht und in eine Vorlage gegossen. Nach dem Aushärten wurde das Gel in die Elektrophoresekammer in 1 x TAE-Puffer gelegt. Die DNA wurde mit 10 x DNA-Marker als Ladepuffer versetzt und in die Taschen des Gels pipettiert. Als Größenstandard wurde 1-kb-DNA-Ladder (Firma New England Biolabs, Frankfurt a. M.) mitgeführt. Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte bei 120 V, 270 mA, 60 min aufgrund der Bewegung der negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA von der Kathode zur Anode. Das Gel wurde anschließend im Ethidiumbromidbad für 30 min gefärbt. Hierbei interkaliert das Ethidiumbromid mit der DNA, so dass nach einer 10-minütigen Entfärbung in Aqua dest. die DNA-Banden unter UV-Licht sichtbar wurden.

3.2.12 Aufreinigung von DNA 3.2.12.1

Aufreinigung von DNA aus Agarosegel

Die Aufreinigung erfolgte mit dem DNA Purification kit von Amersham, Buckinghamshire, GB. Die betreffende Bande wurde nach dem Ethidiumbromidbad mit Hilfe eines UV-Tisches aus dem Gel ausgeschnitten und in einem Eppendorfgefäß gewogen. Es wurden höchstens 300 mg pro Aufreinigung verwendet. Zu dem Gelstück wurde 1 µl Capture-Puffer pro 1 mg Gelstück pipettiert und der Ansatz gevortext und anschließend bei 60°C im Heizblock inkubiert, bis die Agarose vollständig in Lösung war. Hierbei wurde die Agarose gelöst und Proteine wurden denaturiert. Dann wurde der Ansatz kurz anzentrifugiert und auf die GFX™Säule pipettiert. Nach 1 min bei Raumtemperatur wurde die Säule 30 sec bei 10.000 x g zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Es wurden 500 µl Wash-Puffer dazupipettiert und 30 sec bei 10.000 x g die Säule gewaschen. Dann wurde die Säule in ein Eppendorfgefäß überführt, 35 µl steriles Aqua dest. auf die Säule pipettiert und nach 1 min bei Raumtemperatur für 1 min bei 10.000 x g abzentrifugiert. Dieser letzte Schritt wurde mit dem DNA-haltigen Durchfluss wiederholt, um das Aufreinigungsergebnis zu verbessern.

36

3.2.12.2

Aufreinigung von DNA aus Lösung

Die Aufreinigung von DNA aus Lösung erfolgte ebenfalls mit dem Amersham Purification kit. Das maximal einzusetzende Volumen betrug hierbei jedoch 100 µl. Der Capture-Puffer (500 µl) wurde auf der Säule vorgelegt und das aufzureinigende Volumen dazupipettiert. Der Ansatz wurde 30 sec bei 10.000 x g zentrifugiert. Das weitere Vorgehen war analog zu der Aufreinigung aus Agarosegel.

3.2.13 Verwendung der T4-Polymerase Für einige Klonierungsschritte war es notwendig, nach dem Restriktionsverdau 5´-3´Überhänge mit Hilfe der T4-Polymerase aufzufüllen („blunten“ des Fragmentes). Zu diesem Zweck wurde die aufgereinigte DNA mittels der Speedvac-Vakuumzentrifuge auf ca. 15 µl eingeengt, mit 2 µl 10 x T4-Polymerase-Puffer, 2 µl 10 x dNTP und 1 µl T4-Polymerase vermischt und 20 min im 11°C-Wasserbad inkubiert. Die Abstoppung der Reaktion erfolgte durch Flüssigaufreinigung.

3.2.14 Verwendung des Klenow-Enzyms Für einige Klonierungsschritte war es notwendig, nach dem Restriktionsverdau 3´-5´Überhänge mit Hilfe des Klenow-Enzyms abzudauen („blunten“). Hierzu wurden 15 µl eingeengtes Aufreinigungsprodukt mit 1 µl 2 mM dNTP, 2 µl Eco-Pol-Puffer, 1 µl KlenowEnzym und 1 µl Aqua dest. vermischt und für 15 min einem 25°C-Wasserbad ausgesetzt. Das Abstoppen der Reaktion erfolgte durch sofortige Flüssigaufreinigung.

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3.2.15 Dephosphorylierung von Vektor-DNA Um Vektorreligationen des Plasmidvektors ohne Integration des Inserts zu vermeiden, wurde der Vektor nach dem enzymatischen Öffnen und eventueller Behandlung mit Klenow oder T4-Polymerase dephosphoryliert. Hierzu wurden 15 µl aufgereinigtes Produkt mit 2 µl Alkalische-Phosphatase-Puffer, 1 µl alkalischer Phosphatase und 2 µl Aqua dest. für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Eine Flüssigaufreinigung schloss sich an.

3.2.16 Bestimmung des DNA-Gehaltes Um ein für die Ligation ideales Vektor-/Insertverhältnis zu erhalten, wurden die ng/µlMengen des Vektors und des Inserts anhand eines Agarosegels mit Hilfe des smart-Ladders abgeschätzt. Hierzu wurden jeweils 5 µl 1 kb-Ladder und 5 µl smart-Ladder (Firma Eurogentec) sowie jeweils 1,5 µl des Vektors und des Inserts auf ein Gel aufgetragen. Anhand des Vergleiches zum smart-Ladder ließ sich der DNA-Gehalt pro µl abschätzen. Eine photometrische Bestimmung war aufgrund der geringen erhaltenen DNA-Mengen nicht möglich.

3.2.17 Ligation Nach der Bestimmung des DNA-Gehaltes wurde die nötige Menge Vektor und Insert wie folgt berechnet: 50 ng Vektor ≅ x µl Faktor F= (Vektorgröße : Insertgröße)

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Insertmenge in ng = (Vektormenge in ng : Faktor F) x 5 wenn Vektor und Insert blunt end sind. Insertmenge in ng = (Vektormenge in ng : Faktor F) x 3 wenn Vektor und Insert sticky end sind. Die Insertmenge ist also auch davon abhängig, ob ein Fragment einen Überhang besitzt (sticky end) oder nicht (blunt end). Die erforderliche Menge Vektor und Insert sowie 2 µl Ligasepuffer, 1 µl Ligase und die erforderliche Menge Aqua dest., um ein Gesamtvolumen von 20 µl zu erreichen, wurden zusammenpipettiert und über Nacht im 15°C-Wasserbad ligiert.

3.2.18 Glykogenfällung Der Ligationsansatz wurde kurz anzentrifugiert. Es wurden 80 µl Aqua dest. und 100 µl RotiPhenol® dazupipettiert und durch Schwenken gemischt. Der Ansatz wurde 5 min bei 10.000 x g zentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Zur Phenolphase wurden wiederum 50 µl Aqua dest. pipettiert, geschwenkt, 5 min bei 10.000 x g zentrifugiert und der Überstand mit dem ersten Überstand vereinigt. Zur Fällung wurden 15 µl 5 M NaCl, 15 µl Aqua dest., 2 µl Glycogen und 540 µl 100 %iges Ethanol dazupipettiert, gemischt und 15 min bei 4°C 10.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde mit 1 ml 70 %igem Ethanol gewaschen, kurz zentrifugiert (10 min, 4°C, 10.000 x g), der Überstand verworfen, getrocknet und in 6 µl Aqua dest. aufgenommen. Zur Transformation wurden 2 µl verwendet.

39

3.2.19 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Mittels PCR ließen sich spezifische DNA-Abschnitte amplifizieren. Hierzu besteht eine PCR aus drei Abschnitten. Zunächst wird die DNA durch die Denaturierung in Einzelstränge zerlegt. Beim Annealing lagern sich die ausgewählten Primer an die DNA an und bei der anschließenden Extension werden die Primer durch die DNA-Polymerase in 5´-3´-Richtung verlängert und erzeugen somit eine Kopie des DNA-Stranges, der somit wieder doppelsträngig wird. Dieser Vorgang wiederholt sich bei jedem neuen Zyklus. Das verwendete Standardprogramm für diesen Vorgang lautete: 1. Denaturieren

95°C

120 sec

1x

2. Annealing

Tm-4°C

100 sec

Extension

72°C

100 sec

Denaturieren

95°C

60 sec

3. Annealing

Tm-4°C

100 sec

1x

4. Final Extension

72°C

420 sec

1x

35 x

Die Annealingtemperatur richtete sich nach den von MWG Biotech bei Lieferung angegebenen Schmelztemperaturen des Primerpaares. Wenn möglich wurden Primerpaare ausgewählt, die einen identischen Schmelzpunkt aufweisen. Da dies nicht immer möglich war, da es bei Mykobakterien die DNA extrem G-/C-haltig ist, wurde für das Annealing eine Temperatur gewählt, die 4°C unter dem Mittel der Primerschmelztemperaturen lag. Der verwendete Standardansatz lautete: Primer 1

1 pM

=

1 µl 100 µM Stammlösung

Primer 2

1 pM

=

1 µl 100 µM Stammlösung

Taq-Polymerase

2,5 U =

0,5 µl 5 U/µl

10 x Puffer

1x

10 µl

dNTP

0,2 mM=

5 µl 4 mM Stammlösung

Template-DNA

10 µl

10 µl einer 1:10, bzw. einer 1:100-Verdünnung

=

=

Aqua dest. ad 100 µl Gesamtansatz (für Techne-PCR ad 50 µl).

40

3.2.20 Site-directed-mutagenesis Bei der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese ist es möglich, spezifische Punktmutationen hinzuzufügen oder einzelne oder mehrere Basenpaare zu deletieren oder zu insertieren. Um ein größeres DNA-Stück zu deletieren wurden Primer entworfen, die zur Hälfte vor und zur Hälfte hinter der zu setzenden Deletion liegen. Die Primer sollten mindestens 10-15 bp korrekte Sequenz auf beiden Seiten der Deletion aufweisen. Sie sollten eine Schmelztemperatur von etwa 10°C über der Extensionstemperatur von 68°C aufweisen, einen Minimum-GC-Gehalt von 40 % haben und in einem oder mehreren G/C-Basenpaaren enden. Im vorliegenden Fall wurden die Primer ArcA3 und ArcA4 (s.oben) ausgewählt. Diese Primer wurden gemäß Mutagenese-PCR-Protokoll der Firma Stratagene in folgendem Ansatz verwendet: 5 µl 10x Pfu Hotstart Polymerase Buffer 5 µl dNTP (2 mM) 1 µl pCR10 (=50 ng) 10 µl Primer ArcA3 (=20 pmol/l), angegebene Schmelztemperatur: 68°C 10 µl Primer ArcA4 (=20 pmol/l), angegebene Schmelztemperatur: 68°C 1 µl Pfu Hotstart DNA Polymerase 18 µl Aqua dest. Dieser Gesamtansatz von 50 µl wurde in einer Techne Touchgene folgendem Programm ausgesetzt: Segment

Zyklen

1

1

2

16

3

1

°C

Minuten

Denaturieren

95°C

1

Denaturieren

95°C

1

Annealing

56°C

1

Extension

68°C

1

final Extension

68°C

10

41

5 µl des PCR-Produktes wurden auf Agarosegel aufgetragen, um das Ergebnis zu kontrollieren. Der PCR-Ansatz wurde mit DpnI verdaut, um selektiv die methylierte Template-DNA zu verdauen. Hierzu wurde der PCR-Ansatz mit 0,5 µl DpnI eine Stunde bei 37°C inkubiert, die Reaktion dann 20 min bei 80°C abgestoppt. 1 µl des DpnI-Verdaus wurde in CaCl2-kompetente E.coli DH5α transformiert. Die DNA der auf entsprechendem antibiotikumhaltigem Nährboden gewachsenen Kolonien wurde durch Restriktionsverdau kontrolliert.

3.2.21 Erstellung der Konstrukte und Mutanten Die Erstellung der Konstrukte und Mutanten ist im Ergebnisteil dargestellt.

3.2.22 Ansatz zur Messung des Ammoniakgehaltes Die gewünschten Bakterien wurden in 7H9/ADS (in Ink-square-bottles (Firma Nalgene) oder wenn möglich in Rollerbottles) bis zu einer OD600 von ca. 1,0 bebrütet (ideal: 50 ml Suspension in einer Rollerbottle). 25 ml der Bakteriensuspension wurden in ein 50-mlFalconröhrchen überführt. Die Suspension wurde 10 min bei 2250 x g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pellets in je 10 ml MB-Medium (+ADS) resuspendiert. 20 ml MB-Medium (+ADS) wurden dazugegeben und wiederum 10 min bei 2250 x g abzentrifugiert.

Dieser Waschschritt wurde noch zweimal wiederholt. Nach dem dritten

Waschschritt wurden beide Pellets in 1/10 der Ausgangssuspension aufgenommen (bei 50 ml also in 5 ml). In 14-ml-Greinerröhrchen (für aeroben Ansatz ink-square-bottles) wurden 12 ml MB-Medium + ADS vorgelegt und mit der gewaschenen Suspension wurde die gewünschte OD600 eingestellt. Dann wurde die entsprechende Menge Argininstammlösung oder entsprechender anderer Zusatz dazugegeben. Entsprechend wurden die Leerwerte präpariert. Die Ansätze wurden aerob im Brutschrank, bzw. anaerob im Anaerobiertopf im Brutschrank inkubiert.

42

3.2.23 Ammoniakmessung (Roche Ammoniak-Test) Die Durchführung des Boehringer Ammoniak-Tests erfolgte laut Anweisung des Herstellers. In je einem Reagenzglas wurde 1 ml TRA buffer/2-Oxoglutarate vorgelegt. Nach Erreichen der Raumtemperatur wurde diese mit einer NADH-Tablette versetzt und gemischt bis zur vollständigen Lösung der Tablette. Das Probevolumen (0,1-2 ml, je nach geschätztem Ammoniakgehalt) wurde dazupipettiert und der Gesamtansatz auf 3 ml mit Aqua dest. aufgefüllt. Nach 5 min Inkubation wurde 1 ml dieses Ansatzes bei 340 nm im Photometer gemessen. Dieser 1 ml wurde dem Ansatz wieder zugegeben und 20 µl GldH-Solution dazupipettiert. Der Ansatz wurde mindestens 40 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurde erneut die Extinktion bei 340 nm bestimmt. Aus dem bereinigten Extinktionskoeffizienten (Extinktion der Probe – Extinktion des mitgeführten Leerwertes) ließ sich der Ammoniakgehalt berechnen: 17,03 x bereinigter Extinktionskoeffizient =

Ammoniakgehalt in g/l

2100 x Probevolumen in ml

3.2.24 Colony Blot- und Southern Blot-Hybridisierung Zur Detektion von Cosmiden im Colony Blot und definierten DNA-Fragmenten im Southern Blot wurden DNA-Stücke mittels PCR zur Erstellung einer Sonde amplifiziert. Diese Amplifikate wurden mittels Dig-DNA-labeling-kit (Firma Roche, Mannheim) mit Dioxigenin nicht-radioaktiv markiert. Hierzu wurden 50-100 ng DNA/ 15 µl Aqua dest. (bei Bedarf nach Speedvaceinengung) vorgelegt und 10 min im Wasserbad abgekocht, um die DNA in Einzelstränge zu zerlegen. Nach sofortiger Abkühlung auf Eis wurden entsprechend dem Kit 2 µl Nr. 5 (10 x Hexanukleotidgemisch), 2 µl Nr. 6 (dNTP-Markierungsgemisch) und 1 µl Nr. 7 (2 U/µl Klenow-Enzym) dazupipettiert. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht wurde die Reaktion am nächsten Tag durch Zugabe von 2 µl eisgekühlter 0,2 M EDTA (pH 8,0), 2,5 µl 4 M LiCl und 75 µl 100 % Ethanol auf Eis abgestoppt. Nach einer Fällung bei -70°C (1 h)

43

schloss sich ein Zentrifugatiosschritt von 15 min bei 10.000 x g an. Das Pellet wurde in 500 µl eisgekühlten 70 %igem Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen in 50 µl TE-Puffer aufgenommen. Die Lagerung erfolgte bei -20°C. Vor jeder Nutzung der wiederverwendbaren Sonde wurde diese durch 10-minütiges Abkochen denaturiert. Die Sonde wurde in Verdünnungsstufen parallel zu den Kit-Verdünnungsstufen der Kontrollösung auf HybondMembran

aufgetragen

und

nach

UV-Crosslinking

wurden

die

Schritte

der

Chemilumineszenzdetektion durchgeführt. Anhand des Vergleiches mit der Kontrolle ließ sich die benötigte Menge Sonde abschätzen. Gab die Sonde ein der Kontrollösung vergleichbares Signal, wurden 10 µl/ 10 ml Hybridisierungslösung eingesetzt. Für die Colony Blot-Hybridisierung wurden je 100 µl einer 10-8-Verdünnung einer Cosmidbibliothek von M. tuberculosis auf 26 7H10-Platten mit entsprechendem Antibiotikumzusatz ausplattiert und bei 37°C inkubiert. Nach der Ausbildung deutlicher Kolonien (ca. 2 Tage) wurden die Platten eine Stunde im Kühlschrank (4°C) gekühlt. Hierauf wurden Hybond-Nylonmembranen auf die Platten zugeschnitten, nummeriert, aufgelegt und nach Lage markiert. Die Filter wurden vorsichtig wieder abgezogen und je 1 µl genomische DNA von M. tuberculosis wurde pro Membran als Positivkontrolle aufgetupft. Die Platten wurden weiterhin bei 37°C bebrütet, um genügend große Kolonien zu erhalten, die zum Anlegen einer Subkultur geeignet waren. Die Filter wurden mit der Kolonieseite nach oben 15 min in DNA-I inkubiert, 5 min in DNA-II neutralisiert und 20 min mit 2 x Sodiumchloride/Natriumchloride (SSC) behandelt. Diese Befeuchtung mit der entsprechenden Lösung fand auf einem 2-lagigen Stapel WhatmanPapier (durchfeuchtet mit der entsprechenden Lösung) statt. Die DNA der Kolonien wurde dann 30 min bei 120°C im Ofen auf den Membranen festgebacken. Verbleibende Zellreste wurden mit 2 x SSC-getränktem Zellstoff entfernt, um eine unerwünschte Hintergrundbildung zu vermeiden. Die Membranen wurden nun 2 h mit 2 x SSC/ 0,1 % SDS im Hybridisierungsofen bei 65°C gewaschen. Es schloss sich eine einstündige Hybridisierung im 20 ml Hybridisierungspuffer/ 100 cm2 Filterfläche bei 65°C an, um den Hintergrund zu minimieren.

Die

Hybridisierungslösung

wurde

verworfen

und

mit

2,5

ml

2

Hybridisierungslösung/ 100 cm + 5-8 µl Dig-DNA-Sonde (denaturiert) erfolgte über Nacht bei 65°C die Hybridisierung. Am nächsten Tag wurden die Membranen 2 x 30 min in Wash-I und 2 x 30 min in Wash-II bei 65 °C gewaschen. Bei der anschließenden Chemilumineszenzdetektion wurde durch eine 2-Stufen-Detektion durch Antikörperkonjugat

44

und dem Chemilumineszenzsubstrat CSPD eine Hybridisierung nachgewiesen. CSPD wird unter alkalischen Bedingungen zu einem instabilen Zwischenprodukt dephosphoryliert, das unter Lichtemission zu einem stabilen Endprodukt zerfällt. Hierzu wurden die Membranen 5 min in Waschpuffer gewaschen, 30 min in 100 ml/ 100 cm2 Puffer 2 behandelt und 30 min in 50 ml/ 100 cm2 Puffer 2 mit 5 µl Anti-Dig-AP (= 1:10.000 Anti-Dig-AP) inkubiert. Nach drei Waschschritten in je 50 ml Waschpuffer/ 100 cm2 Membran wurden die Membranen 5 min in je 20 ml Puffer 3 äquilibriert. Dann wurden sie in einer Schale in 1:100 in Puffer 3 verdünntes CSPD gelegt und 5 min im Dunkeln inkubiert. Überschüssiges CSPD wurde daraufhin abgenommen, die Membranen in handelsübliche Klarsichtfolie eingeschweißt und 15 min bei 37°C inkubiert. Hierauf wurden die eingeschweißten Membranen auf einen Röntgenfilm aufgelegt. Nach 20 min- 36 h Exposition wurden die Röntgenfilme entwickelt und die positiven Kolonien anhand ihrer Markierung zurückverfolgt und die entsprechenden Kolonien subkultiviert. Bei der Southern Blot-Hybridisierung wurden 5 µl der zu untersuchenden DNA und 3 µl eines Kontrollvektors (oder genomischer DNA) mit Restriktionsendonukleasen geschnitten (für den vollständigen Verdau genomischer DNA wurde die üblicherweise einstündige Inkubation über Nacht durchgeführt). Am nächsten Tag wurde die DNA mit einem Größenmarker auf ein 1 %iges Agarosegel aufgetragen und bei 120 V, 270 mA ca. 50 min nach Größe aufgetrennt. Das Gel wurde nach einem Ethidiumbromidbad mit einem UVLineal fotografiert und die cm-Angaben des Lineals wurden als Markierungen auf das Gel übertragen. Dann wurde das Gel 2 x 30 min in Denaturierungspuffer DNA-I und 2 x 30 min in Neutralisationspuffer DNA-II gewaschen. Der Transfer auf die Nylonmembran fand über Nacht statt. Hierzu wurde ein umgedrehter Gelschlitten in 20 x SSC gestellt, das Gel umgedreht (Geltaschen nach unten) daraufgelegt, darauf eine zugeschnittene Nylonmembran, zwei

zugeschnittene

Schichten

Whatman-Papier

und

ca.

15

cm

zugeschnittener

Zellstoffstapel. Der Aufbau wurde mit einem 1 l-Gefäß, das zur Hälfte mit Flüssigkeit gefüllt war, beschwert. Am nächsten Tag wurden die Markierungen des Gels auf die Membran übertragen und der Transfer im UV-Licht auf Vollständigkeit überprüft. Wenn auf dem Gel keine DNA-Spuren mehr vorhanden waren, wurde die DNA auf der Membran durch UVCrosslinking

fixiert

und

entsprechend

dem

Colony

Blot-Hybridisierungsverfahren

prähybridisiert, hybridisiert, gewaschen, und auf dem Röntgenfilm dokumentiert. Anhand der Markierung ließ sich die Größe von blotpositiven Fragmenten bestimmen.

45

4

Ergebnisse

Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Abbaus von Arginin unter anaeroben Bedingungen. Bei der Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis wurde ein Gen mit Homologie (39,4 %) zur Arginindeiminase (arcA) von Ps. aeruginosa gefunden (COLE et al. 1998). Das Enzym vermittelt die anaerobe Desaminierung von Arginin, die zur Akkumulation von Ammoniak führt. Dieses Gen kodiert für das erste Enzym eines Gen-Clusters mit vier Enzymen (arcABCD), die es Ps. aeruginosa ermöglichen, unter anaeroben Bedingungen mit Argininzusatz zu wachsen (VANDER WAUVEN und PIERARD, 1984). Hierbei wird aus 1 mol Arginin 1 mol ATP generiert. Es stellte sich demnach die Frage, ob auch M. tuberculosis und M. bovis BCG ein entsprechendes Gen-Cluster besitzen, um diesen Stoffwechselweg zu nutzen. Eine Überprüfung der Homologie zu den arcABC-Genen von Ps. aeruginosa bestätigte die Homologie zum arcA-Gen. Weitere Homologien zum ADI-Weg-Cluster konnten nicht gefunden werden. Um festzustellen, ob arcA bei M. tuberculosis und M. bovis BCG Arginin zu Citrullin verstoffwechselt, wurde angenommen, dass die gebildete Menge Ammoniak abhängig von der verstoffwechselten Menge Arginin ist. Um die Funktion des arcA-Gens bei M. tuberculosis und M. bovis BCG zu untersuchen, wurde zunächst der Ammoniaknachweis aus Mykobakterienkulturen etabliert.

46

4.1 Etablierung des Ammoniaktest Hierzu wurde ein System der Firma Roche, das Ammoniak mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion nachweist, verwendet. Das System beruht auf der enzymatischen Reaktion von 2Oxoglutarat zu L-Glutamat in Anwesenheit von Ammoniak (NH4), wobei die gleichzeitige Oxidation von NADH zu NAD+ photometrisch bestimmt wird. Die Reaktionsgleichung lautet: GldH

2-Oxoglutarat + NADH + NH4+

Abbildung 2

L-Glutamat + NAD+ + H2O

Reaktionsgleichung des Roche Ammoniak Test

Anhand des Extinktionskoeffizienten von NADH bei 340 nm läßt sich mittels einer Formel der Ammoniakgehalt berechnen. Die Ammoniakbestimmungen sollten in Minimalnährmedium (MB-Medium) mit Arginin und ADS-Zusatz durchgeführt werden. Daher wurden zunächst verschiedene Konzentrationen von Ammoniak in verändertem MB-Medium (ohne NH4Cl-Zusatz in den Grundsalzen) bestimmt. Es wurde mit dem von Boehringer bei unbekannter Ammoniakkonzentration empfohlenen Probevolumen von 1 ml begonnen. Die Ammoniakkonzentration einer Verdünnungsreihe wurde gegen die gemessene Extinktionsdifferenz aufgetragen, um den linearen Bereich abzuschätzen. In Abbildung 3 ist der gemessene Extinktionskoeffizient bei einem Probevolumen von 1 ml im Verhältnis zu einer Ammoniakverdünnungsreihe aufgetragen.

47

1,4

Extinktionsdifferenz

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

vorgegebene Menge Ammoniak in MB-Medium in µmol/l

Abbildung 3

Linearität der Ammoniakmessung bei v = 1 ml

Bei dieser ersten Messung mit einem Probevolumen von 1 ml zeigte sich, dass der Test in einem Bereich zwischen 100 µM und 1 mM linear ist, obwohl die Messung nicht in klarem Medium durchgeführt wurde. Die Trübung des MB-Medium beeinflußt den Test nicht signifikant, da der Extinktionskoeffizient des mitgeführten Leerwertes (MB-Medium) abgezogen wird. Da laut Boehringer der lineare Bereich bis ∆E = 1,0 verwertbar ist, kann somit mit einem Probevolumen von 1 ml ein Bereich von 100 µM bis ca. 750 µM Ammoniak gemessen werden.

48

Um

Werte

außerhalb

dieses

Bereiches

messen

zu

können,

wurde

bei

einer

Ammoniakkonzentration oberhalb von 750 µM das Probenvolumen reduziert (minimal: 0,1 ml), bzw. unterhalb von 100 µM das Probevolumen erhöht. Das maximale Probevolumen beträgt 2 ml, wodurch sich eine Sensitivität von ca. 30 µM ergab. Das heißt, dass mit einem Probevolumen von 2 ml Ammoniakkonzentrationen ab ca. 30 µM erfasst werden konnten. Der lineare Bereich lag bei einem Probevolumen von 2 ml etwa zwischen 30 µM und 300 µM. Da auch hier ∆E-Werte über 1,0 nicht verwertet werden konnten, konnten mit einem Probevolumen von 2 ml Ammoniakgehalte von 30 µM bis 250 µM detektiert werden (s. Abbildung 4).

1,4

Extinktionsdifferenz

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0

200

400

600

800

1000

vorgegeben Menge Ammoniak in MB-Medium in µmol/l

Abbildung 4

Linearität der Ammoniakmessung bei v = 2 ml

1200

49

Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen genügte der Nachweis einer maximalen Konzentration von 30 mM. Die Messung einer solchen Konzentration im linearen Bereich wurde durch eine 1:10Verdünnung der Probe erreicht (das minimale Probevolumen v = 0,1 ml wurde als 1:10Verdünnung verwendet). Es wurden also 100 µl der zu bestimmenden Flüssigkeit 1:10 in MB-Medium

verdünnt

und

100

µl

der

Verdünnung

im

Test

verwendet.

Der

Verdünnungsfaktor ging in die Formel zur Berechnung des Ammoniakgehaltes ein (s. Abbildung 5).

0,8 0,7

Extinktionsdifferenz

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

vorgegebene Menge Ammoniak in MB-Medium in µmol/l Abbildung 5

Linearität der Ammoniakmessung bei v = 0,1 ml (1:10)

Diese Versuche zeigen, dass dieses enzymatische Testsystem in MB-Medium, das neben Albumin und Glycerol auch das Detergens Tween enthält, Ammoniak in einem Bereich

50

zwischen 3 µM und 30 mM nachweisen kann. Wie weit die Linearität bei einer weiteren Verdünnung der Probe reicht, wurde nicht ausgetestet, da für die gewünschten Untersuchungen eine Detektion einer Ammoniakkonzentration von 30 mM ausreichend war. Theoretisch wäre aufgrund der vorliegenden Tests, sofern man den Verdünnungsfehler berücksichtigt, in MB-Medium eine unendliche Verdünnung möglich. Der Beginn des linearen Meßbereichs liegt bei diesem Probevolumen bei ca. 5 mM. Das nicht ausgetestete Ende des linearen Bereiches (∆E = 1,0) läge rechnerisch bei 45 mM. Im nächsten Experiment (s. Abbildung 6) wurde die anaerobe Desaminierung von Arginin und 17 weiteren Aminosäuren durch M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen verglichen. Hierbei sollte festgestellt werden, ob alle Aminosäuren eine ähnliche Ammoniakakkumulation verursachen.

51

7000

Ammoniakgehalt in µmol/l

6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

0

10

20

30

40

50

60

Tag Arginin Alanin Asparagin Aspartat Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Threonin Valin Negativkontrolle MB+10mMArginin

Abbildung 6 Ammoniakbildung unter anaeroben Bedingungen von M. bovis BCG (OD600:0,25) mit 10 mM Aminosäuren-Zusatz

52

Nach 30 Tagen war in den Kulturen mit Arginin, Asparagin, Glutamin, Aspartat und Leucin Ammoniak akkumuliert worden. Lediglich aus Arginin schien kontinuierlich Ammoniak gebildet zu werden. Bei den anderen Aminosäuren beobachtete man zunächst einen steilen Anstieg, gefolgt von einem Plateau. Dieses Plateau lag in den Kulturen mit Glutamin und Asparagin zwischen 5 mM und 6 mM. Bei Leucin und Aspartat war es mit 2 mM deutlich niedriger. Aus den anderen Ansätzen mit Aminosäuren war weniger oder keine Ammoniakbildung zu messen. Dieser Testansatz wurde mit verschiedenen Aminosäuren unter anaeroben und unter aeroben Bedingungen untersucht, um festzustellen, ob sich die Ammoniakbildung unter aeroben und unter anaeroben Bedingungen grundsätzlich unterscheidet

(s.

Abbildung

7

und

8).

Aufgrund

zu

erwartender

höherer

Ammoniakakkumulation (und somit kürzerer Versuchsansätze) wurde hierbei eine OD600 von 0,5 gewählt.

12000

Ammoniakgehalt in µmol/l

10000

BCG ohne AS Arginin Asparagin Glutamin

8000

6000

4000

2000

0

0

10

20

30

Tag Abbildung 7 Ammoniakbildung aus ausgewählten Aminosäuren durch M. bovis BCG, anaerobe Bebrütung, OD 600: 0,5; 10 mM Aminosäurenzusatz

40

53

14000 BCG ohne AS Arginin Asparagin Glutamin

Ammoniakgehalt in µmol/l

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

0

10

20

30

40

Tag Abbildung 8

Ammoniakbildung aus ausgewählten Aminosäuren durch M. bovis BCG, aerobe

Bebrütung, OD 600: 0,5; 10 mM Aminosäurenzusatz

Die bisher gezeigten Experimente sollten lediglich eine grobe Orientierung über die Desaminierung verschiedener Aminosäuren durch Mycobacterium bovis BCG liefern. Wegen der langen Dauer und des relativ großen Materialaufwandes wurde auf eine Wiederholung zu statistischen Zwecken verzichtet. Stattdessen wurden die Ansätze im weiteren Verlauf dieser Arbeit ausschließlich auf aerobe und anaerobe Desaminierung von Arginin beschränkt. Darüber hinaus wurde neben dem Impfstamm M. bovis BCG nun auch der Erreger der Tuberkulose, M. tuberculosis, miteinbezogen.

54

Die folgenden beiden Experimente zeigen die anaerobe und aerobe Desaminierung von LArginin durch M. bovis BCG und M. tuberculosis im direkten Vergleich (s. Abbildung 9 und 10). Die Wildtypen von M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis Erdman und M. bovis BCG unterscheiden sich nicht nennenswert in der Ammoniakbildung. Auch ein wesentlicher Unterschied zwischen aeroben und anaeroben Bedingungen ist nicht belegbar.

3000

Ammoniakgehalt in µmol/l

2500

H37Rv Erdmann BCG Negativkontrolle

2000 1500 1000 500 0 -500 0

5

10

15

20

Tag Abbildung 9 gemessene Ammoniakbildung der Wildtypen mit Standardabweichung, anaerobe Bebrütung, OD 600: 0,5; 10 mM Argininzusatz

25

55

2000 1800 H37Rv Erdmann BCG Negativkontrolle

Ammoniakgehalt in µmol/l

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0

5

10

15

20

25

Tag Abbildung 10 gemessene Ammoniakbildung der Wildtypen mit Standardabweichung, aerobe Bebrütung, OD 600: 0,5; 10 mM Argininzusatz

Da diese Versuchsansätze keinerlei Unterschiede in Bezug auf die Negativkontrollen und keine

Verfälschungen

der

Testergebnisse

zeigen,

bestand

somit

ein

geeigneter

Funktionsnachweis, um zu testen, ob eine Deletionsmutante im Bereich des arcA-Gens einen Einfluss auf die Ammoniakbildung aus Arginin besitzt. Daraufhin wurde eine Deletionsmutante erstellt.

56

4.2

Erstellung von Deletionsmutanten

4.2.1 Erstellung einer Gensonde: Mit Hilfe der bekannten Gen-Sequenz von M. tuberculosis H37Rv war es möglich, zwei Primer zu generieren (Primer Arg1 und Primer Arg2), anhand derer ein 391 bp großes Amplifikat aus dem arcA-Gen hergestellt wurde. Als template diente genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv. Die Lage des als Sonde verwendeten Amplifikates ist in der folgenden Abbildung dargestellt.

Sph I 340

0

1

Sph I 1379 Not I 1467 Sph I 2213

2

Rv0999 Rv1000

Sph I 3843

3 arcA

4

Not I 4869

5 kb

Rv1002c

Sonde1

Abbildung 11 Lage der Sonde im Genbereich und der für die folgenden Southern BlotHybridisierungen verwendeten Enzyme

Die PCR wurde nach dem allgemeinen PCR-Programm mit einer Annealingtemperatur von 50°C und 52°C in einem PCR-Cycler der Marke Techne Touchgene durchgeführt. Je 5 µl des PCR-Produktes wurden auf einem Agarosegel kontrolliert, auf beiden Seiten wurden je 5 µl 1-kb-DNA-Ladder zur Größenkontrolle mitgeführt. Hierbei zeigte sich, dass bei einer Annealingtemperatur von 50°C unerwünschte Bereiche amplifiziert wurden (entsprechend den Banden, die größer oder kleiner als 391 bp sind). Dies zeigt die Abhängigkeit eines Amplifikates von der entsprechenden Primerschmelztemperatur,

57

bzw. der gewählten Annealingtemperatur. In diesem Fall konnte das Produkt der 52°CAnnealing-PCR ohne weitere Aufreinigung verwendet werden, da es keine unerwünschten Amplifikate in nennenswerter Menge (da nicht auf dem Gel sichtbar) enthält. 50°C

52°C

1 kb

0,5 kb

Abbildung 12

Agarosegel der PCR-Produkte zur Sondenerstellung

Das Amplifikat der PCR, die mit einer Annealingtemperatur von 52°C durchgeführt wurde, wurde mittels DNA-Labeling-kit mit Digoxigenin markiert.

4.2.2

Colony Blot-Hybridisierung einer Cosmidbibliothek von M. tuberculosis H37Rv zum Auffinden des arcA-Gens

Mit der erhaltenen Sonde wurden Cosmide einer Genombibliothek (pIW2) nach homologen Sequenzen durchsucht. Hierzu wurde eine Cosmidbibliothek von M. tuberculosis (H37Rv aus pYUB412, Genomgröße: 4,4 x 106 Basenpaare, ca. 40.000 bp Insertgröße) mit etwa 200 Kolonien pro Platte ausplattiert, auf Nylonmembranen übertragen und im Colony-Blot auf

58

homologe Sequenzen mit der generierten Sonde untersucht. Exemplarisch sind hier die Blotmembranen Nr. 2 und Nr. 5 dargestellt:

Abbildung 13 Colony Blot-Hybridisierungsmembranen (exemplarisch Nr. 2 und Nr. 5) mit nummerierten, im Colony Blot signalgebenden Kolonien, die weiter untersucht wurden. Als Kontrolle (+) diente genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv

4.2.3 Southern Blot-Hybridisierung zur Bestätigung der Cosmide Zwanzig signalgebende Kolonien wurden in der Southern Blot-Hybridisierung weiter untersucht. Hierzu wurde anhand der Markierung auf den Membranen zurückverfolgt, um welche Klone es sich auf den Platten handelte. Diese wurden dann subkultiviert, die Cosmid-DNA präpariert und mit Restriktionsendonukleasen geschnitten.

59

In der ersten Southern Blot-Hybridisierung wurde das Enzym NotI verwendet, das ein 3402 bp großes Fragment, in dem das arcA-Gen vorliegt, herausschneidet. Dieses Fragment wird von der Sonde 1 kenntlich gemacht. Liegt in dem Cosmid kein arcA-Gen vor, bindet die Sonde nicht und auf dem Röntgenfilm ist kein Signal zu erkennen. Die folgende Abbildung zeigt, dass das erhaltene NotI-Fragment (3402 bp) in fünf Fällen eine Bindung mit der oben genannten Sonde einging. Zur Lage des NotI-Fragmentes s. Abb. unten g

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

g

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Abbildung 14 Southern Blot-Hybridisierung der Cosmide (NotI). Zusätzlich zu den zu untersuchenden Cosmiden wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) zur Kontrolle mitgeführt.

Hierbei zeigt sich die Notwendigkeit der Southern Blot-Hybridisierung. 15 der 20 in der Colony Blot-Hybridisierung detektierten Cosmide waren falsch positiv, gaben also auf dem Colony Blot-Röntgenfilm ein Signal, obwohl aufgrund fehlender Homologie keine Bindung mit der Sonde eingegangen worden sein kann. Die Ursache dieser Fehlbindung ist unbekannt. Vier dieser fünf Cosmide (Nr. 1, 5, 16, 17 und 19) wurden in einer weiteren Southern BlotHybridisierung (HpaI-/XmnI-Verdau) verifiziert. Das fünfte Cosmid (Nummer 19) erwies sich als unvollständig. Im SphI-Verdau konnte gezeigt werden, dass Nummer 19 unvollständig war. Demzufolge konnte dieses Cosmid nicht verwendet werden.

60

Die folgende Abbildung zeigt die entsprechenden Enzymschnittstellen. Abgebildet ist das HpaI-/XmnI-Fragment (7308 bp):

Sph I 2379 Not I 2467 Sph I 3213

0

2

Sph I 4843 Not I 5869

4

Rv0999Rv1000 arcA

6 kb

Rv1002c

Sonde1

Abbildung 15

Lage der Enzymschnittstellen für die Southern Blot-Hybridisierungen

Die erwarteten Fragmente hatten folgende Größen: HpaI/XmnI NotI SphI

7.308 bp 3.402 bp 834 und 1.630 bp

SphI-Verdau verursacht zwei Fragmente (834 und 1.630 bp), da das Enzym eine Schnittstelle im Sondenbereich hat. Nachfolgend abgebildet (Abbildung 16) ist der HpaI-/XmnI-Verdau der Cosmide. Hierbei zeigt sich, dass Nr. 19 zwar ein Signal gibt, also an der Sonde bindet, jedoch nicht die erwartete Fragmentgröße von 7.308 bp aufweist.

61

g

HpaI-/XmnI-Verdau 1 5 16 17

19

7 kb

Abbildung 16 Southern Blot-Hybridisierung der in der Colony Blot-Hybridisierung signalgebenden Cosmide (HpaI-/XmnI). Als Kontrolle wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) mitgeführt.

Das Cosmid Nr. 19 bindet nicht im erwünschten Fragment. Dies bedeutet, dass zwar Homologien zur Sonde vorhanden sind, jedoch nicht das vollständige HpaI-/XmnI-Fragment. Es ist somit möglich, dass das Cosmid auch im Bereich des arcA-Gens unvollständig ist. Da das HpaI-/XmnI-Fragment relativ groß ist (7.308 bp) wurde Cosmid Nr. 19 auch in den weiteren Southern Blot-Hybridisierungen mitgeführt. Die Cosmide wurden in NotI und SphISouthern Blot-Hybridisierungen verifiziert. Auf dem nachfolgend abgebildeten Röntgenfilm (Abbildung 17) sind beide Southern Blot-Hybridisierungen dargestellt: NotI-Verdau g

1

5

16 17 19

SphI-Verdau g

1

5

16 17 19

3 kb 1,6 kb 1 kb 0,5 kb

Abbildung 17 Southern Blot-Hybridisierung der Cosmide (NotI und SphI). Als Kontrolle diente genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g).

62

In den NotI-verdauten Genomen, die mittels Southern Blot-Hybridisierung untersucht wurden, war diesmal kein Signal des Cosmids Nr. 19 erkennbar. In der SphI-verdauten Southern Blot-Hybridisierung war das signalgebende Fragment ca. 1.200 bp groß. Da keines der erwarteten Fragmente für SphI diese Größe aufwies, war immer noch unklar, in welchem Bereich das Cosmid unvollständig ist. Cosmid Nr. 19 wurde deshalb verworfen.

4.2.4 Isolierung des arcA-Gens Aus dem Cosmid Nummer 17 (entspricht pCR4) wurde das HpaI-/XmnI-Fragment (7.308 bp) in einen Bluescript-Vektor (pBSK-) subkloniert (pCR7). Dieses Konstrukt wurde aus praktischen Gründen modifiziert (s. Methodenteil) und mit dem entstandenen Konstrukt pCR10 wurde eine Site-directed-mutagenesis durchgeführt, in deren Rahmen 489 bp aus dem arcA-Gen deletiert wurden.

4.2.5 Deletion mittels Site-directed-mutagenesis Mittels

oligonukleotidgerichteter

Site-directed-mutagenesis

können

Punktmutationen

vorgenommen und einzelne oder mehrere Basenpaare entfernt oder verändert werden. Mit diesem Ansatz sollte festgestellt werden, ob es möglich ist, auch größere Mengen Basenpaare (um 500 bp) zu deletieren. Hierzu wurden zunächst die Primer generiert. Diese sollten grundsätzlich zwischen 25-45 bp lang sein, 40 % G/C-Gehalt haben, in einer oder mehr G/CPaaren enden und eine Schmelztemperatur haben, die ca. 10°C über der Extensionstemperatur von 68°C liegt. Die gewünschte Deletion sollte sich jeweils in der Mitte der Primer befinden, flankiert von 10-15 mit dem Ausgangskonstrukt (template) übereinstimmenden Basenpaaren. Mit den so konstruierten Primern ArcA5 und ArcA6 (Schmelztemperatur laut MWG Biotech: 62°C) wurde das Ausgangskonstrukt pCR10 (template) einer PCR ausgesetzt. Das Plasmid pCR10 enthält kein vollständiges arcA-Gen. Es handelt sich hierbei um ein Arbeitsplasmid. Eine Verkleinerung des Ursprungsplasmids war nötig, da dieses über 10.000

63

bp groß war. Ein Plasmid dieser Größe ist schwierig in der PCR zu amplifizieren, da die Extensionszeit relativ lang gewählt werden muss. Das Programm der PCR orientierte sich an den Vorgaben von Stratagene (Quick-change-sitedirected-mutagenesis-Anleitung von Stratagene) 1. Denaturieren

95°C

30 sec

1x

2. Denaturieren

95°C

30 sec

Annealing

55°C

60 sec

Extension

68°C

2 min/kb Plasmidgröße

12-18x

Eine Schwierigkeit stellte hierbei die Anzahl der Zyklen dar. Eine Zyklenzahl zwischen 12 und 18 Zyklen wird von Stratagene vorgeschlagen. Grundsätzlich sollten mehr Zyklen gewählt werden, je größer die gewünschte Deletion ist. Bei einer höheren Zyklenzahl erhöht sich jedoch auch die Wahrscheinlichkeit von Amplifikationsfehlern. Das ausgewählte Programm, mit dem es schließlich gelang, das Plasmid zu amplifizieren lautete:

1. Denaturieren

95°C

30 sec

2. Denaturieren

95°C

60 sec

Annealing

56°C

60 sec

Extension

68°C

300 sec

68°C

300 sec

3. Final Extension

1x 16x 1x

Das Produkt der PCR wurde mit dem Restriktionsenzym DpnI behandelt. Dieses Enzym schneidet die methylierte Ausgangs-DNA, so dass lediglich das PCR-Produkt ohne TemplateDNA übrigbleibt. 5 µl dieses Verdaus wurden mittels Agarosegelelektrophorese kontrolliert.

64

Das Ausgangskonstrukt war hierbei 4.568 bp, das Amplifikat mit der gewünschten Deletion 4.079 bp groß, wie in Abbildung 18 dargestellt.

F1(-) Ampicillin

pCR10 ColE1 origin

4568 bp 'arcA

lacZ

PCR

F1(-) Ampicillin '+1

pCR11 4079 bp arcA

ColE1 origin lacZ

Abbildung 18

Clonemanager-Programm-Darstellung der Site-directed-mutagenesis

65

Es war nicht klar, ob ein solches Amplifikat auf dem Gel sichtbar ist. Deshalb wurde jedes Amplifikat zunächst DpnI verdaut und in CaCl2-kompetente E. coli DH5∝ transformiert, auf antibiotikumhaltigem Nährboden ausplattiert und die gewachsenen Kolonien präpariert. Es stellte sich heraus, dass bei gelungener Site-directed-mutagenesis eine deutliche Bande auf dem gezeigten Agarosegel zu erkennen war. L

1:10 1:100 -

L

3 kb 5 kb

Abbildung 19 Amplifikate der mit 1:10 und 1:100 verdünnter Ausgangs-DNA durchgeführter Sitedirected-mutagenesis. Als Größenmarker wurde 1-kb-DNA-Ladder (L) mitgeführt, als Negativkontrolle diente Aqua dest.

Mit dem oben genannten PCR-Programm gelang es, die Site-directed-mutagenesis durchzuführen und das PCR-Amplifikat in die kompetenten Zellen zu transformieren. Im Probeverdau mittels EcoRI wurde kontrolliert, ob die Kolonie das veränderte Plasmid enthält. Im Probeverdau zeigte das Konstrukt die erwarteten Banden. Das EcoRI-Fragment (1.121 bp) wurde aus dem mutierten Plamid entnommen und gegen das vollständige EcoRI-Fragment (1.610 bp) in pCR9 ausgetauscht. Im entstandenen pCR12 lag somit ein bis auf die gewünschte Deletion vollständiges arcA-Gen vor. Da die Polymerase während der Amplifikation Ablesefehler macht, war es notwendig, die PCR-Amplifikate zu sequenzieren.

66

Da nur mit dem 1.121 bp-EcoRI-Fragment aus dem Amplifikat weitergearbeitet werden sollte, musste auch nur dieses Fragment sequenziert werden. Das EcoRI-Fragment aus pCR12 (1.121 bp) wurde von MWG Biotech nach Sanger sequenziert. Hierbei stellte sich heraus, dass die verwendete Pfu-Hotstart-Polymerase (angegebene Fehlerquote bei der Amplifikation laut Stratagene: 1,3 x 10-6) bereits im Bereich der ersten 200 bp drei Basen fehlerhaft amplifiziert hatte. Dieser Ansatz wurde daraufhin verworfen und der klassische, enzymatische Weg gewählt, um eine In-Frame-Deletion (522 bp) im arcA-Gen herbeizuführen.

4.2.6 Deletion im Arginindeiminase-Gen mittels Klonierung Auch in diesem Fall konnte kein Plasmid mit einem vollständigen arcA-Gen verwendet werden, da in diesem Fall keine verwendbaren Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen vorhanden gewesen wären. Es wurde deshalb wieder auf das bereits für die Site-directedmutagenesis verwendete Arbeitsplasmid pCR10 zurückgegriffen. Mittels NsiI-/SphI wurde aus pCR10 ein 518 bp großes Fragment herausgeschnitten, die 5´-3´-Überhänge des größeren Konstruktes mittels T4-Polymerase geblunted (Verlust von weiteren 4 bp) und das verbleibende Fragment religiert (pCR16). Da das arcA-Gen in pCR16 nicht vollständig vorlag, wurde ein EcoRI-Fragment aus pCR16 (1.058 bp) gegen das entsprechende EcoRIFragment in pCR9 (1.610 bp) ausgetauscht, um ein bis auf die gewünschte Deletion vollständiges arcA-Gen zu erhalten (pCR17). Aus diesem Konstrukt wurde das arcA-Gen mit drei unterschiedlich großen Flanken in den Suicide-Vektor pMP62 kloniert. Der Übersichtlichkeit halber ist die Konstrukterstellung der Suicide-Plasmide hier als Fließdiagramm dargestellt (s. Abbildung 20).

67

Aus dem Cosmid pCR4 wurde das HpaI-/XmnI-Fragment in den EcoRV geöffneten Vektor pBSK- kloniert:

HpaI EcoRV

EcoRV

0

2 -2

4 -1

AscI

XmnI

6 kb

KpnI

Ampicillin

pBSK(-)

+1

arcA

F1(-)

EcoRI lacZ

2958 bps HpaI-/XmnI-Fragment aus Cosmid (7308 bp)

EcoRV SacI

ColE1 origin

Das entstandene Konstrukt wurde pCR7 benannt.

F1(-) Ampicillin ColE1 origin

XbaI

lacZ

pCR7 10266 bp

AscI

+1

-2 -1

arcA

Aus pCR7 wurde eine für die weitere Klonierung störende EcoRI-site deletiert. Zu diesem Zweck wurde pCR7 mit AscI-/XbaI-Restriktionsendonukleasen behandelt. Diese Enzyme

68

schnitten das Konstrukt in ein großes Fragment (9.156 bp), das zu pCR9 religiert wurde, und ein

kleines

Fragment

(1.110

bp),

das

die

unerwünschte

Deletion

enthielt.

F1(-)

Ampicillin XbaI EcoRI

ColE1 lac

pCR7

-2

10266 bp -1

AscI

arcA EcoRI

+1

EcoRI

AscI/XmnI

0

2

4

6

8 kb

ColE1 origin F1(-)

lacZ

Am picillin

-2 -1 arcA +1

großes Fragm ent (9156 bp)

1 kb

EcoRI kleines Fragment (1110 bp)

69

F1(-) Ampicillin

ColE1 origin

lacZ

pCR9 9160 bp

+1

arcA

-2 -1 EcoRI

EcoRI

Die 4 bp mehr resultieren aus dem Abdauen der Überhänge. pCR9 erwies sich als für die Sitedirected-mutagenesis zu groß und mit für eine Deletionsklonierung ungeeigneten Sites ausgestattet. Daraufhin wurde das EcoRI-Fragment (1.610 bp) aus pCR9 in pBSK- kloniert. Das daraus resultierende Plasmid wurde mit pCR10 bezeichnet. Hierbei blieb auch ein Teil des arcA-Gens im verbliebenen pCR9-Fragment zurück.

NaeI BsaAI

XmnI ScaI PvuI

Eco SphI RI

NsiI

arcA

Eco RI +1

'

1610 bp großes EcoRI-Fragment aus pCR9

F1(-)

PvuI

Ampicillin

EcoRI

pBSK(-)

BsaI

KpnI

PvuII

2958 bp lacZ ColE1 origin

PvuI I SapI

SacI

70

F1(-) Ampicillin

EcoRI '+1

pCR10 4568 bp

ColE1 origin

arcA

lacZ

SphI

EcoRI

Zur Deletion mittels Klonierung wurde pCR10 mit den Restriktionsendonukleasen NsiI-/SphI behandelt. Das verworfene, kleine Fragment (548 bp) entspricht hierbei der Deletion. Das große Fragment (4.020 bp) wurde zu pCR16 religiert.

NsiI-/SphI

0

1 EcoRV

EcoRI

2

3

lacZ

4 kb

XmnI

ColE1 origin

''arcA '+1

NsiI

Ampicillin

EcoRV EcoRI

0,5 kb

F1(-)

'arcA''

''arcA'

großes Fragment (4020 bp), das zu pCR16 religiert wird

4 bp gehen durch das das Abdauen verloren

kleines Fragment (548 bp), das der Deletion entspricht

71

Das EcoRI-Fragment mit der Deletion (1.058 bp) aus pCR16 wird gegen das vollständige EcoRI-Fragment (1.610 bp) aus pCR9 ausgetauscht, um das bei der Klonierung verlorengegangene Stück des arcA-Gen zu vervollständigen. Das daraus resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pCR17.

Religation

XmnI

Ampicillin

F1(-)

EcoRV

F1(-)

Ampicillin ColE1 origin

EcoRI

'arcA''

pCR16 ''arcA

lacZ

pCR9

9160 bp -2

4016 bp ColE1 origin

'+1

lacZ

+1

EcoRV

arcA

EcoRI

EcoRI

EcoRI

-1

Das 1058 bp-Fragment aus pCR16 wird mit dem 7550 bp-Fragment aus pCR9 (beide EcoRI) zu pCR17 ligiert.

0

1 kb

0

2

4

C o lE 1 o r ig in

'arcA''

''arcA

'+1

EcoRI-Fragment aus pCR16 (1058 bp)

+1'

la c Z

6 kb

F 1 (-)

A m p ic illin

-2

a rc A '

E c o R I-F ra g m e n t a u s p C R 9 (7 5 5 0 b p )

72

EcoRV

Ampicillin ColE1 origin

pCR17

lacZ

8608 bp '+1

EcoRI

-2

-1

arcA

EcoRV

EcoRI

Aus pCR17 wurde 3x ein Fragment unterschiedlicher Größe in die PacI-Restriktionsstelle des Suicide-Vektor pMP62 kloniert. Das erste Fragment besaß 2 kleine Flanken, das zweite 2 große Flanken und das dritte 1 große und 1 kleine Flanke (Flanken als Region markiert):

PacI

PacI

groEL' sacR amp

sacB

OriE

pMP62 9917 bps Cos

'groEL

Hygromycin

Cos

73

'arcA' amp groEL' sacR

EcoRI

0

1 kb '-1

sacB

pCR19 10931 bp

Cos

'groEL Cos Hygromycin

''+1

arcA

OriE

kleine Flanken-Insert (1042 bp EcoRV-/ MluI-Fragment) aus pCR17

'+1'

amp

OriE

arcA

EcoRI

0

1

-2

-1

EcoRI

2 arcA

3 kb ''+1

-1

pCR20

-2 groEL sacR

13440 bp

sacB

Cos Cos

Hygromycin 'groEL

große Flanken-Insert (3547 bp BclIFragment) aus pCR17b

amp

EcoRI

0 '-1

EcoRI

1 arcA

'arcA'

2 kb ''+1

groEL'

sacR

sacB

OriE

pCR21 12180 bp

Cos Cos

'groEL Hygromycin

1 große, 1 kleine Flanke (2287 bp BclI-/MluI-Fragment) aus pCR17 Abbildung 20: Konstrukterstellung der Suicide-Plasmide

74

Das Konstrukt pMP62 mit dem die Suicide-Plasmide erstellt wurden, ist ein nicht-replikativer Vektor (9917 bp). Es enthält eine Hygromycinresistenz und eine Ampicillinresistenz, ein sacB-Gen und ein OriE, d.h. es repliziert in E. coli. Es besitzt jedoch keinen „Origin of replication“ für Mykobakterien (OriM), ist also nicht in der Lage, sich in Mykobakterien zu replizieren. Der Sinn der Transformation von nicht-replikativen Plasmiden besteht darin, dass es nach der Transformation zur Integration des Plasmides im Bakteriengenom kommt (Singlecrossing-over). Durch weitere Manipulation wird ein Double-crossing-over (Verlust des Wildtypgen) provoziert. Diese das arcA-Gen mit der Deletion enthaltenden Suicide-Plasmide wurden in M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis Erdmann und M. bovis BCG transformiert. Hierbei zeigte sich keine von der Flankengröße abhängige Transformationseffizienz. Zur Erzeugung von ∆arcA-Mutanten waren folgende Schritte nötig: •

Selektion für das Plasmid zum Auffinden der Transformanten

•

Integration des Plasmids im Genom (Rekombination)

•

Kontrolle der Rekombination mittels PCR

•

Kontrolle der Homologen Rekombination mittels Southern Blot-Hybridisierung

•

Elimination des Wildtypgen

•

Kontrolle der Elimination des Wildtypgen mittels Sucrosesubkultur

•

Bestätigung der Elimination durch Ausplattieren auf AB-haltigem Nährboden und

•

Kontrolle der Mutanten in der Southern Blot-Hybridisierung.

4.2.7 Positive Selektion für das Insert Die Plasmid-Klonierungsvektoren waren in Besitz eines Gens, das den Wirtszellen Hygromycinresistenz verlieh. Auf diese Weise konnte davon ausgegangen werden, dass

75

sämtliche, nach 4-6 Wochen auf hygromycinhaltigem Nährboden gewachsenen Kolonien der Transformation plasmidhaltig waren. Diese Transformanten wurden eine Woche in Flüssigkultur mit Antibiotikumzusatz inkubiert. Mit einer Frequenz von 1 x 10-4 wird in dieser Zeit das Plasmid über ein „Single-crossingover“ in das Bakteriengenom integriert. Zur Kontrolle wurden mit Hilfe der PCR (Primer Arg1 und ArcA7) aus der genomischen DNA der Transformanten Amplifikate erstellt. Hierbei wurde aus dem Wildtyp ein 1.329 bp großes Amplifikat gebildet. Sofern ein „Single-crossing-over“ stattgefunden hatte, wurde zusätzlich zu diesem ein 777 bp großes Amplifikat aus dem Plasmid generiert. In diesem Fall war die Amplifikationsbande des Wildtyps auf dem Gel nur noch schemenhaft erkennbar, da das kleinere DNA-Stück des Plasmids bevorzugt amplifiziert wurde (s. Abbildung 22).

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 L w p L

1,6 kb 1 kb

Abbildung 21 PCR zur Überprüfung der Rekombination. Zusätzlich zu den Amplifikaten der zu testenden Kolonien, wurde zur Kontrolle ein 1-kb-DNA-Ladder, genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) zum Ausschluss des Wildtyps und pCR20 (w) zur Kontrolle der gewünschten Amplifikatgröße.

Im gezeigten Gelbild wird deutlich, dass aus Kolonie Nr. 2, 3, 5 und 12 ein 777 bp großes Amplifikat gebildet werden konnte. In diesen Kolonien hatte demnach ein „Single-crossingover“ stattgefunden. Aus den übrigen Kolonien wurde nur die Wildtypbande vom Amplifikat auf dem Gel sichtbar. Diese Kolonien konnten demnach nicht weiter verwendet werden.

76

4.2.8 Überprüfung auf homologe Rekombination Bei diesen Rekombinanten musste nun zwischen erwünschter homologer Rekombination (Integration am Genort) und unerwünschter homeologer Rekombination (Integration irgendwo im Genom) unterschieden werden. Die in der PCR detektierten Rekombinanten wurden in der Southern Blot-Hybridisierung auf homologe Rekombination überprüft. Hierzu wurde ein im Plasmid nicht schneidendes Enzym ausgewählt (EcoNI) und die genomische DNA der Rekombinanten damit geschnitten. Das arcA-Gen enthaltende EcoNI-Fragment des Wildtyps war bei der Integration am Genort/homologer Rekombination um die Größe des Plasmid-Klonierungsvektors (13.440 bp bei pCR20) vergrößert. Es entstand ein großes Fragment. Bei einer Rekombination außerhalb des Genortes entstanden zwei von der arcA-Sonde detektierte Fragmente: das Wildtyp-Fragment (6.007 bp) und ein weiteres Fragment unbekannter Größe (Größe des Plasmid-Klonierungsvektors + Größe des EcoNI-Fragmentes, an dem es integriert hat). Ein Verschwinden der Wildtyp-Bande (nur eine Bande auf dem Röntgenfilm der Southern Blot-Hybridisierung sichtbar) konnte also als Beweis einer homologen Rekombination angesehen werden (s. Nr.4 und 16 in Abbildung 23). g

1

3

4

16

78

116 118 141 153 19 kb 6 kb

Abbildung 22 Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung auf homologe Rekombination (EcoNI). Zur Kontrolle wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) mitgeführt, um die unerwünschte Wildtypbande bestimmen zu können.

77

Aus dem gezeigten Blot wird ersichtlich, dass es oft nicht deutlich zu erkennen ist, bei welchen Klonen eine legitime Rekombination stattgefunden hat. Im vorliegenden Blot wurden nur Nr. 4 und Nr. 16 als homolog eingestuft (eindeutig nur eine Bande) und weiterverwendet.

4.2.9 Entfernung des Wildtypgens mittels „Ausloopen“ („Double-crossing-over“) Die legitimen Rekombinanten wurden ohne Antibiotikumzusatz in 7H9-Medium kultiviert. In dieser Kultur wird nach ca. 14 Tagen ohne Selektionsdruck der positive Selektionsmarker (Hygromycinkassette) und mit ihm das Wildtypgen und ein negativer Selektionmarker (sacBGen) „ausgeloopt“, das heißt, das nicht benötigte Gen für Antibiotikumresistenz und mit ihm das sacB-Gen werden aus dem Genom eliminiert. Die Kontrolle der Elimination dieser Gene (des „Ausloopens“) erfolgte durch das Ausplattieren auf Saccharose- (Sucrose-) haltigem Nährboden. Wenn das Wildtypgen (und somit auch das sacB-Gen) nicht „ausgeloopt“ wurde, bildete die Rekombinante mit dem sacB-Gen aus der Sucrose Levansäuren, die cytotoxisch wirkten. Es handelte sich somit um eine Selektion gegen den Vektor (sacB = negativer Selektionsmarker). Alle auf Sucrose gewachsenen Kolonien mussten somit „ausgeloopt“ haben und eine Deletion im arcA-Gen besitzen.

4.2.10 Ausplattieren zur Bestätigung der Elimination des Wildtypgens Die Bestätigung erfolgte zunächst durch „Pick&Patch“ der auf Sucrose gewachsenen Kolonien. Hierzu wurden die jeweiligen Kolonien etwa in der Mitte geteilt und auf 7H10/OADC-Platten mit und ohne Hygromycinzusatz ausplattiert. An dieser Stelle funktionierte die Hygromycinresistenz als negativer Selektionsmarker, denn nur die Kolonien, die die Hygromycinresistenz ausgeloopt hatten, hatten auch das Wildtypgen verloren. Die Kolonien, die nicht mehr in der Lage waren, auf hygromycinhaltigem Nährboden zu wachsen, wurden durch Southern Blot-Hybridisierung kontrolliert.

78

4.2.11 Überprüfung der Mutanten in der Southern Blot-Hybridisierung Hierbei wurde zunächst ein PvuI-Verdau gewählt, bei dem das erwartete Fragment für die Mutante größer war (1.406 bp) als das Fragment des Wildtyp (1.111 bp), da beim Wildtyp eine Enzymschnittstelle vorhanden war, die im Bereich der Deletion lag und somit bei der Mutante fehlte. Hierzu wurde eine neue Sonde verwendet (Sonde 2), die außerhalb der Deletion bindet. Die Herstellung der Sonde verlief analog zur Herstellung von Sonde 1, jedoch mit den Primern ArcASeq3 und ArcA8. Die verwendete Sonde 2 und die entsprechenden Enzyme sind schematisch in der folgenden Abbildung 24 dargestellt:

Pvu I 1896 Eco RI 2122 Pvu I 2738

0

1 Rv0999

2 Rv1000

Deletion

3

arcA

Eco RI 3732 Pvu I 3849

4

5 kb

Rv1002c Sonde2

Abbildung 23 der Mutanten

Lage der Enzymschnittstellen für die Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung

Nachfolgend wurden alle Mutanten, die in der Lage waren, auf Sucrose, jedoch nicht auf Hygromycin zu wachsen, untersucht. Die folgende Southern Blot-Hybridisierung (s. abbildung 25) detektiert die arcA-Mutanten. Mitgeführt wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv, um die Mutanten deutlich vom Wildtyp unterscheiden zu können:

79

g

4

5

11

16

19

22

1,6 kb

1 kb

Abbildung 24 Southern Blot-Hybridisierung der Mutanten (PuvI), zur Kontrolle wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) mitgeführt.

Nr. 5, 11, 19 und 22 zeigten hierbei die für die Mutante erwartete Bande von 1.406 bp, alle anderen entsprachen dem Wildtyp (1.111 bp großes Fragment).

Die Mutanten wurden in einem weiteren Blot (EcoRI-Verdau) überprüft. Hierbei war das beim Wildtyp detektierte Fragment 1.610 bp groß, das entsprechende Fragment der Mutante jedoch nur 1.063 bp. Da hierbei auch Mutanten von M. bovis BCG getestet wurden, wurde zusätzlich zur genomischen DNA von M. tuberculosis H37Rv (w1) auch genomische DNA von M. bovis BCG (w2) mitgeführt. Zur Kontrolle der Bandengröße der Mutanten wurde das Plasmid pCR20 1:1.000 verdünnt (p) mitgeführt, das ebenfalls die gewünschte Deletion im Arginindeiminasegen aufweist und demnach eine mit den Mutanten identische Bandengröße besitzen muss (s. Abbildung 26).

80

w1 w2

p

11

22 146 148

1,5 kb 1 kb

Abbildung 25 Southern Blot-Hybridisierung der Mutanten (EcoRI), zur Kontrolle der M. tuberculosisMutanten wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (w1) mitgeführt, sowie genomische DNA von M. bovis BCG (w2) zur Kontrolle der BCG-Mutanten und das 1:1.000 verdünnte Plasmid pCR20, das das gleiche signalgebende Fragment aufweisen muss wie die Mutanten.

Alle im PvuI-Blot erkannten Mutanten zeigten die erwartete 1.063 bp große Bande im EcoRIBlot, die ebenso groß wie beim Plasmid pCR20a ist, das hier zur Kontrolle der gewünschten Bandengröße mitgeführt wurde.

4.3

Funktionsassay der Mutanten

Die Mutanten wurden auf die Bildung von Ammoniak aus Arginin unter anaeroben und aeroben Bedingungen untersucht. Hierzu wurden sie wiederum in MB-Medium (+ADS) mit 10 mM Argininzusatz aerob und anaerob bebrütet und die gebildete Menge Ammoniak gemessen (s. Abbildung 27 und 28).

81

3000 MB+Arginin H37Rv CR1 (H37Rv-Mutante) Erdmann CR2 (Erdmann-Mutante) BCG CR3 (BCG-Mutante) Negativkontrolle

Ammoniakgehalt in µmol/l

2500 2000 1500 1000 500 0 -500 0

5

10

15

20

25

Tag

Abbildung 26 Bebrütung

Ammoniakbildung von Mutanten und Wildtyp, OD600, 10 mM Argininzusatz, anaerobe

82

2000 1800

Ammoniakgehalt in µmol/l

1600 1400 1200 1000

MB+Arginin H37Rv CR1 (H37Rv-Mutante) Erdmann CR2 (Erdmann-Mutante) BCG CR3 (BCG-Mutante) Negativkontrolle

800 600 400 200 0 0

5

10

15

20

25

Tag Abbildung 27 Bebrütung

Ammoniakbildung von Mutanten und Wildtypen, OD600, 10 mM Argininzusatz, aerobe

Hierbei wurde deutlich, dass ein Zusammenhang zwischen dem arcA-Gen und der Bildung von Ammoniak aus Arginin besteht. Sämtliche ∆arcA-Mutanten bildeten Ammoniak im Referenzbereich der Negativkontrollen.

83

4.4

Komplementierung der ∆arcA-Mutanten von Mycobacterium tuberculosis

Zur Bestätigung, dass die verminderte Ammoniakproduktion auf der Deletion im arcA-Gen beruht, wurden die M. tuberculosis-Mutanten mit einem Plasmid komplementiert, das ein vollständiges arcA-Gen enthält (pCR5). Hierzu wurde ein 4003 bp großes EcoRv-Fragment aus pCR7 entnommen und in den EcoRV-geöffneten Vektor pMV306kanamycin kloniert. Aufgrund der großen Flanken konnte als sicher angenommen werden, dass ein vollständiges arcA-Gen in pCR5 (gezeigt in Abbildung 29) vorhanden ist.

EcoRI

BclI

EcoRV '+1 EcoRI

arcA

MluI -1

int

pCR5 aph

-2

7998 bp oriE

BclI MluI

MluI EcoRV

Abbildung 28

Plasmid, mit dem die Mutanten komplementiert wurden

Das Plasmid wurde hierzu in die Mutanten transformiert und mit dem entsprechenden Kanamycinzusatz (damit das Plasmid nicht aus den Bakterien eliminiert wird) inkubiert.

84

Die komplementierten Mutanten waren unter anaeroben Bedingungen in Bezug auf die Ammoniakbildung (Abbildung 30) phänotypisch nicht vom Wildtyp zu unterscheiden.

2000 Erdmann-Wildtyp Erdmannmutante komplementiert H37Rv-Wildtyp H37Rv-Mutante komplementiert Erdmannmutante H37Rv-Mutante Negativkontrolle

1800

Ammoniakgehalt in µmol/l

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0

5

10

15

20

25

Tag

Abbildung 29

Ammoniakbildung von Wildtypen und komplementierten Mutanten im Vergleich,

OD600: 0,5, 10 mM Argininzusatz, anaerobe Bebrütung

85

5

Diskussion

Die vielfältige Nutzung von Arginin durch Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden. Von einer Reihe von Bakterien wird L-Arginin als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle genutzt. In vitro konnte jedoch gezeigt werden, dass M. bovis BCG nicht in der Lage ist, Arginin als Stickstoff- und/oder Kohlenstoffquelle zu nutzen (SETH und CONNELL, 2000). Erkenntnisse über M. tuberculosis liegen nicht vor. Die Verwendung als Energiequelle unter aeroben und besonders unter anaeroben Bedingungen ist für mehrere Mikroorganismen bewiesen. So sind Mycoplasma spp. (FENSKE und KENNEY, 1976), Bacillus licheniformis (BROMAN et al., 1978), Halobacterium halobium (HARTMANN et al., 1980) und Enterocoocus faecalis (SIMON et al., 1982) seit langem dafür bekannt, mit Hilfe des Arginindeiminase-Weges (ADI-Weg) aus Arginin ATP zu gewinnen. Dem obligat aeroben Ps. aeruginosa ist es nicht nur möglich, Arginin zur Bildung von ATP zur Motilität zu nutzen (SHOESMITH und SHERRIS, 1960), sondern mit Hilfe des ADIWeges gelingt es ihm auch, in vitro unter anaeroben Bedingungen zu wachsen (VANDER WAUVEN et al., 1984). Die Bildung der Enzyme für den ADI-Stoffwechselweg wird bei Ps. aeruginosa unter mikroaerophilen (MERCENIER et al., 1980) bzw. anaeroben Bedingungen (GALIMAND et al., 1991; GAMPER et al., 1991) induziert. Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen, ob M. tuberculosis und M. bovis BCG einen solchen Stoffwechselweg zur Nutzung unter anaeroben Bedingungen besitzen. Zunächst stellte sich demnach die Frage, ob alle drei Gene des ADI-Weges (Arginindeiminase, Ornithincarbamoyltransferase und Carbamat-Kinase) vorhanden sind. Beim Vergleich der Sequenzen von Ps. aeruginosa und M. tuberculosis wurde eine Homologie des arcA-Gens (kodierend für die Arginindeiminase), gefunden und bei der Sequenzierung des Genoms von M. tuberculosis H37Rv annotiert (COLE et al., 1998). Eine Ornithin-Carbamoyl-Transferase (OTCase) ist im Genom von M. tuberculosis ebenfalls vorhanden. Dies ist nicht ungewöhnlich, da fast alle Mikroorganismen mit Ausnahme einiger obligat parasitär lebender Individuen zumindest ein OTC-Gen besitzen (ZUNIGA et al., 2002).

86

Es kann sich hierbei entweder um eine anabole OTCase handeln, die als argF im Teil des Arginin-Biosynthese-Stoffwechselweges ist und sich im argCJBDFRGH-Cluster befindet. Oder die OTCase wird als arcB im Rahmen des katabolen Argininstoffwechsels genutzt. Dieses arcB ist nicht zu verwechseln mit dem arcB aus dem arcAB-System von H. influenzae und E. coli, die nomenklatorisch identisch sind, aber nicht mit dem Arginindeiminase-Weg in Verbindung stehen (DE SOUZA-HART et al., 2003). Für M. tuberculosis ist nur eine anabole OTCase annotiert. Dies bedeutet nicht, dass eine katabole OTCase nicht vorhanden ist. Bei der Annotierung der Gene ist lediglich keine zu bekannter OTCase-Sequenz hinreichende Homologie festgestellt worden, die zu einer Annotierung geführt hätte. Aufgrund der entfernten phylogenetischen Verwandtschaft von Mykobakterien mit den auf ADI-Weg untersuchten Mikroorganismen ist es möglich, dass sich im Genom eine OTCase befindet, die nicht annotiert wurde. In den Fällen, in denen Gene des ADI-Weges nachgewiesen wurden, lagen diese im Genom dicht beeinander. Es ist möglich, dass die Gene in der Nähe des arcA-Gens (Rv1001) für die restlichen Enzyme des ADI-Weges kodieren. Alle Rv1001 benachbarten Gene sind noch ohne Annotierung mit unbekannter Funktion. BAUR und Kollegen (1990) berichten von einer Nutzbarkeit einer OTCase von M. tuberculosis zu katabolen und zu anabolen Zwecken unter in vitro-Bedingungen. Allerdings wurde zu diesem Zweck ein Aminosäurerest an der CP-Bindungsstelle (Glu-106) durch Alanin oder Glycin ersetzt. In diesem Fall verlor die OTCase ihre Aktivität unter aeroben Bedingungen. Dies zeigt, wie sehr sich die biochemischen Strukturen von cOTCase (katabolischer OTCase) und OTCase gleichen. Schon CUNIN und Kollegen (1986) postulierten ein gemeinsames Stammgen von anaboler und kataboler OTCase, das sich in zwei Gene dupliziert hat, und eine entsprechende, nahe Verwandtschaft. Eine Änderung von anaboler zu kataboler Funktion ist jedoch nur nach Manipulation möglich und stellt keine in vivo ausführbare Funktion dar. Da diese Situation in vivo nicht eintreten wird, kann eine parallele Nutzung der OTCase in anabolem und katabolem Stoffwechsel ausgeschlossen werden. In vivo ist die Expression der OTCase bei mehreren Organismen offenbar pH-abhängig. Hierbei ließ sich für die katabole OTCase ein pH-Optimum von 6,8, für die anabole OTCase ein pH-Optimum von 8,5 feststellen (D´HOOGHE et al., 1997).

87

Nach der Sequenzierung von M. bovis wurde bei einem Alignment (ZUNIGA et al., 2002) ebenfalls eine OTCase annotiert (anabol). Eine Arginindeiminase wurde ebenfalls annotiert, so dass von ähnlichen Verhältnissen bei M. bovis BCG wie bei M. tuberculosis ausgegangen werden kann. Das dritte Enzym, eine Carbamatkinase (CK) ist ebenfalls in vielen der vorliegenden Genome zu finden, nimmt jedoch nicht automatisch am ADI-Weg teil, sondern kann auch Teil anderer Stoffwechselwege sein. Eine Homologie zur arcC entsprechenden Carbamatkinase fehlt im Genom von M. tuberculosis. Demnach ist nur die Existenz des ersten dieser drei Enzyme aus dem ADI-Weg definitiv vorhanden. M. tuberculosis ist demnach möglicherweise nicht in der Lage, mittels ADI-Weg Energie in Form von ATP zu generieren, da die entsprechenden Gene für die anderen beiden Enzyme eventuell fehlen. Es stellte sich die Frage, ob M. tuberculosis auch für die Arginindeiminase, sollte sie solitär vorliegen, Verwendung findet. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass M. tuberculosis und M. bovis BCG unter anaeroben und unter aeroben Bedingungen in einem Minimalmedium Arginin in vitro mittels des arcA-Gens verstoffwechseln und dabei Ammoniak bilden. Die gebildete Menge Ammoniak war hierbei abhängig von der gegebenen Bakteriendichte und vom zugesetzten Arginingehalt. Als Arginingehalt wurde zunächst ein Zusatz von 10 mM gewählt. Dieser Zusatz ermöglichte es M. bovis BCG, unter aeroben Bedingungen in einem Minimalmedium zu wachsen. Ein cytotoxischer Effekt der Ammoniakkonzentration war nicht zu beobachten. Dies lässt noch keine Rückschlüsse über den Argininumsatz in vivo zu. Um quantitativ zu bestimmen, wieviel Ammoniak in vivo gebildet wird, müsste zunächst ermittelt werden, wie viel Arginin überhaupt zu verstoffwechseln ist. Wie viel Arginin den Mykobakterien in vivo zur Verfügung steht, ist nicht bekannt. Der Bedarf ist ebenfalls nicht abschätzbar. Bei Versuchen mit auxotrophen Mutanten von M. tuberculosis (Defekt im argFGen, kodierend für die anabole OTCase des Genclusters zur Synthese von Arginin) benötigte der mutierte Stamm in vitro ca. 1 mM L-Arginin (0,96 mM), um ein dem Wildtyp vergleichbares Wachstum zu erreichen (GORDHAN et al., 2002). Dieser Gehalt entspricht vermutlich eher dem Argininbedarf der wachsenden Bakterien. Wurde diese Menge Arginin

88

nicht supplementiert, so zeigte sich die Mutante kein Wachstum mehr in vitro. In vivo war eine deutliche Attenuierung zu verzeichnen. Dies impliziert, dass das Wachstum in vitro abhängig von der Fähigkeit zur Biosynthese von Arginin ist und dass unter in vivoBedingungen weniger als 1 mM Arginin zur Verfügung steht. Die zum Wachsen benötigte Menge Arginin wurde in den vorliegenden Untersuchungen (durchgeführt mit 10 mM Argininzusatz) nicht berücksichtigt, da zunächst eindeutig geklärt werden sollte, ob Mykobakterien überhaupt Arginin verstoffwechseln können, ungeachtet der in vivo vorliegenden Verhältnisse. Eine In-frame-Deletion im arcA-Gen (552 bp) reduzierte die Ammoniakbildung auf Werte im Referenzbereich der Negativkontrollen. Eine Komplementierung dieser ∆arcA-Mutanten von M. tuberculosis H37Rv und Erdmann führte zu einer Ammoniakakkumulation, die von der des Wildtyps nicht zu unterscheiden war. Andere katabole Arginin-Stoffwechselwege sind hierbei offenbar nicht von Bedeutung, da nach Verlust des arcA-Gens keine Ammoniakbildung mehr festgestellt werden konnte. Es kann demnach davon ausgegangen werden, dass das arcA-Gen in M. tuberculosis und M. bovis BCG tatsächlich für die Arginindeiminase kodiert. Der geringe Grad der Homologie (39,4 %) der annotierten Arginindeiminase rührt hierbei von der entfernten Verwandtschaft von Pseudomonaden und Mykobakterien. Selbst wenn der ADI-Weg in vivo nicht als Energiequelle genutzt werden sollte, ist doch anzunehmen, dass schon die Verstoffwechselung von Arginin zu Citrullin den Mykobakterien Vorteile in vivo verschafft, da bei dieser Reaktion dem Wirtsorganismus Arginin, das Substrat zur Bildung von NO, entzogen wird (s. NO-Zyklus, Abbildung 30).

89

L-Citrullin

ATP

L-Aspartat

NO

2-Oxoglutarat

O2

AMP+PPi

L-Arginin

L-Glutamat

L-Argininosuccinat

Oxalacetat

Fumarat L-Malat

NADH + H+

NAD

Abbildung 30

+

NO-Zyklus (modifiziert nach WU und NORRIS, 1998)

Bekannt ist von NO, dass es in vitro humane Monozyten befähigt, Tuberkuloseerrreger zu eliminieren (BOSE et al., 1999). Außerdem

weiß

man,

dass

murine

Makrophagen

durch

Stimulation

mittels

Lipopolysacchariden (LPS) und IFN-γ zur vermehrten Aufnahme von L-Arginin angeregt werden konnten und vermehrt NO produzierten (HIBBS et al., 1987; PETEROY-KELLY et al., 2001). Hierbei ist die NO-Produktion abhängig von der Verfügbarkeit extrazellulären Arginins (BOGLE et al., 1992). Ob diese vermehrte NO-Produktion auch in vivo im menschlichen Körper stattfindet, wird allerdings kontrovers diskutiert. ASTON und Kollegen (1998) konnten in humanen Alveolarmakrophagen nach Stimulation mit IFN-γ und LPS keine vermehrte Produktion von NO bestätigen. Andererseits ist bei humanen Alveolarmakrophagen bewiesen, dass sich der intrazelluläre BCG-Tötungsmechanismus mittels NO durch Ersatz von Arginin durch das Analogon L-NMMA komplett inhibieren ließ (NOZAKI et al., 1997). Der Mechanismus ist demnach ebenfalls vorhanden. Demnach unterscheidet sich die Steuerung der NO-Produktion im murinen von der im humanen Modell. Dies schließt nicht aus, dass die Nutzung von NO analog erfolgt. Verschiedene Regulationsmechanismen in unterschiedlichen Modellen wurden untersucht.

90

IFN-γ, TNF und Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor allein haben laut SCHNEEMANN und Kollegen (1993) keinen Einfluss auf die Produktion von NO in humanen Makrophagen, während sie in murinen Makrophagen zur Aktivierung des argininabhängigen Stoffwechselweges ausreichend sind. In humanen Hepatozyten sind hierfür zusätzlich IL-1 und Lipopolysaccharide vonnöten (NUSSLER et al., 1992). Eine Hemmung der induzierbaren NO-Synthetase durch in menschlichen Zellen in größerer Menge produzierte autokrine Inhibitoren und toxische Moleküle wird angenommen (OSWALD et al., 1992). In der Maus kann die RNI-Produktion erwiesenermaßen durch verschiedene Cytokine wie IL4, IL-10, und Transforming growth factor beta 1 (TGF-ß1) herunterreguliert werden (NELSON et al., 1991). Auch von Zellwandbestandteilen von Mykobakterien (Lipoarabinomannan) ist bei Kaninchen bekannt, dass sie mit der NO-Produktion assoziiert sind (ROACH et al., 1994). Ein Mechanismus, der auch im menschlichen Organismus denkbar wäre. Des weiteren gibt es Unterschiede in der Immunantwort von humanen Alveolarmakrophagen. Alveolarmakrophagen von Patienten mit einem positiven Tuberkulintest waren in vitro effektiver in der Lage, BCG zu eliminieren und reagierten anders auf Stimulation mit IFN-γ als Makrophagen von anergischen Probanden (KAWATSU et al., 1991). Außerdem wird die Reaktion des humanen Alveolarmakrophagen dadurch beeinflusst, ob und unter welcher Krankheit ein Patient leidet. Dies zeigt, dass die Steuerung der NO-Produktion in menschlichen Zellen anders induziert wird. Die Bekämpfung einer Mykobakterieninfektion im humanen Alveolarmakrophagen mittels NO in vitro ist jedoch bewiesen (BOSE et al., 1999; NOZAKI et al., 1997). Ein weitere Nutzungsmöglichkeit der Arginindeiminase besteht in den Vorteilen, die aus dem gebildeten Ammoniak eventuell gezogen werden können. GORDON und Kollegen (1980) zeigten, dass M. tuberculosis in der Lage ist, Ammoniak im Überschuss zu produzieren, und postulierten,

dass

mittels

der

Ammoniakakkumulation

eine

Inhibition

der

Phagolysosomenfusion bewirkt wird. D´ARCY-HART und Kollegen (1983) zeigten einen Effekt von Ammoniumchlorid auf den „Saltatory effect“ von Lysosomen und die Alkalisierung des intralysosomalen Compartments. Diese Alkalisierung wirkt möglicherweise auch der Bildung von NO entgegen, dass durch Azidifikation von Nitrit entsteht (CHAN et

91

al., 1992). Außerdem wird der Wirkungsgrad der lysosomalen Enzyme, die einen optimalen pH-Wert von ca. 5 benötigen, herabgesetzt. Dieser Effekt wird allerdings mitgetragen vom Ausschluss der vesikulären Protonen-ATPase (STURGILL-KOSZYCKI et al., 1994). Auch ohne Nutzung des ADI-Weges wäre es demnach für Mykobakterien sinnvoll, Arginin durch die Arginindeiminase abzubauen. Inwieweit der menschliche Organismus in der Lage ist, Arginin mittels des Arginin-Synthese-Weges zur Herstellung von NO selbst zu generieren, wie viel Arginin unter physiologischen Bedingungen im Vergleich zu einer Mykobakterieninfektion benötigt wird und ob es möglich ist, einen eventuell radikalen Argininentzug durch Mykobakterien auszugleichen, ist noch unbekannt. Wie solche Stoffwechselwege im menschlichen Organismus reguliert werden könnten, ist ebenfalls nicht geklärt. Der Wirtsorganismus sollte mittels einer höheren Argininverfügbarkeit ein größeres Potential zur NO-Bildung aufweisen, das es ihm ermöglicht, im Makrophagen Mykobakterien abzutöten. In der Therapie der Tuberkulose wurden bereits Versuche mit Arginin zur Unterstützung der Chemotherapie unternommen. Obwohl nicht genau bekannt ist, mit welchen Mechanismen Arginin in vivo genutzt wird, wurde Tuberkulosekranken Arginin verabreicht. Als Chemotherapieadjuvans verbesserte Arginin die Heilungschancen HIV-negativer Patienten mit aktiver Tuberkulose. Dies machte sich in Form verminderten Gewichtsverlust, höherer Sputum-Konversionsrate und schnellerem Rückgang der Symptome, wie früheren Stoppen des Hustenreizes bemerkbar (SCHON et al., 2003). Die Mechanismen des Wirtsorganismus, sich gegen eine Infektion mit Mykobakterien zu wehren sind nicht ausreichend untersucht, um zu beurteilen, ob Argininverfügbarkeit einen Pathogenitätsfaktor für M. tuberculosis darstellt. Es ist zu hoffen, dass ein Defekt im Arginindeiminase-Gen von M. tuberculosis dem Wirtsorganismus in Form einer höheren Argininverfügbarkeit und einer ungehemmten Makrophagentätigkeit zugute kommt. Eine solche Verbesserung der körpereigenen Immunantwort könnte in einer Kombinationsvakzine mehrerer Deletionsmutanten bei immunkompetenten Impflingen hilfreich sein. Bei immunsupprimierten Impflingen ist nicht zu erwarten, dass eine Deletion im arcA-Gen

92

eine verbesserte Immunantwort induziert, da für HIV-positive Tuberkulosekranke kein positiver

Effekt

von

der

Argininverfügbarkeit

zu

erwarten

ist.

HIV-positive

Tuberkulosekranke zeigten im Gegensatz zu HIV-negativen Probanden keine Beschleunigung des Heilungsprozesses, wenn ihnen als Therapieadjuvans Arginin verabreicht wurde (SCHON et al., 2003). Ob mittels einer Deletion im arcA-Gen eine Attenuierung erreicht werden kann, lässt sich aus den vorliegenden Ergebnissen nicht ableiten. Hierzu müssen die Ergebnisse der laufenden in vitro-Versuche (MH Hannover) und in vivo-Versuche (Referenzzentrum für Mykobakterien in Borstel) abgewartet werden.

93

6

Zusammenfassung

Untersuchungen zur Funktion der Arginindeiminase bei Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG in vitro Claudia Röhker Die Mechanismen, die es dem obligat aeroben M. tuberculosis ermöglichen, im mikroaerophilen bis anaeroben Milieu des menschlichen Organismus zu persistieren und sich im Makrophagen zu vermehren, sind nicht vollständig bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen, ob M. tuberculosis und M. bovis BCG das als Arginindeiminase (arcA) annotierte Gen nutzen, um unter anaeroben Bedingungen zu wachsen. Das bei diesem ersten enzymatischen Schritt, der L-Arginin zu Citrullin und Ammoniak abbaut, anfallende Stoffwechselprodukt Ammoniak wurde als Indikator der Reaktion verwendet. Ein Ammoniaktest wurde etabliert, um unter den Vesuchsbedingungen den Ammoniakgehalt zu messen. Der Test beruht auf der enzymatischen Reaktion von 2Oxoglutarat zu L-Glutamat in Anwesenheit von Ammoniak, wobei die gleichzeitige Oxidation

von

NADH

zu

NAD+

photometrisch

bestimmt

wird.

Mittels

des

Extinktionskoeffizienten lässt sich der Ammoniakgehalt errechnen. Nachdem es nicht gelang, mittels Site-directed-mutagenesis eine ablesefehlerfreie Deletion herbeizuführen, wurden mittels Klonierung und nachfolgender homologer Rekombination Mutanten von M. tuberculosis und M. bovis BCG erstellt, die eine Deletion (552 bp) im arcAGen aufweisen. Die Ammoniakproduktion der Mutanten war im Funktionsassay deutlich vermindert. Eine Komplementierung der Mutante führte im Assay zu mit dem Wildtyp identischen Ammoniakgehalten. Es kann demnach davon ausgegangen werden, dass das arcA-Gen in M. tuberculosis und M. bovis BCG tatsächlich für die Arginindeiminase kodiert und in vitro exprimiert wird.

94

Summary Studies

of

Arginine-Deiminase

functions

in

Mycobacterium

tuberculosis

and

Mycobacterium bovis BCG in vitro Claudia Röhker Little is known about mechanisms giving obligate aerobe M. tuberculosis the ability to persist and replicate under oxygen-restricted and anaerobic conditions. In this study the arcA-(arginine-deiminase-) annotated gene of M. tuberculosis and M. bovis BCG was examined under aerobic and anaerobic conditions by constructing arcA-knock-outs. Arginine deiminase is the first of three ADI-Pathway encoding enzymes, giving Pseudomonas aeruginosa the capacity to grow under anaerobic conditions. To prove this first enzymatic step in which L-Arginine was degraded to citrulline and ammonia, the amount of produced ammonia was used as an indicator. An ammonia test was adapted for measuring the amount of produced ammonia. In the presence of ammonia, 2-oxoglutarate reacts to L-glutamate whereby NADH is oxidized. The amount of NADH oxidized is stochiometric to the amount of ammonia and can be measured photometrically and can be used to calculate the amount of produced ammonia. After failing in producing correct sequence amplificates by site-directed-mutagenesis, arcAknock-outs (lacking 552 bp in arcA) were constructed by cloning and subsequent homologous recombination. The mutants showed significantly reduced ammonia production. In complemented mutants no difference to wildtype ammonia production could be detected. It can be presumed that arcA is indeed encoding for Arginindeiminase in M. tuberculosis and M. bovis BCG and is expressed in vitro.

95

7

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107

8

Anhang

8.1 Laborkits, Entwicklungssysteme, Größenstandards • Ammoniaktest

Roche, Mannheim

Best.-Nr. 1 112 732

• Anti-Dioxigenin-AP

Roche, Mannheim

Best.-Nr. 1093274

• Blocking Reagenz

Roche, Mannheim

Best.-Nr. 1096176

• CSPD®

Roche, Mannheim

Best.-Nr. CD010

• DNA purification kit

Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, GB Best.-Nr. 27960201

• Dig-DNA Labeling Kit

Roche, Mannheim

• 1 kb DNA Ladder

New England Biolabs, Frankfurt am Main

Best.-Nr. 1093657 Best.-Nr. N3232L

• Qiagen Plasmid mini kit Qiagen, Hilden

Best.-Nr. 51306

• smart Ladder

Best.-Nr. MW-1700-10

Eurogentec, Seraing, B

8.2 Enzyme 8.2.1 Restriktionsenzyme ApaLI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

AscI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

BglII

New England Biolabs, Frankfurt am Main

DpnI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

EcoRI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

EcoRV

New England Biolabs, Frankfurt am Main

HpaI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

108

HindIII

New England Biolabs, Frankfurt am Main

MluI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

NcoI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

NotI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

NsiI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

PacI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

PvuI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

PvuII

New England Biolabs, Frankfurt am Main

SacI

Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, GB

SphI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

XmnI

New England Biolabs, Frankfurt am Main

8.2.2 Enzymsysteme Firma, Standort

Best.-Nr.

Alkal. Phosphatase und Puffer Roche, Mannheim

713023

Alkal. Lysozym

Sigma, Steinheim

6876

Proteinase K

Merck, Darmstadt

1.24568

T4-DNA-Ligase

NEB, Frankfurt a. M.

M0202T

DNA Polymerase (Klenow)

NEB, Frankfurt a. M.

M0210L

T4-DNA Polymerase

NEB, Frankfurt a. M.

M0203L

Taq-Polymerase

Sigma, Steinheim

D1806

Pfu Hotstart Polymerase

Stratagene, LaJolla, CA, USA 600322

109

8.3 Chemikalien Firma, Standort

Best.-Nr.

Agarose Seakem LE

Biozym, Hessisch-Oldendorf

840004

Ammoniumstandardlösung

Merck, Darmstadt

1198120500

Ammoniumchlorid

Merck, Darmstadt

1011451000

Alanin

Sigma, Steinheim

A5824

Arginin

Sigma, Steinheim

A5006

Asparagin

Sigma, Steinheim

A4159

Aspartat

Sigma, Steinheim

A6558

Cystein

Sigma, Steinheim

C7880

Glutamin

Sigma, Steinheim

G7029

Glutaminsäure

Sigma, Steinheim

G1626

Histidin

Sigma, Steinheim

H8776

Leucin

Sigma, Steinheim

L8000

Lysin

Sigma, Steinheim

L5626

Methionin

Sigma, Steinheim

M9625

Phenylalanin

Sigma, Steinheim

P2126

Prolin

Sigma, Steinheim

P8449

Serin

Sigma, Steinheim

S4500

Valin

Sigma, Steinheim

V0500

Ampicillin

MHH-Bestand, Hannover

Ethanol 100 %ig

MHH-Bestand, Hannover

Ethanol 96 %ig

MHH-Bestand, Hannover

Ethanol 70 %ig

MHH-Bestand, Hannover

Ethidiumbromid

Gibco BRL, Langley, USA

15585-011

EDTA

Sigma, Steinheim

E6758

Glycerol

Merck, Darmstadt

1040931000

D-Glucose

Sigma, Steinheim

G5400

Hygromycin

Roche, Mannheim

843555

110

HEPES

AG Klos, Herkunft unbekannt

Isoamylalkohol

Fluka-Sigma, Seelze

25666

Isopropanol

Merck, Darmstadt

109634

Kanamycin

MHH-Bestand, Hannover

Lithiumchlorid

Merck, Darmstadt

105679

Maleinsäure

Sigma, Steinheim

M0375

Natriumchlorid

Merck, Darmstadt

1064045000

Natriumhydroxid

Merck, Darmstadt

1064981000

OADC Enrichment

Becton, Dickinson&Co, F

211886

Roti-Phenol

Roth, Karlsruhe

A156-1

Salzsäure 36-38%

MHH-Bestand, Hannover

SDS

Sigma, Steinheim

Stickstoff, flüssig

MHH-Bestand, Hannover

Tris

Applichem, Darmstadt

A27561000

Tween 20

Sigma, Steinheim

P1379

Tween 80

Sigma, Steinheim

P8074

L4509

8.4 Puffer, Lösungen und Medien 20 x SSC:

3 M NaCl; 0,3 M NaCitrat, pH 7,4

50 x TAE-Puffer:

2 M Tris/Acetat, pH 8,0; 100 mM EDTA

1 x TAE-Puffer:

20 ml 50 x TAE; 980 ml destilliertes Wasser

Bug-Lysis-Solution: 25 mM TrisHCl (pH9,5);10 mM EDTA; 50 mM D-Glucose; Aqua dest. ad 400ml Cetrimide:

4,1 g NaCl in 90 ml Aqua dest. gelöst, 10 g Cetrimid, auf 65°C erwärmt

DNA-1:

0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl

DNA-2:

1 M TrisHCl (pH7,5); 1,5 M NaCl

Wash-1:

1 mM EDTA (pH8,0); 40 mM Na2HPO4 (pH7,2); 5% v/v SDS

Wash-2:

1 mM EDTA (pH8,0); 40 mM Na2HPO4 (pH7,2); 1% v/v SDS

111

Puffer 1 für Chemilumineszenzdetektion:

100 mM Maleinsäure; 150 mM NaCl; pH 7,5

Puffer 2 für Chemilumineszenzdetektion:

10 x Blocking Solution, 1:10 in Puffer 1

Puffer 3 für Chemilumineszenzdetektion:

100 mM Tris; 100 mM NaCl; pH 9,5

Hybridisierungslösung für Chemilumineszenzdetektion: 1 mM EDTA (pH 8,0); 250 mM Na2HPO4 (pH 7,2); 7 % v/v SDS Einfriermedium für coliforme Keime:

LBB-Medium mit 15 % Glycerol

Einfriermedium für Mykobakterien:

7H9 mit 15 % Glycerol

10x Blocking Solution:

10 % (w/v) Blocking Reagenz in Puffer 1 lösen, 1 h auf der Heizplatte rühren, autoklavieren und 4°C lagern

Waschpuffer:

Puffer 1 mit 0,3 % (v/v) Tween 20

Puffer 1 für Plasmid-Mini-Prep (Qiagen):

Resuspensionspuffer,

RNAse-haltig,

genaue

Zusammensetzung nicht angegeben Puffer 2 für Plasmid-Mini-Prep (Qiagen):

Lysis-Puffer, genaue Zusammensetzung nicht angegeben

Puffer 3 für Plasmid-Mini-Prep (Qiagen):

Neutralisationspuffer, genaue Zusammensetzung nicht angegeben

8.5 Verbrauchsgegenstände Firma, Standort

Best.-Nr.

Anaerobierbeutel

Oxoid, Basingstoke, Hampshire, GB

ANO35A

Anaerobic-Indicator

Oxoid, Basingstoke, Hampshire, GB

BR0055B

Elektroporationsküvetten

Biozym, Hessisch-Oldendorf

748020

Falcons

Becton-Dickinson, Heidelberg

210261

Filtrationseinheiten

Corning Star, Corning NY, USA

430517

Greinerröhrchen

Greiner, Frickenhausen

210261 (50 ml) 188271 (15 ml)

112

Hybond-Nylonmembran

Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, GB RPN203N

Hyperfilm-Röntgenfilm

Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, GB RPN6L

Impfschlingen

Sarstedt, Nürnbrecht

Rollerbottles

850

cm3, Corning Star, Corning NY, USA

861562050 430195

steril Reaktionsgefäße 1,5 ml

Sarstedt, Nürnbrecht

72690

Schraubeppis

Sarstedt, Nürnbrecht

72693005 (2 ml) 72692005 (1,5 ml)

Spritzen

Braun, Melsungen

4606205V

Sterilfilter

Millipore, Eschborn

SLGV R25 LS

8.6

Geräte •

Brutschrank B5090E, Firma Heraeus, Osterode

•

Elektrophoresekammer Mini SubCell™, Firma Bio-Rad, München

•

Pipetten P20, P200, P1000, Firma Gilson, Villiers-de-Bel, F

•

Haerolab EASY RH-3, Firma Herolab, Wiesloch

•

Heizblock BT 100, Firma Kleinfeld Labortechnik, Gehrden

•

Hybridisierungsofen OV-1, Firma Biometra, Göttingen

•

PCR-Thermo-Cycler Techne Touchgene, Firma Techne, Cambridge, GB

•

Photometer, Ultrospec III, Firma Pharmacia, Buckinghamshire, GB

•

Röntgenfilmkassetten, X- Elektroporationsgerät Gene Pulser®, Modell 1652077, Firma Biometra, Göttingen

•

X-Omat Röntgenfilmkassetten, Firma Kodak, Rochester, USA

•

Röntgenfilmentwickler RP X-Omat Prozessor M6B, Firma Kodak, Rochester USA

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Schüttelinkubator, Firma Biometra, Göttingen

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Spannungsgeräte Power Supply 200/2.0, Firma Bio-Rad, München

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Speed-vac, SVC 100, Firma Savant, Farmingdale, NY,USA

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UV-Crosslinker UV-Stratalinker™ 1800, Firma Statagene, Hoofdoorp, NL

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UV-Tisch Croma 43, Firma Labor Vetter GmbH, Wiesloch

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Waagen: Mettler PL1200, Firma Mettler, Gießen BP211D, Firma Sartorius, Göttingen

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Wasserbad, GFL, Firma Dräger & Heerhorst, Göttingen

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Zentrifugen: Biofuge pico, Firma Heraeus, Osterode Beckman J2-21, Firma Beckman, Glenrothes, GB

8.7

EDV-Software und Literatur-Datenbanken

Clone Manager® Sci-ed Software, Durham, USA DNA Star® DNA STAR Ltd. London, GB Microsoft Windows ´98®, Microsoft, Redmond, USA Reference Manager 9.5®, ISI Research Soft, Berkeley, USA Sigma Plot 2001® SPSS Inc. The Institute for Genomic Research (TIGR): www.tigr.com The Sanger Center: www.sanger.ac.uk US National Library of Medicine: www.ncbi.nlm.nih.gov World Health Organisation: www.who.int Robert-Koch-Institut: www.rki.de

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Danksagung Zunächst möchte ich mich bei PD Dr. Franz-Christoph Bange für die Überlassung des Themas und die wissenschaftliche Betreuung, fachliche Kritik und menschliche Unterstützung bedanken. Mein herzlicher Dank gilt Prof. Dr. Achim Gruber, Ph. D., für die stets unbürokratische Betreuung an der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann danke ich für die Freundlichkeit, diese Arbeit im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover anfertigen zu dürfen. Silvia Maaß danke ich für das engelsgeduldige Einarbeiten in unzählige Methoden. Ein besonderer Dank gilt meiner Arbeitsgruppe (Antje Bohrßen, Torsten Jäger, Jaqueline Lachnik, Mareike Möller, Axel Puncken, Sonja Schultze, Ludwig Sedlacek, Marion Stermann und Michael Sührken) für das hervorragende Arbeitsklima und die Aufmunterung bei zahlreichen kleineren und größeren Katastrophen. Den Mitgliedern der Arbeitsgruppen PD Dr. Florian Gunzer, Prof. Dr. Andreas Klos und PD Dr. Jan Buer danke ich für Ihre ständige Ansprechbarkeit und Hilfe bei diversen Methoden, Computerabstürzen und der Beschaffung exotischer Papers. Der größte Dank gilt meinen Eltern für Ihre jahrelange, geduldige Unterstützung jeglicher Art während meines Studiums und der Promotionszeit.

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Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Untersuchungen zur Funktion der Arginindeiminase bei Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG in vitro“ verfasst habe. Bei der Anfertigung habe ich keine Hilfe Dritter in Anspruch genommen. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- oder Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir mittelbar oder unmittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation am Institut für Medizinische Mikrobiologie Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover angefertigt.

und

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen und Gewissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Hannover, den